OBSAH 1. ÚVOD…………………………………………………………………………..
1
2. CÍL……………………………………………………………………………...
2
3. TEORETICKÁ ČÁST…………………………………………………………
3
3.1. Charakteristika biogenních aminů…………………………………….
3
3.2. Rozdělení biogenních aminů podle chemické struktury……………...
3
3.3. Vznik biogenních aminů………………………………………………...
4
3.4. Biologické účinky biogenních aminů…………………………………..
5
3.5. Legislativa a hygienické limity biogenních aminů…………………….
8
3.6. Toxicita biogenních aminů……………………………………………...
10
3.7. Nejdůležitější bakteriální druhy produkující biogenní aminy……….
12
3.8. Startovací kultury……………………………………………………….
12
4. Nejvýznamější faktory ovlivňující výskyt biogenních aminů…………..
13
5. Výskyt biogenních aminů a jejich obsahy v daných potravinách……...
17
5.1. Obsah biogenních aminů v rybách…………………………………...
18
5.2. Obsah biogenních aminů v sýrech……………………………………
18
5.3. Obsah biogenních aminů v salámech………………………………...
23
4. STANOVENÍ VODNÍ AKTIVITY V RÁMCI STANOVENÍ BA………….
25
4.1. Úvod…………..………………………………………………………….
25
4.2. Graficky zpracované výsledky neměřených hodnot vodní aktivity….
27
4.3. Fotograficky zpracované výsledky naměřených vlhkostí…………….
29
4.4. Ukázka naměřených hodnot vodní aktivity z programu Novalog…...
30
5. ZÁVĚR…………………………………………………………………………
31
6. SEZNAM LITERATURY…………………………………………………….
32
1. ÚVOD V dnešní době se stále více spotřebitelů zajímá o zdravotní nezávadnost potravin. Na tento požadavek reaguje legislativa České republiky tak i legislativa ostatních států Evropské unie a dalších vyspělých států světa. V ČR jsou požadavky na jakost a zdravotní nezávadnost potravin definovány podle zákona č. 110/1997 Sb., o potravinách a tabákových výrobcích a podle vyhlášek č. 294/1997 Sb., o mikrobiologických požadavcích a č. 298/1997 Sb., o chemických požadavcích na zdravotní nezávadnost potravin. Spotřebitelé si všímají nejen látek přidávaných do výroby potraviny, a které mají negativní vliv na lidské zdraví ale i toxikologicky významných látek vznikajících při samotné výrobě potraviny. Do této skupiny toxikologických látek patří i biogenní aminy. Jde o látky vznikající z aminokyselin chemickými nebo enzymově katalyzovanými reakcemi. Na každého jedince mají biogenní aminy jiný vliv, který je navíc ovlivněn zdravotním stavem spotřebitele, příjmem léků nebo i genetickými dispozicemi. Největší množství biogenních aminů se vyskytuje ve fermentovaných potravinách živočišného původu a to jak tepelně opracovaných tak i neopracovaných. Vznik biogenních aminů ovlivňuje spousta faktorů, které se výrobci snaží minimalizovat. Tato bakalářská práce se zabývá obsahem biogenních aminů ve fermentovaných potravinách živočišného původu.
1
2. CÍL Cílem této bakalářské práce bylo podat přehled o obsahu biogenních aminů ve fermentovaných potravinách živočišného původu, včetně pojednání o nejvýznamějších faktorech ovlivňujících výskyt biogenních aminů v uvedeném typu potravin.
2
3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1. Charakteristika biogenních aminů
Biogenní
aminy
jsou
skupinou
alifatických,
aromatických
nebo
heterocyklických bází odvozených od aminokyselin, které vykazují různé biologické účinky. Některé biogenní aminy mají samy významné biologické vlastnosti, neboť jsou například tkáňovými hormony (histamin), protoalkaloidy (hordenin, gramin) a stavebními látkami, které se účastní biosyntézy dalších hormonů živočichů (fenylethylamin), fytohormonů neboli auxinů, alkaloidů a dalších sekundárních metabolitů rostlin.
3.2. Rozdělení biogenních aminů podle chemické struktury
● alifatické - alifatické diaminy H 2N
(CH 2 ) 4
NH
H 2N
2
putrescin
(CH 2 ) 5
NH 2
kadaverin
- alifatické polyaminy
H 2N
(CH 2)3
(CH 2)4
NH
NH 2
spermidin
H 2N
(CH 2)3
NH
(CH 2)4
NH
(CH 2)3
spermin NH H2 N
C
(CH2)4
NH
agmatin
3
NH2
NH 2
● aromatické
CH2
CH2
NH2
CH2
OH
fenylethylamin
CH2
NH2
tyramin
● heterocyklické
CH2
N
CH2
NH2
CH2
N H
CH2
NH2
N H
histamin
tryptamin
3.3. Vznik biogenních aminů Až donedávna byly tyto látky chápány jako jedna skupina přírodních látek. Nyní se však uvádějí jako dva typy příbuzných látek, a to z hlediska jak vzniku, tak biologických účinků. Biogenní aminy vznikají z aminokyselin působením dekarboxyláz (dekarboxyláz obsahujících jako kofaktor pyridoxalfosfát) nebo z aminokyselin a karbonylových sloučenin působením transaminas. Při jejich transformaci na další biologicky aktivní produkty se uplatňují některé oxygenázy a methyltransferázy. Z histidinu vzniká jako produkt dekarboxylace histidindekarboxylasou histamin. Z lysinu vzniká působením lysindekarboxylasy kadaverin. Dekarboxylací argininu vzniká agmatin a dále putrescin. Ten vzniká také přímo dekarboxylací ornithinu
4
ornithindekarboxylasou.
Z putrescinu
vzniká
methylací
S-adenosylmethioninem
spermidin a dále spermin. Dekarboxylací fenylalaninu vzniká 2-fenylethylamin, z tyrosinu tyramin a jeho oxidací oktopamin. Bakterie způsobující dekarboxylaci aminokyselin patří do mnoha rodů, zejména Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella a Shigella, dekarboxylázy aminokyseli se vyskytují i v mléčných bakteriích rodu Lactobacillus, Pediococcus a Streptococcus. Situaci však komplikuje skutečnost, že i v rámci určitého druhu existují kmeny s dekarboxylační schopností i bez ní. Dekarboxylační aktivita mezi kmeny určitého druhu se může lišit dokonce až o tři řády. Odstranit alespoň část vytvořených biogenních aminů (BA) z potravin je komplikované, rozhodující je však omezit jejich vznik. Toho lze dosáhnout dodržováním zásad správné výrobní praxe, směřujících k potlačení nežádoucích skupin bakterií. Mezi polyaminy (PA) se řadí putrescin a z něj vznikající spermidin a spermin. Tyto dva aminy nevznikají bakteriální činností, ale biochemickou syntézou v živých organismech od bakterií po člověka. Putrescin se tedy vyskytuje v jakési dvojroli – svým vznikem patří mezi BA, ale tím, že z něj vznikají ״přirozené polyaminy ״spermidin a spermin, se řadí i mezi polyaminy (Kalač, Křížek, 2005).
Pro vznik BA jsou tedy třeba tři podmínky: - výskyt volných aminokyselin - bakterie vybavené dekarboxylasami - prostředí příznivé pro pomnožení těchto bakterií
3.4. Biologické účinky biogenních aminů Biogenní aminy mají v organismu řadu funkcí a mohou zásadně ovlivnit pohodu a zdraví člověka. Pro životní funkce jsou nepostradatelné některé monoaminy – zejména katecholaminy a serotonin. Serotonin je neurotransmiterem v mozku, účastní se například vzniku nálady a také je součástí krevních destiček a tak napomáhá zastavit krvácení, zužuje cévy. Účastní se také zánětlivých a alergických reakcí (Vokurka a kol., 2000).
