2015 PROGRAM URČOVÁNÍ OPTIMÁLNÍ SKLIZŇOVÉ ZRALOSTI SLIVONÍ NA ZÁKLADĚ DETEKCE OBSAHU ETYLENU
RNDr. Aneta Bílková a kol. Výzkumný a šlechtitelský ústav ovocnářský Holovousy s.r.o. 1.12.2015
VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY S.R.O.
Program určování optimální zralosti PROGRAM URČOVÁNÍ OPTIMÁLNÍ SKLIZŇOVÉ ZRALOSTI SLIVONÍ NA ZÁKLADĚ DETEKCE OBSAHU ETYLENU
Autor: RNDr. Aneta Bílková a kol.
Při řešení bylo využito infrastruktury projektu CZ.1.05/2.1.00/03.0116.
Vydavatel: VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o. ISBN 978-80-87030-48-6
Obsah PODĚKOVÁNÍ ........................................................................................................................................... 3 SOUHRN................................................................................................................................................... 4 SUMMARY ............................................................................................................................................... 4 1. ÚVOD ................................................................................................................................................... 5 2. ETYLEN ................................................................................................................................................. 6 2.1. Biosyntéza etylenu ....................................................................................................................... 6 2. 2. Inhibitory etylenu ........................................................................................................................ 8 3. INTENZITA DÝCHÁNÍ ............................................................................................................................ 8 4. ZRÁNÍ A VÝVOJ OVOCE ...................................................................................................................... 10 4. 1. Slivoně a produkce etylenu jako indikátor zrání ....................................................................... 10 4. 2. Sklizňová zralost u slivoní .......................................................................................................... 11 5. PRODUKCE ETYLENU A JEHO STANOVENÍ ......................................................................................... 12 5. 1. Metodika stanovení obsahu etylenu v plodech slivoní ............................................................. 12 5. 2. Vyhodnocení produkce etylenu a CO2 ....................................................................................... 13 6. ZÁVĚR ................................................................................................................................................ 18 7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY.......................................................................................................... 20
PODĚKOVÁNÍ Tento program vznikl za pomoci projektu Ovocnářský výzkumný institut Holovousy s.r.o. (CZ.1.05/2.1.00/03.0116) v rámci Operačního programu Výzkum a vývoj pro inovace (OP VaVpI) a za využití infrastruktury Mendelovy univerzity v Brně Zahradnické fakulty v Lednici. Velké poděkování patří Prof. Ing. Janu Goliášovi DrSc. za odborné a cenné rady při vykonávání experimentální části tohoto programu.
Autorský kolektiv: VÝZKUMNÝ A ŠLECHTITELSKÝ ÚSTAV OVOCNÁŘSKÝ HOLOVOUSY s.r.o. RNDr. Aneta Bílková Ing. Lubor Zelený Ing. Pavol Suran
SOUHRN Tento program je určen především pro pěstitele, kteří pěstují slivoně pro tržní účely a chtějí stanovit přesnou sklizňovou zralost tohoto ovocného druhu, pro skladovatele ovoce a pro využití optimálních zralostních parametrů pro dlouhodobé skladování. Program je zaměřen na stanovení optimální sklizňové zralosti na základě produkce etylenu jako indikátoru zralosti a na výběr vhodných odrůd slivoní pro dlouhodobé skladování. Získané poznatky o produkci etylenu v procesu zrání ovoce přispějí k přesnému stanovení optimální sklizňové zralosti a určení přesného termínu sklizně s ohledem na dlouhodobé skladování plodů. Cílem tohoto programu bylo zjištění souvislostí mezi produkcí etylenu a dozráváním plodů slivoní. Bylo hodnoceno celkem 10 odrůd slivoní (´Amátka´, ´Čačanská najbolja´, ´Elena´, ´Hanita´, ´Presenta´, ´President´, ´Stáňa´, ´Stanley´, ´Tophit´, ´Valjevka´), jejich produkce etylenu jako produktu zrání plodů a následná detekce množství etylenu na plynovém chromatografu. Naměřené hodnoty etylenu vypovídaly o odrůdových rozdílech a různých možnostech následného využití. Určení přesného termínu sklizně na základě detekce etylenu umožní pěstitelům sklízet plody ve správnou dobu a skladovatelům naskladnit ovoce v optimálním stupni zralosti.
SUMMARY This program is designed primarily for growers who grow plums for market purposes and want to determine the exact ripeness of the harvested fruits, for the storekeepers of the stonefruit and for utilization of optimal inner fruit parameters for long-term storage. The program is aimed at determining of the optimal harvest maturity based on ethylene production as an indicator of maturity and a selection of plum varieties suitable for long term storage. Knowledge about the production of ethylene in the ripening process of fruit will help to accurately determine the optimal harvest maturity and determination of the exact date of harvest fruit with regard to long-term storage of fruits. The aim of this program was to determine the relationships between the production of ethylene and ripening of plum fruits. It was evaluated 10 varieties of plum (´Amátka´, ´Čačanská najbolja´, ´Elena´, ´Hanita´, ´Presenta´, ´Prezident´, ´Stáňa´, ´Stanley´, ´Tophit´, ´Valjevka´, their ethylene production as the product of ripening and subsequent detection of the amount of ethylene on gas chromatograph. The measured values of ethylene indicated the varietal differences and about different possibilities of next processing applications. Determining the exact date of harvest based on the detection of ethylene enable growers harvest the fruits at the correct time and warehousekeepers keep store fruits at the optimum degree of maturity.
