ABSTRAK PEMBERIAN EKSTRAK BUAH DELIMA MERAH (Punicagranatum) ORALMENURUNKAN KADAR F2-ISOPROSTANPADAURIN TIKUS (Rattus norvegicus) WISTAR JANTAN YANG DIINDUKSI AKTIVITAS FISIK BERLEBIH Aktivitas fisik berlebih akan meningkatkan komsumsi oksigen yang dapat mengakibatkan naiknya kadar Reactive Oxygen Species (ROS) sehingga menyebabkan Stres Oksidatif yang ditandai dengan meningkatnya F2-Isoprostan sebagai salah satu produk peroksidasi lipid. Buah delima (Punica granatum) mengandung polifenol yang dapat menghambat dan memutuskan rantai reaksi radikal bebas dan mencegah reaksi peroksidasi lipid. Tujuan dari penelitian ini adalah membuktikan bahwa pemberian ekstrak buah delima (Punica granatum) oral dapat menghambat kenaikan kadar F2-isoprostan pada urintikus putih (Rattus norvegicus) galur wistar jantan yang diinduksi pelatihan fisik berlebih. Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni dengan menggunakan pretest-posttest control group design. Subjek penelitian adalah 14 ekor Tikus putih (Rattus norvegicus), jantan, galur wistar, berumur 2-3 bulan, dengan berat badan 200-220 gram yang terbagi menjadi 2 (dua) kelompok masing-masing berjumlah 7 ekor tikus, satu kelompok sebagai kelompok kontrol (P0) yaitu kelompok yang diberikan plasebo dengan pelatihan fisik berlebih, dan kelompok perlakuan (P1) yang diberikan ekstrak buah delima merah (Punica granatum) 314mg/hari dengan pelatihan fisik berlebih. Sebelum dan setelah 7 hari perlakuan, sampel urin ditampung dan diperiksa kadar F2-Isoprostan menggunakan 8isoPGF2α enzyme immunoassay kit (EIA)dari assay designuntuk data pretest dan post-test. Data kemudian dianalisis menggunakan program Statistical Package for the Social Sciences (SPSS®) 17.0. Hasil penelitian menunjukkan rerata kadar F2-Isoprostan pada kelompok kontrol (P0) sebelum perlakuan (pretest) adalah 4,82 ± 0,43 ng/mL, sedangkan pada kelompok perlakuan (P1) adalah 4,56 ±0,57 ng/mL (p>0,05). Namun setelah perlakuan selama 7 hari (post-test), rerata kadar F2-Isoprostan pada kelompok kontrol (P0) adalah 4,73 ± 0,44 ng/mL dan pada kelompok perlakuan (P1) adalah 3,21 ± 0,34 ng/mL (p<0,01). Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan,dapat disimpulkan hal sebagai berikut: Pemberian ekstrak buah delima (Punica granatum) dapat menurunkan kadar F2-isoprostan pada urin tikus putih galur wistar jantan yang di induksi latihan fisik berlebih. Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai dasar penelitin lebih lanjut untuk mengetahui efektifitas dan dosis optimal ekstrak buah delima merah sebagai antioksidan. Kata Kunci: buah delima, F2-Isoprostan, pelatihan fisik berlebih, tikus wistar.
ix
ABSTRACT ADMINISTRATION OF POMEGRANATE (Punicagranatum) FRUIT EXTRACT DECREASED F2-ISOPROSTAN LEVELS IN MALE WISTAR RATS (Rattus norvegicus) URINE INDUCED BY EXCESSIVE PHYSICAL ACTIVITY Excessive physical activity will increase the consumption of oxygen which can result in increased levels of Reactive Oxygen Species (ROS), causing oxidative stress characterized by the elevation of F2-isoprostane as a products of lipid peroxidation. Pomegranate (Punica granatum) contains polyfenol that are able to inhibit and break the chain reaction of free radicals and prevent lipid peroxidation. The purpose of this study was to prove that the extract of pomegranate (Punica granatum) can inhibit the elevation of F2-isoprostane levels in male wistar rats (Rattus norvegicus) urin induced by excessive physical training. This study was a true experimental research using a pretest-posttest control group design. The subjects were 14 male wistar rats (Rattus norvegicus), aged 2-3 months, weights 200-220 grams and were divided into 2 (two) groups. One group as a controlgroup (P0) that were given a placebo with excessive physical overtraining, and the treatment group (P1) which were administered the extract of pomegranate (Punica granatum) of 314mg/day with excessivephysical overtraining. Before and after 7 days of treatment, the urine sample was collected and examined levels of F2-isoprostane 8-isoPGF2α was done using enzyme immunoassay kit (EIA) of the assay design for pretest and post-testdata respectively. Data were analyzed using the program Statistical Package for the Social Sciences (SPSS®) 17.0. The results showed that the average levels of F2-isoprostane in the control group (P0) before treatment (pretest) was 4.82 ± 0.43 ng / mL, while the treatment group (P1) was 4.56 ± 0.57 ng / mL (p> 0.05). On the other hand, after treatment for 7 days (post-test), the mean levels of F2-isoprostane in the control group (P0) was 4.73 ± 0.44 ng / mL and the treatment group (P1) was 3.21 ± 0.34 ng / mL (p<0.01). Based on these result, it can be concluded that the extract of pomegranate (Punica granatum) decreased F2-isoprostane levels in male wistar rats (Rattus norvegicus) urin induced by excessive physical training.The result of this study could be applied as a basis for further research in pursuit of the pomegranate extract effectiveness and optimal dose as antioxidant. Keywords: pomegranate, F2-isoprostane, excessive physical training, Wistar rats.
x
DAFTAR ISI
halaman
SAMPUL DALAM ....................................................................................
i
LEMBAR PRASYARAT GELAR MAGISTER . ......................................
ii
LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................
iii
LEMBAR PENETAPAN PANITIA PENGUJI .........................................
iv
LEMBAR PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT .......................................
v
LEMBAR UCAPAN TERIMA KASIH .......................................................
vi
ABSTRAK ....................................................................................................
ix
ABSTRACT ..................................................................................................
x
DAFTAR ISI .................................................................................................
xi
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................
xvi
DAFTAR TABEL .........................................................................................
xvii
DAFTAR SINGKATAN ............................................................................ xviii DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................
xx
BAB I PENDAHULUAN............................................................................ 1 1.1 Latar Belakang .......................................................................... ......... 1 1.2 Rumusan Masalah ..................................................................... ......... 5 1.3 Tujuan Penelitian .......................................................................
5
1.4 Manfaat Penelitian .................................................................... ......... 5 1.4.1 Manfaat Ilmiah .................................................................. ......... 5 1.4.2 Manfaat Klinik .................................................................. ......... 6 BAB
II KAJIAN .......................................................................7
2.1 Penuaaan (Aging) ...................................................................... ......... 7
xi
PUSTAKA
2.1.1 Mekanisme Terjadinya Penuaan ....................................... 8 2.1.2 Gejala Klinis Penuaan ...................................................... .......... 11 2.2 Radikal Bebas ..................................................................................... 13 2.2.1 Klasifikasi Radikal Bebas ................................................. ......... 13 2.2.2 Sumber Radikal Bebas ...................................................... ......... 14 2.2.3 Pembentukan Radikal Bebas ............................................. ......... 14 2.2.4 Reactive Oxygen Species (ROS) ......................................... 16 2.2.4.1 Dampak Negatif Reactive Oxygen Species ............17 2.2.4.2 Dampak Positif Reactive Oxygen Species ............ ................ 18 2.2.5 Stres Oksidatif ................................................................... ......... 19 2.3 Aktivitas Fisik ...........................................................................20 2.3.1 Definisi .............................................................................. ......... 20 2.3.2 Aktivitas Fisik Berlebih .................................................... ......... 21 2.3.3 Aktivitas Fisik Berlebih Dengan Stres Oksidatif .............. ......... 23 2.4 F2-Isoprostan ..............................................................................
23
2.4.1 Mekanisme Pembentukan F2-Isoprostan .......................... ......... 24 2.4.2 Absorbsi,Distribusi,Metabolisme,dan Ekskresi ................................ F2-Isoprostan ...................................,,,,.................................25 2.4.3 F2-Isoprostan Sebagai Biomarker Peroksidasi Lipid ........
26
2.4.4 F2-Isoprostan dan aktivitas fisik berlebih .......................... 2.5 Antioksidan ...............................................................................
