PENGARUH EKSTRAK ETANOL PROPOLIS TERHADAP HITUNG SEL MAST INTESTINAL PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus) MODEL ASMA ALERGI

perpustakaan.uns.ac.id

digilib.uns.ac.id

PENGARUH EKSTRAK ETANOL PROPOLIS TERHADAP HITUNG SEL MAST INTESTINAL PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus) MODEL ASMA ALERGI

SKRIPSI Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran

Okky Dita Rachmadian G0008035

FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SEBELAS MARET Surakarta commit to user 2011


digilib.uns.ac.id

PERNYATAAN

Dengan ini menyatakan bahwa dalam skripsi ini tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi, dan sepanjang pengetahuan penulis juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali secara tertulis diacu dalam naskah dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surakarta,

Januari 2012

Okky Dita Rachmadian G.0008035

commit to user

iii


digilib.uns.ac.id

ABSTRAK Okky Dita Rachmadian, G.0008035, 2012. Pengaruh Ekstrak Etanol Propolis terhadap Hitung Sel Mast Intestinal pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) Model Asma Alergi. Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret, Surakarta. Tujuan Penelitian: Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol propolis terhadap hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi. Metode Penelitian: Eksperimental laboratorik dengan the post test only control group design menggunakan 35 ekor tikus putih jantan, dibagi dalam 5 kelompok yaitu kontrol (K1), asma alergi (ovalbumin) (K2), ovalbumin (OVA) dan antihistamin generasi III dosis 2 mg/tikus/hari (K3), OVA dan ekstrak propolis dosis 100 mg/kg BB/hari (K4), sedangkan OVA dan ekstrak propolis dosis 200 mg/kg BB/hari (K5). Sensitisasi pada hari ke-1 dan ke-14 dengan 2,5 cc OVA/ tikus/ i.p, dilanjutkan pemaparan OVA aerosol menggunakan nebulizer kecepatan 6 L/ menit selama 20 menit pada hari ke-21, 23, 25, dan 28. Antihistamin dan ekstrak propolis diberikan per oral selama 28 hari berturut-turut. Hari ke-29, tikus dikorbankan kemudian intestinal diambil untuk dibuat preparat dengan metode blok parafin dan pengecatan Toluidine Blue. Preparat diamati di mikroskop dan sel mast dihitung dalam tiga lapang pandang per preparat. Hasil penelitian dianalisis dengan uji Kruskal Wallis dengan menggunakan program SPSS Windows Release 17.0. Tingkat kemaknaan digunakan p < 0,005. Hasil Penelitian: Hitung sel mast (median (min-maks)) sel/lapang pandang masing-masing kelompok K1 1(1-5), K2 3(1-5), K3 3(1-5), K4 2(2-3), dan K5 2(2-3). Hasil uji Kruskal Wallis tidak menunjukkan adanya perbedaan bermakna pada kelima kelompok. Simpulan Penelitian: Pemberian ekstrak propolis dosis 100 dan 200 mg/kg BB/hari dapat menurunkan hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi namun penurunannya tidak bermakna.

Kata kunci: propolis, sel mast intestinal, asma alergi.

commit to user

iv


digilib.uns.ac.id

ABSTRACT Okky Dita Rachmadian, G.0008035, 2012. The Effect of Propolis Ethanol Extract on Intestines Mast Cell Count in White Mouse (Rattus norvegicus) Allergic Asthma Model. Medical Faculty of Sebelas Maret University, Surakarta. Objective: To find out the effect of propolis ethanol extract on intestines mast cell count in white mouse (Rattus norvegicus) allergic asthma model. Methods: This was laboratory experimental research with the post test only control group design that used 35 male white mice, divided to 5 groups, they were control (K1), allergic asthma (ovalbumin) (K2), ovalbumin (OVA) and antihistamin generation III dosage 2 mg/mouse/day (K3), OVA and propolis extract dosage 100 mg/kg BB/day (K4), whereas OVA and propolis extarct 200 mg/kg BB/day (K5). Sensitization on day 1 and 14 dosage 2,5 cc OVA/ tikus/ i.p, then OVA aerosol with nebulizer for 20 minutes on day 21, 23, 25, and 28. Antihistamin and propolis extract was given per oral for 28 day by day. On day 29, mice were sacrificed to get intestines tissue, mast cell was accounted with Toluidine Blue. Data was analyzed with Kruskal Wallis method on SPSS Windows Release 17.0 program. Statistically significant p < 0,005. Results: Mast cell count (median (min-max)) cell/ view K1 group were 1(1-5), K2 3(1-5), K3 3(1-5), K4 2(2-3), dan K5 2(2-3) respectively. There is no significant difference between five groups from Kruskal Wallis test result. Conclusion: Propolis extract dosage 100 and 200 mg/kg BB/day can decrease intestines mast cell count in white mouse (Rattus norvegicus) allergic asthma model but it was not significant.

Key words: propolis, intestines mast cell, allergic asthma.

commit to user

v


digilib.uns.ac.id

PRAKATA Puji dan syukur ke hadirat Allah SWT, atas segala karunia dan kasih-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Pengaruh Ekstrak Etanol Propolis terhadap Hitung Sel Mast Intestinal pada Tikus Putih (Rattus norvegicus) Model Asma Alergi”. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat dalam menyelesaikan program studi pendidikan dokter di Fakultas Kedokteran UNS Surakarta. Penyusunan skripsi ini tentunya tidak terlepas dari bantuan berbagai pihak. Maka pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih kepada: 1. Prof. Dr. Zainal Arifin Adnan, dr., Sp.PD-KR-FINASIM. selaku Dekan Fakultas Kedokteran UNS Surakarta; 2. R. P. Andri Putranto, dr., M.Si. selaku Pembimbing Utama yang telah memberikan bimbingan, masukan, dan motivasi bagi penulis; 3. Martini, Dra., M.Si. selaku Pembimbing Pendamping yang telah memberikan bimbingan, masukan, dan motivasi bagi penulis. 4. Diding Heri Prasetyo, dr., M.Si. selaku Penguji Utama yang telah memberikan kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini; 5. Sarsono, Drs., M.Si. selaku Anggota Penguji yang telah memberikan kritik dan saran demi kesempurnaan penulisan skripsi ini; 6. Seluruh Dosen dan Staf bagian Biokimia FK UNS; 7. Muthmainah, dr., M.Kes. selaku Ketua Tim Skripsi Fakultas Kedokteran UNS Surakarta beserta staf yang telah memberi pengarahan; 8. Semua pihak lainnya yang telah membantu terselesaikannya skripsi ini, yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu. Penulis mengharapkan kritik dan saran demi perbaikan penulis maupun peningkatan karya ini. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat.

Surakarta, Januari 2012 Penulis

commit to user

vi


digilib.uns.ac.id

DAFTAR ISI

PRAKATA ......................................................................................................... vi DAFTAR ISI ...................................................................................................... vii DAFTAR TABEL .............................................................................................. ix DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... x DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xi BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah .................................................................... 1 B. Rumusan Masalah.............................................................................. 3 C. Tujuan Penelitian ............................................................................... 3 D. Manfaat Penelitian............................................................................. 4 BAB II LANDASAN TEORI A. Tinjauan Pustaka ............................................................................... 5 1. Propolis .......................................................................................... 5 2. Asma Alergi................................................................................... 15 3. Sel Mast ......................................................................................... 18 4. Sensitisasi Hewan Coba ................................................................ 20 B. Kerangka Pemikiran .......................................................................... 26 1. Kerangka Konsep .......................................................................... 26 2. Kerangka Pikiran Teoritis.............................................................. 27 C. Hipotesis ............................................................................................ 28 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis Penelitian .................................................................................. 29 B. Lokasi Penelitian ............................................................................... 29 C. Subjek Penelitian ............................................................................... 29 D. Teknik Sampling ............................................................................... 29 E. Penentuan Dosis Perlakuan ................................................................ 30 F. Rancangan Penelitian ......................................................................... 32 G. Identifikasi Variabel Penelitian ......................................................... 32 H. Skala Variabel ................................................................................... 33 I. Definisi Operasional Variabel Penelitian........................................... 33 J. Instrumentasi Penelitian..................................................................... 34 K. Cara Kerja.......................................................................................... 35 commit to user L. Teknik Analisis Data ......................................................................... 36

vii


digilib.uns.ac.id

BAB IV HASIL PENELITIAN A. Hitung Sel Mast ................................................................................. 38 B. Analisis Hasil ..................................................................................... 39 BAB V PEMBAHASAN ................................................................................... 43 BAB VI SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan............................................................................................ 46 B. Saran .................................................................................................. 46 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 47 LAMPIRAN

commit to user

viii


digilib.uns.ac.id

DAFTAR TABEL Tabel 1. Tabel 2. Tabel 3.