1. ÚVOD Zrání ovoce je komplexní, geneticky naprogramovaný proces, který vrcholí finální změnou barvy, textury, chuti a aromatem dužniny. Vzhledem k ekonomickému významu ovocných plodin byly a budou tyto procesy nadále studovány jak na biochemické tak genetické úrovni. Ovoce s různými mechanismy zrání lze rozdělit do dvou skupin: klimakterický typ - zrání je doprovázeno vysokou intenzitou dýchání a současnou vysokou produkcí etylenu, neklimakterický typ ovoce - dýchání je bez dramatických změn a produkce Obr.1: Odrůda Stáňa etylenu zůstává na velmi nízké úrovni. Kromě toho bylo prokázáno, že etylen ovlivňuje transkripci a translaci mnoha genů spojených se zráním ovoce (Gray et al, 1994, Deikman 1997, Giovannoni, 2001). V klimakterických rostlinách fungují dva systémy regulace etylenu. První typ regulace se projevuje tak, že při normálním vegetativním růstu je etylen auto-inhibiční a je odpovědný za výrobu bazální hladiny etylenu, která je detekována ve všech tkáních. Oproti tomu působí regulace 2. typu, která nastává v průběhu zrání klimakterických plodů, kdy syntéza etylenu je procesem autokatalytickým. Zrání obvykle začíná v jednom místě plodu, šíří se do sousedních tkání, etylen difunduje volně od buňky k buňce a integruje proces zrání v celém plodu. Optimální sklizňová zralost plodů je charakterizována daným stupněm zralosti, ve kterém plody nemají nejvyšší chuťovou hodnotu, ale kdy lze dosáhnout jejich nejdelší uchovatelnosti, mají dostatečnou pevnost a optimální podmínky pro transport a skladování. Proto je nezbytné určit optimální dobu sklizně. Plody sklizené předčasně nebo naopak pozdě mají zhoršené kvalitativní a nutriční parametry. Proto je nezbytné pro pěstitele ale i pro konzumenty určit optimální sklizňovou zralost, která se liší podle odrůd, ale také podle klimatických podmínek.
2. ETYLEN Etylen je jednou z nejjednodušších organických molekul s biologickou aktivitou. Tento uhlovodíkový plyn, známý jako hormon indikující zrání plodů, hluboce ovlivňuje růst a vývoj rostlin. Jeho účinky zahrnují inhibici růstu, zrychlení dýchání, iniciaci zakořenění, růst listů a tvorbu pigmentů ovoce (Burg, 1962). Etylen je rostlinný hormon, jenž reguluje zrání plodů a koordinuje expresi genů, které jsou zodpovědné za různé procesy, mezi které patří: zvýšení intenzity dýchání, autokatalytická výroba etylenu, změna barvy, textury, vůně a chut plodu (Oetiker, Yang, 1995). Etylen hraje velice důležitou roli v procesu zrání ovoce. Proces zrání probíhá v plodech, jejichž růst je ukončen a které mají nízký obsah auxinů, zatímco obsah abscisové kyseliny (ABA) je vysoký nebo střední. Plod zraje od středu k povrchu. Při zrání se zvyšuje šťavnatost, barevnost i vůně plodů, což je Obr. 2: Odrůda Haganta spjato s velmi složitými procesy (Kincl, Krpeš, 2000). U dužnatých plodů dochází k poklesu obsahu kyselin a zvyšuje se množství cukrů. Zrání plodů je provázeno zvýšením intenzity dýchání, rozpadem chlorofylu a syntézou některých látek, jako jsou karotenoidy, antokyany aj. (Procházka a kol., 1998). Zrání je procesem nevratným, který je možné vnějšími podmínkami zpomalit, ale ne zastavit. Fáze klimakteria je zahájena před vzestupem respirace, v mezibuněčných prostorách plodu začíná biosyntéza etylenu. Klimakterium označuje přechod od růstových a vývojových stádií k začátku stárnutí (Goliáš, 1996). K produkci etylenu při zrání plodů dochází až do fáze plné zralosti plodů. Současně s produkcí etylenu souvisí intenzita dýchání. U klimakterických typů ovoce (dýchací cyklus se nemění v rámci změn okolní atmosféry – jablka, hrušky, švestky, meruňky, broskve…) současně dochází při dýchání ovoce k produkci etylenu a CO2. Intenzita dýchání vyjadřuje množství produkovaného CO2 nebo spotřebovaného O2 za časovou jednotku vztažené na hmotnost plodiny (Kyzlink, 1980). Kromě přirozených odrůdových rozdílů je intenzita dýchání regulována vnějšími faktory (teplotou, složením atmosféry) i vnitřními faktory (chemickým složením, strukturou pletiv, stupněm zrání).
2.1. Biosyntéza etylenu Etylen je tvořen z metioninu v metioninovém cyklu (Yangův cyklus) prostřednictvím S-adenosyl-Lmetioninu (AdoMet) a cyklické non - protein 1 – aminocyklopropan -1 -karboxylové kyseliny (ACC). ACC je tvořena AdoMet působením ACC synthásy (ACS) a konverzí ACC pomocí ACC oxidasy (ACO) vzniká etylen (Kende, 1993). Kromě ACC, ACS produkuje 5'-methylthioadenosin, který je využit pro syntézu nového metioninu prostřednictvím modifikovaného metioninového cyklu. Tato resyntéza zachovává metylthioskupinu prostřednictvím každého otočení cyklu za cenu jedné molekuly ATP. Přestože je hladina metioninu velice malá, i tak je zachována biosyntéza etylenu. Byly identifikovány dva etylenregulované geny, které mohou hrát možnou roli v metioninovém cyklu, a to E4 – putativní metionin sulfoxid reduktáza protein a ER69 – putativní kobalamin nezávislá metionin- syntáza (Montgomery et
al, 1993a; Zegzouti et al, 1999). V této dráze je dobře známo, že biosyntéza je předmětem jak pozitivní tak negativní regulace zpětné vazby (Kende, 1993). Pozitivní zpětná vazba regulace etylénové biosyntézy je charakteristickým rysem zrání ovoce a vyšších rostlin, v nichž expozice exogennímu etylenu nebo propylenu vede k velkému zvýšení produkce etylenu v důsledku indukce ACS a ACO. Oba tyto enzymy jsou kódovány malými multigenními rodinami a jejich exprese je rozdílně regulována různými faktory - vývoj, výživa, hormonální signály (Kende, 1993, Zarembinski a Theologis 1994, Barry a kol. 2000, Llop-Tous a kol. 2000). Vliv teploty na produkci etylenu je exponenciální podle vztahu: Gt = G0 exp (b . t) kde Gt je pro produkce etylenu při dané teplotě (l. kg -1 h-1), G0 je produkce etylenu při 0°C ((l. kg -1 h1 ), b je teplotní koeficient (°C -1) a t je teplota (°C). Vliv etylenu na dýchání byl zkoumán z mnoha fyziologických hledisek. Etylen indukuje zrání, odkvétání, stárnutí plodů, ztrátu chlorofylu, opadávání listů, nebo například fyziologická onemocnění jako je chladový stres. Během zrání plodu se jeho obsah zvyšuje, stejně tak činností mnohých mikroorganismů, zejména plísní. V prostředí mimo těla rostlin vzniká etylen hořením organických hmot (např. slámy, trávy), čehož se v dřívějších dobách intuitivně využívalo při následném dozrávání plodů. V atmosféře se nachází v koncentraci 1 – 5 nl/l v neznečistěných venkovských oblastech a v rozmezí 30 – 700 nl/l v městských aglomeracích, v 17 – 35 nl/l ve skladech supermarketů a 60 nl/l ve skladech a distribučních centrech. V koncentracích vyšších než 13 nl/l byl stanoven na květinových burzách a v koncentracích 0,1- 2,0 nl/l ve sklenících s balící technologií pro různé druhy ovoce (MAP obaly…)(Goliáš, 2014). Biosyntéza etylenu je ovlivněna širokou škálou ekologických podmínek, suchem, ozónem, chemickými a fyzikálnímu parametry a také rostlinnými hormony. Množství etylenu ve tkáních se mění v průběhu dne. V noci se sníží na minimum. Maximální účinnost biosyntézy nastává při teplotě v rozmezí 25 - 35 °C (Fišerová a kol., 2008).
