Pengaruh Sonikasi Ultrasonik pada Inaktivasi dan Viabilitas Escherichia coli BL21

Jurnal Penelitian Kecil Mikrobiologi Vol. 3, No. 6, 2015, 01-16

Pengaruh Sonikasi Ultrasonik pada Inaktivasi dan Viabilitas Escherichia coli BL21 Muhammad Farhan Maulana*1, Haniswita1, Meliantha1, Nanda Seftyana1, Putri Ayu Fajar1, Agatha Nabila Lestari*2 1

Program Studi Mikrobiologi, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati-ITB, Bandung Asisten Mata Kuliah Proyek Mikrobiologi, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati-ITB, Bandung

2

Email: [email protected]

Abstrak. Selain memiliki berbagai dampak positif, mikroba juga memiliki dampak negatif sehingga diperlukan suatu metode dan prosedur untuk mengendalikan pertumbuhan mikroba. Sonikasi ultrasonik merupakan suatu alternatif pengendalian pertumbuhan mikroba secara fisik. Telah dilakukan percobaan sonikasi ultrasonik terhadap Escherichia coli BL21 dengan waktu yang bervariasi yaitu 4 menit, 6 menit, 8 menit, dan 10 menit dengan tujuan untuk menentukan pengaruh sonikasi 4 menit, 6 menit, 8 menit, dan 10 menit serta perbandingan setiap perlakuan terhadap kontrol. Sebelum perlakuan sonikasi, kultur Escherichia coli BL21 diinkubasi selama 6 jam dalam shaker dengan kecepatan 120 rpm. Kultur Escherichia coli BL21 dalam nutrient broth dimasukkan sebanyak 15 mL ke setiap botol vial. Dalam setiap perlakuan, digunakan pola action time selama 10 detik dan resting time selama 30 detik dan probe dijaga agar tidak menyentuh dasar botol. Suhu kultur dijaga agar konstan dengan mencelupkan botol vial ke dalam es batu. Hasil yang didapat pada perhitungan sel maupun dengan metode OD menunjukkan hasil yang tidak sesuai dengan literatur. Perlakuan dengan waktu durasi total 10 menit menunjukkan angka lempeng total (ALT) yang paling rendah yaitu 0,12 x 109 cfu/mL dibandingkan dengan kontrol yaitu 0,33 x 109 cfu/ mL. Terlihat bahwa inaktivasi dan viabilitas sel sangat dipengaruhi ketika durasi total paling lama. Tetapi tren tersebut tidak terlihat pada tiga perlakuan sebelumnya yang lebih tinggi daripada kontrol.


Kata Kunci: Ultrasonikasi; Inaktivasi; Viabilitas; Escherichia coli BL21, Angka lempeng total, Metode Densitas Optis (OD) Abstract. Microbe has several negative effects, despite also having various benefits. Therefore, methods and procedures for controlling microbial growth is highly needed. Of the various methods and procedures developed to control microbial growth, ultrasonic sonication is one of the alternative of microbial growth control by physical means. An experiment of ultrasonic sonication to Escherichia coli BL21 has been done with various duration of application, which are 4 minutes, 6 minutes, 8 minutes, and 10 minutes, in order to compare the effect of ultrasonic sonication at each different duration and to compare the result of every duration with control. Before applying the treatment of sonication, Escherichia coli BL 21 culture is incubated for 6 hours in shaker with rotational speed of 120 rpm. Then, every vial bottle is inserted with 15 mL of the culture. In every treatment, a pole of 10 seconds of action time and 15 seconds of resting time is applied and the sonicator probe is kept away from the bottom of the vial bottle. The temperature of culture is held constant by dipping the vial bottle in ice. Results acquired from both total plate count and optical density method shows discrepancy with results from literature study. Treatment of total ultrasonic sonication time 10 minute shows the lowest plate count which is 0,12 x 109 cfu/mL compared with control which is 0,33 x 109 cfu/ mL. It has shown that inactivation and viability of cell is greatly influenced with longest duratiom time. But, this trend isn’t shown in three previous treatments which show higher total plate count than control. Keywords: Ultrasonication; Inactivation; Viability; Escherichia coli BL21; total plate count; optical density (OD) method


