Proefschrift_Katrijn_v10.indd :32

Proefschrift_Katrijn_v10.indd 172

23-10-12 20:32

0 1 Chapter 10

Summary and future perspectives


23-10-12 20:32

In this thesis we evaluated the involvement of insulin and IGF-I in the development of cardiovascular disease. Chapter 1 provides a general introduction on insulin and IGF-I. Both these hormones originate from a common ancestral precursor, which is nowadays reflected by the fact that these hormones still show structural similarities, and that their receptors share the same signal transduction pathways. However, the functions of these hormones have diverged over time with insulin predominantly influencing metabolism, and IGF-I growth and development. Whether insulin and IGF-I play a role in the development of cardiovascular disease is largely unknown and this question is further explored in this thesis. The first part of this thesis focuses on the role of insulin in the development of cardiovascular disease. Chapter 2 reviews the literature on clinical trials, population based studies and experimental studies pointing towards the hypothesis that high doses of insulin increase cardiovascular risk in patients with type 2 diabetes. Large-scale intervention trials have failed to show beneficial effects of strict glycemic control (target HbA1c < 48mmol/mol) on cardiovascular outcomes in patients with type 2 diabetes. The ACCORD trial even reported increased (cardiovascular) mortality among intensively treated patients. While the reason for this increased mortality rate remains unclear, it can be speculated that high doses of insulin that were administered to achieve low HbA1c levels, could be responsible for this unexpected outcome. Interestingly, in population based studies, both endogenous and exogenous insulin have been positively associated with cardiovascular disease. Additionally, a wide array of in vitro experiments has demonstrated that insulin has pro-atherosclerotic properties, like increasing adhesion molecule expression on endothelial cells, facilitating transendothelial migration of monocytes, increasing smooth muscle cell proliferation and stimulating metalloproteinase expression by macrophages. Although direct evidence for a pro-atherosclerotic role of insulin in vivo is lacking, we concluded that insulin has the potential to activate atherosclerotic processes within the vessel wall, and that this needs further exploration. In chapter 3 we evaluated whether the degree of exogenous insulin exposure in patients with type 2 diabetes is associated with risk of cardiovascular events. To this end, we performed a nested case-control study among new users of oral glucose lowering drugs, using the PHARMO Institute for Drug Outcomes Research database. Mean daily insulin exposure was calculated in 2,338 cases with a cardiovascular event and in 4,407 controls, who remained free of a cardiovascular event. Interestingly, patients within the highest tertile of daily insulin exposure had a 44% higher cardiovascular risk, whereas patients within the lowest tertile of daily insulin exposure had a 52% lower cardiovascular risk, compared to patients not using insulin. These data imply that high doses of exogenous insulin in patients with type 2 diabetes 174


23-10-12 20:32


might have adverse effects on the development or progression of atherosclerosis. However, whether high insulin exposure has a causal role in increasing cardiovascular risk remains unclear from these data. Therefore, in the following chapters of part I we tried to elucidate through which mechanism insulin could increase cardiovascular risk, using in vitro, ex vivo and in vivo experimental designs.

In chapter 5 we demonstrate that insulin can also be expected to increase angiogenesis within adenocarcinomas. We found that the endothelium of microvessels in tumoral stroma of breast, colon, pancreas, lung and kidney carcinomas stained consistently and strongly positive for the insulin receptor, as measured by double immunohistochemistry techniques. The microvasculature of surrounding non-tumoral stroma and parenchymal tissue showed reduced or absent insulin receptor staining. Hence, comparable to atherosclerotic plaques, insulin receptors also showed a specific distribution pattern on endothelial cells within human adenocarcinomas. This implies that insulin might also be involved in stimulating tumor angiogenesis and subsequent tumor progression. Because especially the insulin analogue glargine has been associated with the progression of adenocarcinomas in the literature, we next examined the angiogenic potential of distinctive insulin analogues in vitro. All four tested insulin analogues increased capillary-like tube formation significantly, suggesting that insulin glargine is not an exclusive candidate for stimulating angiogenesis.

Chapter 10

One of our hypotheses was that insulin might increase atherosclerotic plaque vulnerability by enhancing intra-plaque angiogenesis. In chapter 4 we provide data that support this hypothesis. Using an in vitro angiogenesis assay, we showed that insulin enhances capillary-like tube formation of human microvascular endothelial cells. Furthermore, we demonstrated that insulin receptors are highly expressed on endothelial cells of small nascent microvessels, but not on larger, more mature microvessels, within human atherosclerotic plaques. This specific distribution pattern for the insulin receptor, as measured by immunohistochemistry, suggests that insulin signalling might be involved in outgrowth of microvessels within human atherosclerotic plaque. When we subsequently analysed microvessel density in atherosclerotic plaques of 165 patients with type 2 diabetes, we found that microvessel density tended to be higher among those patients using insulin as compared to those not using insulin. Collectively, these results imply that insulin may promote angiogenesis within atherosclerotic plaques.

In chapter 6 we show that insulin can directly elicit features of atherosclerotic plaque instability in vivo, irrespective of systemic effects of insulin on metabolism. Although exogenous insulin use has been associated with increased cardiovascular risk in population studies, it remains unknown whether insulin has a causal role in stimulating the atherosclerotic process. One of the problems with observational studies is indication bias, i.e. patients for whom insulin is prescribed are generally the patients with more severe insulin resistance and beta-cell failure. This may lead to confounding by disease severity. A second hurdle in studying the 175


23-10-12 20:32

pro-atherosclerotic properties of insulin in vivo, is that insulin has systemic effects on lipid metabolism and weight, which both can affect cardiovascular risk as well. In order to overcome these confounding factors we used an in vivo model in which the direct effects of insulin on the progression of atherosclerosis could be studied. Atherosclerosis was induced in LDLr KO mice by collar placement around the carotid arteries. Thus formed atherosclerotic lesions were focally treated with pluronic gel containing insulin or PBS. While insulin treatment of atherosclerotic plaques did not cause systemic effects, we observed a 33% reduction of intra-plaque collagen content and a 50% increase in activated perivascular mast cells in mice that were treated with insulin compared with control mice. In vitro experiments subsequently revealed that the reduced collagen content may be due to complex effects of insulin on collagen homeostasis in the plaque, possibly in part mediated by its effects on resident mast cells. Stimulation of the insulin receptor with insulin leads to activation of two downstream signalling pathways. One of these pathways, the PI3K pathway, is defective during insulin resistance. In order to study the role of insulin resistance in the development and progression of atherosclerosis in vivo, an animal model in which both atherosclerosis and defective PI3K signalling are present, could be of great value. In chapter 7 we therefore characterized the phenotype of LDLr KO mice in which Akt2 (a kinase of PI3K signalling) is lacking. We found that these so called Akt2/LDLr dKO mice develop insulin resistance, as reflected by raised glucose and insulin levels, and impaired glucose tolerance testing. Atherosclerotic plaques of these mice were significantly smaller compared with LDLr KO controls. However, plaque composition of Akt2/LDLr dKO mice was more complex, showing reduced collagen content, larger necrotic cores and increased apoptosis, while ASMA staining in the media layer was decreased. In vitro experiments additionally showed that vascular smooth muscle cells together with macrophages are likely to play a central role in disturbing collagen homeostasis within atherosclerotic plaques. Taken together, these data imply that Akt2/LDLr dKO mice can serve as an attractive mouse model to study the effects of insulin resistance on the development and progression of atherosclerosis. The second part of this thesis focuses on the role of IGF-I in the development of cardiovascular disease. Low circulating IGF-I levels in adulthood have been associated with increased risk of cardiovascular disease. In this context, an extremely low IGF-I status from childhood onwards might be expected to contribute to premature atherosclerosis and impaired cardiac function in early adulthood. Against this background, we evaluated, in chapter 8, cardiovascular disease profile in a 27 year old patient with extreme low IGF-I levels due to a homozygous IGFALS gene mutation. Besides a mild insulin resistance and lipid disturbances, we did not find any manifestation of subclinical cardiovascular disease, as measured by 64-slice coronary CT scanning, three dimensional-echocardiography and tissue deformation imaging of the heart. 176


