Artikel Penelitian
Penggunaan Krim Amnion pada Penyembuhan Luka Sayatan Tikus Wistar
Menkher Manjas,* Jefri Henky,* Salmiah Agus** *Bagian Bedah/Bank Jaringan Rumah Sakit DR. M Jamil Padang, **Pathologi Anatomi, Fakultas Kedokteran Universitas Andalas, Padang
Abstrak: Selaput amnion dari ketuban sudah lama dikenal sebagai perban biologis dalam mempercepat penyembuhan luka karena secara lokal mampu merangsang pembentukan jaringan kolagen, pertumbuhan epitel dan pembuluh darah baru. Penelitian ini merupakan studi eksperimen pemakaian selaput amnion yang sudah diolah dalam bentuk krim pada penyembuhan luka sayatan dinding abdomen 24 ekor tikus wistar yang dinilai secara makroskopis dan mikroskopis. Binatang percobaan dibagi menjadi dua kelompok yaitu kelompok pertama yang memakai krim amnion dua persen sebagai penutup luka dan kelompok lainnya memakai selaput amnion yang telah disterilkan secara radiasi (amnion lyophilized radiation -sterilized) (ALS-Radiated). Penilaian yang dilakukan secara makroskopis adalah lamanya penyembuhan luka dan kemungkinan timbulnya tanda-tanda infeksi serta alergi pada permukaan luka. Penilaian mikroskopis mencakup tingkat pembentukan jaringan kolagen, epitelisasi dan jumlah pembentukan pembuluh darah baru. Dari hasil penelitian, tidak ditemukan adanya perbedaan yang signifikan penyembuhan luka sesudah 14 hari secara makroskopis dan mikroskopis pada pemakaian kedua jenis amnion (p>0,05) Kata kunci: krim amnion, jaringan kolagen, luka insisi
268
Maj Kedokt Indon, Volum: 60, Nomor: 6, Juni 2010
Penggunaan Krim Amnion pada Penyembuhan Luka Sayatan Tikus Wistar
The Use of Amnion Cream in Wound Healing of Wistar Rats Wound Incision Menkher Manjas,* Jefri Henky,* Salmiah Agus** *Dr. M Djamil Hospital Tissue Bank, Dept. of Surgery Faculty of Medicine Andalas University, Padang, **Dept. of Phatologic Anatomy Faculty of Medicine Andalas University, Padang
Abstract: Amnion membrane of placenta has been known as biological dressing since locally it can stimulate wound healing especially for collagen formation, new epitelization and neovascularization. This experimental studies was done using amnion membrane which was processed into amnion cream, and applied to 24 wistar rats abdominal wall incision wound. The healing was assessed with macroscopic and microscopic evaluation. One group was given two percent amnion cream and other group received amnion lyophilized sterilized radiation. Measures for macroscopic changes were time of wound healing, sign of local infection and alergic reaction while for microscopic evaluations were degree of collagen formation, degree of new epitelization and number of neovascularization. There was no significant different of macroscopic and microscopic evaluation of wound healing which detected after 14 days operation by applying both type of amnion (P>0,05). Keywords: amnion cream, collagen tissue, wound incision
Pendahuluan Selaput amnion adalah lapisan tipis yang menutupi korion plasenta, Selaput amnion banyak mengandung kolagen dan memproduksi cairan amnion pada stadium awal kehamilan.1 Selaput amnion segar yang langsung diambil dari plasenta sesudah ibu melahirkan mulai dimanfaatkan sejak 90 tahun yang lalu sebagai perban biologis luka terutama untuk penutup luka bakar dan ulkus kulit.2,3 Selain mempercepat penyembuhan luka, selaput amnion juga mampu mengurangi nyeri, menurunkan derajat infeksi dan mengurangi kehilangan cairan permukaan pada luka bakar.4 Mulai tahun 1980, sediaan selaput amnion lebih banyak dalam bentuk selaput amnion yang telah diawetkan dan disterilkan dengan radiasi seperti amnion liofilisasi steril - radiasi (ALSRadiasi) yang diproduksi oleh beberapa bank jaringan baik di Indonesia maupun negara-negara lainnya. Amnion yang telah dipreservasi tersebut telah banyak dipergunakan untuk kepentingan klinis untuk penutupan luka seperti luka operasi, luka bakar, luka terbuka, ulkus diabetikum, ulkus lepra dan luka lainnya.5,6 Pemakaian selaput amnion dapat mempercepat penyembuhan luka lebih cepat 50 persen jika dibandingkan dengan pemakaian penutup luka konvensional seperti memakai kasa.7,8 Kemampuan selaput amnion sebagai perban biologis dalam merangsang penyembuhan luka seperti meningkatkan Maj Kedokt Indon, Volum: 60, Nomor: 6, Juni 2010