Pendahuluan Mikroorganisme dapat menyebabkan berbagai dampak terhadap kehidupan manusia, baik dampak positif maupun dampak negatif. Adapun dampak positif keberadaan mikroorganisme terhadap kehidupan manusia adalah diversifikasi makanan melalui kemampuan fermentasi mikroba terhadap bahan pangan. Sedangkan dampak negatif keberadaan mikroorganisme terhadap kehidupan manusia adalah timbulnya kerusakan bahan makanan dan bahan-bahan lainnya yang mana kehadiran mikroba dalam hal ini akan menimbulkan kerugian, salah satu contohnya adalah kerugian ekonomi. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu metode dan prosedur untuk mengendalikan pertumbuhan mikroba sehingga keberadaannya tidak merugikan kehidupan manusia. Adapun yang dimaksud dengan pengendalian pertumbuhan mikroba adalah segala kegiatan yang dapat menghambat atau membasmi mikroba dari suatu permukaan. Secara umum kontrol pertumbuhan mikroba diperlukan untuk mencegah penyebaran penyakit dan infeksi, membasmi mikroorganisme pada inang yang terinfeksi, serta mencegah pembusukan dan perusakan bahan oleh mikroorganisme [7]. Pengendalian pertumbuhan mikroba dapat dilakukan baik secara kimiawi maupun secara fisik. Pengendalian pertumbuhan mikroba secara kimiawi berarti menekan pertumbuhan mikroba dengan menggunakan senyawa kimia yang mana senyawa ini akan menimbulkan reaksi kimia tertentu sehingga menimbulkan efek mikrobiostatik atau bakteriosidal—istilah untuk mikroba lain di antaranya fungisida, virisida, dan sporisida [7]. Pengendalian pertumbuhan mikroba secara fisik berarti melibatkan suatu proses yang menimbulkan

perubahan fisik. Adapun pengendalian pertumbuhan mikroba secara fisik dapat dilakukan dengan menggunakan panas lembap, panas kering, radiasi, filtrasi, dan metode pembersihan fisik dengan memanfaatkan gelombang ultrasonik dan pencucian [7]. Metode pembersihan fisik dengan menggunakan gelombang ultrasonik secara umum dikenal sebagai metode sonikasi. Sonikasi merupakan metode pemecahan sel yang memanfaatkan getaran dari gelombang suara dengan frekuensi tinggi untuk melisiskan sel [7]. Dalam bidang bioteknologi sonikasi biasanya digunakan untuk proses sonoporasi yaitu proses pemecahan membran sel sehingga bagian internal sel keluar [7]. Sebagaimana yang telah dijelaskan sebelumnya, pertumbuhan mikroba perlu dikontrol baik kontrol secara kimiawi maupun kontrol secara fisik. Dalam penelitian kali ini, dilakukan kontrol pertumbuhan bakteri E. coli BL21 dengan menggunakan sonikator. Oleh karena itu perlu diketahui efektivitas sonikasi sebagai kontrol pertumbuhan mikroba secara fisik terhadap inaktivasi dan viabilitas bakteri E. coli BL21 sebagai representasi bakteri Gram negatif. Tujuan dari dilakukannya eksperimen ini adalah untuk menentukan jumlah bakteri perlakuan positif sonikasi 4 menit, 6 menit, 8 menit, dan 10 menit dengan metode TPC, menentukan jumlah bakteri perlakuan negatif dengan metode TPC, menentukan densitas optis perlakuan positif sonikasi 4 menit, 6 menit, 8 menit, 10 menit dengan metode TPC, menentukan densitas optis perlakuan negatif sonikasi. Hipotesis yang diajukan adalah bahwa ultrasonikasi dengan interval nyala 10 detik sekaligus resting 30 detik dan total durasi sonikasi selama 6 menit akan menghasilkan nilai densitas optis dan angka lempeng total terendah Escherichia coli BL21.

Metodologi Cara kerja Bahan Aktivasi E. coli BL 21 Pada penelitian kali ini digunakan kultur Escherichia coli yang berasal dari stock culture, yang kemudian akan diaktivasi. Juga digunakan bubuk nutrien agar dan nutrien broth sebagai medium bagi pertumbuhan Escherichia coli BL 21, serta larutan fisiologi NaCl.