23-10-12 20:32


These results suggest that low circulating IGF-I status, due to an IGFALS mutation, is not necessarily accompanied by increased cardiovascular risk. To further substantiate the findings in this case report, chapter 9 shows the results of a nested case control-study within the EPIC-Norfolk cohort. Among 1,013 cases with coronary artery disease and 2,055 matched controls, we studied the association between circulating IGF-I and IGFBP-3 levels, genetic variation at the loci encoding these proteins, and risk of cardiovascular disease. After adjustment for cardiovascular risk factors, we found no association between circulating IGF-I and IGFBP-3 levels and risk of coronary artery disease. We identified three tagging single nucleotide polymorphysms (tSNPs) that showed independent association with either circulating IGF-I or IGFBP-3 levels. Finally, in an assessment of 31 SNPs spanning the IGF1 or IGFBP3 loci, none were associated with coronary artery disease in a meta-analysis that included EPIC-Norfolk and eight additional studies comprising up to 9,319 cases and 19,964 controls. Together, these results indicate that IGF-I and IGFBP-3 are unlikely to be involved in the aetiology of coronary artery disease in humans.

F uture perspectives

In chapter 3, we show that high daily insulin exposure in patients with type 2 diabetes is associated with increased cardiovascular risk. Given the limitations of observational studies, we cannot plainly assume that this association has a causal basis. Therefore, the hypothesis that insulin is pro-atherogenic should ideally be tested in the setting of a randomised clinical trial. The ORIGIN Trial investigators recently reported on such a trial, in which patients with insulin resistance or type 2 diabetes were randomised to insulin glargine or standard care. In this trial, early use of insulin did not affect cardiovascular outcomes as compared to standard care.1 When interpreting the results of this trial, it should be taken into account that the studied population consisted of patients with mild diabetes or pre-diabetes, that insulin doses were rather low (28 units/day in a 70kg person), and that median HbA1c levels during the trial were equal to or below 48 mmol/mol (6.5%). Repeating this trial in another study population might lead to different results. Since it seems that strict glycemic control may especially lead to increased (cardiovascular) mortality in patients that are older, have longer duration of diabetes and have concomitant macrovascular disease2-4, it would be interesting to assess whether avoidance of high insulin doses in patients with persisting high HbA1c levels and a history of macrovascular disease may reduce cardiovascular risk.

Chapter 10

Insulin

In chapters 4, 5, 6 and 7 we searched for mechanisms that could explain the relationship between insulin and progression of atherosclerosis. In figure 1 an overview of proposed mechanisms, based on in vitro, ex vivo, and in vivo experiments conducted in this thesis, 177


23-10-12 20:32

Figure 1

is presented. We believe that insulin may increase atherosclerotic plaque vulnerability by increasing intra-plaque angiogenesis (chapter 4) and by disturbing collagen homeostasis (chapter 6 and 7). Vascular smooth muscle cells and macrophages probably contribute to the latter process by increasing metalloproteinase (MMP) expression, resulting in increased collagen breakdown (chapter 6 and 7). Additionally, activated mast cells may increase inflammation by secreting Il-6 and TNF-α. It should be emphasized that this proposed mechanism requires confirmation by further research. The concept that insulin might contribute to intra-plaque angiogenesis should be further explored in-vivo. Unfortunately, in most atherosclerotic animal models (including mice) intra-plaque microvessels are scarce. 5 Indeed, we did not observe microvessels in the atherosclerotic plaques of mice that were treated with insulin or PBS in chapter 6. Consequently, larger experimental models of atherosclerosis, like hypercholesteraemic pigs or balloon injured dogs, in which microvessels are more frequently encountered, are required to study the effects of insulin on intraplaque angiogenesis in vivo. Interestingly, because imaging modalities for real time imaging of human plaque angiogenesis are improving6, it may become also feasible in the future to study the effects of insulin on intraplaque angiogenesis directly in humans by using a prospective study design. Such studies should not only focus on the 178


23-10-12 20:32


association between insulin and intra-plaque angiogenesis, but also on the association with cardiovascular outcome. Collagen is an important contributor to atherosclerotic plaque stability. Impaired collagen synthesis and accelerated collagen breakdown cause thinning of the fibrous cap, which makes the plaque more prone to rupture. Our finding that insulin decreases collagen content within atherosclerotic plaques of LDLr KO mice therefore supports the hypothesis that insulin increases cardiovascular risk, but also requires further exploration. Above all, the mechanism through which insulin decreases collagen content should be elucidated. We propose that insulin may contribute to collagen degradation by activating MMPs, since we found that insulin increases MMP mRNA expression of vascular smooth muscle cells and macrophages in vitro. Future research should address whether MMP mRNA and protein levels are also increased in insulin treated atherosclerotic plaques in vivo. With the advent of targeted imaging markers, future clinical studies might address the MMP-activity within advanced plaque in diabetic patients using PET-MMP tracers. Additionally, the role of mast cells in this process needs to be investigated, for instance by using mice that are treated with a mast cell stabilizer, like cromoglicid acid.

Taken together, the studies presented in the first part of this thesis support the hypothesis that insulin has pro-atherosclerotic potential. This raises the question whether clinicians should be cautious when prescribing insulin to their patients with type 2 diabetes, particularly those with marked insulin resistance and overt atherosclerotic disease. It is beyond dispute that exogenous insulin has significantly improved life expectancy in patients with type 2 diabetes and therefore this drug is indispensible for many diabetic patients. However, based on our results, and the results of large clinical trials, including ACCORD2 and UKPDS3, we feel that insulin dosages should not be excessively increased at all costs in order to achieve HbA1c levels of below 53mmol/mol (7%). Especially patients with longer duration of diabetes and concomitant cardiovascular disease might benefit from lower insulin dosages with respect to cardiovascular outcome, still randomised clinical trials are awaited to prove this opinion. In this respect, it should also be investigated whether addition of insulin sensitizing/insulin sparing compounds, such as the recently introduced GLP-1 analogues and DPP-4 inhibitors, will decrease insulin need and improve cardiovascular outcome.

