PENGARUH PEMBERIAN ASAM VALPROAT TERHADAP SEL ENDOKRIN TIKUS (Rattus norvegicus L.) THE EFFECT OF VALROIC ACID ON ENDOCRINE CELL PANCREAS OF TILLERS RAT (Rattus norvegicus L.) Nur Ardhi Praja 1), Hadi Sunaryo1), Kusmardi2), dan Kriana Efendi1) 1 Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah Prof. DR. HAMKA, Jakarta. 2 Bioassay Departemen Kimia Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.
ABSTRAK Asam valproat yang bersifat teratogen dapat menyebabkan cacat tuba neuralis dan jantung, cacat kraniofasial, dan tungkai. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian asam valproat terhadap sel endokrin pankreas anakan tikus. Subjek penelitian ini adalah 12 ekor tikus putih betina galur Sparague Dawley dengan berat 200 g, dibagi dalam 4 kelompok, masing-masing 3 ekor tikus betina. Kelompok I sebagai kontrol normal, kelompok II sediaan uji dosis (20 mg/200 g BB), kelompok III sediaan uji dosis (40 mg/200 g BB), dan kelompok IV sediaan uji dosis (60 mg/200 g BB). Asam valproat diberikan pada Fetal Growth and Development. Setelah tikus lahir dan saat berumur 50 hari tikus dibedah. Jaringan pankreas diambil untuk analisa histopatologi. Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop untuk menghitung jumlah sel pankreas. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa dosis 60 mg/200 g BB dapat menyebabkan penurunan jumlah sel endokrin pankreas anakan tikus. Kata Kunci: Asam Valproat, Embrional Fetal Growth and Development, Sel Endokrin Pankreas ` ABSTRACT Valproic acid which is a teratogenic can cause neural tube and cardiac defects, craniofacial defects, and limb. This research purpose to discover the effect of valproic acid on the endocrine cell of tillers rat pancreatic. The subjects were 12 female white rats Sparague Dawley strain about 200 g of weight, were divided into 4 groups, 3 female white rats each group. Group I was a normal control, group II 20 mg/200 g BW, group III 40 mg/200 g BW, and group IV 60 mg/200 g BW of doses. In periode of Fetal Growth and Development the valproic acid were feeding. After the rat were born and at the 50 days old were sacrificed. The pancreas tissues were taken for histopathological analysis. Observation was conducted using a microscope to count the quantity of pancreas cell. From the research it can be concluded that 60 mg/200 g BW of doses cause decreasing the quantity endocrine cell of tillers rat pancreas. Keywords: Valproic acid, Endocrine Cell of Pancreas
1
PENDAHULUAN Teratogenik (teratogenesis) adalah istilah medis yang berasal dari bahasa Yunani yang berarti membuat monster. Dalam istilah medis, teratogenik berarti terjadinya perkembangan tidak normal dari sel selama kehamilan yang menyebabkan kerusakan pada embrio sehingga pembentukan organ-organ berlangsung tidak sempurna (terjadi cacat lahir). Teratogenik adalah sifat bahan yang dapat menghasilkan kecacatan tubuh pada kelahiran (Loomis 1989). Pada wanita yang sedang hamil tidak selalu bebas dari penyakit, sehingga penggunaan obat tertentu terkadang menjadi suatu keharusan. Seperti pada wanita hamil yang mengalami gangguan atau penyakit susunan saraf pusat seperti epilepsi. Epilepsi adalah nama umum untuk sekelompok gangguan atau penyakit susunan saraf pusat yang timbul spontan dan berulang dengan episode singkat dengan gejala utama kesadaran menurun sampai hilang. Biasanya disertai dengan kejang, hiperaktivitas otonomik, gangguan sensorik dan selalu disertai adanya letupan EEG abnormal (Goodman dan Gilman 2008). Asam valproat adalah obat antipilepsi yang menghasilkan efek terhadap neuron yang diisolasi mirip dengan efek fenitoin atau etosuksimid. Pada konsentrasi yang sesuai secara terapeutik, asam valproat menghambat perangsangan berulang