Aktivasi E. coli BL21 dilakukan dengan cara memindahkan kultur Escherichia coli BL 21 yang berasal dari stock cultur ke dalam labu Erlenmeyer berisi nutrient broth, dan diinkubasi selama 24 jam


dalam shaker 250 rpm dengan suhu 37˚C. Kemudian diambil 2 mL kultur Escherichia coli BL21 dari labu Erlenmeyer tersebut ke dalam 198 mL nutrien broth dalam labu Erlenmeyer yang berbeda. Kultur kemudian diinkubasi selama 6 jam tepat sebelum perlakuan eksperimen dalam shaker 120 rpm dan suhu 28˚C.

dan resting time tiap 30 detik. Probe sonikator dimasukkan pada botol vial sampai batas maksimum yang tidak menyentuh dasar botol. Suhu kultur dijaga dengan cara merendam setengah botol vial dengan es batu.

Sonikasi kultur Escherichia coli BL 21

Setelah diberi perlakuan, dilakukan pengukuran densitas optis—beserta kontrol—dengan menggunakan spektrofotometer. Setelah itu, dibuat pengenceran kultur sampai 10-6 dengan menggunakan larutan fisiologis NaCl 1%. Kemudian, dilakukan inokulasi secara aseptis dengan metode sebar ke dalam medium nutrient agar dalam cawan petri yang telah disiapkan. Pengerjaan dibuat duplo. Semua kultur yang telah selesai diinokulasi kemudian diinkubasi dalam inkubator 370C.

Setelah dilakukan inkubasi, kultur Escherichia coli BL21 dimasukkan ke dalam lima botol vial secara aseptis sebanyak 15 mL. Disiapkan satu botol vial berisi 15 mL kultur yang tidak disonikasi sebagai kontrol. Perlakuan pada kultur menggunakan sonikator dengan frekuensi standar 20,000 Hz dengan variasi pada durasi total sonikasi yaitu 4 menit, 6 menit, 8 menit, dan 10 menit. Pada tiap perlakuan, digunakan pola action time setiap 10 detik

Inokulasi dan inkubasi Escherichia coli BL 21

Hasil Pengamatan dan Pembahasan Bakteri Escherichia coli BL21 dapat tumbuh optimum pada suhu 37oC. Pada percobaan kali ini bakteri Escherichia coli BL21 diinkubasi pada suhu 28oC yang tidak memberikan pertumbuhan optimum [9]. Berikut merupakan grafik densitas sel terhadap temperatur yang digunakan untuk menginkubasi kultur: Sebagaimana ditunjukan pada tabel 1 dan 2, hasil yang didapat pada perhitungan sel maupun dengan metode OD menunjukkan naik turunya data yang diperoleh pada setiap perlakuan. Hasil ini tidak sesuai dengan literatur yang menyatakan bahwa nilai OD dan hasil TPC akan menurun seiring dengan bertambahnya waktu sonikasi. Hal ini disebabkan karena beberapa faktor, salah satunya yaitu suhu inkubasi yang tidak diatur sesuai dengan suhu optimum bagi pertumbuhan Escherichia coli BL 21. Sehingga, pengerjaan praktikum kali ini tidak dilakukan pada kondisi optimum pertumbuhan Escherichia coli BL21. Gambar 1. Grafik densitas sel terhadap temperatur inkubasi [9]


Faktor lain yang sangat berpengaruh terhadap

Grafik 2: 1: Perbandingan Jumlah DensitasTPC Optis terhadap terhadap Waktu WaktuSonikasi Sonikasi

naik turunnya data adalah waktu pengerjaan sonikasi yang tidak dilakukan secara bersamaan. Kultur dimasukkan ke dalam botol vial dalam waktu yang bersamaan. Namun, terdapat jeda waktu yang panjang antara pemasukkan kultur ke botol dengan perlakuan sonikasi. Selama jeda waktu ini, kultur ditempatkan dalam suhu ruang sehingga memungkinkan sel Escherichia coli BL21 untuk terus melakukan pembelahan sel. Jeda waktu yang cukup panjang antara kontrol dengan perlakuan 4 menit, 6 menit, 8 menit, terutama 10 menit dapat menyebabkan pertambahan sel yang signifikan karena Escherichia coli BL21 memiliki generation time yang relatif singkat yaitu sekitar 25 menit [8]. Dengan demikian, meskipun perlakuan sonikasi lebih lama, jumlah sel awal yang jauh lebih tinggi dapat menghasilkan hasil akhir yang lebih tinggi dengan kultur yang diberi perlakuan

Grafik 2: Perbandingan Jumlah TPC terhadap Waktu Sonikasi

sonikasi lebih singkat. Kedalaman probe dalam suspense kultur bakteri juga turut memepengaruhi jumlah sel yang lisis. Dalam sebuah sonikator terdapat vibrating probe yang dapat menghasilkan gelombang suara.

