MS methode voor het bestuderen van tryptofaan-depletie bij patiënten met een chronische inflammatoire darmziekte

Vakgroep Organische Chemie Onderzoeksgroep: Scheidingstechnieken

Ontwikkeling van een snelle LC-MS/MS methode voor het bestuderen van tryptofaan-depletie bij patiënten met een chronische inflammatoire darmziekte

Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Master in de Chemie door

Pieter - Jan Sabbe

Academiejaar 2009-2010

Promotor: prof. dr. Patrick Sandra Copromotor: dr. Frédéric Lynen Begeleider: Vivienne Malanchin

 

WOORD VOORAF

“Welcome to the exciting world of chemistry ...”, herinner ik me als de eerste woorden die ik las toen ik 5 jaar geleden aan deze studie begon. ‘Exciting’ is deze trip doorheen de wondere wereld der wetenschap op de Sterre zeker en vast geweest. Het is een periode geweest van vallen en opstaan, een periode waar obstakels niet vreemd waren en waar wat doorzettingsvermogen vereist was. Dit alles heeft geholpen tot het vormen van mezelf als wetenschapper, maar ook als jongvolwassene ...

Graag zou ik Prof. Dr. P. Sandra, mijn promotor, bedanken voor de geboden kans om deze thesis te kunnnen vervolmaken in zijn onderzoeksgroep. Speciale dank aan de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent, o.l.v. Dr. Harald Peeters, voor het voorzien van de nodige plasmamonsters, die onontbeerlijk waren in het tot stand komen van deze scriptie. Fr´ed´eric zou ik hartelijk willen bedanken voor zijn grote hoeveelheid geduld, zijn v´ele verbeterwerk en zijn talloze antwoorden op mijn evenvele vragen. Vivienne, grazie tante! Senza il tuo aiuto e i tuoi consigli, non avrei potuto scrivere questa tesi. Thomas voor zijn geweldige introductie in de wondere wereld van ‘den 2000’ en voor zijn h´o´og rots-in-de-branding gehalte op het vlak van troubleshooting ervan. i

I would also like to thank Kai for his elaborate work and extensive help he gave me on statistics and chemometrics. Seppe, Barbara en J´ ulia, mijn lotsgenoten in het PARC. Bedankt voor de vele ontspanning voor, tijdens en na de inspanning. Bedankt voor alles, Gr`acies per tot! Graag zou ik alle andere collega’s van het PARC bedanken voor de fijne tijd gedurende het ganse jaar.

Deze scriptie vormt niet enkel en alleen het sluitstuk van mijn studie, maar vormt ook het eindpunt van een h´e´el spannende periode als ‘student in Gent’. Ik zou mezelf niet zijn indien ik hierbij sommige mensen niet zou bedanken. De musketiers: Stijnie, Driesken, Tom en Montie. Bedankt voor de ongelofelijke periode samen op de Sterre! Gel, bro in crime, voor de vele LEGEN — wait for it — DARY nights in Gent! Bobon als mijn vaste vriendin op donderdagavond! Zus, Koenraad en de rest van mijn familie en vrienden voor hun onvoorwaardelijke steun. Merci!

Als laatste, en evenzeer de belangrijkste, zou ik graag mijn ouders bedanken voor de geboden kans om deze periode te mogen meemaken. Mama en Papa, zonder jullie zou me dit nooit gelukt zijn! Bedankt voor ´alles!

The end is not near, it’s here!

Gent 20 mei 2010

ii

INHOUDSOPGAVE

Inleiding en doelstelling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Fundamentele aspecten van de chromatografie

v 3

1.1

Het begrip ‘Chromatografie’ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3

1.2

Geschiedenis

4

1.3

Het chromatografisch proces

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

6

1.3.1

Differenti¨ele migratie: schotelmodel . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

8

1.3.2

Resolutie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.3.3

Bandverbreding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.4

Instrumentele aspecten van HPLC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1.5

Massaspectrometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 1.5.1

Principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.5.2

Theoretische en instrumentele aspecten van LC-MS/MS . . . . . . . 25

2 Statistiek en chemometrie

35

2.1

Standaarddeviatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

2.2

Relatieve standaarddeviatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.3

Detectielimiet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.4

Significantie: de t-toets

2.5

Principale componenten analyse

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 iii

INHOUDSOPGAVE 2.6

Kleinste-kwadraten regressie (PLS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3 Literatuurstudie 3.1

43

Inleiding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43 3.1.1

De ziekte van Crohn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

3.1.2

Colitis ulcerosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.2

Pathogenese van IBD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.3

Tryptofaan-depletie en vermoeidheid bij IBD: een oorzakelijk verband?

3.4

3.3.1

Tryptofaan-depletie bij verhoogde IDO-activiteit . . . . . . . . . . . 49

3.3.2

Emotionele gevolgen van tryptofaan-depletie . . . . . . . . . . . . . 50

Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine: een overzicht. . 51 3.4.1

Gaschromatografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.4.2

Vloeistofchromatografie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.4.3

Detectie van tryptofaan en kynurenine. . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.4.4

Monstervoorbereiding en kwantificatie. . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

4 Experimenteel Gedeelte 4.1

4.2

4.3

57

Algemene Experimentele Aspecten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 4.1.1

Chemicali¨en . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.1.2

Instrumentatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.1.3

Veiligheidsaspecten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.1.4

Ethische commissie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

Optimalisatie van de scheiding van de analieten op een Kinetex kolom. . . . 58 4.2.1

Bereiden van de stockoplossing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.2.2

Ontwikkelen van een gradi¨ent elutiemethode. . . . . . . . . . . . . . 59

Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer . . . . . 64 4.3.1

4.4

. . 48

Optimalisatie van de MS-parameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

Kwantificatie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 4.4.1

Kynurenine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

4.4.2

Tryptofaan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 iv

INHOUDSOPGAVE 4.5

Monstervoorbereiding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

4.6

Batchsamenstelling en resultaat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

5 Statische analyse

81

5.1

Distributie van data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

5.2

T-Toets . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 5.2.1

Kynurenine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5.2.2

Tryptofaan . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5.2.3

KYN/TRP-Ratio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

5.3

Principale componenten analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

5.4

Kleinste-kwadraten regressie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

6 Conclusie

91

Appendix

93

Afkortingen

99

v

INHOUDSOPGAVE

vi

Inleiding en doelstelling De ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, de 2 meest uitgesproken voorbeelden van een chronische inflammatoire darmziekte (Inflammatory Bowel Disease, IBD), treffen ongeveer 0,1 tot 0,2 % van de Belgische bevolking. In absolute cijfers betekent dit 10.000 tot 20.000 pati¨enten in Belgi¨e en tot 4 miljoen wereldwijd. De incidentie (het aantal nieuwe gevallen per jaar) in Belgi¨e bedraagt gemiddeld 4 tot 10 per 100.000 inwoners. Chronische ontstekingen op slijmvlies van het maagdarmkanaal ontstaan door het onophoudend werken van het intestinale immuunsysteem. Deze ziekten verlopen via opstoten (opflakkeringen) en remissies (een periode van tijdelijk herstel die soms enkele jaren kunnen duren). De symptomen van IBD’s zijn vooral spijsverteringsklachten, gepaard gaande met buikpijn en diarree. IBD’s kunnen ernstige gevolgen hebben voor de gezondheid, zoals sterk gewichtsverlies, ondervoeding, groeiachterstand bij kinderen, ... Ondanks uitvoerige studies en klinische ervaringen gedurende de afgelopen decennia, blijven de etiologische oorzaken verantwoordelijk voor deze afwijking onzeker en het verloop van de pathogenese blijft onvolledig. Net zoals bij andere chronische ziektes, is vermoeidheid een frequent geuite klacht bij pati¨enten met een inflammatoir darmlijden en tevens ´e´en van de belangrijkste symptomen tijdens een opstoot van de ziekte. Opvallend is echter dat deze klacht ook nog prominent aanwezig kan zijn wanneer er geen objectiveerbare ziekte-activiteit meer is. Deze chronische vermoeidheid kan ernstige vormen aannemen en voor de pati¨ent als invaliderend worden ervaren, met belangrijke psychosociale en professionele implicaties tot gevolg. Studies over vermoeidheid in inflammatoir darmlijden en de oorzaak ervan zijn echter schaars tot onbestaande. Pogingen om de vermoeidheid bij IBD-pati¨enten te koppelen aan verstoorde mineraal- en vitamine-A concentraties (zoals bv. ijzer, foliumzuur, koper, zink, Vit B1, Vit B12, ...) bleken weinig succesvol.

Dit project maakt deel uit van een ruimere studie in samenwerking met de dienst gastroenterologie van het UZ Gent o.l.v. Dr. Harald Peeters. Het doel van dit project bestaat uit het ontwikkelen van een scheidingsmethode om de concentraties van tryptofaan en zijn toxisch metaboliet kynurenine te bepalen in bloedplasma van IBD-pati¨enten en controlepersonen. Het idee dat hierachter schuilt is dat de kynurenine/tryptofaan-verhouding de activiteit van het enzyme Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) weerspiegelt. Eerder werd aangetoond dat een verhoogde IDO-activiteit het gevolg is van het in werking treden van het immuunssysteem bij IDB-pati¨enten. IDO katalyseert de snelheidsbepalende stap in het katabolische kynurenine-reactiepad van tryptofaan, met lagere tryptofaanconcentraties (tryptofaan-depletie) en hogere kynurenineconcentraties als gevolg. Tryptofaan dient als precursor voor serotonine (5-HT), een belangrijke centrale neurotransmitter. Verlaagde serotonineconcentraties, als gevolg van tryptofaan-depletie, in combinatie met de toxische activiteit van kynurenine (en zijn metabole producten) zouden een mogelijke verklaring kunnen bieden voor de voortdurende vermoeidheid bij IBD-pati¨enten. Ontwikkeling van een snelle analysemethode — gebaseerd op omkeerfase LC-MS/MS — voor niet-gederivatseerd tryptofaan en kynurenine in bloedplasma, in combinatie met een weinig arbeidsintensieve monstervoorbereiding werden vooropgesteld. 149 plasmamonsters, waarvan 104 afkomstig van IBD-pati¨enten en 45 controlepersonen, werden geleverd door de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent. De specificiteit en gevoeligheid van LCESI-MS/MS werden optimaal benut om simultaan het tryptofaan- en kynureninegehalte in het bloedplasma van de 149 monsters te bepalen. Nadien werd de bekomen data onderworpen aan enkele standaard statische testen, zoals de t-toets, en enkele meer geavanceerde chemometrische technieken, zoals principale componenten analyse en kleinste-kwadraten regressie. In het ruimere kader van deze studie zal de IDO-activiteit, gebaseerd op de bekomen resultaten tijdens deze thesis, gecorreleerd worden met vermoeidheidsstudies uitgevoerd op de IBD-pati¨enten.

HOOFDSTUK

1

FUNDAMENTELE ASPECTEN VAN DE CHROMATOGRAFIE

1.1

Het begrip ‘Chromatografie’

Chromatografie is in de loop der jaren uitgegroeid tot een grote verscheidenheid aan methoden en toegepaste technieken waardoor het niet simpel is om een ´e´enduidige, allesomvattende definitie te verschaffen. De International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) geeft de volgende definitie (letterlijk vertaald uit het engels): “Chromatografie is een fysische scheidingsmethode waarbij de te scheiden componenten verdeeld worden over twee fases, waarvan ´e´en fase stationair is (stationaire fase) terwijl de andere fase (mobiele fase) in welbepaalde richting beweegt. ”. [1] Volgens van Dale wordt chromatografie als volgt omschreven: “scheidingsmethode voor mengsels (gas- of vloeistofmengsels) waarbij deze door een adsorberende kolom worden geleid ”. Een duidelijk onderscheid dient vooraf gemaakt te worden tussen Analytische Chromatografie en Preparatieve Chromatografie. Analytische Chromatografie is een micro-analytische methode waarbij de samenstelling van een monster — doorgaans niet groter dan 10−2 g — zowel kwalitatief als kwantitatief onderzocht worden. Daarnaast wordt chromatografie, vooral vloeistofchromatografie, toegepast voor het isoleren van zuivere verbindingen in grote hoeveelheden; een methode die preparatieve chromatografie genoemd wordt. [2] 3

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie

1.2

Geschiedenis

Hoewel de Duitse kleurchemist Carl Runge voor het eerst in 1856 een scheiding van kleurstoffen - gebaseerd op een techniek die nu vergelijkbaar is met papierchromatografie publiceerde, wordt de Russiche Botanicus Mikhail Tswett (14 mei 1872 - 26 juni 1919) als de vader van de Chromatografie beschouwd. Tswett scheidde in 1903 voor het eerst plantenextracten (bladpigmenten) door gebruik te maken van een glazen kolom gepakt met CaCO3 deeltjes en petroleumether (mengsel van laagkokende alifatische koolwaterstoffen) als eluens. De plantenextracten zakten onder invloed van de zwaartekracht met het eluens mee met als resultaat een serie van gekleurde banden op de kolom. Tswett kende elke band toe aan een verschillende component van het plantenextract.[3] Dit vormde meteen ook de basis voor de naam die hij aan de techniek gaf: Chromatografie. Etymologisch kan ‘chromatografie’ ontleed worden in het Griekse ‘chroma’ (kleur) en ‘graphein’ (schrijven) en betekent dus letterlijk ‘kleurschrijven’. Dat de Russische betekenis van ‘Tswett’, kleur is, zal echter wel niet geheel ontoevallig zijn. Hoe baanbrekend Tswetts uitvinding ook was, veel erkenning van zijn tijdsgenoten kreeg hij er niet voor. Mede door de publicatie van zijn doctoraatsverhandeling in het Russisch werden zijn idee¨en maar weinig verspreid waardoor de daaropvolgende 25 jaar de methode niet evolueerde.[4] Zoals het echter vaak voorkomt in de geschiedenis kreeg Tswett pas post mortem erkenning en vanaf 1930 werd kolomchromatografie een gevestigde techniek in laboratoria over de hele wereld. In 1931 werd nieuw leven in de chromatografie geblazen door Kuhn en Lederer.[5] Deze biochemici slaagden erin om de eerste goede preparatieve scheiding van caroteno¨ıden te bekomen. Deze prestatie leverde hen in 1938 de Nobelprijs voor scheikunde op. Het was deze scheiding die het begin betekende van een nieuwe periode waarin de chromatografie een buitengewone bloei zou kennen. Tot op dit moment werd enkel adsorptiechromatografie toegepast. Hierbij wordt de scheiding bekomen door een affiniteitsverchil van de componenten voor de stationaire fase (een adsorbens). Het was wachten tot 1941 vooraleer de eerste scheiding gebaseerd op vloeistof-vloeistof-verdelingschromatografie plaatsvond. Martin en Synge [6] realiseerden 4

1.2. Geschiedenis een scheiding van carbonzuren door gebruik te maken van een met-water-beladen silicagelkolom als stationaire fase en chloroform als mobiele fase. Mede door dit experiment, leverde hun onderzoek hen de Nobelprijs op in 1952. Vloeistofchromatografie bleef, vooral door gebrek aan reproduceerbaarheid en automatisatie, weinig populair gedurende daaropvolgende decennia. Als ‘uitvinders’ van de gaschromatografie, in de vorm waarin we die tegenwoordige in de analytische chemie terugvinden, worden over het algemeen Martin en James naar voor geschoven [2]. In 1952 werd de scheiding van een mengsel van lagere carbonzuren door hen voor het eerst tot een goed einde gebracht. Hierbij werd het mengsel op een glazen kolom, gevuld met diatomee¨enaarde beladen met siliconenolie en stearinezuur, gebracht en werd stikstofgas (N2 ) als mobiele fase gebruikt. De succesvolle scheiding betekende het begin van een stormachtig zoeken naar nieuwe ontwikkelingen in de gaschromatografie en tevens ook het startschot van de instrumentele scheidingsmethodes. Na 1970 echter heeft ook de vloeistofchromatografie zich snel ontwikkeld tot een volwaardige analytische scheidingstechniek. Aminozuuranalyse gebaseerd op ionenuitwisselingschromatografie [7] en de introductie van de eerste gelpermeatiechromatograaf (GPC) door Waters Associates [8] worden beschouwd als de voorloper van de hedendaagse hoge performantie vloeistofchromatografie (HPLC). In beide systemen werd de mobiele fase door een kolom — bestaande uit kleine deeltjes — gepompt onder hoge druk. De eluerende fracties werden continu gedetecteerd wat uiteindelijk resulteerde in een chromatogram bestaande uit een reeks pieken uitgezet in functie van de tijd. Onder invloed van Csaba Horvath en Joseph Huber werd eind jaren ‘60 de techniek verder ontwikkeld tot een volwaardig systeem dat niet enkel alleen aminozuur- of polymeermengsels kon scheiden [9]. In 1941 stelde Martin al dat: “De meest effici¨ente scheidingen worden bekomen door gebruik te maken van kolommen met kleine deeltjes en een groot drukinterval over de gehele lengte van de kolom.” [10] Vanaf 1970 tot op heden was (en blijft) het een voortdurend optimaliseren van HPLC als scheidingstechniek. Scheidingstijden werden, zoals Martin had voorspeld, drastisch verlaagd door het ontwikkelen van pompen die hogere drukken aankunnen en het fabriceren van kolommen met een steeds kleinere partikeldiameter. 5

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie De belangrijkste mijlpalen uit de geschiedenis van de Chromatografie werden samengevat in Tabel 1.1. Tabel 1.1: Geschiedenis van de chromatografie.

1.3

Wanneer? 1903

Wie? Tswett

Wat? Eerste beschrijvingen van vloeistofchromatografie op basis van adsorptiefenomenen in een kolom.

1931 1938 1941 1944

Lederer, Kuhn et. al. Izmailov, Shraiber Martin, Synge Consden, Gordon, Martin

1949 1952

Spedding & Tompkins James, Martin

1952 1957 1958 1962

Martin, Synge Golay Flodin, Porath Klesper

1966

Piel

1980 1984

Jorgenson Terabe

Eerste belangrijke preparatieve scheidingen. Dunlaagchromatografie (TLC). Verdelingschromatografie (LC). Introductie van papierchromatografie (PC) dat nu hoofdzakelijk vervangen werd door TLC. Ionenuitwisselingschromatografie Gas-vloeistofchromatografie (GC) als begin van de instrumentele scheidingsmethodes. Nobelprijs voor Scheikunde Capillaire GasChromatografie (CGC) Gel Permeatie Chromatografie (GPC) Eerste introductie van een Superkritische vloeistof als mobiele fase Hoge Performantie VloeistofChromatografie (HPLC) Capillaire Zone Elektroforese (CZE) Micellaire Elektrokinetische Chromatografie

Het chromatografisch proces

Na injectie van het monster vindt scheiding op de kolom plaats via evenwichtinstelling tussen twee verschillende fasen: een stationaire fase met een groot contactoppervlak en een mobiele fase. In HPLC wordt gebruik gemaakt van een kolom die gepakt is met kleine sferische deeltjes waarvan de diameter varieert tussen 1,5 en 5 µm. Deze deeltjes bestaan meestal uit poreuze silica waarvan de binnenwand van deze porie bezet is met stationaire fase, zoals weergegeven in Figuur 1.1. Afhankelijk van de scheidingsmode die aangewend wordt, zal de stationaire fase verschillen. In dit werk wordt omkeerfase chromatografie (Reversed Phase Chromatography, RPC) aangewend om de scheiding te bekomen. De principes van de verschillende scheidingsmodes in HPLC worden uiteengezet in Tabel 1.2 6

1.3. Het chromatografisch proces .

Figuur 1.1: Schematische voorstelling van een individueel silicadeeltje waarbij aan de wand van de porie C18 -groepen verankerd werden als stationaire fase. Tabel 1.2: Verschillende scheidingsmodes in HPLC. Chromatografische scheidingsmode Normaalfase Chromatografie (Normal Phase Chromatography, NPC)

Omkeerfase Chromatografie (Reversed Phase Chromatography, RPC)

Scheidingsprincipe De kolom is polair (bv. ongebonden silica of polair gebonden functionele groepen zoals cyano-, amino- en diolgroepen) en de mobiele fase is apolair (bv. hexaan, heptaan,...). De scheiding gebeurt op basis van polariteit waarbij de meest polaire component de grootste retentietijd heeft. NPC wordt hoofdzakelijk gebruikt voor monsters die onoplosbaar zijn in water; voor preparatieve HPLC en voor de scheiding van isomeren. De kolom is apolair (silica gemodificeerd met bv. C18 of C8 ) en de mobiele fase is een mengsel van water en een organisch solvent (bv. acetonitril, methanol) en meestal een zuur of basisch additief. De scheiding gebeurt op basis van hydrofobiciteit, waarbij de meest hydrofobe (apolaire) componenten het meest geretenteerd zijn. RPC is de meest gebruikte mode in HPLC omwille van zijn brede toepasbaarheid en uitstekende reproduceerbaarheid, vooral voor de analyse van wateroplosbare monsters.