Chapter 10

As outlined in chapter 2, we hypothesized that insulin might exert its pro-atherosclerotic properties especially during conditions of insulin resistance, when the PI3K pathway is impaired. The Akt2/LDLr dKO mouse model, as presented in chapter 7, might therefore provide an interesting model to study the direct effects of insulin on atherosclerotic plaque progression during insulin resistance in vivo. To this end, it would be interesting to focally treat atherosclerotic plaques of these mice with pluronic gel containing insulin or PBS and subsequently study features of plaque instability.

179


23-10-12 20:32

IGF-I According to the results presented in chapter 8 and 9, circulating IGF-I and IGFBP-3 levels are not likely to be causally involved in ischemic heart disease. These findings are in line with other prospective studies that found no association between IGF-I, IGFBP-3 and ischemic heart disease7-11, but in contrast with studies that did find a negative or positive association.7,11-16 These divergent findings across studies may be due to heterogeneity in phenotype, age and sex of participants, heterogeneity among IGF-I and IGFBP-3 immuno-assays, and pleiotropic effects of these proteins that may result in different actions in different contexts. However, since we did not find an association between common SNPs at the IGF1 and IGFBP3 loci and cardiovascular risk, we are inclined to believe that IGF-I and IGFBP-3 are not causally involved in the development of cardiovascular disease. On the other hand, this does not exclude that locally secreted IGF-I can not be engaged in prognosis after cardiac ischemia. Paracrine/autocrine IGF-I in the heart may play an important role in this process, since IGF-I overexpression within hearts protects against apoptosis and ventricular dilatation after infarction, and local IGF-I therapy in the heart improves myocardial function after cardiac ischemia in animal models.17-19 Therefore, we believe that future studies should focus on the contribution of paracrine/autocrine produced IGF-I in the heart on repair mechanisms after cardiac ischemia. In this context it might be interesting to measure IGF-I levels in blood samples taken from occluded arteries during acute coronary syndrome and correlate this to cardiac performance. Additionally, enrichment of the ischemic environment with target liposomes loaded with IGF-1/IGF BP-3 complex may lead to beneficial healing conditions of the heart. In conclusion, we believe that circulating IGF-I and IGFBP-3 levels are not causally involved in the development of cardiovascular disease. However, the role of paracrine/autocrine secreted IGF-I in cardiac repair mechanisms after myocardial infarction needs further exploration.

180


23-10-12 20:32


Reference L ist

Chapter 10

(1) The ORIGIN Trial Investigators. Basal Insulin and Cardiovascular and Other Outcomes in Dysglycemia. N Engl J Med 2012. (2) Gerstein HC, Miller ME, Byington RP et al. Effects of intensive glucose lowering in type 2 diabetes. N Engl J Med 2008;358:2545-2559. (3) Holman RR, Paul SK, Bethel MA, Matthews DR, Neil HA. 10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N Engl J Med 2008;359:1577-1589. (4) Ismail-Beigi F, Moghissi E, Tiktin M, Hirsch IB, Inzucchi SE, Genuth S. Individualizing glycemic targets in type 2 diabetes mellitus: implications of recent clinical trials. Ann Intern Med 2011;154:554-559. (5) Sluimer JC, Daemen MJ. Novel concepts in atherogenesis: angiogenesis and hypoxia in atherosclerosis. J Pathol 2009;218:7-29. (6) Zagorchev L, Mulligan-Kehoe MJ. Advances in imaging angiogenesis and inflammation in atherosclerosis. Thromb Haemost 2011;105:820-827. (7) Kaplan RC, McGinn AP, Pollak MN et al. Association of total insulin-like growth factor-I, insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1), and IGFBP-3 levels with incident coronary events and ischemic stroke. J Clin Endocrinol Metab 2007;92:1319-1325. (8) Page JH, Ma J, Pollak M, Manson JE, Hankinson SE. Plasma Insulin-Like Growth Factor 1 and Binding-Protein 3 and Risk of Myocardial Infarction in Women: A Prospective Study. Clin Chem 2008;54:1682-1688. (9) Saydah S, Graubard B, Ballard-Barbash R, Berrigan D. Insulin-like growth factors and subsequent risk of mortality in the United States. Am J Epidemiol 2007;166:518-526. (10) Lawlor DA, Ebrahim S, Smith GD, Cherry L, Watt P, Sattar N. The association of insulin-like-growth factor 1 (IGF-1) with incident coronary heart disease in women: Findings from the prospective British Women’s Heart and Health Study. Atherosclerosis 2008;201:198-204. (11) Yeap BB, Chubb SA, McCaul KA et al. Associations of IGF1 and IGFBPs 1 and 3 with all-cause and cardiovascular mortality in older men: the Health In Men Study. Eur J Endocrinol 2011;164:715-723. (12) Laughlin GA, Barrett-Connor E, Criqui MH, Kritz-Silverstein D. The prospective association of serum insulin-like growth factor I (IGF-I) and IGF-binding protein-1 levels with all cause and cardiovascular disease mortality in older adults: the Rancho Bernardo Study. J Clin Endocrinol Metab 2004;89:114-120. (13) Juul A, Scheike T, Davidsen M, Gyllenborg J, Jorgensen T. Low serum insulin-like growth factor I is associated with increased risk of ischemic heart disease: a population-based case-control study. Circulation 2002;106:939-944. (14) Friedrich N, Haring R, Nauck M et al. Mortality and Serum Insulin-Like Growth Factor I and Insulin-Like Growth Factor Binding Protein 3 Concentrations. J Clin Endocrinol Metab 2009. (15) Ruidavets JB, Luc G, Machez E et al. Effects of insulin-like growth factor 1 in preventing acute coronary syndromes: The PRIME study. Atherosclerosis 2011;218:464-469. (16) Chisalita SI, Dahlstrom U, Arnqvist HJ, Alehagen U. Increased IGF-1 levels in an elderly population in relation to heart failure and cardiovascular mortality. Impact of ACE-inhibitors. Eur J Endocrinol 2011. (17) Li Q, Li B, Wang X et al. Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy. J Clin Invest 1997;100:1991-1999. (18) Davis ME, Hsieh PC, Takahashi T et al. Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction. Proc Natl Acad Sci U S A 2006;103:8155-8160. (19) Kotlyar AA, Vered Z, Goldberg I et al. Insulin-like growth factor I and II preserve myocardial structure in postinfarct swine. Heart 2001;86:693-700.

181


23-10-12 20:32


23-10-12 20:32

Appendix


23-10-12 20:32

Nederlandse samenvatting Meer dan 50% van de patiënten met type 2 diabetes mellitus (T2DM) overlijdt ten gevolge van harten vaatziekten. Om harten vaatziekten te voorkómen in deze patiënten is het van belang om te weten welke factoren het cardiovasculaire risico kunnen beïnvloeden. Omdat het momenteel ter discussie staat of patiënten met T2DM behandeld dienen te worden met hoge doses insuline heb ik onderzocht of, en hoe, hoge doses insuline het risico op harten vaatziekten kunnen verhogen. Tevens heb ik onderzocht of een hormoon dat erg lijkt op insuline, het insulin-like growth factor-I (IGF-I), geassocieerd is met een verhoogd risico op harten vaatziekten. In hoofdstuk 1 worden de overeenkomsten en verschillen tussen insuline en IGF-I beschreven. Deze hormonen hebben een gemeenschappelijke voorouder waardoor insuline en IGF-I tegenwoordig nog erg op elkaar lijken. Beide hormonen kunnen ook dezelfde effecten teweegbrengen. Echter, over de jaren heen heeft insuline zich ontwikkeld tot een hormoon met vooral metabole effecten, terwijl IGF-I met name betrokken is geraakt bij groei en ontwikkeling. Of beide hormonen betrokken zijn bij de ontwikkeling van harten vaatziekten is onderzocht in dit proefschrift.