Gelombang suara ini akan menginisiasi pembentukan partikel uap air. Partikel uap air yang banyak menimbulkan shockwave sehingga meradiasi suspensi sel. Jika probe diletakan pada permukaan suspense—baik permukaan atas maupun permukaan bawah—maka energi yang terpancar dari probe tidak merata sehingga tidak semua bagian suspense sel yang mendapat efek shockwave [6].

IV. Kesimpulan dan Saran Kesimpulan Dari hasil penelitian ini diperoleh data jumlah bakteri—setelah hari pertama—dalam sampel setelah dilakukan sonikasi dan yang memenuhi kaidah analisis dengan Total Plate Count selama 4 menit adalah 1,71 x 109 cfu/mL, selama 6 menit adalah 1,48 x 109 cfu/mL, selama 8 menit adalah 2,45 x 109 cfu/mL, dan selama 10 menit adalah 0,12 x 109 cfu/mL. Jumlah bakteri dengan tidak diberi perlakuan sonikasi dan memenuhi kaidah analisis dengan Total Plate Count adalah 0.33 x 109 cfu/ mL. Ukuran rata-rata densitas optis kultur yang diberikan perlakuan 4 menit adalah 0.581, untuk 6 menit adalah 0.575, untuk 8 menit adalah 0.602, untuk 10 menit adalah 0.615. Ukuran rata-rata densitas optis kultur yang tidak diberi perlakuan adalah 0.571. Dengan menggunakan kaidah KLT angka 30-300, didapat hasil terendah pada sonikasi dengan durasi total 10 menit. Hal ini menunjukan bahwa durasi sonikasi sangat berpengaruh pada inaktivasi dan viabilitas sel karena pada durasi ini jumlah sel lebih rendah daripada jumlah kontrol. Tetapi trend terseut tidak terlihat pada tiga perlakuan sebelumnya, diduga karena desain eksperimen yang kurang cermat. Sehingga menyebabkan perhtungan sel tidak konstan Saran Untuk memperoleh data yang baik bagi penentuan efektivitas waktu sonikasi terhadap inaktivasi dan viabilitas sel Escherichia coli BL 21 seharusnya dilakukan pengerjaan penelitian yang sangat terampil, hati-hati, dan setiap proses dilakukan pada waktu yang sangat tepat. Terutama


bagi proses sonikasi masing-masng perlakuan waktu yang harus dilakukan serentak, agar jumlah koloni di awal sonikasi pada tiap perlakuan waktu sama, sehingga didapatkan data yang baik bagi penenentuan efektivitas waktu sonikasi terhadap inaktivasi dan viabilitas sel Escherichia coli BL21. V. Ucapan Terimakasih Penulis mengucapkan terima kasih kepada ibu Dr. Dea Indriani Astuti sebagai dosen mata kuliah proyek mikrobiologi, Fenryco Pratama yang telah memimbing dan mengarahkan penulis dalam penilitian ini. Tidak lupa penulis juga mengucapkan terimakasih kepada Agatha Nabila Lestari sebagai asisten penelitian kecil Proyek Mikrobiologi ini, yang telah membimbing, membantu, dan mengarahkan penulis selama penyusunan jurnal ini. VI. Daftar Pustaka [1] Benov, L. dan Al-Ibraheem, J. 2002. Disrupting Escherichia coli: A Comparison of Methods. Journal of Biochemistry and Molecular Biology. (35) 428-431. [2] Feliu, J. X., Cubarsi, R., dan Villaverde, A. 1997. Optimized Release of Recombinant Proteins by Ultrasonication of E. coli Cells. Journal of Biotech. and Bioeng. (58) 536-540. [3] Furuta, M., Yamaguchi, M, Tsukamoto, T., Yim, B., Stavarache, C. E., Hasiba, K., dan Maeda, Y. 2004. Inactivation of Escherichia coli Ultrasonic Irradiation. Ultrasonics Sonochemistry. 11:57-60 [4] Madigan, M., Martinko, J., Bender, K., Buckley, D., dan Stahl, D. 2015. Brock Biology of Microorganisms. Glenview: Pearson Education, Inc. [5] Monsen, T., Lövgren, E., Widerström, M., dan Wallinder. 2009. In Vitro Effect of Ultrasound on Bacteria and Suggested Protocol for Sonication and Diagnosis of Prosthetic Infections. Journal Of Clinical Microiology. 47(8): 2496–2501 [6] Pelczar, dan Michael J., J. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press. Hlm. 10-25 [7] Roostalu, J., Joers, A., Luidalepp, H., Kaldalu, N., dan Tenson, T. 2008. Cell Division in Escherichia coli Cultures Monitored at Single Cell Resolution [Online]