terus menerus yang diinduksi oleh depolarisasi neuron korteks atau spinalis kordata. Asam valproat efektif dalam absens epilepsi, epilepsi mioklonik, epilepsi parsial, dan epilepsi tonik klonik. Obat ini memberikan efek samping yang paling terjadi berupa gejala gastrointestinal sementara, mencakup anoreksia, mual dan muntah. Efek terhadap SSP mencakup sedasi, ataksia, dan tremor. Gejala-gejala tersebut jarang terjadi dan biasanya berespons terhadap pengurangan dosis. Ruam, alopesia, serta perangsangan nafsu makan, dan mempunyai beberapa efek terhadap fungsi hati (Goodman dan Gilman 2008). Aksi suatu zat yang berakibat pada kecacatan selama kebuntingan berhubungan erat dengan perkembangan fetus. Perkembangan fetus dibagi menjadi blastogenesis, organogenesis, histogenesis dan pematangan fungsional. Pada organogenesis, terjadi proses pembentukan organ sehingga zat teratogen akan menyebabkan malformasi organ, jenis malformasi tergantung dari jenis teratogen. Histogenesis dan pematangan fungsional tergantung pada suplai nutrisi dan diatur berbagai sistem hormon (Diani 1984). Penelitian retrospektif pada wanita hamil pengidap epilepsi yang mengkonsumsi obat asam valproat dapat menyebabkan cacat tuba neuralis dan jantung, cacat kraniofasial, dan tungkai (Sadler 2000). Dalam penelitian ini asam valproat diberikan pada Fetal Growth and Develepmont tikus, karena masa ini merupakan masa perkembangan maturasi dan pertumbuhan lebih lanjut dari janin. Pengaruh buruk senyawa asing terhadap janin pada fase ini tidak berupa malformasi anatomik lagi, tetapi dapat berupa gangguan pertumbuhan baik terhadap fungsi-fungsi fisiologik atau biokimiawi organ-organ. Apabila pada Fetal Growth and Development tikus diberikan asam valproat yang pada prinsipnya mempunyai efek dismorfogenesis (Setiawan 2009). METODOLOGI Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakologi, Laboratorium Patologi Klinik Jurusan Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
2
Universitas Muhammadiyah Prof. DR. Hamka dan Bioassay Departemen Kimia Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. 1. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan meliputi: asam valproat, etanol 70%, larutan NaCl, aqua dest, formalin 10%, Eter, pewarna Gomori, dan tikus putih (Rattus norvegicus L.) galur Sprague dawley. Alat-alat yang digunakan adalah kaca objek, cover glass, kaca pembesar, pipet tetes, batang pengaduk, gelas ukur, spatel, sonde, kertas tisu, kandang berbentuk persegi, timbangan hewan (Ohaus, triple beam balance), timbangan analitik (Denver instrument), mikroskop (Griffin Carton), dan alat bedah tikus. 2. Cara Kerja a. Aklimatisasi Hewan yang digunakan adalah tikus putih betina. Sebelum melakukan pengujian hewan diaklimatisasi selama 2 minggu dan diberi makan, minum ad libitum. b. Penetapan dosis Penetapan dosis berdasarkan dengan perhitungan kesetaraan antara manusia (70 kg) ke tikus (200 gr) maka diperoleh dosis pemberian untuk tikus adalah dosis I 20 mg/200 gr BB, dosis II 40 mg/200 gr BB, dan dosis III 60 mg/200 gr BB. c. Pengawinan Hewan percobaan Pengawinan hewan dilakukan pada masa estrus dengan memasukkan 1 ekor jantan ke kandang yang berisi 3 ekor betina pada sore hari. Keesokan paginya dilakukan pengamatan di daerah vagina, jika ditemukan sumbat vagina (vagina plug, maka tikus dinyatakan kawin, bila sumbat vagina tidak ditemukan dilanjutkan dengan cara membuat apusan vagina). Cara membuat apusan vagina yaitu mengusapkan cottun bat di bagian vagina tikus betina, kemudian ditoreskan pada kaca objek dan diberikan cairan NaCl fisiologi. Lihat pada mikroskop dengan pembesaran 40 x. Tikus dinyatakan kawin apabila ditemukan sperma dalam apusan vaginanya. Tikus yang terbukti kawin dinyatakan sebagai