27 ... 28
2.5.1 Polifenol ............................................................................. ......... 29 2.5.2 Antosianin .......................................................................... ......... 32 2.5.3 Struktur Kimia .............................................................................
xii
32
2.5.4 Efek Fisiologis ................................................................... .........
33
2.6 Delima ........................................................................................ ......... 33 2.7 Tikus Wistar ............................................................................... ......... 39 2.7.1 Klasifikasi Tikus Wistar ............................................................. 39 2.7.2 Pemantauan Keselamatan Tikus ....................................... ......... 41 BAB IIIKERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS............... 42 3.1 Kerangka Berpikir ...................................................................... .......... 42 3.2 Konsep ....................................................................................... ......... 43 3.3 Hipotesis Penelitian ............................................................................. 44 BAB IV METODE PENELITIAN............................................................... 4.1 Rancangan Penelitian .................................................................. ......... 45 4.2 Tempat dan Waktu Penelitian ..................................................... ......... 46 4.2.1 Lokasi Penelitian ............................................................... ......... 46 4.2.2 Waktu Penelitian ............................................................... ......... 47 4.3 Populasi dan Sampel .................................................................. ......... 47 4.3.1 Populasi ............................................................................. ......... 47 4.3.2 Kriteria Subyek ................................................................. ......... 47 4.3.2.1 Kriteria Penerimaan .................................................. ............ 47 4.3.2.2 Kriteria Drop Out .................................................................. 48 4.4 Penentuan Besar dan Cara Pengambilan Sampel ....................... ......... 48 4.4.1 Penentuan Besar Sampel ................................................... ......... 48 4.4.2 Tehnik Pengambilan Sampel ............................................ ......... 49 4.5 Variabel Penelitian ..................................................................... ......... 49
xiii
45
4.5.1 Identifikasi Variabel .......................................................... ......... 49 4.5.2 Klasifikasi Variabel .......................................................... .......... 49 4.5.3 Definisi Operasional Variabel ........................................... ......... 50 4.6 Bahan dan Alat-alat Penelitian ................................................... ......... 51 4.7 Prosedur Penelitian .............................................................................. 52 4.7.1 Pemeliharaan Tikus Percobaan ......................................... ......... 52 4.7.2 Pelaksanaan Perlakuan ...................................................... ......... 53 4.7.3Cara Pembuatan Ekstrak buah Delima (Punica granatum). 54 4.7.4Cara Mengambil Sampel Urin ..........................................
54
4.7.5 Cara Memeriksa F2-isoprostandenganMetode 8-isoprostaglandin F2α .....................................................
54
4.8 Alur Penelitian ........................................................................... ......... 57 4.9 Analisi Data ......................................................................................... 58 BAB V HASIL PENELITIAN...................................................................... 5.1 Analisis Deskriptif ...................................................................... ......... 59 5.2 Uji Normalitas Data .................................................................... ......... 60 5.3 Uji Homogenitas Data ................................................................61 5.4Uji Komparabilitas ..................................................................... ........... 61 5.5Analisis Efek Perlakuan .............................................................. .......... 63 BAB VIPEMBAHASAN............................................................................. 65 6.1 Subyek Penelitian ........................................................................ ......... 65 6.2Distribusi dan Homogenitas Data Hasil Penelitian ..................... .......... 66 6.3Pengaruh Pemberian Ekstrak Buah Delima Merah .....................66
xiv
59
BAB VIISIMPULAN DAN SARAN...........................................................
73
7.1 Simpulan ..................................................................................... ......... 73 7.2 Saran ..................................................................................................... 73 DAFTAR PUSTAKA....................................................................................
xv
74
DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1 Pembentukan Radikal Bebas ..................................................................
16
2.2 Pembentukan ROS oleh reaksi Fenton dan Haber-Weiss ......................
17
2.3 Penyakit terinduksistres oksidatif pada manusia ..................................
20
2.4 Skema sederhana biosintesis F2-isoprostan ........................................... 2.5 Bentuk Molekul Polifenol ......................................................................
26 30
2.6Struktur 6 jenis antosianidin, dalambentuk glukosida dengan glukosa.... 32 2.7 Buah Delima Putih .................................................................................
35
2.8 Buah Delima Merah ...............................................................................
36
2.9 Buah Delima Ungu ................................................................................
36
2.10 Tikus Wistar (Rattus norvegicus) .........................................................
41
3.1 Bagan Kerangka Konsep Penelitian ........................................................
43
4.1 Rancangan Penelitian ..............................................................................
45
4.2 Alur Penelitian ........................................................................................
57
5.1 Grafik Perbandingan Rerata Kadar F2-Isoprostan antar Kelompok Sebelum dan Sesudah Perlakuan .............................................................
xvi
64
DAFTAR TABEL Halaman 2.1 Polifenol ................................................................................................. 2.2 Klasifikasi Ilmiah Tanaman BuahDelima .............................................
31 34
2.3 Kandungan Delima per 100 gram Takar................................................
38
2.4 Data Biologi Tikus .................................................................................
39
2.5 Klasifikasi Tikus Wistar ........................................................................
40
5.1 Hasil Analisis Deskriptif Kadar F2-Isoprostan ...................................... 5.2 Hasil Uji Normalitas Data Antar Kelompok .........................................
60 60
5.3 Hasil Uji Homogenitas Data Antar Kelompok ......................................
61
5.4 Rerata Kadar F2-Isoprostan Antar Kelompok .......................................
62
5.5 Analisis Efek Perlakuan .........................................................................
63
xvii
DAFTAR SINGKATAN
AAM
= Anti Aging Medicine
ACE
= Angiotensin Converting Enzyme
ATP
= Adenosine Triphosphate
COX
= Cyclooxygenase
DHEA
= Dehydroepiandrosterone
DNA
= Deoxyribonucleic Acid
EIA
= enzyme immunoassay kit
eNOS
= Endothelial Nitric Oxide Synthase
GPx
= Glutathione Peroxidase
GSH
= Glutathione
HbA1c
= Hemoglobin A1c
HNE
= 4-Hydroxy-2-Trans-Nonenal
LDL
= Low Density Lipoprotein
MDA
= Malondialdehyde
NF-КB
= Nuclear Factor KappaB
ORAC
= Oxygen Radical Absorption Capacity
p-CREB
= Phospho-cAMP Response Element-Binding Protein
PUFA
= Polyunsaturated Fatty Acid
RNA
= Ribonucleic Acid
RNS
= Reactive Nitrogen Species
ROS
= Reactive Oxygen Species
SOD
= Superoxide Dismutase
viii
SPSS®
= Statistical Package for the Social Sciences
TA
= Total Activity
TBARS
= Thiobarbituric Acid Reactive Substances
TNF –α
= Tumor Necrosis Factor α
USDA
= United State Department of Agriculture
UV
= Ultraviolet
ix
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1.Lampiran I, Tabel Konversi Dosis ( Pages dan Barnes, 1964 )...............
81
2.Lampiran II, Ethical Clearance ................................................................
82
3. Lampiran III, Hasil Analisis Laboratorium ............................................. 83 4.Lampiran IV,
Analisis Deskriptif,Uji Normalitas Data,Uji
Homogenitas Data, Analisis Komparasi, AnalisisEfekPerlakuan .........
84
5.Lampiran V,Hasil Laboratorium F2-Isoprostan ..................................... 87 6..Lampiran VI, Foto-foto Tikus dan alat-alat penelitian ........................... 89
x
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Penuaan adalah proses alami yang akan dialamioleh setiap individu. Penuaanbisa diartikan sebagai suatu proses penurunan fungsi organisme yang terjadi seiring dengan berjalannya waktu. Penuaan merupakan hasil dari perubahan struktur dan fungsi sel suatu organisme dalam suatu periode. Seiring dengan banyaknya perubahan yang dialami baik secara alam dan kondisi lingkungan yang secara tiba-tiba serta di ikuti dengan beban kerja yang berat membuat proses penuaan lebih cepat terjadi. Anti aging medicine (AAM)memperbaiki dan memperlakukan penuaan sebagai suatu penyakit yang dapat dicegah, dihindari, dan diobati, sehingga dapat kembali kekeadaan semula (Pangkahila, 2011; Goldman dan Klatz, 2007). Ada 2 faktor yang menyebabkan seseorang menjadi tua yaitu faktor internal dan faktor eksternal. Faktor internal seperti radikal bebas, berkurangya produksi hormon, metilasi, glikosilasi, apoptosis, menurunnya sistem kekebalan tubuh dan genetik. Sedangkan faktor eksternal seperti gaya hidup yang tidak sehat, polusi lingkungan, kebiasaan yang salah, stres dan kemiskinan (Pangkahila, 2011). Penuaan menimbulkan berbagai penyakit (Fowler, 2003). Sampai sekarang, berbagai studi dan penelitian banyak di lakukan guna mencapai peningkatan kesehatan, kualitas hidup dengan pencegahan, pengobatan dan bahkan pengembalian fungsi seperti semula(Pangkahila, 2011).