http://www.biomedcentral.com. Diakses pada 25 November 2015 pukul 21.00 WIB. [8] Svensson, I. 2015. EHEC, Entrohemorragisk E-coli [Online] https://prezi.com. Diakses pada 24 November 2015 pukul 22.15 WIB. [9] Tessarova, M. 2010. Optimisation of Culture Conditions of E. coli Using Method Design of Experiments [Online] http://www.auc.cz/ipb/vpk/doc/06/prezHladiko va.pdf. Diaskes pada 26 November 201 pukul 20.15 WIB.


Lampiran 1. Tabel hasil pengamatan sonikasi 1

Tanggal pengamatan: 23 November 2015

Tanggal pengamatan: 24 November 2015 Tanggal pratikum: 22 November 2015

Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA Medium: NA Waktu sonikasi : 0 menit (kontrol)

Waktu sonikasi : 0 menit (kontrol) Jumlah koloni : 3 Jumlah koloni : 1 Keterangan: Keterangan: -



Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA Waktu sonikasi : 4 menit

Medium: NA Waktu sonikasi : 4 menit Jumlah koloni : 57

Jumlah koloni : 1 Keterangan: Keterangan: -




Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA Medium: NA Waktu sonikasi : 6 menit Waktu sonikasi : 6 menit Jumlah koloni : 8 Jumlah koloni : 4 Keterangan: Keterangan: -



Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3

Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA Medium: NA Waktu sonikasi : 8 menit Waktu sonikasi : 8 menit Jumlah koloni : 1 Keterangan: -

Jumlah koloni : 2 Keterangan: -




Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA Medium: NA Waktu sonikasi : 10 menit Waktu sonikasi : 10 menit Jumlah koloni : 15 Jumlah koloni : 10 Keterangan: Keterangan: -

2. Tabel hasil pengamatan sonikasi 2


Tanggal pengamatan: 24 November 2015 Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3

Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA Medium: NA Waktu sonikasi : 0 menit (kontrol)

Waktu sonikasi : 0 menit (kontrol) Jumlah koloni : 39 Jumlah koloni : 31 Keterangan: duplo Keterangan: duplo




Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA Medium: NA Waktu sonikasi : 4 menit Waktu sonikasi : 4 menit Jumlah koloni : 157 Jumlah koloni : 171 Keterangan: duplo Keterangan: duplo



Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3

Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA Medium: NA Waktu sonikasi : 6 menit Waktu sonikasi : 6 menit Jumlah koloni : 48 Jumlah koloni : 35 Keterangan: duplo

Keterangan: duplo




Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA

Medium: NA Waktu sonikasi : 8 menit

Waktu sonikasi : 8 menit Jumlah koloni : 5

Jumlah koloni : 6 Keterangan: duplo, spreader

Keterangan: duplo


Tanggal pengamatan: 24 November 2015 Tanggal pratikum: 22 November 2015 Kultur : Escherichia coli BL21 DE3

Kultur : Escherichia coli BL21 DE3 Medium: NA Medium: NA Waktu sonikasi : 10 menit

Waktu sonikasi : 10 menit Jumlah koloni : 40 Jumlah koloni : 8 Keterangan: duplo, spreader Keterangan: duplo

Pengaruh Sonikasi Ultrasonik pada Inaktivasi dan Viabilitas Escherichia coli BL21

Recommend Documents