Neplodnost
Neplodnost Asistovaná reprodukce
Mužská neplodnost • genetická (autozómy, gonozómy) • andrologická (poruchy reprodukčních orgánů a jejich funkcí) • imunologická • hormonální
Lidská neplodnost je podle WHO považována za nemoc = stav, kdy v průběhu jednoho roku při pravidelném pohlavním styku nedojde k otěhotnění WHO dělí neplodnost do následujících kategorií: • primární neplodnost • sekundární neplodnost • pravidelné spontánní potraty/kojenecká úmrtnost • neobjasněná neplodnost (idiopatická)
Hormonální poruchy • vrozená porucha tvorby/sekrece gonadoliberinů (Kallmanův sy., hypogonadotropní hypogonadismus, mutace GnRH receptoru) • sekundární porucha tvorby/sekrece gonadoliberinů (nádor, poranění, ozáření, systémová onemocnění) • snížená tvorba hormonů hypofýzy (hypopituitarizmus) → snížená sekrece testosteronu • hyperprolaktinémie (nádory, léky, drogy) • porucha receptorů (pro androgeny nebo hormony hypofýzy)
Poruchy reprodukčních orgánů
Imunologická příčina
• nesestouplá varlata (poškození zárodečného epitelu) • varikokéla • nádory a záněty varlat • obstrukce vývodných cest (infekce, vazektomie, operace kýly a slepého střeva) • porucha transportu spermií (ektopické vyústění uretry, deformace penisu, fimóza, anejakulace, erektilní dysfunkce)
Ochrana mužských reprodukčních orgánů před vytvořením autoimunity → pasivní (snížená antigennost buněk) → aktivní (účast tlumivých buněk a mezibuněčných působků) • seminální plazma obsahuje řadu imunosupresivních faktorů, např. cytokiny, které vznikají mezibuněčnou souhrou semenných buněk - T-lymfocytů, makrofágů, granulocytů → jejich produkty (tlumivé cytokiny) chrání spermie před autoimunitním poškozením • seminální plazma však obsahuje celou řadu dalších nespecifických působků (beta2-mikroglobulin, alfa2 – makroglobulin, laktátdehydrogenázu, a jiné enzymy, transferin, albumin, prostaglandiny…) • celkově ejakulát obsahuje > 500 bílkovinných a peptidových složek, ale jen některé jsou schopny indukovat vytváření protilátek
1
Imunologická příčina • porucha hematotestikulární bariéry → kontakt imunologicky chráněných povrchových epitopů spermií s imunokompetentními buňkami, které produkují příslušnou protilátku → protilátky se naváží na povrch spermie a způsobí jejich aglutinaci, imobilizaci či cytotoxicitu • protilátky proti spermiím shlukují spermie hlavičkami nebo bičíky nebo bičíky a hlavičkami současně → neprůchodnost spermií hrdlem děložním nebo neschopnost spermie adherovat k zoně pellucidě • protilátky brání progresivnímu pohybu spermií ženským pohlavním traktem, dokáží ovlivnit akrozomální reakci, zasahují do přímé fertilizace oocytu • postfertilizační účinek namířený proti zygotě a proti časnému embryu • v sérech pacientů nalézáme IgG protilátkový izotyp (nebo jeho kombinaci s IgA, výjimečně s IgM) • v seminální plazmě převládá IgA (nebo v kombinaci s IgG vzácně s IgE)
Spermiogram Motilita: a) rychlý progresivní pohyb (25µm/s = 5 délek hlavičky) b) pomalý progresivní pohyb c) pohyb na místě d) nepohyblivé spermie Morfologie: hlavička, akrozóm,krček, bičík
Azoospermie 1. genetické vyšetření – chromozomální aberace v 5-15% (z toho 91% porucha gonozómů) • delece Y chr. • inverze Y chr. • ring Y chr. • balancované translokace autozómů • reciproké translokace mezi gonozómy nebo gonozómem a autozómem • Robertsonovské translokace • ring-chromozóm • mutace v genu pro cystickou fibrózu