7

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie

1.3.1

Hydrofiele interactie Chromatografie (Hydrophilic Interaction Chromatography, HILIC)

De kolom is polair (silica of silica gemodificeerd met amidegroep) en de mobiele fase bestaat uit een mengsel van water en hoofdzakelijk organisch solvent (bv. acetonitril). HILIC wordt vooral gebruikt voor de analyse van extreem polaire componenten die weinig geretenteerd zijn in RPC.

Size Exclusie Chromatografie (Size Exclusion Chromatography, SEC)

Voor SEC wordt een inerte kolom bestaande uit een hars of zeoliet gebruikt in combinatie met een waterige of een organische mobiele fase. De scheiding gebeurt op basis van de grootte/moleculair gewicht van de analieten en wordt het meest gebruikt voor de analyse van grote biomoleculen of synthetische polymeren.

Affiniteitschromatografie (Affinity Chromatography, AC)

De stationaire fase vertoont affiniteit voor welbepaalde componenten uit het mengsel op basis van specifieke sleutel/slot-interacties die de natuurlijke activiteit nabootsen.

Ionenuitwisselingschromatografie (Ion Exchange Chromatography, IEC)

De kolom bevat een geladen groep die analietionen van de tegengestelde lading kan binden. De mobiele fase is meestal een waterige zoutoplossing in combinatie met een buffer. In IEC worden monsterionen uitgewisseld met ionen van de mobiele fase. IEC wordt gebruikt voor het scheiden van ioniseerbare componenten zoals zuren en basen en vooral voor de analyse van grote biomoleculen zoals prote¨ınen en DNA.

Chirale Chromatografie (Chiral Chromatography)

De stationaire fase vertoont verschillende interactie met de enantiomeren van een component met asymmetrische koolstofcentra.

Differenti¨ ele migratie: schotelmodel

Differenti¨ele migratie (verschillende gemiddelde snelheid waarbij componenten doorheen de kolom bewegen) vormt de basis van een chromatografische scheiding. Zonder een verschil in migratiesnelheid kan een scheiding niet plaatsvinden [11]. Dit verschil in migratiesnelheid komt tot stand doordat de componenten van het mengsel op een dynamische manier verdeeld worden tussen de stationaire en de mobiele fase. 8

1.3. Het chromatografisch proces Volgens het schotelmodel (plate theory) kan een kolom opgedeeld worden in theoretische schotels. Wanneer een analiet doorheen de kolom beweegt ondergaat het een reeks sorptieen desorptieprocessen tussen de stationaire en de mobiele fase. Dit is een dynamisch proces dat gebeurt via tussenliggende evenwichtsinstellingen. X(mobielef ase) ⇐⇒ X(stationairef ase)

De schotellengte H is dan de kolomlengte die een component nodig heeft om een evenwichtsinstelling met de mobiele fase te bereiken.

Figuur 1.2: Evenwichtsinstelling van solvent- en analietmolecules tussen de mobiele en de stationaire fase. Het effect van dit dynamisch evenwicht is een verschil in migratiesnelheid.

Zoals in Figuur 1.2 te zien is, bevindt molecule X zich op elk moment evenveel in de stationaire als in de mobiele fase. Molecule Z bevindt zich daarintegen meer in de stationaire fase. Er kan dus gesteld worden dat molecule Z meer geretenteerd is en bijgevolg trager door de kolom migreert. Het dynamische evenwicht en de migratiesnelheid van een component zijn afhankelijk van de moleculaire structuur van de component, de chemische samenstelling van zowel de mobiele als de stationaire fase en van de temperatuur. 9

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie

1.3.2

Resolutie

De retentiefactor k Wanneer een analietmolecule doorheen de kolom migreert, spreiden de molecules zich uit over een bepaald volume in de kolom. Het volume in de kolom dat ´e´en soort component van het mengsel bevat wordt een band genoemd. Wanneer een band uit de kolom elueert en opgenomen wordt in het chromatogram wordt er van een piek gesproken. Een chromatogram bevat zowel kwalitatieve (retentietijd) als kwantitatieve (piekoppervlakte) informatie. Uit Figuur 1.3 kunnen enkele belangrijke parameters gehaald worden.

Figuur 1.3: Schematische voorstelling van een chromatogram: tr , t0r en t0 samen met wb , wh en σ

• De retentietijd tr is de gemiddelde verblijftijd van het analiet in het systeem, startend vanaf de injectie tot elutie en detectie. De retentietijd tr is componentspecifiek voor een soort kolom onder welbepaalde omstandigheden en is bijgevolg een kwalitatief criterium. • De dode tijd t0 is de tijd die een niet weerhouden component nodig heeft om gedetecteerd te worden. Het is bijgevolg de tijd die de mobiele fase nodig heeft om het systeem te doorlopen. • De netto retentietijd t0r is de tijd dat de component in de stationaire fase verblijft. 10

1.3. Het chromatografisch proces De netto retentietijd kan als volgt berekend worden volgens vergelijking 1.1:

t0r = tr − t0

(1.1)

De lineaire snelheid u van de mobiele fase kan bepaald worden met de retentietijd tr en de kolomlengte L volgens vergelijking 1.2: L tr

u=

(1.2)

De retentiefactor k (capaciteitsfactor) wordt gedefinieerd als de verblijftijd van de component in de stationaire fase over de verblijftijd in de mobiele fase.

k=

tr − t0 t0 = r t0 t0

(1.3)

Bij voorkeur wordt de k-waarde gebruikt om retentie aan te geven omdat deze waarde dimensieloos is en bijgevolg onafhankelijk van de kolomparameters (lengte en diameter, partikelgrootte). Zoals eerder vermeld is de plaattheorie gebaseerd op een evenwichtsproces waarbij het analiet dynamisch verdeeld wordt over de mobiele en de stationaire fase. Aan dit evenwichtsproces kan de evenwichtsconstante K (soms ook verdelingsco¨effici¨ent of distributieconstante) toegekend worden (vergelijking 1.4).

K=

cS cM

(1.4)

Hierbij zijn cS en cM de concentratie (in mol/l) van het analiet in respectievelijk de stationaire en de mobiele fase. De waarde van de evenwichtsconstante K wordt enerzijds bepaald door de chemische structuur van het analiet en anderzijds door de chemische natuur van de stationaire en de mobiele fase. Daar K een thermodynamische constante is, is K ook temperatuursafhankelijk. De evenwichtsconstante K en de retentiefactor k zijn gekoppeld volgens vergelijking 1.5:

K=

QS × VM QS /VS = = kβ QM /VM QM × VS 11

(1.5)

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Hierbij zijn QS = hoeveelheid (mol) van de component in de stationaire fase, QM = hoeveelheid (mol) van de component in de mobiele fase, VS = volume van de stationaire fase, VM = volume van de mobiele fase. De evenwichtsconstante K wordt zo opgesplitst in : k = retentiefactor, β = faseratio; kolomafhankelijke constante. De selectiviteit α Om twee opeenvolgende pieken goed van elkaar te kunnen onderscheiden is het noodzakelijk dat hun retentiefactoren, en bijgevolg dus ook hun distributiefactoren, voldoende van elkaar verschillen. Een dimensieloze factor die het verschil in retentie tussen twee pieken weergeeft is de relatieve retentieverhouding of selectiviteit α en wordt gegeven door vergelijking 1.6.

α=

k2 k1

(1.6)

Hoe groter de selectiviteit, hoe groter het verschil in de retentietijd en hoe verder de analietpieken van elkaar gelegen zijn. De selectiviteitsfactor α is voornamelijk afhankelijk van de stationaire fase en de chemie van de te scheiden componenten. De resolutie van een scheiding verbeteren gebeurt in de eerste plaats via de optimalisatie van de selectiviteit. De effici¨ entie: schotelgetal N De effici¨entie van een chromatografische kolom is het vermogen van de kolom om piekverbreding tegen te gaan en dus een hoge resolutie te leveren. Het theoretisch aantal platen (schotels) is een maat voor de kolomeffici¨entie. Een groter aantal platen geeft aanleiding 12

1.3. Het chromatografisch proces tot scherpere pieken en dus een betere scheiding. Uit een chromatogram (Figuur 1.3) kunnen de parameters gevonden worden die nodig zijn om het het schotelgetal N te berekenen. N wordt berekend volgens  2  2  2 tr tr tr N= = 5.54 = 16 σ wh wb

(1.7)

In geval van een gaussiaanse piek geldt: tr = retentietijd, σ = halve breedte van de piek op 60.7 % van de hoogte van de piek, wh = de breedte van de piek op halve hoogte (FWHM) , wb = de breedte van de piek aan de basis. Wanneer de dode tijd in rekening gebracht wordt, wordt het effectieve plaatgetal Nef f bekomen:  Nef f = 5.54

tr0 wh

2 (1.8)

De effici¨entie van een kolom is invers gerelateerd met de schotellengte (height equivalent of a theoretical plate, H). H stelt hierbij de kortst mogelijke kolomlengte voor die vereist is zodat een evenwicht zich kan instellen voor de verdeling van een analiet over de twee fases. H kan berekend worden volgens vergelijking 1.9. L N

H=

(1.9)

Hoe kleiner de H-waarde is, hoe meer platen de kolom bevat. Een kolom met een hoger aantal platen levert scherpere pieken en een betere resolutie. Voor gepakte kolommen kan aangetoond worden dat H ≈ 2dp en dat bijgevolg :

N=

L 2dp

13

(1.10)

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie In dit werk werd gebruik gemaakt van een Kinetex-kolom (Phenomenex) waarvan de lengte 5 cm is en de deeltjesgrootte 1,7 µm wat in principe een typische plaatgetal van N = 13.888 zou opleveren. De Kinetex-kolom is gepakt met partikels bestaande uit een harde kern van 1,25 µm en een poreuze buitenlaag van 0,23 µm, ook wel Halo-partikels genoemd. De poreuze silicalaag vormt hierbij de stationaire fase, waardoor de diffusieafstand een stuk korter is in vergelijking met klassieke poreuze deeltjes met dezelfde dimensies, waardoor een snellere massastransfer verkregen wordt. Een snellere massatransfer resulteert in een verlaagde C-term (zie verder) waardoor een hogere effici¨entie bereikt wordt. Snelle analyses kunnen met dit soort kolom verwezenlijkt worden omwille van de kleine partikelgrootte (1,7 µm) en de unieke harde deeltjes technologie. Dit type materiaal vereist minder tegendruk voor dezelfde effici¨entie, waardoor deze kolommen op conventionele HPLC-apparatuur kunnen gebruikt worden [12]. Het berekende plaatgetal (N = 13.888) bij dergelijke partikels is dus onderschat. Resolutie Rs De resolutie Rs is een maat voor de scheiding van twee componenten op een bepaalde kolom (lengte, straal, stationaire fase, partikelgrootte) onder welbepaalde omstandigheden (aard en snelheid van de mobiele fase, temperatuur, ...) [4]. De resolutie is componentafhankelijk en kan berekend worden volgens :

Rs =

tr2 − tr1 1/2(wb1 + wb2 )

(1.11)

Hierbij zijn tr1 en tr2 de retentietijd van beide signalen en wb1 en wb2 de breedte van de piek aan de basis van beide signalen. Bij twee even grote pieken correspondeert Rs = 1, 50 met ongeveer een volledige scheiding. Door invullen van vergelijking 1.3 , 1.6 en 1.7 in vergelijking in 1.11 wordt de basisvergelijking van de chromatografie bekomen : 1√ Rs = N 4



α−1 α



k k+1

 (1.12)

Deze basisvergelijking bevat alle relevante parameters van een chromatografische schei14

1.3. Het chromatografisch proces ding: kolomeffici¨entie N, selectivititeitseffici¨entie α en retentiefactor k. Elke ingreep in het scheidingsproces die N, α of k doen toenemen heeft een gunstig effect op de resolutie. De selectiviteitsfactor α heeft de grootste invloed op de resolutie. α verhogen van 1, 05 tot 1, 10 resulteert bijna in een verdubbeling van Rs . De keuze van de stationaire fase is dus essentieel in het ontwerp van de scheidingsmethode. Kolomeffici¨entie heeft minder invloed op de resolutie (a.g.v. de vierkantswortel in de vergelijking) dan de selectiviteitsfactor, maar optimalisatie van N levert betere scheidingen voor alle componenten op waarbij optimalisatie van α doorgaans slechts een verbetering voor ´e´en piekpaar oplevert. De retentiefactor k heeft slechts een geringe invloed op de resolutie voor k-waarden die groter zijn dan 4. Optimalisatie van de retentiefactor kan gerealiseerd worden door de hoeveelheid stationaire fase te verhogen of door de temperatuur te verlagen.

1.3.3

Bandverbreding

De kwaliteit van een chromatografische scheiding is sterk afhankelijk van de kolomeffici¨entie N die op zijn beurt verbonden is met de breedte van de eluerende pieken in het chromatogram. Hoe groter de N-waarde is, des te scherper de pieken zijn en hoe beter de resolutie. In het ideale geval heeft de elutiepiek een Gaussiaanse klokvorm, waarbij het signaal symmetrisch rond het maximum is. De piek heeft een welbepaalde breedte, uitgedrukt door de parameters σ, wh en wb (zie Figuur 1.3) [13]. De realiteit toont echter altijd een afwijking van het ideale geval. Intra- als extra-kolom aspecten dragen bij tot bandverbreding (in het systeem) en leiden bijgevolg ook tot piekverbreding in het chromatogram. De piekbreedte neemt toe met de vierkantswortel van zijn afgelegde afstand, waardoor de variantie σx2 lineair zal toenemen met de afgelegde weg [14]. Mathematisch wordt dit:

H=

dσx2 dL

(1.13)

De afwijking van de ideale Gauss-curve wordt vaak uitgedrukt door de variantie σ 2 (bij een curve met standaardafwijking σ). Zoals hoger vermeld is de effici¨entie van de kolom evenredig met zijn lengte, waardoor het wenselijk is de afwijking uit te drukken in variantie 15

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie σ 2 per eenheid van kolomlengte (zie vergelijking 1.14)

N=

L2 σx2

(1.14)

Drie intra-kolom processen kunnen aanleiding geven tot intra-kolom bandverbreding. Deze zijn: Eddy diffusie (A), longitudinale diffusie (B) en massatransfer (C). Eddy diffusie (A) Als gevolg van onregelmatigheden in de pakking van een kolom en door het gebrek aan volledige uniformaliteit in de vorm en grootte van de silicadeeltjes kunnen verschillende vloeipaden in de kolom ontstaan (Figuur 1.4 ). Analietmoleculen die tot een sneller vloeipad behoren elueren sneller dan andere moleculen waardoor een variatie in de retentietijden optreedt. Hoe groter deze variatie, hoe groter de band- en piekverbreding . Deze bijdrage staat bekend als de Eddy diffusie en wordt gedefinieerd door de A-term:

A = 2λdp

(1.15)

waarbij : λ = stapelingsfactor, dp = partikeldiameter.

Figuur 1.4: Schematische voorstelling van het Eddy Diffusie fenomeen

Daar variantie afhankelijk is van de lengte van de kolom (zie hoger) en de A-term een kolomkarakteristiek is geldt : 16

1.3. Het chromatografisch proces

2 σEddy = 2λdp L

(1.16)

Invullen in vergelijking 1.14 levert dit:

HEddy =

2 σEddy

L

= 2λdp = A

(1.17)

Deze bijdrage van de Eddy-diffusie tot plaathoogte en bijgevolg de bandverbreding is afhankelijk van de grootte van de silicadeeltjes en het pakken ervan. Bij open tubulaire kolommen kan deze term verwaarloosd worden.

Longitudinale diffusie Als gevolg van verschillende concentratiezones in de mobiele fase zullen analietmoleculen diffunderen vanuit hoog geconcentreerde naar laag geconcentreerde zones. Indien deze diffusie radiaal verloopt heeft dit geen bijdrage tot bandverbreding, axiale diffusie daarintegen wel. Axiale of longitudinale diffusie wordt afgebeeld in Figuur 1.5 en is gegeven door:

B = 2γDM

met

γ = obstructiefactor,

DM = diffusieco¨ effici¨ ent in de mobiele fase. 17

(1.18)

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie

Figuur 1.5: Schematische voorstelling van de piekverbreding die optreedt als gevolg van longitudinale diffusie.

De B-term is afhankelijk van de kolomlengte L en de snelheid van de mobiele fase u. Logischerwijs zullen analietmoleculen minder de kans hebben om te diffunderen bij een 2 snellere solventstroom dan bij een tragere. De variantie σdif f wordt gedefinieerd door:

2 σdif f =

2λDM L u

(1.19)

Analoog als voor A, wordt de bijdrage van de longitudinale diffusie aan de bandverbreding gegeven door:

Hdif f =

2 σdif f

L

=

2λDM B = u u

(1.20)

Hieruit blijkt dat een hogere snelheid van de mobiele fase en kleine diffusieco¨effici¨enten een gunstig effect hebben op de piekverbreding als gevolg van longitudinale diffusie. Massatransfer Een derde proces dat bijdraagt aan band- en piekverbreding is massatransfer (C) tussen de stationaire en de mobiele fase. Bij gepakte kolommen wordt bv. een onvolledige evenwichtsinstelling bekomen doordat sommige analietmoleculen dieper in de porie van het silicadeeltje penetreren dan andere (voor CM ). Hierdoor zullen sommige analietmoleculen langer in het silicadeeltje verblijven dan andere waardoor die niet verder door de kolom kunnen migreren en uiteindelijk elueren. Bij open tubulaire kolommen, die vooral in 18

1.3. Het chromatografisch proces gaschromatografie (GC) gebruikt worden, is piekverbreding door de massatransfer vooral te wijten aan de trage diffusie doorheen de stationaire fase zelf. De massatransfer C kan dus opgedeeld worden in twee verschillende processen met elk hun verschillende snelheid (Vergelijking 1.21).

C = CM + CS

(1.21)

Waarbij • CM : het transport vanuit de mobiele fase naar het grensvlak tussen de mobiele en de stationaire fase. Deze factor is afhankelijk van processen die plaatsvinden aan de mobiele fase. • CS : het transport vanuit de stationaire fase naar het grensvlak tussen beide fases. Deze factor is afhankelijk van de afgelegde afstand in de stationaire fase en processen eigen aan deze fase. 2 De variantie σmassa en dus de piekverbreding nemen toe met de snelheid van de mobiele

fase u, daar er minder tijd is voor evenwichtsinstelling bij een hogere snelheid van de mobiele fase.

2 σmassa = CLu = (CM + CS )Lu

(1.22)

Met behulp van vergelijking 1.14 wordt de bijdrage van de C-term aan de piekverbreding gegeven door :

Hmassa =

2 σmassa CLu = = Cu L u

(1.23)

van Deemter vergelijking De totale bandverbreding is de som van de bijdragen geleverd door de Eddy diffusie, longitudinale diffusie en massatransfer :

H = HEddy + Hdif f + Hmassa = A + 19

B + Cu u

(1.24)

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie Vergelijking 1.24 is beter bekend als de van Deemter vergelijking en beschrijft de piekverbreding in de kolom in functie van de snelheid van de mobiele fase. Figuur 1.6 is de voorstelling van een van Deemter curve waarbij de plaathoogte in functie van de mobiele fase snelheid u is weergegeven. De ‘eigenlijke curve’ in stippellijn is een combinatie van de A-, B- en C-term en vertoont een minimum waar de effici¨entie maximaal is. Bijgevolg is de snelheid van de mobiele fase optimaal bij het minimum van deze curve.

Figuur 1.6: Schematiche voorstelling van de invloed van de A, B en C-term op de van Deemter curve.

De van Deemter vergelijking

geeft de componenten weer die de oorzaak vormen van

de intra-kolom piekverbreding. Naast deze 3 termen zijn er nog een aantal factoren die niet gerelateerd zijn aan de kolom, maar toch tot piekverbreding kunnen leiden. De belangrijkste extra-kolom effecten zijn :

• Tubings, fittings, ... om de verschillende delen van het systeem met elkaar te verbinden. Ze bevatten een dood volume dat zo klein mogelijk gehouden moet worden om piekverbreding te beperken. • Injectie: het ge¨ınjecteerde volume wordt zo klein mogelijk gehouden (in dit werk : 5 µl) om het Gaussiaans karakter van de piek te behouden. 20

1.4. Instrumentele aspecten van HPLC • Detectie: het volume van de doorstroomcel (flow cell) wordt in combinatie met de responstijd zo klein mogelijk gehouden.

1.4

Instrumentele aspecten van HPLC

Figuur 1.7 geeft schematisch de opstelling van een HPLC-systeem weer. Volgende onderdelen zijn genummerd terug te vinden op de figuur en zijn essentieel in een modern HPLC-systeem. Alle onderdelen zijn tevens terug te vinden in het systeem waarmee dit werk tot stand gekomen is, nl. ‘Waters Alliance 2690’.

Figuur 1.7: Schematische voorstelling van een HPLC-systeem.