Katecholaminy
jsou
hormony
nadledvinek,
které
se
uplatňují
jako
neurotransmitery a také při řízení krevního tlaku. Dopamin a noradrenalin zvyšují krevní tlak. Adrenalin rozšiřuje cévy a podporuje srdeční činnost. Zvyšují obsah
5
glukózy v krvi. Uplatňují se tak v situacích, kdy organismus překonává zátěžové situace jako hlad, infekci nebo stres. Další významnou skupinou jsou polyaminy, které mají vliv na růsta množení buněk, což je příznivé například při hojení ran, ale nažádoucí pro růst nádorů (Kalač, Křížek, 2000). Při hodnocení toxicity je nutno zvažovat nejen přítomnost konkrétního aminu, ale i ostatních faktorů jako množství spotřebované potraviny, přítomnost jiných toxických látek atd. Z tohoto důvodu je velmi těžké stanovit hranici toxicity jednotlivých biogenních aminů (Velíšek, 2002). Produkci biogenních aminů v potravinách ovlivňují : - volné aminokyseliny -
pyridoxalfosfát
-
příznivý růst podmínek pro mikroorganismy
-
mikroorganismy tvořící dekarboxylázy
-
dostupnost aminů a deaminů
-
mikroorganismy které produkují dekarboxylasy se přirozeně mohou nacházet v produktu nebo můžou být přenesené, během nebo po procesu produktů. V kvasitelných produktech, startovací kultura může přímo ovlivňovat produkci biogenních aminů nebo mohly produkovat tyto substance interakcí se znečištěními mikroorganismy. Zvláštní podmínky (syrové mléko/optimální pH/mikrobi/přidání syřidla/prodloužený zrající čas) zdá se, že umocní produkci biogenních aminů během zrání sýrů.
Biogenní aminy jsou pro organismus nepostradatelné, ale ve vysokých koncentracích se mohou projevovat jako látky: • psychoaktivní • vasoaktivní Psychoaktivní aminy působí jako přenašeči v centrálním nervovém systému, vasoaktivní aminy působí přímo nebo nepřímo na vaskulární systém. Vasoaktivní aminy se dle účinku dělí na : • vasokontraktibilní (např. tyramin) • vasodilatační (např. histamin)
6
Nejčastěji vznikají biogenní aminy při fermentačních procesech. Není proto problém je najít např. ve zrajících sýrech, fermentovaných masných výrobcích, pivu nebo vínu. Velmi často se však BA vyskytují v některých typech ryb (tuňák, makrela), a to ne jako důsledek fermentačního procesu, ale při nedodržení hygienických podmínek při zpracování ryb a porušení chladírenského řetězce. Důvodem, proč se biogenní aminy vyskytují ve větší míře u určitých druh ryb, je jednak zvýšený obsah příslušných aminokyselin, a to především histidinu, a také fakt, že v rybách s tmavým masem je vyšší obsah volného histidinu než v bílém rybím mase nebo v mase jatečných zvířat. Důležitým předpokladem pro tvorbu biogenních aminů je přítomnost určitých mikroorganismů, které mají schopnost dekarboxylovat příslušné aminokyseliny. Mezi nejdůležitější mikroorganismy s výraznou produkcí dekarboxyláz patří Proteus morganii, Klebsiella pneumonie a Hafnia alvei (Steinhauserová, 2004). Největší nebezpečí tvorby BA je při vysoké mikrobiální kontaminaci ryb a při nedodržení chladírenského řetězce. Nejčastěji se BA tvoří ihned po vylovení ryb, které nejsou patřičně zchlazeny na teplotu kolem +1°C. Další rizikovou operací je tepelné opracování, především uzení ryb, hlavně makrel. Záleží hlavně na době od přípravy ryb na uzení k vlastnímu tepelnému ošetření. Pokud je tato doba dlouhá a ryby jsou vystaveny vyšším teplotám, dochází k pomnožování mikroorganismů. Uzení ryb probíhá za nižších teplot a některé mikroorganismy proces uzení mohou přežít, ve vhodných podmínkách se pomnožovat a tvořit především histamin (Steinhauserová, 2004). Z BA jsou zdravotně nejzávažnější histamin, tyramin a fenylethylamin. Ovlivňují krevní tlak – histamin jej snižuje, další dva zvyšují. Histamin má rovněž psychoaktivní účinky. Projevy otravy jsou nervové a kožní (dýchací potíže, bušení srdce, bolesti hlavy, pálení v ústech). Zdravý člověk je pro obvyklý příjem BA vybaven dostatečně účinným detoxikačním mechanismem, a to střevními enzymy aminooxidasami. Detoxikační kapacita je však omezena v dětství a snižuje se rostoucím věkem. Aktivitu nejúčinnějšího z těchto enzymů, monoaminoxidasy (MAO), snižuje alkohol ale ještě podstatněji některé léky, ze skupiny psychofarmak. Pro pacienty léčené těmito léky představuje hrozbu hlavně tyramin. Aktivitu enzymu diaminooxidasy (DAO), který se podílí na odbourávání netoxických diaminů putrescinu a kadaverinu, snižují např. léky Ambroxol a Acetylcystein (Kalač, Křížek, 2005).
7
Individuální reakce na BA způsobují, že dosud nejsou stanovena riziková množství příjmu jednotlivých aminů, která by byla pokládána za obecně platná. Pro histamin se vesměs uvádějí hodnoty 8-40 mg jako dávka vyvolávající projevy lehké otravy, 40-100 mg otravy střední a nad 100 mg silné intoxikace. Pro tyramin se uvádí, že příjem 10-80 mg může vyvolat otoky, nad 100 mg migrénu. Pro třetí toxikologicky nejzávažnější z BA, fenylethylamin, zatím obdobné údaje nejsou k dispozici. Biologické role spermidinu a sperminu jsou odlišné. Podílejí se především na syntéze nukleových kyselin a bílkovin. Proto je jejich obsah vyšší v mladých a metabolicky aktivních rostlinných pletivech a živočišných tkáních, mj. i ve tkáních nádorových. Je však třeba zdůraznit, že polyaminy nejsou karcinogeny, nejsou tedy iniciátory nádorového bujení. Lidský organismus využívá polyaminy ze tří zdrojů: vytvářené vlastní biosyntézou z aminokyselin, produkované střevními bakteriemi a přijímané potravou. Proto se jako jedna z cest zastavení, či alespoň zpomalení růstu nádorů ověřuje snížení příjmu či využitelnosti potravních polyaminů. Polyaminy obsažené v potravě však mohou být i žádoucí pro intenzivnější tvorbu či regeneraci tkání. U zdravého člověka je nadbytečný příjem polyaminů odstraněn střevními enzymy polyaminooxidasou (PAO) a již zmíněnou DAO, spermidin a spermin proto nejsou pokládány za zdravotně rizikové. Zatím však není stanovena výše jejich potřeby (Kalač, Křížek, 2005). Putrescin a kadaverin jsou považovány za indikátory nežádoucích přeměn bílkovin. Zvýšený výskyt biogenních aminů v potravinách se proto považuje za nežádoucí. S rozvojem poznání se však mění pohled na roli polyaminů, které se zřejmě podílejí na růstu a množení buněk. To se může příznivě projevit např. při hojení ran, avšak zcela nežádoucí jsou tyto aktivity pro např. pro růst nádorů (Smělá a kol., 2004).
3.5. Legislativa a hygienické limity biogenních aminů Nejvyšší přípustné obsahy biogenních aminů v potravinách jsou v jednotlivých zemích stanoveny různě. Často se týkají potravin významných pro danou zemi – např. mořských ryb a výrobků z nich v přímořských zemích či vína v zemích s jeho velkou spotřebou. Ve vyhlášce MZd č. 298/1997 Sb. Bylo stanoveno nejvyšší přípustné množství histaminu 200 mg.kg-1 v rybách a rybích výrobcích a jeho přípustné množství 20 mg.kg-1 v pivu a vínu. Druhým aminem byl tyramin s přípustným množstvím 50, 100 a 8
200 mg.kg-1 pro červené víno, potraviny konzumované ve významném množství a pro sýry. Ustanovení aktuálně platné Vyhlášky MZd č. 305/2004, harmonizované s legislativou EU, uvádí pouze přípustné množství histaminu 100 mg.kg-1 v rybách a rybích výrobcích s tím, že uvedený obsah může být u dvou z devíti vzorků odebraných z jedné šarže překročen až do 200 mg.kg-1. Obsah histaminu v rybách a rybích výrobcích je do 50 mg/kg bezpečný, obsah v rozmezí 50-200 mg/kg se považuje za potenciálně toxický, 200-1000 mg/kg za pravděpodobně toxický a nad 1000 mg/kg za velmi toxický a nebezpečný pro konzumaci (Kalač, Křížek, 2000). V české republice je NPM pro histamin v rybách a rybích výrobcích 200 mg/kg. Přípustná množství pro pivo a víno je 20mg/kg. Pro tyramin se za přijatelný obsah uvádí hodnoty v rozmezí 100-800 mg/kg. Ve vyhlášce 53/2002 Sb. je uvedeno přípustné množství pro červená vína 50 mg/kg a pro ostatní potraviny 100 mg/kg. Otoky může vyvolávat i obsah 10-80 mg/kg a hodnoty přes 100 mg/kg vyvolávají migrény Zatím v žádné zemi neurčuje legislativa výrobcům deklarovat obsah histaminu a tyraminu v potravinách. Takovýto údaj by však jisté ocenili především jedinci trpící migrénami a dietologové. Pro výrobce by však tato povinnost byla značně obtížná, což vyplývá z již uvedeného velkého kolísání obsahu aminů v rámci určitého druhu potraviny. Výzkum by proto měl vyvinout jednoduché, rychlé a levné, alespoň semikvantitativní metody stanovení obsahů především histaminu a tyraminu v potravinách. Doposud byly stanoveny pouze limitní hodnoty pro histamin a tyramin. Pro ostatní BA nebyly hygienické limity ještě přesně určeny, neboť toxické dávky lze jen velmi těžko stanovit vzhledem k individuálním dispozicím každého jedince a také vzhledem k synergickému efektu některých polyaminů (putrescin), které mohou nepříznivou situaci ještě zhoršovat (Bover-Cid a kol., 2000b). Některé země legislativně stanovily maximální přípustné množství histaminu v některých potravinách. Maximální přípustné množství bylo stanoveno například pro ryby ve Francii (NPM = 100mg/kg), ve Švédsku a Izraeli (NPM = 200mg/kg) (Kalač, Křížek, 2000). Nejméně naměřených údajů pro stanovení hygienických limitů existuje pro PEA. Za přijatelné hodnoty se považuje koncentrace do 30 mg/kg.