Porucha tvorby spermií • vyšetření ejakulátu (spermiogram) – množství, pohyblivost a morfologie spermií • morfologické změny spermií (barvení) • počítačová analýza motility spermií • fluorescentní in situ hybridizace • imunocytochemie - vyšetření pomocí monoklonálních protilátek (jakýkoli proteinový epitop) • detekce intraakrozomálních proteinů (hyaluronidáza, akrozin, glukosamin)
Spermiogram Normospermie – min. 20 mil./1 ml ejakulátu pohyb a+b min. 50%; patologie < 70% Oligozoospermie - < 20mil./1 ml Asthenozoospermie – pohyb a+b < 50% Oligoasthenozoospermie Oligoasthenozoospermie gravis - < 5mil./1 ml Teratozoospermie – patologie > 70% Kryptozoospermie – spermie nalezeny až po centrifugaci Nekrozoospermie – všechny spermie v ejakulátu mrtvé Azoospermie – nepřítomnost spermií v ejakulátu Aspermie – v ejakulátu žádné pohlavní buňky Pyospermie – nadbytek leukocytů v ejakulátu
Azoospermie Mikrodelece Y chromozómu vede k poruchám spermatogeneze na různých stupních PAR – pseudoautozomální oblast na konci krátkého raménka (PAR1) obsahující sex determining region (SRY) a oblast na konci dlouhého raménka (PAR2) AZF (azoospermic factor) na dlouhém raménku (Yq11) obsahuje geny nezbytné pro spermatogenezi AZFa – delece této oblasti způsobuje SCOS (Sertoli Cell Only Syndrome) = nepřítomnost spermatogonií AZFb – obsahuje RBM (RNA-binding motif) – exprimován u spermatogonií a primárních spermatocytů AZFc – obsahuje DAZ rodinu (deleted in azoospermia) – jeho proteiny potřebné ve fázi pozdních spermatid a pro tvorbu bičíku spermií
2
Y chromozóm
Azoospermie Andrologická sterilita v souvislosti s genem pro cystickou fibrózu • oboustranná vrozená aplázie vas deferens (CBAVD = Congenital Bilateral Absence of the Vas Deferens ) → nález mutace u 20% mužů s azoospermií • abnormality struktur utvářených z Wolffovy trubice (atrofie nadvarlat) • vysoká četnost heterozygotního genotypu mutací F508del a R117H
Ženská neplodnost
Azoospermie 2. andrologické vyšetření • neobstrukční azoospermie – snížené hodnoty FSH a testosteronu, malá varlata a nadvarlata • obstrukční azoospermie – vrozená – získaná (vazektomie) Možnosti: • MESA – aspirace (nasátí) spermií z nadvarlete • TESA – aspirace spermií z varlete • TESE – extrakce spermií z tkáně varlete
• hormonální (abnormální hladiny hormonů hypofýzy a vaječníků, anovulace, nedostatečná funkce žlutého tělíska) • onemocnění/abnormality pohlavních orgánů (PCO, endometrióza, neprůchodnost vejcovodů, záněty, nádory) • genetická • imunologická • předčasné ovariální selhání • psychická
Hormonální poruchy Smysluplné je provádět odběr krve na hormonální vyšetření 2x během menstruačního cyklu: 3. den cyklu (2.-4. den) - stanovení tzv. bazálních hormonů • ↑FSH – hladina stoupá s klesající ovariální funkcí (k nastartování růstu folikulů normálně stačí nízká hladina FSH ~ 4IU/l) • ↑LH – u žen trpících PCO • FSH:LH > 1 = špatné výsledky i při IVF • ↑PRL - tlumí vyzrávání vajíčka ve vaječníku a menstruační cyklus a tím i možnost oplodnění, poruchy ovulace, nedostatečná tvorba ovariálních hormonů • estradiol - nízká hladina vypovídá stejně jako nízká hladina FSH o dobré ovariální rezervě (norma 75-80 pg/ml) 22. den cyklu ↓ progesteron – neproběhla ovulace (norma 10 ng/ml)
Ženská neplodnost - anovulace Anovulace - soubor celé řady odchylek v hormonálním prostředí ženy • nedostatečná funkce hypofýzy (FSH, LH) • zvýšená hladina PRL • ženy s polycystickými vaječníky • snížená nebo zvýšená funkce štítné žlázy I. II.