Deel 1. De rol van insuline bij het ontstaan van harten vaatziekten. In hoofdstuk 2 wordt een samenvatting van de literatuur gegeven waarbij studies besproken worden die erop wijzen dat insuline het risico op harten vaatziekten zou kunnen verhogen. In deze context worden ook studies besproken waaruit blijkt dat een hele intensieve behandeling van T2DM (waarbij HbA1c waarden van <48mmol/mol nagestreefd worden) niet leidt tot een verlaging van het risico op harten vaatziekten. Sterker nog, de ACCORD studie heeft laten zien dat intensieve behandeling het risico om te overlijden aan harten vaatziekten juist laat toenemen. Terwijl de redenen voor deze onverwachte verhoogde mortaliteit (nog) niet bekend zijn, is er gespeculeerd dat hoge insuline doseringen in de intensief behandelde patiënten, mogelijk bijgedragen kunnen hebben aan verhoging van het cardiovasculaire risico. Inderdaad blijkt er in de literatuur een associatie te bestaan tussen het gebruik van insuline en het risico op harten vaatziekten. Daarnaast hebben laboratorium experimenten aangetoond dat insuline eigenschappen bezit die atherosclerose (‘aderverkalking’) kunnen stimuleren. Echter, direct bewijs dat insuline atherosclerose in mensen of dieren kan verergeren ontbreekt en is daarom de focus van het eerste deel van dit proefschrift. In hoofdstuk 3 hebben we onderzocht of de mate van insuline blootstelling in patiënten met T2DM geassocieerd is met harten vaatziekten. Hiertoe hebben we een studie gedaan onder mensen die voor het eerst orale antidiabetische middelen zijn gaan gebruiken. De gemiddelde dagelijkse insuline blootstelling werd berekend in 2338 patiënten die een cardiovasculair event hadden doorgemaakt en vergeleken met de insuline blootstelling in 4407 controles 184


23-10-12 20:32

Nederlandse samenvatting

die vrij bleven van harten vaatziekten. Na analyse bleek dat patiënten met de hoogste insuline blootstelling (hoogste tertiel) 44% meer kans hadden op harten vaatziekten, terwijl patiënten met een lage insuline blootstelling (laagste tertiel) 52% lager risico hadden op harten vaatziekten, vergeleken met patiënten die geen insuline gebruikten. Deze resultaten suggereren dat hoge insuline blootstelling mogelijk negatieve effecten heeft op het proces van aderverkalking. Echter, of insuline daadwerkelijk een causale rol heeft bij verergering van aderverkalking kan niet afgeleid worden uit deze data. Daarom hebben we in de volgende hoofdstukken onderzocht via welke mechanismen insuline het cardiovasculaire risico kan verhogen. Een van onze hypotheses was dat insuline de stabiliteit van atherosclerotische afwijkingen (‘plaques’) zou kunnen verstoren door angiogenese (vaatnieuwvorming) in deze plaques te bevorderen. In hoofdstuk 4 presenteren we data die deze hypothese ondersteunen. Met behulp van een in vitro angiogenese proef hebben we laten zien dat insuline de vorming van vaatachtige structuren kan stimuleren in een laboratorium setting. Om erachter te komen of insuline ook vaatnieuwvorming in de plaques bij mensen kan stimuleren hebben we vervolgens eerst onderzocht of de insuline receptor aanwezig is in deze plaques. Het bleek dat de insuline receptor met name aanwezig was op kleine net gevormde vaatjes, en niet op grotere meer uitgerijpte vaatjes. Dit specifieke expressie patroon van insuline receptoren suggereert dat insuline mogelijk betrokken is bij uitgroei van nieuwe vaatjes in atherosclerotische plaques in mensen. Om dit verder te ondersteunen hebben we vervolgens aangetoond dat het aantal vaatjes in plaques hoger is in T2DM patiënten die insuline gebruiken dan in T2DM patiënten die geen insuline gebruiken. Al deze resultaten samen wijzen erop dat insuline mogelijk betrokken is bij vaatnieuwvorming in atherosclerotische plaques van mensen. In hoofdstuk 5 laten we zien dat insuline waarschijnlijk ook betrokken is bij vaatnieuwvorming in tumoren. We hebben namelijk gevonden dat er ook een specifiek expressie patroon voor insuline receptoren bestaat in borst-, darm-, alvleesklier-, long- en niertumoren. In deze tumoren zagen we dat insuline receptoren vooral aanwezig waren op vaatjes in het tumorweefsel, terwijl deze op de vaatjes in het omringende weefsel niet of nauwelijks aanwezig waren. Mogelijk leidt stimulering van deze insuline receptoren op de vaatjes met insuline tot een toename van vaatnieuwvorming, wat vervolgens tumorgroei kan bevorderen. Omdat in de literatuur vooral de insuline analoog glargine geassocieerd is met kanker hebben we vervolgens onderzocht of verschillende insuline analogen een verschillende potentie hebben om vaatnieuwvorming te stimuleren in vitro. Alle vier de insuline analogen die we getest hebben bleken in dezelfde mate de vorming van vaatachtige structuren te kunnen stimuleren, wat erop wijst dat insuline glargine geen exclusieve kandidaat is om vaatnieuwvorming te stimuleren. In hoofdstuk 6 laten we zien dat insuline betrokken is bij het instabieler worden van atherosclerotische plaques in vivo, en dat dit onafhankelijk is van systemische effecten van 185