Kandungan Kimia Propolis Nama-nama Beberapa Flavonoid dan Aktivitas Biologisnya Hitung Sel Mast (Jumlah Sel/Lapang Pandang) Masing-Masing Kelompok Perlakuan

commit to user

ix


digilib.uns.ac.id

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur Molekul Chrysin (diambil dari Harris et al., 2006) Gambar 2. Struktur Molekul Kuersetin (diambil dari Santos, et al., 2008) Gambar 3. Sel Mast dengan Pengecatan Methylene Blue (Nivaldo, 2009) Gambar 4. Kerangka Konsep Penelitian Gambar 5. Rancangan Penelitian Gambar 6. Histogram Hitung Sel Mast Intestinal Tikus Masing-Masing Kelompok Perlakuan Gambar 7. Sel Mast pada Kelompok Kontrol dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x Gambar 8. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x Gambar 9. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Antihistamin Generasi III dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x Gambar 10. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Ekstrak Propolis Dosis 100 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x Gambar 11. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi Ekstrak Propolis Dosis 200 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x

commit to user

x


digilib.uns.ac.id

DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Jadwal Penelitian Lampiran 2. Prosedur Pembuatan Ekstrak Etanol Propolis Lampiran 3. Tabel Konversi Dosis Manusia ke Hewan Lampiran 4. Daftar Volume Maksimal Larutan Sediaan Uji yang Dapat Diberikan pada Berbagai Hewan Lampiran 5. Data Primer Penelitian Lampiran 6. Hasil Uji Statistik Lampiran 7. Dokumentasi Penelitian

commit to user

xi

1 digilib.uns.ac.id


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah Penyakit alergi merupakan kumpulan penyakit yang sering dijumpai di masyarakat (Tanjung & Yunihastuti, 2006). Alergi adalah suatu keadaan hipersensitivitas diinduksi oleh pajanan antigen tertentu yang menimbulkan reaksi imunologi berbahaya pada pajanan berikutnya (Dorland, 2002). Salah satu manifestasinya adalah asma alergi. Prevalensi asma dipengaruhi oleh banyak faktor, antara lain jenis kelamin, umur, status atopi, faktor keturunan, serta lingkungan (Sundaru & Sukamto, 2007). Dalam tiga puluh tahun terakhir terjadi peningkatan prevalensi baik di negara berkembang maupun di negara maju. Dampak asma meliputi

penurunan

kualitas

hidup,

produktivitas

yang

menurun,

ketidakhadiran di sekolah, peningkatan biaya kesehatan, risiko perawatan di rumah sakit dan bahkan kematian (Muchid dkk, 2007). Sel imun yang berperan penting dalam respon inflamasi alergi antara lain limfosit T-helper, sel plasma, sel mast, dan eosinofil (Hohlfeld, 2001). Infiltrasi sel mast pada otot polos saluran nafas merupakan ciri khas asma dan bertanggung jawab terhadap kerusakan fungsi saluran nafas (Jeffery et al., 2006). Sel mast adalah mediator inflamasi pada reaksi hipersensitivitas dan alergi. commit to user 1

2 digilib.uns.ac.id


Sel mast tampak sebagai sel besar yang terdapat pada jaringan pengikat, khususnya di dermis dan mukosa sistem pernafasan serta pencernaan. Sel mast terdiri atas granul yang mengandung bermacam-macam molekul mediator termasuk histamin. Di permukaannya terdapat high-affinity Fcε reseptors

(FcεRI)

yang memungkinkannya

untuk

berikatan

dengan

Imunoglobulin E (IgE) (Janeway et al., 2004). IgE akan berikatan kuat dengan reseptor di permukaan sel mast (Platts-Mill, 2001). Adanya crosslinking antara antigen dengan IgE di permukaan sel mast akan menginduksi pelepasan mediator yang menyebabkan reaksi hipersensitivitas (Abbas dan Lichtman, 2003). Mediator tersebut diantaranya amine biogenic, mediator lipid dan sitokin (Robbins et al., 2007). Pada penelitian ini, sel mast yang diambil adalah sel mast yang berada pada jaringan intestinal karena sel mast jaringan ikat memiliki granul yang banyak mengandung heparin dan histamin. Asma merupakan penyakit yang tidak bisa disembuhkan secara total. Pengobatan profilaksis memerlukan waktu lebih lama, sering menjadi problem tersendiri (Medlinux, 2008). Salah satu pengobatan asma yang saat ini sedang dikembangkan adalah dengan menggunakan obat herbal. Masih banyak obat-obat tradisional nusantara yang belum dikaji secara ilmiah khasiatnya (Handayani, 2001). Oleh karena itu, pembuktian manfaat obat tradisional melalui uji klinik yang didukung dengan penelitian imunologis, baik melalui penilaian kualitatif maupun kuantitatif perlu digalakkan (Djauzi, 2003). commit to user


3 digilib.uns.ac.id

Propolis merupakan herbal yang bisa dimanfaatkan dalam terapi asma alergi. Senyawa terpenting dalam propolis adalah flavonoid. Salah satu flavonoid yang terkandung dalam propolis adalah cafeic-acid dan kuersetin (Kosalec et al., 2004). Cafeic-acid merupakan Ca-antagonist, sehingga mampu mencegah degranulasi sel mast yang akan melepaskan mediatormediator inflamasi setelah sel mast terjadi Ca influks (Kuby, 1997). Sedangkan kuersetin sebagai mast cell stabilizer (Duke, 2009) akan menguatkan efek penghambatan degranulasi sel mast. Dengan dihambatnya degranulasi sel mast, maka sekresi vasoaktif amin seperti histamin, mediator lipid, serta sitokin yang berperan dalam proses inflamasi pada reaksi alergi akan berkurang. Berdasarkan temuan ilmiah di atas, penulis merasa perlu melakukan penelitian mengenai efek propolis terhadap jumlah sel mast intestinal pada tikus putih model asma alergi.

B. Rumusan Masalah Adakah pengaruh pemberian ekstrak etanol propolis terhadap hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi?

C. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol propolis terhadap hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi. commit to user

4 digilib.uns.ac.id


D. Manfaat Penelitian 1. Manfaat Teoritis Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang pengaruh propolis terhadap hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi. 2. Manfaat Praktis Penelitian ini diharapkan dapat menjadi langkah awal untuk penelitian lebih lanjut dalam upaya memanfaatkan propolis sebagai obat anti asma alergi, serta sebagai bahan pertimbangan pemanfaatan propolis dalam pelayanan kesehatan formal.

commit to user


digilib.uns.ac.id

BAB II LANDASAN TEORI

A. Tinjauan Pustaka 1. Propolis a. Pengertian Umum Lebah menghasilkan beberapa produk seperti madu, royal jeli, polen

dan

propolis.

Propolis

sebagai

kompleks

resin

yang

dikumpulkan lebah madu dari berbagai sumber tanaman untuk kemudian dicampur dengan air liurnya, sehingga menghasilkan produk lebah yang bermanfaat (Marcucci et al., 2001; Salatino et al., 2005). Secara penampakan fisik (warna), aroma dan komposisi kimiawi propolis terlihat bervariasi tergantung dari berbagai faktor. Warnanya mungkin putih kekuningan ( krem), kuning, hijau, coklat terang atau gelap. Beberapa sampel memiliki tekstur, rapuh keras, sedangkan sampel lainnya mungkin elastis dan kenyal. Propolis berasal dari bahasa Yunani, pro yang berarti pertahanan dan polis berarti kota. Dengan demikian menyiratkan bahwa propolis sebagai produk yang terlibat dalam pembelaan terhadap masyarakat lebah (Salatino et al., 2005), yang digunakan oleh lebah dalam pembuatan, pemeliharaan, perlindungan dan mensterilkan sarang lebah (Marcucci et al., 2001). commit to user

5

6 digilib.uns.ac.id


Faktor-faktor biologis, zona geografis dan lingkungan dapat mempengaruhi jumlah dan kualitas produksi propolis (Pereira et al., 2009). Beberapa penelitian melaporkan bahwa komposisi propolis dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti sumber bunga (jenis tanaman) untuk madu, musim dan faktor-faktor lingkungan (seperti jenis tanah dan iklim, faktor genetik, dan metode pengolahan). Dengan kata lain, kemungkinan efek-efek yang berhubungan dengan kesehatan sangat tergantung asal-usulnya (Baltrusaityte et al., 2007). Komposisi propolis sangat kompleks. Unsur utamanya adalah lilin lebah, resin dan senyawa volatil. Lebah mensekresikan lilin lebah, sedangkan resin dan senyawa volatil berasal dari tanaman. Aktivitas biologis propolis ditentukan oleh zat tanaman ini berasal. Oleh karena itu, meskipun propolis jelas merupakan produk binatang, proporsi yang cukup besar dari komponen-komponennya yang berperan dalam menentukan aktivitas biologis berasal dari tanaman. Resin merupakan kandungan yang kebanyakan ditemukan dalam ekstrak alkohol dikonsumsi oleh orang dari berbagai negara sebagai makanan pelengkap atau obat alternatif (Salatino et al., 2005). Beberapa senyawa telah diidentifikasi dalam propolis, terutama resin (50%), lilin (30%), minyak esensial (10%), serbuk sari (5%), dan senyawa organik lainnya (5%) (Sivasubramaniam & Seshadri, 2005; G’omez-Caravaca et al., 2006; Viuda-Martos et al., 2008). commit to user