1
2
Salah satu teori menyebutkan bahwa proses penuaan diakibatkan oleh radikal bebas. Radikal bebas merupakan molekul reaktif, terdiri dari satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbit terluar (Pham-Huy et al., 2008). Seiring dengan bertambahanya usia, maka produksi radikal bebas yang dihasilkan oleh metabolisme tubuh akan meningkat secara fisiologis, berbanding terbalik dengan produksi antioksidan yang digunakan untuk menetralisir radikal bebas di dalam sel ataupun yang di asup dari luar biasanya cenderung menurun. Ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan ini disebut stres oksidatif. Stres oksidatif tersebut akan menyebabkan kerusakan komponen selular, termasuk lipid, protein, karbohidrat dan DNA, menyebabkan patogenesis berbagai penyakit (Halliwell dan Gutteridge, 2007) termasuk diabetes, aterosklerosis, kanker (Kesavulu, 2001). Dalam beberapa penelitaan, dapat dibuktikan bahwa penyakit jantung dan hipertensi dapat dikontrol dengan cara berolahraga, walaupun pada olahraga yang berat dapat meningkatkan ROS (reactive oxygen species) dalam jaringan, dan 2-5% oksigen yang digunakan akan berubah menjadi ion superoksid. Pembentukan ROS yang disebabkan oleh olahraga yang berlebih dapat menimbulkan kerusakan sel dan modifikasi molekul termasuk pada DNA, membran lipid, dan protein. Guna melindungi sel dari kerusakan ROS yang disebabkan oleh olahraga berlebih, Jaringan akan merespon dengan meningkatkan aktivitas dari sekelompok enzim antioksidan.
3
Aktivitas fisik yang berlebih juga dapat meningkatkan risiko timbulnya stres oksidatif. Stres oksidatif terjadi karena jumlah radikal bebas yang terbentuk melebihi antioksidan yang di produksi. Saat tubuh menggunakan oksigen, secara alami radikal bebas akan dihasilkan. Kerusakan oksidatif yang berulang dan dalam waktu lama akan menyebabkan sel atau jaringan akan kehilangan fungsinya dan rusak (Suryohusodo, 2000; Singh, 2006). Peroksidasi lipid juga ikut berperan pada kerusakan jaringan, reaksi berantai dari peroksidasi lipid dapat menjadi asupan radikal bebas sehingga akan mencetuskan reaksi oksidasi selanjutnya. Peroksidasi lipid yang diinisiasi oleh endoperoksid dan aldehidakan merusak komponen membran sel yang kaya akan asam lemak tak jenuh ganda / PUFA (polyunsaturated fatty acid). Hasil dari hidrolisis reaksi ini sebagian berupa etan, pentan, 4-hydroxy-2-trans-nonenal (HNE), Malondialdehyde (MDA), dan berbagai aldehid lain (Baraas, 2006; Ann dan Carol, 2008). Beberapa cara dipakai untuk mengukur kadar lipid peroksidasi, antara lain MDA, HNE, TBARS, F2isoprostan, Acrolein lysin (Ann dan Carol, 2008). Banyak biomarker yang bisa dipakai untuk mengukur terjadinya stress oksidatif. F2-isoprostan sering digunakan untuk mengukur kadar reaksi peroksidasi lipid, dan mempunyai implikasi yang penting untuk petanda biologis, karena pengukuran lebih mudah dan stabil sehingga dapat diandalkan untuk menilai danmengkaji status stress oksidatif in vivo. Pemeriksaan ini dapat dilakukan melalui plasma dan urin (Halliwell dan Gutteridge, 2007).
4
Saat ini antioksidan digunakan dalam rangka upayadalam pencegahan dan penanggulangan stres oksidatif.Berbagai macam penggolongan antioksidan,yaitu antioksidan primer (SOD, GPx,) dan antioksidan sekunder (vitamin C, β–Karoten, vitamin E, sistein, Co-Q10, flavonoid),
dan antioksidan tersier (Metionin
sulfoksida reduktase) (Winarsi, 2007). Buah delima merah (Punica granatum) merupakan satu dari sekian banyak sumber antioksidan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan. Buah delima merah mempunyai kandungan polifenol dan antosianin yang cukup tinggi. Pigmen antosianin bertanggung jawab atas pembentukan warna merah, ungu dan biru dari buah, sayuran dan bunga. Antosianin merupakan salah satu antioksidan kuat yang mampu mencegah berbagai kerusakan akibat stress oksidatif sehingga mampu melindungi sel dari radikal bebas (Yanjun et al., 2009; Caoet al., 2001). Studi yang dilakukan di American University of Beirut Medical Center, Beirut, Libanon menunjukkan bahwa penggunaan buah delima dapat mengurangi oedem paru, mengurangi
inflamasi dan memberikan respon yang baik pada
parenkim paru, dan pada paru-paru mencit yang mengalami hiperoksia (Husariet al.,2009). Studi laboratorium pada mencit yang menderita aterosklerotik menunjukkan bahwa 44% lesi dapat dicegah dengan pemberian suplemen buah delima dibandingkan
dengan
mencit
yang
hanya
diberi
air.
Buah
Delima
merupakansumber antioksidan, karena mengandung polifenol komplek dan flavonoid seperti: katekin, antosianin, phenolik (Aviramet al., 2000).
5
Buah delima merah merupakan sumber antioksidan alami dengan kandungan antosianin yang tinggi dan mudah didapat di Indonesia. Meskipun beberapa penelitian dilaporkan bahwa buah delima merupakan salah satu sumber antioksidan yang baik, belum ada penelitian yang melaporkan apakah pemberian ekstrak buah delima merah secara oral dapat menurunkankadarF2-isoprostan pada urin tikus (Rattus norvegicus) wistar jantan yang diinduksi pelatihan fisik berlebih. Penelitian ini dilakukan guna mengingat fungsinya bagi kesehatan dan pencegahan penuaan, cukup aman dan dapat ditanam di Indonesia. 1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang tersebut di atas dapat di rumuskan masalah sebagai berikut: Apakah pemberian ekstrak buah delima merah (Punica granatum) oral menurunkan kadar F2-isoprostan pada urintikus (Rattus norvegicus) wistar jantan yang diinduksi pelatihan fisik berlebih? 1.3. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan pemberian ekstrak buahdelima merah (Punica granatum) oral, menurunkan kadar F2-isoprostan pada urin tikus (Rattus norvegicus)putih wistar jantan yang diinduksi pelatihan fisik berlebih. 1.4. Manfaat Penelitian 1.4.1 Manfaat Ilmiah Dari hasil penelitian diperoleh informasi ilmiah mengenaiefektivitas ekstrak buah delima merah sebagai antioksidan dalam menangkal radikal bebasdengan
6
indikator penurunanankadar F2-isoprostan pada urin tikus putih wistaryang diinduksi pelatihan fisik berlebih.
1.4.2 Manfaat Praktis Proposal penelitian ini dapat membuktikan efektivitas ekstrak buah delima merah dalam menangkal radikal bebas, dan telah dilakukan clinical trial, maka diharapkan ekstrak etanol buah delima merah dapat digunakan sebagai antioksidan.
7
BAB II KAJIAN PUSTAKA
2.1. Penuaan(Aging) Penuaan merupakan proses perubahan fisiologis yang tidak dapat dihindarioleh setiap organisme.Dalam proses penuaan, terjadi penurunan fungsi organ-organ secara bertahap yang terjadi pada manusia, tumbuhan, hewan, dan juga organisme bersel satu. Penuaan telah terjadi pada saat manusia baru saja lahir. Tanda-tanda fisiologis yang terjadi ialahmenurunnya jumlah sel jaringan, melambatnya metabolisme, serta menigkatnya resiko terjadinya penyakit. Beberapa faktor lingkungan yang mempengaruhi penuaan seperti stress, olahraga berlebihan, merokok, dan adanya radiasi sinar ultraviolet (Pangkahila, 2011). Terjadi kerusakan protein jaringan, atrofi jaringan, berkurangnya cairan tubuh, dan metabolisme kalsium yangabnormal pada proses penuaan.Kemudian terjadi perubahan fisiologis berikutnya mengenai disfungsi organ vital seperti kerusakan pada organ kardiopulmonar,fungsi endokrin, persarafan, fungsi motorik dan juga fungsi imunologi. Dengan adanya faktor risiko seperti hipertensi, obesitas, hiperlipidemia, alkohol, perubahan metabolisme glukosa, merokok, stress dan kebiasaan gaya hidup tidak sehat mengakibatkan berbagai variasi penyakit pada sistem tubuh, seperti :penyakit degeneratif, aritmia, gagal jantung, arteriosklerosis, stoke, gagal ginjal, katarak, hilangnya komunikasi sistem saraf, diabetes, emfisema paru,arthritis,
ulkus lambung, osteoporosis,infeksi, atau
tumor, dapat terjadi penuaan lanjut secara patologis (Park dan Yeo, 2013).
8
2.1.1 Mekanisme Terjadinya Penuaan Ada beberapa teori penuaan, pertama yaitu teori program genetik (genetic programming theory) dimana teori ini berpendapat bahwa penuaan dan usia hidup organisme ditentukan oleh faktor genetik.Yang kedua adalah teori kerusakan primer (primary damage theory)yang menyebutkan bahwa penuaan terjadi oleh karena akumulasi kerusakan pada organisme akibat faktor-faktor perusak yang multipel. Termasuk didalamnya adalah teori wear-and-tear, teori error catastrophe, teori radikal bebas, teori kerusakan DNA, teori membran sel (Park dan Yeo, 2013). Pada dasarnya, semua teori itu dibagi menjadi dua kelompok yaitu teori wear and tear dan teori program. Hipotesis kerusakan DNA, glikosilasi, dan radikal bebas termasuk dalam teori wear and tear, sedangkan teori program diantaranya terbatasnya replikasi sel, proses imun, dan teori neuroendokrin (Pangkahila, 2011).