23-10-12 20:32

insuline op metabolisme. Ondanks dat observationele studies hebben laten zien dat het gebruik van insuline in patiënten met T2DM geassocieerd is met een verhoogd risico op harten vaatziekten, is het onduidelijk of insuline een causale rol heeft bij het stimuleren van aderverkalking. Een van de problemen van observationele studies is de zogenaamde indicatie bias. Dat wil zeggen dat de patiënten die insuline voorgeschreven krijgen vaak de patiënten zijn die ernstigere insuline resistentie en beta-cel falen hebben dan de patiënten die geen insuline voorgeschreven krijgen. Dit zou kunnen leiden tot verkeerde interpretaties ten gevolge van ‘confounding’ door ernst van de diabetes. Een tweede probleem bij het bestuderen van de effecten van insuline op aderverkalking in vivo, is dat insuline ook systemische effecten heeft op lipiden metabolisme en gewicht, welke allebei ook het cardiovasculaire risico kunnen beïnvloeden. Om deze verstorende factoren te omzeilen hebben we een in vivo model gebruikt waarin de directe effecten van insuline op het verergeren van aderverkalking bestudeerd kunnen worden. In atherosclerose-gevoelige LDLr KO (low density lipoprotein receptor knockout) muizen werd aderverkalking geïnduceerd door een bandje te plaatsen rondom de halsslagaders. De gevormde atherosclerotische plaques werden vervolgens lokaal behandeld met insuline of met fysiologisch zout. Deze lokale toediening van insuline leidde niet tot systemische effecten, maar leverde wel plaques op die 33% minder collageen bevatten, een eiwit waarvan wordt verondersteld dat het de stabiliteit van plaques bevordert. Bovendien werden in het weefsel rondom deze lesies 50% meer geactiveerde mest cellen waargenomen. Uit in vitro experimenten bleek dat de verlaging van het collageen in de lesies het gevolg zou kunnen zijn van complexe effecten van insuline op collageen homeostase (balans van aanmaak en afbraak), deels via effecten van insuline op mest cellen in het omringende weefsel. Stimulatie van de insuline receptor met insuline leidt tot activatie van twee signaleringspaden in de cel. Een van deze paden, het PI3K-pad, werkt niet goed tijdens insuline resistentie. Om in een in vivo model te onderzoeken wat de rol van insuline resistentie is bij het ontstaan en verergeren van atherosclerotische plaques, zou een muismodel waarin aderverkalking optreedt en tegelijkertijd het PI3K-pad defect is, van grote waarde kunnen zijn. In hoofdstuk 7 karakteriseren we daarom het fenotype van LDLr KO muizen die geen Akt2 hebben (een eiwit betrokken in het PI3K-pad). Deze zogenaamde Akt2/LDLr dKO muizen hadden hogere glucose en insuline waarden dan LDLr KO muizen, en bleken meer insuline resistent te zijn. Opvallend was dat de plaques significant kleiner waren en tegelijkertijd meer complex bleken doordat ze minder collageen bevatten, grotere gebieden van necrose en meer apoptose hadden. In vitro experimenten lieten vervolgens zien dat gladde spiercellen en macrofagen waarschijnlijk een belangrijke rol spelen bij het verstoren van de collageen homeostase in de lesies van de Akt2/ LDLr dKO muizen. Tezamen suggereren deze resultaten dat Akt2/LDLr dKO muizen kunnen dienen als een interessant model waarin de effecten van insuline resistentie op het ontstaan en verergeren van aderverkalking onderzocht kunnen worden.

186


23-10-12 20:32

Nederlandse samenvatting

Deel 2. De rol van IGF-I bij het ontstaan van harten vaatziekten. Verschillende studies bij volwassenen hebben laten zien dat lage IGF-I spiegels in het bloed geassocieerd zijn met een verhoogd risico op harten vaatziekten. In deze context zou verwacht kunnen worden dat patiënten die van jongs af aan lage IGF-I spiegels hebben gehad, op jong volwassen leeftijd al tekenen van aderverkalking en/of hartfalen kunnen vertonen. Daarom hebben we, in hoofdstuk 8, het cardiovasculaire risico profiel bepaald bij een 27 jarige man met extreem lage IGF-I spiegels ten gevolge van een homozygote IGFALS gen mutatie. In het bloed van de patiënt werden extreem lage IGF-I spiegels en milde insuline resistentie en dyslipidemie gemeten. 64-slice CT scan en drie-dimensionale echografie van het hart lieten geen enkele tekenen van subklinisch harten vaatlijden zien. Deze resultaten suggereren dat lage IGF-I spiegels, veroorzaakt door een IFGALS mutatie, niet per definitie gepaard gaan met een verhoogd cardiovasculair risico. Om de bevindingen in de bovengenoemde casus verder te onderbouwen laten we, in hoofdstuk 9, de resultaten zien van een studie binnen het EPIC-Norfolk cohort. In 1013 cases met coronair lijden en 2055 controles hebben we de associatie bestudeerd tussen IGF-I en IGFBP-3 spiegels in het bloed, genetische variatie in de chromosomale gebieden (loci) die coderen voor deze eiwitten, en het risico op harten vaatziekten. Na correctie voor de aanwezigheid van cardiovasculaire risicofactoren bleek er geen associatie te zijn tussen IGF-I en IGFBP-3 spiegels en het risico op coronair lijden. Vervolgens hebben we drie tagging SNPs (single nucleotide polymorphysms) geïdentificeerd die geassocieerd waren met IGF-I of IGFBP-3 spiegels. Tot slot bleek, in een meta-analyse van de EPIC-Norfolk en 8 andere studies, dat geen van de 31 onderzochte tagging SNPs die de gehele IGF1 en IGFBP3 loci omvatten, geassocieerd was met coronair lijden. Samen wijzen deze resultaten erop dat IGF-I en IGFBP-3 waarschijnlijk niet betrokken zijn bij het ontstaan van harten vaatziekten in de mens.

187


23-10-12 20:32

188


23-10-12 20:32

List of publications

L ist of publications

Endothelial insulin receptor expression in human atherosclerotic plaques: linking micro- and macrovascular disease in diabetes? Rensing KL, von der Thüsen JH, Weijers EM, Houttuijn Bloemendaal FM, van Lammeren GW, Vink A, van der Wal AC, van Hinsbergh VWM, van der Loos CM, Stroes ES, Koolwijk P, Twickler ThB. Atherosclerosis 2012; 222:208–215 Prospective study of insulin-like growth factor-I, insulin-like growth factor-binding protein 3, genetic variants in the IGF1 and IGFBP3 genes and risk of coronary artery disease Ricketts SL, Rensing KL, Holly JM, Chen L, Young EH, Luben R, Ashford S, Song K, Yuan X, Dehghan A, Wright BJ, Waterworth DM, Mooser V, GEMS Investigators, Waeber G, Vollenweider P, Epstein SE, Burnett MS, Devaney JM, Hakonarson HH, Rader DJ, Reilly MP, Danesh J, Thompson SG, Dunning AM, van Duijn CM, Samani NJ, McPherson R, Wareham NJ, Khaw KT, Boekholdt SM, Sandhu MS. Int J Mol Epidemiol Genet. 2011;2:261-85 Reducing cardiovascular disease risk in diabetic patients with established macrovascular disease: can insulin be too much of a good thing? Rensing KL, Reuwer AQ, Arsenault BJ, von der Thüsen JH, Kastelein JJP, Twickler ThB. Diabetes Obes Metab. 2011;13:1073-87 Case-report: Low circulating IGF-I levels due to Acid-Labile Subunit deficiency in adulthood is not associated with early development of atherosclerosis and impaired heart function. Rensing KL, van Duyvenvoorde HA, Cramer MJM, Teske AJ, Prokop M, Stroes ES, Wit JM, Hermus ARMM, Twickler ThB. Growth Horm IGF Res. 2011;21:233-7 Could recombinant insulin compounds contribute to adenocarcinoma progression by stimulating local angiogenesis? Rensing KL, Houttuijn Bloemendaal FM, Weijers EM, Richel DJ, Büller HR, Koolwijk P, van der Loos CM, Twickler TB, von der Thüsen JH. Diabetologia. 2010; 53:966-70. Is insulin the preferred compound in lowering glucose levels in patients after a myocardial infarction? Rensing KL, Kastelein JJ, Twickler M. Arch Intern Med. 2009; 169:1636-7 189