7 digilib.uns.ac.id


b. Kandungan Kimia Propolis mempunyai kandungan kimia yang sangat kompleks, antara lain resin, lilin dan asam lemak, minyak esensial, protein, serta senyawa organik lain dan mineral. Selengkapnya disajikan pada tabel berikut : Tabel 1. Kandungan Kimia Propolis Kelas komponen Resin

Jumlah 45-55 %

Lilin dan asam lemak 25-53% lebah dan beberapa dari tanaman Minyak esensial 10% Protein 5%

Group Komponen Flavonoid, asam fenolat dan esternya Sebagian besar dari lilin

Senyawa volatile Protein kemungkinan berasal dari polen dan amino bebas Senyawa organik lain 5% 14 macam mineral yang dan mineral Paling terkenal adalah Fe dan Zn, sisanya seperti Au, Ag, Cs, Hg, La dan Sb. Senyawa lain seperti keton, laktan, kuinon, asam benzoate dan esternya, gula, vitamin B3. (Sivasubramaniam & Seshadri, 2005). Senyawa yang terkandung dalam propolis, secara garis besar dikelompokkan dalam tiga kelompok yaitu (i) flavonoid (flavonol, flavon, flavanon, dan hidroflavonol), (ii) turunan cinnamic acid, dan (iii)

terpenoid.

Flavonol

(kaempferide,

kaempferol,

galangin,

isorhamnetin, rhamnetin, myricetin, fisetin dan rutin), flavon (apigenin, acacetin, baicalein, chrysin, luteolin dan tectochrysin), flavanon (pinocembrin, sakuranetin dan isosakura-netin), turunan cinnamic acid (ferulic acid, p-coumaric acid dan caffeic acid) dan commit to user terpenoids (tt-farnesol, β-caryophyllene, terpineol dan

8 digilib.uns.ac.id


syringaldehyde) (Sivasubramaniam & Seshadri, 2005; Lotfy, 2006). Senyawa-senyawa tersebut memiliki peran penting dalam aktivitas biologis propolis, antara lain sebagai imunomodulator, antimikrobial, antioksidan, antiinflamasi, antifungal, antiprotozoa, antiparasit dan antiproliferatif (Banskota et al., 2001; Koo et al., 2002; Ahn et al., 2004; Lotfy, 2006; El-Bussuony & Abouzid, 2010). Sehingga banyak digunakan sebagai ”obat” secara umum pada sistem kardiovaskuler dan darah (anemia), alat pernapasan (untuk berbagai infeksi), perawatan gigi, dermatologi (regenerasi jaringan, ulkus, eksim, penyembuhan luka-terutama luka bakar, mikosis, infeksi selaput lendir dan lesi), pengobatan kanker, perbaikan dan penunjang sistem imunitas, saluran pencernaan (ulkus dan infeksi), hepatoprotektor dan lain sebagainya (Sivasubramaniam & Seshadri, 2005).

c. Flavonoid Flavonoid banyak terdapat dalam buah-buahan, sayuran dan minuman yang berasal dari tanaman, dan dalam sejumlah makanan suplemen maupun obat-obatan herbal (Moon et al., 2006). Flavonoid juga dikenal sebagai bioflavonoid memiliki kelas beragam, secara alami disusun dari polifenol tanaman yang memiliki berbagai aktivitas biologis penting dalam terapi. Secara kimiawi dikenal ada 12 klas flavonoid

yaitu flavon, isoflavon, flavan, flavanon, flavanol

flavanolol, anthosianidin, katekhin, leuko-anthrosianidin, khalkon, commit to user

9 digilib.uns.ac.id


dihidrokhalkon, dan auron. Nama-nama dari flavonoid disajikan pada tabel berikut : Tabel 2. Nama-Nama Beberapa Flavonoid dan Aktivitas Biologisnya Jenis flavanoid Anthosianidin

Hesperidin Myrecetin

Nobitelin Proanthosianidin (juga dikenal sebagai pycnogenols) Kuersetin

Rutin

Aktivitas biologis Efek menguntungkan pada Sirkulasi dan penglihatan, dan antibakteri Mencegah kerapuhan kapiler Anti-oksidan, mencegah Kerusakan sel-sel syaraf dari Radikal bebas Anti-inflamasi dan membantu detoksifikasi Efek anti-oksidan, 20 kali lebih besar dibandingkan vitamin E Mencegah pembentukan katarak. Membantu permasalahan yang berhubungan dengan alergi, seperti hay fever, asma dan eczema. Kuersetin strukturnya seperti obat antialergi yaitu disodium chromoglycate Membantu dalam pengobatan hipertensi, memar dan perdarahan bawah kulit, termasuk kemerahan akibat radiasi.

(Lazarides, 2010) Flavonoid banyak digunakan sebagai makanan suplemen untuk meningkatkan kesehatan dan mencegah penyakit, karena sangat aman dan toksisitasnya rendah (Moon et al., 2006). Ribuan flavonoid commit to user

10 digilib.uns.ac.id


tanaman telah diidentifikasi dan kadar yang berarti biologis dari bioflavonoid dalam manusia ditunjukkan pada konsumsi 1 gram/hari. Secara umum dianggap bersifat non-toksik (Heo et al., 2001). Flavonoid dilaporkan memperlihatkan aktivitas biologis yang luas, termasuk

antibakteri,

antiviral,

antiinflamasi,

antialergik

dan

vasodilatasi. Flavonoid juga menunjukkan antioksidan, agregasi trombosit, fragilitas dan permeabilitas kapiler, dan menghambat aktivitas sistem enzim termasuk siklooksigenase dan lipoksigenase (Viuda-Martos et al., 2008). Selain itu flavonoid berpotensi untuk pencegahan atau pengobatan arthritis, kardiovaskuler, dan beberapa kanker, termasuk kanker payudara (Murray et al., 2006). 1) Caffeic Acid Phenethyl Ester Caffeic Acid Phenethyl Ester (CAPE) merupakan antioksidan fenolik, yang memperlihatkan sejumlah efek farmakologik dan biologik termasuk aktivitas anti-inflamasi (Jung et al., 2008), antiviral dan anti-tumor (Orsolic et al., 2005). CAPE merupakan penghambat yang poten dan spesifik terhadap aktivasi NF-κB (Fitzpatrick et al., 2001). Peningkatan reactive oxygen species (ROS) maupun aktivitas NF-κB pada pemberian OVA inhalasi, maupun diminimalkan dengan pemberian CAPE. Hal ini mengindikasikan stres oksidatif memiliki fungsi penting dalam patogenesis asma bronchial dan commit to user



CAPE

dapat

digunakan

sebagai

terapi

pembantu

dalam

penatalaksanaan asma bronchial (Jung et al., 2008).

2) Chrysin Chrysin (5,7-dihydroxyflavone) adalah senyawa flavon alami yang ditemukan pada tanaman. Beberapa penelitian terkini menunjukkan chrysin memiliki banyak aktivitas biologic, seperti anti-inflamasi, anti-kanker, dan anti-oksidan (Cho et al., 2004; Harris et al., 2006; Fu et al., 2007). Aktivitas anti-inflamasi chrysin melalui mekanisme penekanan aktivitas promoter enzimenzim pro-inflamasi, cyclooxygenase-2 (COX-2) dan inducible nitric oxide synthase (iNOS) (Cho et al., 2004). Chrysin berpotesi untuk menghambat angiogenesis dan tumorigenesis, melalui penghambatan

hypoxia-inducible

factor-1

(HIF-1)

yang

merupakan faktor transkripsi heterodimer. HIF-1 diekspresikan secara berlebih pada sejumlah kanker pada manusia dan kadarnya akan meningkat pada angiogenesis dan tumorigenesis (Fu et al., 2007). 7

A 5

C

2

B

4΄ 3΄

3

4

Gambar 1. Struktur Molekul Chrysin (diambil dari Harris et al., 2006) commit to user



