PROTEIN YANG TERKAIT DENGAN PATOGENESIS DARI HEVEA BRASILIENSIS MUELL ARG (ISOLASI, STRUKTUR DAN FUNGSI)
ABSTRAK DISERTASI
Karya Ilmiah untuk memperoleh gelar Doktor Dalam bidang Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam di Institut Teknologi Bandung Dipertahankan pada Sidamg Terbuka Komisi Program Doktor Program Pascasarjana Institut Teknologi Bandung Tanggal 24 Juni 2000
Oleh TOTO SUBROTO
Promotor Ko-promotor
: Prof.Hj.Soekeni Soedigdo, Ph.D. : Prof.Dr. J.J. Beintema Purwo Arbianto, Ph.D.
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2000
ABSTRAK Indonesia merupakan negara pengekspor karet alam terbesar di dunia setelah Thailand. Peningkatan kualitas tanaman karet (Hevea brasiliensis) secara konvensional terus dilakukan melalui pencarian bibit unggul. Namun demikian, peningkatan produksi karet alam seringkali dihambat oleh adanya serangan hama terutama fungi patogen. Untuk pengendalian fungi patogen pada umumnya digunakan fungisida sintetik, namun cara ini seringkali menimbulkan dampak negatif terhadap lingkungan dan harganya relatif mahal. Dengan demikian alternatif lain diperlukan untuk pengendalian penyakit yang lebih efisien serta aman terhadap lingkungan. Konsep baru pengendalian penyakit tanaman, adalah melalui transfer gen resisten ke dalam genom sate spesies tanaman maupun spesies lain. Untuk mengidentifikasi dan mengisolasi gen resisten, diperlukan informasi struktur primer parsial proteinnya yang kemudian digunakan untuk merancang oligonukleotida yang kornplemen dengan bagian deret gen yang mengkode protein tersebut. Dengan demikian, informasi struktur primer protein spesifik yang berperan dalam resistensi tanaman, sangatlah esensial untuk mengisolasi dan mengidentifikasi gen resisten tersebut, selain itu protein alami diperlukan untuk pengujian aktivitas biologisnya serta mengetahui proses yang terjadi selama modifikasi pascatranslasinya. Informasi mengenai protein yang berperan dalam pertahanan H. brasiliensis, terlebih lagi pada klon H. brasiliensis yang resisten belum banyak diketahui. Penelitian protein yang berperan dalam pertahanan tanaman, mengungkapkan bahwa tanaman mensintesis protein-PR (Pathogenesisrelated protein) ketika tanaman diinfeksi oleh patogen Fungsi protein-PR antara lain sebagai kitinase Ban β-1,3- glukanase, kedua enzim ini mampu mengkatalisis hidrolisis polisakarida yang merupakan komponen utama Binding sel fungi. Dengan demikian kemungkinan besar kedua enzim tersebut berperan dalam pertahanan tanaman terhadap serangan fungi patogen. Kenyataan ini didukung oleh tidak ditemukannya kitin pada tanaman tinggi, juga kedua enzim ini dapat mendegradasi isolat dinding sel fungi Ban telah ditunjukkan menghambat pertumbuhan fungi in vitro Ban bahkan uji in vivo pada tanaman transgenik proteinPR dapat meningkatkan resistensi tanaman terhadap fungi patogen. Penelitian ini bertujuan untuk: 1) mengisolasi Ban mengidentifikasi protein utama dalam organel lutoid lateks H. brasiliensis, 2) mengkarakterisasi struktur primer proteinnya, untuk mencari homologi dengan protein-PR yang telah diketahui fungsinya, 3) rnempelajari sifat-sifat enzimatik protein tersebut. Di samping itu, untuk mengetahui peranan protein-PR pada klon H. brasifensis