23-10-12 20:32

Abdominal aorta aneurysm: an exceptional expression of atherolscerotic disease in type II diabetes. Rensing KL, Twickler ThB. European Heart Journal, 2008; 29:581-582 Lessons from France. The Cardiovascular Prevention Clinic in the La Pitié- Salpêtrière Hospital in Paris. Rensing KL, Timmerman MK, Giral P, Cramer MJM, Bruckert E, Twickler ThB. Netherlands Heart journal. 2007;15:22-26 High daily insulin exposure in patients with type 2 diabetes is associated with increased risk of cardiovascular disease. Rensing KL, Nieuwdorp M, Twickler ThB, Holleman F, von der Thüsen JH, Zwinderman AH, Stroes ES, Currie CJ, Hutten BA. Submitted Insulin elicits features of atherosclerotic lesion instability in LDLr KO mice. Rensing KL, Bot I, de Jager SCA, Twickler ThB, Stroes ES, Kuiper J, von der Thüsen JH. Submitted Akt2/LDLr double knockout mice display impaired glucose tolerance and develop more complex atherosclerotic plaques than LDLr knockout mice due to altered collagen homeostasis. Rensing KL, de Jager SCA, Stroes ES, Vos M, Twickler ThB, Dallinga-Thie GM, de Vries CJM, Kuiper J, Bot I, von der Thüsen JH. Submitted

190


23-10-12 20:32

Authors and affiliations

Authors and affiliations Arsenault, BJ Department of Vascular Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Ashford, S Department of Public Health and Primary Care, Strangeways Research Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK Boekholdt, SM Department of Cardiology, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Bot, I Division of Biopharmaceutics, LACDR, Leiden University, Leiden, The Netherlands Büller, HR Department of Vascular Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Burnett, MS Cardiovascular Research Institute, MedStar Research Institute, Washington Hospital Center, Washington, DC, USA Chen, L Division of Cardiology, University of Ottawa Heart Institute, Ottawa, ON, Canada Cramer, MJ Department of Cardiology, University Medical Center Utrecht, Utrecht, The Netherlands Currie, CJ Department of Primary Care and Public Health, School of Medicine, Cardiff University, Cardiff, United Kingdom Dallinga-Thie, GM Department of Experimental Vascular Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Danesh, J Department of Public Health and Primary Care, Strangeways Research Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK Dehghan, A Department of Epidemiology, Erasmus Medical Center, Rotterdam, The Netherlands 191


23-10-12 20:32

Devaney, JM Cardiovascular Research Institute, MedStar Research Institute, Washington Hospital Center, Washington, DC, USA Duijn van, CM Department of Epidemiology, Erasmus Medical Center, Rotterdam, The Netherlands Dunning, AM CR-UK Department of Oncology, Strangeways Research Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK Duyvenvoorde van, HA Department of Pediatrics, Department of Endocrinology and Metabolic Diseases, Center for Human and Clinical Genetics, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands Epstein, SE Cardiovascular Research Institute, MedStar Research Institute, Washington Hospital Center, Washington, DC, USA Hakonarson, HH The Center for Applied Genomics, Children’s Hospital of Philadelphia, PA, USA Hermus, ARMM Department of Endocrinology, Radboud University Nijmegen Medical Center, Nijmegen, The Netherlands Hinsbergh van, VWM Institute for Cardiovascular Research, Laboratory for Physiology, VU University Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Hoekstra, JBL Department of Internal Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Holleman, F Department of Internal Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Holly, JM University Department of Clinical Science at North Bristol, Southmead Hospital, Westburyon-Trym, Bristol, UK

192


23-10-12 20:32


Houttuijn Bloemendaal, FM Department of Vascular Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Hutten, BA Department of Clinical Epidemiology, Biostatistics & Bioinformatics, Academic Medical Center, Amsterdam, the Netherlands Jager de, SCA Division of Biopharmaceutics, LACDR, Leiden University, Leiden, The Netherlands Kastelein, JJP Department of Vascular Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Khaw, KT Department of Public Health and Primary Care, Strangeways Research Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK Koolwijk, P Institute for Cardiovascular Research, Laboratory for Physiology, VU University Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Kuiper, J Division of Biopharmaceutics, LACDR, Leiden University, Leiden, the Netherlands Lammeren van, GW Experimental Cardiology Laboratory, University Medical Center Utrecht, Utrecht, The Netherlands Loos van der, CM Department of Pathology, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Luben, R Department of Public Health and Primary Care, Strangeways Research Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK McPherson, R Division of Cardiology, University of Ottawa Heart Institute, Ottawa, ON, Canada Mooser, V Genetics Division, GlaxoSmithKline R&D, King of Prussia, PA, USA

193


23-10-12 20:32

Muredach, PR The Institute for Translational Medicine and Therapeutics, School of Medicine, The Cardiovascular Institute, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA Nieuwdorp, M Department of Vascular Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Prokop, M Department of Radiology, Radboud University Nijmegen Medical Center, Nijmegen, The Netherlands Rader, DJ The Institute for Translational Medicine and Therapeutics, School of Medicine, The Cardiovascular Institute, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA Reilly, MP The Institute for Translational Medicine and Therapeutics, School of Medicine, The Cardiovascular Institute, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA Reuwer, AQ Department of Vascular Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Richel, DJ Department of Internal Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Ricketts, SL Department of Public Health and Primary Care, Strangeways Research Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK Samani, NJ Department of Cardiovascular Sciences, University of Leicester, Glenfield Hospital, Leicester, UK Sandhu, MS Department of Public Health and Primary Care, Strangeways Research Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, UK MRC Epidemiology Unit, Institute of Metabolic Science, Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK Song, K Genetics Division, GlaxoSmithKline R&D, King of Prussia, PA, USA 194


23-10-12 20:32


Stroes, ESG Department of Vascular Medicine, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Teske, AJ Department of Cardiology, University Medical Center Utrecht, Utrecht, The Netherlands Thompson, SG MRC Biostatistics Unit, Institute of Public Health, Cambridge, UK Thüsen von der, JH Department of Pathology, Medisch Centrum Haaglanden, The Hague, The Netherlands Twickler, ThB Department of Endocrinology, Diabetology and Metabolic Diseases, Antwerp University Hospital, Antwerp, Belgium Vink, A Department of Pathology, University Medical Center Utrecht, Utrecht, the Netherlands Vollenweider, P Department of Internal Medicine, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Lausanne, Switzerland Vos, M Department of Medical Biochemistry, Academic Medical Center, Amsterdam, the Netherlands Vries de, CJM Department of Medical Biochemistry, Academic Medical Centre, University of Amsterdam, the Netherlands Waeber, G Department of Internal Medicine, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Lausanne, Switzerland Wal van der, AC Department of Pathology, Academic Medical Center/University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands Wareham, NJ MRC Epidemiology Unit, Institute of Metabolic Science, Addenbrooke’s Hospital, Cambridge, UK