3) Galangin Galangin (3,5,7-trihydroxyflavone) termasuk salah satu kelas flavonoid yang dikenal sebagai flavonol. Galangin adalah komponen utama propolis lebah madu yang memiliki aktivitas anti-inflamasi (Borrelli et al., 2002). Aktivitas biologis galangin yang lain adalah menghalangi induksi mRNA iNOS selama respon inflamasi (Blonska et al., 2004), menurunkan transkripsi COX-2 (O’Leary et al., 2004), menghambat replikasi virus secara In Vitro (Amoros et al., 1992), menekan pertumbuhan sel bakteri (Basio et al., 2000), dan menghambat proliferasi sel kanker payudara melalui penurunan regulasi siklin D3, E, dan A. Galangin menghambat aktivitas aryl hydrocarbon receptor (AhR), suatu faktor transkripsi yang terlibat dalam memprakarsai dan pertumbuhan tumor payudara (Murray et al., 2006). 4) Kuersetin Kuersetin

(3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone),

merupakan

flavonoid yang banyak ditemukan pada tanaman ataupun buahbuahan termasuk bawang, brokoli, apel, teh, coklat, dan anggur merah. Kuersetin adalah flavonoid utama yang banyak ditemukan pada makanan yang dikonsumsi manusia, di USA diperkirakan asupan kuersetin berkisar 25 mg/hari (Nanua et al., 2006).

commit to user



Gambar 2. Struktur Molekul Kuersetin (diambil dari Santos, et al., 2008) Oleh karena itu, kuersetin memiliki aktivitas biologis yang beragam. Aktivitas biologis yang ditunjukkan antara lain adalah efek pro-apopotosis dan anti-proliferatif untuk sejumlah sel kanker ataupun pre-neoplastik, anti-inflamasi, proteksi terhadap stress oksidatif. Pemanfaatan kuersetin untuk kesehatan, antara lain : a) Manfaat kuersetin pada penyakit saluran nafas Manfaat potensi kuersetin dalam pengobatan penyakit saluran nafas, karena beberapa penelitian telah menunjukkan efek penghambatan pada produksi sitokin atau kemokin dalam kultur sel. Kuersetin dapat mengurangi produksi Nitric Oxide (NO) yang diinduksi lipopolisakarida, ekspresi inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS), dan pelepasan TNFα dan IL-6. Kuersetin sangat mengurangi aktivasi MitogenActivated Protein Kinases (MAPK) dan NF-κB, suatu commit to user kompleks faktor transkripsi yang sangat berperan dalam



ekspresi gen-gen pro-inflamasi (Cho et al., 2003). Kuersetin juga memiliki efek penghambatan terhadap aktivasi sel mast dan pelepasan histamin, TNF-α, IL-6, dan IL-8 (Kimata et al., 2005). Kuersetin menghambat induksi IL-8 dan Monocyte Chemotractant Protein (MCP)-1 oleh TNF-α pada kultur sel sinovial manusia. EM-X, suatu campuran mengandung kuersetin berasal dari fermentasi beras yang tidak dipoles, papaya, dan rumput laut, memperlihatkan penghambatan ekspresi IL-8 yang diinduksi TNF-α pada kultur sel epitel alveolar manusia (Deiana et al., 2002). Hasil-hasil penelitian tersebut konsisten pada suatu gagasan yang memperlihatkan bahwa kuersetin dapat mengurangi inflamasi saluran nafas pada pasien asma. b) Manfaat kuersetin pada sistem kardiovaskuler Flavonoid dapat memperbaiki fungsi endotel dan akhirnya

menyebabkan

efek

kardiovaskuler

yang

menguntungkan. Kuersetin dapat meningkatkan status NO dan

mengurangi

konsentrasi

endotelin-1

dan

dengan

demikian dapat memperbaiki fungsi endotel (Loke et al., 2008). Konsumsi makanan yang kaya akan

kuersetin akan

menurunkan risiko trombosis dan penyakit kardiovaskuler (Hubbard et al., 2006). commit to user



c) Manfaat kuersetin sebagai antioksidan Sehubungan dengan aktivitas anti-oksidan, anti-tumor dan anti-inflamasi, kuersetin banyak diteliti pada sejumlah model kanker sebagai agen kemoprotektif. Kuersetin memperlihatkan penghambatan berbagai macam kanker, seperti kanker prostat, serviks, paru, payudara dan kolon. Penelitian terbaru telah mengungkapkan bahwa kuersetin menghambat proliferasi sel dengan menyebabkan apoptosis dan/atau menahan siklus sel (Lee et al., 2006). Kuersetin merupakan antioksidan yang kuat, sebab dapat mengikat logam-logam, menangkap radikal bebas, dan menghambat xanthine oxidase dan li;id peroxidation secara In Vitro (Vulcain et al., 2005).

2. Asma Alergi Alergi adalah suatu keadaan yang disebabkan oleh reaksi imunologik spesifik yang ditimbulkan oleh alergen. Pada umumnya berupa pertahanan selular dan humoral organisme terhadap benda asing (Zukesti, 2003). Degranulasi sel mast merupakan komponen sentral pada penyakit alergi, sedangkan manifestasi klinis dan patologis bergantung pada letak dan kronisitasnya (Abbas & Lichtman, 2003). Asma alergi diawali dengan inhalasi alergen (Busse dan Lemanske, 2001). Alergen yang masuk ke dalam tubuh akan didegradasi oleh commit to user



Antigen Presenting Cells (APCs) menjadi peptida-peptida untuk selanjutnya dipresentasikan pada sel limfosit T CD4+ atau yang lebih dikenal dengan sel Th0. Sel T CD4+ dapat berdiferensiasi menjadi sel CD4+ Th1 dan sel CD4+ Th2 (Baratawidjaja, 2004). Aktivasi sel CD4+ Th2 terlihat berperan utama dalam mengawali dan memelihara terjadinya inflamasi alergi (Temann, 2002; Blease et al., 2000; Laouini et al., 2003). Hal ini terlihat pada penderita asma dimana jumlah sel CD4+ Th2 lebih tinggi secara signifikan dibandingkan kontrol, sebaliknya jumlah sel CD4+ Th1 tidak berbeda (Laouini et al., 2003). Sel CD4+ Th2 akan memproduksi mediator-mediator inflamasi seperti histamin dan leukotriene yang dapat menarik sel-sel inflamasi (netrofil, monosit, eosinofil, dll); sitokin-sitokin termasuk IL-4, IL-5(Busse & Lemanske, 2001), IL-10, dan IL-13 (Abbas & Lichtman, 2003). Histamin meningkatkan sekresi sitokin sel CD4+ Th2 seperti IL-3, IL-4, IL-5, IL-10 dan IL-13 serta menghambat produksi sitokin sel CD4+ Th1, di antaranya IL-2, IL-12 dan IFN-Ɣ. Melalui sitokin yang dihasilkannya, sel CD4+ Th2 juga berperan dalam hipersekresi mukus dan hiperplasi sel mast (Blease et al., 2000; Temann, 2002; Abbas & Lichtman, 2003). Interleukin-4 yang dihasilkan oleh sel CD4+ Th2 akan merangsang perkembangan sel CD4+ Th2 sendiri dari sel Th0 dan merupakan stimulus utama produksi IgE (Baratawidjaja, 2004). IL-4 bersama IL-3 dan IL-10 berperan dalam merangsang pertumbuhan sel mast. IL-5 berfungsi merangsang pertumbuhan dan diferensiasi eosinofil serta sekresi berbagai commit to user



sitokin (Li-Weber & Krammer, 2003). Sedangkan IL-4 dan IL-13 merangsang pertumbuhan, proliferasi, diferensiasi, dan pematangan sel B menjadi sel plasma dan memproduksi IgE (Janeway, 2004; Kuby, 1997). Pembentukan IgE oleh sel B memerlukan enzim Protein-Kinase-C (PKC), Phosphatidilinositol-specific Phospholipase C-γ (PLCγ), dan faktor transkripsi Nuclear Factor кB (NF-кB) (Abbas & Lichtman, 2003). Imunoglobulin E sangat berperan dalam terjadinya reaksi alergi. IgE yang dihasilkan sel plasma tersebut akan berikatan dengan sel mast pada reseptor FceRI. Proses perlekatan IgE pada sel mast disebut sensitisasi (Janeway, 2004; Abbas & Lichtman, 2003). Setelah tersensitisasi, sel mast mempengaruhi reaksi inflamasi. Pada paparan berikutnya dengan alergen yang sama, alergen akan berikatan dengan IgE pada sel mast atau basofil yang tersensitisasi dan terjadi proses degranulasi pada sel tersebut, kemudian mediator akan dilepaskan dari granula sel mast dan berefek pada jaringan sekitar (Kuby, 1997; Abbas & Lichtman, 2003). Dalam peristiwa degranulasi, sel mast melepaskan sejumlah mediator antara lain histamin, enzim siklooksigenase (COX) dan lipoxygenase (Laprise et al., 2004; Blease et al., 2000), Prostagalandin D2 (PGD2), leukotriene-C4, leukotriene-D4, leukotriene-E4, dan platelet-activating factor (Abbas & Lichtman, 2003). Histamin memainkan peran yang sangat penting pada patogenesis asma atopi melalui pengaturan diferensiasi limfosit sel CD4+ Th0 (Blease commit to user



et al., 2000; Abbas & Lichtman, 2003). Histamin menyebabkan peningkatan permeabilitas pembuluh darah, kontraksi otot polos, dan meningkatkan aktivitas kelenjar respirasi yang merupakan pathogenesis asma alergi (Abbas & Lichtman, 2003; Kuby, 1997). Siklooksigenase melalui mediator utamanya PGD2 menyebabkan vasodilatasi pembuluh darah, bronkokontriksi, dan kemotaksis neutrofil. Sedangkan

lipoxygenase

menyebabkan

melalui

bronkokontriksi,

mediator

sekresi

utamanya

mukus

dan

leukotriene peningkatan

permeabilitas pembuluh darah. Selain mediator-mediator di atas, sel mast juga mengeluarkan sitokin berupa TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6 (Abbas & Lichtman, 2003; Kuby, 1997).