yang resisten, maka sebagai studi perbandingan digunakan klon PR261 Ban RRIM 600 (resisten ) serta klon GTl (rentan) Ban satu klon LCB1320 (primer). Untuk mengungkap adanya protein-PR, protein utama dalam organel-lutoid lateks segar diisolasi Ban dimumikan dengan cara: sentrifugasi, pemecahan membran organel lutoid, presipitasi protein dengan amonium sulfat, diikuti fraksionasi dengan kromatografi kolom: filtrasi gel, penukar kation Ban anion, serta HPLC fasa terbalik. Sementara itu kemunian sampel protein diamati secara ektroforesis gel SDS poliakrilamida (SDS-PAGE) menurut metode Laemmli. Protein murni diidentifikasi dengan cara menentukan Beret ujung-N-nya dengan metode degradasi Edman melalui penentu deret, atau peptida internalnya setelah proteinnya dipotong dengan CNBr atau enzim tripsin, kemudian individu peptida dipisahkan dengan HPLC fasa terbalik. Selanjutaya isolat peptidanya dipelajari secara spektrometri massa ESMS atau MALDI TOF. Fungsi protein hasil pemurnian dari organel-lutoid lateks dapat diprediksi, dengan cara membandingkan struktur primer parsialnya dengan protein yang telah diketahui fungsinya dari bank data. Aktivitas kitinase dari protein murni ditemukan menurut metode Melchers, sedangkan β-1,3glukanasenya menurut metode Kauffmann. Sementara itu uji Aktvitas biologis protein murni diteliti dengan uji inhibisi terhadap pertumbuhan fungi menurut metode Woloshuk. Lima komponen protein utama dalam organel-lutoid lateks H. brasiliensis dapat diidentifikasi secara SDS-PAGE, yaitu protein berbobot molekul: 5 kDa (hevein), 14 kDa, 19 kDa, 29 kDa (hevamin) dan 35 kDa, sedangkan protein 25 kDa dan 43 kDa merupakan komponen minornya. Protein 19 kDa dan 14 kDa dapat diisolasi dan dimurnikan secara simultan dengan
kromatografi
kolom karboksimetilselulosa gradien linier konsentrasi bufer borat yang meningkat pada pH 8,9. Dari kajian lebih lanjut oleh Soedjanaatmadja menunjukkan bahwa protein 14 kDa merupakan ujung-N dari prohevein, sedangkan protein 19 kDa adalah prohevein. Selain ditemukan kedua komponen hevamin A dan B, juga ditemukan isoform hevamin ketiga yang disebut sebagai hevamm X, dan terelusi dari kolom sebelum hevamin A dan B dengan kekuatan ion 600 pMhos, sementara itu hevamin A dan B berturut- turut pada 1100 pMhos dan 1500 pMhos. Penentuan deret asam amino ujung-N hevamin X, menunjukkan deret yang identik dengan hevamin A dan B, yaitu Gly-Gly-Ile-Ala-Ile-Tyr-Trp-Gly-Gln-Asn-, namun titik isoelektriknya (9,3), yang berbeda dengan hevamin A (9,9) dan B (10,5).
Untuk menelusuri perbedaan antara hevamin X dan hevamin A pada taraf asam amino, ditentukan sidik jari (fingerprint) peptida hasil pemotongan hevamin X dan A dalam kondisi identik dengan enzim tripsin dan diteliti dengan HPLC fasa terbalik, kemudian diikuti penentuan massa isolat peptidanya secara spektrometri massa. Hasilnya menunjukkan bahwa pola peptida dari hevamin X dan A adalah identik dan semua peptida yang diperkirakan dapat diidentifikasi dengan spektrometri massa. Dengan demikian perbedaan hevamin X dan A pada taraf asam amino tidak ditemukan. Kemungkinan besar perbedaan kedua komponen disebabkan adanya pergantian Asp atau Glu dengan Asn atau Gln, sebagai hasil mutasi alami atau deaminasi yang spesifik. Keadaan ini akan menghasilkan perbedaan titik isoelektrik tetapi masssanya hampir sama, oleh karena itu perbedaanya tidak akan terdeteksi dengan spektrometri massa. Deret cDNA hevamin yang ditentukan Bokma menunjukkan bahwa hevamin di sintesis dengan deret signal ujung-N, yang mengarahkan protein baru terbentuk ini ke retikulum endoplasma untuk dieksresikan
(-Met-Ser-Ser-Ser-His-Val-Asp-↓Gly~Gly-Gly-IIe-Ala-Ile-Tyr-Trp-Gly-Gln-Asn-,