9
3.6. Toxicita biogenních aminů Při hodnocení toxicity je nutno zvažovat nejen přítomnost konkrétního aminu, ale i ostatních faktorů jako množství spotřebované potraviny, přítomnost jiných toxických látek atd. Také z tohoto důvodu je velmi těžké stanovit hranici toxicity jednotlivých biogenních aminů (Velíšek, 2002). Předpokládá se, že příjem 2 - 10 mg histaminu denně na osobu se považuje za netoxickou dávku . Toxikologické množství se mění při příjmu 70 až 1000 mg, podle vnímavosti jednotlivé k této substanci. Předpokládá se dále, že příjem dávky nad 100 mg histaminu obvykle bude vyvolávat otravné symptomy. Málo je známo o toxikologické dávce dalších biogenních aminů. Pro tyramin, zákonné omezení z 100 – 800 mg/kg jsou zmíněné pro potraviny, pro fenylethylamin, 30 mg/kg. Sýr je nejběžnější jídlo spojené s otravou histaminem.Tyramin a fenylethylamin zase způsobují bolest hlavy. Další BA, které se našly v sýru byly tryptamin, putrescin a kadaverin. Stanovení toxické dávky je extrémně obtížné a liší se u každého jedince. Obsah biogenních aminů do 40 mg.kg-1 v jídle je považované za potenciální toxicitu. U významných aminů jako je histamin, tyramin a fenylethylamin se toxicita liší. Spanjer a van Rood navrhli, že suma tyraminu, histaminu, putrescinu a kadaverinu by neměla přesahovat 900 mg.kg-1 v sýru. Uvedli, že v EU a USA není stanovena zákonná horní mez biogenních aminů kromě histaminu. To platí pro sýry i pro ryby. Tyramin a fenyletylamin způsobují zvýšení krevního tlaku a migrény (Křížek, 1999). Putrescin, kadaverin, agmatin a tryptamin jsou méně toxické než histamin.
Toxicita histaminu Histamin projevuje svou toxicitu pomocí interakcí s receptory na buněčných membránách. Ovlivňuje nervový systém, cévní soustavu, trávící a dýchácí soustavu. Způsobuje bolesti hlavy, třes, pocení a návaly horkosti spojené se závratěmi. Kůže červená a objevuje se vyrážka kolem úst. Podílí se na kontrakcích intestinálního hladkého svalstva a je odpovědný za břišní křeče, průjmy a zvracení (Silla Santos,1996). Histamin, který může zasahovat do řady fyziologických funkcí, je dvojího původu. V lidském organismu je uložen v žírných buňkách a v basofilních granulocytech, což je jeden z druhů bílých krvinek. Odtud se při alergické reakci uvolňuje do krevního oběhu. Druhým zdrojem je potrava. 10
Příjem histaminu potravou může vést ke stejným potížím, jako jeho uvolnění z tělních depozit. Projevy jsou obdobné jako alergie na určité potraviny, takže se intoxikace často mylně diagnostikuje jako alergická reakce. Rychlost, s jakou se dostaví účinky po příjmu histaminu (někdy dokonce do pěti minut) nasvědčuje vstřebávání alespoň části histaminu , případně i dalších BA již z dutiny ústní, tedy dříve než může být detoxikován střevními aminooxidázami (Silla Santos, 1996). I když se pro otravu histaminem traduje zesilující účinek dalších současně přijatých BA, existují názory, že se tyto synergické účinky neuplatňují (Kalač, Křížek, 2005). Inkubační doba je vesměs do 30 minut po požití. Projevy obvykle trvají několik hodin, někdy však až několik dnů.
Metabolismus histaminu v lidském organismu je dvojí: -
dusík
v imidazolovém
cyklu
je
metylován
pomocí
histamin-N-
metyltransferasy za vzniku N-metyl-histaminu, který je dále oxidován MAO na N-metylimidazoloctovou kyselinu -
působením DAO je oxidován na imidazoloctovou kyselinu, která se váže na ribosu (Stratton a kol., 1991).
Toxicita tyraminu Tyramin je nejúčinnější ze skupiny tzv. vasoaktivních aminů, tj. látek, které zvyšují krevní tlak. Tyramin může při podávání léků inhibujících MAO vyvolat hypertenzní krizi se silnými bolestmi hlavy, krvácením do mozku i selháním srdce. Mírnější intoxikace tyraminu se projevují jako migrény (Kalač, Křížek, 2000). Poprvé bylo zvýšení krevního tlaku vyvolané tyraminem zjištěno po konzumaci sýrů u pacientů léčených inhibitory MAO v 60. letech. Proto se intoxikace tyraminem často označuje jako „reakce na sýry“ (angl. Cheese reaction).
11
3.7. Nejdůležitější bakteriální druhy produkující biogenní aminy ● Ve fermentovaných masných výrobcích: Pediococcus pentosaceus; Staphylococcus carnosus; Lactobacillus spp.; Pseudomonas spp.; Streptococcus spp.; Micrococcus spp.; čeleď Enterobacteriaceae ● V sýrech: Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, L. plantarum, L. casei, L. acidophilus, L. brevis; Streptococcus faecium, Streptococcus mitis; Bacillus macerans; Propionibacterium spp.; druh Leuconostoc ● V rybím mase: Proteus morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris; Klebsiella pneumoniae, Clostridium perfringens, Hafnia alvei, Enterobacter aerogenes, Bacillus spp.; Staphylococcus xylosus ● Ve fermentovaných nápojích: víno – Pediococcus cerevisiae pivo – kvasinky: Debaryomyces hansenii Candida famata ● V mléce se nachází Pseudomonas, Enterobacteriaceae a Micrococcaceae
3.8. Startovací kultury Startovací kultury jsou vybrané kmeny mikroorganismů, které jsou aplikovány do potravin během výroby za účelem vyvolání požadovaných změn. Výsledkem přídavku startovací kultury do díla při výrobě např. fermentovaných salámů je zajištění správného a rychlejšího průběhu zrání, snížení pH vlivem vytvořené kyseliny mléčné, redukce dusičnanů a dusitanů, štěpení bílkovin a lipidů, vytváření typického aroma a chuti a pevné textury. Startovací kultury nesmějí být patogenní a musí vykazovat příslušnou biochemickou aktivitu. V souvislosti s obsahem biogenních aminů spočívá význam startovacích kultur v tom, že inhibují růst kontaminující mikroflóry a tím nepřímo také tvorbu biogenních aminů, především putrescinu a kadaverinu. Přímo pak ovlivňují množství histaminu a tyraminu. Řada publikovaných studií (Masson a kol., 1996; Silla Santos, 1996) se zabývala schopností určitých druhů mikroorganismů používaných ve startovacích kulturách při výrobě fermentovaných masných výrobků produkovat biogenní aminy. Masson a kolektiv (1996) zjistili, že Lactobacillus plantarum a L. curvatus mohou produkovat velká množství biogenních aminů, celkově více než 200 mg/kg, zatímco u druhu Lactobacillus sakei nebyla prokázána zvýšená tvorba biogenních 12
aminů. Jeho použití do průmyslově vyráběných startovacích kultur je tedy velmi vhodné.