1. Solventfles : Een reservoir voor de mobiele fase is een simpel toch essentieel onderdeel van een HPLC-systeem. Elke chromatgraaf bevat er tenminste 2, waarbij een aparte fles voorzien is voor zowel de waterige als de organische fase (indien er met omkeerfase LC gewerkt wordt). Vooraleer de mobiele fase de fles verlaat via ´e´en van de kanalen wordt het gefilterd via een inlet-filter. 2. Verbindingskanalen: ‘Tubings’ en ‘Fittings’ worden gebruikt om de verschillende componenten van het HPLC-systeem met elkaar te verbinden. Tubings zorgen voor het transport van het analiet en de mobiele fase door het systeem. Tubings vervaardigd uit PolyEther Ether Ketone (PEEK) worden vaak gebruikt omwille van hun flexibiliteit en gebruiksvriendelijkheid. Bij drukken hoger dan 7000 psi (482 bar) worden tubings uit roestvrij staal gebruikt. Essentieel is de kleine interne dia21

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie meter van tubings om het extra-kolom volume zo klein mogelijk te houden en om bandverbreding tegen te gaan. 3. Ontgassingssysteem: De aanwezigheid van luchtbellen in de mobiele fase kunnen leiden tot een drukverval in het systeem en bijgevolg weinig betrouwbare en reproduceerbare metingen. Ontgassen van de mobiele fase vooraleer het in het systeem ge¨ıntroduceerd wordt is dus noodzakelijk. Ontgassen kan vooraf gebeuren door de mobiele fase in het ultrasoonbad te plaatsen, maar meestal gebeurt dit on-line. On-line ontgassen is gebaseerd op de selectieve permeabiliteit van een tubing die doorheen een ge¨evacueerde kamer loopt. Het vacu¨ um zuigt het opgeloste gas doorheen de polymere wand van de tubing terwijl het solvent verder naar de mengpomp wordt gezogen. 4. Pompsysteem & mengkamer: Een hoge druk pomp (tot 400 bar) levert de mobiele fase met een precies gecontroleerd debiet tot in de mengkamer. In de mengkamer worden de solventen gemengd in de gewenste verhouding en naar de kolom gestuurd. Afhankelijk van het te analyseren mengsel kan gekozen worden voor een isocratische elutie of voor een gradi¨ent elutie. Bij isocratische elutie blijft de mobiele fase, ofwel een zuiver solvent ofwel een mengsel, onveranderd gedurende de analyse [15]. Bij gradi¨ent-elutie verandert de samenstelling van de mobiele fase gedurende de scheiding volgens een vooraf ingesteld schema. Het pompsysteem bestaat uit een heen en weer bewegende zuiger (reciprocating piston) vervaardigd uit saffier of porselien, een rubberen afsluitring (pump seal), ventielen (check valve) en een motor om de zuiger heen en weer te laten bewegen. 5. Injectiesysteem: Het injectiesysteem wordt gebruikt om een bepaalde hoeveelheid van het analiet in de kolom te introduceren zonder een druk- of debietverval te cre¨eren. Hiervoor wordt een zeswegkraan gebruikt (Figuur 1.8). In de laadpositie wordt de injectielus (loop) gevuld met het monster afkomstig van de injectienaald. De injectielus wordt volledig gevuld en het overtollige analiet wordt naar het afvalvat gestuurd. In deze positie is de kolom met de pomp verbonden waardoor er 22

1.4. Instrumentele aspecten van HPLC voortdurend mobiele fase door de kolom stroomt, dit om uitdroging te verkomen. Om het monster te introduceren in de kolom wordt de kraan 60◦ gedraaid naar de injectiepositie. In deze stand stuurt de pomp de mobiele fase door de loop naar de kolom waardoor het analiet samen met de mobiele fase op de kolom terecht komt.

Figuur 1.8: Laadpositie (links) en injectiepositie (rechts) van de zeswegkraan.

6. De kolom & kolomoven: De kolom is het hart van het HPLC-systeem. De kolom bestaat uit een stalen omhulsel waarin silicadeeltjes gepakt zijn. De pori¨en van elk silicadeeltje bevat de stationaire fase, bv. een octadecyl-groep (C18 ). In dit werk werd gebruik gemaakt van een kolom gepakt met 1,7 µm Kinetex C18 -deeltes. Om de scheiding van het mengsel onder controle te houden is temperatuurcontrole van de kolom noodzakelijk. Een constante temperatuur wordt bekomen door de kolom in een kolomoven te plaatsen. 7. Detectiesysteem: Een detector wordt gebruikt om de gescheiden banden te visualiseren wanneer ze uit de kolom elueren en dusdanig het chromatogram te construeren. Verschillende detectiesystemen zijn beschikbaar op de markt met elk hun eigen voor- en nadelen. Enkele voorbeelden zijn UV-VIS detectie, Massaspectrometrie, fluorescentie-detectie (FLD), elektrochemische detectie, corona discharge detectie, light scattering detectie, ... In dit werk werd massaspectrometrie (MS) gebruikt 23

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie als detectiesysteem. De principes van deze detector worden uitvoerig beschreven in sectie 1.5 . 8. Datasysteem: Een datasysteem met de nodige software is nodig om de elektronische signalen te verzamelen en om te zetten tot een bruikbaar chromatogram. In dit werk werd gebruik gemaakt van het Analyst 1.4 - pakket van Applied Biosystems In Figuur 1.9 is een afbeelding weergegeven van de gebruikte opstelling waarmee dit werk tot stand gekomen is.

Figuur 1.9: Opstelling: Waters Alliance 2695 gekoppeld aan een API 2000 massaspectrometer van Applied Biosystems.

1.5 1.5.1

Massaspectrometrie Principe

Massaspectrometrie (MS) is een analytische detectietechniek waarbij de gevormde gasvormige ionen van een monster gescheiden worden volgens hun verhouding van massa over lading, om vervolgens gedetecteerd en gekwantificeerd te worden. Als resultaat wordt een massaspectrum verkregen waarbij de absolute of relatieve intensiteit (in tellen) van de geproduceerde ionen in functie van hun massa over lading (m/z) uitgezet wordt. Een massaspectrum levert informatie over de moleculaire massa van het analiet en kan, desgewenst, ook structurele informatie geven uit het fragmentatiepatroon. De massaspectrometer is de 24

1.5. Massaspectrometrie afgelopen eeuw ge¨evolueerd tot een hoogtechnologisch systeem. In zijn meest elementaire vorm bestaat de massaspectrometer uit :

• de ionenbron: productie van gasvormige ionen

• de massa-analysator: analyseert en scheidt de ionenbundel volgens hun m/z − ratio. Een magneetsector scheidt de geproduceerde ionen in de ruimte, een time-of-flight (TOF) zondert de verschillende moleculen af volgens hun vluchttijd in de zogenaamde flighttube en een quadrupoolfilter treedt op als massafilter. Elk systeem heeft zijn eigen voor- en nadelen waarbij de kostprijs vaak de bepalende factor is.

• het detectiesysteem: zet de ionenbundel om in een meetbaar signaal

Naast deze essenti¨ele onderdelen zijn een geschikt monsterintroductie- en ionisatiesysteem (de interface), een systeem om de overgang van atmosferische druk naar hoog vacu¨ um te overbruggen en een dataverwerkingsysteem onontbeerlijk. Gekoppeld aan een HPLC-systeem wordt er gesproken van een ‘hyphenated technique’ waarbij twee populaire opstellingen vaak onderscheiden worden: LC-MS en LC-MS/MS. Wanneer over LC-MS gesproken wordt, wordt het HPLC systeem gekoppeld aan een enkelvoudige MS (single stage detector). Hierbij wordt de ionaire vorm van elk analiet, meestal het geprotoneerde moleculaire ion, gemeten en geregistreerd. Bij LC-MS/MS wordt de HPLC gekoppeld met Tandem-MS. Hierbij worden ionen twee maal geanalyseerd, waarbij na de eerste massaselectie fragmentatie van het analietion plaatsvindt. In dit werk werd geopteerd voor LC-MS/MS daar deze modus operandi toelaat om in zeer complexe mengsels — zoals plasma — zeer selectief bepaalde molecules kwantitatief te bepalen.

1.5.2

Theoretische en instrumentele aspecten van LC-MS/MS

In Figuur 1.10 wordt een vereenvoudigde weergave gegeven van de gebruikte massaspectrometer, nl. de API 2000 van Applied Biosystems. 25

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie

Figuur 1.10: Schematische voorstelling van de API 2000 massaspectrometer van Applied Biosystems.

LC-MS interface: Atmosferische druk electrospray ionisatie (AP-ESI) De ontwikkeling van een robuuste interface om het eluens van een HPLC te introduceren in de MS, in combinatie met met een relatief hoge ionisatie effici¨entie, is de belangrijkste factor voor het hedendaagse succes van LC-MS. John B. Fenn en Koichi Tanaka werden dan ook de Nobelprijs chemie toegekend in 2002 voor de ontwikkeling van de ESI-interface [16]. Omdat een MS-detector slechts functioneert onder hoog-vacu¨ um moeten de ge¨ıoniseerde analietmoleculen in de gasvormige toestand voorkomen. Dit is de taak van de interface. Vandaag worden nog bijna uitsluitend ionisatiebronnen bij atmosferisch druk gebruikt (Atmospheric Pressure Ionisation, API). De twee bekendste zijn de elektrospray (ESI) en de atmosferische druk chemische ionisatiebron (APCI). In dit werk werd ESI aangewend en bijgevolg wordt enkel deze interface besproken [11, 17].

Figuur 1.11: Ionenbron

26

1.5. Massaspectrometrie Het eluens, afkomstig van het HPLC-apparaat of via directe injectie met een spuit, wordt naar de ionenbron geleid onder atmosferische druk (Figuur 1.11). Het proces waarbij gasvormige analietionen gevormd worden bij ESI is nog steeds een onderwerp van discussie. Algemeen kan het proces van electronspray ionisatie in vijf verschillende stappen omschreven worden. [18]

1. Ionisatie in oplossing. Hoewel dit niet noodzakelijk is voor ESI wordt de beste gevoeligheid verkregen wanneer er al ionen gevormd worden in de eluensstroom. Door een optimale solvent-, buffer- en dus pH-keuze worden reeds ionen gevormd in de oplossing. Ionaire analietmoleculen zijn makkelijker in staat om te ‘verdampen’ uit de geladen druppeltjes dan neutrale moleculen. Componenten die nog niet ge¨ıoniseerd zijn in oplossing kunnen ook geanalyseerd worden omdat verneveling van het monster, desolvatatie van het gegenereerde aerosol en ionevaporatie in staat zijn een sterke elektrische lading op het oppervlak van de druppeltjes te cre¨eren, wat ionisatie van de analietmoleculen teweeg brengt [15].

2. Verneveling Verneveling ontstaat wanneer de analietoplossing in de ionisatiekamer ge¨ıntroduceerd wordt. Geladen solventdruppeltjes worden gecre¨eerd door het aanleggen van een sterk elektrisch veld op de tip van het capillair (tot 6000 V) — waar het eluens naar gekanaliseerd wordt — enerzijds, en de sterke afschuifspanning van het verstuivergas anderzijds [19]. Deze druppeltjes hebben een diameter van ongeveer 2 µm en bevatten circa 100.000 ladingen. Afhankelijk van het teken van de aangelegde spanning (positieve of negatieve modus) worden ionen van tegengestelde polariteit preferentieel naar het oppervlak van de druppel getrokken. Resultaat is een fijne nevel van geladen druppeltjes, m.a.w. een elektrospray (Figuur 1.12). 27

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie

Figuur 1.12: Schematische voorstelling van het elektronspray fenomeen 3. Coulomb fissie: desolvatatie van geladen druppeltjes. Vooraleer de gevormde ionen de massa-analysator binnentreden moeten de omringende solventmoleculen verwijderd worden. Een tegenstroom van verwarmd drooggas (N2 ) verdampt de solventmoleculen en zorgt voor een stijging van de lading/volumeratio binnenin de druppeltjes. De druppeltjes zullen kleiner worden totdat de elektrostatische Coulombkracht groot genoeg is om de oppervlaktespanning te overwinnen, op dit moment is de Rayleigh limiet bereikt. De Rayleigh desintegratie limiet is de maximum lading dat een druppeltje kan bevatten bij constant volume. Wanneer deze limiet overschreden wordt onstaat er een explosie van de druppeltjes (Figuur 1.13). Wat volgt is een cascade van druppelexplosies waardoor steeds kleinere druppels gevormd worden, een proces dat beter bekent staat als Coulomb fissie.

Figuur 1.13: Schematische voorstelling van de desolvatatie via Coulomb fissie.

28

1.5. Massaspectrometrie 4. Vormen van ionen: ion evaporatie model (IEM) en geladen residu model (CRM) Er zijn twee belangrijke theori¨en die de finale productie van gasfase ionen beschrijven: het ion evaporatie model en het geladen residu model. Welk model het nauwst aansluit bij de werkelijkheid is de dag van vandaag nog steeds een punt van discussie. IEM postuleert dat de ionen direct vrijgesteld worden in de gasfase vanuit de druppeltjes. Bij de steeds kleiner wordende druppeltjes zal een moment komen dat de gecre¨eerde veldsterkte door de ionen aan het oppervlak, de oppervlaktespanning overschreidt. Op dit moment vindt desorptie van de ionen plaats en ontstaan naakte analietionen in de gasfase. Figuur 1.14 geeft schematisch het IEM-proces weer.

Figuur 1.14: Schematische voorstelling van de elektrosprayvorming: ionevaporatie.

Een alternatief model wordt beschreven in het geladen residu model (CRM). CRM stelt dat de fissiecascade blijft doorgaan tot ´e´en druppeltje gemiddeld ´e´en analietion bevat. Het uiteindelijke analietion in de gasfase wordt bekomen waneer de resterende solventmoleculen verdampt zijn. De ladingen die het druppeltje bevatte, worden vanaf dan gedragen door het analietion. 5. Gasfasereacties Protontransfer- en ladingsuitwisselingsreacties kunnen plaatsvinden bij het transport van de moleculen door de ionisatiekamer. Zoals hoger vermeld bevindt de ionisatiekamer zich bij atmosferische druk waardoor duizenden van deze reacties kunnen plaats vinden a.g.v. botsing van de analietmoleculen in de API-bron.

29

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie De orifice plaat (Figuur 1.10) introduceert de analietionen in een intermediaire vacu¨ um regio waarna ze via de skimmer in het hoog-vacu¨ um regio van de massa-analysator gestuurd worden. ESI is een zeer zachte ionisatietechniek waarbij nagenoeg geen fragmentatie ontstaat en het is vandaag tevens ook de interface voor LC-MS die de hoogste ionisatie-effici¨entie en dus de grootste gevoeligheid oplevert. De massa-analysator: de quadrupool De quadrupoolmassa-analysator bestaat uit vier evenwijdige geleidende cilindervormige staven. De tegenover elkaar liggende staven zijn elektrisch met elkaar verbonden, waarbij de elektrodenparen op een gelijke, doch tegengestelde, potentiaal gebracht worden. De potentiaal bestaat uit een radiofrequentiecomponent (RF, wisselspanning) en een gelijkspanningcomponent (DC) waarbij hun RF/DC-ratio constant blijft. Zoals op Figuur 1.15 weergegeven is, beweegt de ionenbundel door de quadrupoolfilter naar de detector. De aangelegde spanning be¨ınvloedt het traject van de ionenbundel waarbij enkel ionen met een bepaalde m/z-ratio de detector bereiken. Andere ionen hebben een onstabiel traject en botsen met ´e´en van de quadrupoolstaven. Deze methode laat toe om een welbepaalde m/z-waarde te volgen of een m/z-interval te doorlopen door voortdurend de RF- en DCvoltages aan te passen.

Figuur 1.15: De quadrupoolanalysator

30

1.5. Massaspectrometrie De belangrijkste voordelen van de quadrupoolmassaspectrometer zijn de relatief hoge snelheid waarmee het massaspectrum kan geconstrueerd worden (´e´en scan duurt ongeveer 0,1 - 0,5 s, afhankelijk van de ingestelde scanrange), de mogelijkheid om te werken bij relatief hoge drukken, de instrumentele eenvoud en bijgevolg de relatief lage kostprijs [18]. Een nadeel van de quadrupoolmassaspectrometer is dat de massaresolutie zich beperkt tot ´e´en atomaire ´e´enheid (amu) en dat hoge resolutie MS met quadrupooltoestellen bijgevolg niet mogelijk is. Tandem Massaspectrometrie De in dit werk aangewende en tevens ´e´en van de meest gebruikte tandem massaspectrometers is de triple quadrupool (QQQ). Dit instrument bestaat uit twee massa-analysators (Q1 en Q3) gescheiden door een botsingscel (Q2). Door specifieke monsterionen te fragmenteren en deze dochterionen te identificeren kan structurele informatie over het analiet bekomen worden. Tandem-MS wordt vaak gebruikt, zoals in dit werk, voor de kwantitatieve analyse van specifieke componenten te detecteren in complexe mengsels (plasma, urine,...) op basis van hun specifiek en karakteristiek fragmentatiepatroon. De botsingscel is gevuld met een botsingsgas (in dit werk N2 ) waar moederionen, geselecteerd door Q1, mee zullen botsen en fragmenteren. De geproduceerde dochterionen worden gefilterd door Q3 tot dat ze uiteindelijk de detector bereiken. Door drie quadrupolen te koppelen wordt de selectiviteit en de gevoeligheid sterk verbeterd ten opzichte van een enkelvoudige quadrupool. De detector: Elektronenvermenigvuldiger Het laatste onderdeel van de massaspectrometer is de detector. De detector genereert een elektrisch signaal wanneer het door een ion geraakt wordt en versterkt dit tot een bruikbaar signaal voor het dataverwerkingssyteem. Meestal is de massaspectrometer uitgerust met een elektronenvermenigvuldiger (electron multiplier, EM) als detectiesysteem. De elektronenvermenigvuldiger bestaat uit een aantal opeenvolgende dynodes (een aantal elektrodes tussen de anode en de kathode van de elektronenvermenigvuldiger) waarop steeds een hogere potentiaal aangebracht werd. Wanneer een ion invalt op de kathode van 31

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie de EM worden een aantal secundaire elektronen vrijgesteld. Deze elektronen worden door het potentiaalverschil versneld naar de daaropvolgende dynode waar een nieuwe botsing zal plaats vinden. Bij deze botsing wordt een veelvoud aan nieuwe elektronen vrijgesteld die opnieuw zullen botsen met de volgende dynode. Dit vermenigvuldigingseffect voorzaakt uiteindelijk een elektronenlawine die makkelijker gemeten kan worden. Modes voor dataverwerking in MS en tandem-MS. Voor het verkrijgen van data bij gebruik van een enkelvoudige quadrupool kunnen twee verschillende modes onderscheiden worden: • TIC: total ion current De TIC-modus is beter bekend als de scan modus. Hierbij worden complete spectra herhaaldelijk opgenomen in een gedefineerd massabereik. Spectra moeten snel opgenomen worden om zeker te zijn dat een spectrum volledig in de chromatografische piek ligt. Wanneer bijvoorbeeld in het massabereik van 50 tot 500 dalton gescand wordt bij lage resolutie, zal er 10 ms per massa-eenheid gespendeerd worden. Gedurende deze periode (dwell time) worden alle ionen geteld die de detector bereiken. Om de gevoeligheid te verhogen kan het massabereik verkleind worden of de dwell time verhoogd worden. • SIM: Single Ion monitoring Wanneer de beoogde componenten gekend en goed gekarakteriseerd zijn wordt SIM aangewend. Maximale gevoeligheid wordt verkregen doordat de volledige meettijd gespendeerd wordt om ´e´en, of meerdere, m/z waardes te meten. Wanneer een triple quadrupool (QQQ) gebruikt wordt, zijn er doorgaans 4 verschillende scanmodi ter beschikking die toelaten om heel wat informatie over de molecules te verzamelen of om zeer gevoelig metingen uit te voeren. • Dochter (product) ion scan De eerste quadrupool wordt gebruikt om de ionen van interesse met een welbepaalde massa te selecteren. Deze ionen worden gefragmenteerd in de botsingscel en erna 32

1.5. Massaspectrometrie gescheiden volgens m/z in de Q3-analysator. Het resulterende massaspectrum levert informatie over het fragmentatiepatroon van de vooraf gekozen precursor ionen [17].

Figuur 1.16: Dochter (product) ion scanmodus.

• Ouder (precursor) ion scan In deze modus wordt de eerste quadrupool (Q1) in scan modus geplaatst en de derde quadrupool zodanig ingesteld dat slechts ionen met een welbepaalde m/z waarde de detector bereiken. Een signaal wordt enkel en alleen maar waargenomen wanneer ionen zowel door Q1 als Q3 doorgelaten worden, wanneer dus het gewenste dochterion gevormd wordt (Figuur 1.17). Deze modus laat toe om bv. specifiek klasses moleculen te detecteren die gekwantiseerd worden door gekende fragmentaties (bv. fosfolipiden).

Figuur 1.17: Ouder (precursor) ion scanmodus.