signal sebelum tanda ↓), dan deret signal ujung-C pengarah ke vakuola telah dipecah pada protein matang hasil isolasi dari organel-lutoid. Inkubasi hevamin dengan kitin sebagai substrat menunjukkan bahwa ketiga isoform hevamin memiliki Aktvitas spesifik kitinase yang sama. Namun inkubasi dengan substrat dinding sel hasil preparasi dari Micrococcus lysodeikticus, menunjukkan bahwa ketiga isoform hevamin memiliki aktivitas spesifik lisozim yang berbeda. Aktivitas lisozim dart hevamin memiliki pH optimum yang sangat tajam (pH 4,9), sedangkan pH optimum kitinase sangat melebar pada kisaran pH 4 hingga lebih tinggi pH 6. Aktivitas lisozim hanya dapat diamati pada konsentrasi garam yang rendah, sedangkan aktivitas kitinase tidak banyak dipengaruhi oleh konsentrasi garam. Protein 35 kDa telah dimurnikan dengan kromatografi kolom karboksimetil-selulosa gradien linier konsentrasi NaCl yang meningkat dalam bufer NaOAc pada pH 5,2. Analisis deret asam amino protein ini menunjukkan ujung-N terebat. Setelah protein dipotong dengan CNBr dan dipisahkan dengan HPLC fasa terbalik diperoleh suatu campuran peptida yang mengandung komponen utama dan minor. Pencarian homologi dengan deret protein dari bank data menunjukkan bahwa peptida utama dan minor adalah homolog dengan bagian ujung-C dan ujung-N deret yang dideduksi dari cDNA β-1,3-glukanase H.brasiliensis, yang juga homolog dengan deret protein PR-2 (β-1,3glukanase) dari tanaman lain.
Hasil analisis deret dan spektrometri massa ESMS, diperoleh suatu informasi bahwa protein 35 kDa adalah protein dengan bagian ujung-C yang tidak utuh, adanya komponen utama yang mengandung ujung-C glisina, tetapi ada juga yang mengandung ujung-C alanina serta alanina-glutamat yaitu: Asn-Leu-Asn-Phe-Gly↓Ala↓Glu↓ dengan perbandingan 6:1:1. Selain itu, perbandingan deret asam amino bagian ujung-C protein 35 kDa dengan deret yang dideduksi dari cDNA (-Asn-Leu-Asn-PheGly↓-Ala↓-Glu↓-Lys-Asn-Trp-Asp-Ile-Ser-Thr-GIu-His-),
menunjukkan
bahwa
protein
ini
merupakan protein organel-lutoid lateks. Kenyataan ini tampak di muka, pada deret asam amino ujung-C dari cDNA masih ditemukan adanya ekstra peptida (huruf tebal) yang mengarahkan protein ini menuju ke organel target yaitu organel-lutoid (C-terminal lutoid targeting signal). Penentuan sifat enzimatik protein 35 kDa melalui inkubasi dengan oligo β-1,3-glukan sebagai substrat menunjukkan bahwa protein 35 kDa memiliki aktivitas β-1,3glukanase. Pengujian aktivitas biologisnya in vitro, menunjukkan bahwa tidak hanya hevamin tetapi juga protein 35 kDa memiki aktivitas antifungal. Sementara itu analisis kandungan protein 35 kDa dan hevamin pada lutoid lateks H. brasiliensis yang terinfeksi fungi patogen menunjukkan bahwa kedua protein disintesis sebesar 1,5 dan 3 kali lebih tinggi dibandingkan dengan yang berasal dari lutoid lateks H. brasiliensis yang sehat. Dengan ini dapat dinyatakan bahwa hevamin dan protein 35 kDa berperan dalam pertahanan H. brasiliensis terhadap serangan patogen. Protein 25 kDa telah dimurnikan dari organel lutoid lateks klon PR261 setelah presipitasi dengan amonium sulfat pada kejenuhan 50-l00%, kemudian kromatografi kolom karboksimetilselulosa dengan gradien limier konsentrasi NaCl yang meningkat dalam bufer Tris--HCI pada pH 8, dikuti dengan HPLC fasa terbalik elusi gradien linier asetonitril 0-70% dalam 0,1% TFA dengan kolom aukleosil C18 Sementara itu protein amonik 43 kDa telah dimurnikan dengan kolom penukar anion dietilaminoetil dengan gradien konsentrasi linier NaCl yang meningkat dalam bufer Tris HCI, pH 8, dan dilanjutkan rekromatografi dengan kolom fltrasi gel Sephadex G 75. Analisis deret parsial ujung N protein 25 kDa dan peptida CNBr protein menunjukkan homologi dengan protein antifungal mirip-taumatin yang berasal dan Nicotinia tabacum, juga homolog dengan deret protein PR-5 dari tanaman lain. Analisis deret ujung-N protein 43 kDa menunjukkan ujung-N terebat. Setelah dipotong dengan CNBr dan dipisahkan HPLC fasa terbalik diperoleh peptida campuran. Deret ujung-N suatu peptida CNBr pendek internal menunjukkan homologi dengan patatin, suatu protein yang memiliki aktivitas palmitat asilase dari Solarium tuberosum, dan identik dengan alerge lateks hev b 7, suatu protein yang diisolasi dari C-serum (sitoplasma) lateks karet.