3. Sel Mast Semua sel mast merupakan derivat dari progenitor di sumsum tulang. Awalnya sel mast membelah secara heteroplastik, lalu dilanjutkan secara mitosis homoplastik (Arvy, 1956). Normalnya, sel mast matur tidak terdapat di sirkulasi. Progenitor bermigrasi ke jaringan perifer sebagai sel mast imatur dan berdeferensiasi in situ (Abbas & Lichtman, 2003). Pada mencit terdapat dua tipe sel mast yaitu sel mast mukosa dan sel mast jaringan ikat. a. Sel mast mukosa mempunyai granul yang banyak mengandung kondroitin sulfat dan sedikit histamin. Sel mast jenis ini predominan terdapat di alveoli paru-paru dan mukosa intestinal. commit to user



b.

Sedangkan sel mast jaringan ikat memiliki granul yang banyak mengandung heparin dan histamin. Predominan terdapat di submukosa intestinal dan kulit (Abbas & Lichtman, 2003). Di intestinal, sel mast terutama terdapat di vili, sekitar glandula

duodenal Lieberkuhn, dan juga tersebar di mukosa usus kecil serta caecum (Sansonow, 1909). Sedangkan pada bronkus, sel mast dapat ditemukan di sekitar glandula submukosa, otot polos bronkus, dan bagian lain dari bronkus (Martin et al., 1991). Salah satu cara untuk melihat sel mast di jaringan yaitu dengan melakukan pewarnaan preparat menggunakan methylene blue. Dengan pewarnaan ini, granula sitoplasma sel mast akan terlihat sebagai gambaran metakromasi (Martin et al., 1991). Sebenarnya, organ normal hanya mengandung sedikit jaringan pengikat dan sel mast. Sebaliknya, sel mast terlihat banyak pada jaringan yang mengalami inflamasi baik pada inflamasi kronik (Prakken dan Woedermann, 1952) maupun inflamasi akut (Bensley, 1950). Pada keadaan tersebut terjadi peningkatan jumlah sel mast secara progresif di sekitar area inflamasi. Selama fase proliferasi sel mast masih terjadi, populasinya akan terus meningkat (Bensley, 1950). Kemudian melalui pemeriksaan secara histologi diketahui bahwa peningkatan destruksi sel mast mengakibatkan reaksi inflamasi yang besar pada jaringan di sekitarnya (Riley, 1959). commit to user



Gambar 3. Sel Mast dengan Pengecatan Methylene Blue (Nivaldo, 2009) Pada reaksi inflamasi, aktivasi sel mast didahului dengan masuknya alergen (Utomo & Sutijanto, 2005) yang dapat menimbulkan respon biologi berupa sekresi isi granul, sintesis dan sekresi mediator lipid, serta sintesis dan sekresi sitokin. Proses sintesis mediator lipid di antaranya yaitu pembentukan prostaglandin dan leukotriene. Proses ini memerlukan enzim cytosolic Phospholipase A2 (PLA2). Sedangkan dalam proses pelepasan granul sel mast dibutuhkan PLC , PKC, dan influks Ca2+ sel (Abbas & Lichtman, 2003).

4. Sensitisasi Hewan Coba Terdapat beberapa spesies binatang yang digunakan sebagai binatang model asma, di antaranya adalah tikus putih, tikus, marmut, musang, anjing, kambing, monyet, dan kuda. Dari spesies-spesies tersebut, yang paling banyak digunakan adalah tikus putih karena memiliki keuntungan yang paling besar dibanding spesies lain, di antaranya adalah karena IgE commit to user



merupakan antibodi terhadap alergi yang utama pada tikus putih (Shin et al., 2009). Tikus putih secara tipikal meningkatkan dominasi Th2 pada respon imun, dan menginduksi parameter respon alergi seperti IgE spesifik alergen, Airway Hyperresponsiveness (AHR), dan meningkatkan inflamasi eosinofilik pada jalan nafas (Shin et al., 2009). Ovalbumin (OVA) digunakan sebagai sensitisasi, komponen OVA utamanya adalah putih telur, secara struktural adalah serpin (sejenis protein). OVA merupakan fosfoglikoprotein monomer dengan berat molekul 43 hingga 45 kD dan bersifat asam pada titik isoelektrik (Huntington & Stein, 2001). OVA memiliki peran dalam peningkatan IgE secara spesifik. Mayoritas model yang sekarang digunakan adalah tikus putih yang disensitisasi dengan ovalbumin secara intraperitoneal, yang dalam penggunaannya sering bersama-sama dengan adjuvant sel Th2, seperti alumunium hidroksida (Kips et al., 2003; Diding dkk., 2007). Alumunium hidroksida(Al(OH)3), merupakan alumunium yang paling stabil dalam kondisi normal. Al(OH)3 dimasukkan sebagai adjuvant pada beberapa vaksin karena perannya dalam menginduksi respon Th2 (Petrovsky & Aguilar, 2004). Dalam penelitian untuk mensensitisasi hewan coba menggunakan tikus putih diimunisasi dengan suntikan ovalbumin (OVA; 8µg) intraperitoneal (i.p) yang diencerkan dengan jel alumunium hidroksida (1 mg) dalam 0,5 ml PBS, dan diulangi pada hari ke-14. Sedangkan commit to user



pemaparan tikus dengan 10 µg of OVA memberikan kadar tertinggi IgE dan IgG. Penelitian lain untuk membuat asma alergi, maka tikus putih disensitisasi dengan menginjeksikan secara i.p. 10 µg OVA yang dilarutkan ke dalam 2.25 mg alumunium hidroksida dalam 100 µl saline pada hari ke-0 dan 14. Pada hari ke-35, 39, dan 42, tikus putih dipapar dengan inhalasi OVA aerosol selama 20 menit. Aerosol menggunakan nebulizer cairan OVA (10mg/ml) dalam saline menggunakan Pari LC Star nebulizer (Pari Respiratory Equipment, Richmond, VA) yang digerakkan kompresor udara dengan flow rate 6L/min. Untuk protokol penelitian pemaparan antigen akut (kurang lebih 1 bulan) maupun kronik (lebih dari 2 bulan), tikus putih diimunisasi secara s.c. pada hari ke-0, 7, 14, dan 21 dengan 25 µg OVA (grade V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) yang dilarutkan pada 1 mg alumunium hidroksida (Sigma-Aldrich) dalam 200 µl PBS (Phosphat Buffer Saline). a. Tikus Putih Model Asma Alergi Akut Sifat dari model inflamasi akut dipengaruhi oleh pilihan strain, alergen, dan protokol sensitisasi dan paparan. Alergen yang umumnya dipakai adalah ovalbumin (OVA), yang merupakan derivat dari telur ayam. OVA relatif tidak mahal, tidak berbahaya, dapat dimurnikan, dan memiliki epitop yang mendominasi respon imun (Shin et al., 2009). Protokol sensitisasi pada model inflamasi akut biasanya membutuhkan pemberian alergen secara sistemik yang multiple commit to user



dengan penambahan adjuvant (Nials & Uddin, 2008). Adjuvant seperti alumunium

hidroksida

[Al(OH)3]

diketahui

menginduksi

perkembangan fenotip Th2 oleh sistem imun ketika dipapar antigen (Nials & Uddin, 2008; Shin et al., 2009). Protokol

