Proč nemohou být imunoanalytické metody přísně specifické, proč je není možné standardizovat a co z toho vyplývá Lochman I. oddělení imunologie a alergologie ZÚ Ostrava
XI. ČASOMIL, Znojmo, 13.-15.6.2012
Imunoanalytické metody = metody založené na reakci antigenů s protilátkami používané v medicíně k diagnostice jsou zatím nestandardizovatelné Cox L. et al.: Annals of Allergy, Asthma & Immunology 2008;101(6):580-92 Mattson PEJ et al.: I/LA20-A2 CLSI document, 2009, 156 pages Lochman I.: Sborník přednášek XXXI. IAD 2010, s. 26-29 Lochman I. et al.: Proč nemůžeme očekávat brzkou standardizaci imunoanalytických metod. Stanovování RF jako příklad . Sborník přednášek XXXIII. IAD, 2012, on flash
Důvody: • Rozpoznávání a reakce imunitního systému nejsou založeny na přísné specifičnosti. • Různí výrobci používají různá, většinou patentem chráněná diagnostika, takže nelze objektivně posoudit, nakolik jsou jejich diagnostika totožná nebo se liší • Musíme proto akceptovat fakt, že různé imunoanalytické metody a různé diagnostické soupravy budou u některých vzorků pro daný analyt dávat rozdílné výsledky. • Je malá šance, že administrativně definované „standardní“ metody budou mít lepší validitu, mají-li splňovat svůj účel podle normy ISO 15189, než většina v praxi osvědčených metod.
Reakce antigenu s protilátkou
Vybráno a upraveno podle: Rozprimová L.: Imunoanalytické metody: historie a současnost. Prezentace na 26.IAD, Praha, 2005
Protilátky • jsou také komunikační molekuly IS zajišťující „specifičnost“ rozpoznávání v rámci imunitní odpovědi • jsou vytvářeny proti všem strukturám, se kterými se organismus setkává, tedy i proti strukturám vlastním • v tomto smyslu jsou např. autoprotilátky a autoimunita fysiologickou součástí imunitní odpovědi • důležitá je nejen specifičnost protilátek, ale i jejich izotyp a detailní složení, avidita (afinita) • protilátky: přirozené & obranné polyreaktivní & monoreaktivní autoprotilátky katalytické (protilátkové enzymy)
Úloha EHK (EQA) při kontrole imunoanalytických metod • Klinická/lékařská laboratoř si by si měla vybírat a nabízet taková vyšetření, která splňují požadavky uživatelů a zároveň jejich praktická realizace je po všech stránkách přiměřená účelům, pro které jsou realizovány. Preferovány by měly být takové postupy, které byly zveřejněny v hodnověrných knihách, časopisech nebo mezinárodních, národních nebo oblastních doporučeních. (ISO 15189:2011, 3. vydání, odst. 5.5) • Laboratoře by měl dbát také na to, aby tato vyšetření byla prováděna ve vyhovující kvalitě a tuto kvalitu validovat a průběžně verifikovat. Mezi postupy ověřující kvalitu poskytovaných služeb (nabízených a realizovaných metod) patří také mezilaboratorní srovnávání - ILC (ISO 15189:2011, 3. vydání, odst. 5.6.4), kde nejvýhodnější je zapojení se do vhodných programů EHK. Na základě výsledků mezilaboratorních porovnání může laboratoř své postupy potvrzovat event. je korigovat. • EHK patří mezi ILC a akreditační orgány si mají při prověrkách všímat také výsledků laboratoří v ILC a způsobu, jak na ně reagují. (ILAC P9-11, odst. 3.2 ) • Při výběru ILC (EHK) si musí laboratoř zvážit, zda je v ní je ověřováno skutečně to, co chce ověřovat a jak jsou jednotlivé cykly ILS vyhodnocovány. Zda z pohledu posuzování použití techniky jako takové, nebo vlastností metody ve vztahu k účelům, ke kterým je používána nebo k jednotlivým subjektům, které jsou posuzovány. O výběru vhodného EHK a frekvenci účasti rozhoduje laboratoř. (EA 4/18, 2010)
Úloha EHK při kontrole imunoanalytických metod shrnutí •Organizované cykly EHK jsou jednou z možností mezilaboratorní kontroly, která pomáhá laboratořím ověřovat a prokazovat, že jí používané laboratorní postupy (metody) mají potřebnou kvalitu a splňují účel, pro nějž jsou používány. •O tom, jakých EHK a s jakou frekvencí by se jich měla laboratoř účastnit, by měla rozhodovat laboratoř sama. •Norma ale nevylučuje, že to může být v rámci států nebo regionů jinak.