• Neutraal verlies (neutral loss) scan Naast fragmentatiereacties kunnen ook moleculen met specifieke functionele groepen reorganisatiereacties ondergaan in de ionenbron van de massaspectrometer. Deze reorganisatiereacties kunnen ook plaatsvinden in tandem-MS waarbij de neutral loss scanning modus toelaat om fragmentaties te detecteren waarbij een welbepaalde 33

Hoofdstuk 1. Fundamentele aspecten van de chromatografie hoeveelheid massa verloren gaat (bv. verlies van CO2 , - 44 amu). De kennis hiervan kan van groot belang zijn bij de structuuranalyse van ongekende componenten. In deze modus worden de massa-analysator zowel voor als na de botsingscel in de scan modus geplaatst.(Figuur 1.18)

Figuur 1.18: Neutral loss scanmodus.

• Multiple Reaction Monitoring (MRM) In de MRM-mode worden beide massa-analysatoren statisch ingesteld op ´e´en bepaalde m/z-waarde. Specifiek geselecteerde ionen worden naar de botsingscel gebracht, waarna specifiek geselecteerde dochterfragmenten de elektronenvermenigvuldiger bereiken (Figuur 1.19). Deze uiterst gevoelige methode kan enkel aangewend worden wanneer vooraf de te onderzoeken componenten gekend zijn. MRM wordt, net zoals in dit werk, gebruikt om de aanwezigheid van een component in een matrix ondubbelzinnig te bevestigen, bv. het tryptofaangehalte in bloedplasma. Merk op dat naast deze zeer hoge specificiteit van de QQQ-MS, de retentietijden van de molecules voor een extra bevestiging van hun identiteit zorgt.

Figuur 1.19: Multiple Reaction Monitoring modus

34

HOOFDSTUK

2 STATISTIEK EN CHEMOMETRIE

In dit werk werd gebruik gemaakt van enkele typische statistische basistoepassingen en enkele meer geavanceerde chemometrische technieken zoals principale componentenanalyse en regressie-analyse. De term Chemometrie werd in 1974 ge¨ıntroduceerd door de Zweedse organische scheikundige Svante Wold [20]. Hij definieerde het kernachtig als volgt : “ Chemometrie is de tak van de chemie die zich bezig houdt met de analyse van chemische data (extraheren van informatie uit deze data) en die er voor zorgt dat deze experimentele data zoveel mogelijk bruikbare informatie bevat (experimentele design). ”. In wat volgt wordt een kort overzicht gegeven van statistiek en chemometrie die gebruikt werden in het kader van deze studie.

2.1

Standaarddeviatie

De standaarddeviatie, ook wel standaardafwijking genoemd, is een maat voor de spreiding van een variabele. In dit werk omvat dit piekoppervlaktes (in tellen) of retentietijden (in minuten). De standaarddeviatie wordt gedefineerd als de wortel uit de variantie en kan berekend worden via: sP S=

n i=1 (xi

− x)2 n−1

35

(2.1)

Hoofdstuk 2. Statistiek en chemometrie Hierbij zijn : n = het aantal experimenten xi = piekoppervlak of retentietijd van de individuele meting x = de gemiddelde waarde van de piekoppervlaktes of van de retentietijden.

2.2

Relatieve standaarddeviatie

De relatieve standaarddeviatie (RSD, relatieve standaardafwijking), in publicaties vaak weergegeven als CV (coefficient of variation), geeft de percentuele verhouding van de standaarddeviatie ten opzichte van het gemiddelde. De RSD-waarde wordt bekomen via vergelijking 2.2:

RSD =

2.3

S × 100% x

(2.2)

Detectielimiet

De detectielimiet (Limit of detection, LOD) is de laagste concentratie die een signaal geeft dat significant verschilt van het signaal van een blanco monster. De detectielimiet wordt soms verkeerdelijk verward met gevoeligheid (sensitivity), wat slaat op de richtingsco¨effici¨ent van de kalibratiecurve. De LOD kan op verschillende manieren berekend worden:

36

2.3. Detectielimiet • Het kleinste signaal dat onderscheiden kan worden van de ruis, waarbij de signaaltot-ruis verhouding (signal-to-noise, S/N, gemeten zoals op Figuur 2.1) S/N = 3 algemeen als LOD beschouwd wordt [11]. Algemeen wordt Limit of Quantitation (LOQ) beschouwd als S/N = 10.

Figuur 2.1: Berekenen van de signaal-tot-ruis verhouding op een chromatogram.

• De EPA (Environmental Protection Agency) stelt dat LOD’s moeten bepaald worden door herhaling van een analyse van een standaardoplossing van het analiet. Vervolgens wordt voor het analiet de standaardafwijking berekend en deze vermenigvuldigd met 3, wat de LOD oplevert [21]. • De LOD kan ook ge¨extraheerd worden uit de opgestelde kalibratiecurve. Hierbij wordt er gebruik gemaakt van de richtingsco¨effici¨ent en de standaardafwijking op de respons (oppervlakte) [11]. LOD kan bekomen worden via:

LOD =

3, 3 × σ S0

(2.3)

Hierbij zijn : σ = standaardafwijking van de kalibratiecurve S 0 = richtingsco¨ effici¨ ent In dit werk werd gebruik gemaakt van de methode weergeven op Figuur 2.1 om LOD en LOQ te bepalen. 37

Hoofdstuk 2. Statistiek en chemometrie

2.4

Significantie: de t-toets

De t-toets wordt gebruikt om te achterhalen of het verschil tussen 2 waarden of 2 normaal verdeelde groepen (bv. IBD-pati¨enten en controlepersonen) significant verschillend zijn, of dat het verschil tussen beide waarden te wijten is aan toevallige variatie [22]. De t-toets werd in 1908 ontwikkeld door William Sealy Gosset. Daar deze statistische methode door zijn werkgever (Guinness) als bedrijfsgeheim beschouwd werd, werd Gosset verplicht zijn werk te publiceren onder zijn pseudoniem: ‘Student’. Vandaar wordt de t-toets soms vernoemd als de Student t-test. In dit werk wordt gebruik gemaakt van de t-toets voor 2 onafhankelijke steekproeven. Hierbij wordt er veronderstelt dat de steekproeven afkomstig zijn van populaties waarvan de standaarddeviaties niet gelijk zijn. Wanneer de nulhypothese stelt dat de populatiegemiddelden gelijk zijn :

H0 = µ1 = µ2

(2.4)

dan kan de t-waarde als volgt berekend worden: (x1 − x2 ) t= q s1 s2 n1 + n2

(2.5)

waarbij het aantal vrijheidsgraden gelijk is aan: s2

df =

s22 2 n1 ) s41 s42 + 2 2 n1 (n1 −1) n2 (n2 −1)

( n11 +

(2.6)

De propabiliteit dat de bekomen waarde voor t groter is dan de getabeleerde waarde (voor een 95% confidentie-interval, bij een zelfde aantal vrijheidsgraden) wordt uitgedrukt door de significantie. Indien de significantie groter is dan 5%, anders geformuleerd P (|t| ≥ t0 ) ≥ 0, 05, dan kan gesteld worden dat verschil tussen de 2 waarden of groepen te wijten is aan toevallige variatie. Is P (|t| ≥ t0 ) < 0, 05, dan moet de nulhypothese H0 verworpen worden. 38

2.5. Principale componenten analyse

2.5

Principale componenten analyse

Principale componenten analyse (Principal Component Analysis, PCA) is een chemometrische techniek met als doel de hoeveelheid data te reduceren door p oorspronkelijk veranderlijken Xj te vervangen door p nieuwe veranderlijken Zi , die principale componenten (PC) genoemd worden. Enkele voorwaarden waaraan de PC’s moeten voldoen zijn [20]:

• De PC’s zijn lineaire combinaties van de oorspronkelijke veranderlijken.

• De eerste principale component heeft de grootste variantie, gevolgd door de tweede principale component, de derde principale component, ... De p-de principale component heeft dus de laagste variantie en bevat bijgevolg het minst informatie.

• De variabelen van de data moeten gecorreleerd zijn.

• De principale componenten vertonen geen overlapping van informatie.

De principale componenten Zi worden als volgt opgebouwd :

Z1 = a11 X1 + a12 X2 + a13 X3 + ... + a1n Xn Z2 = a21 X1 + a22 X2 + a23 X3 + ... + a2n Xn enz.

(2.7)

De co¨effici¨enten zijn zo opgebouwd dat de nieuwe PC: Z1 , Z2 ... niet meer gecorreleerd zijn in tegenstelling tot de oorspronkelijke variabelen. Reductie van het aantal variabelen kan nu bekomen worden door de laatste PC’s, met minst variate en dus informatie, weg te laten vallen. 39

Hoofdstuk 2. Statistiek en chemometrie

Figuur 2.2: Grafische weergave van de opbouw van de principale componenten in PCA

Figuur 2.2 geeft dit principe weer voor 2 variabelen en bijgevolg 2 principale componenten, zoals in dit werk. Figuur 2.2 a geeft de opbouw van de principale componenten weer (gestreepte lijn). Merk op dat beide PC’s orthogonaal opgebouwd zijn. Figuur 2.2 b geeft de datapunten en hun projectie t.o.v. PC1 en PC2. Er kan waargenomen worden dat de projectie op PC1 (niet gevulde stippen) meer variabiliteit, en bijgevolg dus ook meer informatie bevat dan PC2. Hierdoor is het mogelijk om de variabelen X1 en X2 te reduceren naar Z1 . In het algemeen kan het aantal variabelen n teruggebracht worden op 2 tot 3 principale componenten, met een minimaal verlies aan informatie. [22]

2.6

Kleinste-kwadraten regressie (PLS)

Kleinste-kwadraten regressie (Partial Least Squares, Projection to Latent Structures, PLS) is een chemometrische regressie-methode die, net zoals bij PCR (Principal Component Regression), het aantal oorspronkelijke predictor variabelen probeert te reduceren. In PLS moet een onderscheid gemaakt worden tussen predictor en respons variabelen. Hier kun40

2.6. Kleinste-kwadraten regressie (PLS) nen concentraties als predictor variabele naar voor geschoven worden (de oorspronkelijke onafhankelijk veranderlijke) en de piekoppervlakte als respons variabele. PLS zal het oorspronkelijk aantal predictor variabelen reduceren door er lineaire combinaties van te maken. In PLS worden predictor variabelen, die een hoge mate van correlatie met de respons variabele vertonen, extra gewicht gegeven in de lineaire combinatie. Dit omdat ze effici¨enter zouden zijn in het voorspellen van de regressie-vergelijking. Zo worden uiteindelijk lineaire combinaties van de predictor variabelen bekomen die in hoge mate gecorreleerd zijn met de respons variabelen, en tevens ook de variabiliteit bij de predictor variabelen verklaren. Zoals bij andere datareductiemethodes (bv. PCA, PCR) is het doel om uiteindelijk minder lineaire combinaties te gebruiken dan het oorspronkelijk aantal variabelen. De statische achtergrond van PLS behoort niet tot het terrein van deze studie. We beperken ons in deze thesis enkel tot interpretatie van de PLS-output na interactie met de hier bekomen data [22].

41

Hoofdstuk 2. Statistiek en chemometrie

42

HOOFDSTUK

3 LITERATUURSTUDIE

3.1

Inleiding

De ziekte van Crohn en colitis ulcerosa zijn de twee belangrijkste chronische aandoeningen van het maagdarmkanaal. Deze chronische inflammatoire darmziektes worden in het Engels gebundeld onder de term: ‘Inflammatory Bowel Disease (IBD)’. De beide aandoeningen onderscheiden zich vooral van elkaar op vlak van de locatie en de aard van de ontstekingsreactie. De ziekte van Crohn kan het volledige maagdarmkanaal, van mond tot anus, aantasten terwijl colitis ulcerosa enkel de dikke darm viseert (Figuur 3.1). Microscopisch gezien wordt colitis ulcerosa enkel in de slijmvlieslaag van de darmwand teruggevonden, terwijl de ziekte van Crohn de volledige darmwand kan aantasten [23] (Figuur 3.2). De beide aandoeningen steken vaak voor het eerst tussen het twintigste en het dertigste levensjaar de kop op, waarbij de meerderheid van de pati¨enten een chronische aandoening ontwikkelen. Hoewel de precieze oorzaak van het syndroom nog steeds een raadsel is, worden erfelijke en omgevingsfactoren steeds meer naar voor geschoven [24]. Genetisch onderzoek heeft aangetoond dat aanwezigheid van IBD bij de familie nog steeds de belangrijkste onafhankelijke factor is om de ziekte te ontwikkelen [25]. Deze oorzaak wordt meer en meer aangevuld met factoren inzake de omgeving van de pati¨ent. Factoren zoals: woonplaats, etniciteit, levensstijl (passief en actief roken, overmatige inname van suikers, appendectomie, ...) blijken een invloed te hebben op de ontwikkeling van ´e´en van de aan43

Hoofdstuk 3. Literatuurstudie doeningen. In wat volgt wordt een kort overzicht gegeven van de belangrijkste factoren van beide aandoeningen.

Figuur 3.1: De aangetaste delen van het maagdarmkanaal bij de ziekte van Crohn (links) en colitis ulcerosa (rechts)

3.1.1

De ziekte van Crohn

De ziekte van Crohn werd voor het eerst ontdekt door de Duitse chirurg Wilhelm Fabry in 1623, maar werd in 1932 volledig beschreven en genoemd naar de Amerikaanse geneesheer Burril B. Crohn [25]. Zoals hoger al vermeld werd is de ziekte van Crohn een chronische ontsteking van het maagdarmkanaal, waarbij vooral het laatste deel van de dunne en de dikke darm getroffen worden. De ziekte van Crohn heeft een uiterst grillig verloop. De aandoening kan vari¨eren van een snelle uitbreiding naar andere darmgedeeltes in de accute fase, tot een relatief rustig beeld dat door de jaren heen weinig klachten geeft en bijgevolg weinig behandeling nodig heeft. De belangrijkste kenmerken van de ziekte van Crohn zijn ontstekingen van het darm-slijmvlies in combinatie met diepe zweren. Ontstoken (ge¨ınflammeerde) plaasten kunnen vanzelf genezen waarbij een littekenweefsel achterblijft dat de darmwand dikker en de darmdoorgang nauwer maakt. Wanneer zweren echter door de darmwand heen groeien produceren zij een kleverig ontstekingsvocht aan de buitenkant van de darm, waardoor verklevingen tussen het aangetaste deel van de darm en de buikholte kunnen ontstaan. Via deze verklevingen kan de ontsteking tot in andere organen doordringen waardoor ongewenste verbindingen, fistels ontstaan. Omdat de darm ontlasting en bacteri¨en bevat kan het lang duren vooraleer een dergelijke fistel geneest [26]. 44

3.1. Inleiding De belangrijkste symptomen van de ziekte zijn terug te brengen tot de ontstekingen zelf , die in ernstige gevallen pijn in de buik, koorts, vermagering en krampaanvallen veroorzaken. Omdat ontstoken weefsel veel prote¨ınerijk vocht afscheidt, blijft bij deze aandoening veel vocht in de darmen en worden voedingstoffen slecht opgenomen. Diarree, soms met bloed en slijm, en voedingstekorten zijn hiervan het gevolg. Klachten die niet afdoende behandeld worden kunnen leiden tot vermagering en verklevingen. Mogelijke gevolgen zijn dat een deel van de dunne darm afgesloten raakt, een obstructie-ileus, waarvoor operatief ingrijpen noodzakelijk kan zijn. Om tot de diagnose ziekte van Crohn te komen worden volgende klinische onderzoeken verricht: lichamelijk onderzoek waarbij vooral de buik en de anus bestudeerd wordt, bloeden urineonderzoek, coloscopie, echografie , radiologie, ... [27] Een specifiek dieet is niet nodig, hoewel de voeding een belangrijk aspect vormt om de lichamelijke conditie op peil te houden. Vooral vezelrijke producten, met voldoende vochtinname om constipatie te verkomen, zijn belangrijk. Behandeling van de ziekte van Crohn bestaat uit ontstekingsremmende medicijnen zoals 5-Aminosalicylaat (5-ASA) en corticostero¨ıden; immunosuppresieve middelen zoals azathioprine of ledertrexaat en anti-TNF-α antilichamen (infliximab of adalimumab) [23].

3.1.2

Colitis ulcerosa

Colitis ulcerosa werd voor het eerst beschreven door de Britse arts Sir Samuel Wilks in 1859 [25]. Colitis ulcerosa vindt zijn etymologische oorsprong in het Latijn, nl. colitis (ontsteking van de dikke darm) ulcerosa (zweren), of dus een volledige ontsteking van de dikke darm gepaard gaande met verzwering. Colitis ulcerosa is een chronische ontsteking van het slijmvlies (mucosa) van de dikke darm. Kenmerkend zijn meerdere oppervlakkige zweren — ook wel ulcera genoemd — die beperkt blijven tot de slijmvliesbekleding (Figuur 3.2). Meestal begint de ontsteking in de endeldarm, het laatste stukje darm voor de anus, maar ze kan zich uitbreiden naar de volledige dikke darm. Een levensgevaarlijke complicatie van de ziekte kan ontstaan bij ernstige ontsteking en verzwering met koorts, belangrijke bloeding, uitzetting en dreigende perforatie van de darm tot gevolg (toxisch megacolon)[27]. 45

Hoofdstuk 3. Literatuurstudie

Figuur 3.2: Aantasting van de darmwand bij de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa.

De belangrijkste klachen bij pati¨enten die lijden aan colitis ulcerosa zijn langdurige en frequente diarree-aanvallen (vrijwel altijd met bloed in de stoelgang), buikkrampen, vermoeidheid en koorts. Andere symptomen die kunnen wijzen op colitis ulcerosa zijn bloedarmoede en vermagering. Periodes met deze klachten gaan vaak weer over waardoor arts en pati¨ent denken dat een gewone buikgriep genezen is. Wanneer deze symptomen echter langdurig en frequent aanwezig zijn, moet altijd aan de diagnose colitis ulcerosa gedacht worden. Diagnose van colitis ulcerosa komt tot stand via lichamelijk onderzoek van o.a. de anus en de buik, bloed- en urineonderzoek, coloscopie en echografie [26]. De behandeling van de aandoening is gebaseerd op het onderdrukken van de onsteking van het slijmvlies van de dikke darm, de darm tot rust te brengen en zo de functie van de dikke darm te herstellen. Een specifiek dieet is niet nodig, hoewel voeding van groot belang is om de fysieke conditie op peil te houden. Net als bij de ziekte van Crohn is is vezelrijk voedsel in combinatie met voldoende vocht belangrijk. Wanneer de ontsteking echter actief is, is licht verteerbaar voedsel aangeraden. Behandeling van colitis ulcerosa gebeurt analoog als de ziekte van Crohn. Middelen zoals 5-ASA en corticostero¨ıden worden gebruikt om de ontsteking van het slijmvlies af te rem46

3.2. Pathogenese van IBD. men, terwijl azathioprine de werking van het immuunsysteem (mogelijks de oorzaak van de ziekteverschijnselen) onderdrukt [23]. Soms is operatief ingrijpen nodig bij pati¨enten waarvan de de dikke darm volledig ontstoken is, de darmwand extreem uitgezet is of geperforeerd dreigt te raken. Indien een operatieve ingreep bij colitis ulcerosa onvermijdelijk is, wordt steeds de volledige dikke darm verwijderd en een tijdelijk ileostoma, een kunstmatige afvoerweg voor de vloeibare inhoude van de darm, aangelegd. Na genezing wordt het stoma meestal weggenomen en wordt een nieuwe verbinding (via een ileo-anale pouch) met het anaal kanaal gemaakt.

3.2

Pathogenese van IBD.