4. Nejvýznamnější faktory ovlivňující výskyt biogenních aminů
● Dostupnost substrátu: Přítomnost volných aminokyselin a cukrů (optimální koncentrace glukózy je 0,5 – 2 %)
● Teplota: (např. histaminu se tvoří při 5 °C řádově méně než při 20 °C) Analytické rozbory ukázaly (Greifová a kol., 2003), že Escherichia coli při všech sledovaných teplotách (teploty – 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 °C) produkovala kadaverin a putrescin. Optimální teplota růstu Escherichia coli je 37 °C. Již po devíti hodinách, při teplotě 37 °C začala Escherichia coli produkovat kadaverin, maximální obsah kadaverinu byl dosažen po 45 hodinách při teplotě růstu 10 °C. Za deset hodin, po naočkování potraviny při teplotě 37 °C začala Escherichia coli produkovat putrescin. Maximální obsah putrescinu byl dosažen po 70 hodinách, při teplotě 10 °C. Putrescin byl tvořený z argininu, zatímco přímý prekurzor pro tvorbu putrescinu (ornitin) se v substrátě nevyskytoval.
● pH: Enterobacter aerogenes produkoval lyzin- a histidin-dekarboxylázu přičemž vznikal kadaverin a histamin. Nejvyšší koncentrace kadaverinu byla při pH = 5,8 (2863 µg.ml-1) a histaminu při pH = 7,3 (330 µg.ml-1). Najvyšší rychlost nárustu u kadaverinu byla při pH = 5,8 a se stoupající hodnotou pH výrazně klesala. Nejvyšší rychlost nárustu u histaminu byla při pH = 7,3. Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium měly nejvyšší růstovou rychlost při pH = 7. Při vyšším pH rychlost klesala. Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium jsou schopné produkovat enzym tyrozindekarboxylázu, v důsledku čehož vzniká tyramin. Enterococcus faecalis produkoval 1,5 až 2 násobně vyšší koncentrace tyraminu než Enterococcus faecium (Greifová a kol., 2003). Specifická rychlost nárustu tyraminu sledovanými enterokoky byla nejvyšší při pH = 7. Růstová schopnost bakterií víc ovlivňuje tvorbu BA než podmínky růstu. Je třeba vzít do úvahy i fakt, že koncentrace buněk se výrazně podílí na na jejich tvorbě. 13
Značné spomalení nárustu kinetiky dekarboxyláz pozitivních mikroorganismů spolu s nízkou teplotou můžou redukovat zdravotní riziko spojené s přítomností těchto sloučenin v potravinách (Parente a kol., 2001).
● Přítomnost soli: Obecně inhibuje tvorbu BA, ale na druhé straně histamin nebo tyramin působí na některé bakterie osmoprotektivně a jeho syntéza je tedy v přítomnosti NaCl někdy zvýšena. Chlorid sodný se používá při výrobě mlékárenských, masových a rybích výrobků. Na+ ionty všeobecně podporují enzymatické reakce. Koncentrace soli do 2,2 % příznivě ovlivňuje rychlost nárustu tyraminu produkovaného E. faecium, avšak v případě E. coli rychlost nárustu tyraminu klesala (Greifová a kol., 2003). Beutling (1996) uvádí, že NaCl podporuje tvorbu aminů tak, že aktivuje enzym tyrozindekarboxylázu, i když v přítomnosti soli se shorší růst E. faecalis . Koncentrace soli (1,3 %) měla příznivý vliv na růst E. faecalis a E. faecium (Greifová a kol., 2003). Je důležité, aby počty mikroorganismů, které produkují biogenní aminy v potravinách, nepřesahovaly limity, které by mohly mít na lidské zdraví negativní účinek.
● Přístupnost kyslíku: Tento faktor je však nejednoznačný, protože na tvorbě BA se mohou podílet mikroorganismy aerobní, anaerobní i fakultativně anaerobní
● Doba skladování výrobku: V této oblasti se názory autorů rozcházejí, což je způsobeno jednak podmínkami pokusů a jednak různými druhy skladovaných potravin. Silla Santos (1996) uvádí, že skladovací teplota nemá prokazatelný vliv na obsah tyraminu v ančovičkách. Opačný názor uvedli Sayem–El–Daher a kol. (1984), že hladina tyraminu v potravinách živočišného původu je v pozitivní korelaci se skladovací teplotou a časem, zatímco koncentrace histaminu není podmínkami skladování ovlivněna. Mnoho autorů uvádí, že obsah biogenních aminů vzrůstá s časem a teplotou skladování (Suzzi, Gardini 2003). Silla – Santos (1996) uvádí vzrůstající koncentraci tyraminu a histaminu s časem a skladovací teplotou v sýrech. Komprda a kol. (2001) uvedli vyšší tvorbu biogenních 14
aminů u salámů skladovaných při pokojové teplotě (22 °C) ve srovnání se salámem skladovaným při chladírenské teplotě (4 °C). Stejně tak i Bover–Cid a kol. (2000b) uvedli u fermentovaných salámů skladovaných při teplotě 4 °C nižší koncentraci BA ve srovnání se salámy skladovanými při 22 °C. Při sledování biogenních aminů v průběhu fermentačního procesu při výrobě trvanlivého salámu se sledovaly koncentrace BA během skladování za laboratorní teploty ve vakuovém balení a v nebaleném stavu. Již po dvou týdnech skladování byl obsah tyraminu vyšší než připouští toxikologický limit, ke konci skladovací doby (doby minimální trvanlivosti) se koncentrace dokonce ztrojnásobila (Křížek, 1999). V případě vakuovaných salámů nebyl pozorován žádný vliv na obsah aminů. V případě polyaminů (spermidin, spermin) zůstavá obsah konstantní nebo se naopak snižuje, proto není nutné sledovat jejich obsah během celého procesu (Komprda a kol., 2001).
● Vodní aktivita Vysoké hodnoty vodní aktivity podporují dekarboxylázovou aktivitu a tím i tvorbu BA (Gonzáles-Fernándes., 2003).
● Dusitanové solící směsi
● Dodržování hygienických podmínek během výroby a skladování: Je nutná přísná aplikace hygienických zásad při získávání surovin i při jejich zpracování. Při zrání sýrů dochází k výrazné tvorbě biogenních aminů jen v provozech s nedostatečnou hygienickou úrovní, tedy vlivem kontaminující mikroflóry. Při dobré technologii a dodržování správných hygienických zásad obsahují i dlouhodobě zrající sýry jen poměrně malá množství biogenních aminů (Velíšek, 2002). Pro zabezpečení zdravotní nezávadnosti potravin je jedním z nejúčinnějších nástrojů systém HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points). Systém HACCP musí být aplikován při výrobě potravin a musí být zaměřen na zajištění zdravotní nezávadnosti (Komprda, 2004). ● Startovací kultury: 15
Při výrobě fermentovaných potravin je nutno vybírat startovací kultury bez dekarboxylázové aktivity (Komprda, 2004). Účinek startovací kultury se podílí na produkci biogenních aminů během zrání potravin. Pokud startovací kultura obsahuje mikroorganismy netvořící BA a naopak potlačují růst nativních MO podílejících se na tvorbě BA, pak můžeme výrazně snížit produkci biogenních aminů (Suzzi, Gardini, 2003). Startovací kultury nejsou vždy schopny „kontrolovat” kmeny s pozitivní dekarboxylázovou aktivitou. Rozpory ve schopnosti startovacích kultur redukovat tvorbu biogenních aminů, které pozorujeme, mohou být způsobené různou mikrobiologickou kvalitou výchozích materiálů (Suzzi, Gardini, 2003). Laktobacily ve startovacích kulturách soutěží s nativními bakteriemi během zrání a skladování a zabraňují tak nadměrné produkci biogenních aminů. Suzzi a Gardini (2003) uvádí, že Lactobacillus casei je schopen redukce obsahu BA (s vyjímkou tyraminu) i v přítomnosti laktobacilů s pozitivní dekarboxylázovou aktivitou. Podobné výsledky uvádí i Bover-Cid a kol. (2000a), kteří zmiňují pokles tvorby BA v salámu za přídavku startovací kultury obsahující Lactobacillus casei ve směsi s S. carnosus a S. xylosus. Bover-Cid a kol. (1999) zveřejnili velký rodíl v obsahu tyraminu mezi vzorky se dvěma růnými startovacími kulturami. Protože startovací kultura dokáže nejvíce ovlivnit vznik biogenních aminů, patří proto mezi nejdůležitější faktory, které dokáží koncentraci BA nejvíce ovlivňovat.