1. Teori Wear and Tear Menurut teori ini, penuaan terjadi jika sel ataupun jaringan tubuh yang dipakai atau disalahgunakan secara terus menerus menjadi rusak atau habis. Teori “pakai” dan “rusak” ini diperkenalkan oleh Dr. August Weismann, biologis dari Jerman tahun 1882 (Pangkahila, 2011; Jin, 2010). a. Teori DNA Damage Kerusakan pada DNA akan terus terjadi pada setiap sel organisme hidup. Sebagian dapat diperbaiki, tetapi sebagian lagi terakumulasi pada saat DNA
9
Polimerase. Proses perbaikan lainnya tidak bisa memperbaiki kerusakansama atau secepat waktu kerusakan itu muncul pertama kali. Kerusakan DNA yang terus menerus ini terjadi juga pada sel mamalia yang tidak dapat membelah. Seiring bertambahnyausia mutasi genetik mulai terjadi, menyebabkan sel mengalami malfungsi. Kerusakan DNA pada mitokondria juga mengakibatkan disfungsi mitokondria. Restriksi kaloriditemukan dapat meningkatkan usia hidup hewan coba sejak tahun 1930 (Park dan Yeo, 2013; Jin, 2010). b. Glikosilasi Glikosilasi merupakan ikatan kovalen antara gula darah dan hemoglobin pada sel darah merah. Proses glikosilasi ini penting untuk penyakit-penyakit degeneratif seperti diabetes. Pada kondisi normal tanpa diabetes, hanya sekitar 4,5% sampai 6% gula darah yang berikatan dengan hemoglobin. Banyaknya ikatan kovalen ini dapat diketahui dengan mengukur Hemoglobin A1c (HbA1c). Jika kadar HbA1c ini terlalu tinggi maka akan memperburuk struktur dan fungsi sel. Pada organ-organ yang tidak tergantung insulin, seperti ginjal, pembuluh darah, saraf perifer, dan lensa mata, glukosa akan diabsorbsi dengan mudah sehingga terjadi kekakuan arteri, hilangnya fungsi saraf, dan katarak. Pada diabetes proses penuaan ini merupakanrole model dari proses penuaan pada kondisi lainnya (Pangkahila, 2011).
c. Teori Radikal Bebas TeoriinidikenalkanolehDr.Gerschmanpadatahun 1954,lalu dikembangkan oleh Dr. Denham Harman yang menegaskan bahwa superoksida dan radikal bebas
10
lain mengakibatkan kerusakan pada komponen makromolekul sel dan organ. Radikal bebas merupakan molekul yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan. Makromolekul seperti gula, asam nukleat, protein, dan lipid mudah diserang radikal bebas. Ikatan single- dan double- asam nukleat dapat berikatan dengan molekul lain karena rusak, dan dapat berikatan dengan basa atau kelompok gula lain (Pangkahila, 2011; Jin, 2010).
2. Teori Program Teori ini mengemukakan bahwa penuaan mengikuti suatu jam biologik, kemungkinan merupakan lanjutan dari sistem yang mengatur pertumbuhan dan perkembangan masa kecil. Pengaturan ini bergantung pada perubahan ekspresi gen yang berpengaruh pada respon pemeliharaan, perbaikan, dan pertahanan. Teori ini terbagi menjadi tiga subkategori : a. Teori Terbatasnya Replikasi Sel Panjang telomere (enam nukleotida sekuen DNA yaitu TTAGGG) yang terletak pada ujung chromosome strandsberpengaruh pada kehidupan sel. Telomere mempengaruhi fungsi sel punca pada organ yang pergantian selnya tinggi. Padareplikasi sel, telomere mengalami pemendekan setiap kali terjadi pembelahan sel. Setelah beberapa kali pembelahan sel, telomere telah dipakai dan pembelahan sel berhenti. Proses telomere ini menentukan rentang usia sel yang pada akhirnya juga rentang usia pada organisme itu sendiri (Pangkahila, 2011).
11
b. Teori Immunologi Sistem imun akan mengalami penurunan dengan berjalannya waktu, hal ini mengakibatkan ketahanan tubuhorganisme semakin rentan terhadap resiko terjadinya penyakit infeksi dan menyebabkan penuaan yang berujung kematian. Efektivitas maksimal dari sistem imun ialah sewaktu pubertas dan akan menurun seiring bertambahnya usia (Jin, 2010). c. Teori Neuroendokrin Hormon dihasilkan oleh beberapa organ yang dikontrol oleh hipotalamus di otak. Hipotalamus membentuk poros dengan hipofise dan organ tertentu, contohnya
poros
hipotalamus-hipofise-testis,
poros
hipotalamus-hipofise-
suprarenalis, dan lain-lain. Fungsi hormonal lebih optimal saat usia muda dibandingkan dengan usia tua (Pangkahila, 2011).
2.1.2 Gejala Klinis Penuaan Proses penuaan dimulai dari menurunnya bahkan berhentinya fungsi dari masing-masing organ tubuh. Hal ini mengakibatkan berbagai tanda dan gejala penuaan, yang pada dasarnya dibagi menjadi dua yaitu (Pangkahila, 2011): 1. Tanda fisik, seperti berkurangnya massa otot, peninggkatan sel lemak, elastisitas kulit menurun atau berkerut, daya ingat menurun, terganggunya fungsi seksual dan reproduksi, kemampuan kerja menurun, sakit pada tulang. 2. Tanda psikis, seperti kurangnya gairah hidup ,susah tidur, mudah cemas, mudah tersinggung, merasa tidak berguna lagi.
12
Proses penuaan tidak timbul begitu saja, ada tiga fase dalam proses penuaanantara lain (Pangkahila, 2011) : 1. Fase subklinik (rentan usia 25-35 tahun) Pada Fase ini, terjadi penurunan berbagai hormon didalam tubuh, seperti hormon testosteron, growth hormone, dan hormon estrogen. Kerusakan akibat penurunan hormon ini biasanya tidak terlihat dari luar, sehingga orang terlihat normal, tidak mengalami gejala dan tanda penuaan. 2. Fase Transisi (rentan usia 35-45 tahun) Padafase ini, level hormon mengalami penurunan sampai 25 persen. Terjadi penurunan massaotot sekitar satu kilogram setiap beberapa tahun, hal ini mengakibatkan hilangnya kekuatan dan tenaga, sedangkan disisi lain komposisi lemak terus bertambah.Pada fase ini orang sudah merasa tidak muda lagi dan kelihatan lebih tua. Kerusakan yang diakibatkan radikal bebas mulai merusak ekspresi genetik, yang bisa menimbulkan penyakit. 3. Fase klinik (usia lebih dari 45 tahun) Terjadi penurunan kadar hormon secara terus menerus pada fase ini. Hormon yang turun diantaranya DHEA (Dehydroepiandrosterone), melatonin, growth hormone, testosteron, estrogen, dan hormon tiroid.Penurunan juga disertai hilangnya fungsi penyerapan bahan makanan, vitamin, dan mineral. Densitas tulang menurun, massa otot mengalami penurunan sekitar satu kilogram setiap tiga tahun, yang menyebabkan ketidakmampuandalam membakar kalori, diikuti dengan meningkatnya lemak tubuh, dan berat badan.
13
2.2Radikal Bebas Radikal bebas merupakan molekul reaktif, terdiri dari satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada orbit terluar (Pham-Huy et al., 2008). Karena ketidakstabilan molekul ini membuatnya dapat berinteraksi dengan molekul yang berdekatan, seperti karbohidrat, protein, lipid, dan asam nukleat, sehinggamembuat molekul tersebut menjadi tidak stabil juga dan terbentuklah reaksi rantai baru yangakan berhenti jika diredam oleh senyawa yang bersifat antioksidan. Radikal bebas yang paling banyakmengakibatkan kerusakan sistem biologi ialah oxygen-free radical, yang dikenal sebagai reactive oxygen species (ROS) (Rahman, 2007).
2.2.1 Klasifikasi Radikal Bebas Berdasarkan pendapat Salama dan El-Bahr (2007), radikal bebas dibedakan menjadi: 1.
Oxygen centered radicals antara lain radikal alkoksil (RO●), anion superoksida (O2●), radikal peroksil (●OOH atau ROO●), danradikal hidroksil (●OH).
2.
Oxygen centered non radicals antara lain hidrogen peroksida (H2O2) dan oksigen singlet (1O2).
3.
Spesies radikal lain atau reactive nitrogen species (RNS) terdiri dari: nitrit oksida (NO●), peroksinitrit (OONO-),dan nitrit dioksida (NO●2).