hari ke-0 dari kehamilan. d. Pemberian Sediaan Uji Volume pemberian asam valproat diusahakan tidak melebihi volume lambung tikus yaitu 5 ml. Asam valproat diberikan secara oral pada tikus putih hamil embrional Fetal Growth and Development (hari ke 18), dibagi menjadi 4 kelompok dengan masing-masing kelompok terdiri dari 3 tikus betina). Kelompok I merupakan kontrol normal yang diberikan aquadest. Kelompok II adalah kelompok dosis I yang diberikan sediaan asam valproat dengan dosis 20 mg/200 g BB. Kelompok III adalah kelompok dosis II yang diberikan sediaan asam valproat dengan dosis 40 mg/200 g BB. Kelompok IV adalah kelompok dosis III yang diberikan sediaan asam valproat dengan dosis 60 mg/200 g BB. Pada masa kehamilan hewan uji diamati 2 x sehari dengan jarak 6 jam. Pisahkan masingmasing betina (agar tidak saling berkelahi, dan jika sudah lahir mudah untuk mengetahui jumlah fetus yang lahir). e. Pembedahan dan pengambilan Organ Pankreas Pembedahan dilakukan pada saat anak tikus berumur 50 hari. Pada pengujian ini tikus dianastesi dengan menggunakan eter. Tikus diletakkan di atas papan bedah dengan posisi ventral menghadap peneliti. Bagian perut tikus dibedah dengan gunting, organ dikeluarkan dan disimpan pada vial berisi buffer
3
formalin 10%. Untuk pembuatan preparat histologi dengan menggunakan metode pewarnaan Gomori. f. Pembuatan Preparat Histologi Pankreas yang telah dipisahkan dimasukkan ke dalam cairan formalin 10%, kemudian dibuat preparat histologi dengan pewarnaan Gomori. Prosedur pembuatan preparat histologi adalah sebagai berikut (Ketut 2005): 1) Fiksasi 2) Dehidrasi 3) Pembeningan 4) Infiltrasi dan Penanaman (Embedding) 5) Pemotongan 6) Penempelan 7) Pewarnaan Metode pewarnaan Gomori, dengan langkah-langkah sebagai berikut: Preparat di masukkan ke dalam larutan ferric ammonium sulfat 2% selama 1 menit, larutan ammoniacal silver selama 1 menit, formalin 10% selama 3 menit, larutan gold chloride 0,2% selama 5-10 menit, larutan meta bisulfit selama 1 menit, larutan sodium thiosulfat 2,5% selama 1-2 menit dan dicuci dengan air kemudian didehidrasi, clearing, mounting. kemudian preparat diberi 1 tetes entelan dan objek glass ditutup. g. Pengamatan mikroskopik sel endokrin pankreas Pengamatan mikroskopik dilakukan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 40 x untuk pemeriksaan dan menghitung rata-rata jumlah sel pankreas dari 4 pulau Langerhans dalam setiap preparat. Untuk memudahkan perhitungan, setiap gambar pulau Langerhans diberi kotak-kotak pengamatan dengan ukuran yang sama. Bagian yang dihitung adalah sel pankreas yang terletak dikotak pengamatan lalu dihitung jumlahnya. 3. Analisa Data Data kuantitatif rata-rata jumlah sel endokrin pankreas anakan tikus dianalisa secara statistik menggunakan ANOVA satu arah. Jika mean berbeda bermakna, analisis dilanjutkan dengan uji (Tukey) untuk melihat perbedaan bermakna antar tiap kelompok perlakuan (Triheandradi 2008). HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Pengamatan Histologi Pankreas Hasil pengamatan pada kelompok kontrol normal dan kelompok perlakuan dilakukan dengan menghitung jumlah sel dalam pulau Langerhans diperlihatkan pada gambar 1. 2. Hasil Rata-rata Jumlah Sel Endokrin Pankreas Dari hasil penelitian pengaruh pemberian asam valproat terhadap tikus putih hamil diperoleh data tabel 1. Subjek penelitian yang digunakan adalah tikus putih betina galur Sparague Dawley sebanyak 12 ekor dan beberapa tikus putih jantan dengan berat badan 200 g umur 3 bulan. Tikus putih betina dipilih dengan tujuan untuk dikawinkan dengan tikus putih jantan, karena pada umumnya tikus betina masa kehamilannya
4
singkat yaitu 22 hari dan kepekaan yang lebih besar terhadap teratogen dari pada hewan lainnya.