Faktory jako obsah soli,vodní aktivita, pH, přístupnost kyslíku mají na vznik BA značný podíl, ale jejich účinek není tak významný jako vliv startovací kultury, skladovacích podmínek a technologie výroby dané potraviny a s tím spojená přísná aplikace hygienických zásad. Z uvedených faktorů vyplývá, že tvorbu biogenních aminů při výrobě a uchovávání potravin lze potlačit. Nezbytné je používání výchozích surovin a materiálů s dobrou hygienickou kvalitou a také dodržování hygienických pravidel při výrobě a skladování. Tyto zásady vedou k inhibici mikroorganismů a tím k menší tvorbě biogenních aminů. Význam výše uvedených opatření je mimo jiné zdůrazněn termostabilitou BA. Již vytvořené biogenní aminy nelze zničit ani tepelnou úpravou při 200 °C.
16
5. Výskyt biogenních aminů a jejich obsahy v daných potravinách Obsahy biogenních aminů v potravině určitého druhu kolísají ve velmi širokých mezích, někdy až o dva řády. To téměř znemožňuje poskytnout lékařům věrohodné tabulkové údaje. Přesto se již podařilo nashromáždit značné množství informací o obsazích biogenních aminů a v menší míře i polyaminů a také poznatků o faktorech ovlivňujících jejich tvorbu v různých druzích potravin. Největší zájem je o histamin, jehož rozsáhlé databáze jsou např. v Německu nebo Dánsku (Kalač, Křížek, 2005). Z hlediska výskytu se obvykle potraviny dělí na nefermentované, v nichž biogenní aminy vznikají především činností hnilobných bakterií, a na fermentované, v nichž je rozhodující působení bakterií mléčného kvašení. Obvyklé obsahy jednotlivých obsahů aminů v potravinách se pohybují v řádu jednotek až desítek miligramů v kilogramu, hodnoty ve stovkách mg.kg-1 se již pokládají za vysoké až velmi vysoké. Vyjímečně dochází i k překročení hladiny 1000 mg.kg-1 (Kalač, Křížek, 2005). V mase, rybách a sýrech bývají hlavními biogenními aminy histidin, kadaverin, putrescin a tyramin. Při skladování masa dochází vlivem enzymové aktivity přítomné mikroflóry k růstu obsahu biogenních aminů, a obsah některých z nich lze proto využít jako indikátor čerstvosti masa (Velíšek 2002). Čerstvé vepřové maso např. obsahuje do 7 mg.kg-1 kadaverinu a putrescinu, zatímco zkažené maso 60 mg.kg-1 a více. Obsah biogenních aminů vzrůstá při výrobě fermentovaných salámů a některých sýrů. Tento nárust je patrný hlavně v počátečních fázích fermentace výrobků a je závislý na druhu přítomných mikroorganismů. Na vzniku biogenních aminů v trvanlivých salámech se mohou podílet mikroorganismy použité ve startovacích kulturách i mikroorganismy zpracovávané suroviny. Greif a kolektiv se zaměřil na měření biogenních aminů v masných výrobcích tepelně opracovaných a tepelně neopracovaných a konzerv z ryb (Greif a kol., 1997).
17
Tab.7. Jednotlivé koncentrace biogenních aminů u jednotlivých výrobků (mg.kg-1) (Greif a kol., 1997)
Vzorek dietní párky lovecký salám domácí klobása suchý salám treskový salát rybí salát tuňák-konzerva
Počet 6 3 8 3 4 4 3
Kadaverin (mg.kg-1) 80 – 167 105 – 190 24 – 140 14 – 255 0 – 15 1 – 20 20 – 180
Putrescin (mg.kg-1) 72 – 220 80 – 186 35 – 93 7 – 101 0 – 24 0 – 35 124 – 171
Histamin (mg.kg-1) 0 – 20 2 – 49 8 – 35 1 – 30 11 – 75 1–5 35 – 1820
Tyramin (mg.kg-1) 0 10 – 58 20 – 445 1 – 31 30 – 182 109 – 136 0 – 35
Z tabulky vyplívá, že nejvyšší koncentrace histaminu byla naměřena u tuňáka (1820 mg.kg-1).
5.1. Obsah biogenních aminů v rybách V čerstvém rybím mase je obsah biogenních aminů malý, např. v mase tuňáka bývá 0-10 mg.kg-1 histaminu a 0-2 mg.kg-1
tyraminu. Obsah BA však roste při
nevhodném skladování. Při skladování ryb při teplotách kolem 0 °C a nižších vznikají biogenní aminy v téměř zanedbatelném množství. Při vyšších teplotách je přítomnou mikroflóru dekarboxylován hlavně histidin a tkáně zejména makrelovitých ryb (Scrombroidae, kam patří hlavně tuňák a makrela) mohou obsahovat až 3000 mg.kg-1 (makrela) nebo dokonce 8000 mg.kg-1 histaminu (tuňák) (Velíšek, 2002). Minoritním BA zpravidla bývá agmatin, který se v mase a v mase ryb nachází běžně v množství 1-3 mg.kg-1.
5.2. Obsah biogenních aminů v sýrech Koncentrace BA v čerstvém mléku je nepatrná. V čerstvém mléku, mléčných nápojích a výrobcích, které nejsou fermentované se nacházejí aminy (propylamin, hexylamin, alifatické di- a polyaminy, histamin a tyramin) v malém množství (méně než 1 mg.kg-1). Obsah histaminu v mléku se pohyboval od 0,5 – 0,8 mg.kg-1. Co do četnosti otrav jsou z fermentovaných potravin nejzávažnější sýry. Zvlášť vysoké koncentrace biogenních aminů jsou v tvrdých a v plátkových sýrech, obsah však může mít u každého druhu značný rozptyl. Z hlediska množství jsou v popředí zájmu histamin a tyramin, přičemž u 2 – 3 % vzorků sýrů je třeba počítat s obsahy nad 1000 mg.kg-1. Fenylethylamin je zjišťován občas v množstvích 10 – 100 mg.kg-1. Výskyt biogenních aminů je v mléku nízký pod 1 mg.kg-1, ale v sýrech se udává až nad 1 g.kg-1
18
Množství tyraminu v sýru může dosáhnout hodnotu až 500 mg.kg-1, jestliže jsou přítomné proteolytické enzymy a tyramindekarboxylasa pozitivní kmeny Enterococcus faecalis subsp. Liquiefaciens (Parente a kol. 2001). Tvorba biogenních aminů v sýrech je závislá od koncentrace aminokyselin nebo peptidů, které účinkují jako prekurzory jejich tvorby, přítomnost bakterií schopných dekarboxylovat aminokyseliny, pH, koncentraci soli, vodní aktivity, doby zrání a skladování, množství mikroorganismů, a přítomnosti kofaktorů jako je pyridoxalfosfát (je ve velkém množství přítomný v sýrech). Podmínkou vzniku toxického množství BA v sýrech je proteolýza, která je při zrání sýrů považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňujících kvalitu sýra. Na proteolýze mléčných bílkovin se podílejí nativní proteázy z mléka, proteázy zákysových kultur, siřidlové enzymy, proteázy kontaminující mikroflóry, ale hlavně bakterie startovacích kultur (Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subs. Bulgaricus, Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium). Nejvyšší obsahy těchto aminů jsou v sýrech zrajících pod mazem (typu tvarůžků či romaduru) a v sýrech poloměkkých a plísňových. Další skupinou jsou sýry vyráběné z nepasterovaného mléka a za zhoršených hygienických podmínek (např. brynza). Ve tvrdých sýrech holandského typu jsou hladiny biogenních aminů nižší. Sýr vytváří ideální prostředí pro produkci aminů ale aminová koncentrace se široce mění a závisí na faktorech jako je např. druh sýrů, doba zrání a mikroflóra. Velká změna v obsazích BA byla také pozorována uvnitř každého druhu sýru, zvláště v sýrech vyrobených z nepasterizovaného mléka. V roce 2000 byl analyzován sýr Feta, pocházející z Řecka, a který patří do skupiny sýrů fermentovaných a zrajících ve slané vodě (Valsamaki, Michaelidou, 2000). K výrobě se využívá ovčí i kozí mléko, které mohou obsahovat startovací mikroorganismy. Znečištění ze sýrárny je také možné. Feta sýr je vyráběn tradiční metodou. Mléko k sýření bylo složeno ze 70 % ovčího mléka a 30 % kozího mléka, které bylo standardizované kaseinem ke ztučnění v procentech 0,8 a ošetřeno při teplotě 65 °C po dobu patnácti minut. Startovací kultura byla mezofilní a uvedena pod názvem Hansen R 703, typu 0. Za 120 dnů zrání byla vejvyšší koncentrace ve Feta sýru naměřena tyraminu (246 mg.kg-1).
