PhD Disszertáció Tézis

PhD Disszertáció Tézis

Szinaptikus Átrendeződés, Mint az Epilepszia Kialakulásának Mechanizmusa Elektrofiziológiai és Fotostimulációs Mérések Patkány Epilepszia Modellben

Molnár Péter

Konzulens: Dr. Hernádi István, Ph.D.

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológiai Doktori Iskola Pécs, 2010

Bevezetés Felnőttkorban a temporális lebeny epilepszia (TLE) a leggyakrabban előforduló parciális epilepsziás tünetegyüttes (Halász és Fogarasi, 2006). TLE a betegek többségénél visszavezethető valamilyen elsődleges agysérülésre, amely következtében létrejövő funkcionális változások az agyban egy hosszú látens periódus után a spontán rohamok megjelenéséhez vezetnek (Sharma és mtsai., 2007). A betegek 70-80%-ban figyelhető meg hippokampális lézió, amelyet neuronális degeneráció, asztrogliózis, szemcsesejtek diszperziója, aberráns moharost sarjadzás jellemez. A moharost sarjadzás a hippokampusz gyrus dentatusában lévő szemcsesejtek axonjainak (ezek a moharostok) az újrarendeződése melynek során a moharostok megjelennek a szemcsesejtek dendritikus rétegében és ott izgató szinaptikus kapcsolatokat képeznek a szemcsesejtekkel (Sloviter, 1994). Széles körben elfogadott az a nézet, hogy a moharost sarjadzás során létrejövő pozitív visszacsatolás szerepet játszhat az epileptikus rohamok kialakulásában. A patkányban akut pilokarpin kezeléssel kiváltott krónikus epilepsziás állapotot azért tartják a humán TLE egyik legjobb modelljének, mivel nagymértékben reprodukálja annak nemcsak a fiziológiai és hisztopathológiai tüneteit, de kialakulásának folyamatát is (Curia és mtsai., 2008). Az akut pilokarpin kezelés által kiváltott, elhúzódó generalizált epileptikus roham ugyanis olyan maradandó változásokat okoz az agyban, amelyek hatására (egy ‘csendes periódus’ után) krónikus epilepszia alakul ki. Ebben a modellben a sejtpusztulás ultrastruktúrális szerkezete hasonló ahhoz, amit embereknél írtak le agysérülést követő epilepsziában (Cavalheiro, 1995). A mohasejtek a gyrus dentatus hilusában szinte mind elpusztulnak. A mohasejtek pusztulása egyes elméletek szerint növeli a gyrus dentatus ingerelhetőségét, mivel a mohasejtek fontos szerepet játszanak a feed-back és feed-forward gátlásban a hippokampuszban (Lothman, 1992; Ratzliff és mtsai., 2004). A mohasejtek fő bemenetét a moharostok képezik és főleg gátló interneuronokon képeznek excitátoros szinaptikus kapcsolatokat. A mohasejtek kismértékben kapnak beidegzést a perforáns pálya felől is (Amaral és mtsai., 2007). A pilokarpin modellben státusz epileptikusz hatására drasztikus módon felgyorsul a neurogenezis a hippokampusz gyrus dentatus területén (Parent és mtsai., 2006). A SE hatására újonnan született szemcsesejtek egyrészt hiperexcitabilitásuk, aberráns elhelyezkedésük és szinaptikus kapcsolataik miatt hozzájárulhatnak az epileptikus rohamok kialakulásához, másrészt bizonyos mértékben átvehetik az elpusztult mohasejtek szerepét a rekurrens / feed-forward gátlás folyamatában (Scharfman és mtsai., 2007). Más kutatók szerint az újonnan született szemcsesejtek szerepe kevésbé jelentős az epilepszia kialakulásában (Haas és Frotscher, 2009). A pilokarpin modellben a státusz epileptikuszt követő csendes szakasz folyamán zajlik le a moharost sarjadzás jelensége (Tauck és Nadler, 1985; Okazaki és mtsai., 1995; Scharfman és mtsai., 2003). Hasonló szinaptikus átrendeződést más agyterületeken is megfigyeltek, de csak a moharostokra létezik szelektív, egyszerüen végrehajtható festési eljárás. Nem világos, hogy a szinaptikus átrendeződésnek mi a szerepe az epilepszia kifejlődésében és fenntartásában, ugyanis az új pályák, attól függően, hogy milyen sejten végződnek, egyaránt erősíthetik a serkentő, valamint a gátló mechanizmusokat a különböző agyterületeken.

1

Elektrofiziológiai tulajdonságai alapján a gyrus dentatust tartják a hippokampusz ‘kapuőrzőjének’ (Lothman és mtsai., 1992. In vivo és in vitro mérések bizonyítják, hogy normál esetben nagyon nehéz epileptikus aktivitást kiváltani a gyrus dentatusban, amit elsősorban az erős negatív feed-back és feed-forward gátlás jelenléte, valamint az excitációs pozitív visszacsatolás hiánya magyaráz (Ribak és Peterson, 1991; Acsady és mtsai., 1998). Státusz epileptikusz hatására azonban ez a helyzet megváltozik; a mohasejtek pusztulása jelentősen megváltoztatja a feed-back és a feed forward gátlást (Magloczky és Freund, 2005). Ezzel párhuzamosan a gyrus dentatusban a moharost sarjadzás létrehozza azt a pozitív visszacsatolást, ami számos kutató szerint magyarázatot adhat a gyrus dentatus epileptikus aktivitással szembeni ellenállásának meggyengülésére (Cronin és mtsai., 1992; Hardison és mtsai., 2000). Kísérletek bizonyították, hogy a moharost sarjadzás során kiterebélyesedett szemcsesejt-axonok szinaptikus kapcsolatokat létesítenek a szemcsesejtekkel, de ezzel egyidejüleg gátló interneuronokkal is (Ribak, 1985; Sharma és mtsai., 2007). Elektrofiziológiai kísérletek azt is bizonyították, hogy a létrejött szemcsesejt-szemcsesejt kapcsolatok funkcionálisak és excitátorosak (Molnar és Nadler, 1999; Scharfman és mtsai., 2003). A moharost sarjadzás nemcsak a pozitív visszacsatolás létrejöttén keresztül járulhat hozzá a gyrus dentatus epileptikus szinkronizált aktivitással szembeni ellenállásának meggyengüléséhez, hanem azzal is, hogy a moharostok nagy koncentrációban tartalmaznak cinket, amely aktivitásfüggően ürül a preszinaptikus terminálokból és cink gátolhatja a posztszinaptikus GABAA receptorokat. Epilepszia esetén a GABAA receptorok cink érzékenysége drasztikusan megnő (Buhl és mtsai., 1996). Ezzel ellentétes hatású folyamat, hogy a glutamáttal együtt ürülő cink gátolja az N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptorokat, ez a hatás antiepileptogén (Vogt és mtsai., 2000). A cink szerepe az mediotemporális epilepsziában még mindíg vitatott, mivel mind epileptogén, mind antiepileptogén hatásait leírták (Timofeeva és Nadler, 2006; Noyan és mtsai., 2007; Foresti és mtsai., 2008). A moharost sarjadzás pontos kiváltó oka nem ismert (Curia és mtsai., 2008). Egyes feltételezések szerint a mohasejtek pusztulásával a moharostok rekurrens ágai elveszítik célsejtjeiket és a moharost sarjadzás folyamán más célt keresnek maguknak. Ennek ellentmond az a megfigyelés, hogy a kindling modellben sejtpusztulás nélkül is létrejön moharost sarjadzás. Más elméletek szerint az epileptikus aktivitás bizonyos növekedési faktorok valamint axon vezérlő molekulák fokozott termelődését / átrendeződését okozza, ami hozzájárulhat a moharost sarjadzás serkentéséhez (Morimoto és mtsai., 2004). A moharost sarjadzás szerepe a mediotemporális epilepszia kialakulásában ma is erősen vitatott (Morimoto és mtsai., 2004). Egyrészt megmutatták, hogy ha cyclohexamiddel meggátolják a moharost sarjadzást akkor is kialakulhatnak epileptikus rohamok (Longo és Mello, 1998), másrészt még az epileptikus hippokampuszban is, ahol a moharost sarjadzás jelentős, nehezen váltható ki epileptikus neuronális aktivitás in vitro. Valószínűleg a moharost sarjadzás csak egy (bár jelentős) azok közül a mechanizmusok közül amik lehetővé teszik az epileptikus rohamok keletkezését és terjedését mediotemporális epilepsziában.

2

Célkitűzések (1)

Az spontán epileptikus rohamok kialakulása folyamán létrejövő szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok funkcionális jellemzése a pilokarpin epilepszia modellben.

(2)

Szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok farmakológiai jellemzése különös tekintettel a szinaptikus áram NMDA komponensére.

(3)

A moharostokból szinaptikus úton ürülő cink posztszinaptikus GABAA és NMDA receptorokra kifejtett hatásainak jellemzése epileptikus állatokban. Módszerek

Pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz Hím Sprague-Dawley patkányokat (150–200 g) 2 mg/kg scopolamin methyl bromiddal majd fél óra múlva 330 mg/kg pilokarpin hydrokloriddal kezeltünk intraperitoneálisan. A státusz epileptikuszt annak kezdete után 3-4 órával Na-phenobarbitállal (50 mg/kg i.p.) állítottuk meg. Szövettani eljárások Pilokarpin kezelés után 10 héttel, egyes kísérletekben 4-6 nappal, 400 µm vastag, a hippokampusz hossztengelyére merőleges szeleteket készítettünk a kaudális hippokampuszból vibratóm segítségével. A szövettanra szánt szeleteket Na2S oldatban 90 percig inkubáltuk, majd 10% foszfát-pufferelt formalinban 4 ºC on 1-2 napig fixáltuk. Ezután a szeleteket albumin-gelatinba ágyaztuk be majd 30 µm vastag szeleteket készítettünk. A páratlan szeleteket Timm-festéssel, a páros szeleteket krezilibolya festéssel festettük. A neurodegeneráció kimutatására epileptikus és kontroll patkányokat transzkardiálisan 4% foszfát-pufferelt paraformaldehiddel átperfundáltunk, majd 3-20 napig a paraformaldehid oldatban 4ºC –on tároltunk. Ezután belőlük 40 µ m vastag horizontális vagy koronális szeleteket készítettünk a fagyasztva metszés technikájával. Váltakozó szeleteket vagy krezil-ibolya festéssel, vagy ezüst impregnációs technikával festettük. Extracelluláris elektrofiziológiai mérések Elektrofiziológiai mérésekre 400 µm vastag agyszeleteket használtunk. A mesterséges cerebrospinális folyadék (ACSF) a következő konponenseket tartalmazta (mM-ban): 122 NaCl, 25 NaHCO3, 3,1 KCl, 1,8 CaCl2, 1,2 MgSO4, 0,4 KH2PO4, and 10 D-glucose, pH 7,4. Stimulálásra 25 µm vastag monopoláris elektródát használtunk, melyet a hippokampusz CA3b stratum lucidum területére helyeztük, 100 µm-re a hilus nyílásától. Az extracelluláris electródát (1M NaCl-dal feltöltött üveg elektróda; 2-6 MΩ ellenállás) a szemcsesejt rétegbe helyeztük. A stimulálást 100 µs széles monopoláris pulzusokkal végeztük, a stimuláló áramot úgy választottuk meg, hogy közel maximális választ hozzon létre. Más kísérletekben a stimuláló elektródát a perforáns pályához helyeztük, ott ahol a perforáns pálya belép a hippokampuszba az entorhinális kéreg felől. Azokban a kísérletekben, amelyekben csak a glutamaterg szinaptikus komponensre voltunk

3

kíváncsiak, 30 µM bicuculline-t (GABAA antagonista) adtunk az extracelluláris folyadékhoz. A visszamaradt szinaptikus komponens glutamaterg voltát NBQX (AMPA antagonista) és D-AP5 (NMDA antagonista) adásával bizonyítottuk. Patch clamp mérések elektromos stimulálással Tradicionális whole-cell patch clamp méréseket végeztünk a gyrus dentatus szemcsesejt rétegében közel az extracelluláris elektródához egy Axopatch 200A erősítővel. Az intracelluláris oldat összetétele a következő volt (mM-ban): 120 cesium gluconate, 10 HEPES, 2 MgATP, és 10 QX-314 (N-ethyl lidocaine) chloride, pH 7,2, az ozmolaritás 276–277 mOsm; ellenállás 5–8 MΩ. A soros ellenállást 75%-ban kompenzáltuk. A jeleket 2 kHz-en szűrtük, 10 kHz-en mintavételeztük és pClamp 6 (Axon) programmal mértük és értékeltük ki. Az antidromikus stimulációval kiváltott excitátoros posztszinaptikus áramokat (EPSC) -80 mV membránpotenciál mellett mértük voltage clamp módban 30-100 µM bicuculline vagy 50 µM picrotoxine mellett és úgy definiáltuk, hogy az az áram, amit 50 µM D-AP5 és 20 µM DNQX vagy 5 µM NBQX blokkol. Az antidromikus stimulációval kiváltott gátló posztszinaptikus potenciálokat (IPSC) 0 mV membránpotenciál mellett mértük és úgy definiáltuk, hogy az az áram, amit 30 µM bicuculline vagy 50 µM picrotoxine blokkol. Az EPSC AMPA és NMDA receptorok által mediált komponenseit egyrészt feszültségfüggésük, másrészt farmakológiájuk alapján különítettük el. Az AMPA receptor mediálta áramot -80 mVon, bicuculline és D-AP5 jelenlétében mértük és úgy definiáltuk, hogy az a komponens amit DNQX blokkol. Az NMDA receptor mediálta áramot -22 mV-on, bicuculline jelenlétében mértük és úgy definiáltuk, hogy az a komponens amit D-AP5 blokkol. Fotostimuláció Egy 80 mW Coherent Enterprise 653 argon ion UV lézert egy Nikon Optiphot-2 mikroszkóphoz kapcsoltunk az epifluoreszcens porton keresztül egy üvegszálas kábel segítségével. A mikroszkóp fel volt még szerelve egy Noran Odyssey konfokális mikroszkóp rendszerrel. A lézer fényét egy 40x Olympus víz-immerziós objektívvel fókuszáltuk. Fotostimulációhoz 200 µM γ-(CNB-caged) L-glutamátot használtunk. Először patch clamp mérést végeztünk egy szemcsesejten -80 és / vagy -20 mV membránpotenciál mellett. Ezután a szemcsesejttől 75 µm-re kezdve fotostimulációt végeztünk a szemcsesejt rétegben. A fotostimuláció 4 ms széles, 50mW teljesítményű lézer pulzusokból állt, amit 15 s-ként alkalmaztunk. Más kísérletekben megpróbáltunk mohasejt – szemcsesejt kapcsolatokat találni, ilyenkor a stimuláló fényimpulzus helyét nem a szemcsesejt rétegen futtattuk végig, hanem a hiluson, ahol a mohasejtek várhatóan elhelyezkedtek. Más kísérletekben 50 µM D-AP5 adásával elkülönítettük az EPSC NMDA és AMPA receptorok mediálta komponenseit. A fotostimuláció helyének valamint a moharost – szemcsesejt kapcsolat megjelenítése DiI hidrofób fluoreszcens festéket forró csukamáj olajban oldottuk fel és egy pipettából injektáltuk a fotostimuláció helyére. Ezzel párhuzamosan a mért szemcsesejtet is feltöltöttük Lucifer Yellow fluoreszcens festékkel. Fixálás után 50 µm szeleteket készítettünk és a konfokális mikroszkóppal képeket készítettünk 488 nm excitáció és egy 510 nm-es felüláteresztő szűrő mellett.