tanpa

adjuvant

juga

dapat

dilakukan,

tetapi

membutuhkan alergen dalam jumlah yang lebih banyak. Setelah sensitisasi (14-21 hari), jalan nafas tikus putih dipapar dengan alergen, biasanya selama beberapa hari. Alergen dapat diinhalasi menggunakan formulasi nebulizer (aerosol), atau dengan intratrakeal (i.t) atau intranasal (i.n) (Nials & Uddin, 2008). Paparan pada model inflamasi akut ini disebut dengan paparan alergen primer (Shin et al., 2009). Protokol untuk yang akut adalah pemaparan OVA secara intranasal (20 µg dalam 50 µl PBS) diberikan pada hari ke-26, 28, 30, dan 35, dan tikus putih dikorbankan pada hari ke-36 (Hopfenspriger et al., 2002). Paparan primer pada model inflamasi akut memperlihatkan perubahan seperti asma di klinik seperti peningkatan kadar IgE, inflamasi jalan napas, hiperplasia sel goblet, hipertrofi epitel, AHR yang spesifik stimulus, dan -pada beberapa model- bronkokonstriksi fase cepat dan fase lambat. Namun, karena paparan ini bersifat paparan singkat, maka tidak dijumpai beberapa lesi yang ada pada asma kronik pada manusia, seperti inflamasi kronik pada dinding jalan napas dan remodelling jalan nafas. Terlebih lagi, beberapa proses commit to user



berjalan singkat, dan pada beberapa model, inflamasi jalan nafas dan AHR berkurang setelah beberapa minggu dari paparan alergen terakhir. Oleh karena itu, model paparan akut lebih cocok digunakan untuk meneliti proses yang mendasari inflamasi jalan napas akut dan AHR (Nials & Uddin, 2008). b. Tikus Putih Model Asma Alergi Kronik Tujuan pembuatan model inflamasi kronik adalah untuk memperlihatkan perubahan yang terjadi seperti pada asma di klinik, seperti AHR yang persisten dan remodelling jalan nafas, dan juga memungkinkan evaluasi obat baru sebagai rancangan terapi daripada sebagai rancangan profilaksis (Nials & Uddin, 2008). Selain itu, keuntungan dari protokol ini adalah kemampuannya untuk memonitor perubahan parameter inflamasi (Shin et al., 2009). Paparan kronik alergen dilakukan dengan memaparkan secara berulang jalan nafas dengan alergen kadar rendah sampai selama 12 minggu (Nials & Uddin, 2008).

Sedangkan Shin et al. (2009) menuliskan paparan

untuk model asma kronik (paparan sekunder) diberikan 2-6 minggu setelah paparan primer ketika eosinofilia jalan nafas dan AHR menurun

sampai

baseline

level.

Pemaparan

kronik

alergen

memperlihatkan perubahan-perubahan seperti asma pada manusia, termasuk alergen dependent sensitisasi, Th2 dependent inflamasi alergi dengan karakteristik influks eosinofil pada mukosa jalan nafas, AHR, commit to user



remodelling jalan nafas seperti hiperplasia sel goblet, hipertrofi epitel, dan fibrosis subepitelial atau peribronkiolar (Nials & Uddin, 2008). Sedangkan protokol untuk yang kronik, tikus putih yang telah mendapatkan pemaparan OVA intranasal pada hari ke-26, 28, 30 seperti pada protokol akut dan kemudian dilanjutkan dengan pemberian pemaparan OVA intranasal dua minggu sekali. Untuk melakukan pemberian intranasal, tikus putih diberikan anestesi dengan isoflurane (Isosol TM; Abbott Laboratories, North Chicago, IL) (Ikeda R.K., 2003). Sedangkan pada penelitian Cho et al., 2004, tikus putih diimunisasi i.p. pada hari ke-0 dan 12 dengan 50 µg OVA (grade V; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) dilarutkan pada 1 mg alum (Sigma-Aldrich) dalam 200 µl normal

saline. Pemaparan OVA

intranasal (20 µg/ 50 µl dalam PBS) diberikan pada hari ke-26, 29, dan 31 di bawah, anestesi dengan isoflurane (Vedco lnc., St. Joseph, Missouri, USA) dan kemudian diulangi dua minggu sekali selama 3 bulan. Tikus putih dikorbankan 24 jam setelah akhir pemaparan OVA terakhir (Cho J. Y., 2004).

commit to user



B. Kerangka Pemikiran 1. Kerangka Konsep

Gambar 4. Kerangka Konsep Penelitian

Keterangan : : merangsang : menghambat

commit to user



2. Kerangka Pikiran Teoritis Ovalbumin sebagai alergen masuk ke tubuh, ditangkap oleh Antigen Presenting Cell (APCs). Kemudian diproses dan dipresentasikan ke sel T CD4+ atau sel Th0. Sel Th0 akan berdiferensiasi menjadi sel CD4+ Th1 dan sel CD4+ Th2. Kerja dua sel tersebut bersinergi, dimana sel CD4+ Th2 berperan sebagai respon imun humoral yang akan mensekresikan antibodi (IgE). Sedangkan sel CD4+ Th1 berperan dalam respon imun seluler, yang akan menghasilkan sitokin-sitokin proinflamasi seperti IL-1β, IL-2, IL-6, dan TNF-α. TNF-α bersifat proteolitik, sehingga akan melisiskan sejumlah sel-sel termasuk sel saluran nafas. Debris lisis sel ini akan menimbulkan stres oksidatif (Reactive Oxygen Species/ROS), yang akan menambah beratnya reaksi asma alergi. Ovalbumin melalui sel CD4+ Th2 memicu produksi sel mast, paparan ovalbumin berikutnya akan menimbulkan degranulasi sel mast yang akan memproduksi lipid mediator (termasuk histamin) sehingga timbul alergi inflamasi pada saluran nafas yang akan bermanifestasi sebagai asma alergi. Propolis mengandung CAPE yang memiliki aktivitas biologis sebagai Ca-antagonis yang akan menghambat degranulasi sel mast. Kuersetin yang terkandung dalam propolis memiliki aktivitas biologis yang akan memperkuat membran sel mast sehingga membran sel mast tidak mudah terdegranulasi. Selain itu CAPE memiliki aktivitas biologis sebagai anti commit to user



oksidan, kandungan ini dapat menghambat stres oksidatif

yang akan

mengurangi terjadinya reaksi inflamasi pada asma alergi.

C. Hipotesis Ekstrak etanol propolis menurunkan hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi.

commit to user


digilib.uns.ac.id

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian Penelitian yang akan dilakukan ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan rancangan penelitian the post test only control group design.

B. Lokasi Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret. Pada bulan Mei sampai dengan September 2011.

C. Subjek Penelitian Subjek penelitian berupa tikus putih (Rattus norvegicus) jantan dengan berat badan ± 150 - 200 gram, dan berumur 4 - 6 minggu. Tikus putih diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Coba Universitas Setia Budi Surakarta.

D. Teknik Sampling Pengambilan sampel dilakukan dengan cara incidental sampling. Dimana jumlah sampel ditentukan menggunakan rumus Federer (Purawisastra, 2001), yaitu : (k-1) (n-1) > 15

commit to user

29



Keterangan: k : jumlah kelompok n : jumlah sampel dalam tiap kelompok Dalam penelitian ini, subjek dibagi menjadi 5 kelompok. Berdasarkan rumus Federer di atas, didapatkan jumlah subjek masing-masing kelompok sebagai berikut: ( k-1) (n-1)

≥ 15

(5-1) (n-1)

≥ 15

4

(n-1)

≥ 15

4n

≥ 19

n

≥ 4,75 ≈ 5

Jadi tiap kelompok minimal terdiri dari 5 ekor tikus putih. Pada penelitian kali ini kami menggunakan 7 ekor tikus putih.