pembentukan jaringan kolagen, pembentukan epitelisasi dan pembuluh darah baru dikarenakan selaput amnion mengandung beberapa bahan dasar yang diperlukan pada penyembuhan luka. Lapisan dasar selaput amnion mengandung kolagen tipe IV dan tipe VII, allantoin, laminin-1, laminin-5, fibronectin, lysozime, transferine, progesterone dan beberapa jenis growth factors lainnya. Kolagen tipe IV dan VII dapat menfasilitasi perlengketan antar sel sedangkan growth factors dan beberapa protein lainnya berperan sebagai natural inhibisi protease. Allantoin berfungsi sebagai generator antibodi dan mengandung enzim lysozyme yang dapat berfungsi sebagai bakteriostatik dan bakteriolitik, sedangkan progesteron sendiri dapat sebagai bakteriostatik terhadap bakteri gram-positif.9 Sel amnion juga mengandung transferin dengan kadar yang tinggi sehingga dapat mengurangi kemungkinan timbulnya reaksi imunologis dari resipien. Dengan demikian amnion tidak mempunyai efek resisten sehingga secara klinis aman dipakai sebagai penutup luka.10 Sebagai penutup luka, selaput amnion hanya dapat dipergunakan dan dipasangkan oleh seseorang yang terlatih atau paramedis dan tidak bisa dipergunakan oleh semua orang.11 Sedangkan krim amnion, sebagai bentuk alternatif amnion dengan komposisi dan kandungan yang tidak berubah diharapkan dapat mengatasi persoalan tersebut karena lebih
269
Penggunaan Krim Amnion pada Penyembuhan Luka Sayatan Tikus Wistar mudah dan praktis dioleskan pada luka kecil ataupun luka besar selain mudah disimpan dan lebih ekonomis di produksi.11-13 Pemakaian amnion dalam bentuk krim belum pernah dilaporkan untuk penutupan luka pada manusia. Karena itu penelitian ini dilakukan pada binatang percobaan dalam bentuk studi perbandingan untuk membuktikan hipotesis bahwa tidak ada perbedaan efek pemakaian antara krim a amnion dua persen dengan amnion liofilisasi steril - radiasi (ALSRadiasi) pada penyembuhan luka yang dinilai secara makroskopis dan mikroskopis
Penilaian hasil penelitian dilakukan oleh peneliti sendiri bekerja sama dengan bagian Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Unand pada kedua grup binatang percobaan baik secara makroskopis ataupun mikroskopis mempergunakan kriteria Nagaoka 14 Penyembuhan luka sayatan secara makroskopis pada kedua grup binatang percobaan dimonitor sampai 14 hari, mencakup tanda-tanda infeksi, alergi dan lamanya waktu penyembuhan dengan memakai kriteria modifikasi Nagaoka (2000) sebagai berikut: Tabel 1. Skor Penilaian Makroskopis
Metode Penelitian ini dilakukan di laboratorium Fakultas Farmasi Universitas Andalas bekerja sama dengan Instalasi Bank Jaringan Dr. M Djamil Padang/Bagian Bedah Fakultas Kedokteran Universitas Andalas Padang pada bulan bJuni sampai Juli 2009. Binatang percobaan yang digunakan adalah tikus wistar jantan sehat usia 8 - 12 minggu, berat badan 200300 gr. Pemilihan tikus jantan bertujuan untuk menghindari adanya pengaruh hormonal yang dapat mempengaruhi respon reaksi imunologis. Perhitungan jumlah sampel memakai cara Steel and Terri18 dengan menghitung perbedaan rata-rata kelompok pada analisis dua arah dengan alpha 0,05 dan beta 0,20, sehingga diperoleh n=8 dengan tingkat kebebasan 7 dan faktor perubahan n = 1,25, sehingga sampel yang dibutuhkan 8 x 1,25 = 10 pasang. Untuk antisipasi loss to follow up, kami menggunakan 12 pasang tikus percobaan yang dibagi menjadi dua group. Jumlah binatang percobaan sebanyak 24 ekor yang dibagi grup perlakuan memakai krim amnion 12 ekor dan yang lainnya memakai amnion liofilisasi steril - radiasi (ALS-Radiasil) sebagai grup kontrol . Semua tindakan operasi dikerjakan