Sebagai tambahan pada protein 25 kDa mirip-taumatin, ditemukan protein lain dengan bobot molekul yang sama telah diisolasi dari organel-lutoid dengan menggunakan prosedur yang sama untuk isolasi protein 25 kDa mine-taumatin. Analisis deret dan spektrometri massa peptida CNBr yang diperoleh dari protein ini menunjukkan keidentikan dengan protein pengikat-sitrat dari lateks H. brasiliensis yang telah ditemukan deret cDNA-nya oleh Rentsch. Demikian juga deret signal ujung-N dan ujung-C tidak ditemukan lagi pada protein 25 kDa matang. Dad kajian perbandingan klon H.brasifensis yang diteliti ditemukan adanya perbedaan: protein 25 kDa mirip-taumatin antifungal hanya ditemukan pada klon yang resisten (PR261 dan RRIM600) dan tidak ditemukan pada klon yang rentan (GT1). Ditemukan pula perbedaan β-1,3--glukanase diantara klon PR261 dan GTI. Bobot molekul enzim ini pads klon GTI lebih tinggi, kemungkinan besar disebabkan oleh glikosilasi. Pada ujung-C peptida CNBr ditemukan dua deret asam amino yang berbeda diantara β-1,3-glukanase dari klon PR261 dan GTI, yaitu pada posisi 306 (Asn), dan 316 (Ser). Demikian juga aktivitas spesifik β-1,3-glukanase dari kedua klon berbeda, aktivitas spesifk dari klon GTI tiga kali lebih rendah dibandingkan klon PR261.
PATHOGENESIS-RELATED PROTEINS FROM HEVEA BRASILIENSIS MUELL ARG (ISOLATION, STRUCTURE AND FUNCTION)
Indonesia is one of the largest exporters of natural rubber next to Thailand. Efforts to increase crop production tends to be retarded by pests, especially by fungal infection. A way to overcome this problem is the application of synthetic fungicides, but to some extent they have a negative environmental impact, and even are agrochemically costly. Therefore an alternative for fungal disease control is necessary, which is more efficient and environmentally safe. A new strategy for control of fungal diseases is to transfer the resistance genes to the genome of the same or different species (transgenic plants). To isolate and identify a resistance gene, one needs information of part of the primary structure of the protein. Given the amino acid sequence, the genetic code can be used to design an oligonucleotide probe of DNA that base-pairs with the gene or cDNA coding for that sequence. So, information on a specific protein which plays a role in resistance is essential for the isolation and identification of its encoding gene. Beside that, we also
need an assay of the biological activity of a native protein to know which posttranslational modifications of the protein have occurred. Information regarding pathogenesis-related protein from Hevea brasiliensis, especially from clones of this species, which are more resistance against infection is rather incomplete. Investigations regarding pathogenesis-related proteins (PRproteins) reveal that the plant synthesizes PR-proteins when infected by pathogens. Functional PR proteins are chitinase and β-1,3-giucanase. These enzymes catalyze the hydrolysis of polysaccharides that represent major components of many fungi cell walls and therefore both enzymes have been suggested to be involved in protecting plant against fungal pathogens. Such function is supported by the absence of chitin from higher plants and indeed, chitinase and 1,3-β-glucanase can degrade isolated cell walls and have been shown to efficiently restrict growth of several fungi in vitro. Also chitinase and 1,3-β-giucanase can restrict growth of microbial pathogens in vivo (transgenic plant). This research was conducted to study. 