De pathogenese (stapsgewijze ontstaan en ontwikkeling van een ziekte of aandoening) van de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa zijn nog altijd niet precies bekend. Wel zijn er een aantal bevorderende factoren zoals familiaal risico en omgevingsfactoren (zie hoger) ontdekt. De meest doorslaggevende bewijzen van een genetische oorsprong van de aandoening werden geleverd door concordantiestudies bij tweelingen. De concordantie (het risico dat de twee leden van een tweeling elk de ziekte krijgen) voor een ´e´eneiige tweeling bedraagt 58% voor de ziekte van Crohn en 17% voor colitis ulcerosa. Bij een dizygotische tweeling bedroeg dit maar respectievelijk 15% en 5% [28]. Dit duidelijk verschil tussen eeneiige en twee-eiige tweelingen wijst op de belangrijke rol van genetische factoren bij het ontstaan van de ziekten. Dat meer dan de helft van de eeneiige tweelingen geen chronische darmziekte ontwikkelt wanneer hun tweelingsbroer of -zus er wel aan lijdt, ook al hebben ze precies hetzelfde erfelijk materiaal, bewijst de rol van de omgevingsfactoren [29]. Deze bevindingen leidde in 2001 tot het ontdekken van het gevoeligheidsgen NOD2/CARD15 voor de ziekte van Crohn, gelegen op chromosoom 16, een bevestiging dat IBD’s gedeeltelijk genetisch bepaald zijn [30]. De tegenwoordig meest aanvaarde hypothese is dat een IBD-aandoening het resultaat is van een overbodige en overdreven immuunrespons van het darmslijmvlies (mucosa) op symbiotische saprofyten (darmflora)[25]. Antigenen afkomstig van symbiotische darmbacteri¨en kunnen het immuunsysteem op verschillende manieren op gang zetten. Het verschijnsel 47

Hoofdstuk 3. Literatuurstudie waarbij myelo¨ıde dendritische cellen uit de mucosa verkeerdelijk deze symbiotische bacteri¨en als pathogenen beschouwen, is ´e´en van deze manieren. Experimenteel bewijs werd hiervoor geleverd doordat aangetoond werd dat in muizenmodellen IBD-aandoeningen nooit ontwikkeld werden in bacterie-vrije omgevingen [23]. De verkeerdelijke inschatting van deze dendritische cellen (deel uitmakend van het aangeboren immuunsysteem) schakelt ook het verworven immuunsysteem aan waardoor een cascade aan ontstekingsreacties ontstaan. Wanneer dit immuunsysteem in werking treedt ontstaat een verhoogde secretie van inflammatoire signaalprote¨ınes, cytokines genaamd. Verschillende cytokines spelen een belangrijke rol bij de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa [23]: • Interleukines (IL) : IL-4, IL-5, IL-12, IL-13 • Interferonen (IFN): IFN-γ • Tumor Necrosis Factor (TNF) : TNF-α Bij een ontsteking wisselen de verschillende lymfocyten (verschillende types witte bloedcellen) cytokines uit om hun acties op elkaar af te stellen. Deze pro-inflammatoire eiwitten — waaronder TNF-α en IFN-γ — bevorderen in het algemeen de ontstekingsreactie, wat in s´e heilzaam is voor het organisme. Bij aandoeningen zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa slaat het immuunsysteem echter op hol en wordt de ontsteking chronisch, ook al heeft ze geen enkel nut meer. Het afweersysteem keert zich tegen het lichaam, waarbij de cytokines zoals TNF-α en IFN-γ het ontstekingsproces bevorderen. Organen worden aangetast, verzwering vindt plaats, fistels groeien, ... m.a.w. een chronische inflammatoire darmziekte (IBD) is het gevolg.

3.3

Tryptofaan-depletie en vermoeidheid bij IBD: een oorzakelijk verband?

Een chronische darmaandoening kent over het algemeen een zeer grillig verloop bestaande uit acute periodes van inflammatie en periodes van remissie zonder objectiveerbare ziekteactiviteit. Vermoeidheid is ´e´en van de belangrijkste symptomen tijdens de ziekte. Deze vermoeidheid kan uiteraard prominent zijn tijdens actieve ziekte-opstoten doch kan ook 48

3.3. Tryptofaan-depletie en vermoeidheid bij IBD: een oorzakelijk verband? opvallend aanwezig blijven tijdens episodes van remissie (waarbij de pati¨ent geen enkele andere klacht van de darmziekte ondervindt). De onderliggende oorzaak van deze vermoeidheid (zeker in geval van inactieve ziekte) is onduidelijk en onverklaard. Een mogelijke hypothese hiervoor is een verhoogde activiteit van het enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) door de cytokines IFN-γ en TNF-α.

3.3.1

Tryptofaan-depletie bij verhoogde IDO-activiteit

Indoleamine 2,3-dioxygenase, kortweg IDO (Figuur 3.3), is een intracellulair enzym dat tryptofaandegradatie katalyseert via het kynurenine-reactiepad [31]. Tryptofaan (Figuur 3.3) — een natuurlijk voorkomend, essentieel aminozuur — dient enerzijds als precursor van de belangrijke centrale neurotransmitter serotonine (5-hydroxytriptamine, 5-HT Figuur 3.3) en wordt anderzijds gemetaboliseerd tot kynurenine (Figuur 3.3) via het IDOreactiepad (Figuur 3.4 ).

Figuur 3.3: Belangrijke structuren.

IDO speelt een sleutelrol in immunologische processen zoals infectie, autoimmuniteit, allergische reacties en chronische ontsteking [32]. De groep van Wolf [33] ontdekte voor het 49

Hoofdstuk 3. Literatuurstudie eerst dat cytokines zoals IFN-γ en TNF-α een stimulerende activititeit voor IDO bezitten. Bijgevolg stelden Wolf et al. [33] dat IBD-pati¨enten te kampen hebben met een overmatige expressie van het IDO-enzyme. Een verhoogde IDO-activiteit leidt op zijn beurt tot een verlaagde concentratie van tryptofaan, een tryptofaan-depletie, en een verhoogde concentratie van zijn toxisch metaboliet kynurenine. Meten van de kynurenine/tryptofaan-ratio levert informatie op over de IDO-activiteit en dus de mate van inflammatie van het maagdarmkanaal. Terwijl Wolf et al. dit testte op biopsi¨en (secties) van het darmslijmvies, werd dit door onder andere Yamada et al. en Forrest et al. bevestigd voor bloedplasma [34, 35]. Deze bevindingen werden ondersteund door Torres et al. voor coeliakie (gluten-allergie) [36] en door Schefold et al. voor CKD (chronische nieraandoening) [32].

Figuur 3.4: Metabolisatie van tryptofaan tot serotonine enerzijds (boven) en kynurenine anderzijds (onder).

3.3.2

Emotionele gevolgen van tryptofaan-depletie

IFN-α wordt vaak gebruikt als geneesmiddel tegen hepatitis C en kanker [37], hoewel bijwerkingen zoals: slaperigheid, irriteerbaarheid, futteloosheid, ... echter onvermijdbaar 50

3.4. Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine: een overzicht. zijn. Net zoals IFN-γ en TNF-α, stimuleert IFN-α de activiteit van IDO. Het effect van een verhoogde IDO-activiteit op de gemoedstoestand van de pati¨ent is tweeledig. Enderzijds leidt de overstimulatie van IDO tot een tryptofaan-depletie, wat een lagere concentratie van serotonine (5-HT) in de hersenen teweeg brengt. Een tekort aan serotonine in de synaptische spleet kan een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van vermoeidheidsverschijnselen en depressie [38]. Anderzijds werd aangetoond dat verschillende metabolieten gevormd langs het kynurenine-reactiepad, neurotoxische effecten hebben met neurodegradatie tot gevolg. Zo spelen 3-hydroxy kynurenine en quinolinezuur (quinolinic acid), weergegeven in Figuur 3.4 een belangrijke rol bij de ontwikkeling van depressie en de bijkomstige symptomen [37]. Samenvattend kan gesteld worden dat de verhoogde IDO-activiteit via cytokines zoals IFN-γ en TNF-α, als gevolg van het geactiveerde immuunsysteem door de chronische darminflammatie, leidt tot een depletie van het tryptofaangehalte in bloedplasma. Meten van de kynurenine/tryptofaan-ratio weerspiegelt de IDO-activiteit en kan een mogelijke verklaring geven voor de vermoeidheidsverschijnselen bij IBD-pati¨enten.

3.4

3.4.1

Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine: een overzicht. Gaschromatografie

Gezien de hoge polariteit van aminozuren in het algemeen, tryptofaan en kynurenine specifiek, en hun lage ontbindingstemperaturen is gaschromatografie (GC) geen goede techniek om aminozuren te analyseren. Mits derivatisatie, met behulp van bv. silylatie of verestering-acylatie, kunnen de polaire functies echter gemaskeerd worden en is GCanalyse wel mogelijk. Verestering-acylatie voor tryptofaan, met ethyl- of propylchloroformaat, worden gebruikt voor aminozuuranalyse gebruik makende van GC-FID of GC-MS. Phenomenex heeft op basis van propylchloroformaat een kit gecommercialiseerd waarmee derivatisatie van aminozuren mogelijk is. Nadelen hiervan zijn tijd en prijs. LC-MS is lijkt veel logischer voor analyses van aminozuren in bloedplasma. 51

Hoofdstuk 3. Literatuurstudie

3.4.2

Vloeistofchromatografie

Om redenen aangehaald in de vorige paragraaf is in het overgrote deel van de literatuur, waarbij al-dan-niet tryptofaan en/of kynurenine simultaan geanalyseerd werden, gebruik gemaakt van omkeerfase LC. Snelheid, effici¨entie en betrouwbaarheid van die methode werden daarbij dikwijls als grootste voordelen naar voor geschoven [39]. Scheidingen op C18 - kolommen [40, 41, 42, 34, 43, 44, 39, 45, 46], met een grote verscheidenheid aan kolomdimensies, en C8 -kolommen [47] werden gemeld. Petritis et al. beschreef onder andere het gebruik van een Hypercarb-kolom. Deze kolom met actieve kool werd aanvankelijk in dit werk ook gebruikt, daar de hoge retentie op die kolommen de analyse van niet gederivatiseerde aminozuren toelaat [41, 48]. De groep van Amirkhani publiceerde een methode op basis van een capillaire C18 -kolom [46]. De betrouwbaarheid en robuustheid van capillaire LC is echter heel wat minder goed in vergelijking met de klassieke kolomdimensies. Voor een uitgebreid onderzoek, zoals in deze scriptie, lag het gebruike van conventionele omkeerfase LC dan ook voor de hand. Als mobiele fase werd in de literatuur, afhankelijk van het detectiesysteem, gekozen voor fosfaat- [40, 44], acetaat- [42, 43, 45, 47] en ammoniumformaatbuffers [34] of voor typische omkeerfase chromatografie solventen zoals H2 O met mierezuur (FA) [46] of heptafluorboterzuur (HFBA) [41], als waterige fase, in combinatie met methanol (MeOH) [34, 44] of acetonitril (ACN) [40, 41, 42, 46, 47] of een combinatie ervan [43] als organische fase. Niet vluchtige buffers worden achterwege gelaten (behalve door Yamada et al. [34]), wanneer massaspectrometrie (MS) als detectiesysteem werd aangewend. Dit omdat de ionisatiebronnen in LC-MS anders zeer snel vervuild zouden geraken met verlies van gevoeligheid en niet reproduceerbare piekoppervlaktes als gevolg. Afwisselend werd gekozen voor een isocratisch [40, 42, 45] of een gradi¨ent [34, 43, 41] elutieprogramma. Gradi¨ent elutie is echter veel beter voor analyse van plasma, daar gebruik van een isocratische methode zeer snel tot prote¨ıneprecipitatie in de kolom kan leiden, wat de kolom na enige tijd waardeloos zou maken.

3.4.3

Detectie van tryptofaan en kynurenine.

De voorgestelde methodes in de literatuur verschilden vaak van elkaar op vlak van gebruikte detectiesysteem. Elk systeem heeft zijn eigen voor- en nadelen, maar vaak is de 52

3.4. Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine: een overzicht. beschikbaarheid en aankoopprijs een bepalende factor. De origine van de monsters is hierbij ook van belang daar dit tot grote verschillen in noodzakelijke gevoeiligheid van de methode kan leiden. Verschillende methodes werden beschreven. De groep van Tcherkas [44] en Maneglier [40] gebruikten beiden elektrochemische detectie. Maneglier et al. gebruikte coulormetrische detectie zonder derivatisatie, terwijl Tcherkas et al. verschillende aminozuren, waaronder tryptofaan, elektrochemisch detecteerde na OPA-derivatisatie. Maneglier et al. schoven de z´e´er hoge specificiteit en verminderde fluorescentieproblemen als grootste voordelen van hun ontwikkelde methode naar voor. Een steeds voorkomend probleem met elektrochemische detectie zijn modificaties die aan de elektrode kunnen optreden (electrode foaling) tijdens de analyse van complexe monsters zoals bloedplasma. Dit leidt dikwijls tot weinig reproduceerbare kwantitatieve resultaten. De groep van Petritis [41] ging origineel te werk. Ze slaagden erin om niet gederivatiseerde aminzuren en metabolieten te detecteren met een ELSD-detector (Evaporative Light Scattering Detection) via ion-interactie chromatografie. Het gebruik van het ionparend reagens HFBA als additief voor de waterige mobiele fase, zoals in dit werk, werd hier naar voor geschoven. De ELSD-detector is echter niet zo gevoelig (state of the art ELSD detectors hebben een detectielimiet van 1 µg/ml), wat een probleem vormt voor de analyses in dit werk, waar er vaak onder het ppm-niveau (µg/ml) moet gekwantificeerd worden. Vaak werden UV-VIS en Fluorescentiedetectie, apart [45, 47, 39] of gekoppeld aan elkaar [42, 43, 49] als detectiesysteem naar voor geschoven. Het voordeel van beide detectoren aan elkaar te koppelen is een verhoogde selectiviteit van detectie. Slecht enkele aminozuren bevatten een chromofore of fluorofore groep (waaronder tryptofaan) waardoor niet alle aminozuren via UV of FLD (Fluorescentiedetectie) bepaald kunnen worden. Nadeel aan het gebruik van dergelijke spectrometrische methodes is dat derivatisatie bijna steeds noodzakelijk is indien men zich niet wil beperken tot enkel de analyse van hoge concentraties. Na derivatisatie is overlap met andere pieken, met verkeerde kwantificaties tot gevolg, steeds mogelijk waardoor deze detectie niet mogelijk is in dit werk. Het gebrek van een sterk chromofore of fluorofore groep zorgt ervoor dat deze extra functionele groep voorafgaand aan de scheiding (pre-kolom derivatisatie) of detectie (post-kolom derivatisa53

Hoofdstuk 3. Literatuurstudie tie) chemisch verankerd moeten worden aan het tryptofaan of kynurenine. Dansyl chloride [50] en o-phthalaldehyde (OPA)[43, 44] zijn de meest gebruike reagentia voor pre-kolom derivatisatie. De aminozuren die gederivatiseerd worden met OPA of dansylchloride zijn ook hydrofober en worden daarom veel beter geretenteerd op klassieke C18 -kolommen bij omkeerfase LC. In Figuur 3.5 is de reactie van tryptofaan met OPA in aanwezigheid van 2-mercaptoethanol weergegeven. Voordelen zijn een verhoogde gevoeligheid en selectiviteit. Kynurenine is niet fluorescerend waardoor derivatisatie ofwel een gekoppelde UVFluorescentie detector nodig zijn voor detectie [45]. Nadelen van alle methodes waarbij derivatisatie gebruikt worden zijn: arbeidsintensief, tijdrovend, mogelijk extra bron van onzuiverheden, instabiliteit en variabiliteit als gevolg van onvolledige derivatisatie [51, 41]. Keuze van het al dan niet derivatiseren van tryptofaan en kynurenine is dus deels arbitrair gezien de vele beschreven mogelijkheden.

Figuur 3.5: Derivatisatie van tryptofaan met o-phthaalaldehyde en 2-mercaptoethanol

In dit werk werd er, zoals verder uiteengezet, gezocht naar een methode die toeliet om zeer betrouwbaar kynurenine en tryptofaan te kwantificeren in complexe monsters zoals bloedplasma. Er werd tevens geopteerd om de monstervoorbereiding zo eenvoudig mogelijk te houden (zie verder). LC-MS/MS is vandaag d´e methode die toelaat om dit alles uit te voeren voor grote hoeveelheden monsters. De selectiviteit van de methodologie is uniek daar de moleculen gekarakteriseerd worden door retentietijd en specifieke fragamentatiepatronen. Bovendien is analyse met LC-MS/MS op ng/ml niveau volkomen mogelijk, wat ook inhoudt dat de kwantificatie van kynurenine en tryptofaan, die op µg/ml-niveau voorkomen in bloed, uiterst betrouwbaar wordt. Het grootste nadeel van een LC-MS/MS methode zijn de kostrpijs en de grotere ontwikkelingstijd die nodig is om een methode op 54

3.4. Chromatografische bepaling van tryptofaan en kynurenine: een overzicht. punt te stellen. Als laatste, en tevens ook in dit werk gebruikte, detector wordt ESI-MS/MS aangehaald [34, 46]. Indien de niet gederivatiseerde moleculen geretenteerd zijn op de kolom is derivatisatie in dit soort scheidingsmethode niet nodig omdat de gevoeligheid geleverd wordt door de MS-detector. Specificiteit, gevoeligheid, selectiviteit en simultaan meten zijn sterke voordelen waardoor deze detector ideaal is om analietmoleculen in een complexe biologische matrix, zoals bv. plasma, te meten. Beide groepen maakten gebruik van de positieve modus om de moleculen te meten in combinatie met ‘Multiple Reaction Monitoring’ (MRM) om de hoogste gevoeligheid te behalen.

3.4.4

Monstervoorbereiding en kwantificatie.

In dit werk werd het doel voorop gesteld om tryptofaan- en kynurenineconcentraties te meten in bloedplasma. Het is dus gewenst om de nodige monstervoorbereiding hier op uit te voeren. Prote¨ıneprecipitatie, van hoofdzakelijk humaan serum albumine (HSA), is noodzakelijk om o.a. de gebruiksperiode van de kolom hoog te houden. Neerslaan van de prote¨ınes met HClO4 [40], TCA (gechloreerd azijnzuur) [42, 45, 46], TFA (Trifluorazijnzuur) [34], methanol [44] werden voorgesteld, waarna centrifugatie gedurende enkele minuten volgde. Marklova et al. voerde een vast fase extractie (SPE) uit als monstervoorbereiding. De voorgestelde methodes beperken zich niet enkel tot plasma als biologische matrix. De literatuur vermeldt dat deze methodes ook gebruikt werden voor andere biologische matrices zoals: urine, serum, hersenvocht (cerebrospinal fluid), supernatans van gecultiveerde cellen, enz. [44, 34]. Verschillende methodes van kwantificatie werden voorgesteld. De literatuur vermeldt vooral externe kalibratie [40, 34, 49] zonder gebruik van een interne standaard. Kalibratie met 3 − nitro − l − tyrosine als interne standaard werd voorgesteld door Laich et al. [42]. De groep van Amirkhani [46] stelde standaardadditie voor als kalibratiemethode, dit om matrixeffecten op de elektrospray-respons te onderdrukken. De keuze van een gedeutereerde interne standaard zoals die in dit werk gebruikt wordt, in combinatie met MS-MS, laat echter de meest betrouwbare kwantifcatie toe. 55

Hoofdstuk 3. Literatuurstudie

56

HOOFDSTUK

4 EXPERIMENTEEL GEDEELTE

4.1 4.1.1

Algemene Experimentele Aspecten Chemicali¨ en

De gebruikte chemicali¨en L-tryptofaan en DL-Kynurenine (95% zuiver) waren beide afkomstig van Sigma Aldrich. De gebruikte interne standaard L-tryptofaan-indool-d5 werd verkregen bij Isotec. De solventen (LC-MS kwaliteit) water, methanol en acetonitril zijn afkomstig van Biosolve. Heptafluoroboterzuur (HFBA) van Fluka werd gebruikt. 149 plasmamonsters, waarvan 104 afkomstig van IBD-pati¨enten en 45 als controlestaal, werden geleverd door de dienst gastro-enterologie van het UZ Gent. Plasmamonsters werden bewaard bij −12◦ C in de diepvriezer van het laboratorium. De data werden verwerkt met Analyst Software (versie Analyst 1.4) en met Chemstation software (Agilent). Verder werd Microsof Excel 2007, SPSS 16 en Matlab 7 gebruikt voor de statistische analyses.

4.1.2

Instrumentatie

De chromatografische analyses werden uitgevoerd op een Agilent 1200 series en een Alliance 2690 van Waters. De gebruikte kolom is een Phenomenex Kinetex C18 -kolom, 50 mm en 2,1 mm interne diameter en een partikelgrootte van 1,7 µm. Om de hoofdkolom te beschermen werd een Security Guard (Phenomenex) prekolom gebruikt. Detectie op het Alliance HPLC-systeem vond plaats met een API 2000 massaspectrometer (Applied Bio57

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte systems Sciex Instruments) en een UV-detector voor de Agilent 1200. Directe injectie in de massaspectrometer vond plaats met een spuitpomp afkomstig van KR Analytical LTD. Plasmamonsters werden bereid met pipetten afkomstig van ThermoScientific (Finepipette 10 - 100 µl en 100 - 1000 µl), een vortexmixer afkomstig van LAB-LINE instruments en een Galaxy 16DH centrifuge van VWR. Voor het filteren van het supernatant, afkomstig van het plasma, werden polyvinylideen (PVDF) spuitfilters (0,45 µm) van GRACE gebruikt.

4.1.3

Veiligheidsaspecten

L-tryptofaan is licht irriterend bij contact met de huid en ogen en door inname of inhalatie. Kynurenine kan irriterend zijn bij inname en inhalatie of bij contact met huid of ogen. Acetonitril is schadelijk bij inhalatie of inname en kan irritatie veroorzaken bij contact met de huid. Acetonitrile is tevens licht ontvlambaar. Methanol is giftig bij inhalatie, opname door de mond en contact met de huid. Methanol is licht ontvlambaar, kan elektrostatisch opgeladen worden met kans op ontsteking. HFBA veroorzaakt brandwonden in contact met huid, ogen en luchtwegen. Inname kan zware irritatie veroorzaken met braken tot gevolg. Gebruik van een labojas, handschoenen, veiligheidsbril en werken in een trekkast waren dus aangewezen.

4.1.4

Ethische commissie

Het ruimer kader van deze studie werd goedgekeurd door de onafhankelijke Commissie voor Medisch Ethiek verbonden aan het UZ Gent na consultatie van de lokale commissies voor Medische Ethiek verbonden aan de ziekenhuizen waar deze studie doorging. Deze studie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de goede klinische praktijk (ICH/GCP) en de verklaring van Helsinki (versie 2000) opgesteld ter bescherming van mensen deelnemend aan klinische studies.