oleh peneliti sendiri dengan bantuan dokter bedah yunior dengan anestesi umum inhalasi eter. Secara asepsis, dibuat insisi pada dinding abdomen sepanjang 5 cm sampai fascia subcutaneus. Perdarahan yang timbul dikontrol dengan penekanan memakai kasa lebih kurang 5 menit dan kemudian luka ditutup dengan jahitan interupted memakai silk 4,0. Luka dinding abdomen binatang percobaan tikus wistar dengan nomor genap ditutup dengan krim amnion dua persen dan dimasukkan ke dalam grup perlakuan, sedangkan binatang percobaan dengan nomor ganjil ditutup dengan amnion liofilisasi steril - radiasi (ALS-Radiasil) sebagai grup kontrol. Pemberian nomor dilakukan secara acak terhadap semua binatang coba di awal penelitian. Perawatan pasca operasi diperlakukan sama pada kedua grup. Kedua grup percobaan kemudian dimonitor dan diawasi secara klinis setiap hari sampai hari ke-14 dan kemudian dilakukan pembiusan dosis tinggi. Selanjutnya dilakukan insisi pada pinggir luka percobaan untuk pemeriksaan histopatologis. Sebelum dan A selama percobaan, semua tikus wistar dikandangkan dalam tempat khusus dan diberi makanan dan minuman binatang dari pabrik makanan binatang (PT Charoen Pophan Medan). 270
Parameter dan Deskripsi Waktu penyembuhan luka - Di bawah 7 hari - Antara 7- 14 hari - Di atas 14 hari Infeksi lokal - Infeksi lokal disertai dengan pus - Infeksi lokal tanpa pus - Tidak ada tanda infeksi lokal Reaksi alergi - Reaksi alergi lokal berupa warna bintik merah sekitar luka - Tidak ada reaksi alergi
Skor
3 2 1 3 2 1 3 1
Penilaian mikroskopis penyembuhan luka pada kedua grup binatang percobaan menggunakan hasil pemeriksaan patologi anatomi dari biopsi insisi luka yang mencakup tingkat pembentukan kolagen, tingkat pembentukan epitelisasi dan jumlah pembentukan pembuluh darah baru dengan kriteria modifikasi Nagaoka (2000) sebagai berikut: Tabel 2. Skor Penilaian Mikroskopis Parameter dan Deskripsi Derajat pembentukan kolagen - Kepadatan kolagen lebih dari jaringan normal/lapan pandang kecil mikroskop - Kepadatan kolagen sama dengan jaringan normal/ lapang pandang kecil mikroskop - Kepadatan kolagen kurang dari jaringan normal/lapang pandang kecil mikroskop Derajat terjadinya epitelisasi - Epitelisasi normal/lapang pandang kecil mikroskop - Epitelisasi sedikit/lapang pandang kecil mikroskop - Tidak ada epitelisasi/lapang pandang kecil mikroskop Jumlah pembentukan pembuluh darah baru - Lebih 2 pembuluh darah baru/lapang pandang kecil mikroskop - 1-2 pembuluh darah baru/lapang pandang kecil mikroskop - Tidak ada pembuluh darah baru/lapang pandang kecil mikroskop
B
Skor
3 2 1
3 2 1 3 2 1
C
Analisa hasil penelitian memakai T test tidak berpasangan yang dipergunakan untuk membandingkan efek Maj Kedokt Indon, Volum: 60, Nomor: 6, Juni 2010
Penggunaan Krim Amnion pada Penyembuhan Luka Sayatan Tikus Wistar penyembuhan antara krim amnion dua persen dan amnion liofilisasi steril-radiasi (ALS-Steril) dari penjumlahan dan ratarata skor secara keseluruhan dengan nilai p>0,05 di-anggap tidak bermakna. Data diolah dengan menggunakan rumus statistik secara manual dan diuji dengan tabel-tabel statistik. Hasil Penelitian dilakukan terhadap 24 ekor binatang percobaan tikus wistar yang separuhnya memakai krim amnion dua persen sebagai penutup luka dan dimasukkan sebagai grup percobaan. Dua belas ekor lainnya memakai amnion liofilisasi steril-radiasi (ALS-Radiasi) dan dimasukkan sebagai grup kontrol. Selama penelitian, semua binatang percobaan hidup sampai observasi hari ke 14 dan tidak ada yang dikeluarkan dari penelitian. Semua luka insisi pada kedua grup binatang percobaan secara klinis sembuh dalam waktu rata-rata 7,6 ± 1,4 hari, sedangkan pada group kontrol sembuh dalam waktu 7,00 ± 0,7 hari. Tidak terdapat perbedaan yang bermakna antara kedua kelompok ini dengan t = 0.340 dan p=0,737. Reaksi alergi lokal hanya ditemukan pada satu ekor pada grup percobaan namun tetap sembuh dalam waktu sebelum 14 hari. Dari