Obr. 3: Biosyntéza a regulace biosyntézy etylenu
2. 2. Inhibitory etylenu V průběhu několika posledních let byla řešena řada přístupů k oddálení zrání ovoce, jejichž úkolem byla blokace produkce etylenu a jeho činnosti. Byla zkoumána řada anorganických a organických sloučenin, které ovlivňovaly biosyntézu etylenu nebo jeho činnost. Tyto sloučeniny měly výrazný dopad na chování zrajících plodů ovoce, zejména klimakterického typu, a to zpomalením zrání plodů (Larrigaudiere a kol., 2009). Existují dva typy inhibitorů etylenu, které se liší v předmětu inhibice. Yang a Hoffman (1984) prozkoumali první typ inhibitorů, které inhibují vznik 1 - aminocyklopropan 1 – karboxylové kyseliny, jako meziprodukt vzniku etylenu. Tyto inhibitory konkurenčně inhibují ACS (ACC synthasa) pomocí aminoethoxyvinylglycinu (AVG) a kyseliny aminoethoxyacetylové (AOA). Druhý typ inhibuje ACC oxidasovou (ACO) aktivitu, prostřednictvím kobaltnatých kationtů a aminoizomáselné kyseliny. Tyto sloučeniny inhibují produkci etylenu. Stejný účinek inhibice jako předchozí inhibitory mají také sloučeniny thiosíran stříbrný (STS) a 1 - methylcyklopropen (1-MCP). Tyto sloučeniny jsou specifickými inhibitory, které způsobují blokaci etylenových receptorů. Tímto brání tvorbě etylenu a změně procesu zrání v rostlinných pletivech (Sisler a Šerek, 1997). Tyto látky především na bázi 1 – MCP se využívají pro komerční účely jako přípravky SmartFresh, které působí antietylenovým účinkem nejen v oblasti ovocných plodin.
3. INTENZITA DÝCHÁNÍ Intenzita dýchání závisí na řadě faktorů – kromě přirozených rozdílů mezi ovocnými a zeleninovými druhy a odrůdami je regulována vnějšími faktory – teplotou, složením atmosféry, ale i vnitřními faktory – chemickým složením, strukturou pletiv, stupněm zrání a dalšími činiteli, které druhotně tyto faktory ovlivňují (Goliáš, 1996). Vyvíjející se plody dýchají během vegetace velmi intenzivně. Rychlost produkce CO2 se s vývojem plodu postupně tlumí až k určité minimální hodnotě, která se časově shoduje se závěrem růstové fáze (tzv. klimakterické minimum).
Obr. 4: Průběh dýchání plodů během vývoje a zrání (Goliáš, 1996) V období nejnižší intenzity dýchání (klimakterické minimum) je plod sklizňově zralý a vstupuje do fáze zrání, která je fyziologicky ukončena fází konzumní zralosti (klimakterické maximum). Následná fáze, v níž intenzita dýchání má stále klesající tendenci, se označuje jako stárnutí plodu (senescence). Délka
období od klimakterického minima do klimakterického maxima je závislá na teplotě plodu. Časový úsek mezi oběma charakteristickými znaky v dýchací aktivitě – tzv. klimakterium, je obdobím, které je rozmezím pro uchování plodů, zejména chladírenského skladování (Goliáš, 1996). V následující fázi vybarvování plodů, zvyšování obsahu cukrů, měknutí dužniny a tvorby vonných látek, tedy typických projevů zrání, se produkce CO2 na přechodnou dobu nápadně zvýší. Tento první příznak stárnutí nebývá zpravidla spojen s větší spotřebou kyslíku, což vede ke zvýšení respiračního kvocientu. Po dosažení tzv. klimakterického maxima, tedy maximální hodnoty intenzity dýchání, které splývá s konzumní zralostí, pak rychle následuje pokles intenzity dýchání, který je např. u hrušek mnohem větší než u jablek. Tento zlom charakterizuje úplnou fyziologickou zralost, resp. počátek přezrávání plodů, tj. období, kdy plody jsou právě nejvhodnější ke konzumaci, avšak kdy se už nehodí ke skladování při nízkých teplotách anebo v atmosféře obohacené CO2. Plody peckovin a jádrovin sbírané v klimakterickém maximu jsou plně zralé a mají skvělou organoleptickou kvalitu. Bohužel vhodnost pro skladování je značně limitována tím, že plody rychle podléhají měknutí a zvyšuje se intenzita výskytu hnilob. Proto se plody sklízí v době sklizňové zralosti, která navazuje na pomologické a chuťové zhodnocení, kdy plody vykazují optimální kvalitu pro daný ovocný druh. Pak tyto plody mají i dobré skladovací vlastnosti, u pozdních odrůd slivoní můžeme takto sbírané ovoce skladovat 1 – 2 měsíce ve skladech s modifikovanou atmosférou. Naopak pokud je ovoce sklizeno předčasně, je pravděpodobné, že bude malé, bez barvy a nebude se u něj vyvíjet plná chuťová škála. Ovoce sklizené příliš měkké je následně velice citlivé na vnitřní rozklad (Peirs, 2002). Peirs (2002) dále uvádí, že je vhodné optimální periodu sklizně stanovit přesně. Tato optimální doba sklizně pro dlouhodobé skladování odpovídá okamžiku, v kterém je aktivita dýchání minimální anebo o trochu dříve. Předpověď optimální sklizňové periody je založena na změnách několika chemických a fyzikálních faktorů před sklizní. Hlavní charakteristiky ovoce popisující správnou dobu sklizně jsou pevnost dužniny, barva slupky, komponenty chuti (obsah cukrů, kyselost) aroma (estery a alkoholy) a produkce etylenu. Ovocné plodiny jsou kategorizovány na základě jejich vlastností týkajících se zvýšené produkce etylenu a zvýšení dýchací rychlosti na počátku zrání (Barry, 2007). Ovoce s rozdílným mechanismem zrání může být rozděleno do dvou skupin (Tab. 1). : Klimakterické – jablka, banány, broskve, ve kterém je zrání doprovázeno rychlým vzrůstem intenzity dýchání za samovolného vzniku etylenu. Malé množství etylenu iniciuje klimakterický vzestup, ale nemá vliv na rychlost dýchání. Neklimakterické – citrusy, grepy, jahody, ve kterém nedochází k dramatickým změnám intenzity dýchání a produkce etylenu zůstává na velmi nízké hladině. Rychlost dýchání se vyvíjí v závislosti na koncentraci etylenu. To znamená, že rychlost dýchání vzrůstá se zvýšením koncentrace etylenu a klesá po odstranění etylenu (Alexander, Grierson, 2002, Fennema, 1996). Ale toto rozdělení nemusí být absolutní, třeba meloun může být klimakterický i neklimakterický a některé ovoce nazývané neklimakterické vykazuje zvýšené zrání v důsledku exogenního etylenu (Barry, 2007).