19
Koncentrace histaminu ve zralém Feta sýru (za 60 dnů) byla 47 mg.kg-1.Ve 120 dnech se koncentrace zvýšila na 84,6 mg.kg-1. Tento obsah je mnohem nižší než u ementálu (Stratton a kol., 1991). Koncentrace putrescinu byla vysoká (77,7 a 193 mg.kg-1 v 60 a 120 dnech) (Valsamaki, Michaelidou, 2000). Podobné výsledky uvedli Parente a kol (2001). Celkový obsah BA ve Feta sýru za 120 dní byl 617mg/kg. Biogenní aminy obsažené ve Feta sýru byly tyramin, putrescin, histamin, kadaverin, tryptamin a fenylethylamin. Koncentrace tyraminu a putrescinu byly největší ze všech BA ve zralém sýru (69,7 % v 60. dnu zralosti a 71,2 % ve 120. dnu zralosti), zatímco koncentrace tryptaminu a fenylethylaminu byly velmi nízké ve všech zrajících obdobích. Nejvyšší koncentrace se objevovaly okolo 15.dne a pak mezi 60.dnem a 120. dnem. Nicméně celkový obsah BA ve Feta sýru je zřejmě vyšší než ukázaly výsledky experimentu kvůli slané vodě, která měla vliv na bílkoviny obsažené v sýru (Valsamaki, Michaelidou, 2000). Experiment, který se zabýval stanovením biogenních aminů v Montasio sýru proběhl v roce 2001 (Innocente, D’Agostin, 2002). Montasio je polotvrdý sýr. Jedná se o typický sýr, který pochází ze severovýchodní Itálie z nepasterizovaného mléka. Buď jako syrový nebo se tepelně upravuje při teplotě 64 - 68°C po dobu 30 sekund. Konzumuje se po dvou měsících zrání nebo až po 8 – 9 měsících zrání. Experiment prokázal, že koncentrace hlavních biogenních aminů (histaminu a tyraminu) byly ve všech obdobích zrání nízké. Obsahy tryptaminu a fenylethylaminu byly ještě nižší než u histaminu a tyraminu. Podobné výsledky uvedl Moret a kol. (1992) v dalších italských sýrech. Koncentrace histaminu a tyraminu byla po 150 dnech zrání mezi 39 – 40 mg/100g sýru (Innocente, D’Agostin, 2002). Byla tedy vyloučena otrava tímto sýrem, protože koncentrace histaminu by se musela pohybovat mezi 100 – 180 mg/100g sýru. Koncentrace kadaverinu byla velmi nízká a pohybovala se mezi 2,58 – 16,75 mg/100g sýru. Zatímco koncentrace putrescinu se pohybovala v toxických hodnotách a to mezi 54,98 – 110,46 mg/100g sýru. Vysoký obsah putrescinu je hlavně spojován s kontaminací koliformními bakteriemi. V každém případě obsahy biogenních aminů v Montasio sýru byly pod hodnotou, která je považovaná za potenciálně toxickou.
20
Další pokus byl proveden v roce 1996 ve Švýcarsku. Pokus se zabýval hodnotami biogenních aminů v poloměkkých sýrech vyrobených z nepasterovaného mléka a v poloměkkých sýrech vyrobených z pasterizovaného mléka (Schneller a kol., 1997). U sýrů z nepasterizovaného mléka se zjistila vyšší koncentrace tyraminu (294,9 -1
mg.kg ) a histaminu (243,3 mg.kg-1) (Schneller a kol., 1997). Koncentrace celkových biogenních aminů se zvýšovala během zrání sýru a maximální hodnoty dosáhla po 3 měsících. Následující 2 měsíce zůstala maximální hodnota BA na stejné úrovni. Z jednotlivých aminů se snížil pouze obsah putrescinu. Nejvyšší obsah celkových biogenních aminů byl zjištěn u sýru z nepasterizovaného mléka (702,1 mg.kg-1) (Schneller a kol., 1997).
Tab.1. Koncentrace biogenních aminů u sýrů vyrobených z nepasterizovaného a pasterizovaného mléka (Schneller a kol., 1997) Vzorek (poloměkký sýr)
Fenylethylamin (mg.kg-1)
Putrescin (mg.kg-1)
Kadaverin (mg.kg-1)
Histamin (mg.kg-1)
Tyramin (mg.kg-1)
pasterizované mléko nepasterizované mléko
9,4
55
146
3,4
131,9
Celkový obsah BA (mg.kg-1) 345,9
24,6
52,1
87,2
243,3
294,9
702,1
V roce 1993 prováděla stejná laboratoř stanovení obsahů BA v poloměkkém sýru, tvrdém sýru a měkkém sýru (Schneller a kol., 1997). Výsledky jsou následující: Tab.2. Koncentrace biogenních aminů (mg.kg-1) (Schneller a kol., 1997) Vzorek
Fenylethylamin (mg.kg-1)
Putrescin (mg.kg-1)
Kadaverin (mg.kg-1)
Histamin (mg.kg-1)
Tyramin (mg.kg-1)
poloměkký sýr
12,3
21,6
111,4
96,2
141
Celkový obsah BA (mg.kg-1) 373,8
tvrdý sýr
1,5
7,08
27,5
136,2
47,2
220,2
měkký sýr
0,05
2,7
11,7
0
1,5
16
21
Nejvyšší koncentrace celkových biogenních aminů se objevila u poloměkkého sýru, pak následoval tvrdý sýr a měkký sýr. Pouze histamin měl nejvyšší koncentraci u tvrdého sýru, jinak jednotlivé koncentrace byly nejvyšší u poloměkkého sýru. Greif a kolektiv se zabývaly zastoupením biogenních aminů (histamin, tyramin, putrescin, kadaverin) v sýrech. Biogenní aminy jsou významným indikátorem mikrobiální kontaminace a jejich vliv na lidský organismus je celosvětově zkoumaný (Greif a kol., 1993). Tab.3. Jednotlivé koncentrace biogenních aminů v sýrech (mg.kg-1) (Greif a kol., 1993) Vzorek
Tyramin (mg.kg-1)
Histamin (mg.kg-1) Putrescin (mg.kg-1) Kadaverin (mg.kg-1)
sýr "Zlato"
65
10,2
9,8
21,0
bryndza
410,0
201,2
500,8
856,2
V roce 2003 uvádí Greif a kolektiv výsledky svého výzkumu, který se zabýval obsahy BA v mléčných produktech. Tab.4. Jednotlivé koncentrace biogenních aminů v sýrech (mg.kg-1) (Greif a kol., 2003) Vzorek sýr Niva sýr Primátor sýr Ementál Bryndza – jarní sýr Balkán sýr Hrudka jogurt
Počet 6 6 8 4 3 3 5
Kadaverin (mg.kg-1) 25 – 705 1 – 42 5 – 30 930 – 1208 1 – 20 1 – 24 0
Putrescin (mg.kg-1) 7 – 61 5 – 30 4 – 20 520 – 610 1 – 35 5 – 40 0
Histamin (mg.kg-1) 1 – 28 1 – 20 5 – 50 180 – 202 58 – 102 5 – 83 1–5
Tyramin (mg.kg-1) 3 – 82 2 – 120 130 – 420 408 – 435 3 – 29 0 – 10 10 – 45
Z tab.4. vyplívá, že koncentrace tyraminu je překročená u vzorku ementálského sýru a jarní bryndzi. Přísun BA z následujících potravin kromě ementálu a bryndzy, by za předpokladu normálního konzumu neměl u zdravých lidí vyvolat zdravotní problémy (Greif a kol., 2003). Jiná je však otázka u nemocných lidí, kteří užívají léky s inhibičními účinkami na MAO a DAO, jako jsou antihistaminika (Alfadryl, Bromadryl),
22
tuberkulostatika (Ninrazid), ale především psychofarmaka s antidepresivním účinkem (Narval). Koncentrace jednotlivých biogenních aminů uvádí Velíšek v roce 2002. Uvádí, že koncentrace mohou dosahovat hodnoty až 2000 mg.kg-1 (histamin). Záleží na druhu sýru a dalších faktorech podporujících vznik BA. Tab.5. Koncentrace biogenních aminů (mg.kg-1) (Velíšek, 2002) Vzorek Cheddar Emmental Gouda Eidam Roquefort
Kadaverin (mg.kg-1) 4 – 408 0 – 460 1 – 140 stopy 42 – 905
Putrescin (mg.kg-1) 1 – 996 1 – 130 1 – 200 stopy 44 – 830
Histamin (mg.kg-1) 0 – 1300 stopy – 2000 0 – 850 0 – 88 0 – 4100
Tyramin (mg.kg-1) 0 – 1500 1 – 1000 0 – 670 stopy – 320 stopy – 1350
Při zrání sýrů dochází k výrazné tvorbě biogenních aminů jen v provozech s nedostatečnou hygienickou úrovní, tedy vlivem kontaminující mikroflóry. Při dobré technologii a dodržování správných hygienických zásad obsahují i dlouhodobě zrající sýry jen poměrně malá množství BA.