E. Penentuan Dosis Perlakuan 1. Pemberian anti histamin generasi III Antihistamin generasi III yang digunakan dalam penelitian ini adalah Telfast® 120 mg yang mengandung Fexofenadine. Faktor konversi manusia (dengan berat badan ±70 kg) ke tikus putih (dengan berat badan ± 200 gr) adalah 0,018 (Suhardjono, 1995). Sehingga dosis yang diberikan kepada tikus putih : 120 x 0,018 = 2,16 mg ≈ 2 mg Dalam penelitian ini dosis anti histamin yang diberikan ialah 1 ml/tikus putih/hari, sehingga pelarut yang diperlukan : 120/2 x 1 = to 60user ml commit



2. Pemberian propolis Dosis propolis yang diberikan pada tikus putih adalah 100 mg/kg BB/hari/oral (Lotfy, 2006). Oleh karena tikus putih yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai berat badan ±200 mg, maka didapatkan perhitungan sebagai berikut :

Untuk mengetahui berapa banyak dosis per oral yang diberikan untuk tiap tikus, maka dapat dihitung sebagai berikut :

v = 0,5 ml Sehingga untuk dosis 100 mg/kg BB/hari setiap tikus mendapatkan dosis per oral 0,5 ml. Sedangkan untuk dosis 200 mg/kg BB/hari setiap tikus mendapatkan dosis per oral 1 ml.

commit to user



F. Rancangan Penelitian

S

K1

E1

K2

E2

K3

E3

K4

E4

K5

E5

Uji ANOVA dilanjutkan dengan Post Hoc Test antar kelompok

Gambar 5. Rancangan Penelitian Keterangan : S : Jumlah tikus putih yang digunakan K1 : Kelompok kontrol K2 : Kelompok asma alergi K3 : Kelompok asma alergi + antihistamin 2 mg/tikus putih/hari per oral K4 : Kelompok asma alergi + ekstrak propolis dengan dosis 100mg/kg BB/tikus putih/oral K5 : Kelompok asma alergi + ekstrak propolis dengan dosis 200mg/kg BB/tikus putih/oral E1 : Hitung sel mast K1 E2 : Hitung sel mast K2 E3 : Hitung sel mast K3 E4 : Hitung sel mast K4 E5 : Hitung sel mast K5

G. Identifikasi Variabel Penelitian 1. Variabel Bebas

: ekstrak etanol propolis

2. Variabel Terikat

: hitung sel mast

3. Variabel Luar a. dapat dikendalikan : gizi, makanan dan minuman, galur, umur, dan jenis kelamin hewan coba. b. tidak dapat dikendalikan : kondisi psikologis, sistem kekebalan tubuh hewan coba, genetik, dan keadaan awal tikus putih. commit to user



H. Skala Variabel 1. Ekstrak etanol propolis : skala nominal 2. Hitung sel mast : skala rasio

I. Definisi Operasional Variabel 1. Ekstrak etanol propolis Propolis lebah pada penelitian ini diperoleh dari peternak lebah di daerah Kecamatan Kerjo, Kabupaten Karanganyar, Surakarta, Jawa Tengah. Ekstraksi dilakukan dengan metode perkolasi, dengan cairan penyari etanol 80%. Sekitar 1 gram (akurasi penimbangan sampai 0,0001 gram) bubuk propolis mentah diekstraksi dengan 10 mL etanol 80% di shaker dengan kecepatan 200 rpm pada suhu kamar selama 24 jam. Setelah penyaringan melalui kertas saring, filtrat dibuat hingga 25 mL dengan 80% etanol dan disimpan dalam botol sampai analisis (Fu et al., 2005). Ekstrak Etanol Propolis (EEP) menunjukkan aktivias anti-inflamasi baik akut ataupun kronik. EEP dosis 50 mg/kg BB/hari/oral dan 100 mg/kg BB/hari/oral menunjukkan aktivitas anti-inflamasi kronik, sedangkan dosis 200 mg/kg BB/hari/oral menunjukkan aktivitas anti-inflamasi akut pada hewan coba model. 2. Hitung Sel Mast Tikus putih dikorbankan dengan pentobarbital-Na 100mg/kg BB/i.p. 24 jam setelah akhir pemaparan OVA untuk diambil jaringan intestinal, kemudian direndam dalam larutan formalin buffer 10% selama 10 jam, commit to user



setelah itu dibuat blok parafin. Selanjutnya dilakukan potongan serial terhadap blok parafin tersebut untuk dibuat slide dengan pewarnaan Toluidine Blue untuk hitung sel mast. Hitung sel mast diidentifikasi menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 40 kali, pada tiga lapang pandang yang berbeda. 3. Sensitisasi Hewan Coba Tikus putih diadaptasikan selama satu minggu. Kemudian dilakukan penimbangan untuk menentukan dosis dan dilakukan perlakuan. Untuk membuat model tikus putih asma alergi maka tikus disensitisasi pada hari ke-1 dengan 2,5 cc ovalbumin (OVA)/tikus putih/i.p dari 2,5 mg OVA yang dilarutkan pada 7,75 ml Alumunium hidroksida. Hari ke-14 disensitisasi ulang menggunakan 2,5 cc OVA/tikus putih/i.p dari 2,5 mg OVA yang dilarutkan pada 10 ml PBS. Pemaparan OVA aerosol dalam PBS (10:1) selama 20 menit dengan nebulizer kecepatan 6 L/menit diberikan pada hari ke-21, 23, 25 dan 27. Hari ke-28 tikus putih dikorbankan, jaringan intestinal dan serum dikoleksi.

J. Instrumentasi Penelitian 1. Alat penelitian a. Kandang hewan percobaan (20 cm x 30 cm x 15 cm) b. Timbangan digital c. Spuit injeksi 0,1 ml d. Sonde tikus putih 0,1 ml commit to user



e. Labu ukur 5 ml f. Beaker glass 5 ml g. Minor set h. Deck glass i. Nebulizer j. Mikroskop 2. Bahan penelitian a. Ekstrak propolis b. Intestinal hewan coba c. Aquades d. Pakan tikus putih BR I e. OVA f. Antihistamin generasi III g. Formalin buffer 10% h. Al(OH)3 i. Blok paraffin j. Pewarna Toluidine Blue

K. Cara Kerja 1. Sebelum perlakuan a. Hewan uji diadaptasi dengan kondisi laboratorium tempat penelitian selama kurang lebih 1 minggu. commit to user



b. Hewan uji dikelompokkan secara incidental sampling menjadi 5 kelompok. Masing-masing kelompok terdiri dari 7 ekor tikus putih. 2. Pemberian Perlakuan a. Sejak hari ke-1 sampai hari ke-7 kelompok K1, K2, K3, K4 dan K5 diberi diet standar. Masing-masing diberi perlakuan yang berbeda. b. Antihistamin untuk kelompok 3 dan ekstrak propolis untuk kelompok 4 dan 5 diberikan setiap hari. c. Sensitisasi OVA dalam Al (OH)3/tikus putih dari 2,5 mg ovalbumin yang dilarutkan pada 7,75 ml Al (OH)3. intraperitoneal (i.p.) dilakukan pada hari ke-0 dan 14 dengan dosis 0,15 ml/tikus putih. d. Hari ke-21, ke-23, ke-25 dan ke-27 tikus putih dipapar dengan ovalbumin aerosol dari 50 mg ovalbumin dalam 5 ml PBS dengan alat nebulizer kecepatan 6 L/menit selama 20 menit. 3. Setelah perlakuan Dua puluh empat jam setelah paparan terakhir, semua tikus putih dikorbankan menggunakan teknik cervical dislocation. Jaringan intestinal diambil untuk dibuat preparat imunohistokimia dan dicat dengan Toluidine Blue. Preparat diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 1000 kali.

L. Teknik Analisis Data Data yang diperoleh akan dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji Anova dilanjutkan dengan LSD Post Hoc Test untuk membandingkan commit to user



perbedaan mean antarkelompok. Jika data tidak memenuhi syarat untuk uji Anova, sebaran data tidak normal (p < 0,05) dan varians data tidak sama meskipun sudah ditransformasi, digunakan uji alternatifnya yaitu uji KruskalWallis untuk membandingkan perbedaan mean lebih dari dua kelompok. Dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney, untuk membandingkan perbedaan mean antar kelompok menggunakan program SPSS for Windows Release 17.0.

commit to user


digilib.uns.ac.id

BAB IV HASIL PENELITIAN

A. Hitung Sel Mast Penelitian ini menggunakan 35 ekor tikus putih (Rattus norvegicus), galur Wistar, jenis kelamin jantan, usia 4 - 6 minggu, berat badan ± 150 - 200 gram. Tikus-tikus tersebut dibagi secara acak menjadi lima kelompok yaitu kelompok I yang menjadi kelompok kontrol, kelompok II yaitu kelompok asma alergi, kelompok III yang dibuat asma dan diberi antihistamin, kelompok IV yang dibuat asma dan diberi ekstrak propolis dosis 100 mg/kg BB/tikus putih/oral, dan kelompok V yang dibuat asma dan diberi ekstrak propolis dosis 200 mg/kg BB/tikus putih/oral. Sebelum pemberian perlakuan, kelima kelompok tikus diadaptasikan terlebih dahulu dan diukur berat badannya. Rerata berat badan tikus adalah 150 gram. Pada hari ke-28 kelima kelompok tikus dikorbankan, dan diambil jaringan intestinalnya untuk dibuat preparat. Preparat intestinal masing-masing kelompok diamati menggunakan mikroskop dengan pengecatan toluidine blue. Pengamatan sel mast jaringan intestinal dengan mikroskop perbesaran 10 x 100 dan dihitung dalam tiga lapang pandang. Data selengkapnya disajikan pada tabel 4.1 :

commit to user

38



Tabel 3. Hitung Sel Mast (Jumlah Sel/Lapang Pandang) Masing-Masing Kelompok Perlakuan Kelompok Median (min-max) K1 = Kontrol 1(1-5) K2 = Asma Alergi 3(1-5) K3 = Asma alergi + Antihistamin generasi III 3(1-5) K4 = Asma Alergi + Propolis I 2(2-3) K5 = Asma Alergi + Propolis II 2(2-3) Sumber: Data primer, 2011 Hasil hitung sel mast masing-masing kelompok disajikan pada gambar berikut ini : 3