Nízká produkce estrogenů Neustálá sekrece estrogenů
3
Ženská neplodnost - anovulace Řešení: vyšetření hormonálního profilu (2.- 4. den MC) • možnost podávání léků provokujících ovulaci = antiestrogeny (obsazují estrogenní receptory v hypofýze → vzniká falešná informace o nedostatku estrogenů v organismu a dojde k vyplavení FSH) • podání rFSH, hCG • UZ potvrzení ovulace – v půlce MC • ovulační testy
Ženská neplodnost Neprůchodnost vejcovodů • oboustranná nebo jednostranná • částečná x úplná • často způsobená komplikovaným průběhem zánětu slepého střeva, gynekologickými záněty v malé pánvi, sactosalpingy nebo mimoděložním těhotenstvím ve vejcovodu Diagnóza: • laparoskopické vyšetření – drobné srůsty lze odstranit (při úplném srůstu je jediným řešením umělé oplodnění) • hysterosalpingografie
Ženská neplodnost PCO – syndrom polycystických vaječníků (hyperandrogenní syndrom) • přítomnost velkého počtu měchýřků (cyst o velikosti 2-8 mm) naplněných tekutinou • anovulace • oligo-/amenorrhea • hypersekrece androgenů a LH • metabolické abnormality – hyperinsulinémie, inzulínová rezistence (riziko cukrovky nezávislé na inzulínu), dyslipidemie Řešení: podávání antiestrogenů, antiandrogenů
Ženská neplodnost Endometrióza – onemocnění, při kterém se děložní sliznice vyskytuje na pobřišnici, ve vaječnících, ale i kdekoliv jinde • ložiska endometriózy reagují na hormonální změny v průběhu menstruačního cyklu tak, že v nich probíhá narůstání, přeměna a odlučování s krvácením stejně jako v děložní sliznici (tento proces poškozuje tkáně v okolí → může vyvolávat bolesti a často vede k srůstům) Diagnóza – laparoskopie, biopsie, ultrasonografie, sérové markery (CA-125, C-reaktivní protein) Možnosti léčby: • Odstranění lézí CO2 laserem (u mírné až střední endometriózy) • Hormonálně – zastavení menstruace na dobu min. půl roku • těhotenství
Imunologické příčiny
Imunologické příčiny
1. protilátky proti spermiím • v oblasti cervixu, dutiny děložní, vejcovodů, v peritoneální tekutině, v séru • izoimunizační proces bývá usnadněn, když partnerovi chybí v ejakulátu imunosupresivní faktor seminální plazmy • v děložním hrdle nacházíme protilátky proti spermiím v izotopu IgG, IgA, vzácně IgE • cervikální T-lymfocyty se účastní buňkami zprostředkované reakce namířené jak proti různým mikroorganismům, tak i proti pohyblivým spermiím • podobnou účinnost mají i makrofágy → některé jsou „přeškolené“ na specifickou reakci prostřednictvím buněčných mediátorů-lymfokinů → některé spermie se za zcela fyziologických podmínek dostanou až k vajíčku, jiné jsou rychle fagocytovány makrofágy nebo polymorfonukleárními leukocyty už v hrdle
2. protilátky proti zona pelucida • vysoká hladina antizonálních protilátek způsobuje zabránění vstupu spermie do vajíčka při přirozené nebo umělé fertilizaci 3. antifosfolipidové protilátky (APA) • skupina imunoglobulinů namířených proti negativně nabitým buněčným fosfolipidům • mohou se vázat na fosfolipidy ovariální tkáně → zabraňují vytvoření a uvolnění funkčního oocytu • přítomnost vysokých hladin APA je důvodem k vyšetření dalších autoprotilátkových aktivit 4. další – protilátky proti trofoblastu, antiendometriální protilátky, embryocytotoxické cytokiny (u pacientek s endometriózou), nedostatek vlastních blokujících protilátek (samovolné potraty z imunologické příčiny)
4
Asistovaná reprodukce Zjištění příčiny neplodnosti: • Osobní a rodinná anamnéza • Vyšetření muže – spermiogram, v případě špatného výsledku genetické + andrologické vyšetření • Vyšetření ženy – obecné gynekologické vyšetření, hormonální profil, UZ verifikace ovulace (v polovině MC)
Intrauterinní insemice (IUI) IUI = zavedení kapacitovaných spermií přímo do dělohy Podmínky: • normální nebo lehce snížené hodnoty spermiogramu • tubární průchodnost • ovulace (přirozená nebo indukovaná)
Intrauterinní insemice Postup: • Oddělení spermií od seminální plazmy (centrifugace) • Kapacitace • Zavedení do dělohy pomocí katetru → zkrácení cesty k vajíčku, překonání přirozených překážek (cervikální kanálek, hlen) AIH – použití spermií manžela AID – použití spermií dárce
In vitro fertilizace (IVF) 1.