5.3. Obsah biogenních aminů v salámech Obdobná situace je u fermentovaných trvanlivých masných výrobků. Hůře ošetřená surovina vnáší do výrobku zejména zvýšené obsahy putrescinu a kadaverinu. V závislosti na technologii výroby a použitých startérových kulturách mléčných bakterií se může konečný obsah a zastoupení jednotlivých aminů značně lišit. U mikroflóry charakteristické pro maso a masné výrobky se zjistilo, že existují kmeny bakterií, které dokáží odbourávat část vytvořeného tyraminu. Při výrobě domácích klobás, které patří do skupiny výrobků tepelně neopracovaných byl vysoký obsah tyraminu, který poukazuje na pomnožení grampozitivních koků, a to především na rody Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium, které jsou odpovědné za produkci tyraminu a jsou indikátorem úrovně hygieny a sanitace v dané výrobě. Putrescin a kadaverin jsou indikátory pomnožení bakterií z čeledě Enterobacteriaceae, a to především Escherichia coli, Enterobacter, Proteus, Klebsiella a pseudomonád (Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa), a také skutečnosti, že v trávicím traktu oslabují činnost MAO a DAO, což má za následek zvýšení koncentrací histaminu a tyraminu v krvi (Greif, 1997).
23
V zahraničí i u nás byly proběhlo několik výzkumů zabývajících se touto problematikou. Hernández-Jover a kol. (1996) zjišťovali obsahy biogenních aminů v různých typech španělských fermentovaných masných výrobků (salchichon, choriso, fuet, sobraza) a mezi těmito výrobky nenalezli žádný průkazný rozdíl. Hlavními stanovenými BA byly tyramin a putrescin. Jejich koncentrace velmi kolísaly a dosahovaly hodnot několika stovek mg.kg-1, přičemž převažujícím aminem byl tyramin. Dále se zde vyskytovaly v nižších koncentracích histamin, kadaverin a také tryptamin a fenylethylamin. Podobný výzkum proběhl také ve finských fermentovaných masných výrobcích. Eerola a kol. (1998) potvrdili, že tyramin je nejběžnějším biogenním aminem a přítomny byly i další vazoaktivní aminy histamin, fenylethylamin a tryptamin. Ve většině vzorků se vyskytovaly indikátory kažení putrescin a kadaverin v koncentracích i několik stovek mg.kg-1. V německu zkoumali salám cervelat. Ve výskytu BA převažoval putrescin a tyramin, dále histamin, spermin a spermidin (Treviňo a kol., 1997). V České republice byly sledovány biogenní aminy u šesti druhů fermentovaných masných výrobků. Jednalo se o Paprikový salám, Poličan, Herkules, Gombaseckou klobásu, Dunajskou klobásu a Prim (Standara a kol. 1995). Téměř všude byl nalezen tyramin a putrescin v koncentracích přes 100 mg.kg-1, v menších koncentracích byl histamin. Vyjímečně kadaverin. V desítkách mg.kg-1 se jednalo o tryptamin, spermin a spermidin. Celkový obsah biogenních aminů se pohyboval od 200 – 700 mg.kg-1. V roce 2001 byl uskutečněn experiment s typickým českým fermentovaným masným produktem – Poličanem (Komprda a kol., 2001). Vzorky byly uložené v chladících komorách s regulovanou teplotou nebo při pokojové teplotě (22°C). Proteus, Enterobacter, Escherichia a Pseudomonas spp., nebyli pozorováni ve vzorku během zrání salámu a enterobakterie nebyly prakticky objevené (Komprda a kol., 2001). Startovací kultury obsahující Lactobacillus sakei, Staphylococcus carnosus a Staphylococcus xylosus (kultura A), a L. sakei, S. carnosus a Pediococcus pentosaceus (kultura B). Obsahy byly měřeny během 60. dnů. Vždy po dvou vzorkách. a – kultura A
b – kultura B
24
Tab.6. Koncentrace biogenních aminů ve fermentovaných masných výrobcích (mg.kg1
) při různých teplotách s různými startovacími kulturami (Komprda a kol., 2001)
Vzorek
0.den 10.den 20.den 30.den 40.den 50.den 60.den
A B A B A B A B A B A B A B
histamin
tyramin
putrescin
Σ BA
mg.kg-1
mg.kg-1
mg.kg-1
mg.kg-1
8°C 25 32 25 31 23 29 23 31 23 31 24 35 24 36
22°C 25 32 23 29 23 34 25 34 22 38 22 43 24 46
8°C 22°C 8°C 86 86 54 92 92 54 85 86 50 157 217 77 83 85 64 154 230 80 88 83 65 159 228 79 89 83 64 154 233 83 104 87 92 152 250 80 104 95 96 154 273 80
22°C 54 54 52 94 56 107 52 105 56 104 77 103 75 104
8°C 22°C 183 183 197 197 177 186 291 360 193 190 289 398 193 182 290 392 194 181 287 402 240 205 286 422 241 216 291 448
Vzorky s druhou startovací kulturou měly mírně vyšší koncentrace biogenních aminů. Již po dvou týdnech skladování byl obsah tyraminu vyšší (120 mg.kg-1) než připouští toxikologický limit (100 mg.kg-1), ke konci doby minimální trvanlivosti byl jeho obsah již kolem 300 mg.kg-1.
4. STANOVENÍ VODNÍ AKTIVITY 4.1. Úvod Na Mendlově zemědělské a lesnické univerzitě v Brně, na ústavu Technologie potravin, probíhá stanovení biogenních aminů v sýrech. Jako jeden z pomocných faktorů ke stanovení BA byla měřena vodní aktivita a vlhkost sýrů. K měření vodní aktivity byly poskytnuty sýry od dvou výrobců. Každý výrobce poskytl vzorky o různé tučnosti (30% a 45%) a dvou různých startovacích kulturách. Každý vzorek byl ještě rozdělen na okraj (A) a střed (B) a ještě rozdělen do tří bloků. Celkový počet analyzovaných vzorků dosáhl počtu 24. u každého měření. Měření probíhalo od 16.listopadu 2005 do 18.dubna 2006.
25
Pro měření byl vytvořen následující harmonogram: Výrobce
1
Tučnost sýru (%) Kultura Výroba
Odběry (pořadí + datum) po 1 měsíci vždy 3 bloky pro danou tučnost a danou kulturu
2
30
45
30
45
YY-88
LL-50
YY-88
LL-50
YY-88
LL-50
YY-88
LL-50
datum
16.11.
16.11.
16.11.
16.11.
23.11.
23.11.
23.11.
23.11.
množství (počet bloků) 0.
21
21
21
21
21
21
21
21
16.11.
16.11.
16.11.
16.11.
23.11.
23.11.
23.11.
23.11.
1.
12.12.
12.12.
12.12.
12.12.
19.12.
19.12.
19.12.
19.12.
2.
9.1.
9.1.
9.1.
9.1.
16.1.
16.1.
16.1.
16.1.
3.
13.2.
13.2.
13.2.
13.2.
20.2.
20.2.
20.2.
20.2.
4.
13.3.
13.3.
13.3.
13.3.
20.3.
20.3.
20.3.
20.3.
5.
10.4.
10.4.
10.4.
10.4.
18.4.
18.4.
18.4.
18.4.
Na stanovení se používaly následující přístroje: -
pro měření vodní aktivity: Novasina – AW Sprint (TH-500) (program Novalog)
-
pro měření vlhkosti: Mettler – Toledo HB 43
-
váhy: Precisa 500 M – 200 C Všechny naměřené hodnoty vodní aktivity byly zapsány a vzorky byly použity
na měření vhlkosti. Hodnoty vodní aktivity byly zpracovány graficky a vzorky po naměření vlhkosti byly vyfotografovány.
26
4.2. Graficky zpracované výsledky naměřených hodnot vodní aktivity
Výrobce 1
0,97 0,968 0,966 0,964 0,962 0,96 0,958 0,956 0,954
YY-88,30% (A) YY-88,30% (B) LL-50,30% (A)
0,952 0,95 0,948
LL-50,30% (B) YY-88,45% (A) YY-88,45% (B) LL-50,45% (A) LL-50,45% (B)
aw 0,946 0,944 0,942 0,94 0,938 0,936 0,934 0,932 0,93 0,928 0,926 0,924 0,922 XI.