Incidence Frekvence výskytu onemocnění v časovém úseku
Prevalence Podíl populace trpící onemocněním v daném časovém období
výsledky testu
definice
+
-
onemocnění
+
A
B
bez onemocnění
-
C
D
Positivní předpovědní hodnota Podíl skutečně pozitivních výsledků testů mezi všemi pozitivními výsledky testů
Sensitivita Podíl pozitivních výsledků mezi nemocnými pacienty
Negativní předpovědní hodnota Podíl skutečně negativních výsledků testů mezi všemi negativními výsledky testů
Specificita Podíl negativních výsledků testů mezi zdravými
Efektivita Relativní počet správně klasifikovaných pacientů
A A+C A A+B D B+D D C+D A+D A+B +C+D
Přehled účastníků, metod a výrobců v EHK RF 1/11 analyt
metoda
počet účastníků
počet výrobců
nephel/turbid
134 (96)
20 (7)
EIA
9
6
titrace
12
7
RF IgG
EIA
36 (24)
7 (4)
RF IgA
EIA
36 (24)
7 (4)
RF IgM
EIA
36 (22)
7 (4)
anti-CCP
EIA
62 (29)
15 (3)
RF screening
Počet účastníků a výrobců, kteří byli zavzati do konečné analýzy je uveden v závorkách.
Přehled výsledků stanovení RF nefelometricky a turbidimetricky v EHK RF1/11 Sample A mean CV(%) Bonf 0.470 97 0.530 82 1.057 17 1.152 15 0.573 33 0.783 13 0.820 36 <0.001
Sample B mean CV(%) Bonf 30.05 30 21.48 35 34.07 12 33.31 14 23.32 40 30.83 18 32.81 32 <0.001
Ratio A/B mean CV(%) Bonf 0.016 90 0.026 99 0.031 17 0.035 10 0.028 48 0.026 14 0.025 12 <0.001
.08
12 49 RF 58 screening 60 neph/turb 115 149 179 ANOVA (p - value)
# labs 23 9 15 27 6 8 8
IP Ratio of sample A / sample B .02 .04 .06
producer
0
analyte
12
49
58
60 Producer
115
149
179
Přehled výsledků stanovení RF a anti-CCP pomocí EIA v cyklu EHK RF1/11
analyte
producer
135 IgG RF 140 ELISA 147 148 ANOVA (p - value) 135 IgA RF 140 ELISA 147 148 ANOVA (p - value) 135 140 IgM RF ELISA 147 148 ANOVA (p - value) 1 anti-CCP 87 ELISA 140 ANOVA (p - value)
# labs 6 10 4 4
6 10 4 4 4 10 4 4 12 4 13
Sample A mean CV(%) Bonf 0.676 51 0.761 21 0.453 64 0.483 32 0.112 0.279 81 0.542 18 0.203 40 0.118 70 <0.001 0.220 25 32 0.540 0.393 45 0.463 19 0.015 0.288 84 0.188 47 0.385 77 0.370
Sample B mean CV(%) Bonf 16.02 25 7.91 46 7.20 43 10.73 30 0.001 8.18 49 7.08 64 18.00 157 5.51 43 0.403 24.24 5 17.78 59 18.15 56 21.38 49 0.680 16 155.44 24.75 112 43.18 90 <0.001
Ratio A/B mean CV(%) Bonf 0.047 62 0.110 37 0.072 95 0.053 73 0.042 0.047 94 0.097 44 0.042 91 0.027 73 0.018 0.009 22 51 0.038 0.040 125 0.026 49 0.255 0.002 68 0.015 74 0.016 76 0.002
Výsledky stanovení anti-CCP vzorku B v cyklu EQA RF1/11
0
Sample B - Index of Positivity 50 100 150
200
anti-CCP
1
87 Producer
140
Výrobce 1 používá pro koutování jiný antigen než výrobci 2 a 3
J.G., muž, nar.1958 HLA DQ
2005
Rizikové alely u celiakie cis-haplotyp alela
haplotyp
izoforma
subtyp
DQA1
DQB1
HLA-DQ2
DQ α5β2
DQ2.5
*0501
*0201
HLA-DQ8
α3β8
DQ8.1
*0301
*0302
DQ
V Evropě jen 6% celiaků nemá rizikové alely DQ2.5 nebo DQ8. Z nich 4% mají DQ2.2 izoformu a jen 2% nemají DQ2 nebo DQ8. Jen u 5% jedinců s rizikovou alelou HLA-DQ2 dojde k propuknutí celiakie, ale riziko je 250x vyšší než u jedinců, kteří ji nemají. (Wikipedia) průkaz v krvi