14
2.2.2Sumber Radikal Bebas Sumber-sumber radikal bebas menurut Pham-Huy et al. (2008)dapat dibagi menjadi: 1.
Radikal bebas yang dibentuk dari dalam tubuh oleh karena proses
enzimatik oleh mitokondria, retikulum endoplasma, membran plasma, inti sel, dan lisosom. Oksidasi pada proses respirasi, pencernaan, dan metabolisme
merupakan
proses
enzimatik
yang
mengakibatkan
terbentuknya radikal bebas. 2.
Radikal bebas yang dibentuk didalam tubuh oleh karena proses
nonenzimatik. Hal ini terjadi karena reaksi oksigen dengan senyawa organik melalui ionisasi dan radiasi yang terjadi pada reaksi inflamasi dan iskemia. 3.
Radikal bebas yang berasal dari luar tubuh yang disebabkan oleh
polutan seperti radiasi sinar UV, sinar X, sinar gamma, asap rokok, asap kendaraan bermotor, konsumsi makanan tinggi lemak, alkohol, caffeine, pestisida atau zat beracun lainnya. Disamping itu, radikal bebas juga dapat terjadi oleh karena stres atau aktivitas fisik yangberlebih. 2.2.3Pembentukan Radikal Bebas Radikal bebas secara umum terbentuk melalui tiga tahapan reaksi berikut (Winarsi, 2007): 1.
Tahap inisiasi, merupakan awal pembentukan radikal bebas,
mengubah senyawa non radikal menjadi radikal. Misalnya:
15
R1 _H Fe ++
+ •OH
R1•
+ H2O2
2.
Fe
+++
+ H2O + OH-
+ •OH
Tahap propagasi, merupakan pemanjangan dari rantai radikal,
dalam hal ini reaksi berantai radikal bebas diperluas sehingga membentuk beberapa radikal bebas baru, misalnya : R2_H
+
R1•
R3_H
+
R2•
R2 • R3 •
+
R1_H
+ R2_H
3.
Tahap
terminasi, merupakan pembentukan non radikal dari
radikal
bebas, bereaksinya senyawa radikal dengan radikal yang lain
atau dengan penangkap radikal, mengakibatkan potensi propagasinya rendah, misalnya :
R2 •
R1 •
+
R1 •
R2 •
+
R1 •
+
R2 •
R1_R1 R2_R1 R2_R2 dan seterusnya
16
Gambar 2.1 Pembentukan radikal bebas
2.2.4Reactive Oxygen Species (ROS) Reactive Oxygen Species (ROS)merupakan elemen oksigen yang penting bagi organisme aerob, seperti manusia. Sekitar 90% dari oksigen yang ada didalam tubuh digunakan untuk pembentukan energi berupa ATP melalui proses fosforilasi oksidatif di mitokondria. Sisanya 10% oksigen dipergunakan untuk proses hidroksilasi dan reaksi oksigenasi dengan bantuan enzim. Sekitar 1 – 2 % oksigen akanmenjadi residu yang dikonversi menjadi reactive oxygen species atau dikenal juga dengan ROS (Baynes dan Dominiczak, 2014). ROS ialah istilah yang dipakai untuk radikal, tidak hanya radikal yang mengikat oksigen (superoksida (O2●) dan radikal hidroksil (●OH)) tetapi juga derivat oksigen yang tidak mengandung elektron atau tidak berpasangan misalnya hidrogen peroksida (H2O2) dan oksigen singlet(1O2) (Pham-Huy et al., 2008). Ada tiga tahapan mekanisme terbentuknya ROS secara in vivo, yaitu :
17
1. Reaksi Fenton, akibat reaksi antara oksigen dengan ion metal 2. Sebagai reaksi sampingan dari transpor elektron pada mitokondria, 3. Melalui proses enzimatik normal misalnya pembentukan H2O2 oleh oksidasi asam lemak di peroksisom (Baynes dan Dominiczak, 2014).
Gambar 2.2 Pembentukan ROS oleh reaksi Fenton dan Haber-Weiss (Baynes danDominiczak, 2014) 2.2.4.1 Dampak Negatif Reactive Oxygen Species ROS bisa merusak DNA, protein dan lipid, tetapi dalam kondisi normal, tubuh mempunyai sistem yang dapat memperbaiki kerusakan oleh ROS, yaitu : 1.
DNA • Kerusakan:semua komponen DNA bisa dirusak oleh radikal hidroksil (•OH). Sedangkan oksigen singlet (1O2) biasanya mengenai guanin. Hidrogen peroksida (H2O2) dan Superoksida (O2●) tidak mengenai DNA.
18
• Sistem perbaikan: enzim tubuh mengenali kerusakan pada DNA, kemudian dilanjutkan proses eksisi, resintesis, dan penyatuan kembali rantai DNA. 2.
Protein • Kerusakan: ROS banyak merusak gugus sulfhidril. Radikal hidroksil (•OH) merusak residu asam amino. • Sistem perbaikan: residu oksidasi metionin ditanggulangi oleh methionine sulfoxide reductase. Protease selular dapat mengenali dan menghancurkan kerusakan protein lain..
3.
Lipid • Kerusakan: sebagian ROS, kecuali superoksida (O2●) dan hidrogen peroksida (H2O2), bisa menginisiasi terbentuknya peroksidasi lipid. • Sistem perbaikan: chain-breaking antioxidants khususnya tokoferol dapat meniadakan propagasi rantai radikal peroksil. Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase dapat menghilangkan peroksida membran.
2.2.4.2Dampak Positif Reactive Oxygen Species Tidak hanya efek negatif, ternyata ROS juga memiliki dampak positif, seperti (Bagiada, 2001; Baynes dan Dominiczak, 2014): 1.
Membunuh dan melawan organisme patogen yang dihasilkan
granulosit, makrofag dan monosit 2.
Berperan sebagai substrat untuk enzim, contohnya H2O2 sebagai
substrat untuk enzim hemeperoksidase yang berperan penting dalam iodinisasi hormon tiroid
19
3.
Merupakan sinyal untuk metabolisme zat tertentu, seperti insulin.
H2O2mempunyaifungsi dalam mekanisme inaktivasi reversible dari sebagian protein tirosin fosfatase, yangakan kemudian mengaktivasi protein tirosin kinase melalui reseptor insulin pada waktu yang bersamaan. 2.2.5Stres Oksidatif Stres oksidatif yaitu suatu keadaan dimana jumlah produksi ROS lebih tinggi dibandingkan dengan eliminasinya, yang menyebabkan kerusakan oksidatif
molekul-molekul
biologi.
Jika
terjadi
terus-menerus,
maka
mengakibatkan akumulasidari kerusakan oksidatif di dalam sel dan jaringan yang akan membuat jaringan tersebut kehilangan fungsinya (Bagiada, 2001). Stres oksidatif bisa terjadi secara lokal, seperti pada penyakit artritis dan aterosklerosis, maupun secara sistemik, seperti pada systemic lupus erythematosus dan diabetes (Baynes dan Dominiczak, 2014). Berbagai penyakit yang diinduksi oleh stres oksidatif digambarkan pada gambar 2.3 (Pham-Huy et al., 2008).
20
Gambar 2.3 Penyakit terinduksistres oksidatif pada manusia (Pham-Huy et al., 2008)
2.3Aktivitas Fisik 2.3.1 Definisi Aktivitas fisik secara umum di bedakan menjadi : 1. Aktivitas fisik yang dikerjakan secara mendadak (acute exercise) 2. Aktivitasfisik yang dikerjakan secara berulang (training exercise) Semua aktivitas fisik baik ringan, sedang, ataupun berat akan direspon oleh tubuh baik secara fisiologik maupun biomolekuler. Ketika sedang melakukan aktivitas fisik yang cukup berat (seperti tes treadmil), terjadilah peristiwa dimana peningkatan kebutuhan oksigen (oxygen demand) seringkali tidak tercukupi oleh penyediaan oksigen (oxygen supply). Fenomena ini disebut sebagai fase iskemia. Sementaraitupeningkatan oxygen suply justru akan meningkatkan terjadinya radikal bebas oksigen bahkan bisa mencapai 10x lipat (fenomena ini disebut fase reperfusi). Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa stres oksidatif dapat
21
disebabkan oleh aktifitas fisik yang berat.dimana produksi radikal bebas oksigen meningkat secara bermakna (Baraas, 2006).