4

Külsőleg adott cink direkt hatásának a mérése GABAA és NMDA receptorokon Cinket az extracelluláris oldatban adtuk 200 µM koncentrációban. Egy üveg mikroelektródát (nyílásátmérő: 5-10 µm) használtunk a GABAA agonista (muscimol, 400 µM) közvetlenül egy mért szemcsesejt dendritjéhez juttatásához. NMDA-receptor mediálta áramokat a perforáns pálya elektromos ingerlésével váltottunk ki és -20 mV membránpotenciálon, 5 µM NBQX és 30 µM bicuculline jelenlétében mértük. Cink hatásának mérése a spontán mini gátló posztszinaptikus áramokra (mIPSC) Cinket az extracelluláris oldatban adtuk 200 µM koncentrációban . Ezekben a mérésekben CsCl-ot használtunk az intracelluláris oldatban. Az extracelluláris oldat 5 µM NBQX-t, 50 µM D-AP5-t valamint 1 µM tetrodotoxint tartalmazott. A méréseket PO4/SO4-mentes ACSF-ben végeztük. Moharostokból felszabaduló cink hatásának mérése a GABAA receptor mediálta áramokra A moharostokat antidromikus stimulálással aktiváltuk NBQX és D-AP5-jelenlétében PO4/SO4 mentes ACSF-ben. A GABAA mediálta áramokat γ-aminobutyrate, α-carboxy2-nitrobenzyl ester-t (cGABA; 200 µM) UV aktiválásával váltottuk ki. A lézert a mért és Alexa 488 fluoreszcens festékkel feltött sejt szómájára, majd attól 50, 75 és 100 µm távolságra fókuszáltuk az apikális dendrit mentén. A cinket a moharostok nagyfrekvenciájú (10 vagy 100 Hz, 1 s –ig vagy 10 Hz, 5 percig) antidromikus stimulálásával bocsátottuk ki. Közben 10 s-ként mértük a GABAA áramot. Néhány kísérletben további lépéseket tettünk, hogy megnöveljük a stimulációval kibocsátott cink mennyiségét, pld. eltávolítottuk a magnéziumot is az extracelluláris oldatból, felemeltük a kálium koncentrációját 6 mM-ra valamint a hőmérsékletet 33°C-ra. cGABA hatásának mérése a monoszinaptikus IPSC-re Egy bipoláris stimuláló elektródát helyeztünk a gyrus dentatus szemcsesejt rétegébe, 200–500 µm távolságra a mért szemcsesejttől. A stimuláláshoz 100 µs hosszúságú négyszög impulzust használtunk és a stimulus áramot úgy választottuk meg, hogy a mért szemcsesejtben közel maximális IPSC-t váltsunk ki. A stimulálást 30 s-ként végeztük. A patch clamp méréseket 0 mV membránpotenciálnál végeztük 5 µM NBQX és 50 µM DAP5 jelenlétében. Egyes mérésekben a membránpotenciált 10 mV lépésenként változtattuk. CaEDTA (cink kelátor) hatása a moharost és a perforáns pálya ingerléssel kiváltott EPSC NMDA receptor mediálta komponensére Az EPSC-ket antidromikus moharost és perforáns pálya ingerléssel váltottuk ki. Az EPSC NMDA receptor mediálta komponensét NBQX-szel szeparáltuk és D-AP5-tel gátoltuk. Ezekben a kísérletekben 1 mM CaEDTA, egy magas affinitású és specifikus cink kelátor hatását teszteltük a moharost (amely nagy koncentrációban tartalmaz cinket) valamint a perforáns pálya (amely nem tartalmaz cinket) stimuláció által kiváltott NMDA áramokra gyrus dentatus szemcsesejteken epileptikus állatokban.

5

Eredmények Sejtpusztulás, moharost sarjadzás és spontán epileptikus rohamok a pilokarpinnal kiváltott státusz epileptikusz után1 Pilokarpin (330 mg/kg, i.p.) státusz epileptikuszt váltott ki az állatok 2/3-ban. A státusz epileptikusz 4 órája alatt ezeknek az állatoknak az 1/3-a elpusztult. Azokat az állatokat, amelyek nem mutatták az epilepszia jeleit, kontrollnak tekintettük, mivel semmilyen további mérés alapján nem tudtuk megkülönböztetni őket a nem kezelt, vagy fiziológiás sóoldattal kezelt állatoktól. A státusz epileptikusz után 3 héttel figyelhettük meg az első spontán komplex parciális roham megjelenését. A rohamok frekvenciája nagy variációt mutatott (heti egytől napi 3-4 roham között). A spontán rohamok frekvenciája az 5. hét végére stabilizálódott és stabil maradt a kísérletsorozat végéig, vagyis a pilokarpin injekciót követő 10. hét végéig. A szövettani és az elektrofiziológiai méréseket pilokarpin adása után 4-6 nappal végeztük, amikorra az állatok már felépültek a státusz epileptikusz akut hatásaiból, de még spontán epileptikus rohamok (sem moharost sarjadzás) nem alakult ki, valamint 10 héttel a státusz epileptikusz után, amikorra a spontán rohamok frekvenciája elérte a maximumot és stabilizálódott. A Timm-féle festési eljárás a moharostokban nagy koncentrációban található cink kimutatására szolgál. Minden epileptikus állatnál megfigyelhető volt az erős moharostokra jellemző festődés a gyrus dentatus belső molekuláris rétegében 10 héttel a kezelés után, míg kontroll állatban sohasem találtunk a szinte észrevehetetlen szporadikus jeleknél erősebb festődést. Státusz epileptikusz után 4-6 nappal a moharost sarjadzás még kimutathatatlan volt. Státusz epileptikusz után 1-3 nappal kiterjedt sejtpusztulás volt megfigyelhető több agyterületen a hippokampuszt is beleértve. A hippokampuszon belül elszórt neuronális degeneráció volt látható a CA1 és CA3 piramissejt rétegében valamint a gyrus dentatus szemcsesejt rétegében. A legerősebb degeneráció a gyrus dentatus hilusban volt, ott a sejtek kb. fele elpusztult. Erős axonális degeneráció volt megfigyelhető a gyrus dentatus belső molekuláris rétegében, ahol a hilusban található mohasejtek axonjai végződnek, míg egyáltalán nem volt axonális degeneráció a külső molekuláris rétegben, ahol a perforáns pálya axonjai végződnek. Ezek az adatok azt sugallják, hogy nagyrészt a hilus mohasejtjei pusztultak el. Kontroll állatokban nem lehetett neuron degenerációt kimutatni. A moharost sarjadzás során létrejövő moharost – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok funkcionális jellemzése A szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok vizsgálatát nehezítette, hogy 1) A szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatok valószínűsége nagyon alacsony, vagyis szinte reménytelen két szinaptikusan összekapcsolt szemcsesejtet találni. 2) A moharostok szelektív aktiválása nehéz mivel a moharostok a hiluson keresztül térnek vissza a molekuláris rétegbe, a hilus pedig sokfajta sejttípust tartalmaz.

1

Okazaki, M., P. Molnar és J. V. Nadler, “Recurrent mossy fiber pathway in the rat dentate gyrus: synaptic currents evoked in the presence and absence of seizure-induced growth,” J. Neurophysiol. 81:1645-1660 (1999).

6

Ezeknek a problémáknak a megoldására háromféle (egymást kiegészítő / megerősítő) módszert dolgoztunk ki: 1) Antidromikus moharost stimulálással kiváltott extracelluláris field-potenciálok vizsgálata a szemcsesejt rétegben 2) Antidromikus moharost stimulálással kiváltott szinaptikus áramok vizsgálata patch clamp módszerrel 3) Preszinaptikus szemcsesejt stimulálása glutamát neurotranszmitter fényimpulzussal történő felszabadításával, és ezzel párhuzamosan a szinaptikus áramok mérése a posztszinaptikus szemcsesejtben patch clamp módszerrel. A moharostok antidromikus stimulálásával egy populációs spike-ot váltottunk ki a szemcsesejtekben, valamint szinaptikus úton egy extracelluláris field potenciált hoztunk létre azon a területen, ahol a moharostok végződtek. A szemcsesejtrétegben extracelluláris elvezetést használva minden esetben megfigyeltük az antidromikus populációs spike-ot, míg a szinaptikus komponenst csak akkor, amikor a moharostok monoszinaptikusan vagy poliszinaptikusan stimulálták magukat a szemcsesejteket. Moharostok antidromikus stimulálásával kiváltott glutamát mediálta field potenciált a státusz epileptikuszon átesett állatok kevesebb, mint felében találtunk, pedig a kísérleteket akkor végeztük, amikor a moharost sarjadzás maximális volt (10 héttel SE után). Ezt a komponenst NBQX-el blokkolni lehetett. Meglepő módon mind a kezelt, mind a kezeletlen kontroll állatokból származó szeletek egy kis százalékában megfigyelhető volt a glutamaterg szinaptikus komponens, amely NBQX-el blokkolható volt. Patch clamp intracelluláris elvezetést használva minden esetben sikerült antidromikus moharost stimulálással egy GABAA receptor mediálta posztszinaptikus áram - komponenst kiváltanunk függetlenül attól, hogy epileptikus vagy kontroll állatról volt szó. 4-6 nappal státusz epileptikusz után a GABAerg feed-back gátlás szignifikánsan csökkent a kontroll csoporthoz viszonyítva. A 10. hétre azonban (a 4-6 naphoz viszonyítva) a kontroll csoportban a GABAerg feed-back gátlás szignifikánsan csökkent, míg az epileptikus állatoknál nem változott, ennek eredményeképpen az epileptikus állatoknál a feedback gátlás a hasonló korú kontrollhoz képest erősebbé vált. Nem csak az epileptikus, hanem a kontroll állatok viszonylag magas százalékában is megfigyeltünk antidromikus moharost stimulálással kiváltható izgató posztszinaptikus áramokat (EPSC). EPSC-t leggyakrabban a státusz epileptikuszon átesett állatok esetén 10 hét elteltével figyelhettünk meg, a vizsgált szeletek 74%-ban. A kezelt kontroll esetén 38%, míg a kezeletlen kontroll esetén 26% volt ez az arány. Az EPSC maximális amplitúdója is szignifikánsan nagyobb volt a státusz epileptikuszon átesett állatok esetén. Az epileptikus állatoknál, ritkán, késleltetett EPSC-ket is megfigyeltünk (több 100 ms késés), amelyek amplitúdóban elérhették a 700 pA is. Az EPSC amplitúdója valamint a Timm-festés alapján megbecsült moharost sarjadzás mértéke között nem volt nyilvánvaló korreláció. Más elektrofiziológiai paraméterekben (membránpotenciál, membrán ellenállás) nem találtunk a csoportok között szignifikáns eltérést. Szintén nem találtunk eltérést a csoportok között semmilyen paraméterben sem 4-6 nappal a pilokarpin adása után. Az antidromikus moharost stimulálással kiváltható EPSC NMDA receptor mediálta komponensét NBQX, majd később D-AP5 adásával határoztuk meg. 10 hét túlélési idő mellett a státusz epileptikusz csoportban nagyobb NMDA áramokat találtunk a kontrollhoz viszonyítva. Az NMDA receptor mediálta áram az AMPA komponenshez

7

viszonyítva is nagyobbnak adódott. Nem találtunk különbséget az NMDA komponens feszültségfüggésében a csoportok között. A moharostokkal szemben a perforáns pályával kapcsolatban nem mutattak ki szinaptikus átrendeződést temporális lebeny epilepsziában. Mi sem találtunk fiziológiai különbséget a kontroll és a státusz epileptikuszon étesett csoportok között a perforáns pálya ingerléssel kiváltott válaszokban (GABAerg, AMPA vagy NMDA receptor mediálta áramok). Az állatok kora, ahogyan azt a moharostok antidromikus stimulálása esetén is megfigyeltük, szignifikánsan befolyásolta a GABAA receptor által mediált komponens nagyságát, az állatok korának előrehaladtával ez a komponens csökkent. A fotostimuláció módszerét2 azért vezettük be, hogy kisszámú szemcsesejtet szelektíven tudjunk stimulálni. Ezekben a kísérletekben egy olyan glutamát analógot használtunk az extracelluláris oldatban, amelynek az aktiválásához egy UV fényimpulzus szükséges. Megállapítottuk, hogy a fotostimulálásnál használt paraméterekkel kb. 12 µm távolságból tudtunk akciós potenciált kiváltani szemcsesejtekből. A szemcsesejt réteg fotostimulációval történő ingerlése a legnagyobb gyakorisággal a státusz epileptikuszon átesett állatok esetében váltott ki EPSC-t a szemcsesejtekben. Általában 7 stimulációs helyet kellet kipróbálnunk, mielőtt találtunk egy szinaptikus kapcsolatot, vagyis kb. 176 – 266 sejtet kellett tesztelnünk. Különböző típusú EPSC-ket figyelhettünk meg. Optimális esetben hirtelen (kb. 10 – 20 ms késéssel) jelentkező egyedi, kb. 30 – 100 pA amplitúdójú egy exponenciális időkonstanssal hanyatló befelé irányuló áramokat láthattunk. Nem mindegyik stimulus indukált EPSC-t, a hiba százalék 60-70% volt. Más sejtek esetén a fotostimuláció komplex EPSC-ket váltott ki, amelyek vagy több egymásra, egymás után szuperponált egyszerű EPSC-ből állt, vagy pedig egymástól elkülöníthetetlen komplex, polisszinaptikusnak tűnő áramokból. Nem találtunk szignifikáns különbséget az EPSC-k tulajdonságaiban (csak a gyakoriságban) a státusz epileptikuszon átesett és a kontroll állatok között. A szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok további jellemzése során megállapítottuk, hogy NMDA receptorok részt vesznek a szinaptikus transzmisszióban. Néhány kísérletben a stimuláció helyét egy hidrofób fluoreszcens festékkel (DiI) jelöltük, míg a mért sejtet Lucifer Yellow-val töltöttük fel. A jelölt, feltehetően szemcsesejt axonok párhuzamosan haladtak a szemcsesejt réteggel és látszólag szinapszist képeztek a jelölt szemcsesejttel. Megfigyelhetőek voltak az óriás (~2 µm) varikozitások a jelölt axonon, ami jellemző a moharostokra. A moharostok által tartalmazott és szinaptikusan kibocsátott cink hatása a szemcsesejtek excitabilitására epileptikus állatokban3 Külsőleg adott cink csak PO4/SO4-mentes ACSF-ben gátolta külsőleg adott muscimollal kiváltott GABAA és perforáns plálya stimulálással kiváltott NMDA mediálta áramokat.

2

Molnar P. és J. V. Nadler, “Mossy fiber - granule cell synapses studied with whole cell patch clamp recording and laser photostimulation,” J. Neurophysiol. 82:1883-1894 (1999). 3 Molnar P. és J. V. Nadler, “Lack of effect of mossy fiber-released zinc on postsynaptic GABAA receptors in the pilocarpine model of epilepsy,” J. Neurophysiol. 85:1932-40 (2001).

8

Külsőleg adott cink szintén gátolta a spontán mini gátló szinaptikus áramokat (mIPSC) PO4/SO4-mentes ACSF-ben. A moharostokból ürülő cink posztszinaptikus GABAA receptorokra kifejtett hatásait a moharostok nagyfrekvenciás (10 és 100 Hz) antidromikus stimulálásával vizsgáltuk, miközben a GABAA receptorokat egy GABA prekurzor fényimpulzussal történő felszabadításával teszteltük. A GABAA receptorokat ott stimuláltuk, ahol a feltételezett moharostok terminálisai találhatók, vagyis 100 µm-nél közelebb a mért és fluoreszcens festékkel feltöltött szemcsesejt szómájához a jelölt dendrit mentén. Mivel megfigyeltük, hogy cGABA gátolta a spontán IPSC-ket, ezért a kísérleteket nem folyattuk addig, amíg meg nem győződtünk arról, hogy a cGABA ezen tulajdonsága nem befolyásolja a méréseink eredményét4. Megállapítottuk, hogy az extracelluláris oldatban adott 160-200 µM cGABA szinte teljesen blokkolta az IPSC-ket és szinte alig módosította az EPSC-ket. Ezzel szemben 200 µM cGABA csak kismértékben gátolta a GABAA receptor mediálta áramokat. Ezekből a mérésekből azt a következtetést vontuk le, hogy cGABA csak kismértékben befolyásolhatja az eredeti mérésünk eredményét. Hogy maximalizáljuk annak a valószínűségét, hogy cink valóban kibocsátódott a szinapszisokból, különböző stimulációs protokollokat (10 Hz, 100 Hz, zéró magnézium, magas kálium, folytonos stimulálás, magasabb hőmérséklet) próbáltunk ki. Ennek ellenére nem találtuk olyan esetet, amikor a moharostok stimulációja megváltoztatta volna a GABAA áramokat a szemcsesejteken. A moharostokból szinaptikus úton ürülő cink hatását az NMDA receptorokra egy magas affinitású és specifikus cink kelátor, CaEDTA segítségével végeztük, valamint kihasználtuk azt a tényt, hogy a moharostok tartalmaznak, míg a perforáns pálya rostjai nem tartalmaznak cinket5. Az extracelluláris oldatba adott 1 mM CaEDTA növelte a moharost stimulációval, de nem változtatta meg a perforáns pálya stimulációval kiváltott NMDA áram amplitúdóját. Megbeszélés Ebben a kísérletsorozatban a temporális lebeny epilepszia kialakulása során jelentkező moharost sarjadzás jelenségét vizsgáltuk hisztológiai, elektrofiziológiai, fotostimulációs és farmakológiai módszerekkel a pilokarpin patkány modellben. Megállapítottuk, hogy a caudális hippokampuszban normál, státusz epileptikuszon nem átesett és spontán epileptikus rohamokat nem mutató állatokban is létrejönnek funkcionális szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok, csak alacsony gyakorisággal. Korábban normál, nem epileptikus állatban szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatokat nem figyeltek meg (Wuarin és Dudek, 1996). Egyik lehetőség, hogy technikai nehézségek miatt nem csak szemcsesejteket, de a dentát hilusban található mohasejteket is stimuláltuk. Ennek ellentmond az a megfigyelés, hogy minden, antidromikus moharos stimulálással vagy fotostimulálással kiváltott EPSC-nek mérhető 4

Molnar P. és J. V. Nadler, “O-(CNB-caged) GABA selectively blocks inhibitory synaptic transmission in rat hippocampal slices,” Eur. J. Pharmacol. 391:255-262 (2000). 5 Molnar P. és J. V. Nadler, “Synaptically-released zinc inhibits N-methyl-D-aspartate receptor activation at recurrent mossy fiber synapses,” Brain Res. 910:205-207 (2001).