1) isolation and identification of major proteins in the lutoid body fraction of H. brasiliensis latex, 2) structural characterization of these proteins by determination of part of the primary structure and looking for the homologies with other PR-protein of known function, 3) study of the enzymatic properties and biological activity. Besides that, to know more about the role of PR proteins in H. brasiliensis resistant clones, a comparative study of PR 261 and RRIM 600 (resistant) GTI (susceptible) and LCB 1320 (primer) clones was made. To investigate the presence of these PR- proteins, the major lutoid proteins from fresh latex were isolated and purified by means of centrifugation, freezing thawing, precipitation by using ammonium sulfate, followed by fractionation using gel filtration, anionic and cation exchange chromatography and reversed-phase HPLC. The purities of the proteins was monitored by SDS PAGE according to Laemmli. The purified proteins were identified by determination of amino acid sequences at their N-termini by Edman degradation with a sequenator or of internal peptides, which were obtained by CNBr or tryptic digestion and which were separated by reversed-phase HPLC. Isolated peptides were also investigated by mass spectrometry ESMS or MALDI TOF and amino acid analysis. The function of these proteins isolated from lutoid bodies could be predicted by comparison of their partial primary structures with those of proteins of known function in data banks. The chitinase activity of purified protein was determined according to Melchers, while the β-1,3-glucanase
activity was determined according to Kauffmann. The biological activity of the purified protein was investigated by testing in vitro the lytic affect on fungi according to Waloshuk. Five major protein in the lutoid bodies of H. brasiliensis have been identified by SDSPAGE, these are: 5 kDa (hevein), 14 kDa, 19 kDa, 29 kDa (hevamine) and 35 kDa, while two proteins of 25 kDa and 43 kDa are minor components. The protein of 19 kDa and 14 kDa could be isolated and purified simultaneously by CM-cellulose column chromatography with a linear gradient of increasing concentration of borate buffer of pH 8,9. Further studies of both proteins showed that the protein of 19 kDa is the precursor of hevein (prohevein) and the protein of 14 kDa is the C-terminal domain of prohevein. It has also been found that besides the two hevamine componen A and B a third isoform occurs which is called hevamine X and which was eluted from the column before hevamine A and B at ionic strength at 600 µMhos, while hevamine A and B elute at 1100 µMhos and 1500 µMhos, respectively. Determination of the N-terminal amino acid sequences of hevamine X showed that it is identical to hevamine A dan B, that is: Gly-Gly-IIe-Ala-Ile-Tyr:Trp-Gly-Gln-Asn however the isolectric point of hevamine X was found to be is 9.3 which is different from those of hevamine A (9.9) and B (10.5). To investigate a difference at the amino acid sequence level between hevamine X and A, fingerprint of tryptic digests of identical quantities of the two protein were made and investigated by reversed phase HPLC, followed by mass spectrometry of the isolated peptides. The result showed that the patterns of two digests are identical and all expected tryptic peptides could be identified by mass spectrometry. So the difference between hevamine A and X at the amino acid level could not be found. It may be that both hevamine components differn in e.g. Asp or Glu instead of Asn or Gln, as a result of a natural mutation or of specific deamidation. This will result in different isoelectric points, but almost identical masses. Therefore such a difference will not be detected by mass spectrometry. The cDNA sequence of hevamine has been determined by Bokma. This sequence shows that the protein is synthesized with an N-terminal signal sequence, which directs the nascent protein to the endoplasmic reticulum for excretion (-Met-SerSer-Ser-His-Val-Asp-Gly-↓Gly-Gly-Ile-Ala-Ile-TyrTrp-Gly-Gln-Asn-, signal before the ↓ symbol) and putative C-terminal vacuolar targeting signal sequence which are cleaved off in the mature protein isolated from lutoid bodies.