2.3.2 Aktivitas Fisik Berlebih Latihan atau aktivitas yang berlebih atau over training / burnoutialah suatu kondisi dimana terjadi kelelahan kronis selama aktivitas yang melebihi batas kemampuan individual sampai menimbulkan cedera otot yang biasanya timbul sebelum akhir dari kompetisi (Vincen et al., 2000; Prentice, 2011). Tanda-tanda dan gejala aktivitasfisik berlebih : 1. Tanda-tanda pada penampilan : - Penurunan konsistensi penampilan (performance) - Dibutuhkan penyembuhan yang lama setelah pertandingan - Kelelahan yang menetap dan menjadi lambat - Penampilan yang tidak konsisten 2. Gejala Fisik - Penurunan efektivitas kerja - Sulit tidur - Sakit kepala dan perut - Kaku dan nyeri otot atau persendian - Konstipasi dan diare - Nafsu makan dan masa tubuh menurun - Amenorhea - Kenaikan denyut nadi pada waktu bangun tidur
22
3. Gejala Psikis - Depresi - Apatis - Kurang percaya diri - Emosi menjadi labil - Sulitberkonsentrasi - Gairah bertanding menurun atau bahkan hilang Saat aktivitas fisik berlebih, konsumsi oksigen naik menjadi 10 kali bahkan 20 kali lipat dibandingkan waktu istirahat yang disertai juga peningkatan konsumsi oksigen didalam otot sampai 100-200 kali lebih besar dibandingkan waktu istirahat. Sesaat setelah aktivitasfisik berlebih yang berkaitan dengan stres oksidatif, terjadi respon inflamasi terutama 24 jam setelah selesai latihan dan sistem kekebalan
tubuh
bereaksi
terhadap
kerusakan
dikarenakan
latihan
tersebut.Kemudian selama 2-7 hari terjadi proses adaptasi yang bisa membuat lebih sehat. Selama periode ini, neutropil sangat berperan dalam pertahanan jaringan. Aktivitas fisik berlebih juga mengakibatkan penurunan kondisi fisik, penimbunan lemak, berkurangnya massa otot, peningkatan kadar hormon kortisol yang lebih tinggi daripada testosteron, insomnia, mudah lemas, cepat tersinggung, nyeri sendi dan tulang serta penurunan imunitas tubuh (Maffetone, 2007) Pada aktivitas fisik berlebih, Karena retribusi aliran darah ke otot menurun maka terjadi pula kondisi hipoksia relatif di jaringan organ dalam, hal ini
23
akanmemacu pembentukan radikal superoksid, yang akan mengaktifkan jalur xanthin oksidase. 2.3.3 Aktivitas Fisik Berlebih Dengan Stres Oksidatif Aktivitas fisik yang berlebih bisa mengakibatkan terbentuknya radikal bebas (Adiputra, 2008). Radikal bebas yang berlebih dapat mengakibatkan kerusakan pada DNA, akan terjadi peroksidasi lipid membran sel dan sitosol yang merusak membran dan organel, juga mengakibatkan terjadinya modifikasi protein yang teroksidasi. Latihan fisik yang berlebih mengakibatkan stres oksidatif, dimana stres oksidatif dapat dikontrol dengan pola hidup yang sehat dan komsumsi antioksidan (Hersh, 2004). Aktivitas fisik berlebih mengakibatkan peningkatan pada biomarker stres oksidatif seperti peningkatan jumlah leukosit, glutation peroksidase, glutation teroksidasi, isoprostan urin, juga dapat menyebabkan peningkatan komsumsi oksigen pada otot skeletal (Murray et al., 2000) Apabila terjadi aktivitas fisik yang berlebih atau overtraining, maka kadar isoprostan, malondialdehyde, dan kreatin kinase diperiksa untuk mengetahui terjadinya cedera otot karena beban berlebih.
2.4 F2-isoprostan Stres oksidatif diyakinimenjadi penyebab dari berbagai penyakit baik akut ataupun kronis, tetapi evaluasi terhadap kadar radikal bebas menjadi hal yang sulit karena sifat dari radikal bebas sangat reaktif, cepat hilang, dan mempunyai
24
karakteristik yang berbeda-beda. Cara yang mudah dilakukan ialahdengan melakukan evaluasi terhadap hasil reaksi radikal bebas di dalam tubuh, salah satunya dengan mengukurkadar F2-isoprostan. Isoprostan adalah senyawa yang menyerupai prostaglandin yang disintesis oleh esterifikasi asam arakhidonat akibat dari reaksi katalisasi radikal bebas nonenzimatik in vivo. Kadar F2isoprostan bisa menjadi gambaran peroksidasi lipid yang terjadi pada kondisi stres oksidatif. Peroksidasi lipid in vivo dan in vitro dengan analisa kuantitatif F2-isoprostan diakui lebih unggul jika dibandingkan metode analisis lain seperti MDA, TBARS (thiobarbituric acid–reactive substances),lipid hidroperoksida, dan exhaled alkanes (ethaneataupunpentane)(Basu, 2008). Kadar F2-isoprostan normalialah kurang dari 2 ng/ml kreatinin, tetapi dapat naik pada kondisi stres oksidatif. Hal ini yang mengakibatkankadar F2isoprostan tidak boleh melebihi normal, karena kenaikan kadar F2-isoprostan menunjukkan peroksidasi lipid yang terjadi pada kondisi stres oksidatif. Jika stres oksidatif tidak dikurangi maka bisa menimbulkan kerusakan oksidatif. Kerusakan oksidatif yang terjadi secara terus menerus dapat mengakibatkan kerusakan dari molekul tubuh, jaringan, penurunan fungsi organ, penuaan, dan beberapa penyakit lainnya. 2.4.1Mekanisme Pembentukan F2-isoprostan Sebelum tahun 1990, pembentukan nonenzimatik derivat prostaglandin belum banyak diketahui. Beberapa studi menemukan bahwa pembentukan F2isoprostan melewati jalur cyclooxygenase (COX) dari sel monosit dan trombosit manusia, tetapi pembentukan melalui jalur ini sangatlah minimal. Isoprostan
25
tidak membutuhkancyclooxgenase dalam pembentukannya, oleh sebab itu F2isoprostan tidak bisa disebut sebagai prostaglandin (Basu, 2008). Tahapan mekanisme pembentukan isoprostan dengan prekusor asam arakhidonat yaitu (Basu, 2008): 1.
Pemisahan atom hidrogen yang tidak stabil atau labil
2.
Penambahan molekul oksigen pada asam arakhidonat yang
menghasilkan empat bentuk radikal peroksil 3.
Endocyclization
4.
Penambahan molekul oksigen yang membentuk empat PGG2-
like bicyclic endoperoxide intermediates yang tidak stabil 5.
Glutation
mereduksi
PGG2-like
bicyclic
endoperoxide
intermediates yang akan menghasilkan bentuk awal isoprostan kemudian berubah menjadi rmacam-macam bentuk. Bentuk isoprostan dipengaruhi oleh letak ikatan regioisomer atom karbon
dengan gugus hidroksil,
apakah terletakpada seri ke 5-, 8-, 12-, atau 15- regioisomer. Komponen ini disebut juga F2-isoprostan karena komponen ini isomer dengan PGF2 primer
2.4.2 Absorbsi, Distribusi, Metabolisme, dan Ekskresi F2-isoprostan Belum diketahui secara pastifarmakokinetik dari F2-isoprostan. Hasil studi memperlihatkan bahwa isoprostan diproduksi secara in situ pada sel yang rusak, kebanyakan berbentuk ester, lalu dimetabolisme menjadi bentuk asam bebas. Setelah melalui tahapan biosintesis dalam jaringan, komponen ini siap
26
diabsorbsi dan didistribusikan ke seluruhbagian tubuh dalam bentuk asam bebas maupun ester. Setelah dalam bentuk bebas, isoprostan dilepaskan ke dalam sirkulasi perifer lalu mengalami hidrolisis dan metabolisme lanjutan. Isoprostan primer dan produk oksidasinya bisa dijumpai dalam darah maupun urin (Basu, 2008).
Gambar 2.4 Skema sederhana biosintesis F2-isoprostan (Basu, 2003)
2.4.3F2-isoprostan Sebagai Biomarker Peroksidasi Lipid Pada beberapa kondisi yang berhubungan dengan cedera oksidatif, kadar F2-isoprostan diketahui cenderung meningkat. Peningkatan kadar F2-isoprostan baik dalam jaringan ataupun cairan tubuh inibisa digunakan sebagai penanda peroksidasi lipid yang disebabkan oleh radikal bebas secara in vivo. Pada cedera oksidatif, kadar F2-isoprostan biasanya meningkat sepuluh kali lebih banyak daripada PGF2 enzimatik pada plasma. F2-isoprostan yang berbentuk bebas
27
dengan mudah
didapatkan pada jaringan dan cairan tubuh. Perhitungan
isoprostan yang berbentuk ester dan bentuk bebas bisadikerjakan pada jaringan, yang memperlihatkan adanya stres oksidatif pada jaringan tersebut (Basu, 2008). Perhitungan kadar MDA (malondialdehyde) dilaporkan kurang sensitif jika dibandingkan dengan kadar isoprostan dalam hal melihat adanya stres oksidatif. Tetapi tidak ada hubungan antara kadar MDA dengan peningkatan isoprostan. Walaupunadanya oksidasi asam arakhidonat dapat digambarkan oleh isoprostan dengan baik, tetapibisa saja merupakan hasil oksidasi dari lipid lain .Disamping itu, pengambilan sampel yang tidak baik, persiapan yang kurang hati-hati (selama proses ekstraksi, purifikasi, dan hidrolisasi), dan pengawetan sampel yang dilakuakan sebelum dilakukan analisa juga bisa mengakibatkan kesalahan dalam analisis isoprostan (Basu, 2008).