A
B
C
D
Gambar 1. Gambaran Histologi Pulau Langerhans: (A) Kelompok normal. (B) Kelompok perlakuan asam valproat dosis I (20 mg/200 g BB). (C) Kelompok perlakuan asam valproat dosis II (40 mg/200 g BB). (D) Kelompok perlakuan asam valproat dosis III (60 mg/200 g BB).
Tabel 1. Rata-rata Jumlah Sel Endokrin Pankreas Anakan Tikus Umur 50 Hari Rata-rata jumlah sel pankreas No Kn Dosis I Dosis II Dosis III 1 109,75 99,25 73,25 67,00 2
100,75
91,00
97,25
49,75
3
92,75
82,50
66,25
57,25
Rata-rata SD
101,08 8,51
90,92 8,38
78,92 16,26
58,00 8,65
5
120 101,08 90,92
Jumlah Sel
100
78,92
80
58
60 40 20 0 Kn
Dosis I
Dosis II
Dosis III
Kelompok Gambar 2. Diagram Batang Rata-rata Jumlah Sel Endokrin Pankreas Anakan Tikus Umur 50 hari umur 50 hari Tikus dibagi menjadi 4 kelompok masing-masing kelompok terdiri dari 3 tikus betina. Kn adalah kontrol normal yang diharapkan dapat menunjang sel endokrin pankreas pada keadaan normal. Dosis I, Dosis II, dan Dosis III adalah kelompok dosis 20 mg/200 g BB, 40 mg/200 g BB, dan Dosis 60 mg/200 g BB yang diharapkan dapat menunjukkan pengaruh asam valproat terhadap sel endokrin pankreas anakan tikus. Asam valproat diberikan secara oral pada tikus putih embrional Fetal Growth and Development. Pada saat berumur 50 hari semua anak tikus dibedah kemudian diambil jaringan pankreas untuk dijadikan preparat histologi. Gambaran histologis pankreas diperoleh dari hasil pemeriksaan dan pembacaan secara mikroskopik dengan pembesaran 40 x terhadap preparat pankreas tikus yang menggunakan metode pewarnaan gomori. Pengamatan gambaran histologis pankreas dilakukan dalam preparat pankreas dan menghitung jumlah sel dalam pulau Langerhans. Pada gambar (2), menunjukkan bahwa rata-rata jumlah sel dalam pulau Langerhans pada kelompok sediaan uji dosis III 60 mg/200 g BB mengalami penurunan lebih banyak dibandingkan dengan kelompok sediaan uji lainnya yaitu dengan jumlah 58 sel. Rata-rata jumlah sel dalam pulau Langerhans (Tabel 1) yang diperoleh, dianalisa secara statistik. Uji normalitas dengan menggunakan uji KolmogorovSmirnov untuk mengetahui apakah populasi data terdistribusi normal atau tidak. Uji homogenitas menggunakan uji Levene untuk mengetahui apakah varian populasi homogen atau tidak. Uji Anova satu arah digunakan untuk mengetahui apakah mean adalah sama atau berbeda bermakna dan dilanjutkan dengan menggunakan uji Tukey untuk melihat perbedaan bermakna antar tiap kelompok perlakuan. Hasil penelitian dianalisa secara statistik, diperoleh hasil uji KolmogorovSmirnov sebesar (p=0,850) menunjukkan bahwa (p>0,05) dan hasil uji Levene sebesar (p=0,380) menunjukkan bahwa (p>0,05). Hal ini menunjukkan bahwa 6