4.2

Optimalisatie van de scheiding van de analieten op een Kinetex kolom.

Voor de scheiding van het testmengsel bestaande uit L-tryptofaan (TRP), kynurenine (KYN), L-tryptofaan-idool-d5 (TRP-D5) en aanvankelijk kynureninezuur (kynurenic acid, 58

4.2. Optimalisatie van de scheiding van de analieten op een Kinetex kolom. KYNA) werd gebruik gemaakt van een Kinetex C18 - kolom ( 50 × 2.1 mm, 1.7 µm; Phenomenex, Torrance, USA). Deze kolom werd uiteindelijk gekozen boven de Hypercarb kolom (Thermoscientific, 100 × 4.6 mm) en Waters XBridge C8 -kolom (4,6 × 100 mm) wegens slechte piekvorm als gevolg van een slechte effici¨entie (laag aantal platen). Er wordt niet gesteld dat deze scheiding niet mogelijk is op dit soort kolommen, enkel niet op deze voor handen. Bovendien kunner er vraagtekens geplaatst worden bij het gebruik van een Hypercarb-kolom voor de kwantitatieve analyse van TRP en KYN in grote reeksen bloedmonsters. De zeer hoge retentie die deze kolommen vertonen voor hydrofobe componenten leidt daarbij gemakkelijk tot irreversibele binding op de fase wat leidt tot problemen met de reproduceerbaarheid van de retentietijden en dus tot een algemene verlaging van de robuustheid van de methode. De scheiding van het testmengsel werd geoptimaliseerd op de Agilent 1200 series HPLC, met UV als detectiesysteem. Eens de scheiding op punt stond, werd er overgeschakeld naar de Alliance 2690 van Waters in combinatie met de API 2000 massaspectrometer om de verwachte lagere detectielimieten in bloedplasma te bereiken. Het voordeel hiervan is dat, eens overgeschakeld op MS-detectie, het elutiepatroon gekend was en meteen in MRM-mode gemeten kon worden.

4.2.1

Bereiden van de stockoplossing

Om de geconcentreerde stockoplossing te bereiden werd telkens 0,02 g TRP, KYN en TRPD5 afgewogen en opgelost in 20 ml van een (50/50) H2 O/MeOH-mengsel om een stockconcentratie van 1000 ppm te verkrijgen. De TRP- en TRP-D5-oplossing, losten volledig op na enkele minuten in het ultrasoonbad. Het KYN-mengsel loste enkel op na toevoeging van een druppel geconcentreerd HCl. De stockoplossingen van 1000 ppm werden gebruikt voor het maken van testmengsel en kalibratiestandaarden. De stockoplossingen werden regelmatig opnieuw gemaakt en bewaard in de koelkast.

4.2.2

Ontwikkelen van een gradi¨ ent elutiemethode.

Zoals hoger vermeld, werd aanvankelijk gebruik gemaakt van een UV-detectie systeem om TRP, TRP-D5 en KYN te scheiden. In de literatuur werden verschillende absorbantiegolf59

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte lengtes voorgesteld: 254 nm, 280 nm, 363 en 390 nm. Uiteindelijk gaf 254 nm voor TRP en KYN het beste resultaat, met 254 nm als absorptiemaximum voor kynurenine. Een testmengsel bestaande uit 10 ppm van elke component werd gebruikt om de scheidingsmethode te ontwikkelen. Verschillende mobiele fases werden getest: methanol/water, methanol/water (+ 0,1 % mierenzuur), methanol/water (+ 0,1% HFBA), acetonitril/water (+ 0,1% HFBA) en acetonitril/water (+ 0,5% HFBA). Aanvankelijk bestond het idee om zoveel mogelijk methanol i.p.v. acetonitril te gebruiken, wegens de hoge acetonitrilprijzen. Wegens de minder goede scheidingen moest van dit idee afgestapt worden. Uiteindelijk bleek de laatste optie: ACN/H2 O (+ 0,5% HFBA) de meest belovende. HFBA als ionenparend reagens werd weerhouden toen de hypercarb-kolom getest werd, en bleek mooie piekvormen te geven. Het debiet werd getest op 0,2 en 0,35 ml (hoger kon niet wegens de kolomdimensies) waarbij uiteindelijk voor 0,2 ml werd gekozen om de overschakeling op het andere HPLC-systeem mogelijk te maken. Dit laatste systeem beperkt het gebruik van hoge debieten in die zin dat er onder de 400 bar gewerkt moet worden. Aanvankelijk werd een gradi¨ent elutie uitgevoerd met als initi¨ele condities 90/10 water (+ 0,5 % HFBA)/ACN. Deze condities werden initieel 2 minuten aangehouden en vervolgens werd naar een samenstelling van 10/90 water(+ 0,5 % HFBA) /ACN ge¨evolueerd in 10 minuten. Meteen erna werd naar de initi¨ele condities teruggekeerd in 3 minuten tijd. Het elutieprogramma en het bekomen chromatogram zijn respectievelijk weergegeven in Figuur 4.1 en Figuur 4.2.

60

4.2. Optimalisatie van de scheiding van de analieten op een Kinetex kolom.

Figuur 4.1: Gradi¨ent elutieprogramma voor scheiding van het testmengsel.

Figuur 4.2: Chromatogram van het testmengsel gescheiden volgens de gradi¨entmethode weergegeven in Figuur 4.1.

Dit gradi¨entprogramma leverde een basislijnscheiding op voor alle componenten (inclusief KYNA). Zoals op Figuur 4.2 kan opgemerkt worden overlappen de TRP en TRP-D5 piek hoofdzakelijk, wat wegens hun vrijwel identieke chemische samenstelling te verwachten 61

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte viel. Toch kan opgemerkt worden dat beide pieken niet volledig overlappen. Dit suggereert de z´e´er hoge kolomeffici¨entie die met de Kinetex 1,7 µm deeltjes bekomen kan worden. Hoewel deze gradi¨entmethode een goede scheiding oplevert kan deze methode verder geoptimaliseerd worden. Volgende punten zijn van belang:

• Gedurende de eerste 10 minuten werd een vlakke basislijn verkregen, zonder enige chromatografische activiteit. Er moet getracht worden de pieken vroeger te laten elueren en een lagere k-waarde te verkrijgen. • Deze scheiding werd op Agilent 1200 verkregen bij een druk van maximum 240 bar bij 0,2 ml/min. Het Waters systeem kan slechts bij maximaal 400 bar geopereerd worden, wat weinig ruimte over laat voor een lineaire versnelling van het debiet. Om deze reden is het nuttig om reeds in dit stadium de retentietijden te verkorten. • In het voorgestelde gradi¨entprogramma werd geen schoonmaakprocedure ingebouwd. Bij analyse van plasma is het noodzakelijk om gedurende een bepaalde tijd 100 % organische fase door de kolom te laten lopen, vooraleer te herconditioneren. Dit is noodzakelijk om zeker te zijn dat de kolom contaminatievrij is vooraleer een nieuwe analyse te beginnen.

Na verschillende gradi¨entmethodes te testen werd uiteindelijk volgende gradi¨entmethode gebruikt. De initi¨ele condities bedragen 90/10 water(+ 0,5 % HFBA)/ACN en worden 1 minuut aangehouden. Vervolgens wordt in 5 minuten naar 70/30 water(+0,5 %HFBA) /ACN gegaan, om daarna in 1 minuut naar 10/90 water(+ 0,5 % HFBA)/ACN te bereiken. Deze samenstelling wordt gedurende 1 minuut aangehouden. Direct daarna wordt de schoonmaakprocedure ingebouwd waarbij gedurende 3 minuten 100 % ACN door de kolom stroomt. Daarna wordt de kolom gedurende 12 minuten geherconditioneerd. Een dergelijke lange equilibratie is nodig ook bij zo’n korte kolom om reproduceerbare resultaten te bekomen. Een schematische weergave van het gradi¨entprogramma alsook van het bekomen chromatogram worden weergegeven in Figuur 4.3 en Figuur 4.4. 62

4.2. Optimalisatie van de scheiding van de analieten op een Kinetex kolom.

Figuur 4.3: Optimalisatie van het gradi¨ent elutieprogramma voor de scheiding van het testmengsel.

Figuur 4.4: Chromatogram van het testmengsel gescheiden volgens de geoptimaliseerde gradi¨ent elutiemethode.

63

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte Op Figuur 4.4 is een basislijnscheiding te zien van de componenten: KYN, Kynureninezuur (Kynurenic Acid, KYNA) en TRP (overlappend met TRP-D5) in respectievelijke elutievolgorde. De bepaling van de KYNA-concentratie werd later achterwege gelaten. KYNA-concentratie is niet nodig om de IDO-activiteit te bepalen en, alhoewel interessant, werd bijgevolg de bepaling van die component weggelaten uit tijdsoverwegingen en omdat dit ook niet gevraagd werd door de onderzoeksgroep van Dr. H. Peeters. Alle analyses werden uitgevoerd bij 30◦ C met een injectievolume van 5 µl. Het bekomen gradi¨entprogramma werd gebruikt op de Waters Alliance 2690 om de plasmamonsters te analyseren.

4.3

Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer

In dit stadium werd er overgeschakeld naar massaspectroscopische detectie. Bloedplasma is een complexe biologische matrix waardoor co¨elutie van andere componenten met KYN of TRP niet ondenkbaar is. De extra selectiviteit en de lagere detectielimieten geleverd door de MRM-modus van de massaspectrometer leveren heel wat extra voordelen op, en maken, zoals hoger uiteengezet, van de massaspectrometer de meest geschikte detector om het bloedplasma te analyseren. Vooraleer de detectie met de MS optimaal is, moeten echter verschillende parameters aangaande de vorming van de elektrospray door de ESI-bron en de massaselectie door de quadrupoolfilter aangepast worden.

4.3.1

Optimalisatie van de MS-parameters

Voor de optimalisatie van KYN, TRP en TRP-D5 werd gebruik gemaakt van een oplossing van 10 µg/ml (10 ppm) verdund uit de bereide 1000 ppm stockoplossing. Elke component werd via infusie (bij 10 µl/min) met een spuitpomp naar de ionenbron geleid. Componentafhankelijke parameters De componentafhankelijke parameters (instellingen voor de quadrupoolfilter) werden handmatig geoptimaliseerd via de ‘ramp’ optimalisatiemethode. Het ‘rampen’ van een parameter is een proc´ed´e waarbij een experiment meerdere malen wordt uitgevoerd waarbij 64

4.3. Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer een welbepaalde parameter telkens wordt aangepast. Het experiment wordt herhaald tot een optimum gevonden wordt voor de te ‘rampen’ parameter. De betekenis van deze componentafhankelijke parameters wordt in wat volgt kort toegelicht:

• CAD Gas (CAD) De CAD parameter controleert de druk van het botsingsgas in de botsingscel tijdens Q3 MS en MRM. • Declustering Potential (DP) De DP parameter controleert de spanning op de orifice-plaat, wat een invloed heeft op het declusteren van ionen tussen de orifice en de skimmer. Het wordt gebruikt om solventclusters te minimaliseren die kunnen achterblijven op monsterionen nadat ze de vacu¨ umkamer zijn binnengegaan en — indien gewenst— om ionen te fragmenteren. Hoe hoger de spanning, hoe hoger de energie die aan de ionen gegeven wordt, des te hoger de kans op (ongewenste) fragmentatie. • Focusing Potential (FP) De FP-parameter controleert de spanning die wordt aangelegd op de focusing ring lens. De FP helpt om ionen te focusseren door de skimmer regio van de MS interface. Het kan fragmentatie induceren in de interface, net zoals de DP. • Collision Cell Entrance Potential (CEP) De CEP parameter wordt gebruikt om ionen te focusseren en te versnellen in de botsingscel (Q2). CEP speelt een rol bij Q1- en MRM-type scans en is massaafhankelijk. • Collision Cell Exit Potential (CXP) De CXP parameter wordt gebruikt om ionen te focusseren en te versnellen uit de botsingscel (Q2). CXP speelt een rol bij Q3 en MRM type scans en is massaafhankelijk. 65

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte • Collision Energy (CE) De CE parameter controleert het potentiaalverschil tussen Q1 en Q2 voor MRM type scans. Dit is de hoeveelheid energie die de percursorionen ontvangen bij het versnellen in de Q2 botsingscel, waar ze botsen met het gas en fragmenteren. In Figuur 4.5 zijn de geoptimaliseerde componentafhankelijke parameters van KYN, TRP en TRP-D5 weergegeven.

Figuur 4.5: De componentafhankelijke parameters van KYN, TRP en TRP-D5.

Bronafhankelijke parameters De bronafhankelijke parameters werden geoptimaliseerd via split infusie. Hierbij werd met behulp van een T-stuk (de splitter) een debiet van 50 µl/min afkomstig van de directe infusie (spuit) met het analietmengsel, gecombineerd met een stroom van 150 µl/min (90/10 water (+ 0,5% HFBA)/ACN) afkomstig van de HPLC naar de MS gestuurd (zonder kolom). De invloed van deze parameters werd bestuurd door de parameters systematisch handmatig te vari¨eren tot een maximale intensiteit voor het mengsel bekomen werd. De aanbevolen verticale positie van de ionenbron bedroeg 3 en de aanbevolen horizontale positie 5. • Gas 1 (GS1) De GS1 parameter controleert het verstuivergas. Het verstuivergas helpt kleine druppeltjes te genereren van de sample stroom en be¨ınvloedt de stabiliteit en de gevoeligheid van de spray. • Gas 2 (GS2) De GS2 parameter controleert het droog- of turbogas. Het wordt gebruikt om de 66

4.3. Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer neveldruppeltjes te helpen verdampen en om zo het solvent te verhinderen monsterionen in de gasfase te produceren. • Temperature (TEM) De TEM-parameter controleert de temperatuur van het turbogas in de ionenbron. Het wordt gebruikt om het solvent te helpen verdampen om zo monsterionen in de gasfase te produceren. • Curtain Gas (CUR) De CUR parameter controleert het curtain gas dat tussen de curtain plaat en de orifice plaat stroomt. Het verhindert dat solventdruppeltjes de ionenoptica binnendringen en contaminatie veroorzaken. Deze parameter moet zo hoog mogelijk genomen worden zonder gevoeligheid te verliezen. • Ionspray Voltage (IS) De IS parameter controleert de spanning die aangelegd wordt op de tip van de ionenbron die het monster ioniseert. Deze spanning hangt af van de polariteit van de analieten en be¨ınvloedt de stabiliteit van de spray en de gevoeligheid. • Interface Heater (ihe) De interface heater kan aan- of uitgeschakeld worden. Door de interface te verwarmen, wordt het ionsignaal gemaximaliseerd en wordt contaminatie van de ionenoptica verhinderd. De interface plaat wordt tot 100 ◦ C verwarmd. In Figuur 4.6 worden de geoptimaliseerde bronafhankelijke parameters weergegeven.

Figuur 4.6: Bronafhankelijke parameters voor het testmengsel.

Na invullen van de optimale parameters werden volgende TIC-massaspectra bekomen. 67

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte

Figuur 4.7: TIC-spectrum van Kynurenine.

Het massaspectrum van kynurenine geeft een basispiek bij 208,9 amu ([M + H]+ ). 191,9 amu zal waarschijnlijk het belangrijkste dochterion vormen, terwijl 231,1 amu het Na+ adduct van kynurenine vormt ( [M + H]+ + 22 amu). Het verlies van 17 amu komt waarschijnlijk overeen met het verlies van NH+ 3 , maar kan ook te wijten zijn aan het verlies van OH+ van het moleculair ion.

Figuur 4.8: TIC-spectrum van tryptofaan.

Het massaspectrum van tryptofaan geeft een basispiek bij 205,0 amu ([M + H]+ ). 188,0 amu zal meer dan waarschijnlijk het belangrijkste dochterion vormen, terwijl 227 amu het Na+ -adduct van tryptofaan vormt ( [M + H]+ + 22 amu). Het verlies van 17 amu komt 68

4.3. Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer waarschijnlijk overeen met het verlies van NH+ 3 , maar kan ook te wijten zijn aan het verlies van OH+ van het moleculair ion.

Figuur 4.9: TIC-spectrum van gedeutereerd tryptofaan.

Het massaspectrum van gedeutereerd tryptofaan geeft een basispiek bij 210,0 amu ([M + H]+ ). 192,0 amu zal meer dan waarschijnlijk het belangrijkste dochterion vormen, terwijl 232,0 amu het enkele Na+ -adduct van TRP-D5 vormt ( [M + H]+ + 22 amu) en 254,0 het dubbele Na+ -adduct ([M + H]+ + 2× 22 amu). 248,0 vormt het K+ -adduct ([M + H]+ + 38 amu) van TRP-D5. Merk op dat het moleculair ion van TRP-D5 een fragment van 18 amu verliest i.p.v. 17 amu in het geval van de niet-gedeutereerde component. Dit suggereert dat er toch ook protonen van de NH2 of de OH groep gedeutereerd zijn. Dit was enerzijds verwonderlijk daar het tryptofaan in principe enkel op de indool-structuur gedeutereerd was. Anderzijds lijkt het helemaal denkbaar dat er toch ook uitwisseling van de protonen plaats gevonden heeft, daar er met deze protonen het makkelijkst uitgewisseld kan worden. Na uitvoeren van een dochterscan op KYN, TRP en TRP-D5 werden volgende massaspectra verkregen. Het verlies van 18 amu is hierbij ook de meest voorkomende fragmentatie. 69

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte

Figuur 4.10: Dochterscan van kynurenine met 209,2 als precursorion en 192,1 als belangrijkste dochterion.

Figuur 4.11: Dochterscan van tryptofaan met 205,2 als precursorion en 188,2 als belangrijkste dochterion.

70

4.3. Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer

Figuur 4.12: Dochterscan van gedeutereerd tryptofaan met 210,2 als precursorion en 192,1 als belangrijkste dochterion.

Op basis van de uitgevoerde dochterscans en automatische massa-optimalisatie werd volgend MRM-schema bekomen (Figuur 4.13).

Figuur 4.13: Bekomen MRM-schema voor de analyse van KYN, TRP en TRP-D5.

De massaspectrometer wordt nu als zo goed mogelijk afgesteld beschouwd om zo gevoelig mogelijk het testmengsel en de bloedplasmamonsters te analyseren. Figuur 4.14 toont het chromatogram dat bekomen werd door gebruik te maken van de geoptimaliseerde gradi¨ent elutiemethode (Figuur 4.3) en de ontwikkelde MRM-methode. De herhaalbaarheid voor deze ontwikkelde methode werd getest door een tienvoudige injectie van het testmengsel. Zoals de tabel in Figuur 4.15 weergeeft wordt een goede herhaalbaarheid (RSD ≤ 5%) verkregen voor zowel het piekoppervlak als de retentietijd van KYN, TRP en TRP-D5. 71

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte

Figuur 4.14: Chromatogram bekomen via de geoptimaliseerde scheidingsmethode voor LC-MS/MS voor een testmengsel van 10 µg/ml van KYN, TRP en TRP-D5.

Figuur 4.15: Herhaalbaarheidsanalyse voor KYN, TRP en TRP-D5 voor de bekomen scheidingsmethode.

Om te testen of de methode ook werkt op bloedplasma werd plasma, na staalvoorbereiding, ge¨ınjecteerd op de kolom. Figuur 4.16 en Figuur 4.17 geeft het bekomen chromatogram weer van een bloedplasmamonster van een positieve IBD-pati¨ent. 72

4.3. Detectie van het testmengsel met de API 2000 massaspectrometer TRP&TRPD5

KYN

Figuur 4.16: Chromatogram na scheiding van plasmamonster op LC-MS/MS van een IBD-pati¨ent (1).

TRP&TRPD5

KYN

Figuur 4.17: Chromatogram na scheiding van plasmamonster op LC-MS/MS van een IBD-pati¨ent (23).

73

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte Volgende opmerkingen kunnen hierbij gemaakt worden: • De retentie bleek op het Alliance-systeem een stuk hoger te zijn in vergelijking met het Agilent-systeem. Dit is mogelijks het gevolg van verschillen in de effectieve gradi¨entsamenstelling in beide systemen. Het Agilent-systeem maakt gebruik van een binaire pomp in combinatie met hoge druk menging. In het Alliance-systeem daarentegen worden de solventen gemengd v´o´or de pomp (lage druk menging). Dit kan leiden tot discrepanties in de bekomen chromatogrammen. • Elutievolgorde blijft onveranderd in vergelijking met scheiding op Agilent 1200. Bevestiging werd geleverd door MS-spectra. • Kynurenine vertoont schijnbaar 2 pieken in het spectra. Dit is te wijten aan het kleine massatransitieverschil van KYN ( 209,2 → 192,1) en TRP-D5 ( 210,2 → 192,1). De massaspectrometer veronderstelt kynurenine te meten, terwijl het eigenlijk de interne standaard is. Deze these werd bevestigd doordat deze piek niet verscheen bij gebruik van norvaline als interne standaard. Door de voorafgaande scheiding op de kolom vormt dit echter geen probleem. Deze massatransitie werd echter behouden om geen verlies in gevoeligheid te verkrijgen bij detectie van KYN en TRP-D5. • Noteer dat tussen Figuur 4.16 en Figuur 4.17 een retentieverschil van ca. 10 % optreedt. Dit is te wijten aan het feit dat opnames met een tijdsverschil van enkele weken uitgevoerd werden. De specificiteit van MS/MS compenseert ruimschoots voor dit fenomeen.