Klimakterický typ Jablka Meruňky Broskve Slivoně Hrušky Nektarinky Borůvky Rajčata Banány
Klasifikace ovoce podle zrání Neklimakterický typ Třešně Černý rybíz Hrozny Citrusy Jahody Asijské hrušky Papriky Maliny Pomeranče
Tab. 1: Klasifikace ovoce podle procesu zrání Neklimakterické plody jsou charakteristické lineárním poklesem intenzity dýchání během zrání, což je jejich prioritním odlišením od plodů klimakterických. Odlišují se také svojí reakcí na exogenně aplikovaný etylen. Neklimakterické plody nedávají stejný rozsah odezvy na vnější etylen ve srovnání s plody klimakterickými. Jestliže klimakterické plody reagují prakticky všemi vnějšími znaky zrání jako je měknutí pletiv, ztrátou chlorofylu, biosyntézou barevných sloučenin, odkyselováním a sládnutím, pak plody neklimakterické, jako jsou citrusy, se vyšší koncentrací etylenu odzeleňují (degreening), přičemž ostatní znaky zrání nejsou významně dotknuty.
4. ZRÁNÍ A VÝVOJ OVOCE Zrání ovoce je velice složitý a geneticky naprogramovatelný proces, který vrcholí konečným vybarvením plodu, chutí, danou texturou plodu a charakteristikou dužniny pro daný ovocný druh. Doba zrání je geneticky daná vlastnost ovoce, ovlivněná klimatickými a stanovištními podmínkami a způsobem pěstování (Dvořák, 1969). V rámci zralosti ovoce rozeznáváme zralost konzumní a sklizňovou. V době sklizňové zralosti se plody lehce oddělují od plodonoše a je dobrá odlučitelnost od pecky. Stupeň zralosti se určuje na základě senzorického hodnocení. Hodnotí se především vnější znaky plodu, jako jsou velikost, barva, vzhled, tvar, stupeň vybarvení, chuť a odlučitelnost od pecky. Mezi další hodnocené charakteristiky patří hmotnost plodů, ojínění, barva dužniny, vůně, chuť slupky, šťavnatost, aromatičnost, kyselost, velikost pecky (šířka a tloušťka) a refrakce. Hlavním indikátorem zralosti jsou texturní znaky. Jedná se o pevnost dužniny, měkkost, tvrdost. Hlavní důraz je kladen na její kvalitu, která by se neměla během transportu, zpracování a skladování porušit. Stanovení optimální sklizňové zralosti rozhoduje především o kvalitě sklizených plodů (Kader, 1999). Pokud dojde ke sklizení plodů před sklizňovou zralostí, mají plody horší senzorické vlastnosti, dochází k vyššímu výskytu fyziologických chorob. Předčasná sklizeň znamená také nižší výnos. Naproti tomu sklizeň po datu sklizňové zralosti určuje kratší dobu skladovatelnosti plodů, změny v textuře plodů, vyšší míru poškození plodů.
4. 1. Slivoně a produkce etylenu jako indikátor zrání Slivoně (angl. Plums, něm. Pflaumen) je souhrnný název pro několik pomologických skupin peckovin patřících do botanického druhu Prunus domestica a některých dalších s ním příbuzných druhů rodu Prunus. Švestky jsou u nás nejrozšířenějším pěstovaným druhem ovoce po jabloních a je považováno
za jednu z nejhodnotnějších ovocných plodin, co se týče nutričních parametrů (Blažek, 2005). Tyto plody jsou bohaté na polyfenolické komponenty, jako jsou antokyaniny, vitamin C a vláknina. Spotřeba těchto plodů je spojena s poklesem chronických degenerativních onemocnění, oběhových a trávicích problémů. Tyto účinky jsou důsledkem jejich vysoké koncentrace polyfenolických sloučenin a související antioxidační kapacity (Cook, Samman 1996, Lombardi-Boccia et al., 2004). Slivoně se pěstují pro konzum plodů v čerstvém, zmrazeném nebo usušeném stavu. Využívají se pro přípravu kompotů, marmelád, povidel, popř. koncentrátů, džusů, nektarů a na proslazování. Čerstvé plody se nejčastěji konzumují jako dezertní ovoce. Kvalitní plody nových velkoplodých odrůd obstojí jako dezertní ovoce i v konkurenci s dováženými broskvemi a nektarinkami, a na trhu v západních zemích jsou proto i cenově lépe ohodnoceny (Blažek, 2013). Naproti tomu se v posledních letech u nás snižuje podíl čerstvých plodů použitých pro kuchyňské zpracování, které bylo dříve nejvýznamnější oblastí spotřeby. Plody řady nově vybraných odrůd lze v čerstvém stavu nyní uchovávat a skladovat v nejmodernějších skladech s modifikovanou atmosférou i několik měsíců. Pěstováním těchto odrůd vhodných pro dlouhodobé skladování bude možno významně prodloužit dobu konzumu tohoto ovoce pocházejícího z tuzemské produkce. Slivoně během zrání mění zbarvení plodu ze zelené na modrou, fialovou, červenou nebo žlutou v závislosti na kultivaru. Tyto změny barev jsou důsledkem degradace chlorofylu enzymem chlorophyláza (Dangl et al., 2000), který je shodný pro každý kultivar pro tento charakteristický pigment. Na zbarvení slivoňových plodů se podílí zejména antokyany a karotenoidy. Obecně platí, že během zrání dochází ke zvyšování koncentrace antokyanů, které mění barvu plodu v rozmezí od růžové, červené, fialové až po modrou barvu ovoce, karotenoidy jsou zodpovědné za změnu zbarvení od žluté na červenou (DiazMula et al, 2008, Valero a Serrano, 2010).