XII.
I.
II.
doba zrání
27
III.
IV.
Výrobce 2
0,98 0,978 0,976 0,974 0,972 0,97 0,968
YY-88,30% (A)
0,966
YY-88,30% (B) LL-50,30% (A) LL-50,30% (B)
aw 0,964
YY-88,45% (A) YY-88,45% (B)
0,962
LL-50,45% (A) LL-50,45% (B)
0,96 0,958 0,956 0,954 0,952 0,95 0,948 XI.
XII.
I.
II.
doba zrání
28
III.
IV.
4.3. Fotograficky zpracované výsledky naměřených vlhkostí Výrobce 1
Výrobce 2
29
4.4. Ukázka naměřených hodnot vodní aktivity z programu Novalog Výrobce 1
Výrobce 2
30
5. ZÁVĚR Tato bakalářská práce se zabývala problematikou biogenních aminů a to konkrétně jejich obsahy ve fermentovaných potravinách živočišného původu a faktory, které ovlivňují jejich výskyt a množství v daných potravinách. Mezi nejvýznamější faktory, které se podílejí největší mírou na tvorbě biogenních aminů patří startovací kultura, dodržování hygienických podmínek během výroby a skladování a teplota skladování. Menší mírou ovlivňují vznik biogenních aminů pH, dusitanové solící směsi, vodní aktivita, přístupnost kyslíku a dostupnost substrátu. Mezi potraviny nejvíce ohrožené vznikem biogenních aminů patří maso, sýry a ryby, kde se nejvíce objevují biogenní aminy histamin, kadaverin, putrescin a tyramin. V ojedinělých případech se může obsah biogenních aminů ve fermentovaných salámech pohybovat až okolo 1000 mg.kg-1. U fermentovaných sýrů se objevují vysoké hodnoty hlavně histaminu, kadaverinu a tryptaminu. U ryb může obsah histaminu vystoupat až na 3000 mg.kg-1 (u makrely) až 8000 mg.kg-1 (u tuňáka). Abychom předcházeli vzniku biogenních aminů je důležité, abychom dodržovali obecné zásady, které tomu zabrání. Výrobci by měli dodržovat zásady hygieny při vlastní výrobě potravin a prodejci správnou teplotu při skladování, protože při požití potraviny se zvýšeným obsahem biogenních aminů, může dojit k poruchám lidského těla a poškození zdraví, neboť zatím přesně nevíme, jak na každého z nás působí jednotlivé biogenní aminy, protože každý jedinec reaguje jinak na příjem této toxické látky.
31
6. SEZNAM LITERATURY
Bover-Cid, S., Holzapfel, W.H.: Improved screening procedure for biogenic amine production by lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, 59, 1999, 391-396
Bover-Cid, S., Izquierdo-Pulido, M., Vidal-Carou, M.C.: Mixed starter cultures to control biogenic amine production in dry fermented sausages. Journal of Food Protection, 63, 2000a, 1556-1562
Bover-Cid, S., Izquierdo-Pulido, M., Vidal-Carou, M.C.: Influence of hygienic quality of raw material on biogenic amine production during ripening and storage of dry fermented sausages. Journal of Food Protection, 63, 2000b, 1544-1550
Eerola, S., Roig-Sagués, A.X., Hirvi, T.K.: Biogenic amines in Finis dry sausages. Journal of Food Safety, 18, 1998 b, 127-138 Gonzáles-Fernandés, C., Silla-Santos, E.M., Jaime, I., Jordi, R.: Influence of starter culture and sugar concentrations on biogenic amine contents in chorizo dry sausages. Food Microbiology, 20, 2003, 276-284 Greif, G., Drdák, M., Čižmár, Z.: Stanovenie biogénnych amínov vo vybraných druhoch potravín. Chemické listy, 9a, 1993, 155-156
Greif, G., Drdák, M.: Problematika biogénnych amínov v potravinách. Chemické listy, 9a, 1993, 146-147
Greif, G., Greifová, M., Drdák, M.: Stanovenie biogénnych amínov v potravinách živočíšneho pôvodu metódou HPLC. Potravinářské vědy, 15, 1997 (2), 119-129
Greif, G., Greifová, M., Karovičová, J., Kohajdová, Z.: Význam biogénnych amínov a ich obsah vo vybraných mliečnych produktoch. Celostátní přehlídka sýrů, 2003, 66-70
32
Greifová, M., Greif, G., Kukurová, I., Karovičová, j., Kohajdová, Z.: Vplyv modelových podmienok na rast a produkciu biogénnych amínov mliekarensky významnými mikroorganizmami. Celostátní přehlídka sýrů, 2003, 134-138
Hernándes-Jover, T., Izquierdo-Pulido, M., Veciana-Nogués, M.T., Mariné-Font, A., Vidal-Carou, M.C.: Biogenic amine and polyamine contents in meat and meat products. Journal of Argricultural and Food Chemistry, 44, 1996, 2710-2715 Innocente, N., D’Agostin, P.: Formation of biogenic amines in a typical semihard italian cheese. Journal of Food Protection, Vol.65, Number 9, 2002, 1498-1501
Kalač, P., Křížek, M.: Biogenní aminy v potravinách. Biologie, chemie, zeměpis, 2000, 27-30 Kalač, P., Křížek, M.: Biogenní aminy a polyaminy v potravinách a jejich vliv na lidské zdraví. Potravinářská revue, 2, 2005, 40-42
Komprda, T.: Obecná hygiena potravin. MZLU Brno, 2004, 28-32
Komprda, T., Nezvalová, J., Standara, S., Bover-Cid, S.: Effect of starter culture and storage temperature on the content of biogenic amines in dry fermented sausage poličan. Meat Science, 59, 2001, 267-276
Křížek, M.: Krátká procházka našim výzkumem biogenních aminů. Internetová stránka. Jihočeská univerzita České Budějovice, 1999 Křížek, M., Kalač, P.: Biogenní aminy v potravinách a jejich role ve výživě. Czech Journal of Food Sciences, Vol.16, Number 4, 1998, 151-159
Masson, F.- Talon, R.- Motel, M.C.: Histamine and tyramine production by bacteria from meat products. International Journal of Food Mikrobiology, 32, 1996, 199-207 Parente, E., Martuscelli, M., Gardini, F., Grieco, S., Crudele, M.A., Suzzi, G.: Evolution of microbial populations and biogenic amine production in dry sausages in Southern Italy. Journal of Applied Mikrobiology, 90, 2001, 882-891 Sayen – El – Doher, N. et al.: Changes in the amine content of ground beef during storage and processing. Lebensm. – Wiss. – Technol, 17, 1984, 319-323
33
Schneller, R., Good, P., Jenny, M.: Influence of pasteurised milk, raw milk and different ripening cultures on biogenic amine concentrations in semi-soft cheeses during ripening. Z Lebensm Unters Forsch A, 1997, 265-272 Silla-Santos, M.: Biogenic amine: their importace in foods. International Journal of Food Mikrobiology, 29, 1996, 213-231 Smělá, D., Pechová, P., Komprda, T., Klejdus, B., Kubáň, V.: Chromatografické stanovení biogenních aminů v trvanlivých salámech během fermentace a skladování. Chemické listy, 98, 2004, 432-437 Standara, S. a kol.: Biogenní aminy ve fermentovaných trvanlivých masných výrobcích. In: XXII. Seminář o jakosti potravin a potravinových surovin. Brno 7.9.1995, 13-14 Steinhauserová, I.: Otrava biogenními aminy. Veterinářství, 54, 2004, 174-175 Stratton, J.E., Hutkins, R.W., Tailor, S.L.: Review: Biogenic amines in cheese and other fermented foods. Journal of Food Protection, 54, 1991, 460-470
Suzzi, G., Gardini, F.: Biogenic amines in dry fermented sausages: a review. International Journal of Food Mikrobiology, 88, 2003, 41-45 Treviňo, E., Beil, D., Steinhart, H.: Formation of biogenic amines dutiny the maturity process af raw meat products, for example of cervelat sausages. Food Chemistry, 60, 1997, 521-526 Valsamaki, K., Michaelidou, A., Polychroniadou, A.: Biogenic amine production in Feta cheese. Food Chemistry, 71, 2000, 259-266
Velíšek, J.: Chemie potravin III. Tábor, 2002, 123-130 Vokurka, M., Hugo, J. a kol.: Praktický slovník medicíny. MAXDORF, 2000, 490 s., ISBN-80-85912-38-4
34
35