4.4

Kwantificatie

Bij uitzetten van het analytisch signaal (piekoppervlak in tellen) in functie van de concentratie van het analiet wordt een kalibratiecurve bekomen. In deze scriptie werd gebruikt gemaakt van interne kalibratie als kwantificatiemethode. Een inwendige standaard (IS) is 74

4.4. Kwantificatie een component die aan het monster wordt toegevoegd om te corrigeren voor verliezen tijdens monstervoorbereiding (prote¨ıneprecipitatie) en het chromatografisch proces. Keuze van de inwendige standaard is belangrijk en moet aan volgende criteria voldoen • De inwendige standaard moet qua structuur zo goed mogelijk op de te bepalen component lijken. • De inwendige standaard mag niet met de analieten reageren. • De inwendige standaard mag niet van nature aanwezig zijn in het monster. Veelal wordt gekozen voor een gedeutereerde vorm van het analiet. In dit werk werd gekozen voor de gedeutereerde versie van tryptofaan: tryptofaan-indool-d5 . Om de concentratie van kynurenine en tryptofaan te bepalen werd de interne standaard toegevoegd om te corrigeren voor verliezen tijdens de prote¨ıneprecipitatie en om fluctuaties in de ESIMS gevoeligheid op te vangen. De piekoppervlakte van kynurenine en tryptofaan wordt gedeeld door het piekoppervlak van de interne standaard en externe kalibratie wordt uitgevoerd op deze relatieve piekoppervlakken. Gezien de chemische similariteit tussen KYN en TRP-D5 kan er verondersteld worden dat deze interne standaard ook geschikt is voor correctie van deze component. De resultaten verder bekomen in dit werk bevestigen ook deze keuze. Zo wordt er bv. weinig verschil gemeten tussen de resultaten bekomen m´et en zonder I.S.-correctie, wat aantoont dat de methodologie sowieso reeds zeer robuust is. Om de kalibratiecurve op te stellen, werden alle metingen in drievoud uitgevoerd; hieruit kon RSD (%) bepaald worden. Er werd een lineair verband (y = ax + b) gezocht tussen de relatieve piekoppervlakte en de concentratie voor een concentratiebereik van 0,5 tot 100 µg/ml, een relevant interval in vergelijking met concentratiewaarden gekend uit de literatuur.

4.4.1

Kynurenine

In Figuur 4.18 is de opbouw van de kalibratiecurve voor kynurenine weergegeven. De relatieve piekoppervlakte (piekoppervlakte KYN / piekoppervlakte TRP-D5) werd uitgezet 75

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte in functie van de KYN-concentratie. Een zeer goede lineariteit, weerspiegeld door de correlatiefactor (R2 = 0, 9997), werd bekomen in het beoogde gebied. Een behoorlijk goede herhaalbaarheid (% RSD) werd bekomen; RSD ≤ 5% werd in de meeste gevallen bekomen.

Figuur 4.18: Opstellen van kalibratiecurve van kynurenine via relatieve piekoppervlakte.

In Figuur 4.19 werd het signaal weergegeven van kynurenine met een concentratie van 0,5 µg/ml. Dit chromatogram werd gebruikt om LOD en LOQ te bepalen van KYN zoals weergegeven in Figuur 2.1, waarbij LOD overeenkomt met S/N = 3 en LOQ overeenkomt met S/N = 10. Op deze manier werd LOD = 0,102 µg/ml en LOQ = 0,342 µg/ml.

Figuur 4.19: Bepalen van LOD (S/N = 3) en LOQ (S/N = 10) voor kynurenine.

76

4.4. Kwantificatie

4.4.2

Tryptofaan

In Figuur 4.20 is de opbouw van de kalibratiecurve voor tryptofaan weergegeven. De relatieve piekoppervlakte (piekoppervlakte TRP / piekoppervlakte TRP-D5) werd uitgezet in functie van de TRP-concentratie. Een zeer goede lineariteit, weerspiegeld door de correlatiefactor (R2 = 0, 9927), werd bekomen in het vooropgestelde gebied. In het laag concentratie gebied werd een matige tot minder goede herhaalbaarheid gehaald. In het hogere concentratiegebied, van toepassing voor TRP, werd een goede herhaalbaarheid bekomen met RSD ≤ 5%.

Figuur 4.20: Opstellen van kalibratiecurve van tryptofaan via relatieve piekoppervlakte.

In Figuur 4.21 werd het signaal weergegeven van tryptofaan met een concentratie van 0,5 µg/ml. Dit chromatogram werd gebruikt om LOD en LOQ te bepalen van TRP zoals weergegeven in Figuur 2.1, waarbij LOD overeenkomt met S/N = 3 en LOQ overeenkomt met S/N = 10. Op deze manier werd LOD = 0,119 µg/ml en LOQ = 0,396 µg/ml, wat ruim onder de verwachte TRP-concentraties valt. Op een analoge manier werd dit uitgevoerd voor TRP-D5 wat een LOD = 0,068 µg/ml en LOQ = 0,228 µg/ml, ruim 77

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte onder het niveau van de gebruikte 10 µg/ml.

Figuur 4.21: Bepalen van LOD (S/N = 3) en LOQ (S/N = 5) voor Tryptofaan

De concentratie van tryptofaan en kynurenine werd bepaald door de relatieve piekoppervlakte in de gevonden lineariteitsvergelijking voor tryptofaan en kynurenine in te vullen (x =

4.5

y−b a ).

Monstervoorbereiding

Vooraleer chromatografische analyses van de re¨ele monsters uitgevoerd werd, is de monstervoorbereiding een zeer belangrijke en vaak ook moeilijke, tijdsrovende stap. Bij de monstervoorbereiding van bloedplasma is de belangrijkste stap verwijderen van prote¨ınes, zoals humaan serum albumine (HSA). Deze prote¨ınen kunnen de reproduceerbaarheid van de methode ondermijnen daar ze kunnnen co-elueren met de analieten die bestudeerd worden en zo via competitieve ionisatie de gevoeligheid voor de analietmoleculen onderdrukken. Vaste fase extractie of solid phase extraction (SPE) is een veel gebruikte methode, maar werd als te tijdrovend beschouwd voor deze grote hoeveelheid monsters (ongeveer 500, daar elk monster in triplicaat diende behandeld te worden). In de literatuur werden verschillende alternatieven voorgesteld. Een drievoudige overmaat methanol, een dubbele overmaat acetonitril, een dubbele overmaat koude methanol en 10 Volume% TCA (gechloreerd azijnzuur) als precipiterend reagens, werden uitgeprobeerd. Uiteindelijk bleek een drievoudige overmaat methanol de beste resultaten te geven. 78

4.6. Batchsamenstelling en resultaat Alle monsters werden als volgt bereid: 1. Het plasma wordt verdeeld in 3 gelijke volumes (aliquots) van 50 µl. 2. 50 µl interne standaardoplossing wordt bij het plasma gepipetteerd. 3. 300 µl methanol wordt toegevoegd om de prote¨ınes neer te slaan. 4. Het monster wordt gedurende enkel minuten gemixed met een vortex-mixer. 5. Het monster wordt vervolgens gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij 12.000 RPM. 6. Het supernatant wordt gefilterd op een PVDF-filter (0,45 µm) en in een microvial gebracht.

4.6

Batchsamenstelling en resultaat

Na de methode-ontwikkeling volgde, tijdens deze scriptie, een lange periode van monstervoorbereiding en analyse. Een batch werd gevuld met 20 plasmamonsters, telkens vooraf gegaan door een verse kalibratiereeks. Na analyse van de kalibratiereeks werd de kolom twee maal gespoeld met 100 % ACN gedurende 23 minuten. Deze spoelprocedure werd ook uitgevoerd na analyse van de 3 aliquots van elk plasmamonster. Uiteindelijk na analyse van alle 149 monsters, integratie en kwantificatie werden de TRP- en KYN-concentraties gemeten. Alle resultaten zijn terug te vinden in de bijgevoegde appendix, achteraan in deze thesis. De interpretate van deze resultaten wordt in het volgende hoofdstuk besproken.

79

Hoofdstuk 4. Experimenteel Gedeelte

80

HOOFDSTUK

5 STATISCHE ANALYSE

Het bekomen van de KYN- en TRP-concentraties vormt niet het eindpunt in deze scriptie. In wat volgt worden verschillende statische methodes, gaande van standaardtoepassingen zoals de t-toets tot meer geanvanceerde technieken zoals PCA en PLS, toegepast op de bekomen data met als doel een onderscheid te kunnen maken tussen monsters afkomstig van IBD-pati¨enten en controlepersonen.

5.1

Distributie van data

In Figuur 5.1 worden de resultaten weergegeven van alle 149 monsters op basis van de KYN- en TRP-concentratie. IBD-pati¨enten worden voorgesteld door een vierkantje en controlepersonen door een driehoekje. Op basis van Figuur 5.1 kan vastgesteld worden dat er een duidelijk onderscheid kan gemaakt worden tussen beide groepen. IBD-pati¨enten bezetten hoofdzakelijk de lage concentratie gebieden (links onderaan de grafiek), terwijl de controlemonsters hoofdzakelijk in het hoge concentratie gebied terug te vinden zijn. Merk op dat elk resultaat de gemiddelde waarde is van de analyse van 3 analyses van elk plasmamonster. De relatieve standaardafwijking van de resultaten wordt gegeven in de appendix achteraan de thesis. Deze lage waarden lagen volledig in lijn met de verwachte hoge robuustheid van de ontwikkelde methode. 81

Hoofdstuk 5. Statische analyse

Figuur 5.1: Distributie van 149 monsters op basis van KYN- en TRP-concentratie voor de IBD-pati¨enten en de controlegroep.

Projectie van deze punten, zowel op de KYN- als de TRP-as, levert een distributie van de monsters op onder de vorm van een histogram. Het histogram voor KYN is weergegeven in Figuur 5.2, terwijl het histogram van TRP weergegeven is in Figuur 5.3. Uit de bekomen histogrammen kunnen al enkele conclusies getrokken worden. • Voor KYN kan er, op basis van de meest voorkomende waarde in het histogram, een beter onderscheid gemaakt worden tussen IBD-pati¨ent en controlepersonen dan voor TRP. Biologisch en biochemisch is dit aanvaardbaar aangezien TRP-concentraties in het lichaam zo constant mogelijk gehouden worden, ongeacht de persoon, en KYN een katabolisch product van TRP is waarvan de concentraties variabel geacht worden. • De spreiding (variantie) van de resultaten is groter voor TRP dan voor KYN. • De spreiding (variantie) van de resultaten is groter voor controlepersonen dan voor IBD-pati¨enten. 82

5.1. Distributie van data • Voor KYN is er een verschuiving naar de hogere concentraties voor de controlepersonen t.o.v. IBD-pati¨enten. Dit ligt niet in lijn met de verwachtingen aangezien een verhoogde IDO-activiteit bij IBD-pati¨enten aanleiding geeft tot hogere KYN productie. Uit deze bevindingen kan er geen sluitende conclusie getrokken worden, daar de KYN/TRP-ratio een representatieve parameter van IDO-activiteit zou moeten zijn.

Figuur 5.2: Distributie van kynurenine in IBD-pati¨enten en controlepersonen. De x-as onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml). De z-as geeft het aantal weer bij elke concentratie.

In Figuur 5.4 is de distributie weergegeven van de KYN/TRP-ratio voor IBD-pati¨enten en controlemonsters. De these die in deze scriptie aangenomen wordt is dat de KYN/TRPratio de activiteit van het IDO-enzyme weerspiegelt. Opregulatie van IDO, a.g.v. chronische inflammatie in het maagdarmkanaal, zou leiden tot een verhoogde KYN/TRP-ratio bij IBD-pati¨enten. Figuur 5.4 weerspiegelt weinig verschil tussen de distributie van de ratio bij IBD-pati¨enten en controlepersonen. De inverse these, hogere KYN/TRP-ratio bij controlepersonen, dringt zich eerder op. Om meer sluitende conclusies te trekken werd een T-test uitgevoerd. 83

Hoofdstuk 5. Statische analyse

Figuur 5.3: Distributie van tryptofaan in IBD-pati¨enten en controlepersonen. De x-as onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml). De z-as geeft het aantal weer bij elke concentratie.

Figuur 5.4: Distributie van KYN/TRP-ratio in IBD-pati¨enten en controlepersonen. De x-as onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml). De z-as geeft het aantal weer bij elke concentratie.

84

5.2. T-Toets

5.2

T-Toets

In dit onderdeel wordt een T-Toets voor 2 onafhankelijke steekproeven uitgevoerd. Er wordt getest of er een significant verschil bestaat tussen de gemiddelde waarde van KYN, TRP en KYN/TRP-ratio voor IBD-pati¨enten en controlepersonen. De nulhypothese H0 stelt dat de gemiddelde concentratie (of ratio) voor KYN of TRP van de steekproef voor IBD-pati¨enten gelijk is aan dat voor controle personen. Wanneer de bekomen waarde voor significantie (p-waarde) kleiner is dan een bepaalde kritische waarde, die ingesteld wordt op 0,05 voor het gebruikte 95% significantie-interval, kan gesteld worden dat het verschil in gemiddelde waarde voor elke groep niet te wijten is aan toevallige variatie. De nulhypothese wordt m.a.w. verworpen. In Figuur 5.5 zijn de resultaten van de tweezijdige T-toets voor 2 onafhankelijke steekproeven, berekend via SPSS 16, weergegeven. De Ttoets werd uitgevoerd wanneer er verondersteld werd dat varianties van beide groepen (IBD-pati¨ent en controle) gelijk waren, alsook wanneer de varianties verschillend zouden zijn.

Figuur 5.5: Resultaat van tweezijdige T-toets voor 2 onafhankelijke steekproeven voor KYN, TRP en hun ratio.

85

Hoofdstuk 5. Statische analyse

5.2.1

Kynurenine

Uit Figuur 5.5 blijkt dat de 104 IBD-pati¨enten een gemiddelde KYN-concentratie hebben van 0, 894252 ± 0, 3763 µg/ml terwijl de 45 controle pati¨enten een gemiddelde KYNconcentratie van 1, 784948 ± 0, 4070 µg/ml. De significantie, voor zowel gelijke als verschillende variantie, geeft een waarde v´e´el kleiner dan 0,05 aan. Hieruit blijkt dat H0 verworpen moet worden, en dat met 95% zekerheid gesteld kan worden dat variatie tussen deze gemiddelde waardes niet te wijten is aan toeval. Zoals al bleek uit vorige paragraaf kan er perfect onderscheid gemaakt worden tussen IBD-pati¨ent en controlepersoon op basis van KYN-concentratie. Er blijkt ook dat er een hogere KYN-concentratie gevonden wordt voor controlemonsters dan voor monsters afkomstig van IBD-pati¨enten.

5.2.2

Tryptofaan

Uit Figuur 5.5 blijkt dat de 104 IBD-pati¨enten een gemiddelde TRP-concentratie hebben van 9, 883463 ± 3, 1904 µg/ml terwijl de 45 controle pati¨enten een gemiddelde TRPconcentratie van 15, 20096 ± 6, 1285 µg/ml. De significantie, voor zowel gelijke als verschillende variantie, geeft een waarde v´e´el kleiner dan 0,05 aan. Hieruit blijkt dat H0 verworpen moet worden, en dat met 95% zekerheid gesteld kan worden dat variatie tussen deze gemiddelde waardes niet te wijten is aan toeval. Zoals al bleek uit vorige paragraaf kan er onderscheid gemaakt worden tussen IBD-pati¨ent en controlepersoon op basis van TRP-concentratie, maar op een minder significante manier dan voor kynurenine. Dit blijkt uit de hogere p-waardes (significantie). Er wordt een hogere TRP-concentratie gevonden voor IBD-pati¨enten dan voor monster afkomstig van controlepersonen.

5.2.3

KYN/TRP-Ratio

Uit Figuur 5.5 blijkt dat de 104 IBD-pati¨enten een gemiddelde KYN/TRP-ratio hebben van 0, 1002116 ± 0, 056470µg/ml terwijl de 45 controle pati¨enten een gemiddelde KYN/TRP-ratio hebben van 0, 129836 ± 0, 046035µg/ml. De significantie, voor zowel gelijke als verschillende variantie, geeft een waarde kleiner dan 0,05 aan. Hieruit blijkt dat H0 verworpen moet worden, en dat met 95% zekerheid gesteld kan worden dat variatie 86

5.3. Principale componenten analyse tussen deze gemiddelde waardes niet te wijten is aan toeval. Nu kan met zekerheid gesteld worden dat er onderscheid gemaakt worden tussen IBD-pati¨ent en controlepersoon op basis van KYN/TRP-ratio. Dit is echter op een heel wat minder significante manier dan voor beide moleculen afzonderlijk, wat af te leiden valt uit de hogere p-waardes (significantie). Wat echter ook blijkt, en niet overeenkomt met de gebruikte IDO-hypothese, is dat een hogere KYN/TRP-ratio gevonden wordt voor controlepersonen dan voor plasmamonsters afkomstig van IBD-pati¨enten. Het idee van een hogere KYN/TRP-ratio bij IBD-pati¨enten blijkt dus niet te kloppen, uitgaande van deze data. Een vergelijkende studie met data van controlepersonen uit de literatuur levert een grote gelijkenis op voor TRP-concentraties (±15µg/ml) maar een afwijking voor KYN-concentraties (± 0, 4µg/ml). Dit resultaat werd uitvoerig besproken met Dr. F. Lynen en mogelijke problemen zoals een verlaagde gevoeligheid gedurende de analyseperiode, een fout bepaalde LOD,... konden telkens weerlegd worden. In dit opzicht werd er verondersteld dat de bekomen data betrouwbaar zijn. Verder is er geen informatie beschikbaar over de controlepersonen waardoor mogelijke biologische of biochemische verklaringen eerder subjectief en wetenschappelijk incorrect zouden zijn.

5.3

Principale componenten analyse

De statische achtergrond voor PCA werd eerder in Hoofdstuk 2 aangehaald. PCA is een clustermethode die hoofdzakelijk gebruikt worden om data, afhankelijk van meerdere variabelen, makkelijker te interpreteren en visueel voor te stellen. PCA vormt principale componenten (PC1 en PC2) door combinaties te vormen van de oorspronkelijke variabelen (KYN- en TRP-concentratie), waarbij de meeste variantie ( lees informatie) terug te vinden is bij PC1. Gebruik maken van de ratio, ´e´en variabele dus, is bijgevolg voor PCA nutteloos en tevens niet mogelijk. Aangezien er oorspronkelijk slechts 2 variabelen bepaald werden, is datareductie hier overbodig. Het bekomen PCA-plot in Figuur 5.6 is bijgevolg een genormaliseerde en geroteerde versie van Figuur 5.1. 87

Hoofdstuk 5. Statische analyse

Figuur 5.6: Principale Componenten Analyse opgebouwd uit de concentratievariabelen voor IBD-pati¨enten en controlepersonen.

Uit de bekomen PCA-grafiek kan vastgesteld worden dat het, behalve de veronderstelde rotatie en normalisatie, weinig verschilt van de scatterplot bekomen in Figuur 5.1. Opnieuw kan een verschil in regio’s waargenomen worden voor IBD-Pati¨enten en controlepersonen, waardoor classificatie van onbekende monsters (IBD-pati¨ent of niet) mogelijk is via PCA. Zoals het PCA toekomt, is er duidelijk te zien dat er meer spreiding (onderscheid) waar te nemen is op PC1 dan op PC2. Ook wordt bevestigd dat er meer variantie aanwezig is bij de controlemonsters dan bij IBD-pati¨enten. PCA maakt geen gebruik van een groepsvariabele, het weet dus m.a.w. niet op voorhand welk monster tot de IBD-groep behoort en welk monster tot de controlegroep behoort. PCA is dus een niet gesuperviseerde methode. Aangezien dit op voorhand wel gekend is, wordt er — bij gebruik van PCA — handige informatie niet gebruikt. Een gesuperviseerde methode biedt de oplossing en wordt geleverd door kleinste-kwadraten regressie (PLS).

5.4

Kleinste-kwadraten regressie

Kleinste-kwadraten regressie (PLS) werd uitgevoerd op de concentratievariabelen van IBDpati¨enten en controlepersonen. PLS maakt gebruik van formule 5.1 om voor elke monster een responswaarde f te verkrijgen wanneer de KYN- en de TRP-concentratie in de verge88

5.4. Kleinste-kwadraten regressie lijking ingevuld worden.

f = β1 + β2 × ConcKY N + β3 × ConcT RP

(5.1)

Het PLS-proc´ed´e (uitgevoerd met Matlab) zoekt vervolgens naar de beste β-co¨effici¨enten voor vergelijking 5.1, wetende welke monster tot welke categorie behoort. Op voorhand werd gesteld dat IBD-pati¨enten een responswaarde -1 (zouden moeten) hebben, terwijl controlepersonen een responswaarde +1 (zouden moeten) hebben. Uiteindelijk werd vergelijking 5.2 als PLS-regressie vergelijking bekomen.

f = −2, 0123 + 1, 0477 × ConcKY N + 0, 0346 × ConcT RP

(5.2)

Invullen van alle waardes voor de KYN- en TRP-concentratie levert voor elk monster een responswaarde. Deze responswaarden werden uitgezet in Figuur 5.7.