dg: torpidní refrakterní celiakie zjištěna před 15 lety (potvrzena histologicky 2x, ale podle tehdy uznávaných kriterií) nereaguje na dietu ani na léčbu systémovými kortikoidy
sensitivita
specifičnost
HLA-DQ2
94%
73%
HLA-DQ8
12%
81%
EMA IgA negativní anti-tTG IgA silně pozitivní 2011 EMA IgA negativní, IgG negativní anti-tTG IgA pozitivní, IgG negativní anti-DGP IgA negativní, IgG negativní anti-GL IgA silně poz, IgG poz, IgE neg rizikové alely: DQ2 neg, DQ8 pozitivní IgG 6,0 g/l, IgA 21,6 g/l, IgM 0,25 g/l, IgD <22 U/L, IgE < 2 kIU/l, monoklon.Ig neprokázán,podtřídy IgA1,2 zvýšeny symetricky
Hadithi M. et l.: Ann.Intern.Med. 2007; 147(5): 294-302
negativní jsou ukazatele zánětlivé Jak lze vysvětlit jasnou pozitivitu anti-tTG a negativitu EMA ve třídě IgA aktivity, u pozitivní ASCA NIF v IBD screenu tohoto muže? Jde o vůbec o celiakii? (negativní anti-DGP)
K.K., dívka nar. 2002 • Asi od 9.7.09 teplota do 37,5oC, bolesti břicha a krku. Bolesti krku odezněly, ale bolesti celého břicha a subfebrilie přetrvávají. • 18.7. jednodenní vzestup teplot na 39,5oC. Poté již bez teplot, bolesti břicha nebyly. • V pátek 25.7. odjezd k moři, v sobotu ráno se dívenka vzbudila již žlutá, žluté bělmo, bolesti břicha, bez teplot, zvracela, stolice řídká, mastná, světlá, moč tmavá. Odjíždí zpět do ČR. • 27.7. hospitalizace se susp. inf. hepatitidou na infekčním odd. nemocnice v Opavě. Infekční etiolologie t.č. a pak i dále vyloučena (VHA, VHB, VHC, HCV i VHE – kompletně sérologie, VHB a VHC i PCR – provedeno v Opavě a na ZÚ Ostrava, opakovaně pak i v Olomouci). UZ břicha bez patol. nálezu. Výrazná elevace jat. enzymů, amoniaku a bilirubinu, terapie hepatoprotektivy a domluven překlad na JIP DK v Olomouci • 31.7. v rámci komplexní diferenciální dg vyšetřeny k vyloučení AIH a PSC také autoprotilátky. Výrazná pozitivita anti-LKM v blotové technice soupravou A. Na základě tohoto vyšetření pacientka připravována na biopsii jater. Zároveň však hematologická vyšetření ukázala na aplastickou anemii a předána z DK na HK. • Během toho požádala laboratoř ÚI FN Olomouc o konfirmaci anti-LKM pozitivity laboratoř ve FN Motol, laboratoř výrobce soupravy A a laboratoř OIA ZÚ Ostrava. Laboratoř výrobce i laboratoř FN Motol pozitivitu anti-LKM potvrdily, laboratoř FN Motol i ZÚ Ostrava nenalezly pozitivitu anti-LKM v IFA a laboratoř ZÚ Ostrava ani v immunoblotu soupravou výrobce B. • Dívka zůstala v péči hematologů, byla připravena pro transplantaci kostní dřeně, biopsie jater nebyla provedena a výsledek anti-LKM blotovou technikou soupravou A byl uzavřen jako falešně pozitivní
Závěr Je vždy dobré ověřit a mít možnost potvrdit si pozitivní a eventuelně i negativní nálezy zvláště při nesouhlasu s anamnézou, zvláště při podezření na tak závažné diagnózy, jako je AIH2, jinou, než rutinně používanou technikou.