4. 2. Sklizňová zralost u slivoní Sklizňová zralost se u slivoní stanovuje podle vybarvení plodů, chuti, na základě pevnosti dužniny. Pokud bychom určovali sklizňovou zralost jen podle chuti, sklízeli bychom plody až v konzumní zralosti, kdy již zpravidla špatně snášejí manipulaci a transport. U většiny odrůd je optimálním termínem pro sklizeň stupeň zralosti ve fázi přibližně 3 – 5 dní před dosažením plné zralosti. Příliš brzy sklizené plody nebývají dostatečně vybarvené, mají nízký obsah cukru a vysoký obsah škrobu a kyselin. Brzy po sklizni silně vysychají a vadnou. Naproti tomu příliš pozdě sklizené plody rychle měknou, jsou velmi citlivé na mechanické poškození, na houbové choroby a fyziologické poruchy. Sklizené plody by se měly co nejdříve zchladit. Pokud je skladujeme při pokojové teplotě, začínají produkovat etylen jako indikátor zrání a produkt dýchání, který urychluje jejich další zrání a tím i měknutí plodů. Ideální teplota pro krátkodobé skladování je mezi 1 - 2 °C. Při vyšších teplotách podléhají plody rychlé destrukci, přičemž platí přímá úměra mezi zvyšující se teplotou a počtem plodů napadaných hnilobou. Pravé švestky jsou typickým klimakterickým typem ovoce s velmi výrazným zvyšováním produkce etylenu a respirační rychlosti v průběhu zrání. Souběžný průběh v posklizňovém zrání má také biogeneze etylenu s obdobným časovým průběhem klimakterického píku. Rozsah produkce etylenu 10-80 l. kg -1 h-1 platí pouze pro pravé švestky a je 100 krát vyšší než pro plody s potlačeným klimakteriem, které jsou z rodu Prunus salicina L., (japonské švestky), vyznačující se produkcí etylenu v rozmezí desetin l. kg -1 h-1, prakticky nepostřehnutelnou při běžných měřeních.
5. PRODUKCE ETYLENU A JEHO STANOVENÍ K analýze etylenu se využívají velmi citlivé přístroje, jejichž citlivost detekce plynů je menší než 0,1 ppm. Analýza velkého počtu vzorků a detekce i jiných plynů kromě etylenu jsou základními požadavky na přístrojové vybavení pro toto stanovení. Vhodnou metodou pro takové analýzy je metoda plynové chromatografie. Nejčastěji využívanou metodou pro stanovení etylenu je plynová chromatografie s využitím detektoru FID (plamenově ionizační detektor).
5. 1. Metodika stanovení obsahu etylenu v plodech slivoní V průběhu zrání plodů slivoní byly stanoveny hodnoty produkce etylenu, který byl uvolňován přes neporušenou slupku určitého počtu plodů (0,2 kg) do volné atmosféry (uzavřená plynotěsná skleněná 1 litrová lahev) a produkce CO2 pro 10 odrůd slivoní. V pomologické laboratoři byla následně vyhodnocena také refrakce a penetrace plodů. Pro analýzu etylenu byly vybrány rané i pozdní odrůdy slivoní (´Amátka´, ´Čačanská najbolja´, ´Elena´, ´Hanita´, ´Presenta´, ´President´, ´Stáňa´, ´Stanley´, ´Tophit´, ´Valjevka´). Jednotlivé vzorky plodů slivoní pocházely z výsadeb VŠÚO Holovousy, ve kterých byly dodržovány zásady integrovaného pěstování ovoce.
Plody 10 odrůd slivoní ve sklizňové zralosti byly před první analýzou aklimatizovány po dobu 1 hodiny. Poté byly plody jednotlivých odrůd slivoní v množství 0,2 kg uloženy do hermeticky uzavřených skleněných nádob, z nichž byly odebírány vzorky atmosféry s uvolněným etylenem a CO2 (Obr. 7.) Měření etylenu a oxidu uhličitého bylo provedeno metodou plynové chromatografie na plynovém chromatografu Agilent GC 4890C, nosným plynem bylo helium (FW = 1,0 ml/min), teplota kolony byla temperována v rozmezí 80 – 120 0 C. Pro stanovení etylenu byla využita kapilární plynová chromatografie s využitím plamenově ionizačního detektoru FID (Obr. 6.). Obsah CO2 byl stanoven paralelně při stanovení etylenu metodou kapilární plynové chromatografie CGC s využitím teplotně vodivostního detektoru TCD.
Obr. 6: Plynový chromatograf Agilent 4890
Tímto paralelním stanovením obou plynů zároveň ve stejných měřících systémech bylo dosaženo přesného vyhodnocení koncentrace obou analytů.
Obr. 7: Plynotěsné nádoby naplněné plody slivoní Při vlastní analýze probíhalo měření ve 3 opakováních v několika intervalech resp. 0., 4. a 10. den po sklizni. Plody slivoní byly uloženy v plynotěsné nádobě po dobu 1 hodiny a poté byl stříkačkou odebrán objem 1 ml atmosféry, který byl následně nastříknut ručně pomocí nástřikového prostoru do kolony plynového chromatografu. Měřený vzorek byl unášen nosným plynem kolonou. Na základě vhodné stacionární fáze, kterou je naplněna kolona, došlo k separaci jednotlivých složek měřeného vzorku. Ty byly poté unášeny různou rychlostí dál nosným plynem a zachyceny v detektoru. Jako stěžejní hodnota pro stanovení zralosti plodů byla stanovena hodnota uvolněného etylenu nad G = 0,30 l. kg -1h-1. Pomocí softwaru Clarity byl vyhodnocen signál ve formě chromatografických píků, které zobrazovaly produkci etylenu a oxidu uhličitého a z časového průběhu intenzity signálu bylo určeno kvalitativní a kvantitativní zastoupení těchto dvou plynů. Refraktometrická sušina byla měřena refraktometrem ATAGO PAL – 1 v 0 Brix a pevnost dužniny penetrometrem AGROSTA®100X s indexem 1 – 99, kdy vyšší hodnoty odpovídají vyšší pevnosti plodů.