9

volt az NMDA-receptor mediálta komponense NBQX jelenlétében, vagyis nagy valószínüséggel monoszinaptikus EPSC-ről volt szó. Ezen kívül a fotostimulációs mérésekben egyértelmüen megfigyelhettünk monoszinaptikusnak tűnő szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatokat a kontroll állatokban is. Ezek alapján az adatok alapján el kellett fogadnunk, hogy legalábbis a caudális hippokampuszban, kis valószínűséggel, de létrejönnek monoszinaptikus szemcsesejt-szemcsesejt kapcsolatok egészséges állatokban is. Státusz epileptikusz után 10 héttel (de nem 4-6 nappal) az epileptikus állatokban drasztikusan megnövekedett a szemcsesejt – szemcsesejt szinapszisoknak a száma. A fotostimulációs mérések adatait használva kiszámolhattuk, hogy SE hatszorosára növeli a szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatok számát, valamint hogy a szinaptikus kapcsolat valószínűsége két szemcsesejt között epileptikus állatokban kb. 0.5%. A státusz epileptikusz szelektíven befolyásolta a moharostok által mediált szinaptikus transzmissziót, mivel a perforáns pálya ingerlésével a szemcsesejtekben kiváltott válaszok nem különböztek epileptikus vs kontroll állatokban. Ezek az eredmények összhangban vannak más kutatók korábbi eredményeivel is a moharost sarjadzás funkcionális következményeivel kapcsolatban. A mi fotostimulációs méréseinkhez hasonló elrendezésben glutamát lokális injekciója a szemcsesejt rétegbe megnövelte a spontán excitatórikus posztszinaptikus áramok frekvenciáját a szemcsesejteken (Wuarin és Dudek, 1996). A mi fotostimulációs méréseink demonstrálták először egyértelműen a szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus kapcsolatok létezését és fiziológiai jellemzőit. A méréseink arra is rávilágítottak azonban, hogy funkcionális szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok még az epileptikus állatokban is, amelyekben hisztológiai módszerekkel nagyon erős moharost sarjadzás mutatható ki, viszonylag ritkák. Ha ehhez hozzávesszük, hogy normál aktivitás esetén a szinaptikus hiba százalék viszonylag magas ezekben a szinapszisokban, akkor nem tűnik valószínűnek, hogy a moharost sarjadzás és az újonnan képződött szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok az elsődleges / egyedüli okai az epileptikus rohamok kialakulásának temporális lebeny epilepsziában. Szemcsesejt – szemcsesejt monoszinaptikus EPSC-k tulajdonságai Az fotostimulációval kiváltott monoszinaptikus EPSC-k amplitúdója (~30 pA) kisebbnek bizonyult a szemcsesejt – CA3 piramissejt esetében korábban leírtaknál (~70 pA) (Jonas és mtsai., 1993) de nagyobbnak a hippokampusz más területein leírt EPSCknél (Allen és Stevens, 1994; Kneisler és Dingledine, 1995). Ez a megfigyelés összhangban van korábbi hisztológiai adatokkal, ugyanis a moharostok axon terminálisai a gyrus dentatus molekuláris rétegében kisebbek, mint a CA3-ban, de mindenképpen nagyobbak mint egy átlagos axon terminális (Okazaki és mtsai., 1995). A mi kísérleteinkben Az EPSC-k időbeli lefutása a szemcsesejteken lassabb volt, mint amit korábban mások a CA3 piramissejtek esetében megfigyeltek (Jonas és mtsai., 1993). Egy lehetséges magyarázat, hogy mi a kísérleteinket öreg állatokon végeztük, és a szemcsesejtek elektrofiziológiai tulajdonságai korfüggőek lehetnek. A viszonylag magas szinaptikus hiba százalék (failure rate), amit kísérleteink során tapasztaltunk, összhangbam van mások megfigyeléseivel a moharost – CA3 szinaptikus kapcsolatokra (Jonas és mtsai.,1993), valamint a Schaffer kollaterális – CA1 piramissejt kapcsolatokra (Allen és Stevens, 1994) vonatkozóan. A moharost – kosársejt szinapszisok esetén a

10

mienkhez hasonló körülmények között a szinaptikus hiba százalék 33%-nak bizonyult (Kneisler és Dingledine 1995). Szemcsesejt – szemcsesejt kapcsolatok AMPA és NMDA komponense Mindhárom mérési módszerünk egybehangzóan bizonyította, hogy mind kontroll, mind epileptikus állatokban a glutamaterg szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus transzmisszióban mind AMPA, mind NMDA receptorok részt vesznek. NMDA receptorok szerepét korábban leírták a moharost – CA3 piramis sejtek (Weisskopf és Nicoll, 1995) valamint a moharost – gátló kosársejtek (Kneisler és Dingledine, 1995) szinaptikus kapcsolatok esetén is. Kísérleteink szerint az NMDA komponens amplitúdója nagyobb volt az epileptikus állatokban, mint a kontroll állatokban (legalábbis, amikor a moharostokat stimuláltuk). Epileptikus fokozott aktivitás során ez kiemelt jelentőségű lehet, mivel ilyenkor a szemcsesejtek depolarizálódnak és a lassan inaktiválódó NMDA receptorok fokozott aktivációja elősegítheti az epileptikus szinkronizált aktivitás terjedését a gyrus dentatuson keresztül (Dingledine és mtsai., 1990; Traub és mtsai., 1994). Ezt azok a korábbi megfigyelések is alátámasztják, amelyek szerint D-AP5, egy NMDA antagonista, gátolta az antidromikus moharost ingerléssel kiváltható epileptikus aktivitás kialakulását a gyrus dentatusban (Patrylo és Dudek, 1998). Az a mechanizmus, amivel az antidromikus moharost stimulálással kiváltott EPSC-k NMDA komponense epileptikus patkányokban többszörösére növekedett, amíg a perforáns pálya ingerléssel kiváltott EPSC-k NMDA komponense nem változott, nem ismert. A fotostimulációs kísérleteinkben nem tapasztaltuk a monoszinaptikus EPSC-k NMDA receptor mediálta komponensének növekedését epileptikus állatokban. Egy lehetséges magyarázat, hogy az antidromikus moharost stimulálás esetén az EPSC-ben nem csak a szinapszisban, hanem az extraszinaptikusan elhelyezkedő NMDA receptorok is részt vehettek. A fotostimulációs kísérletben a stimuláció erőssége sokkal kisebb volt, vagyis valószíműleg az extraszinaptikus NMDA receptorok kevésbé jutottak szerephez. GABAerg gátlás epilepsziában Az antidromikus moharost stimulálással kiváltott gátló posztszinaptikus áramok (IPSC) amplitúdója mintegy 40%-al kisebbnek bizonyult státusz epileptikuszon átesett patkányokban mint a kontroll állatokban 4-6 nappal a státusz epileptikusz után mérve. Ez valószínüleg annak az eredménye, hogy a mohasejtek, amelyek kiemelt szerepet játszanak a gátló interneuronok stimulálásában, szelektíven elpusztulnak státusz epileptikuszt követően (Obenaus és mtsai., 1993). Az igazán meglepő eredmény azonban az volt, hogy kontroll állatokban a moharost-függő GABAerg gátlás szignifikánsan csökken az állatok korának előrehaladtával, és ez a csökkenés nem következik be epileptikus állatokban. Vagyis valamilyen mechanizmus, amely összefügghet a moharost sarjadzással, növeli a moharost-függő GABAerg gátlást a gyrus dentatusban epilepsziás állatokban. Ezt az is alátámasztja, hogy bár a perforáns pálya stimulálással kiváltott IPSC-k amplitúdója is csökkent az állatok korának az előrehaladtával, de itt nem volt különbség az epileptikus és a kontroll állatok között. A mohasejtek pusztulásán kívül a gátló interneuronok szelektív pusztulása is magyarázatot adhat a moharost-függő GABAerg gátlás szelektív csökkenésére a gyrus dentatusban SE után (Buckmaster és Dudek, 1997; Lurton és mtsai., 1997). Korábbi

11

eredmények azt sugallják, hogy a GABAerg interneuronok száma csökken az állatok korának az előrehaladtával (Shetty és Turner, 1998). Az elpusztuló interneuron populáció azonos lehet azzal, amely SE után pusztul el, ez magyarázatot adhat arra, hogy az SE utáni sejtpusztulás lezajlása után a GABAerg gátlás nem csökken tovább epileptikus állatokban. A moharostokból szinaptikusan ürülő cink szerepe epilepsziában Az extracelluláris oldathoz adott cink csökkentette mind a muscimol helyi adásával kiváltott GABAA receptor mediálta áramokat, mind a perforáns pálya ingerlésével kiváltott NMDA receptor mediálta áramokat, de csak akkor, amikor a kétértékű anionokat eltávolítottuk az extracelluláris oldatból. Cink szintén csökkentette a spontán gátló posztszinaptikus áramok amplitúdóját. Cink a mi kísérleteinkben jelentősen gyengébben gátolta a GABAA receptorokat mint ahogyan azt más kutatók korábban leírták (Gibbs és mtsai., 1997). Ennek egy lehetséges magyarázata lehet, hogy mi a szemcsesejtek dendritjén, a gyrus dentatus belső molekuláris rétegében teszteltük a GABAA receptorokat agyszeletben, míg a korábbi kísérleteket izolált sejteken, a sejt szómáján elhelyeszkedő receptorokon végezték. Antidromikus moharost stimulálás NBQX és D-AP5 jelenlétében semmilyen hatással sem volt a szemcsesejtek dendritjén fotostimulálással kiváltott GABAA receptor mediálta áramokra epileptikus állatokban, még olyan körülmények között sem, amikor a cink ürülésének valószínüségét megnöveltük. A kísérletek technikai nehézségei miatt ez az eredmény nem jelenti azt, hogy 100% biztonsággal kizártuk ezt a lehetőséget, de mindenesetre a valószínüsége annak, hogy ez bekövetkezzék a mi méréseink alapján nagyon alacsony. Ahhoz, hogy a moharostokból ürülő cink gátolhassa a GABAA receptorokat, először is elég nagy koncentrációban kell kilépnie a terminálisokból ahhoz, hogy a szinaptikus résből kijutva elérje a szomszédos GABAerg terminálisokat még elég magas koncentrációban ahhoz, hogy gátolni tudja azokat. A cink szabad diffúzióját a szinaptikus résből két folyamat is gátolja. Az egyik: a neurotranszmitterekhez hasonlóan létezik olyan transzporter, amelynek a feladata cink visszavétele a preszinaptikus terminálisba, vagyis preszinaptikus aktivitás után a cink koncentrációja nagyon gyorsan csökken a szinapszisban, nem a viszonylag lassú diffúzió a meghatározó tényező (Howell és mtsai., 1984). Másodsorban a sejtközötti folyadék mindíg tartalmaz kétértékü anionokat, amelyek megkötik a szabad cinket így azt hatástalanítják. A cinknek ezek a tulajdonságai magyarázatul szolgálhatnak a negatív eredményünkre. Más kísérletekben megállapítottuk, hogy a szinaptikusan a moharostokból ürülő cink kismértékben gátolta a posztszinaptikus NMDA receptorokat, vagyis játszhat (eszerint gátló) szerepet az epileptikus rohamok kialakulásában. Későbbi saját mérések és más kutatók vizsgálatai ellentmondó képet festettek a cink lehetséges szerepéről epilepsziában, de általában a cink hatása kicsi volt és igen nehezen kimutatható vagy értékelhető. Legújabb eredmények szerint cink epileptogén hatású a kindling modellben (Foresti és mtsai., 2008), nincs hatása a pilokarpin által kiváltott rohamokra (Noyan és mtsai., 2007) de más szerzőknél facilitálta a gyrus dentatus szemcsesejtjeinek epileptikus aktivitását kifejlett epilepszia esetén a pilokarpin modellben (Timofeeva és Nadler, 2006).

12

Az általunk használt GABA prekurzornak korábbi mérések szerint semmilyen aktivitása nem volt GABAA receptorokon (Gee és mtsai., 1994). A mi kísérleti rendszerünkben cGABA 200 µM koncentrációban egy gyenge GABAA receptor antagonistaként viselkedett. Ezzel ellentétben cGABA jelenlétében a GABA mediálta spontán IPSC-k teljesen eltűntek a szemcsesejteken mérve. cGABA-nak nem volt mérhető hatása az glutamaterg szinaptikus transzmisszióra a gyrus dentatusban. Méréseink alapján nem tudtuk egyértelműen eldönteni, vajon cGABA hatása a GABAerg szinaptikus transzmisszióra preszinaptikus vagy posztszinaptikus mechanizmussal mediálódik-e. cGABA hatása a GABAerg szinaptikus transzmisszióra hasonlónak mutatkozott, mint amit bizonyos phenothiazine-típusú antipszichotikus gyógyszerek esetén leírtak (Zorumski és Yang, 1988). A mi kísérletünk szempontjából úgy gondoltuk, a cGABA által a GABAA receptorokra kifejtett, a mi kísérleti körülményeink között gyenge gátlás nem befolyásolta a méréseink kimenetelét, különösen, hogy cGABA-nak semmilyen hatása sem volt a glutamaterg transzmisszióra és így nagy valószínüséggel a cink szinaptikus ürülésére sem.

13

Összefoglalás Ebben a kísérletsorozatban megmutattuk, hogy funkcionális szemcsesejt-szemcsesejt kapcsolatok normál, nem epileptikus patkányokban is megfigyelhetők a kaudális hippokampuszban. Státusz epileptikusz hatására a moharost sarjadzás során a funkcionális szemcsesejt – szemcsesejt szinapszisok száma drasztikusan megnő. Ezek az újonnan képződött szinapszisok fiziológiai és farmakológiai tulajdonságaikban nem különböznek a kontroll állatokban megfigyelhető szemcsesejt – szemcsesejt szinapszisoktól. A szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus jelátvitelben nem csak AMPA, de NMDA receptorok is részt vesznek. A moharostokból szinaptikus aktivitás során ürülő cink folyamatosan és lehet, hogy frekvenciafüggően6 gátolja a posztszinaptikus NMDA receptorokat, de valószínűleg a szomszédos GABAerg szinapszisok működésére csak minimális hatással van. Ezek az eredmények alátámasztják azt az elméletet, hogy a moharost sarjadzás során egy funkcionális pozitív visszacsatolás jön létre a gyrus dentatusban, amely növeli a gyrus dentatus excitabilitását és elősegítheti az epileptikus aktivitás keletkezését / terjedését; azonban a szemcsesejt – szemcsesejt szinaptikus kapcsolatok még epileptikus állatokban is viszonylag ritkák, vagyis a moharost sarjadzás valószínüleg nem lehet az epilepszia kialakulásának elsődleges / egyetlen mechanizmusa. Köszönetnyilvánítás Köszönetemet szeretném nyilvánítani Dr. Victor Nadlernek, akinek a laborjában ezeket a méréseket végezhettem, Dr. Maxine Okazakinak, aki sokat segített az agyszelet elektrofiziológiai módszerek elsajátításában, Dr. Hernádi Istvánnak, jelenlegi konzulensemnek, a sok segítségért, amit kaptam tőle, Dr. Csoknya Mária Professzor Asszonynak a dolgozat többszöri átnézéséért és javításáért, valamint az önzetlen segítségéért, Dr. Gábriel Róbert Rektor Úrnak, a Doktori Iskola vezetőjének hogy

lehetővé

tette

a

programban

való

részvételemet

valamint

a

Pécsi

Tudományegyetem Biológia Doktori Iskola minden közreműködőjének színvonalas munkájáért.

6

Feng, L., P. Molnar és J. V. Nadler: Short-Term Frequency-Dependent Plasticity at Recurrent Mossy Fiber Synapses of the Epileptic Brain. J. Neurosci. 23. 5381-5390 (2003).