3

2

2

Jumlah Sel Mast 1

Gambar 6. Histogram Hitung Sel Mast Intestinal Tikus Masing-Masing Kelompok Perlakuan

B. Analisis Hasil Data yang diperoleh dari hasil penelitian, pertama kali diuji apakah data yang ada memenuhi syarat uji parametrik One-Way ANOVA. Analisis data dilakukan dengan menggunakan program komputer Statistical Product and Service Solution (SPSS) 17.0 for Windows. Syarat menggunakan uji parametrik One-Way ANOVA: 1. Hanya dapat digunakan dengan masalah skala pengukuran numerik. commit to user



2. Skala variabel numerik harus memiliki sebaran data normal, yang dibuktikan dengan uji normalitas data metode analitik yaitu uji Kolmogorov-Smirnov atau Saphiro-Wilk. Pada sebaran data normal, nilai p lebih besar daripada nilai α. Misal, α = 0,200 maka nilai p untuk uji sebaran data normal harus p > 0,200. 3. Varians data, untuk jumlah kelompok lebih dari dua, harus sama. Hal ini dapat diketahui dengan menggunakan uji homogenitas varians yaitu Levene’s Test of Varians. Varians data yang sama akan memiliki nilai p lebih besar daripada nilai α. Misal, α = 0,05 maka nilai p untuk uji varians data normal harus p > 0,05. 4. Jika salah satu dari ketiga syarat di atas tidak terpenuhi, dilakukan transformasi data untuk menormalkan data. Apabila hasil transformasi data tidak berhasil menormalkan data maka digunakan uji hipotesis alternatifnya yaitu uji non parametrik Kruskall-Wallis. Uji normalitas data metode analitik yang dapat digunakan untuk menentukan sebaran data normal atau tidak adalah uji Kolmogorov-Smirnov (sampel > 50) atau uji Saphiro-Wilk (sampel ≤ 50) (Dahlan, 2007). Penelitian ini menggunakan 35 sampel, maka digunakan uji Saphiro-Wilk untuk menentukan apakah sebaran data normal atau tidak. Hasil uji Saphiro-Wilk menunjukkan distribusi data tidak normal karena ada nilai p = 0,032 dan p = 0,150. Syarat kedua untuk menggunakan uji OneWay ANOVA tidak terpenuhi sehingga perlu dilakukan normalisasi data dengan cara transformasi data. commit to user



Setelah dilakukan transformasi data, ternyata data tetap tidak memenuhi syarat untuk uji Anova karena meskipun varians data sama tetapi sebaran data tidak normal (p < 0,05), sehingga data dianalisis menggunakan uji alternatifnya, yaitu Kruskal-Wallis untuk membandingkan perbedaan mean lebih

dari

dua

kelompok,

dilanjutkan

uji

Mann-Witney

untuk

membandingkan perbedaan mean antar kelompok menggunakan program SPSS for Windows Release 17.0. Hasil uji Kruskal-Wallis diperoleh nilai 0,371. Jadi nilai tidak signifikan, tidak terdapat perbedaan bermakna antar kelompok. Hasil perhitungan uji sebaran data, uji varians, dan uji Kruskal-Wallis selengkapnya dilihat pada lampiran 1.

Gambar 7. Sel Mast pada Kelompok Kontrol dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x

Gambar 8. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x commit to user



Gambar 9. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Antihistamin Generasi III dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x

Gambar 10. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi + Ekstrak Propolis Dosis 100 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x

Gambar 11. Sel Mast pada Kelompok Asma Alergi Ekstrak Propolis Dosis 200 mg/kg BB dilihat dengan Mikroskop Perbesaran 40x commit to user


digilib.uns.ac.id

BAB V PEMBAHASAN

Menurut Zukesti (2003), alergi merupakan reaksi imunologik spesifik yang ditimbulkan oleh alergen baik berupa pertahanan selular maupun humoral dari organisme terhadap benda asing. Penelitian ini menggunakan ovalbumin (OVA) sebagai alergen. Hasil penelitian didapatkan peningkatan jumlah sel mast pada kelompok asma (tabel 3), tetapi tidak bermakna dibandingkan kelompok kontrol (p = 0,337), sedangkan pada penelitian Prihantiny (2010) dengan petanda asma hitung sel mast didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok kontrol dan asma (p < 0.001). Hal ini sesuai dengan pernyataan Busse dan Lemanske (2001) bahwa OVA akan mengaktivasi sel mast serta sel CD4+ Th2 sebagai reaksi terhadap alergi. Sel CD4+ Th2 yang teraktivasi akan memproduksi mediator-mediator inflamasi seperti histamin, leukotriene, serta sitokin-sitokin seperti IL-4, IL-5 (Busse dan Lemanske, 2001), IL-10, dan IL-13 (Abbas dan Lichtman, 2003). IL-4 dan IL-10 dapat merangsang pertumbuhan sel mast (Li-Weber dan Krammer, 2003). Sitokin-sitokin yang dihasilkan oleh sel CD4+ Th2 berperan dalam hiperplasi sel mast (Blease et al., 2000; Temann, 2002; Abbas dan Lichtman, 2003) dan sangat berpengaruh pada respon alergi (Hohlfeld, 2001). Tidak didapatkannya perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol dan kelompok asma pada penelitian ini kemungkinan disebabkan oleh sistem kekebalan tubuh setiap individu bervariasi, sehingga respon yang diberikan juga berbeda. commit to user

43



Pemberian antihistamin generasi III (fexofenadine) pada tikus model asma alergi diharapkan dapat menekan reaksi inflamasi akibat alergi pada kelompok K2 (kelompok asma alergi) sebagai kontrol positif, sehingga dapat menurunkan hitung sel mast. Dari hasil penelitian, antihistamin generasi III (fexofenadine) tidak dapat menurunkan hitung sel mast. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh efek obat yang belum mencapai jaringan intestinal. Propolis mengandung flavonoid, kandungannya antara lain Cafeic-Acid Phenethyl Ester (CAPE), chrysin, galangin dan kuersetin. Flavonoid yang berpengaruh dalam penurunan hitung sel mast pada penelitian ini yaitu CAPE, dan kuersetin. Menurut Fitzpatrick et al. (2001) CAPE memiliki aktivitas biologis sebagai penghambat poten dan spesifik terhadap aktivasi NF-kB, sehingga sebagai Ca-antagonis yang akan menghambat degranulasi sel mast. Menurut Kimata et al. (2000) dan Kempuraj et al. (2005) kuersetin memiliki aktivitas biologis yang akan memperkuat membran sel mast sehingga membran sel mast tidak mudah terdegranulasi dan menghambat pelepasan histamin, TNF-α dan IL-6. Selain itu propolis juga memiliki efek antileukotrien, antihistamin, dan antiprostaglandin sehingga dapat mencegah

stres oksidatif yang dapat

menimbulkan reaksi inflamasi. Pada penelitian ini propolis dosis 100 dan 200 mg/kgBB/hari dapat menurunkan hitung sel mast pada intestinal tikus putih tetapi penurunannya tidak bermakna. Saat tikus diberi dosis propolis yang lebih tinggi (200 mg/kg BB/hari) efek terapinya sama dengan propolis dosis 100 mg/kg BB/hari. Hal ini dapat disebabkan oleh dosis yang diberikan belum mencapai dosis optimal yang dibutuhkan dalam pengobatan asma alergi. commit to user



Penelitian ini juga tidak terlepas dari adanya kekurangan yang bisa mempengaruhi hasil penelitian. Dosis ekstrak propolis yang diberikan kemungkinan belum mencapai kadar optimal sehingga tidak menimbulkan efek yang diharapkan.

commit to user


digilib.uns.ac.id BAB VI SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan Hasil penelitian ini menunjukkan pemberian ekstrak propolis dosis 100 dan 200 mg/kg BB/hari dapat menurunkan hitung sel mast intestinal pada tikus putih (Rattus norvegicus) model asma alergi namun secara statistik penurunannya tidak bermakna.

B. Saran Penelitian lebih lanjut dalam pengembangan terapi untuk asma alergi dengan menggunakan propolis dapat dilakukan dengan memberikan dosis yang berbeda sehingga didapatkan dosis yang optimal untuk digunakan dalam terapi.

commit to user 46

PENGARUH EKSTRAK ETANOL PROPOLIS TERHADAP HITUNG SEL MAST INTESTINAL PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus) MODEL ASMA ALERGI

Recommend Documents