5. 2. Vyhodnocení produkce etylenu a CO2 Během uložení slivoňových plodů v plynotěsné nádobě probíhalo uvolňování etylenu a CO2 do atmosféry ve skleněné nádobě. Při první analýze v den odběru vzorků došlo k minimální produkci etylenu a zároveň CO2 . Na základě tohoto měření bylo patrné, že plody odrůd slivoní, které nevykazovaly dostatečnou produkci etylenu, nebyly dostatečně zralé a bylo by třeba u dalších vzorků těchto odrůd oddálit datum sklizně. Další měření stejných plodů bylo provedeno v časovém intervalu po 4 a po 10 dnech. Po 4 dnech skladovaných plodů v nádobách už nastávala produkce etylenu, ale i CO2 jako produktu aerobního dýchání ovoce. Hodnoty naměřených analytů se mezi vybranými odrůdami lišily. Stěžejní hodnota pro pozitivní detekci etylenu byla stanovena na hodnotu G = 0,30 l. kg -1 h-1. Hodnoty vyšší než 0,30 l. kg -1 -1 h byly brány jako průkazné pro zralost plodů a jsou v Tabulce 2 označeny žlutě. V Tabulce 2 je znázorněno hodnocení produkce etylenu podle data sklizně. Stejným způsobem byla hodnocena produkce etylenu v atmosféře po 10 dnech skladování. Kvalitativní a kvantitativní vyhodnocení produkce probíhalo pomocí datového softwaru Clarity, jehož výstupem byl chromatogram znázorňující vybrané analyty ve formě chromatografických píků (zón). (Obr. 8, 9, 10).
Obr. 8: Záznam z programu Clarity při analýze etylenu
etylen
CO2
Obr. 9: Záznam výstupu z datového programu Clarity pro vyhodnocení dat
etylen CO2
Obr. 10: Signál detekce etylenu a oxidu uhličitého na reálném vzorku slivoně ´Stanley´ Produkce CO2, který se uvolňuje přes slupku plodu, odráží intenzitu aerobního dýchání ze zásobních metabolitů (sacharidů a organických kyselin) (Bolzoni, 1990). Produkce etylenu je biochemicky propojena s přeměnou aminokyseliny metioninu.
Produkce etylenu G (l.kg -1h -1)
ODRŮDA
TYP ODRŮDY
0. den
4. den
´Amátka´
0,191
´Stáňa´
velmi raná až raná středně raná
´Stanley´ ´Čačanská najbolja´ ´Hanita´
Produkce oxidu uhličitého R (mg CO2 .kg -1h -1)
0. den
4. den
61,12
10. den 104,74
128,63
62,16
10. den 110,24
0,062
0,242
0,328
42,39
36,2
41,74
raná
0,547
32,15
80,68
46,96
46,53
55,01
raná
0,06
0,179
8,37
63,35
27,04
28,37
středně raná
0,24
13,36
22,44
62,72
66,32
64,07
´Valjevka´
pozdní
0,129
0,211
0,608
64,74
43,64
71,22
´President´
pozdní
0,159
-
5,332
66,07
-
48,79
´Elena´
pozdní
1,82
-
32,59
77,1
-
57,49
´Tophit´
pozdní
0,409
-
2,64
71,29
-
50,53
´Presenta´
pozdní
8,32
-
12,53
89,03
-
37,86
Tab. 2.: Hodnocení produkce etylenu a CO2 u jednotlivých odrůd slivoní
Z Tabulky 2 je patrné, že u 6 odrůd probíhalo měření v den sklizně plodů (0. den), po 4 dnech a po 10 dnech, kdy byly plody uskladněny v PVC sáčcích, aby pro měření byly využity stále stejné plody. Jednalo se o odrůdy: ´Amátka´, ´Stáňa´, ´Stanley´, ´Čačanská najbolja´, ´Hanita´, ´Valjevka´. Ostatní vybrané odrůdy (´President´, ´Elena´, ´Tophit´ a ´Presenta´) byly měřeny pouze v den odběru vzorku plodů a 10. den po odběru. Měření 4. den po odběru vzorků bylo vynecháno z hlediska naměřených nízkých hodnot etylenu v den odběru vzorků. Ale i přesto naměřené hodnoty signalizovaly, že byly plody sklizeny v době optimální zralosti. Z výsledků měření je patrné, že odrůda ´Amátka´ byla v optimální zralosti o 4 dny později než termín sklizně, který byl určen na základě senzorického hodnocení. Srovnatelné zjištění bylo pozorováno i u odrůdy ´Hanita´. U odrůd ´Stáňa´, ´Čačanská najbolja´, ´Valjevka´ a ´President´ byla optimální zralost posunuta o 10 dnů později, než byly plody sklizeny na základě senzorického hodnocení. Raná odrůda ´Stanley´ a pozdní odrůdy ´Elena´, ´Tophit´ a ´Presenta´ produkovaly etylen již v den odběru vzorku. Bylo tedy možné usoudit, že tyto plody odrůd byly sklizeny již v době sklizňové zralosti a postupně se budou hodnoty produkce etylenu zvyšovat. Pokud dochází k produkci etylenu a jeho hodnota nepřekračuje hranici 100 l.kg/h, můžeme plod označit jako optimálně zralý, pokud hodnoty etylenu jsou příliš vysoké, označujeme tento stupeň jako přezrálý. Ovšem platí, že dané měření koreluje i s pomologickým hodnocením chuti, barvy, pevnosti. Zároveň se stanovením koncentrace etylenu bylo měřeno množství uvolňovaného CO2, které ukazovalo na fyziologickou aktivitu dužnatého plodu. Jak uvádí Tabulka 2 a Graf 1, byl zjištěn významný rozdíl v produkci CO2 mezi jednotlivými odrůdami. Odrůdy ´Stáňa´ (42,39 mg CO2 .kg -1h -1) a ´Stanley´ (46,96 mg CO2 .kg -1h -1) - s nízkou produkcí CO2 v porovnání se skupinou odrůd ´Amátka´ (128,63 mg CO2 .kg -1h -1), ´Elena´ (77,1 mg CO2 .kg -1h -1), ´Tophit´ (71,29 mg CO2 .kg -1h -1) a ´Presenta´ (89,03 mg CO2 .kg -1h -1) s vyšší produkcí CO2. Ostatní odrůdy - ´Čačanská najbolja´, ´Hanita´, ´Valjevka´ a ´President´ vykazovaly průměrné hodnoty produkce oxidu uhličitého v rozmezí 62 - 66 mg CO2 .kg-1h-1. Dýchání pletiva vyjádřené produkcí CO2 kg -1h -1, je podobné etylenové produkci, nicméně vytvoření píku, jako odezva detekce oxidu uhličitého, není natolik výrazná jako pro etylen.