14

Irodalom Acsady, L., A. Kamondi, A. Sik, T. Freund és G. Buzsaki (1998). "GABAergic Cells Are the Major Postsynaptic Targets of Mossy Fibers in the Rat Hippocampus." Journal of Neuroscience 18(9): 33863403. Allen, C. és C. F. Stevens (1994). "An Evaluation of Causes for Unreliability of Synaptic Transmission." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91(22): 10380-10383. Amaral, D. G., H. E. Scharfman és P. Lavenex (2007). "The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies) " Progress in Brain Research 163: 3-22. Buckmaster, P. S. és F. E. Dudek (1997). "Neuron loss, granule cell axon reorganization, and functional changes in the dentate gyrus of epileptic kainate-treated rats." Journal of Comparative Neurology 385(3): 385-404. Cavalheiro, E. A. (1995). "The Pilocarpine Model of Epilepsy." Italian Journal of Neurological Sciences 16(12): 33-37. Cronin, J., A. Obenaus, C. R. Houser és F. E. Dudek (1992). "Electrophysiology of Dentate Granule Cells after Kainate-Induced Synaptic Reorganization of the Mossy Fibers." Brain Research 573(2): 305-310. Curia, G., D. Longo, G. Biagini, R. S. G. Jones és M. Avoli (2008). "The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy." Journal of Neuroscience Methods 172(2): 143-157. Dingledine, R., C. J. Mcbain és J. O. Mcnamara (1990). "Excitatory Amino-Acid Receptors in Epilepsy." Trends in Pharmacological Sciences 11(8): 334-338. Foresti, M. L., G. M. Arisi, A. Fernandes, C. Q. Tilelli és N. Garcia-Cairasco (2008). "Chelatable zinc modulates excitability and seizure duration in the amygdala rapid kindling model." Epilepsy Research 79(2-3): 166-172. Gee, K. R., R. Wieboldt és G. P. Hess (1994). "Synthesis and Photochemistry of a New Photolabile Derivative of Gaba - Neurotransmitter Release and Receptor Activation in the Microsecond Time Region." Journal of the American Chemical Society 116(18): 8366-8367. Gibbs, J. W., M. D. Shumate és D. A. Coulter (1997). "Differential epilepsy-associated alterations in postsynaptic GABA(A) receptor function in dentate granule and CA1 neurons." Journal of Neurophysiology 77(4): 1924-1938. Haas, C. és M. Frotscher (2009). "Reelin deficiency causes granule cell dispersion in epilepsy." Experimental Brain Research Published Online. Halász, P. és A. Fogarasi (2006). "Temporal lobe epilepsy--state of art review - Temporalis lebeny epilepszia-"state of art" beszámoló." Ideggyógyászati szemle 59(9-10): 331-352. Hardison, J. L., M. M. Okazaki és J. V. Nadler (2000). "Modest increase in extracellular potassium unmasks effect of recurrent mossy fiber growth." Journal of Neurophysiology 84(5): 2380-2389. Howell, G. A., M. G. Welch és C. J. Frederickson (1984). "Stimulation-Induced Uptake and Release of Zinc in Hippocampal Slices." Nature 308(5961): 736-738. Jonas, P., G. Major és B. Sakmann (1993). "Quantal Components of Unitary Epscs at the Mossy Fiber Synapse on Ca3 Pyramidal Cells of Rat Hippocampus." Journal of Physiology-London 472: 615-663. Kneisler, T. B. és R. Dingledine (1995). "Synaptic Input From CA3 Pyramidal Cells to Dentate Basket Cells in Rat Hippocampus." Journal of Physiology-London 487(1): 125-146. Longo, B. M. és L. E. A. M. Mello (1998). "Supragranular mossy fiber sprouting is not necessary for spontaneous seizures in the intrahippocampal kainate model of epilepsy in the rat." Epilepsy Research 32(1-2): 172-182. Lothman, E. W., J. L. Stringer és E. H. Bertram (1992). "The Dentate Gyrus as a Control Point for Seizures in the Hippocampus and Beyond." Epilepsy Research: 301-313. Lurton, D., L. Sundstrom, C. Brana, B. Bloch és A. Rougier (1997). "Possible mechanisms inducing granule cell dispersion in humans with temporal lobe epilepsy." Epilepsy Research 26(2): 351-361. Magloczky, Z. és T. F. Freund (2005). "Impaired and repaired inhibitory circuits in the epileptic human hippocampus." Trends in Neurosciences 28(6): 334-340. Molnar, P. és J. V. Nadler (1999). "Mossy fiber-granule cell synapses in the normal and epileptic rat dentate gyrus studied with minimal laser photostimulation." Journal of Neurophysiology 82(4): 1883-1894. Morimoto, K., M. Fahnestock és R. J. Racine (2004). "Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain." Progress in Neurobiology 73(1): 1-60. Noyan, B., M. S. Jensen és G. Danscher (2007). "The lack of effects of zinc and nitric oxide in initial state of pilocarpine-induced seizures." Seizure-European Journal of Epilepsy 16(5): 410-416.

15

Obenaus, A., M. Esclapez és C. R. Houser (1993). "Loss of Glutamate-Decarboxylase Messenger-Rna Containing Neurons in the Rat Dentate Gyrus Following Pilocarpine-Induced Seizures." Journal of Neuroscience 13(10): 4470-4485. Okazaki, M. M., D. A. Evenson és J. V. Nadler (1995). "Hippocampal Mossy Fiber Sprouting and Synapse Formation after Status Epilepticus in Rats - Visualization after Retrograde Transport of Biocytin." Journal of Comparative Neurology 352(4): 515-534. Okazaki, M. M., P. Molnar és J. V. Nadler (1999). "Recurrent mossy fiber pathway in rat dentate gyrus: Synaptic currents evoked in presence and absence of seizure-induced growth." Journal of Neurophysiology 81(4): 1645-1660. Parent, J. M., R. C. Elliott, S. J. Pleasure, N. M. Barbaro és D. H. Lowenstein (2006). "Aberrant seizureinduced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy." Annals of Neurology 59(1): 81-91. Patrylo, P. R. és F. E. Dudek (1998). "Physiological unmasking of new glutamatergic pathways in the dentate gyrus of hippocampal slices from kainate-induced epileptic rats." Journal of Neurophysiology 79(1): 418-429. Ribak, C. E. (1985). "2 Different Abnormal Gabaergic Circuits in Experimental-Models of Epilepsy - Loss of Inhibition and Disinhibition." Epilepsia 26(5): 525-525. Ribak, C. E. és G. M. Peterson (1991). "Intragranular mossy fibers in rats and gerbils from synapses with the somata and proximal dendrites of basket cells in the dentate gyrus." Hippocampus 1(4): 355-364. Scharfman, H., J. Goodman és D. McCloskey (2007). "Ectopic granule cells of the rat dentate gyrus." Developmental Neuroscience 29(1-2): 14-27. Scharfman, H. E., A. L. Sollas, R. E. Berger és J. H. Goodman (2003). "Electrophysiological evidence of monosynaptic excitatory transmission between granule cells after seizure-induced mossy fiber sprouting." Journal of Neurophysiology 90(4): 2536-2547. Sharma, A. K., R. Y. Reams, W. H. Jordan, M. A. Miller, H. L. Thacker és P. W. Snyder (2007). "Mesial temporal lobe epilepsy: Pathogenesis, induced rodent models and lesions." Toxicologic Pathology 35(7): 984-999. Shetty, A. K. és D. A. Turner (1998). "Hippocampal interneurons expressing glutamic acid decarboxylase and calcium-binding proteins decrease with aging in Fischer 344 rats." Journal of Comparative Neurology 394(2): 252-269. Sloviter, R. S. (1994). "The Functional-Organization of the Hippocampal Dentate Gyrus and Its Relevance to the Pathogenesis of Temporal-Lobe Epilepsy." Annals of Neurology 35(6): 640-654. Tauck, D. L. és J. V. Nadler (1985). "Evidence of Functional Mossy Fiber Sprouting in HippocampalFormation of Kainic Acid-Treated Rats." Journal of Neuroscience 5(4): 1016-1022. Timofeeva, O. és J. V. Nadler (2006). "Facilitation of granule cell epileptiform activity by mossy fiberreleased zinc in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy." Brain Research 1078: 227-234. Traub, R. D., J. G. R. Jefferys és M. A. Whittington (1994). "Enhanced Nmda Conductance Can Account for Epileptiform Activity-Induced by Low Mg2+ in the Rat Hippocampal Slice." Journal of PhysiologyLondon 478(3): 379-393. Vogt, K., J. Mellor, G. Tong és R. Nicoll (2000). "The actions of synaptically released zinc at hippocampal mossy fiber synapses." Neuron 26(1): 187-196. Wuarin, J. P. és F. E. Dudek (1996). "Electrographic seizures and new recurrent excitatory circuits in the dentate gyrus of hippocampal slices from kainate-treated epileptic rats." Journal of Neuroscience 16(14): 4438-4448. Zorumski, C. F. és J. Yang (1988). "Non-Competitive Inhibition of Gaba Currents by Phenothiazines in Cultured Chick Spinal-Cord and Rat Hippocampal-Neurons." Neuroscience Letters 92(1): 86-91.

16

Közlemények

A disszertáció alapjául szolgáló tudományos közlemények 1. Okazaki, M., P. Molnar és J. V. Nadler, “Recurrent mossy fiber pathway in the rat dentate gyrus: synaptic currents evoked in the presence and absence of seizure-induced growth,” J. Neurophysiol. 81:16451660 (1999). 2. Molnar P. és J. V. Nadler, “Mossy fiber - granule cell synapses studied with whole cell patch clamp recording and laser photostimulation,” J. Neurophysiol. 82:1883-1894 (1999). 3. Molnar P. és J. V. Nadler, “O-(CNB-caged) GABA selectively blocks inhibitory synaptic transmission in rat hippocampal slices,” Eur. J. Pharmacol. 391:255-262 (2000). 4. Molnar P. és J. V. Nadler, “Lack of effect of mossy fiber-released zinc on postsynaptic GABAA receptors in the pilocarpine model of epilepsy,” J. Neurophysiol. 85:1932-40 (2001). 5. Molnar P. és J. V. Nadler, “Synaptically-released zinc inhibits N-methyl-D-aspartate receptor activation at recurrent mossy fiber synapses,” Brain Res. 910:205-207 (2001). 6. Feng, L., P. Molnar és J. V. Nadler: Short-Term Frequency-Dependent Plasticity at Recurrent Mossy Fiber Synapses of the Epileptic Brain. J. Neurosci. 23. 5381-5390 (2003).

A disszertáció alapjául szolgáló konferencia előadások és poszterek 1. Molnár, P. és J.V. Nadler: Mossy fiber - granule cell synapses studied with whole cell patch clamp recording and laser photostimulation (27th. Annual meeting of American Neuroscience Association, New Orleans, USA, 1997).

Egyéb tudományos közlemények 1. Gaál L. és P. Molnár, “Effects of vinpocetine on noradrenergic neurons in rat locus coeruleus,” Eur. J. Pharmacol. 187:537-539 (1990). 2. Molnár P. és L. Gaál, “Effect of different subtypes of cognition enhancers on long-term potentiation in the rat dentate gyrus in vivo,” Eur. J. Pharmacol. 215:17-22 (1992). 3. Tarnawa, I., P. Molnár, L. Gaál, és F. Andrási, “Inhibition of hippocampal field potentials by GYKI 52466 in vitro és in vivo,” Acta Physiol. Hungarica 79:169-175 (1992). 4. Molnár P., L. Gaál, és Cs. Horváth, “The impairment of long-term potentiation in rats with medial septal lesion és its restoration by cognition enhancers,” Neurobiology 2:255-266 (1994). 5. Maksay G., P. Molnár, és L. Gruber, “Common modes of action of g -butyrolactones and pentylenetetrazol on the convulsant és benzodiazepine sites and channel activity of the GABA receptor-ionophore complex,” Eur. J. Pharmacol. - Mol. Pharmacol.Sect. 288:61-68 (1994). 6. Molnár P. és S.L. Erdő, “Vinpocetine is as potent as phenytoin in blocking voltage-gated sodium channels in rat cortical neurons,” Eur. J. Pharmacol. 273:303-306 (1995). 7. Lakics V., P. Molnár, és S.L. Erdő, “Protection against veratridine toxicity in rat cortical neurons: relationship to sodium channel blockade,” Neuroreport 7:89-92 (1995). 8. Maksay G., P. Molnár, és M. Simonyi, “Thermodinamics and kinetics of t-butylbicyclophosphorothionate binding differentiate convulsant and depressant barbiturate stereoisomers acting via GABAA ionophores,” Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology 353:306-13 (1996). 9. Molnár P. és S.L. Erdő, “Differential effects of five glycine site antagonists on NMDA receptor desensitization,” Eur. J. Pharmacol. 311:311-314 (1996). 10. Erdő S.L., P. Molnár, V. Lakics, J.Zs. Bence, és Zs. Tömösközi, “Vincamin and vincanol are potent blockers of voltage-gated Na channels,” Eur. J. Pharmacol. 314:69-73 (1996). 11. Das, M., P. Molnar, H. Devaraj, M. Poeta és J. J. Hickman: Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motoneurons in a defined system. Biotechnology Progress 19. 1756-1761 (2003) 12. Das, M., P. Molnar, C. Gregory, L. M. Riedel és J. J. Hickman: Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on organosilane surface in serum-free media. Biomaterials, 25: 5643-47 (2004)

17

13. Natarajan, A., P. Molnar, K. Sieverdes, A. Jamshidi és J.J. Hickman: Microelectrode array recordings of cardiac action potentials as a high throughput method to evaluate pesticide toxicity. In Vitro Toxicology, 20 (3): 375-81 (2005) 14. Mohan, D. K., P. Molnar, és J. J. Hickman: Toxin detection based on action potential shape analysis using a realistic mathematical model of differentiated NG108-15 cells. Biosensors and Bioelectronics, 21 (9): 1804-11 (2006) 15. Das M, Bhargava N, Gregory C, Riedel L, Molnar P és Hickman JJ. Adult Rat Spinal Cord Culture on an Organosilane Surface in a Novel Serum-Free Medium. In Vitro – Animal, 41 (10): 343-8 (2005) 16. Peng, P.L., Zhong, X., Tu W., Soundarapandian, M.M., Molnar, P. Zhu D., Lau L., Liu S. , Liu F. és Lu Y.M. ADAR2-Dependent RNA Editing of AMPA Receptor Subunit GluR2 Determines Vulnerability of Neurons in Forebrain Ischemia. Neuron, 49, 719-733 (2006). 17. Xu, T., C. Gregory, P. Molnar, S. Jalota, S. B. Bhaduri, T. Boland: Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures made by the Inkjet Printing. Biomaterials, 27, 3580-3588. (2006) 18. Das M., C. Gregory, P. Molnar, L. M. Riedel és J. J. Hickman: A Defined System to Allow Skeletal Muscle Differentiation and Subsequent Integration with Silicon Microstructures. Biomaterials. 27, 4374-80 (2006) 19. Molnar P., W. Wang, A. Natarajan, J. W. Rumsey és J. J. Hickman: Photolithographic Patterning of C2C12 Myotubes using Vitronectin as Growth Substrate in Serum-Free Medium. Biotechnology Progress, 23: 265-268 (2007) 20. Wilson K. A., P. Molnar és J. J. Hickman: Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a Chip, 7, 920-922 (2007) 21. Das, M., K. Wilson, P. Molnar, és J. J. Hickman: Differentiation of skeletal muscle and integration of myotubes with silicon microstructures using serum-free medium and a synthetic silane substrate. Nature Protocols, 2, 1795-1801. (2007) 22. Das, M., J. W. Rumsey, C. A. Gregory, N. Bhargava, J. F. Kang, P. Molnar, L. Riedel, X. Guo és J. J. Hickman: Embryonic motoneuron-skeletal muscle co-culture in a defined system. Neuroscience, 146. 481-488 (2007) 23. Rumsey, J. W., M. Das, J. F. Kang, R. Wagner, P. Molnar és J. J. Hickman: Tissue engineering intrafusal fibers: Dose- and time-dependent differentiation. Biomaterials. 29. 994-1004 (2008) 24. Ramalingam, M., P. Molnar, K. P. Rao és J. J. Hickman: Biomaterial Surface patterning utilizing self assembled monolayers to control neuronal cell behavior. International Journal of Biomedical Engineering and Technology. 2, 104 - 134 (2009) 25. Natarajan A., C.J. Chun, J.J. Hickman és P. Molnar: Growth and Electrophysiological Properties of Rat Embryonic Cardiomyocytes on Hydroxyl- and Carboxyl-Modified Surfaces. Journal of Biomaterials Science: Polymer Edition. 19, 1319-31 (2008) 26. Rolland, J., K. , K. S. Lee, L. A. Mahmood, L. Fluck, J. Duarte, I. Kaya, A. Santhanam, P. Meemon, S. Murali, O. Ilegbusi, P. Kupelian, W. Warren, P. Molnar, J. J. Hickman és P. E. Kolattukudy. " Collaborative Engineering: 3-D Optical Imaging and Gas Exchange Simulation of In-Vitro Alveolar Constructs." Studies in health technology and informatics 132: 426-432. (2008) 27. Thakore, V., A. Behal, P. Molnar, D. Leistritz és J.J. Hickman, Nanoscale Nonlinear Dynamic Characterization of the Neuron-Electrode Junction. Journal of Computational and Theoretical Nanoscience, 5, 2164-2169 (2008) 28. Liu, J., J.W. Rumsey, M. Das, P. Molnar, C. Gregory, L. Riedel, et al., Electrophysiological and immunocytochemical characterization of DRG neurons on an organosilane surface in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 44(5-6): p. 162-168. (2008) 29. Varghese, K., M. Das, N. Bhargava, M. Stancescu, P. Molnar, M. S. Kindy és J. J. Hickman: Regeneration and characterization of adult mouse hippocampal neurons in a defined in vitro system . Journal of Neuroscience Methods: 177, 51-59 (2009) 30. Dhir, V., A. Natarajan, M. Stancescu, A. Chunder, N. Bhargava, M. Das, L. Zhai, P. Molnar: Patterning of diverse mammalian cell types in serum free medium with photoablation. Biotechnology Progress: 25, 594-603 (2009) 31. Xu, T., P. Molnar, C. Gregory, M. Das, T. Boland és J.J. Hickman: Electrophysiological characterization of embryonic hippocampal neurons cultured in a 3D collagen hydrogel. Biomaterials. In Press (2009)