195


23-10-12 20:32

Waterworth, DM Genetics Division, GlaxoSmithKline R&D, King of Prussia, PA, USA Weijers, EM Institute for Cardiovascular Research, Laboratory for Physiology, VU University Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Wit, JM Department of Pediatrics, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands Wright, BJ Departments of Health Sciences and Genetics, University of Leicester, Leicester, UK Young, EH Department of Public Health and Primary Care, Strangeways Research Laboratory, University of Cambridge, Cambridge, UK Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridge, UK Yuan, X Genetics Division, GlaxoSmithKline R&D, King of Prussia, PA, USA Zwinderman, AH Department of Clinical Epidemiology, Biostatistics & Bioinformatics, Academic Medical Center, Amsterdam, the Netherlands

196


23-10-12 20:32

Abbreviations

Abbreviations ADVANCE Action in Diabetes and Vascular Disease-Preterax and Diamicron Modified Release Controlled Evaluation Akt2/LDLr dKO

Akt2/low density lipoprotein receptor double knockout

ALS

acid labile subunit

ASMA

alpha smooth muscle actin

ATHERO-EXPRESS

atherosclerotic plaque expression

bFBG

basic fibroblast growth factor

CAD

coronary artery disease

CV cardiovascular CVD cardiovascular disease CVE cardiovascular event DCCT

Diabetes Control and Complications Trial

DM2

type 2 diabetes mellitus

ET-1 endothelin-1 hMVEC

human microvascular endothelial cells

IGFBP-3 IGF-binding protein-3 IGF-I

insulin-like growth factor I

IGF-IR IGF-I receptor IMT

intima media thickness

IR insulin receptor LDLr KO

low density lipoprotein receptor knockout

MAPK

mitogen-activated protein kinase

MMP

metalloproteinase

NO

nitric oxide

PI3K

phosphatidyl-inositol-3’-kinase

SMC

smooth muscle cell

T2DM

type 2 diabetes mellitus

TNF-α

tumor necrosis factor-α

tSNP

tagging single nucleotide polymorphism

UKPDS

United Kingdom Prospective Diabetes Study

VADT

Veterans Affairs Diabetes Trial

VSMC

vascular smooth mucle cell

197


23-10-12 20:32

198


23-10-12 20:32

Dankwoord

Dank woord Graag wil ik iedereen bedanken die bijgedragen heeft aan de totstandkoming van dit proefschrift. Een aantal mensen wil ik in het bijzonder noemen. Allereerst mijn promotor Erik Stroes. Beste Erik, bedankt dat je een uitstapje naar de cardiovasculaire endocrinologie hebt willen maken door mijn promotie traject te begeleiden. Jouw betrokkenheid, interesse en de laagdrempeligheid waarmee je te benaderen bent, zijn van enorm veel waarde voor mij geweest. Ik bewonder de hoeveelheid energie, enthousiasme en gedrevenheid die jij hebt en weet over te dragen op je promovendi. Mijn co-promotores Marcel Twickler en Jan von der Thüsen. Marcel, dankzij jou heb ik tijdens mijn studie geneeskunde twee fantastische stages in Parijs kunnen doen. Ik ben enorm blij dat je me daarna naar de Vasculaire Geneeskunde hebt gehaald. Jouw gedrevenheid, creativiteit en translationele manier van denken hebben me gestimuleerd en hebben bijgedragen aan de diversiteit van dit proefschrift. Jan, ik vind het geweldig dat, wat ruim vier jaar geleden begonnen is als een klein samenwerkingsverband, uitgegroeid is tot grote betrokkenheid bij de vele projecten waarin je me begeleid hebt. Wat was het fijn dat jouw reacties op mijn vragen altijd snel, to the point en duidelijk waren. Ook in Engeland bleef je betrokken en was er altijd tijd voor brainstormsessies of het beoordelen van coupes. Graag wil ik ook de leden van de promotiecommissie, prof. dr. J.A. Romijn, prof. dr. J.B.L. Hoekstra, prof. dr. P.M.M. Bossuyt, prof. dr. V.W.M. van Hinsbergh, prof. dr. M.J.A.P. Daemen, en prof. dr. E.A.L. Biessen hartelijk bedanken voor het lezen en beoordelen van dit proefschrift en het plaatsnemen in de promotiecommissie. Hoewel ik promoveer bij de Vasculaire Geneeskunde, heb ik de meeste tijd doorgebracht in laboratoria van andere afdelingen en in andere ziekenhuizen, verspreid over het land. De eerste anderhalf jaar van mijn promotie heb ik voornamelijk doorgebracht bij de afdeling biochemie, onder leiding van Carlie de Vries. Carlie, doordat je me het gevoel gaf dat ik onderdeel uitmaakte van jouw onderzoeksgroep heb ik me altijd heel welkom gevoeld. In jouw lab heb ik mijn eerste experimentele stappen gezet, met hulp van Jasper, Anita en Mariska. Ik vind het mooi dat ik mijn promotieonderzoek uiteindelijk heb kunnen afsluiten met een gezamenlijk artikel! Vanuit de biochemie stapte ik over naar de afdeling pathologie, waar ik de kleuringen in eerste instantie had uitbesteed aan een studente. Felicia, vanaf het begin af aan vond ik je al een topstudent! Je hebt niet alleen enorm veel werk verzet, maar je dacht ook mee over de inhoud 199


23-10-12 20:32

en bracht veel enthousiasme en vrolijkheid mee. Ik ben je werk na je vertrek nog meer gaan waarderen toen ik ineens alle kleuringen zelf moest opzetten en uitvoeren. Gelukkig bleef Chris van der Loos zeer betrokken en leerde mij alle “ins and outs” van de immunohistochemie. Chris, jouw kennis op het gebied van dubbelkleuringen en spectral imaging is enorm. Bedankt voor je duidelijke uitleg, tijd en een goede samenwerking. De eerste helft van mijn promotietijd heb ik ook veel tijd doorgebracht bij de afdeling fysiologie van het VUmc. Victor van Hinsbergh en Pieter Koolwijk, bedankt voor deze samenwerking en het meedenken bij het interpreteren van de resultaten. Ester, jou wil ik in het bijzonder bedanken voor alle angiogenese experimenten die we samen gedaan hebben. Het was heerlijk om experimenten te doen die lukten en mooie consistente resultaten opleverden! Jouw gedegen manier van werken, voorbereiding en betrokkenheid hebben daar zeker aan bijgedragen. Bij de afdeling Experimentele Cardiologie in het UMC Utrecht heb ik mij bezig gehouden met het kwantificeren van vaatjes in endarteriëctomie materiaal. Guus van Lammeren en Aryan Vink wil ik graag bedanken voor hun hulp hierbij en het beschikbaar stellen van materiaal uit de ATHERO-EXPRESS. De laatste 2 jaar reisde ik af naar het LACDR in Leiden. Johan Kuiper, ik wil je bedanken voor de geboden gastvrijheid en de hartelijkheid waarmee ik ontvangen ben. Ilze en Saskia, wat heb ik ontzettend veel geleerd van jullie! Bedankt dat jullie je kennis, expertise en tijd hebben willen inzetten voor mijn projecten. Hierbij deden jullie het telkens overkomen alsof alles een kleine moeite was, terwijl jullie in werkelijkheid enorm veel werk verzet hebben. Daarnaast heb ik ook genoten van de goede sfeer op de afdeling, de gezellige momenten aan de koffietafel, en het uitwisselen van kinderanekdotes. Tussendoor werkte ik met Barbara Hutten van de afdeling Klinische Epidemiologie, Biostatistiek en Bio-informatica aan het pharmo-project. Barbara, bedankt dat je deze moeilijke puzzel (want dat was het toch wel echt) met me hebt willen oplossen. Vele uren hebben we samen achter de computer doorgebracht. Jij liet vervolgens de syntaxen vaak ’s nachts thuis draaien omdat het runnen zo lang duurde. Ik heb enorm veel waardering voor alle tijd die je aan dit project besteed hebt. Ook Koos Zwinderman wil ik bedanken voor de betrokkenheid bij dit project. I also owe many thanks to Sally Ricketts, Elizabeth Young, Matthijs Boekholdt, Manjinder Sandhu, and all other investigator of EPIC-Norfolk study for the collaboration on IGF-I, IGFBP-3, genetic variants and cardiovascular disease. Verder gaat mijn dank uit naar alle mede-auteurs die hierboven niet genoemd staan.