Incubation of hevamine with chitin as substrate showed that the three isoforms have equal chitinase specific activities. However incubation with a Micrococcus lysodeikticus cell wall preparation showed that the three isoforms hevamine have different lysozyme specific activities. The lysozyme activity of hevamine has a sharp optimum at pH 4.9, while the chitinase activity extends over a much broader range and extends from pH 4 to higher than pH 6. Lysozyme activity can be observed only at low salt concentrations, while the chitinase activity is much less dependent on salt concentration. The protein of 35 kDa has been purified by CM-cellulose column chromatography with a linear gradient of NaCl in acetate buffer of pH 5,2. Sequence analysis indicated a blocked N-terminus. After cleavage with CNBr and reversed-phase HPLC, a peptide mixture consisting of a major and a minor component was obtained. A homology search with protein sequences in data banks showed the major and minor peptides are identical with the C-terminal part and a more N-terminally located part of the cDNA derived sequence of β-1,3-glucanase of H. brasiliensis, which also show homology with sequenced PR-2 proteins (β-1,3-glucanase) from other plants. However, the result from the Electro Spray Mass Spectrometry analysis showed that 35 kDa protein has a ragged C-terminal sequence. There are several components with different variation at the Cterminal position. These are components which have Cterminal Gly, Ala, and Glu as follow: -AsnLeu-Asn-Phe-Gly↓-Ala↓-Glu↓-Lys-Asn-Trp-Asp-Ile-Ser-Thr-Glu-His-, in the ratio of about 6:1:1. Comparison of amino acid sequences of the C-terminal part with that derived from CDNA howed that the 35 kDa protein a vacuolar-lutoid protein, which is targeted to this cell organelle by a Cterminal fragment which is cleaved off postranslationally. The evidence for this process is obtained by comparing the C-terminal sequence of the protein with that derived from cDNA (boldface). The enzymatic activity of the 35 kDa protein was determined by incubation with oligo-β-1,3-glucan as a substrate, showing that it has β-1,3-glucanase activity. Further studies of biological activity in vitro, had shown that not only hevamine but also β-1,3-glucanase has an antifungal activity. Analysis of the contents of β-1,3-glucanase and hevamine in the lutoid body fraction of latex of fungal inflected H. brasiliensis showed that both proteins were synthesized 1,5 and 3 fold higher than in healthy trees. Therefore the function of hevamine and β-1,3-glucanase may be a defense of H. brasiliensis against invading pathogen.
A protein of 25 kDa has been purified from the lutoid-bodies of latex of clone PR 261 after ammonium sulfate fractionation at 50-100% saturation, followed by CMC cation exchange column chromatography with a linear gradient of NaCI in Tris-HCI buffer at pH 8,0, and by reverse phase HPLC on a nucleosil 10 C18 column with a linear gradient of 0-70% acetonitril in 0,1% CF3COOH. An anionic protein of 43 kDa has been purified by diethylaminoethyl anionic exchanger column chromatography with a linear gadient of NaCI in Tris-HCI buffer at pH 8,0, followed by Sephadex G 75 gel filtration column chromatography. Sequence analysis of the N-terminal part of the 25 kDa protein and a CNBr peptide of this protein indicated that it is homologous with the thaumatin-like antifimgal protein from Niconnia tabacum, and with other members of the family PR-5 proteins. Sequence analysis of the N-terminus of the 43 kDa protein indicated a blocked N-terminus. Alter cleavage with CNBr and reversed-phase HPLC, a peptide mixture was obtained. N-terminal sequence analysis of a short internal CNBr peptide showed that it is homologous with patatin, a protein with palmitate acylase activity from Solanum tuberosum and identical with latex allergen hev b 7, a protein isolated from the C-serum (cytoplasma) of rubber latex. In addition to the thaumatin-like protein of 25 kDa, another protein of this size was isolated from the lutoid-body fraction using a similar procedure as used to isolate the thaumatin-like protein of 25 kDa. Sequence analysis and mass spectrometry of CNBr petides obtained from this protein showed that it is identical to the citrate binding protein from latex H. brasiliensis, already sequenced as cDNA by Rentsch. But also in this protein the N-terminal signal and C-terminal vacuolar peptides targeting are not present anymore in the mature protein. There are differences between the investigated rubber clones: The antifungal thaumatin-like 25 kDa was only found in the fungal-resistant clone (PR261 and RRIM600) and not in the susceptible one GTI. There are also differences between p1,3-glucanase of clone PR261 dan GTI. The apparent molecular mass of this enzyme in clone GT I larger, Probably caused by glycosylation. In the Cterminal CNBr peptide two amino acid sequence differences were found between P-glucanases from clones PR261 and GTI at positions 306 (Asn), and 316 (Ser). Also the specific activities of the enzymes from both clones were different, with a three times lower activity of the enzyme from clone GTI than from clone PR261.