18

Egyéb konferencia előadások és poszterek 1. Kang J-F, M. Poeta, L. Riedel, M. Das, C. Gregory, P. Molnar és J. J. Hickman, “Patterned Neuronal Networks for Robotics, Neurocomputing, Toxin Detection and Rehabilitation,” Proceeding of 24th Army Science Conference, Nov. 29th, 2004. 2. Hickman, JJ, Das, M., Kang, J-F, Chun, ChJ, Molnar, P., Wilson, K., Varghese, K. és Leistritz, D.: Hybrid Biological / Non-biological Systems for Toxin Detection, Functional Drug Screening and as Disease Models. Florida Tech Transfer Conference, Orlando, May 2005. Regional 3. Das, M., Bhargava, N., Patil, S., Riedel, L., Molnar, P., Seal, S. és Hickman, J.J.: Novel In Vitro Cell Culture Model of Adult Mammalian Spinal Cord Cells. In vitro Biology Meeting, Baltimore, June 2005, International 4. Molnar, P., Mohan, D.K. és Hickman, J.J.: Toxin detection based on action potential shape analysis using a realistic mathematical model of differentiated NG108-15 cells. Society for Neuroscience, Washington, November, 2005, International 5. Hickman, J.J., Molnar, P., Das, M., Riedel, L., Kang, J-F., Chun, ChJ. és Wilson, K.: Patterned Neuronal Networks for High-Throughput Functional Drug Screening and for Functional Models of Neurodegenerative Diseases. Society for Neuroscience, Washington, November, 2005, International 6. Molnar, P. és Hickman, J.J.: Engineered Neuronal Networks. Winter conference on neuronal plasticity. Guadeloupe, February, 2005, International 7. Mitchell P.O., Molnar, P., Gourdie R.G., Borg, T.K. és Gao, B.Z.: Fibroblast-Myocyte Electrical Coupling in a Micropatterned Cell Coculture Biomedical Engineering Society, Baltimore, September, 2005. International 8. Kerry A. Wilson, Mainak Das, P. Molnar, és J. J. Hickman: Reflex-arc on a chip: An in silico cell culture analog American Chemical Society Meeting & Exposition. March 26 - 30, 2006. Atlanta, GA USA 9. Peter Molnar, Melissa Kuchma, Anupama Natarajan, Jung-Fong Kang, Neelima Bhargava, Mainak Das és J. J. Hickman: Photolithographical patterning of single cells and cell assemblies on commercial multielectrode arrays. 5th MEA meeting on Substrate Embedded Microelectrode Arrays, July 04-07, 2006, Reutlingen, Germany, 10. Peter Molnar, Jung-Fong Kang, Neelima Bhargava, Mainak Das, Anupama Natarajan és James J. Hickman: Design, implementation and characterization of engineered neuronal networks. FENS Forum, July 8-12, 2006, Vienna, Austria 11. Peter Molnar, Jung-Fong Kang, Neelima Bhargava, Mainak Das, Anupama Natarajan és James J. Hickman: Characterization and applications of engineered neuronal networks. 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, October 14-18, 2006 Atlanta, GA 12. Thakore, V., A. Behal, P. Molnar, D. C. Leistritz és J. J. Hickman: Nonlinear dynamic characterization of the neuron-electrode interface. 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, October 14-18, 2006 Atlanta, GA 13. Kerry A. Wilson, Mainak Das, J. W. Rumsey, Peter Molnar, és J. J. Hickman: A Bio-MEMS Device for Modeling the Reflex-arc. 53rd Annual conference of the American Vacuum Society Meeting. Novemver 12-17, 2006. San Francisco, 14. Peter Molnar, Neelima Bhargava, Mainak Das, Anupama Natarajan, Kerry Wilson és James J. Hickman: Integration of living cells with silicon nanostructures for MEMS applications. NSTI Nanotech 10th Annual Conference. May 20-24, 2007 Santa Clara, CA, USA 15. Vipra Dhir, Anupama Natrajan, Anindarupa Chunder, Neelima Bhargava, Mainak Das, Lei Zhai, Peter Molnar: Micropatterned self assembled polyelectrolyte based cytophobic coatings. 234th ACS National Meeting, August 19-23, 2007. Boston, MA, USA 16. Anupama Natarajan, Peter Molnar, Neelima Bhargava, Vipra Dhir, Mainak Das, Kucku Varghese és James J Hickman: Surface modification and photolithographic patterning of microelectrode arrays for cell-based biosensor applications. 234th ACS National Meeting, August 19-23, 2007. Boston, MA, USA 17. Vipra Dhir, Anupama Natrajan, Anindarupa Chunder, Lei Zhai, Peter Molnar: Micropatterning cardiac myocytes on self assembled polyelectrolyte multilayers Materials Science Society 2007 Fall Meeting, November 26 - 30, 2007, Boston, MA, USA 18. Kerry A. Wilson, Mainak Das, Peter Molnar, Kathy J. Wahl, Richard J. Colton és James J. Hickman: A Bio-MEMS Device for Measuring Contractile Forces of Cultured Myotubes on Microfabricated Cantilevers. AVS 54th International Symposium October 14-19, 2007, Seattle, USA.

19

19. Anupama Natarajan, Neelima Bhargava, Peter Molnar, Mainak Das, James J. Hickman: Surface Modification and Photolithographic Patterning of Microelectrode Arrays for Cell-Based Biosensor Applications. AVS 54th International Symposium October 14-19, 2007, Seattle, USA

20

Thesis of PhD Dissertation

Synaptic Reorganization as the Mechanism of the Development of Epilepsy – Electrophysiological and Photostimulation Measurements in a Rat Model of Epilepsy

Péter Molnár

Consultant: Dr. Hernádi István, Ph.D.

UNIVERSITY OF PÉCS Doctoral Program in Biology

Pécs, 2010 1

Introduction Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common epileptic syndrome in adults (Halász et al. 2006). In most of TLE patients epilepsy can be traced back to some form of initial brain damage, which, after a long latent period, leads to functional reorganization in the brain resulting in the emergence of spontaneous seizures (Sharma et al. 2007). Hippocampal lesion is present in about 70-80% of the cases, and it characterized by neuronal degeneration, astroglyosis, dispersion of granule cells and aberrant mossy fiber sprouting. Mossy fiber sprouting is the reorganization of the axons of the granule cells (these are the mossy fibers). During this process mossy fibers appear in the dendritic layer of the granule cells and form excitatory synaptic connections with granule cells (Sloviter 1994). It is widely accepted, that this positive feedback, created by mossy fiber sprouting, could play a role in the development of epileptic seizures. The chronic epileptic state evoked by a single injection of pilocarpine in rats considered as one of the best model of human TLE, because it is reproducing not only the physiological and histopathological symptoms, but also the mechanism of the progression of the disease (Curia et al. 2008). Acute pilocarpine treatment causes status epilepticus (SE) in rats and the prolonged generalized seizure causes permanent damages in the brain resulting in the development of chronic epilepsy. The pattern of neurodegeneration throughout the brain in this model is very similar to that described in human TLE initiated by brain injury (Cavalheiro 1995). The mossy cells in the dentate gyrus almost completely disappear in this model, which increases the excitability of the dentate gyrus, because the mossy cells play an important role in the feed-back and feed-forward inhibition in this brain area (Lothman et al. 1992; Ratzliff et al. 2004). The main input of the mossy cells is the mossy fibers, but they might also receive some innervations from the perforant path (Amaral et al. 2007). The axons of mossy cells are forming excitatory synapses mostly with inhibitory interneurons. Neurogenesis is drastically speeding up in the dentate gyrus after status epilepticus in the pilocarpine model (Parent et al. 2006). The newly born granule cells could play a major role in the development of seizure activity, because they are hyperexcitable and located deep in the hilus, thus they could receive aberrant synaptic connections from granule cells. According to other theories, they could increase inhibition by taking over the role of degenerated mossy cells in feed-back and feed-forward inhibition (Scharfman et al. 2007). According to other researchers the role of the newly born granule cells is minimal in TLE (Haas et al. 2009). Mossy fiber sprouting occurs during the ‘quiet period’ after status epilepticus in the pilocarpine model (Tauck et al. 1985; Okazaki et al. 1995; Scharfman et al. 2003). Similar synaptic reorganization has already been described in other brain areas, but there is no simple and specific staining method exists for those pathways. It is not clear, what is the role of synaptic reorganization in epilepsy, because its effect could be either epileptic or anti-epileptic depending on the type of cells the pathways are innervating. Based on its electrophysiological properties the dentate gyrus is considered as the ‘doorkeeper’ of the hippocampus (Lothman et al. 1992). In vivo and in vitro experiments showed that it is very difficult to evoke epileptic activity in the dentate gyrus, because of the strong feed-back and feed-forward inhibition and because of the lack of excitatory positive feedback (Ribak et al. 1991; Acsady et al. 1998). After status epilepticus there is

1

a drastic change in the dentate gyrus, the degeneration of mossy cells causes a significant change in the feed-back and feed-forward inhibition (Magloczky et al. 2005) and mossy fiber sprouting creates a positive feed-back which could explain the decreased resistance of the dentate gyrus against epileptic synchronized activity in the pilocarpine TLE model (Cronin et al. 1992; Hardison et al. 2000). There is experimental evidence that sprouted mossy fibers do form synapses on granule cells, but also on inhibitory interneurons (Ribak 1985; Sharma et al. 2007). Electrophysiological experiments also showed that the newly developed granule cell – granule synapses are functional and excitatory (Molnar et al. 1999; Scharfman et al. 2003). Mossy fiber sprouting could contribute to the increased excitability of the dentate gyrus not only by the creation of the positive feedback but by the release of zinc, a compound mossy fibers contain at high concentrations. Zinc is activity dependently released from mossy fibers and could inhibit postsynaptic GABAA receptors. It was reported that zinc sensitivity of GABAA receptors drastically increased in epilepsy (Buhl et al. 1996). In contrast, zinc also has anti-epileptic effects; zinc released together with glutamate from synaptic terminals inhibits postsynaptic N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (Vogt et al. 2000). The role of zinc in TLE is still not clear, because both epileptic and anti-epileptic effects of zinc have been reported (Timofeeva et al. 2003; Noyan et al. 2007; Foresti et al. 2008). The exact cause of mossy fiber sprouting is not known (Curia et al. 2008). According to the leading theory, with the degeneration of the mossy cells the mossy fibers are losing their postsynaptic target cells and they are trying to find new targets. A contradictory observation is that mossy fiber sprouting could occur without mossy cell degeneration in the kindling model of TLE. Other theories explain mossy fiber sprouting with changed expression of growth factors and axon guidenance molecules which could cause enhancement of mossy fiber growth (Morimoto et al. 2004). The role of mossy fiber sprouting in the development of temporal lobe epilepsy is still controversial (Morimoto et al. 2004). It was shown that if mossy fiber sprouting was prevented with cyclohexamid epileptic seizures still develop (Longo et al. 1998). Also, even in the epileptic hippocampus, where mossy fiber sprouting is significant, it is very difficult to evoke epileptic synchronized activity in vitro. Most possibly, mossy fiber sprouting is only one (although significant) mechanism among many which promote the development and spread of epileptic activity in temporal lobe epilepsy. Aims (1)

Functional characterization of granule cell – granule cell synaptic connections formed during the development of spontaneous seizures in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy.

(2)

Pharmacological characterization of granule cell – granule cell synaptic connections especially focusing on the NMDA component of the synaptic current.

(3)

Characterization of the effects of zinc, which is synaptically released from the mossy fibers, on the postsynaptic GABAA and NMDA receptors in epileptic rats.

2

Methods Status epilepticus evoked by pilocarpine injection Male Sprague-Dawley rats (150–200 g) received a single injection of pilocarpine hydrochloride (330–360 mg/kg i.p.). The animals were pretreated 30 min. earlier with scopolamine methyl bromide (2 mg/kg i.p.) to block peripheral side effects and maintain respiration. If status epilepticus developed, it was terminated 3–4 h after onset with a single injection of phenobarbital sodium (50 mg/kg i.p.). Histology 10 weeks, or in some experiments 4-6 days, after pilocarpine treatment transverse 400µm-thick slices of the caudal hippocampal formation were cut with a vibratome. Slices set aside for histology were incubated in Na2S solution for 90 min and then were fixed in phosphate buffered 0.9% (wt/vol) saline that contained 10% formalin. After storage in 10% formalin at 4°C for 1–2 days, the slices were embedded in albumin-gelatin and cut into 30-µm-thick sections. Alternate sections were stained for the presence of heavy metals. The remaining sections were stained with cresyl violet. A separate group of rats was used to determine the extent of neuronal degeneration. The animals were perfused transcardially with 4% (wt/vol) paraformaldehyde in 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.4. After 3–20 days of postfixation at 4°C, the brains were cut into 40-µm-thick frozen coronal or horizontal sections. Alternate sections were stained with cresyl violet or impregnated with silver to visualize degenerating neuronal somata and terminals. Extracellular electrophysiological measurements Transverse 400-µm-thick slices of the caudal hippocampus were used for electrophysiological recordings. The artificial cerebrospinal fluid (ACSF) contained (in mM) 122 NaCl, 25 NaHCO3, 3.1 KCl, 1.8 CaCl2, 1.2 MgSO4, 0.4 KH2PO4, and 10 Dglucose, pH 7.4. The 25-µm nichrome monopolar stimulating electrode was placed in the stratum lucidum of area CA3b, 100 µm from the opening of the dentate hilus. Then a glass extracellular electrode (filled with 1 M NaCl; resistance of 2–6 MΩ) was placed in the granule cell body layer. The stimulus current was set to a near-maximal value and rectangular pulses of 100-ms duration were applied in every 30 s. In other experiments the stimulating electrode was placed in the perforant path where it enters into the hippocampus from the direction of the entorhinal cortex. In those experiments when only the glutamaterg synaptic transmission was measured, 30 µM bicuculline (a GABAA antagonist) was added to the extracellular solution. Glutamatergic synaptic transmission was validated by inhibition by NBQX (AMPA antagonist) and DAP5 (NMDA antagonist). Whole-cell patch clamp measurement with electric stimulation Traditional whole cell patch-clamp recordings were made from dentate granule cells located close to the extracellular recording electrode with an Axon Axopatch 200A amplifier. The intracellular solution consisted of (in mM) 120 cesium gluconate, 10 HEPES, 2 MgATP, and 10 QX-314 (N-ethyl lidocaine) chloride, pH 7.2; 276–277 mOsm and 5-8 MΩ. Series resistance was compensated in ~75%. Signals were filtered at 2 kHz, digitized at 10 kHz, and stored and analyzed with Axon’s PClamp 6 software. The antidromically evoked EPSC was studied at a holding potential of -80 mV in the presence

3

of 30 µM bicuculline methiodide or 50 µM picrotoxin and was defined as the inward current abolished by 50 µM D-AP5 and either by 20 µM DNQX or 5 µM NBQX. The antidromically evoked GABAA IPSC was studied at a holding potential of 0 mV and was defined as the outward current abolished by bicuculline methiodide or picrotoxin. The AMPA and NMDA components of the EPSC was separated based on their voltage dependence and pharmacology. AMPA mediated currents were measured at -80 mV holding in the presence of bicuculline and D-AP5 and was defined as the current component blocked by DNQX. NMDA mediated currents were measured at -22 mV holding in the presence of bicuculline and was defined as the current component blocked by D-AP5. Photostimulation An 80-mW Coherent Enterprise 653 argon ion UV laser was used for photostimulation. The laser was coupled to the epifluorescence input of the Nikon Optiphot-2 microscope by a fiber optic cable. The microscope was equipped with a Noran Odyssey confocal imaging system. The laser beam was focused on the tissue with a 40x Olympus waterimmersion objective. To locate a presynaptic granule cell, 200 µM γ-(CNB-caged) Lglutamate was added to the extracellular solution. First, we performed a patch clamp recording on a granule cells at -80 or -20 mV holding. Then we focused the laser beam in the granule cell body layer; 75 µm from the recorded cell. The photostimulation consisted of 4 ms, 50 mW pulses of UV light repeated in every 15 s. In attempts to study mossy cell– granule cell pairs, the laser beam was focused at sites within the dentate hilus where mossy cells were most likely located. In other experiments the NMDA and AMPA components of the EPSC were selected with 50 µM D-AP5. Visualization of the location of photostimulation and mossy fiber – granule cell synapses In some experiments, DiI was applied to the uncaging spot. DiI was dissolved in hot cod liver oil and pressure ejected through a glass micropipette. The recorded cell was filled with Lucifer yellow. The slice was then fixed, was embedded in an albumin-gelatin mixture and sections of 50-µm thickness were cut with a vibratome. Fluorescent dyes were visualized under the confocal microscope by excitation at 488 nm and use of a 510nm barrier filter. Effect of externally applied Zinc on GABAA and NMDA receptors Zinc was added to the extracellular mediun at a concentration of 200 µM. The GABAA agonist (muscimol, 400 µM) was pressure ejected from a glass pipette (5-10 µm opening) directly to the dendrite of the recorded granule cell. NMDA-receptor mediated currents were evoked by electrical stimulation of the perforant path and were recorded at -20 mV holding in the presence of 5 µM NBQX and 30 µM bicuculline. Effect of Zinc on spontaneous miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSC) Zinc was added to the extracellular mediun at a concentration of 200 µM. In these experiments the intracellular solution contained CsCl. The extracellular solution contained 5 µM NBQX, 50 µM D-AP5 and 1 µM tetrodotoxin. The experiments were performed in PO4/SO4-free ACSF.