200


23-10-12 20:32

Dankwoord

Ook wil ik alle stafleden en arts-onderzoekers van de Diabetesgroep bedanken voor hun gastvrijheid bij de lunch, de inhoudelijke adviezen en de gezelligheid! Hoewel het vergaren van data dus vooral elders plaatsvond, lag mijn basis op F4, bij de Vasculaire Geneeskunde. De echte spil van deze afdeling is natuurlijk Joyce! Joyce, wat ben je geweldig! Het lijkt alsof je nergens je hand voor omdraait; congressen, ski-tripjes, je regelt het allemaal met hetzelfde gemak. Bedankt voor al je hulp en je bijdrage aan de goede sfeer op de afdeling (en op menig feestje en borrel!). De (ik heb even geteld) 55 arts-onderzoekers met wie ik op F4 gezeten heb, wil ik ook bedanken voor de geweldige tijd die we samen gehad hebben. Tussen al het gezwoeg door in onze cubicals bleef er gelukkig ook tijd over voor een ‘break’ op het voetenplein, een borrel in de CRIB met bier dat over de datum was of werd er een reden verzonnen om met z’n allen in ‘het zitje van Mieke’ te gaan zitten (niet door iedereen altijd even gewaardeerd). Ook al was het soms zwaar (ik zie ons in een AMC T-shirt in de BONI staan of ’s ochtends vroeg bij een Pfizer update symposium), het was vooral een hele leuke tijd. Het voelt als een voorrecht dat we telkens in groten getale naar congressen af konden reizen (athans, de meesten van ons ;-)), of met z’n allen in het vliegtuig konden stappen voor een skiweekend. Het laatste congres in Sydney was de ultieme afsluiting. Vooral de ‘road-trip’ met Aart, Ties en Ruud, waar we zeer moeilijke keuzes hebben moeten maken en een hilarisch verblijf in the Rydges hebben gehad… Ik heb nu al zin in de volgende rooftop-borrel! Bas, Renée en Meeike, jullie wil ik in het bijzonder noemen. Bas, onze vriendschap die de afgelopen jaren ontstaan is, is me zeer dierbaar. Gelukkig heb ik binnenkort weer tijd voor een biertje! Renée, op de 4m2 van F4-143 hebben we veel wel en wee gedeeld, zowel werk gerelateerd als daarbuiten (met de deur open, of met de deur dicht ;-)). Je was een super kamergenoot en ik ben blij dat we nog steeds contact hebben. Meeike, met jou als opvolger van Renée heb ik het zeker getroffen. Ook al was ik veel in Leiden, als we allebei op F4 waren, was het altijd gezellig en was er genoeg te bespreken. Bedankt voor de fijne tijd en ik kijk er naar uit je in het VUmc te zien! Natuurlijk wil ik ook alle stafleden van de Vasculaire Geneeskunde bedanken en ook de medewerkers van het lab op G1. Ook al was ik weinig op het Vasculaire lab aanwezig, toch waardeer ik het dat ik met vragen of hulp altijd bij jullie terecht kon. Voor een arts-onderzoeker bij de Vasculaire Geneeskunde was ik ook weinig op het trialbureau te vinden. Desalniettemin waren de momenten dat ik er was altijd erg gezellig en was het leuk weer even bij te kletsen. Vooral Linda en Jet wil ik bedanken voor de goede samenwerking in de ‘Roche-FMD’.

201


23-10-12 20:32

Dan mijn paranimfen. Lieve Q, EBCR-partner, buurvrouw op F4, vaste hotelkamergenoot, maar bovenal goede vriendin. Samen zaten we in hetzelfde schuitje, ieder op ons eigen hormooneilandje binnen de afdeling. Wat was het fijn dat we elkaar altijd zo goed begrepen en elkaar op het juiste moment konden oppeppen! Bedankt voor je vriendschap en ik ben superblij dat je me terzijde wilt staan. Lieve Eef, wat was het fijn dat jij ook in het AMC werkte en dat we elkaar te allen tijde voor de kleinste dingen konden bellen. De vele uren die we op het voetenplein hebben doorgebracht met evaluaties, geklaag, peptalks en het krijgen van nieuwe inzichten, zijn me heel dierbaar. Daarnaast ben ik je natuurlijk ook eeuwig dankbaar voor je assistentie bij mijn proefjes! Goed dat je er was! (en zal zijn ;-)) Vrienden, vriendinnen, jaarclub en ‘de meisjes’. Dank voor jullie belangstelling en gezellige afleiding buiten werktijd. Nieuwe collega’s van de microbiologie in het VUmc, wat ben ik blij dat ik in zo’n leuke groep terecht gekomen ben. Bedankt voor jullie interesse, medeleven en begrip de afgelopen maanden. Ik kijk er echt naar uit om dadelijk alle tijd te hebben om me helemaal te storten op de microbiologie. Mijn schoonfamilie wil ik ook graag bedanken voor hun interesse en betrokkenheid. Maarten, ik vond het fijn dat je met me meegedacht hebt, kritische vragen hebt gesteld, en dat je met me meeleefde. Onze gesprekken hebben me meer inzicht gegeven in het hele proces van promoveren. Lieve papa en mama, bedankt dat jullie me altijd gestimuleerd en gesteund hebben, maar ook dat jullie me vrij gelaten hebben in het maken van mijn eigen keuzes. Lieve Olivier, broer plus. Zo lang ik me kan herinneren ben jij er voor me geweest. Onze band is onvoorwaardelijk en voor altijd! IJsboerderij… Laurine en Carel, wat fijn dat jullie voor zoveel vrolijkheid zorgen! Tot slot wil ik de twee belangrijkste mannen in mijn leven bedanken. Lieve Quirijn, wat een feest dat je er bent! Lieve Jasper, bedankt voor je onvoorwaardelijke steun en inlevingsvermogen. Met jou ben ik gelukkig en ik heb zoveel zin om samen met jou verder de toekomst in te duiken!

202


23-10-12 20:32

203


23-10-12 20:32

Met dank aan de kunstuitleen! Of toch niet?


23-10-12 20:32

Proefschrift_Katrijn_v10.indd :32

Recommend Documents