Hormonální stimulace vaječníků
2.
Odběr vajíček
3.
Oplození vajíček
4.
Přenos embryí do děloh
IVF - hormonální stimulace vaječníků
IVF - hormonální stimulace vaječníků
• zvýšení úspěšnosti léčby – ve vaječnících se vyvíjí a dozrává vyšší počet vajíček • podání léků obsahující gonadotropiny (FSH a LH) • analoga gonadoliberinu - tlumí funkci hypofýzy a tím zabrání vyplavení hormonu, který je odpovědný za uvolnění vajíček z folikulu (zabránění prasknutí folikulů a uvolnění vajíček ještě před odběrem) • GnRH agonisti - bifázické působení → první dny stimulují sekreci gonadotropinů a zvyšují LH a FSH v plazmě; v další fázi jsou tyto hormony potlačovány • aplikace hCG (36 hodin před odběrem vajíček) → uvolnění vajíček z folikulů
Krátký protokol • GnRH-a se podávají déle současně s injekcemi FSH; dlouhodobou aplikací GnRH-a dojde k útlumu funkce hypofýzy a tak by nemělo dojít k předčasnému uvolnění vajíčka z folikulů Dlouhý protokol z folikulární fáze • první nebo druhý den menstruačního krvácení se aplikuje GnRH-a s dlouhodobým účinkem (snížení funkce hypofýzy jako příprava na superovulaci) • za 14–18 dnů se provádí UZ vyšetření, při kterém se hodnotí děložní sliznice, ta by neměla být vyšší než 4 mm a vaječníky by neměly obsahovat žádné cysty ani folikuly větší než 10 mm; při odpovídajícím UZ nálezu a hladině estradiolu je možné aplikovat denně gonadotropiny
5
IVF - hormonální stimulace vaječníků
IVF – odběr oocytů (ovum pick-up)
Protokol s antagonisty GnRH antagonisti působí proti GnRH → zabraňují produkci LH a tím předčasné ovulaci • druhý nebo třetí den menstruace se začne aplikovat FSH • po čtyřech až pěti dnech léčby se provádí UZ vyšetření → jestliže jsou ve vaječnících již folikuly větší než 12 mm, začne se s aplikací antagonistů • další postup je totožný jako v protokolech předchozích • když při UZ vyšetření dosáhne průměr největšího folikulu nejméně 16 mm, aplikuje se hCG
• Výkon v celkové anestezii • Probíhá transvaginálně pod kontrolou ultrazvuku • Odsání vajíček z folikulů i s folikulární tekutinou • Okamžitá kontrola v embryologické laboratoři
Oplození vajíček (fertilizace)
Oplodnění vajíček - inseminace in vitro
• Zpracování spermií (oddělení od seminální plazmy a kapacitace) • Fertilizace (dle spermiogramu) Inseminace in vitro ICSI (intracytoplazmatická injekce)
• přidání kapacitovaných spermií do média s oocyty • po 18 hodinách očištění vajíček od spermií a zbytků kumulárních buněk a kontrola fertilizace
Oplodnění vajíček - ICSI
Mikromanipulátor
• očištění vajíček od kumulárních buněk • mikroinjekce jediné spermie do cytoplazmy oocytu • po 18 hodinách kontrola fertilizace
6
Mikropipety • • • • •
Přenos embrya do dělohy (embryotransfer)
holding ICSI hatching biopsy denuding
• kultivace embryí 72-120 hodin • selekce nejlepších embryí • přenos tenkým katetrem přes děložní hrdlo pod kontrolou ultrazvuku (ambulantní výkon) • obvykle přenos dvou embryí
Další metody asistované reprodukce • • • •
Asistovaný hatching Kryokonzervace embryí Kryokonzervace spermií Odběr blastomer při PGD (prenatální genetická diagnostika) • Program darovaných oocytů a spermií
Kryokonzervace Historie • 1949 – glycerol dokáže ochránit spermie před poškozením při mrazení • 1950 – použití glycerolu při mrazení červených krvinek • 1959 – objevení DMSO jako kryoprotektantu • 1972 – získání živého jedince po zmrazení a rozmrazení osmibuněčného myšího embrya • 1983 – první dítě po zmrazení a rozmrazení osmibuněčného lidského embrya • 1983 – DMSO je nahrazen méně toxickým propylenglykolem • 1985 – první zamrazení lidských blastocyst za použití glycerolu • 1987 – první dítě po oplození zamrazených oocytů • 1998 – úspěšné zamrazení lidské ovariální tkáně
Asistovaný hatching (AH) Šetrné narušení zona pellucida pomocí mikropipety → usnadnění „vycestování“ embrya z obalu → vyšší šance uhnízdění do děložní sliznice • u starších pacientek • u pacientek s vyššími hodnotami FSH • je-li zona příliš silná či tuhá • při opakovaném neúspěchu IVF
Kryokonzervace v IVF • Oocyty – stále problematické → může být poškozeno dělící vřeténko → změny kortikálních granul → zvýšení výskytu aneuploidií u embryí • Embrya – lze mrazit ve všech stádiích vývoje → čím vyšší vývojové stádium, tím problematičtější mrazení a následné rozmrazení • Spermie, tkáň varlete • Ovariální tkáň
7
Princip kryokonzervace
Princip kryokonzervace 1.