4

Effect of mossy fiber released zinc on GABAA receptor mediated currents Mossy fibers were antidromically stimulated in the presence of NBQX and D-AP5 in PO4/SO4 -free ACSF. GABAA receptors were tested by UV activation of γ-aminobutyrate, α-carboxy-2-nitrobenzyl ester-t (cGABA; 200 µM). The laser was focused to the soma of the recorded and fluorescently labeled (Alexa 488) granule cell, then to different spots along the labeled dendrite, 50, 75 and 100 µm distance from the soma. Zinc was released by high-frequency antidromic stimulation (10 or 100 Hz for 1 s or 10 Hz for 5 min) of the mossy fibers. At the same time GABAA currents were recorded in every 10 s. In some experiments we attempted to increase the probability of Zinc release by removing Mg from the extracellular solution or by increasing the extracellular potassium concentrations to 6 mM or by increasing the temperature to 33°C. Effect of cGABA on monosynaptic IPSCs A bipolar stimulating electrode was placed in the granule cell layer of the dentate gyrus, 200–500 µm distance away from the recorded cell. For the stimulation 100 µs long square impulses were used in every 30s. The stimulation current was selected to evoke a nearmaximal IPSC in the recorded granule cell. The patch clamp recordings were performed at 0 mV membrane potential in the presence of 5 µM NBQX and 50 µM D-AP5. In some experiments the membrane potential was changed in 10 mV steps. Effect of CaEDTA (a zinc chelator) on the NMDA receptor mediated component of the EPSCs, evoked by mossy fiber or perforant path stimulation EPSCs were evoked by antidromic mossy fiber or perforant path stimulation. The NMDA component of the EPSC was separated with NBQX and inhibited by D-AP5. In these experiments the effect of 1 mM CaEDTA, a high-affinity and specific zinc chelator was tested on the mossy fiber (which contains zinc at high concentrations) and on the perforant path (which does not contain zinc) evoked NMDA mediated currents in granule cells in the dentate gyrus in epileptic animals. Results Cell death, mossy fiber sprouting and spontaneous epileptic seizures after pilocarpine induced status epilepticus1 Single injection of pilocarpine (330 mg/kg, i.p.) evoked status epilepticus (SE) in about 2/3 of the treated rats. About 2/3 of the rats survived the 4 h of status epilepticus. Those animals which did not show the signs of SE were treated as controls, because there was no measurable difference between the pilocarpine treated, vehicle treated or non-treated control groups based on the performed tests. The first spontaneous seizures were observed about 3 weeks after status epilepticus. The frequency of the seizures varied widely (between 1/week to 3-4/day). The frequency of the spontaneous seizures stabilized by the end of the 5th week and remained stable until the end of the experiments (10 weeks after pilocarpine injection). Histological and electrophysiological experiments were performed 1

Okazaki, M., P. Molnar and J. V. Nadler, “Recurrent mossy fiber pathway in the rat dentate gyrus: synaptic currents evoked in the presence and absence of seizure-induced growth,” J. Neurophysiol. 81:1645-1660 (1999).

5

either 4-6 days (by this time the rats had recovered from the acute effects of pilocarpine, but neither spontaneous seizures nor mossy fiber sprouting could be observed) or 10 weeks (when the frequency of spontaneous seizures and mossy fiber sprouting reached maximum) after pilocarpine treatment. In every epileptic rat Timm’s staining showed strong ‘mossy fiber – like’ staining in the inner molecular layer of the dentate gyrus 10 weeks after status epilepticus, whereas there was no significant staining in any control animal, except some very weak sporadic labeling. Mossy fiber sprouting could not be observed in any groups 4-6 days after status epilepticus. There was extensive cellular degeneration observed 1-3 days after status epilepticus. In the hippocampus there was sporadic neuronal degeneration in areas CA1, CA3 and the dentate gyrus. The strongest degeneration was observed in the hilus, where about 50% of the cells died. There was a strong axonal degeneration in the inner molecular layer of the dentate gyrus, in the terminal zone of the mossy cells, but there was no degeneration in the outer molecular layer, in the terminal zone of the perforant path. These data suggest that mostly the mossy cells in the hilus died in consequence of SE. There was no observable neurodegeneration in control animals. Functional characterization of mossy fiber – granule cell synapses developed during mossy fiber sprouting The major problems hindering the characterization of granule cell – granule cell synapses were: 1) The probability of finding two connected granule cells is extremely low 2) Selective stimulation of the mossy fibers is difficult because of the many celltypes in the hilus. For the solution of these problems we used three different methods which gave indirect partial information concerning functionality and characteristics of mossy fiber – granule cell synapses. These methods were: 1) Activation of mossy fibers with antidromic stimulation and record extracellular field responses in the granule cell layer 2) Antidromic mossy fiber stimulation combined with whole-cell patch clamp recordings of synaptic currents 3) Specific and local stimulation of presynaptic granule cells with photostimulation combined with patch clamp recordings from postsynaptic cells. Antidromic mossy fiber stimulation evoked an antidromic population spike in the granule cell layer and a synaptically mediated field potential in the terminal zone of the stimulated mossy fibers. Using extracellular recordings in the granule cell layer we could always observe the antidromic population spike, but we could see the synaptically mediated field potential component only when the mossy fibers monosynaptically or polysynaptically innervated the granule cells. We found synaptically mediated field potentials evoked by antidromic mossy fiber stimulation only in about half of the slices obtained from epileptic rats, although we performed these experiments when mossy fiber sprouting was maximal (10 weeks after SE). This component could be blocked with NBQX. Surprisingly, in a small percentage of the treated and untreated controls we could measure synaptically mediated field potentials evoked by antidromic mossy fiber stimulation. This component was also blocked by NBQX. When we used whole cell patch clamp recordings from granule cells and antidromic mossy fiber stimulation we always found a postsynaptic GABAA receptor mediated inhibitory current component in the epileptic and also in the control groups. 4-6 days after SE the GABAergic feed-back inhibition decreased significantly in the

6

hippocampus compared to the control group. Interestingly, by the 10th week GABAerg IPSCs evoked by antidromic mossy fiber stimulation did not change in the epileptic group, but significantly decreased in the control group. Thus, comparing epileptic rats to age-matched controls, at 10 weeks the GABAergic inhibition in epileptic rats was stronger. Excitatory postsynaptic currents (EPSC) evoked by antidromic mossy fiber stimulation were observed not only in the epileptic, but also in control rats. EPSC could be measured most frequently in epileptic rats, 10 weeks after SE, in about 74% of the measured slices. In the pilocarpine treated control this percentage was 38%, whereas in the untreated group it was 26%. The maximal amplitude of the EPSC was also significantly higher in the epileptic group. In the epileptic rats delayed EPSCs could also be observed (several 100s of ms delay) with amplitudes above 700 pA. There was no obvious correlation between the amplitude of the EPSC and mossy fiber sprouting visualized by Timm’s staining. We did not find differences in any other parameters (membrane potential, membrane resistance) between the measured groups. We did not find any difference between the groups 4-6 days after pilocarpine treatment. The NMDA receptor mediated component of the EPSC evoked by antidromic mossy fiber stimulation was determined by the application of NBQX and later by D-AP5. There were larger NMDA currents observed in the epileptic group compared to the control 10 weeks after SE. The NMDA current was larger not only in absolute value but also as the percentage of the AMPA component of the EPSC. We did not find any difference in the voltage dependence of the NMDA component in any of the measured groups. In contrast to mossy fibers, there was no reorganization reported in connection with the perforant path in epilepsy. We did not find any difference in the perforant path evoked responses (GABA, AMPA or NMDA receptor mediated currents) between the epileptic and the control groups. Similarly to the mossy fiber evoked responses, the amplitude of the GABAA receptor mediated IPSC component evoked by perforant path stimulation showed an age-dependent decline. Laser photostimulation was introduced to enable the local and specific stimulation of a small group of granule cells2. In these experiments we used an inactive glutamate analogue in the extracellular solution which activation required an UV pulse. We have determined that we could evoke an action potential from a granule cell from a distance of 12 µm. Stimulation of the granule cell layer with UV pulses evoked EPSC most frequently in the epileptic group. We had to try in average of 7 stimulation sites before EPSC were observed in the recorded granule cell. This means, that we had to stimulate about 176-266 granule cells before we could find two connected ones. Photostimulation evoked different types of EPSCs in the recorded postsynaptic cell. In optimal case we could observe a single EPSC with a fast rise time, short (10-20 ms) delay, mono-exponential decay and an amplitude of about 30 – 100 pA. Not all of the stimuluses generated an EPSC; the error rate was about 60-70%. In other cases we could observe complex EPSCs evoked by the photostimulation consisting of multiple superpositioned inward currents or complex, polysynaptic EPSCs. We did not find any 2

Molnar P. and J. V. Nadler, “Mossy fiber - granule cell synapses studied with whole cell patch clamp recording and laser photostimulation,” J. Neurophysiol. 82:1883-1894 (1999).

7

difference in the properties of EPSCs between the epileptic and control groups, only in the probability of finding an EPSC. In subsequent experiments we have determined that NMDA receptors did participate in the synaptic transmission between granule cells. Some other experiments the site of a successful photostimulation was labeled with a hydrophobic dye (DiI), whereas the recorded cell was filled up with Lucifer Yellow. The DiI labeled, most possibly granule cell axons traveled parallel with the granule cell layer in the inner molecular layer of the dentate gyrus and formed synapse-like structures with the dendrites of the measured granule cell. The DiI labeled axons had large varicosities (~2 µm) which are characteristic for mossy fibers. Effect of Zinc, synaptically released from mossy fibers, on the excitability of granule cells in epileptic rats3 Externally applied zinc inhibited muscimol-evoked GABAA currents and NMDA currents evoked by perforant path stimulation only in PO4/SO4-free ACSF. Externally applied zinc also inhibited spontaneous miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSC) in PO4/SO4-free ACSF. The effect of mossy fiber – released zinc on postsynaptic GABAA receptors was studied with high frequency (10 and 100 Hz) antidromic stimulation of mossy fibers, whereas the postsynaptic GABAA receptors were tested with UV activation of a GABA precursor. The site of the photostimulation of GABAA receptors were located in the terminal zone of the sprouted mossy fibers, in the inner molecular layer of the dentate gyrus, closer than 100 µm to the cell body of the recorded and fluorescent dye - filled granule cell, along the labeled dendrite. Because we have observed that cGABA inhibited spontaneous GABAergic IPSCs, thus we continued these experiments only after we have verified that this feature of cGABA would not affect the result of our experiments4,5. We have determined that 160-200 µM cGABA in the extracellular solution almost completely blocked the IPSCs, but did not significantly affect the EPSCs. In contrast, 200 µM cGABA only marginally affected GABAA receptor mediated currents. We concluded that these effects of cGABA could not significantly influence the results of our original experiment. In order to maximize the probability of zinc release, we have tried different stimulation protocols (10 Hz, 100 Hz, zero magnesium, high potassium, continuous stimulation, high temperature), but we could not be able to observe any cases when antidromic mossy fiber stimulation affected GABAA receptor mediated currents in granule cells.

3

Molnar P. and J. V. Nadler, “Lack of effect of mossy fiber-released zinc on postsynaptic GABAA receptors in the pilocarpine model of epilepsy,” J. Neurophysiol. 85:1932-40 (2001). 4 Molnar P. and J. V. Nadler, “O-(CNB-caged) GABA selectively blocks inhibitory synaptic transmission in rat hippocampal slices,” Eur. J. Pharmacol. 391:255-262 (2000). 5 Molnar P. and J. V. Nadler, “O-(CNB-caged) GABA selectively blocks inhibitory synaptic transmission in rat hippocampal slices,” Eur. J. Pharmacol. 391:255-262 (2000).

8

In contrast, we have observed inhibitory effect of mossy fiber – released zinc on postsynaptic NMDA receptors6. In these experiments the effect of a high affinity and specific zinc chelator, CaEDTA was studied, whereas NMDA receptors were activated by antidromic mossy fiber stimulation (mossy fibers contain zinc) or perforant path stimulation (they do not contain zinc). 1 mM CaEDTA in the extracellular solution increased the amplitude of NMDA currents evoked by mossy fiber stimulation, but did not affect NMDA currents evoked by perforant path stimulation. Discussion In this work the functional consequences of mossy fiber sprouting was studied using histological, electrophysiological, photostimulation and pharmacological methods in the pilocarpine rat model of temporal lobe epilepsy. We showed that functional granule cell granule cell synaptic connections were present in the caudal part of the hippocampus not only in epileptic, but also in control rats, only with a much smaller probability. This observation is in contradiction with earlier data; other researches could not find monosynaptic granule cell – granule cell synaptic connections in healthy normal rats (Wuarin et al. 1996). One possibility is, that because of technical difficulties, we stimulated not only mossy fibers but also some mossy cells in the dentate hilus. We excluded this possibility, because in our experiments all EPSC, evoked by antidromic mossy fiber stimulation or photostimulation, had an NMDA receptor mediated component in the presence of NBQX, thus, most possibly they were monosynaptic. Moreover, in our photostimulation experiments we observed monosynaptic granule cell - granule cell synaptic connections in normal rats. Based on these facts we had to accept that, at least in the caudal hippocampus, with low probability, functional granule cell – granule cell synaptic connections are present in normal animals. 10 weeks (but not 4-6 days) after status epilepticus the number of functional granule cell – granule cell synapses increased drastically. Based on the photostimulation experiments we showed that the number of functional mossy fiber – granule cell synapses increased 6-fold after SE. The probability of finding two synaptically connected granule cells were about 0.5% in the epileptic rats. The observed changes were specific to mossy fibers, because we did not find any difference in perforant path mediated synaptic transmission between the epileptic and control groups. These results are in good agreement with earlier observations of other researchers concerning functional consequences of mossy fiber sprouting. Using a similar arrangement as our photostimulation setup Wuarin and coworkers have shown that local injection of glutamate to the granule cell layer increased the frequency of spontaneous EPSCs in granule cells in epileptic rats (Wuarin et al. 1996). Our photostimulation experiments showed first and unambiguously the formation and physiological properties of monosynaptic granule cell – granule cell synapses. But our experiments demonstrated also, that functional granule cell – granule cell synapses are very rare even in epileptic rats, where histological methods show very strong mossy fiber sprouting. Our experiments 6

Molnar P. and J. V. Nadler, “Synaptically-released zinc inhibits N-methyl-D-aspartate receptor activation at recurrent mossy fiber synapses,” Brain Res. 910:205-207 (2001).