2.4.4F2-isoprostan dan Aktivitas Fisik Berlebih Pada kondisiaktivitas fisik berlebih seperti lari ultramaraton yang dapat mencetuskan terjadinya lipid peroksidase, terjadi peningkatan isoprostan. Studi terdahulu menyebutkan bahwa kadar F2-isoprostan meningkat pada subyek sehat setelah mengerjakan aktivitas fisik berupa knee extensor selama tiga jam (Fischer et al., 2004; Fischer et al., 2006). Menurut Sacheck et al. (2003), dalam 72 jam pertama setelah aktivitas fisik berlebih dapat terjadi peningkatan kadar F2-isoprostan hingga 5 ng/ml akibat kerusakan pada otot. Pada penelitian dengan menggunakan 12 subyek sehat yang diberi perlakuan berupa aktivitas fisik berlebihselama 12 minggu, terbagi dalam empat fase yang masing-masing fasenya terdiri dari beban latihan fisik bervariasi,
28
dengan lama latihan tiga minggu per fase, dan jarak istirahat 96 jam antar fase, diperoleh hasil bahwa terjadi peningkatan F2-isoprostan yang berbanding lurus terhadap peningkatan beban latihan. Kemudian terjadi penurunan F2-isoprostan secara signifikan waktu istirahat selama 96 jam setelah diberi aktivitas fisik yang berat (Margonis et al., 2007).
2.5Antioksidan Penatalaksanaan terapianti penuaan (anti aging)adalah penerapan dari berbagai terapi yang bisa digunakan dalam deteksi awal, pencegahan, pengobatan, atau penyembuhan kembali dari disfungsi dan penyakit yang berhubungan dengan penuaan, sehinggaterjadi peningkatan kualitas dan memperpanjang kuantitas dari umur manusia itu sendiri. Keadaan yang ideal ialahmeliputigolden triangle yaitu terciptanya keseimbangan oksidatif antara oksidan, antioksidan, dan biomolekul, serta aktivitas fisik yang disesuaikan pada setiap individu (Fusco et al., 2007). Antioksidan berperan dalam mencegah kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas sehingga dapat memperpanjang usia hidup. Organisme selalu membuat sistem pertahanan secara primer agar dapat melindungi dirinya sendiri terhadap toksisitas radikal bebas dengan memproduksi komponen antioksidan seperti protein, Superoksida Dismutase (SOD), Glutation Peroksidase (GPx), Glutation (GSH), katalase dan antioksidan yang berat molekulnya lebih kecil seperti coenzim Q, asam uratdan asam lipoic. Disamping itu tubuh juga dapatmembentuk pertahanan sekunder yaitu dengan memproduksi enzim lipolitik (Fosfolipase A2), sistem proteolitik (proteinase dan peptidase), dan mengadakan sistem perbaikan DNA dan RNA (endonuklease dan eksonuklease)
29
yang berfungsi untuk membuang atau memperbaiki produk hasil kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas (Poljsak et al., 2013). Buahdelima (pomegranate), wolfberry, manggis dan gojimengandung antioksidan yang cukup tinggi berdasarkan pengukuran Oxygen Radical Absorption Capacity (ORAC). Tes ORAC merupakan tes yang berfungsi untuk mengukur potensi antioksidan total yang terdapat pada makanan dan suplemen nutrisi per 100 gram sampel. Tes ORAC semuanya dilakukan di Brunswick Laboratories di bawah naungan United State Department of Agriculture (USDA). Dalam delima mengandung 500 mg ellagitannin,buah manggis mengandung 500 mg antioksidan, dan buah goji 500 mg dengan 40% polisakarida(Barron, 2008).
2.5.1 Polifenol Polifenol merupakansuatu komponen non-nutrient yang banyak dijumpaipada buah, coklat, kacang-kacangan kering, sayuran, sereal, dan minuman. Buahbuahanmisalnyapir, anggur, berry, cherry, dan apel mengandung setidaknya 200300 mg polifenol per 100 gram takaran buah segar. Segelas teh atau kopi atau satu gelas anggur merah mengandung sekitar 100 mg polifenol. Polifenol yang terdapatpada makanan bisa memberikan rasa pahit, rasa, warna, dan bau yang khas. Antioksidan yang terdapat dalam polifenol sangat besar dapat mencapai 1g/d, lebih tinggi dibandingkan dengan kandungan yang adadalam fitokimia yang lain. Contohnya 10 kali lebih tinggi dibandingkan dengan Vitamin C dan 100 kali lebih tinggi bila dibandingkan dengan mengkonsumsi Vitamin E dan karotenoid (Scalbert et al., 2005)
30
Gambar 2.5 Bentuk Molekul Polifenol
Bioavailabilitas yaitujumlah nutrisi yang bisa dicerna, diabsorbsi, dan melewati tahap metabolisme normal. Bioavailabilitas masing-masing polifenol berbeda satu dengan yang lainnya. Tidak adaketerkaitan antara banyaknya polifenol yang dikonsumsi lewat makanan dengan bioavailabilitasnya yang terdapat dalam tubuh manusia. Komponen polifenol melalui pre-hidrolisa terlebih dahulu oleh enzim intestinal dan oleh koloni mikroflora usus, sebelum diabsorbsi tubuh. Polifenol akan terkonjugasi lalu terjadi metilasi, sulfasi danglukoronidasi di hati. Karena bentuk yang beredar dalam darah dan jaringan berbeda sehingga susah untuk mengidentifikasi metabolit dan mengukur aktivitas biologisnya. Yang paling
31
penting untuk menentukan laju dan tingkat absorbsi yaitu struktur kimia polifenol, bukan dari konsentrasinya. Tempat absorbsi antar komponen polifenol juga berbeda-beda, banyak yang diabsorbsi di traktus gastro-intestinal, intestinal, atau bagian traktus digestivus lainnya (Bohn, 2014). Kandungan polifenol buah delima merah yang diperiksa di UPT Laboratorium Kimia Analitik Universitas Udayana adalah 1,56 mg/ml (Yuniari, 2015)
32
2.5.2 Antosianin Antosianin adalah suatu jenis polifenol grup flavonoid yang palingbanyak ditemukan pada buah-buahan dan sayuran. Antosianinadalah pigmen yang dapatlarut dalamair, memberi warna merah, ungu dan biru pada banyak buahbuahan, sayuran, bunga dan biji-bijian(Wang dan Stoner, 2008). 2.5.3 Struktur Kimia Antosianinadalah
derivatif
polihidroksi
atau
polimetoksi
dari
2-
fenilbenzopiriliumyang terglikosilasi, mengandung 2 cincin benzoyl (A dan B) yang dipisahkan oleh cincin heterosilik(C) (Gambar 2.6). Dengan kata lain, antosianin adalah senyawa antosianidin dan glukosadalamasamorganik. Ada 6 jenis antosinidin yang ditemukan dalamtanaman, yaitu cyanidin, delphinidin, malvidin, pelargonidin, peonidin dan petunidin(Shipp dan Abdel-Aal, 2010).
Gambar 2.6 Struktur 6 jenis antosianidin, dalambentuk glukosida dengan glukosa.
33
2.5.4 Efek Fisiologis Antosianin
paling
dikenal
sebagai
antioksidan.
Beberapa
penelitianmenunjukkan bahwa selain sebagai antioksidan, antosianin juga mempunyai efek anti-inflamasi,efek anti-diabetik, anti-kanker, dan dapat memperbaiki profil lipid darah dan memiliki efek vasoprotektif (Wrolstad, 2001; Shipp dan Abdel-Aal,2010). Struktur fenolik antosianin bertanggung jawab dalamefek antioksidannya, yaitugugus hidroksil pada posisi 3 dari cincin C dan posisi 3’, 4’, 5’ dari cincin B. Sebagai antioksidan, antosianin bekerja sebagai scavengerROS seperti superoksid (O2- ), singlet oksigen (‘O2), peroksida (ROO-), hidrogen peroksida (H2O2) dan radikal hidroksil (OH.) (Wang dan Stoner, 2008). Mekanisme
efek
antosianin
sebagai
anti-inflamasi
memang
belumdiketahui, tapi suatu penelitianin vitromenunjukkan bahwa administrasi antosianindapat menurunkan aktivasi faktor transkripsi NFKB dan menurunkan ekspresi beberapasitokin dan mediator proinflamasi (Karlsen et al., 2007). Suatu penelitian epidemiologi menunjukkan penurunan insidens penyakit-penyakit inflamasi pada populasi yang mengkonsumsi makanan kaya polifenol (Spormann et al., 2008), dan konsumsi antosianin menunjukkan berkurangnya risiko penyakit kardiovaskular, diabetes, arthritis dan keganasan (Wang dan Stoner, 2008).