penilaian secara makroskopis kedua grup binatang percobaan tikus wistar didapatkan bahwa skor rata-rata infeksi , alergi dan waktu penyembuhan tidak jauh berbeda dan hanya satu tikus wistar dengan infeksi lokal pada grup percobaan. Dari penilaian secara mikroskopis sesudah 14 hari didapatkan pula skor rata-rata kepadatan jaringan granulasi, pembentukan epitel dan pembuluh darah baru hampir sama pada kedua grup. Pada grup kontrol ditemukan delapan ekor dengan pembentukan jaringan kolagen diatas jaringan normal. Penemuan lebih rinci dari evaluasi secara makroskopis dan mikroskopis sesuai skor yang telah ditentukan dipresentasikan pada Tabel 3. Tabel 3. Skor Makroskopis dan Mikroskopis dari Penyembuhan Luka Antara Pemakaian Krim Amnion Dua Persent dan Amnion Liofilisasi Steril-Radiasi (ALS) Steril Skor
Krim Amnion
ALS Radiasi
t
p
Skor Makroskopis Skor Mikroskopis
6,4 + 0,7 6.5 + 0,9
6,3 + 0,2 6,4 + 0,5
0,348 0,277
>0,05 >0,05
Diskusi Tujuan utama pengobatan luka adalah mengembalikan fungsi dan bentuk jaringan kulit kembali normal dengan komplikasi lokal seminimal mungkin.15 Pengobatan lokal dilakukan mulai dari tindakan pembersihan, debridement, penjahitan dan penutupan luka agar terjadi penyembuhan luka primer tanpa adanya komplikasi lokal seperti infeksi, pembentukan jaringan ikat (sikatrik) dan keloid yang Maj Kedokt Indon, Volum: 60, Nomor: 6, Juni 2010
berlebihan.16,17 Berbagai metode penutupan luka secara local terus dikembangkan agar mendapatkan hasil yang maksimal. Dimulai dengan penutupan luka memakai kasa (perban sintesis/non biologis) ditambah bahan antiseptik, anti biotik dan lainnya. Sedangkan pemakaian verban biologis seperti selaput amnion pada manusia telah dimulai sejak lama pada penutupan luka bakar, kemudian dikembangkan untuk pemakaian beberapa jenis luka lain termasuk ulkus.15,17 Karena itu pemakaian selaput amnion sebagai perban biologis pada manusia telah banyak dilakukan dan memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan dengan pemakaian perban konvensional (khasa). Didapatkan bahwa selaput amnion sebagai perban biologis dapat merangsang terjadinya jaringan granulasi, pembentukan epitelisasi dan pembuluh darah baru.2-4,7 Selain itu selaput amnion juga bersifat anti scarring dengan menurunkan TGF dan tidak mempunyai efek imunogenik karena tidak mengandung HLA A, B, C atau beta 2-microbulin.10 Peran amnion dalam meningkatkan kualitas penyembuhan luka lebih banyak tergantung pada komposisi bahan–bahan yang ditemukan dalam amnion, bukan karena luasnya selaput amnion yang dapat menutupi luka.9,13 Dari hasil penelitian binatang percobaan sebelumnya, Manjas dan kawan-kawan melaporkan bahwa pemakaian krim amnion yang komposisinya tidak dirusak dapat memberikan efek penyembuhan luka.11,12 Dari hasil penelitian ini didapatkan bahwa, pemakaian krim dua persen pada penyembuhan luka sayatan yang dinilai secara makroskopis dan mikroskopis memakai kriteria Nagaoka memberikan hasil yang tidak berbeda dibanding pemakaian amnion liofilisasi steril - radiasi (ALS-Radiasi) (P>0,05). Hasil penelitian ini belum dapat dibandingkan dengan hasil penelitian-penelitian lain karena sediaan amnion sebagai perban biologis umumnya tersedia dalam bentuk selaput amnion. Dari pembahasan di atas terlihat bahwa, tidak terdapat perbedaan yang bermakna efek penyembuhan luka sayatan pada pemakaian krim amnion dua persen dengan selaput amnion yang telah diradiasi (ALS-Radiasi) pada percobaan binatang tikus wistar yang dinilai secara makroskopis dan mikroskopis. Kesimpulan Dari hasil penelitian, tidak ditemukan adanya perbedaan yang signifikan penyembuhan luka insisi tikus wistar percobaan sesudah 14 hari secara makroskopis dan mikroskopis pada pemakaian kedua jenis amnion (p>0,05) yaitu krim amnion 2% sebagai bentuk lain sediaan selaput amnion dan amnion liofilisasi steril-radiasi (ALS-Radiasi) . Untuk pemakaian pada manusia masih diperlukan penelitian lebih lanjut. Daftar Pustaka 1.