9

also showed a high failure rate in these newly formed synapses. Thus, it is not very likely that mossy fiber sprouting and the newly formed granule cell – granule cell synapses are the major / only cause of the development of spontaneous epileptic seizures in temporal lobe epilepsy. Characteristics of monosynaptic granule cell – granule cell synapses The average amplitude of the monosynaptic EPSCs evoked in granule cells by photostimulation in the granule cell layer was smaller (~30 pA) than it was reported in granule cell – CA3 pyramidal cell synapses (~70 pA) (Jonas et al. 1993), but larger than monosynaptic EPSCs described in other areas in the hippocampus (Allen et al. 1994; Kneisler et al. 1995). This observation is in good agreement with earlier data because the axon terminals of the mossy fibers in the molecular layer of the dentate gyrus are smaller than in the CA3, but definitely larger than an average axon terminal in the hippocampus (Okazaki et al. 1995). In our experiments the time course of the EPSCs were slower than it was reported in CA3 pyramid cells (Jonas et al. 1993). One possible explanation is that we used old animals for the experiments and electrophysiological properties of granule cells could depend on the age of the animals. The relatively high synaptic failure rate, we observed in these experiments, is in good agreement with earlier results concerning mossy fiber – CA3 pyramidal cell (Jonas et al. 1993) and Schaffer collateral – CA1 pyramidal cell (Allen et al. 1994) synapses. The failure rate for the mossy fiber – basket cell synapses was found to be about 33% in experimental conditions which were similar to ours (Kneisler et al. 1995). Characteristics of AMPA and NMDA components of granule cell – granule cell synaptic transmission All of our experiments unambiguously showed that both AMPA and NMDA receptors participated in the mossy fiber – granule cell synaptic transmission in epileptic and also in control animals. The role of NMDA receptors has already been described in the mossy fiber – CA3 pyramidal cell (Weisskopf et al. 1995) and also in the mossy fiber – basket cell (Kneisler et al. 1995) synaptic transmission. According to our data, the amplitude of the NMDA current was larger in the epileptic group than in the control group when the mossy fibers were stimulated. During epileptic synchronized activity this could be especially important, because during epileptic seizures the granule cells are depolarized and increased activation of the slowly inactivating NMDA receptors could promote the spread of epileptic synchronized activity through the dentate gyrus (Dingledine et al. 1990; Traub et al. 1994). Our data is supported by earlier observations, namely that DAP5, an antagonist of NMDA receptors, inhibited the development of epileptic activity evoked by mossy fiber stimulation in the dentate gyrus (Patrylo et al. 1998). The mechanism by which the NMDA component of the EPSCs evoked by mossy fiber stimulation increased by several fold, whereas the NMDA component of the EPSCs evoked by perforant path stimulation did not change in epileptic animals, is not known. Interestingly, in the photostimulation experiments we did not see this increase. A possible explanation is that with the stronger antidromic mossy fiber stimulation we have activated not only synaptic, but also extrasynaptic NMDA receptors, whereas during the weaker photostimulation the extrasynaptic NMDA receptors played a much smaller role.

10

GABAergic inhibition in epilepsy The amplitude of the inhibitory postsynaptic currents evoked by antidromic mossy fiber stimulation was about 40% smaller in epileptic rats than in the control group 4-6 days after status epilepticus. This is most possibly the result of the degeneration of mossy cells, which play a significant role in the stimulation of inhibitory interneurons (Obenaus et al. 1993). The most surprising result was that the mossy fiber – dependent GABAergic inhibition significantly decreased in control, but not in epileptic rats by 10 weeks after pilocarpine treatment. That means, there is some mossy fiber sprouting – dependent mechanism by which the GABAergic inhibition is increased in the dentate gyrus in epileptic animals. In contrast, although the perforant path – dependent inhibition also decreased with the age of the animals, we did not find any difference in perforant path evoked responses between epileptic and control animals. Besides the degeneration of mossy cells, the selective death of inhibitory interneurons could also explain the selective decrease of mossy fiber dependent GABAergic inhibition in the dentate gyrus after SE (Buckmaster et al. 1997; Lurton et al. 1997). Earlier results showed a decrease in the number of inhibitory interneurons as the age of the animals advanced (Shetty et al. 1998). If the neuronal population which degenerates with the age of the animals is the same which dies after status epilepticus it could explain that after the initial decrease the GABAergic inhibition did not decreased further with the age in epileptic rats (the agesensitive cells have already been degenerated after SE). The role of mossy fiber released zinc in epilepsy Zinc, added to the extracellular solution, decreased GABAA and NMDA receptors mediated responses evoked by externally applied muscimol or perforant path stimulation, but only when polyvalent anions were removed from the extracellular medium. Zinc also decreased the amplitude of spontaneous inhibitory postsynaptic currents. Zinc in our experiments had a significantly weaker inhibitory effect on GABAA receptors than it was described earlier (Gibbs et al. 1997). One possible explanation for this is that we measured GABAA receptor mediated responses on the dendrite of granule cells, in the inner molecular layer of the dentate gyrus in brain slices, whereas earlier studies were performed on the soma of isolated cells. Antidromic mossy fiber stimulation in the presence of NBQX and D-AP5 had no effect on the GABAA receptor mediated responses evoked by photostimulation on the dendrites of granule cells in epileptic rats, even in those conditions when we have increased the probability of zinc release. Because of technical difficulties, this does not mean with 100% probability that we excluded the possibility of any effect of mossy fiber released zinc on GABAA receptors in epilepsy, but, based on our experiments, it is not likely. For the inhibition of postsynaptic GABAA receptors zinc should be released from the presynaptic mossy fiber terminals in a high – enough concentration to overflow the synaptic cleft and reach the neighboring GABAA receptors and block them. Free diffusion of zinc from the synaptic cleft is inhibited by two factors. First, there is a transporter in the presynaptic membrane which role is the uptake of zinc and its removal from the synaptic cleft, thus, after presynaptic activity the extracellular concentration of zinc decreases very fast with non-diffusion based mechanism (Howell et al. 1984). Second, the extracellular fluid always contains polyvalent anions, which bind zinc and hindering it ineffective. These properties of zinc could explain our negative result.

11

In other experiments we have shown that mossy fiber released zinc slightly inhibited postsynaptic NMDA receptors, thus, zinc could play (based on this effect – an inhibitory) role in the development of epileptic seizures. Other studies and our subsequent experiments showed that the role of zinc in epilepsy is very complex, but usually weak and, thus, difficult to interpret. According to latest observations, zinc is an epileptogenic agent in the kindling model (Foresti et al. 2008), having no effect on seizures evoked by pilocarpine injection (Noyan et al. 2007), but facilitating the epileptic activity of the granule cells of the dentate gyrus in fully developed epilepsy in the pilocarpine model (Timofeeva et al. 2006). According to earlier measurements, the GABA precursor we used in these experiments was inactive on GABA receptors (Gee et al. 1994). In our experimental system 200 µM of cGABA showed weak GABAA antagonist properties. In contrast, it completely inhibited spontaneous GABA mediated IPSCs in granule cells. cGABA had no measurable effect on the glutamatergic synaptic transmission in the dentate gyrus. Based on our experiments we could not decide whether the effects of cGABA on the GABAergic transmission are mediated by presynaptic or postsynaptic mechanism, but we found cGABA effects very similar to the actions of some phenothiazine-type antipsychotics (described earlier in Zorumski et al. 1988). Based on these data we concluded that the weak, GABAA receptor-mediated inhibitory effect of cGABA could not influence our results concerning the role of mossy fiber released zinc in epilepsy. Especially, that cGABA had no effect on the excitatory synaptic transmission and, most possibly, on zinc release from mossy fibers. Summary In these experiments we showed that functional granule cell – granule cell synaptic connections are formed in normal, non-epileptic animals in the caudal hippocampus. As the consequence of status epilepticus, during mossy fiber sprouting, the number of functional granule cell – granule cell synaptic connections increased drastically. The physiological and pharmacological properties of these newly formed synapses were not different than that observed in control animals. Not only AMPA but also NMDA receptors participated in the granule cell granule cell synaptic transmission. Zinc, released upon synaptic activity from mossy fibers, continuously and (probably) frequency dependently7 inhibited postsynaptic NMDA receptors, but most possibly it has no or only minimal effect on the neighboring GABAergic synapses. These results are supporting the idea that during mossy fiber sprouting a functional positive feedback is developing in the dentate gyrus, which consequently increase the excitability of the dentate gyrus and could promote the development / spread of epileptic activity. But the probability of functioning granule cell – granule cell synapses are relatively low even in epileptic animals, thus, mossy fiber sprouting most possibly cannot be the primary / only mechanism of epileptogenesis in temporal lobe epilepsy.

7

Feng, L., P. Molnar and J. V. Nadler: Short-Term Frequency-Dependent Plasticity at Recurrent Mossy Fiber Synapses of the Epileptic Brain. J. Neurosci. 23. 5381-5390 (2003).

12

Acknowledgement I would like to express my gratitude to Dr. Victor Nadler, in whom laboratory this work was performed, to Dr. Maxine Okazaki, who taught me brain slice electrophysiology, to Dr. István Hernádi, my supervisor, for all the support and help I received from him, to Professor Mária Csoknya, for reading and correcting my work several times and for her selfless help, to Dr. Róbert Gábriel, Rector of the University and the Director of the Ph.D. Program, for making my participation possible and to All Members of the Biology Ph.D. Program at the University of Pécs for their excellent work.

References Acsady, L., A. Kamondi, A. Sik, T. Freund and G. Buzsaki (1998). "GABAergic Cells Are the Major Postsynaptic Targets of Mossy Fibers in the Rat Hippocampus." Journal of Neuroscience 18(9): 3386-3403. Allen, C. and C. F. Stevens (1994). "An Evaluation of Causes for Unreliability of Synaptic Transmission." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91(22): 10380-10383. Amaral, D. G., H. E. Scharfman and P. Lavenex (2007). "The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies) " Progress in Brain Research 163: 3-22. Buckmaster, P. S. and F. E. Dudek (1997). "Neuron loss, granule cell axon reorganization, and functional changes in the dentate gyrus of epileptic kainate-treated rats." Journal of Comparative Neurology 385(3): 385-404. Buhl, E. H., T. S. Otis and I. Mody (1996). "Zinc-induced collapse of augmented inhibition by GABA in a temporal lobe epilepsy model." Science 271(5247): 369373. Cavalheiro, E. A. (1995). "The Pilocarpine Model of Epilepsy." Italian Journal of Neurological Sciences 16(1-2): 33-37. Cronin, J., A. Obenaus, C. R. Houser and F. E. Dudek (1992). "Electrophysiology of Dentate Granule Cells after Kainate-Induced Synaptic Reorganization of the Mossy Fibers." Brain Research 573(2): 305-310. Curia, G., D. Longo, G. Biagini, R. S. G. Jones and M. Avoli (2008). "The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy." Journal of Neuroscience Methods 172(2): 143-157. Dingledine, R., C. J. Mcbain and J. O. Mcnamara (1990). "Excitatory Amino-Acid Receptors in Epilepsy." Trends in Pharmacological Sciences 11(8): 334-338. Foresti, M. L., G. M. Arisi, A. Fernandes, C. Q. Tilelli and N. Garcia-Cairasco (2008). "Chelatable zinc modulates excitability and seizure duration in the amygdala rapid kindling model." Epilepsy Research 79(2-3): 166-172. Gee, K. R., R. Wieboldt and G. P. Hess (1994). "Synthesis and Photochemistry of a New Photolabile Derivative of Gaba - Neurotransmitter Release and Receptor Activation

13

in the Microsecond Time Region." Journal of the American Chemical Society 116(18): 8366-8367. Gibbs, J. W., M. D. Shumate and D. A. Coulter (1997). "Differential epilepsy-associated alterations in postsynaptic GABA(A) receptor function in dentate granule and CA1 neurons." Journal of Neurophysiology 77(4): 1924-1938. Haas, C. and M. Frotscher (2009). "Reelin deficiency causes granule cell dispersion in epilepsy." Experimental Brain Research Published Online. Halász, P. and A. Fogarasi (2006). "Temporal lobe epilepsy--state of art review Temporalis lebeny epilepszia--"state of art" beszámoló." Ideggyógyászati szemle 59(9-10): 331-352. Hardison, J. L., M. M. Okazaki and J. V. Nadler (2000). "Modest increase in extracellular potassium unmasks effect of recurrent mossy fiber growth." Journal of Neurophysiology 84(5): 2380-2389. Howell, G. A., M. G. Welch and C. J. Frederickson (1984). "Stimulation-Induced Uptake and Release of Zinc in Hippocampal Slices." Nature 308(5961): 736-738. Jonas, P., G. Major and B. Sakmann (1993). "Quantal Components of Unitary Epscs at the Mossy Fiber Synapse on Ca3 Pyramidal Cells of Rat Hippocampus." Journal of Physiology-London 472: 615-663. Kneisler, T. B. and R. Dingledine (1995). "Synaptic Input From CA3 Pyramidal Cells to Dentate Basket Cells in Rat Hippocampus." Journal of Physiology-London 487(1): 125-146. Longo, B. M. and L. E. A. M. Mello (1998). "Supragranular mossy fiber sprouting is not necessary for spontaneous seizures in the intrahippocampal kainate model of epilepsy in the rat." Epilepsy Research 32(1-2): 172-182. Lothman, E. W., J. L. Stringer and E. H. Bertram (1992). "The Dentate Gyrus as a Control Point for Seizures in the Hippocampus and Beyond." Epilepsy Research: 301-313. Lurton, D., L. Sundstrom, C. Brana, B. Bloch and A. Rougier (1997). "Possible mechanisms inducing granule cell dispersion in humans with temporal lobe epilepsy." Epilepsy Research 26(2): 351-361. Magloczky, Z. and T. F. Freund (2005). "Impaired and repaired inhibitory circuits in the epileptic human hippocampus." Trends in Neurosciences 28(6): 334-340. Molnar, P. and J. V. Nadler (1999). "Mossy fiber-granule cell synapses in the normal and epileptic rat dentate gyrus studied with minimal laser photostimulation." Journal of Neurophysiology 82(4): 1883-1894. Morimoto, K., M. Fahnestock and R. J. Racine (2004). "Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain." Progress in Neurobiology 73(1): 1-60. Noyan, B., M. S. Jensen and G. Danscher (2007). "The lack of effects of zinc and nitric oxide in initial state of pilocarpine-induced seizures." Seizure-European Journal of Epilepsy 16(5): 410-416. Obenaus, A., M. Esclapez and C. R. Houser (1993). "Loss of Glutamate-Decarboxylase Messenger-Rna Containing Neurons in the Rat Dentate Gyrus Following PilocarpineInduced Seizures." Journal of Neuroscience 13(10): 4470-4485. Okazaki, M. M., D. A. Evenson and J. V. Nadler (1995). "Hippocampal Mossy Fiber Sprouting and Synapse Formation after Status Epilepticus in Rats - Visualization after Retrograde Transport of Biocytin." Journal of Comparative Neurology 352(4): 515534.

14

Parent, J. M., R. C. Elliott, S. J. Pleasure, N. M. Barbaro and D. H. Lowenstein (2006). "Aberrant seizure-induced neurogenesis in experimental temporal lobe epilepsy." Annals of Neurology 59(1): 81-91. Patrylo, P. R. and F. E. Dudek (1998). "Physiological unmasking of new glutamatergic pathways in the dentate gyrus of hippocampal slices from kainate-induced epileptic rats." Journal of Neurophysiology 79(1): 418-429. Ratzliff, A. D. H., A. L. Howard, V. Santhakumar, I. Osapay and I. Soltesz (2004). "Rapid deletion of mossy cells does not result in a hyperexcitable dentate gyrus: Implications for epileptogenesis." Journal of Neuroscience 24(9): 2259-2269. Ribak, C. E. (1985). "2 Different Abnormal Gabaergic Circuits in Experimental-Models of Epilepsy - Loss of Inhibition and Disinhibition." Epilepsia 26(5): 525-525. Ribak, C. E. and G. M. Peterson (1991). "Intragranular mossy fibers in rats and gerbils from synapses with the somata and proximal dendrites of basket cells in the dentate gyrus." Hippocampus 1(4): 355-364. Scharfman, H., J. Goodman and D. McCloskey (2007). "Ectopic granule cells of the rat dentate gyrus." Developmental Neuroscience 29(1-2): 14-27. Scharfman, H. E., A. L. Sollas, R. E. Berger and J. H. Goodman (2003). "Electrophysiological evidence of monosynaptic excitatory transmission between granule cells after seizure-induced mossy fiber sprouting." Journal of Neurophysiology 90(4): 2536-2547. Sharma, A. K., R. Y. Reams, W. H. Jordan, M. A. Miller, H. L. Thacker and P. W. Snyder (2007). "Mesial temporal lobe epilepsy: Pathogenesis, induced rodent models and lesions." Toxicologic Pathology 35(7): 984-999. Shetty, A. K. and D. A. Turner (1998). "In vitro survival and differentiation of neurons derived from epidermal growth factor-responsive postnatal hippocampal stem cells: Inducing effects of brain-derived neurotrophic factor." Journal of Neurobiology 35(4): 395-425. Sloviter, R. S. (1994). "The Functional-Organization of the Hippocampal Dentate Gyrus and Its Relevance to the Pathogenesis of Temporal-Lobe Epilepsy." Annals of Neurology 35(6): 640-654. Tauck, D. L. and J. V. Nadler (1985). "Evidence of Functional Mossy Fiber Sprouting in Hippocampal-Formation of Kainic Acid-Treated Rats." Journal of Neuroscience 5(4): 1016-1022. Timofeeva, O., P. Molnar and J. V. Nadler (2003). "Facilitatory and Inhibitory Actions of Mossy Fiber-Released Zinc on Granule Cell Epileptiform Activity in the Pilocarpine Model of Epilepsy." Journal of Neurophysiology Submitted. Timofeeva, O. and J. V. Nadler (2006). "Facilitation of granule cell epileptiform activity by mossy fiber-released zinc in the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy." Brain Research 1078: 227-234. Traub, R. D., J. G. R. Jefferys and M. A. Whittington (1994). "Enhanced Nmda Conductance Can Account for Epileptiform Activity-Induced by Low Mg2+ in the Rat Hippocampal Slice." Journal of Physiology-London 478(3): 379-393. Vogt, K., J. Mellor, G. Tong and R. Nicoll (2000). "The actions of synaptically released zinc at hippocampal mossy fiber synapses." Neuron 26(1): 187-196.