2.6 Delima Buah delima(Punica granatum) dikenal juga sebagai pomegranate (bahasa Inggris) merupakan tanaman buah-buahan yang bisa tumbuh hingga mencapai 5-8
34
m. Delimaadalah tumbuhan asli Persia dan daerah Himalaya di India Selatan. Tumbuhan ini diperkirakan berasal dari Iran, tetapi telah lama dikembangbiakkan didaerah Mediterania. Delima dipercayaada di Indonesia sejak dibawa para pedagang Persia pada tahun 1416. Ada beberapa namadelima diberbagai daerah diIndonesia, seperti disebut delima oleh Melayu di Sumatera,gangsalan (Jawa), glima (Aceh), glineu mekah (Gayo), dhalima (Madura), dalima (Sunda), teliman (Sasak), lele kase dan rumu dari Timor (Heber dan Schulman, 2006).
Tabel 2.2 Klasifikasi Ilmiah Tanaman BuahDelima (Bhowmik et al., 2013) Kingdom
Plantae
Sub-Kingdom
Tracheobionta - Tumbuhan berpembuluh (Vascular Plants) Spermatophyta - Tumbuhan yang menghasilakan biji(Seed
Superdivisi Divisi
plants) Magnoliophyta – Tumbuhan berbunga(Flowering plants) Magnoliopsida – Tumbuhan dikotil / berkeping
Kelas
dua(Dikotiledon)
Sub-kelas
Rosidae
Ordo
Myrtales
Famili
Punicaceae - Pomegranate family
Genus
Punica L. – pomegranate
Species
Punica granatum L. – pomegranate
Punica malus Sinonim Berdasarkan warna buahnya, terdapat tiga jenis delima yang tersebar di Indonesiayaitu delima putih, delima merah, dan delima ungu/hitam. Delima merah adalah yang paling terkenal dari ketiga jenis tersebut.
35
I. Buah delima putih Buah delima ini bijinya berwarna putih dan rasanya lebih sepat bila dibandingan dengan jenis delima yang lain karena mengandung tanin yang lebih banyak. Sudah agak jarang ditemukan.
Gambar 2.7 Buah Delima Putih (Rahmadsyah dan Riana, 2015) II. Buah delima merah Delima merah ini mempunyai biji yang banyak dan berwarna merah.Banyak disajikan saat menjelang Tahun Baru Imlek bagi masyarakat Cina. III. Buah delima ungu/hitam Delima ini bijinya bewarna ungu. tanaman ini seringkali ditanam di pekarangan rumah sebagai tanaman hias.
36
Gambar 2.8 Buah Delima Merah (Abbasy, 2015)
Gambar 2.9 Buah Delima Ungu (William, 2015)
37
Komposisi kandungan fitokimia terbesar dalam delima ialah polifenol yang terdapat pada buahnya. Polifenol yang terdapat didalam delima meliputi flavonoid (flavanol, dan antosianin), tannin terkondensasi (protoantosianidin), dan tannin terhidrolisa (ellagitannin yaitu punicalagin dan gallotannin). Sedangkan kulit delima mengandung flavonoid (flavonol) seperti quercetin, luteolin dan kaempferol, serta pada kulit biji terdapat antosianin (Li et al., 2006). Bioaktivitasfitokimia dari buah delima antara lain ialah agen antiaterogenik dan antioksidan. Penelitian secara in vitro dan in vivo pada sel endotel koronaria yang dilakukan pada tikus hiperkolesterolemia membuat aktivasi faktor transkripsi ELK-1 dan p-JUN menurun serta meningkatkan ekspresi dari eNOS, efek ini berkaitan dengan aktivitas aterogenik. Penelitian lain dengan buah delima ditambah minuman anggur bisa menghambat Tumor Necrosis Factor α (TNF –α) dan aktivasi Nuclear Factor KappaB (NF-КB) pada sel endotel vaskular (Barron, 2008). Buah delima juga dipercaya efektif dalam menurunkan faktor risiko penyakit jantung, status oksidatif oleh makrofag, oksidasi LDL, dan formasi sel foam. Oksidasi LDL oleh makrofag peritoneal pada tikusmenurun hingga 90% sesudah
mengkonsumsi sari buah delima. Sari buah delima juga dapat
menurunkan aktivasi
sinyal kimia yang berperan merangsang terbentuknya
metastasis kanker prostat menuju tulang. Kulit buah dan kulit pohon delima sering dipakai pada pengobatan tradisionaluntuk obat diare, disentri, dan parasit usus. Air dan biji buah delima
38
berfungsi
untuk
mencerahkan
mengobati
gejala
sakit
jantung,
kulit,mengencangkanpayudara,
kerongkongan,
hemorrhoid
serta
mata, untuk
menghentikan perdarahan hidung serta gusi. Biji delima juga bisa digunakan untuk mencegah pembekuan trombosit sehingga mencegah terbentuknya plak di jantung dan arteri (Bhowmik, 2013).
Tabel 2.3 Kandungan Delima per 100 gram Takar (Bhowmiket al., 2013)
Kandungan
Kadar
Air Kalsium Protein Fosfor Lemak Besi Mineral Vitamin C Karbohidrat Vitamin B Kompleks Serat Kalori
78,00% 10 mg 1,60% 70 mg 0,10% 0,3 mg 0,70% 16 mg 14,50% Sedikit 5,10% 65
Kandungan kimia pada buah delima antara lain oleat, icosanoic, linoleat, asam
sitrat,
palmitat,
punicic, asam
stearat,asam
klorogenik,
asama
malic,flavanoid, fenol seperti asam gallic, asam protocatechuic, asam caffeic, asam ferulic, asam o- dan p-coumaric,phloridzin, katekin,dan quercetin. Buah delima juga kaya akan antioksidan polifenol seperti asam ellagic, antosianin, dan punicalagin (Pandey dan Rizvi, 2009).
39
2.7 Tikus Wistar (Rattus norvegicus) 2.7.1 Klasifikasi Tikus Wistar Penelitian ini menggunakan tikus wistar jantan karena ukuran yang lebih besar dibanding tikus-tikus jenis lain sehingga memudahkan untuk proses pengambilan sample urin yang akan diperiksa untuk mengetahui kadar F2isoprostan yang dipakai sebagai biomarker berhubungan dengan stress oksidatif. Berikut beberapa ciri dari tikus wistar, Tikus Wistar berukuran lebih besar daripada famili tikus pada umumnya dimana ukuran tikus inibisa mencapai 40 cm yang diukur dari hidung sampai ujung ekor dengan berat 140-500g. Tikus betina biasanya memiliki ukuran lebih kecildibandingkan dengan tikus jantan, warnyanya kecoklatan,kadang terdapat bercak putih atau hitam, serta mempunyai ukuran ekor yang lebih panjang dari tubuhnya. Kematangan seksual pada tikus jantan biasanya berkisar pada umur 3 bulan sedangkan pada tikus betina pada umur 4 bulan(Kusumawati, 2004). Tikus ini dapat hidup hingga 4 tahun.
Tabel 2.4 Data Biologi Tikus (Russel et al., 2008)
No. 1.
Kondisi Biologi
Jumlah
Berat badan : - Jantan
300-400 g
- Betina
250-300 g
2.
Lama hidup
2,5 – 3 tahun
3.
Temperatur tubuh
37,5o C
4.
Kebutuhan : - air
8-11 ml/100g BB
40
- makanan
5 g/100g BB
5.
Pubertas
50-60 hari
6.
Lama kehamilan
21-23 hari
7.
Tekanan darah : - sistolik
84-184 mmHg
- diastolik 8.
Frekuensi : - Jantung - Respirasi
9.
Tidal Volume
58-145 mmHg 330-480/menit 66-114/menit 0,6-1,25 mm
Klasifikasi Tikus Wistar menurut Armitage (2006) dalam (Russel et al., 2008) adalah sebagai berikut :
Tabel 2.5 Klasifikasi Tikus Wistar (Russel et al., 2008)
Kingdom
Animalia
Filum
Chordata
Kelas
Mamalia
Ordo
Rodentia
Famili
Muridae
Genus
Rattus
Spesies
Rattus norvegicus
41
Gambar 2.10 Tikus Wistar (Rattus Norvegicus)
2.7.2 Pemantauan Keselamatan Tikus Saat menggunakan tikus sebagai hewan coba, harus memperhatikan halhal sebagai berikut seperti : kandang yang harus kuat, tidak mudah rusak, mudah di bongkar pasang, mudah untuk di bersihkan, tahan dari gigitan tikus, sehingga tikus tidak mudah lepas. Selain itu juga perlu hewan harus tampak jelas dari luar. Tempat tidur beralaskan sekam yang mudah menyerap air. Kelembaban, suhu dan pertukaran sirkulasi udara didalam kandang harus baik (Ngatidjan, 2006). Kandang dibersihkan setiap hari dan alas tidur diganti, tangan perawat harus selalu bersih ketika merawat tikus. Peneliti harus memperhatikan jika muncul gejala sakit seperti penurunan berat badan, sukar bernafas ataupun diare.