Farazdaghi M, Adler J, Farazdagi SM. Electron microscopey of human amniotic membrane. Dalam: Philips GO, Strong DM, von Versen R, Nather A, editors. Advances in tissue banking: The
271
Penggunaan Krim Amnion pada Penyembuhan Luka Sayatan Tikus Wistar scientific basis of tissue transplantation. World Scientific Singapore. 2001.hal.149-71. 2. Crush JS and Jirsch DW. Human amniotic membrane, a versatile wound dressing. Can Med Assoc J. 1978; 118(10):1237-46. 3. Manjas M, Tarusar P, Hilmy N. The use of irradiated Amnion grafts in Wound Healing. Dalam: Nather A, Yosof N, Hilmy N, editors. Radiation in tissue banking: Basic science and clinical application of irradiated tissue allograft. World Scientific Singapore. 2007.hal.329-42. 4. Matthews R, Bennett J, Page Faulk W. Wound healing using amniotic membranes. British Journal of Plastic Surgery. 1981; 34:76-8. 5. Gajiwala AL, Sharma V. Use of irradiated amnion as a biological dressing in the treatment of radiation induced ulcers. Cell Tissue Bank Springer Netherlands. 2003;147-50. 6. Hilmy N, Siddik S, Gentur, Gulardi. Physical and chemical properties of freeze dried amnion membranes sterilized by irradiation. J Atom Indonesia. 1987;13(2):1-14. 7. Kamardi T, Nursal H, Nazly H. Clinical studies on application of sterile irradiated freeze-dried amniochorion membranes on burn wound treatment. Proceding in Anually Indonesian Surgery Meeting. Padang; 1993:5-24. 8. Panakova E., Koller J. Utilisation of foetal membrane in the treatment of burn and other skin defects. In: Philips GO, Strong DM, von Versen R, Nather A, editors. Advances in tissue banking: The scientific basis of tissue transplantation. World Scientific Singapore. 1998;2.hal.165-73. 9. Faulk WP, Matthews R, Steven PJ. Human amnion as an adjunction in wound healing. Lancet. 1980;31:1156-57. 10. Akle CA, Adinolfi M, Welsh KI, Leibowitz S, McColl I. Immunogenicity of human amniotic epithelial cells after transplantation into volunteers. Lancet. 1981;2:1003-05.
272
11. Manjas M, Usman F, Agus S. Is amnion cream also effective in collagen formation for wound healing (wistar rats wound experimental studies). Proceedings of the 11th International Conference on Tissue Banking, 2006 Nov 24-26; Mumbai, India. Tata Memorial Hospital, 2006 12. Manjas M, Henky J, Agus S. Comparison studies of wound healing with using two percent and one percent amnion cream concentration. (wistar rats wound experimental studies). Proceedings of the 5th World Congress on Tissue Bank 2008June 2-6; Kuala Lumpur, Malaysia. 2006 13. Meller D, Pires R.T, Mack R.J. Amniotic membrane trans-plantation for acute chemical or thermal burns. Ophthalmology.2000; 107:980-98 14. Nagaoka, T, Kaburagi, Y, Hamaguchi, Y, Hasegawa M, Takehara, K, Steeber D, et al. Delayed wound healing in the absence of intercellular adhesion molecule-1 or L-selectin expression. . Am. J. Pathol. 2000;157:237-47 15. Robson MC, Steed DL, Franz MG. Wound healing: Biologic features and approaches to maximize healing trajectories. Current Problems in Surgery. University of South Florida. 2001;38: 65140. 16. Martin, Paul. “Wound-Healing-Aiming for Perfect Skin Regeneration.” Science London 1997;276(5309):75-81. 17. Longaker MT, Adzick NS. The biology of fetal wound healing: a review. Plast Reconstr Surg.1991;87(4):788-98. 18. Steel, RGD dan Torrie, JH, Principles and Procedures of Statistics, A Biometrical Approach, Second Edition, MacGraw-Hill Book Company, New York, 1980
FS
Maj Kedokt Indon, Volum: 60, Nomor: 6, Juni 2010