Hlavním faktorem způsobujícím poškození živých buněk při mrazení je tvorba intracelulárního ledu a s tím spojených osmotických změn • Dehydratace buněk před zamrazením • Přidání kryoprotektiv (chrání před poškozením a snižují bod tání kryoprotekčního média)
Princip kryokonzervace 3.
4.
Postupné ochlazování vzorku rychlostí 0,3°C/min do -30 až -36 °C KRYOPLANER
Uchování v tekutém dusíku (-196°C)
Vitrifikace • jednorázová expozice embryí vysokým koncentracím kryoprotekčního média s následným ochlazením na 196°C na stojánku (vzorek nepřijde přímo do styku s tekutým dusíkem) • speciálně upravený povrch zajišťuje efektivní a rychlou změnu teploty → molekuly vody ve vzorku nemají dostatek času na přeskupení se do krystalické mřížky → nedochází k tvorbě ledových krystalků
2.
Dehydratace → látky, které neprocházejí buněčnou membránou, umožňují prostup vody z buňky ve směru koncentračního gradientu (sacharóza) → jeli dehydratace nedostatečná, vytvoří se intracelulární krystaly ledu a dojde k poškození buněk Kryoprotektanty → vážou vodu a tím redukují toxické vlivy vysokých koncentrací dalších sloučenin → ve vysokých koncentracích minimalizují poškození způsobené vznikem ledových krystalů → nutí vodu, aby mrzla v nekrystalické formě propandiol (propylenglykol) – mrazení nižších vývojových stádií embryí a oocytů glycerol – mrazení blastocyst
Kryokonzervační metody • Slow-freeze protokoly → použití nízkých koncentrací kryoprotektantů (∼1,5M) • Rapid-freeze → vyšší koncentrace kryoprotektantů (∼4M) ⇒ kratší čas působení • Ultra rapid-freeze (vitrifikace) → extrémně rychlé mrazení za využití vysokých koncentrací kryoprotektantů (>6M)
Program darovaných gamet Darované spermie • Azoospermie s nemožností získání spermií (TESE) • Genetická zátěž • OAT gravis Darované oocyty • Ženy s předčasným ovariálním selháním • Starší pacientky • Genetická zátěž
8
Méně obvyklé metody v IVF GIFT (Gamets IntraFallopian Transfer) - laparoskopické zavedení spermií a odebraného vajíčka do vejcovodu FREDI (Fallopian Replacement of Eggs with Delayed Intrauterine Insemination) - zavedení vajíčka do vejcovodu s následným provedením inseminace EIFT (Embryo Stage IntraFallopian Transfer) - zavedení embryí různého vývojového stadia do vejcovodu DIPI (Direct IntraPeritoneal Insemination) - zavedení spermií do břišní dutiny POST (Peritoneal Oocyte and Sperm Transfer) - zavedení vajíček a spermií do břišní dutiny VITI (Vaginal IntraTubal Insemination) - zavedení spermií do vejcovodů
Problémy spojené s IVF • OHSS – ovariální hyperstimulační syndrom nadměrná tvorba folikulů při stimulaci extrémně vysoké hodnoty pohlavních hormonů zahuštění krve (možnost orgánového selhání; riziko vzniku trombů) • Krvácení • Problémy spojené s anestezií • Vícečetné těhotenství • Redukce počtu plodů • Mimoděložní těhotenství
9