data terdistribusi normal dan homogen. Analisa dilanjutkan dengan metode Anova satu arah dan hasil yang didapat (p=0,000) menunjukkan bahwa (p<0,05) dan mean mempunyai perbedaan bermakna antar kelompok perlakuan. Selanjutnya dilakukan analisa Tukey untuk melihat perbedaan yang bermakna dengan taraf signifikansi 5% antara Kn, Dosis I, Dosis II, dan Dosis III. Hasilnya kelompok dosis I (20 mg/200 g BB) dan dosis II (40 mg/200 g BB) tidak berbeda bermakna dengan kontrol normal. Sedangkan pada kelompok dosis III (60 mg/200 g BB) berbeda bermakna dengan kontrol normal. Berdasarkan hasil yang dianalisa secara statistik penelitian ini menunjukkan bahwa pemberian asam valproat pada dosis III 60 mg/200 mg BB) dapat menyebabkan penurunan jumlah sel endokrin pankreas anakan tikus. SIMPULAN Pemberian asam valproat pada tikus putih hamil embrional Fetal Growth and Develoment dengan dosis 20 mg/200 g BB, 40 mg/200 g BB tidak memberikan pengaruh terhadap jumlah sel endokrin pankreas anakan tikus, sedangkan pada dosis 60 mg/200 g BB dapat menyebabkan penurunan jumlah sel endokrin pankreas anakan tikus. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang pengaruh pemberian zat aktif lain terhadap penurunan jumlah sel β pankreas dengan menggunakan metode pewarnaan yang lebih spesifik dan dapat menimbulkan penyakit diabetes. UCAPAN TERIMA KASIH Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Hadi Sunaryo, M.Si., Apt., Bapak Drs. Kusmardi, M.Biomed., dan Bapak Kriana Efendi, M.Farm., Apt., selaku pembimbing, serta seluruh staf Fakultas Farmasi dan Sains Universitas Muhammadiyah DR. HAMKA, Jakarta, atas bantuan dan dukungannya dalam pelaksanaan penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Diani P. 1984. Uji Teratogenitas Difenilhidantoin Pada Mencit Strain Biomedis. Skripsi. Fakultas Farmasi UI, Depok. Hlm. 3, 14-26. Goodman dan Gilman 2008. Dasar Farmakologi Terapi. Edisi X. Buku Kedokteran EGC. Jakarta. Hlm. 506, 521-522. Ketut IS. 2005. Teknologi Ilmu Jaringan dan Imunohistokimia. CV. Sagung Seto. Jakarta. Hlm. 28-29. Loomis TA. 1989. Toksikologi Dasar. Edisi III. Terjemahan: Drs Imono A Donatus. IKIP Press. Semarang. Hlm. 242-243. Sadler. 2000. Malformasi Konginetal Dalam Embriologi Kedokteran Langman. Edisi VII. EGC. Jakarta. Hlm. 122. Setiawan C. 2009. Efek Teratogenik Kombucha Pada Tikus Putih (Rattus norvegicus L.) Galur Wistar. Skripsi. Fakultas Biologi USM, Surakarta. Hlm. 3. Trihendradi C. 2008. Memecahkan Kasus Statistik: Deskriptif, Parametrik dan Nonparametrik dengan SPSS 17. Andi, Jakarta. Hlm. 106-113.
7