LKM krysí ledvina
LKM krysí játra
AIH2/11 – vzorek A RL
HEp-2
PL
1:40, AM
1:40, AM
1:40, AM
RK
RS
MI
1:40, AM
1:40, AM
1:40, AM
AIH2/11 vzorek A
Imunoblot (IP): anti-BPO - 1.0 anti-LKM1 - 3.38 anti-Ro52 - 7.38 Euroimmun Liver Mosaic 3, lot F101104CA
ELISA/blot pozitivní
negativní
Euroimmun
32
1
Pharmacia
2
0
Aesku-lab Dg
0
1
D-Tek
1
6
Biovendor
0
1
DRG
1
0
AIDA
1
0
Rods and rings (RR) autoantigeny • Rozpoznávány autoprotilátkami u pacientů s infekcí VHC léčených ribavirinem nebo pegylovaným interferonem alfa. (Většinou u těch, kteří špatně odpovídají na uvedenou terapii?) • Na HEp-2 buňkách (některých výrobců) se prezentují v cytoplazmě buď jako tyčinky (dlouhé ∼ 3-10 µm) a/nebo jako kolečka (∼ 2-5 µm v průměru) • RR nemají vztah k žádným zatím známým cytoplasmatickým strukturám. • Bylo prokázáno, že jejich složkami jsou řídce se vyskytující enzymy zapojené do syntézy nukleotidů syntetáza 1 cytidin trifosfátu (CTPS1) a dehydrogenáza 2 inosin monofosfátu (IMPDH2) Carcamo W.C. et al.: Autoantigens, Autoantibodies, Autoimmunity, Vol. 7, PABST, 2011, pp.107-108 Carcamo W.C. et al.: Plos ONE, 2011; 6(12): e29690
R.L. Humbel ve svém atlasu označuje jako antigen těchto struktur nematin Humbel R.L.: From the most commpn to the rarest in HEp-2 slides. Bio-Rad, 2011, pp 90-91
SEKK AIM1/12, sada vorků 2, vzorek B Euroimmun etOH-GR
Euroimmun form-GR
Inova etOH-GR
Euroimmun HEp-2
1:40
Euroimmun PL 1:40 1:80
1:160
1:320
metoda/IP
MPO
PR3
Euroimmun (hr-hn)
1,37
5,03
Euroimmun Profile
0,94
7,36
Orgentec Alegrie
6,34
4,68
GA ANCA Dot
neg
pos
Euroimmun Profile: Lf: 0,30; Ela: 0,16; Cath: 0,04; BPI: 0,06
SEKK AIM1/12, sada vzorků 2, vzorek B IFA – všichni pozitivní (53 účastníků, 8 různých diagnostik) IFA typ: 38x C-ANCA, 12x P-ANCA + C-ANCA, 2x P-ANCA, 1x NSA (A-ANCA) Anti-PR3: 61 účastníků, 13-14 výrobců, 2 techniky, všichni pozitivní Anti-MPO: 61 účastníků: 43 pozitivní, 4 neprůkazný, 14 negativní 135 139 B MPO EIA blot EIA 1
4
66
87
14
147
148
?
EIA
EIA
1
3
EIA
EIA
blot
EIA
1
9
6
2
1
poz
16
HP
1
1
neg
1
4
135 – OrgenTec 87 – Euroimmun 137 – AIDA 999 – jiný
101
191 EIA
999
blot blot 1
3 139 – BL Dg 101 – Hycor 148 – Aescu.lab
1
1
1
66 – DRG 14 – Bio-Rad 191 – D-tek
1