15

Weisskopf, M. G. and R. A. Nicoll (1995). "Presynaptic Changes during Mossy Fiber Ltp Revealed by Nmda Receptor-Mediated Synaptic Responses." Nature 376(6537): 256259. Wuarin, J. P. and F. E. Dudek (1996). "Electrographic seizures and new recurrent excitatory circuits in the dentate gyrus of hippocampal slices from kainate-treated epileptic rats." Journal of Neuroscience 16(14): 4438-4448. Zorumski, C. F. and J. Yang (1988). "Non-Competitive Inhibition of Gaba Currents by Phenothiazines in Cultured Chick Spinal-Cord and Rat Hippocampal-Neurons." Neuroscience Letters 92(1): 86-91.

Papers and conference abstracts

Papers related to the topics of the Ph. D. dissertation 1. Okazaki, M., P. Molnar and J. V. Nadler, “Recurrent mossy fiber pathway in the rat dentate gyrus: synaptic currents evoked in the presence and absence of seizureinduced growth,” J. Neurophysiol. 81:1645-1660 (1999). 2. Molnar P. and J. V. Nadler, “Mossy fiber - granule cell synapses studied with whole cell patch clamp recording and laser photostimulation,” J. Neurophysiol. 82:18831894 (1999). 3. Molnar P. and J. V. Nadler, “O-(CNB-caged) GABA selectively blocks inhibitory synaptic transmission in rat hippocampal slices,” Eur. J. Pharmacol. 391:255-262 (2000). 4. Molnar P. and J. V. Nadler, “Lack of effect of mossy fiber-released zinc on postsynaptic GABAA receptors in the pilocarpine model of epilepsy,” J. Neurophysiol. 85:1932-40 (2001). 5. Molnar P. and J. V. Nadler, “Synaptically-released zinc inhibits N-methyl-D-aspartate receptor activation at recurrent mossy fiber synapses,” Brain Res. 910:205-207 (2001). 6. Feng, L., P. Molnar and J. V. Nadler: Short-Term Frequency-Dependent Plasticity at Recurrent Mossy Fiber Synapses of the Epileptic Brain. J. Neurosci. 23. 5381-5390 (2003). Conference abstracts related to the topics of the Ph. D. dissertation 1. Molnár, P. and J.V. Nadler: Mossy fiber - granule cell synapses studied with whole cell patch clamp recording and laser photostimulation (27th. Annual meeting of American Neuroscience Association, New Orleans, USA, 1997).

Other scientific papers 1. Gaál L. and P. Molnár, “Effects of vinpocetine on noradrenergic neurons in rat locus coeruleus,” Eur. J. Pharmacol. 187:537-539 (1990).

16

2. Molnár P. and L. Gaál, “Effect of different subtypes of cognition enhancers on longterm potentiation in the rat dentate gyrus in vivo,” Eur. J. Pharmacol. 215:17-22 (1992). 3. Tarnawa, I., P. Molnár, L. Gaál, and F. Andrási, “Inhibition of hippocampal field potentials by GYKI 52466 in vitro and in vivo,” Acta Physiol. Hungarica 79:169-175 (1992). 4. Molnár P., L. Gaál, and Cs. Horváth, “The impairment of long-term potentiation in rats with medial septal lesion and its restoration by cognition enhancers,” Neurobiology 2:255-266 (1994). 5. Maksay G., P. Molnár, and L. Gruber, “Common modes of action of g -butyrolactones and pentylenetetrazol on the convulsant and benzodiazepine sites and channel activity of the GABA receptor-ionophore complex,” Eur. J. Pharmacol. - Mol. Pharmacol.Sect. 288:61-68 (1994). 6. Molnár P. and S.L. Erdı, “Vinpocetine is as potent as phenytoin in blocking voltagegated sodium channels in rat cortical neurons,” Eur. J. Pharmacol. 273:303-306 (1995). 7. Lakics V., P. Molnár, and S.L. Erdı, “Protection against veratridine toxicity in rat cortical neurons: relationship to sodium channel blockade,” Neuroreport 7:89-92 (1995). 8. Maksay G., P. Molnár, and M. Simonyi, “Thermodinamics and kinetics of tbutylbicyclophosphorothionate binding differentiate convulsant and depressant barbiturate stereoisomers acting via GABAA ionophores,” Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology 353:306-13 (1996). 9. Molnár P. and S.L. Erdı, “Differential effects of five glycine site antagonists on NMDA receptor desensitization,” Eur. J. Pharmacol. 311:311-314 (1996). 10. Erdı S.L., P. Molnár, V. Lakics, J.Zs. Bence, and Zs. Tömösközi, “Vincamin and vincanol are potent blockers of voltage-gated Na channels,” Eur. J. Pharmacol. 314:69-73 (1996). 11. Das, M., P. Molnar, H. Devaraj, M. Poeta and J. J. Hickman: Electrophysiological and morphological characterization of rat embryonic motoneurons in a defined system. Biotechnology Progress 19. 1756-1761 (2003) 12. Das, M., P. Molnar, C. Gregory, L. M. Riedel and J. J. Hickman: Long-term culture of embryonic rat cardiomyocytes on organosilane surface in serum-free media. Biomaterials, 25: 5643-47 (2004) 13. Natarajan, A., P. Molnar, K. Sieverdes, A. Jamshidi and J.J. Hickman: Microelectrode array recordings of cardiac action potentials as a high throughput method to evaluate pesticide toxicity. In Vitro Toxicology, 20 (3): 375-81 (2005) 14. Mohan, D. K., P. Molnar, and J. J. Hickman: Toxin detection based on action potential shape analysis using a realistic mathematical model of differentiated NG108-15 cells. Biosensors and Bioelectronics, 21 (9): 1804-11 (2006) 15. Das M, Bhargava N, Gregory C, Riedel L, Molnar P and Hickman JJ. Adult Rat Spinal Cord Culture on an Organosilane Surface in a Novel Serum-Free Medium. In Vitro – Animal, 41 (10): 343-8 (2005) 16. Peng, P.L., Zhong, X., Tu W., Soundarapandian, M.M., Molnar, P. Zhu D., Lau L., Liu S. , Liu F. and Lu Y.M. ADAR2-Dependent RNA Editing of AMPA Receptor

17

Subunit GluR2 Determines Vulnerability of Neurons in Forebrain Ischemia. Neuron, 49, 719-733 (2006). 17. Xu, T., C. Gregory, P. Molnar, S. Jalota, S. B. Bhaduri, T. Boland: Viability and Electrophysiology of Neural Cell Structures made by the Inkjet Printing. Biomaterials, 27, 3580-3588. (2006) 18. Das M., C. Gregory, P. Molnar, L. M. Riedel and J. J. Hickman: A Defined System to Allow Skeletal Muscle Differentiation and Subsequent Integration with Silicon Microstructures. Biomaterials. 27, 4374-80 (2006) 19. Molnar P., W. Wang, A. Natarajan, J. W. Rumsey and J. J. Hickman: Photolithographic Patterning of C2C12 Myotubes using Vitronectin as Growth Substrate in Serum-Free Medium. Biotechnology Progress, 23: 265-268 (2007) 20. Wilson K. A., P. Molnar and J. J. Hickman: Integration of functional myotubes with a Bio-MEMS device for non-invasive interrogation. Lab on a Chip, 7, 920-922 (2007) 21. Das, M., K. Wilson, P. Molnar, and J. J. Hickman: Differentiation of skeletal muscle and integration of myotubes with silicon microstructures using serum-free medium and a synthetic silane substrate. Nature Protocols, 2, 1795-1801. (2007) 22. Das, M., J. W. Rumsey, C. A. Gregory, N. Bhargava, J. F. Kang, P. Molnar, L. Riedel, X. Guo and J. J. Hickman: Embryonic motoneuron-skeletal muscle co-culture in a defined system. Neuroscience, 146. 481-488 (2007) 23. Rumsey, J. W., M. Das, J. F. Kang, R. Wagner, P. Molnar and J. J. Hickman: Tissue engineering intrafusal fibers: Dose- and time-dependent differentiation. Biomaterials. 29. 994-1004 (2008) 24. Ramalingam, M., P. Molnar, K. P. Rao and J. J. Hickman: Biomaterial Surface patterning utilizing self assembled monolayers to control neuronal cell behavior. International Journal of Biomedical Engineering and Technology. 2, 104 - 134 (2009) 25. Natarajan A., C.J. Chun, J.J. Hickman and P. Molnar: Growth and Electrophysiological Properties of Rat Embryonic Cardiomyocytes on Hydroxyl- and Carboxyl-Modified Surfaces. Journal of Biomaterials Science: Polymer Edition. 19, 1319-31 (2008) 26. Rolland, J., K. , K. S. Lee, L. A. Mahmood, L. Fluck, J. Duarte, I. Kaya, A. Santhanam, P. Meemon, S. Murali, O. Ilegbusi, P. Kupelian, W. Warren, P. Molnar, J. J. Hickman and P. E. Kolattukudy. " Collaborative Engineering: 3-D Optical Imaging and Gas Exchange Simulation of In-Vitro Alveolar Constructs." Studies in health technology and informatics 132: 426-432. (2008) 27. Thakore, V., A. Behal, P. Molnar, D. Leistritz and J.J. Hickman, Nanoscale Nonlinear Dynamic Characterization of the Neuron-Electrode Junction. Journal of Computational and Theoretical Nanoscience, 5, 2164-2169 (2008) 28. Liu, J., J.W. Rumsey, M. Das, P. Molnar, C. Gregory, L. Riedel, et al., Electrophysiological and immunocytochemical characterization of DRG neurons on an organosilane surface in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 44(5-6): p. 162-168. (2008) 29. Varghese, K., M. Das, N. Bhargava, M. Stancescu, P. Molnar, M. S. Kindy and J. J. Hickman: Regeneration and characterization of adult mouse hippocampal neurons in a defined in vitro system . Journal of Neuroscience Methods: 177, 51-59 (2009)

18

30. Dhir, V., A. Natarajan, M. Stancescu, A. Chunder, N. Bhargava, M. Das, L. Zhai, P. Molnar: Patterning of diverse mammalian cell types in serum free medium with photoablation. Biotechnology Progress: 25, 594-603 (2009) 31. Xu, T., P. Molnar, C. Gregory, M. Das, T. Boland and J.J. Hickman: Electrophysiological characterization of embryonic hippocampal neurons cultured in a 3D collagen hydrogel. Biomaterials. In Press (2009)

Other conference abstracts 1. Kang J-F, M. Poeta, L. Riedel, M. Das, C. Gregory, P. Molnar and J. J. Hickman, “Patterned Neuronal Networks for Robotics, Neurocomputing, Toxin Detection and Rehabilitation,” Proceeding of 24th Army Science Conference, Nov. 29th, 2004. 2. Hickman, JJ, Das, M., Kang, J-F, Chun, ChJ, Molnar, P., Wilson, K., Varghese, K. and Leistritz, D.: Hybrid Biological / Non-biological Systems for Toxin Detection, Functional Drug Screening and as Disease Models. Florida Tech Transfer Conference, Orlando, May 2005. Regional 3. Das, M., Bhargava, N., Patil, S., Riedel, L., Molnar, P., Seal, S. and Hickman, J.J.: Novel In Vitro Cell Culture Model of Adult Mammalian Spinal Cord Cells. In vitro Biology Meeting, Baltimore, June 2005, International 4. Molnar, P., Mohan, D.K. and Hickman, J.J.: Toxin detection based on action potential shape analysis using a realistic mathematical model of differentiated NG108-15 cells. Society for Neuroscience, Washington, November, 2005, International 5. Hickman, J.J., Molnar, P., Das, M., Riedel, L., Kang, J-F., Chun, ChJ. and Wilson, K.: Patterned Neuronal Networks for High-Throughput Functional Drug Screening and for Functional Models of Neurodegenerative Diseases. Society for Neuroscience, Washington, November, 2005, International 6. Molnar, P. and Hickman, J.J.: Engineered Neuronal Networks. Winter conference on neuronal plasticity. Guadeloupe, February, 2005, International 7. Mitchell P.O., Molnar, P., Gourdie R.G., Borg, T.K. and Gao, B.Z.: FibroblastMyocyte Electrical Coupling in a Micropatterned Cell Coculture Biomedical Engineering Society, Baltimore, September, 2005. International 8. Kerry A. Wilson, Mainak Das, P. Molnar, and J. J. Hickman: Reflex-arc on a chip: An in silico cell culture analog American Chemical Society Meeting & Exposition. March 26 - 30, 2006. Atlanta, GA USA 9. Peter Molnar, Melissa Kuchma, Anupama Natarajan, Jung-Fong Kang, Neelima Bhargava, Mainak Das and J. J. Hickman: Photolithographical patterning of single cells and cell assemblies on commercial multielectrode arrays. 5th MEA meeting on Substrate Embedded Microelectrode Arrays, July 04-07, 2006, Reutlingen, Germany, 10. Peter Molnar, Jung-Fong Kang, Neelima Bhargava, Mainak Das, Anupama Natarajan and James J. Hickman: Design, implementation and characterization of engineered neuronal networks. FENS Forum, July 8-12, 2006, Vienna, Austria 11. Peter Molnar, Jung-Fong Kang, Neelima Bhargava, Mainak Das, Anupama Natarajan and James J. Hickman: Characterization and applications of engineered neuronal networks. 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, October 14-18, 2006 Atlanta, GA

19

12. Thakore, V., A. Behal, P. Molnar, D. C. Leistritz and J. J. Hickman: Nonlinear dynamic characterization of the neuron-electrode interface. 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, October 14-18, 2006 Atlanta, GA 13. Kerry A. Wilson, Mainak Das, J. W. Rumsey, Peter Molnar, and J. J. Hickman: A Bio-MEMS Device for Modeling the Reflex-arc. 53rd Annual conference of the American Vacuum Society Meeting. Novemver 12-17, 2006. San Francisco, 14. Peter Molnar, Neelima Bhargava, Mainak Das, Anupama Natarajan, Kerry Wilson and James J. Hickman: Integration of living cells with silicon nanostructures for MEMS applications. NSTI Nanotech 10th Annual Conference. May 20-24, 2007 Santa Clara, CA, USA 15. Vipra Dhir, Anupama Natrajan, Anindarupa Chunder, Neelima Bhargava, Mainak Das, Lei Zhai, Peter Molnar: Micropatterned self assembled polyelectrolyte based cytophobic coatings. 234th ACS National Meeting, August 19-23, 2007. Boston, MA, USA 16. Anupama Natarajan, Peter Molnar, Neelima Bhargava, Vipra Dhir, Mainak Das, Kucku Varghese and James J Hickman: Surface modification and photolithographic patterning of microelectrode arrays for cell-based biosensor applications. 234th ACS National Meeting, August 19-23, 2007. Boston, MA, USA 17. Vipra Dhir, Anupama Natrajan, Anindarupa Chunder, Lei Zhai, Peter Molnar: Micropatterning cardiac myocytes on self assembled polyelectrolyte multilayers Materials Science Society 2007 Fall Meeting, November 26 - 30, 2007, Boston, MA, USA 18. Kerry A. Wilson, Mainak Das, Peter Molnar, Kathy J. Wahl, Richard J. Colton and James J. Hickman: A Bio-MEMS Device for Measuring Contractile Forces of Cultured Myotubes on Microfabricated Cantilevers. AVS 54th International Symposium October 14-19, 2007, Seattle, USA 19. Anupama Natarajan, Neelima Bhargava, Peter Molnar, Mainak Das, James J. Hickman: Surface Modification and Photolithographic Patterning of Microelectrode Arrays for Cell-Based Biosensor Applications. AVS 54th International Symposium October 14-19, 2007, Seattle, USA

20