71,22 64,74
Valjevka 50,53
Tophit
71,29 55,01 46,96 41,74 42,39 48,79 66,07 37,86
Stanley Stáňa President Presenta
89,03
64,07 62,72 57,49 77,1
Hanita Elena Čačanská…
28,37
63,35 110,24
Amátka 0 20 40 60 80 100 Produkce oxidu uhličitého R (mg CO2 .kg -1h -1) 10. den
120 0. den
Graf 1: Produkce oxidu uhličitého u jednotlivých odrůd slivoní
128,63 140
Hodnoty penetrace plodů jsou obecně odlišné v závislosti na odrůdě slivoní. U všech sledovaných odrůd byly zjištěny výrazné rozdíly mezi odrůdami (Graf 2). Nejvyšší hodnoty pevnosti plodu byly zjištěny u odrůd ´Stanley´ (index 85,9), ´Valjevka´ (index 78,5), ´Amátka´ (index 70,3) a odrůda ´Stáňa´ (index 70,1). Odrůdy ´Čačanská najbolja´, ´Elena´, ´Hanita´, ´Presenta´ vykazovaly podobné hodnoty pevnosti plodu, průměrná hodnota byla 60,25. Naopak plody s nejmenší pevností byly zjištěny u odrůdy ´President´ (index 51) a odrůdy ´Tophit´ (index 38,4). Významné odrůdové rozdíly byly prokazatelné i při měření refrakce plodů. Existují odrůdy s vyšším obsahem rozpustné sušiny, konktrétně se jedná o odrůdy ´Elena´, ´Presenta´, ´President´. Odrůdy ´Amátka´, ´Čačanská najbolja´, ´Hanita´, ´Stáňa´, ´Stanley´ a ´Tophit´ vykazovaly průměrně hodnotu refraktometrické sušiny 16,03 0 Brix. Nejnižší cukernatost byla zjištěna u odrůdy ´Valjevka´ (14,9 0 Brix) (Graf 2). I přesto, že pevnost plodů u odrůd ´Čačanská najbolja´, ´Elena´ , ´President´ byla poměrně nízká (v rozmezí index 50 - 60), tak na základě měření uvolněného etylenu bylo možné říci, že plody byly na počátku sklizňové zralosti, jak ukazuje Tab. 2. Pro přesně určení sklizňové zralosti je tedy vhodné doplnit senzorické, refraktometrické nebo i penetrometrické stanovení o měření produkce etylenu.
100 85,9
90 80
78,5 70,3
70,1
70 57,8
60
57,6
63
62,6
51
50 38,4
40 30 20
16,7
16,1
21,4 15,6
22,7
18,8
15,6
15,2
17
10 0
Refrakce (0 Brix )
Penetrace (index 1- 99)
Graf 2: Hodnoty refrakce a penetrace u jednotlivých odrůd slivoní
14,9
6. ZÁVĚR Jak je uvedeno výše, etylen je přirozeně se syntetizující rostlinný hormon, který hraje klíčovou roli v iniciaci zrání a během pozdějších fází zrání ovoce (Watkins, 2003). Jde o látku přirozeně produkovanou rostlinným pletivem v průběhu dozrávání nebo růstu. Tyto změny vedou k rozvoji charakteristických vlastností jako je chuť, textura, aroma pro dané odrůdy, které tvoří optimální kvalitu tohoto ovoce (Weatherspoon et al., 2005). Během dozrávání plodů dochází ke změně velikosti, barvy a texturních znaků, což je doprovázeno produkcí etylenu. Během produkce etylenu dochází zároveň také k produkci CO2, což značí aktivní dýchání a vývoj nezralého plodu v konzumně zralý plod. Na základě jednoletých výsledků stanovení těchto dvou plynů můžeme stanovit odrůdovou odlišnost v produkci etylenu a CO2, zralost plodů a vhodnost jednotlivých odrůd švestek pro skladování. Měřením množství uvolněného etylenu a CO2 lze přesně stanovit technologickou, sklizňovou nebo i konzumní zralost plodů. Pokud sklidíme plod před sklizňovou zralostí, produkce etylenu a CO2 je neměřitelná a plody jsou sklizňově nezralé, což dokumentují hodnoty v Tabulce 1. Plody s dostatečnou produkcí etylenu (hodnoty uvolněného etylenu jsou přijatelné v korelaci se senzorickým hodnocením), které dosáhly požadované kvalitativní parametry (hmotnost, barva, chuť, pevnost dužniny, obsah refraktometrické sušiny) jsou v technologické zralosti. Plody mají dostatečnou pevnost, aby snesly různé zpracovatelské operace, aniž by se tím narušila celistvost plodů nebo se příliš snížila původní konzistence čerstvého ovoce. Určení sklizňové zralosti bývá stěžejní hlavně pro plody určené ke skladování. V průběhu skladování v klimakterických plodech probíhají nadále fyziologické procesy dozrávání. Z toho důvodu je vhodnější pro dlouhodobé skladování použít plody v období sklizňové zralosti. Měřením hodnot etylenu v průběhu skladování lze indikovat vhodnou dobu vyskladnění ovoce, tak aby nedošlo k přezrání plodů. Z hlediska správnosti určení termínu sklizně podle produkce etylenu je nejvhodnější dobou pro sklizeň ovoce fáze klimakterického minima v závislosti na předpokládaném využití ovoce. V tomto období nejnižší respirace je plod sklizňově zralý. Hodnoty uvolněného etylenu jsou detekovatelné. Během dozrávání ovoce (fáze klimakteria) dochází k nárůstu syntézy etylenu v plodech a zároveň ke zvýšenému uvolňování etylenu. V tomto období jsou hodnoty etylenu měřitelné a postupně se zvyšují, což je indikátorem dosažení konzumní zralosti (fáze klimakterické maximum). Po této fázi dochází již k přezrávání plodů (senescence) a prakticky nedochází k dalšímu vylučování etylenu. Přesná doba sklizně se určuje souběžně s hodnocením kvalitativních znaků plodů, kterými jsou hmotnost, vybarvení slupky a dužniny, pevnost dužniny, obsah refraktometrické sušiny a chuť. Podle Watkinse (2003) se etylen používá jako rozhodující faktor pro určování sklizně klimakterických ovocných plodin, a to zejména jablek. Pro stanovení doby sklizně je důležité zohlednit i jiné činitele, jako jsou stanovištní podmínky, organizace výsadeb, kultivar a vegetační období (Vendrell a Larrigadiere, 1997, Watkins, 2003). Vzhledem k této skutečnosti je potřeba při predikci sklizňové zralosti pro optimální kvalitu ovoce brát zřetel na tyto činitele. Na základě naměřených hodnot etylenu jsou vidět odrůdové rozdíly mezí produkcí etylenu, která je z velké části daná geneticky, ale i ostatními klimatickými podmínkami, jak je patrné z Tabulky 1. Pomologické dělení odrůd podle doby zrání na rané a pozdní koresponduje s produkcí etylenu. Hladina etylenu se u raných odrůd švestek zvyšuje dříve než u pozdních odrůd. I ve skupině raných a pozdních odrůd jsou patrné odrůdové rozdíly v produkci etylenu. Pro každou odrůdu je charakteristické uvolňování etylenu, ale i produkce CO2, jehož hodnota souvisí s aktivním dýcháním plodu a na základě souběžného stanovení s etylenem můžeme rozdělit partie plodů na vhodné pro dlouhodobé
skladování, pro konzumní použití nebo pro zpracování. Odrůdy s malou intenzitou dýchání, které jsou vhodné pro dlouhodobé skladování, patří do skupiny pozdních odrůd. Jmenovitě jsou to odrůdy ´President´, ´Elena´, ´Presenta´, ´Tophit´. Rané odrůdy nejsou vhodné pro dlouhodobé skladování z důvodu rychlého měknutí dužniny způsobeného rychlým vylučováním etylenu do okolní atmosféry. Tyto odrůdy jsou využitelné pro konzum a pro různé způsoby zpracování. Správné predikce sklizňové zralosti umožní pěstitelům dobře plánovat sklizeň a uvádění plodů na trh se správnou kvalitativní hodnotou. Proto, aby bylo zajištěno optimální kvality, je potřeba přesně stanovit markery zralosti, které pomohou určit přesně stádium zralosti ovoce (Abdi, et al., 1997). Vzhledem k časové i finanční náročnosti určování produkce etylenu je určování zralosti uvedenou metodou vhodné především pro pěstitele s vysokou produkcí a pro skladovatele plodů slivoní.
7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ABDI, N., HOLFORD, P., McGLASSON, W. B., MIZRAHI, Y. 1997. Ripening behaviour and responses to propylene in four cultivars of Japanese type plums., Postharvest. Biol. Technol. 12, 21–34. ALEXANDER, L., GRIERSON, D. Ethylene biosynthesis and action in tomato : a model for climacteric fruit ripening. Journal of Experimental Botany [online]. 2002, vol. 53, no. 377 [cit. 2007-04-24], s. 2039-2055. Dostupný z WWW:
KENDE, H. 1993. Ethylene biosynthesis. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 44, 283–307. KINCL, M., KRPEŠ, V. 2000. Základy fyziologie rostlin. Montanex, Ostrava, 221 s. ISBN 80-7225-041-8. KYZLINK, V. 1980. Základy konzervace potravin. Státní nakladatelství technické literatury, Praha, 516s. LIOP-TOUS, I., BARRY, C. S, GRIERSON, D. 2000. Regulation of ethylene biosynthesis in response to pollination in tomato flowers., Plant Physiology 123, 971–978. LOMBARDI-BOCCIA, G., LUCARINI, M., LANZI, S., AGUZZI, A., CAPPELLONI, M. 2004. Nutrients And antioxidant molecules in yellow plums (Prunus domestica L.) from conventional and organic productions and comparative study, Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52, 90–94. MONTGOMERY, J., GOLDMAN, S., DEIKMAN, J., MARGOSSIAN, L., FISCHER, R. L. 1993. Identification of an ethylene-responsive region in the promoter of a fruit ripening gene. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA vol. 90, 5939–5943. PEIRS, A., et al. 2002. Uncertainty analysis and modelling of the starch index during apple fruit maturation. Postharvest Biology and Technology [online]., no. 26 [cit. 2009-02- 68 15], s. 199-207. PROCHÁZKA, S., et. al. 1998. Fyziologie rostlin. Academia, Praha, 484 s. ISBN 80- 200-0586-2. RATO, A. E., 2003. Ethylene Production and Respiration Rate in 'Green Gage' Plums (Prunus domestica L.). SISLER, E. C., SEREK, M. 1997. Inhibition of ethylene responses in plants at the receptor level: Recent developments, Physiol. Plant, 577–582. VALERO, D., SERRANO, M. Fruit ripening. In: Postharvest Biology and Technology for Preserving Fruit Quality. Edited by Valero D, Serrano M. Boca Raton. CRC Press-Taylor & Francis., 2010. 7-47. VENDRELL, M., LARRIGADIERE, C. 1997. Effect of cold storage on ethylene biosynthesis capacity of ‘Granny Smith’ apples, 135-144. http://ressources.ciheam.org YANG, S. F., HOFFMAN, N. E. 1984. Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants., Annu. Rev. Plant Physiol. 35, 155–89. ZAREMBINSKI, T.I, THEOLOGIS A. 1994. Ethylene biosynthesis and action: a case of conservation., Plant Molecular Biology 26, 1579–1597. ZEGZOUTI, H., JONES, B., FRASSE, P., MARTY, C., MAITRE, B., LATCHE, A., PECH, J.C., BOUZAYEN, M. 1999. Ethylene-regulated gene expression in tomato fruit: characterization of novel ethyleneresponsive and ripening-related genes isolated by differential display., The Plant Journal 18, 589–600.