Figuur 5.7: Responswaarde bekomen volgens vergelijking 5.2 uitgezet in functie van het monsternummer. De ideale responswaarde voor IBD-pati¨enten bedraagt -1, terwijl die voor controlepersonen +1 bedraagt.

89

Hoofdstuk 5. Statische analyse Figuur 5.7 geeft de responswaarde van elk monster terug. -1 werd vooraf ingesteld als ideale responswaarde voor IBD-pati¨enten terwijl +1 de controlemonsters representeert. Het gemiddelde van -1 en +1, vormt dus een grenswaarde voor de voorspelling. Wanneer van een onbekend monster de KYN- en TRP-concentratie gekend zou zijn, zou aan de hand van de responswaarde voorspeld kunnen worden tot welke groep het monster behoort. Zoals op Figuur 5.7 te zien valt leveren de eerste 104 monsters, de IBD-pati¨enten, hoofdzakelijk responswaarden in de buurt van -1 en de laatste 45 monsters, de controlepersonen, hoofdzakelijk waarden op van +1. Voor IBD-pati¨enten valt te zien dat er 7 monsters een waarde hebben die groter is dan 0, waardoor deze verkeerdelijk als ’gezond’ aanzien kan worden. Er is sprake van een valse negatieve waarde. Voor controlepersonen vallen er 9 waarden onder 0, waardoor er sprake is van 9 valse positieve waarden. Deze 9 personen zouden verkeerdelijk als pati¨ent bestempeld worden volgens dit PLS-model. PLS vormt dus een beter classificatiemodel is deze studie dan PCA.

90

HOOFDSTUK

6 CONCLUSIE

In deze scriptie werd intensief gezocht naar een snelle methode om op een simultane manier de tryptofaan- en kynurenineconcentratie in bloedplasma te bepalen. Op deze manier werd geprobeerd om een verband te leggen tussen tryptofaan-depletie, a.g.v. een verhoogde IDO-activiteit (weerspiegeld door KYN/TRP-ratio), en blijvende vermoeidheid bij pati¨enten met een chronische inflammatoire darmziekte zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa. Een testmengsel bestaande uit kynurenine (KYN), tryptofaan (TRP) en een interne standaard (tryptofaan-indoold5 , TRP-D5) werd gescheiden volgens een gradi¨ent elutiemethode op een Kinetex kolom. Verschillende mobiele fases en zure additieven werden getest, waarbij de beste scheiding verkregen werd met H2 O (+ 0,5 % HFBA) en acetonitril. Er werd gezocht naar een detectiemethode waar derivatisatie van de moleculen onnodig was. De selectiviteit en gevoeligheid in MRM-modus, maakten van de massaspectrometer de ideale detector om deze molecules te detecteren in een complexe biologische matrix als die van bloedplasma. Aangezien een grote hoeveelheid monsters (149 in triplicaat) voorbereid moest worden, werd gezocht naar een zo eenvoudig mogelijke monstervoorbereiding. Prote¨ıneprecipitatie met een drievoudige overmaat methanol, gevolgd door homogenisatie en centrifgugatie bleek een geschikte manier. Interne kalibratie werd gebruikt als kwantificatiemethode. Kalibratiecurven werden op91

Hoofdstuk 6. Conclusie gesteld op basis van relatieve piekoppervlakte (oppervlakte TRP of KYN / oppervlakte TRP-D5) voor TRP en KYN. Voor KYN werd een heel goede herhaalbaarheid en lineariteit bekomen en een LOD van 0,102 µg/ml werd bereikt. Voor TRP werd een goede herhaalbaarheid en lineariteit bekomen en een LOD van 0,119 µg/ml. Na een lange periode van monstervoorbereiding en analyse van de plasmamonsters, gepaard gaande met de daarbij horende instrumentele problemen, werden uiteindelijk voor alle 149 plasmamonster de KYN- en TRP-concentratie bepaald. De resultaten werden geanalyseerd met statische methodes zoals t-toets, PCA en PLS. De kleinste-kwadraten regressiemethode bleek de beste manier om een onderscheid te maken tussen beide groepen, daar deze methode gesuperviseerd is. Uit de resultaten bleek echter, in tegenstelling tot de IDO-hypothese, dat een hogere KYN/TRP-ratio waar te nemen valt bij controlepersonen dan bij IBD-pati¨enten. Uit een vergelijkende studie met de literatuur bleek dat TRP-concentraties overeen komen maar KYN-concetraties veel hoger blijken in deze steekproef. Een mogelijk probleem hierbij zou kunnen zijn dat iets te dicht bij de LOD van KYN gemeten werd, wat op zijn beurt niet verklaart waarom de controlegroep significant meer KYN meet. Een mogelijke biochemische of biologische verklaring kan niet geboden worden door het gebrek aan informatie over de controlepersonen.

92

93

Bijlage . Appendix

APPENDIX

Resultaten

94

95

Bijlage . Appendix

96

97

Bijlage . Appendix

98

99

Bijlage . Afkortingen

AFKORTINGEN

100

101

Bijlage . Afkortingen

102

LIJST VAN FIGUREN

1.1

Schematische voorstelling van een individueel silicadeeltje waarbij aan de wand van de porie C18 -groepen verankerd werden als stationaire fase.

1.2

. .

7

Evenwichtsinstelling van solvent- en analietmolecules tussen de mobiele en de stationaire fase. Het effect van dit dynamisch evenwicht is een verschil in migratiesnelheid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.3

9

Schematische voorstelling van een chromatogram: tr , t0r en t0 samen met wb , wh en σ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.4

Schematische voorstelling van het Eddy Diffusie fenomeen . . . . . . . . . . 16

1.5

Schematische voorstelling van de piekverbreding die optreedt als gevolg van longitudinale diffusie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.6

Schematiche voorstelling van de invloed van de A, B en C-term op de van Deemter curve. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.7

Schematische voorstelling van een HPLC-systeem. . . . . . . . . . . . . . . 21

1.8

Laadpositie (links) en injectiepositie (rechts) van de zeswegkraan. . . . . . . 23

1.9

Opstelling: Waters Alliance 2695 gekoppeld aan een API 2000 massaspectrometer van Applied Biosystems.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

1.10 Schematische voorstelling van de API 2000 massaspectrometer van Applied Biosystems. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 1.11 Ionenbron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 103

Lijst van figuren 1.12 Schematische voorstelling van het elektronspray fenomeen . . . . . . . . . . 28 1.13 Schematische voorstelling van de desolvatatie via Coulomb fissie. . . . . . . 28 1.14 Schematische voorstelling van de elektrosprayvorming: ionevaporatie. . . . . 29 1.15 De quadrupoolanalysator . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 1.16 Dochter (product) ion scanmodus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 1.17 Ouder (precursor) ion scanmodus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 1.18 Neutral loss scanmodus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 1.19 Multiple Reaction Monitoring modus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 2.1

Berekenen van de signaal-tot-ruis verhouding op een chromatogram. . . . . 37

2.2

Grafische weergave van de opbouw van de principale componenten in PCA

3.1

De aangetaste delen van het maagdarmkanaal bij de ziekte van Crohn (links)

40

en colitis ulcerosa (rechts) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.2

Aantasting van de darmwand bij de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa. . . 46

3.3

Belangrijke structuren. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.4

Metabolisatie van tryptofaan tot serotonine enerzijds (boven) en kynurenine anderzijds (onder). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

3.5

Derivatisatie van tryptofaan met o-phthaalaldehyde en 2-mercaptoethanol . 54

4.1

Gradi¨ent elutieprogramma voor scheiding van het testmengsel. . . . . . . . 61

4.2

Chromatogram van het testmengsel gescheiden volgens de gradi¨entmethode weergegeven in Figuur 4.1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.3

Optimalisatie van het gradi¨ent elutieprogramma voor de scheiding van het testmengsel. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.4

Chromatogram van het testmengsel gescheiden volgens de geoptimaliseerde gradi¨ent elutiemethode. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.5

De componentafhankelijke parameters van KYN, TRP en TRP-D5. . . . . . 66

4.6

Bronafhankelijke parameters voor het testmengsel. . . . . . . . . . . . . . . 67

4.7

TIC-spectrum van Kynurenine. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

4.8

TIC-spectrum van tryptofaan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 104

Lijst van figuren 4.9

TIC-spectrum van gedeutereerd tryptofaan. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.10 Dochterscan van kynurenine met 209,2 als precursorion en 192,1 als belangrijkste dochterion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.11 Dochterscan van tryptofaan met 205,2 als precursorion en 188,2 als belangrijkste dochterion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.12 Dochterscan van gedeutereerd tryptofaan met 210,2 als precursorion en 192,1 als belangrijkste dochterion. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.13 Bekomen MRM-schema voor de analyse van KYN, TRP en TRP-D5. . . . . 71 4.14 Chromatogram bekomen via de geoptimaliseerde scheidingsmethode voor LC-MS/MS voor een testmengsel van 10 µg/ml van KYN, TRP en TRP-D5. 72 4.15 Herhaalbaarheidsanalyse voor KYN, TRP en TRP-D5 voor de bekomen scheidingsmethode. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72 4.16 Chromatogram na scheiding van plasmamonster op LC-MS/MS van een IBD-pati¨ent (1). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 4.17 Chromatogram na scheiding van plasmamonster op LC-MS/MS van een IBD-pati¨ent (23). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 4.18 Opstellen van kalibratiecurve van kynurenine via relatieve piekoppervlakte.

76

4.19 Bepalen van LOD (S/N = 3) en LOQ (S/N = 10) voor kynurenine. . . . . . 76 4.20 Opstellen van kalibratiecurve van tryptofaan via relatieve piekoppervlakte. 4.21 Bepalen van LOD (S/N = 3) en LOQ (S/N = 5) voor Tryptofaan 5.1

77

. . . . . 78

Distributie van 149 monsters op basis van KYN- en TRP-concentratie voor de IBD-pati¨enten en de controlegroep. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

5.2

Distributie van kynurenine in IBD-pati¨enten en controlepersonen. De x-as onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml). De z-as geeft het aantal weer bij elke concentratie. . . . . . . . . . . . . . . 83

5.3

Distributie van tryptofaan in IBD-pati¨enten en controlepersonen. De x-as onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml). De z-as geeft het aantal weer bij elke concentratie. . . . . . . . . . . . . . . 84 105

Lijst van figuren 5.4

Distributie van KYN/TRP-ratio in IBD-pati¨enten en controlepersonen. De x-as onderscheid op vlak van groep en de y-as op basis van concentratie (µg/ml). De z-as geeft het aantal weer bij elke concentratie. . . . . . . . . . 84

5.5

Resultaat van tweezijdige T-toets voor 2 onafhankelijke steekproeven voor KYN, TRP en hun ratio.

5.6

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

Principale Componenten Analyse opgebouwd uit de concentratievariabelen voor IBD-pati¨enten en controlepersonen.

5.7

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

Responswaarde bekomen volgens vergelijking 5.2 uitgezet in functie van het monsternummer. De ideale responswaarde voor IBD-pati¨enten bedraagt -1, terwijl die voor controlepersonen +1 bedraagt. . . . . . . . . . . . . . . . . 89

106

BIBLIOGRAFIE

[1] L.S. Ettre. Nomenclature for Chromatography (IUPAC recommendations 1993). Pure and Applied Chem, 65(4):819, 1993. [2] R.S. Deelder G.J. De Jong J.H.M. Van den Berg. Chromatografie. Heron-reeks, 1994 (tweede druk). [3] M. Tswett G. Hesse. Michael Tswett’s Erste Chromatographische Schrift. Woelm, page 37 S., 1954. [4] Prof. Dr. P. Sandra. Scheidingstechnieken: Een Inleiding. Universiteit Gent, 20002001. ¨ [5] Richard Kuhn Edgar Lederer. Uber α - und β - Carotin. 1931. [6] A.J. Martin R.L. Synge. A New Form of Chromatography Employing Two Liquid Phases. Biochem J., 35:1358 – 1368, 1941. [7] L.S. Ettre. LCGC., 243:390, 2006. [8] L. S. Ettre. LCGC, 23:752, 2005. [9] L.S. Ettre A. Zlatkis. 75 Years of Chromatography: A Historical Dialog. Elsevier, Amsterdam, 1979. [10] A. J. P. Martin R. L. M. Synge. Biochem J., 35:1358, 1941. 107

Bibliografie [11] Lloyd R. Snyder Joseph J. Kirkland John W. Dolan. Introduction to Modern Liquid Chromatography. John Wiley & Sons, 3rd edition, 2010. [12] Micha¨el Polet.

Evaluatie van Onconventionele Microsferen in Geminiaturiseerde

Vloeistofchromatografie. Master’s thesis, Universiteit Gent, 2008-2009. [13] D.H. Williams I. Fleming. Spectroscopic Methods in Organic Chemistry. McGrawHill, Berkshire, 1995. [14] Deidre Cabooter. Possibilities and Limitations of the Kinetic Plot Method to Compare the Kinetic Performance of Chromatographic Seperation Methods and Colums. PhD thesis, Vrije Universiteit Brussel, 2009. [15] Jente Boelaert. Kwantitatieve Analyse van Cytostatica in Urine, Opstellen van een Screeningsysteem. Master’s thesis, Universtiteit Gent, 2008-2009. [16] John B. Fenn. Electrospray Wings for Molecular Elephants. Nobel Lecture, 2002. [17] Robert E. Ardrey. Liquid Chromatography - Mass Spectrometry : An Introduction. John Wiley & Sons, 2003. [18] Robert D. Voyksner. Liquid Chromatography / Mass Spectrometry: The Techniques of Electrospray and APCI. LCMS Limited, Raleigh, North Carolina, 2003. [19] P. Kebarle M. G. Ikonomou, A. T. Blades. Investigations of the Electrospray Interface for Liquid-Chromatography Mass-Spectrometry. Analytical Chemistry, 629:957, 1990. [20] Prof. Dr. Karel Strijckmans. Chemometrie. Universiteit Gent, 2008-2009. [21] T. Gorecki F. Lynen R. Szucs P. Sandra. Analytical Chemistry, 78:3186, 2006. [22] J.N. Miller J.C. Miller. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. Pearson/ Prentice Hall, 2005. [23] Gerd Bouma Warren Strober. The Immunological and Genetic Basis of Inflammatory Bowel Disease. Nature Reviews Immunology 3, 3:521, 2003. 108

Bibliografie [24] R.J Xavier D.K. Podolsky. Unravelling the Pathogenis of the Inflammatory Bowel Disease. Nature, 448:427–434, 2007. [25] Daniel C Baumgart Simon R Carding. Inflammatory Bowel Disease: Cause and Immunobiology. The Lancet: Gastroenterology, 369:1627–1640, 2007. [26] http://www.ziekenhuis.nl/index.php?cat=animaties&action=show&movie=197. [27] Daniel C Baumgart William J Sandborn. Inflammatory Bowel Disease: Clinical Aspects and Established and Evolving therapies. The Lancet: Gastroenterology, 369:1641–157, 2007. [28] C. Tysk E. Lindberg G. Jarnernot B. Floderus-Myrhed. Ulcerative colitis and Crohn’s Disease in an Unselected Population of Monozygotic and Dizygotic twins. A Study of Heritability and the Influence of Smoking. Gut, 29:990–996, 1988. [29] H. Bouhdid. Chronische inflammatoire darmziekten [IBD’s]: Begrijpen en behandelen (informatiebrochure). [30] JP. Hugot M .Chamaillard H. Zouali et al. Association of NOD2 leucine-rich Repeat Variants with Susceptibility to Crohn’s disease. Nature, 411:599, 2001. [31] MW Taylor G. Feng. Relationship Between Inteferon-γ, Indoleamine 2,3-dioxygenase, and Tryptophan-catabolism. FASEB Journal, 5:2516– 2522, 1991. [32] J¨org C. Schefold Jan-Philip Zeden Christina Fotopoulou Stephan van Haehling Rene Pschowski Dietrich Hasper Hans-Dieter Volk Christine Schuett Petra Reinke. Increased Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) Activity and Elevated Serum Levels of Tryptophan Catabolites in Patients with Chronic Kidney Disease: A Possible Link between Chronic Inflammation and Uraemic Symptoms. Nephrol Dial Transplant, 24:1901–1908, 2009. [33] Anna Maria Wolf Dominik Wolf Holger Rumpold Alexander R. Moschen Arthur Kaser Peter Obrist Dietmar Fuchs Gerald Brandacher Christiane Winkler Karel Geboes 109

Bibliografie Paul Rutgeerts Herbert Tilg. Overexpression of Indoleamine 2,3-dioxygenase in Human Inflammatory Bowel Disease. clinical immunology, 113:47, 2004. [34] Kazuo Yamada Takeshi Miyazaki Tomoko Shibata Nobumasa Hara Mikako Tsuchiya. Simultaneous Measurement of Tryptophan and Related Compounds by Liquid Chromatography/ Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Journal of Chromatography B, 867:57–61, 2008. [35] Caroline M. Forrest Philippa Youd Alan Kennedy Stuart R. Gould L. Gail Darlington Trevor W. Stone. Purine, Kynurenine, Neopterin and Lipid Peroxidation Levels in Inflammatory Bowel Disease. Journal of Biomedical Science, 9:436, 2002. [36] M.I. Torres M.A. L´ opez-Casado P. Lorite A. Rios. Tryptophan Metabolism and Indoleamine 2,3-dioxygenase Expression in Coeliac Disease. Clinical and Experimental Immunology, 148:419, 2007. [37] Marieke C. Wichers Michael Maes. The Role of Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) in the Pathophysiology of Interferon-α-induced Depression. Journal of Psychiatry Neuroscience, 29:11, 2004. [38] M. Maes R. Verkerk S. Bonaccorso W. Ombelet E. Bosmans S. Scharpe. Depressive and Anxiety Symptoms in the Early Puerperium are Related to Increased Degradation of Tryptophan into Kynurenine, a Phenomenon which is Related to Immune Activation. Life Science, 71:1837, 2002. [39] E. Marklova H. Makovickova I. Krakorova. Screening for Defects in Tryptophan Metabolism. Journal of Chromatography A, 870:289, 2000. [40] Benjamin Maneglier Christine Rogez-Kreuz Paulette Cordonnier Patrice Therond Charles Advenier Dominique Dormont Pascal Clayette Odile Spreux-Varoquaux. Simultaneous Measurement of Kynurenine and Tryptophan in Human Plasma and Supernatants of Cultured Human Cells by HPLC with Coulometric Detection. Clinical Chemistry, 50:2166, 2004. 110

Bibliografie [41] K. Petritis M. de Person C. Elfakir M. Dreux. Validation of an Ion-Interaction Chromatography Analysis of Underivatized Amino Acids in Commercial Preparation using Evaporative Light Scattering Detection. Chromatographia, 60:293, 2004. [42] Andreas Laich Gabrielle Neurauter Bernhard Widner Dietmar Fuchs. More Rapid Method for Simultaneous Measurement of Tryptophan and Kynurenine by HPLC. Clinical Chemistry, 48:579–581, 2002. [43] P. Presits I. Molnar-Perl. HPLC of Tryptophan and its Metabolites using Simultaneously UV, Native Fluorescence and Pre-Column Fluorescence Derivatzation. Chromatographia, 57:S–87, 2003. [44] Y.V. Tcherkas L.A. Kartsova I.N. Krasnova. Analysis of Amino Acids in Human Serum by Isocratic Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection. Journal of Chromatography A, 913:303, 2001. [45] Rui Wang Aiguo Tang. Simultaneous Determination of Dynurenine and Tryptophan in Serum by High Performance Liquid Chromatography. Chinese Journal of Chromatography, 24:140, 2006. [46] Ardershir Amirkhani Eva Heldin Karin E. Markides Jonas Bergquist. Quantitation of Tryptophan, Kynurenine and Kynurenic acid in Human Plasma by Capillary Liquid Chromatography -Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Journal of Chromatography B, 780:381, 2002. [47] Pi Lan-Gan Tang Ai-Guo Mo Xi-Ming Luo Xi bo Ao Xiang. More Rapid and Sensitive Method for Simultaneous Determination of Tryptophan and Kynurenic Acid by HPLC. Clinical Biochemistry, 42:420, 2009. [48] Alberto dos Santos Pereira Pat Sandra. Reversed Phase Liquid Chromatographic Seperation of 24 Underivatized Amino Acids and Detection by Evaporative Light Scattering and Mass Spectrometry, Pfizter International Report. [49] Ibolya Molnar-Perl. Tryptophan Analysis in Peptides and Proteins, mainly by Liquid Chromatography. Journal of Chromatography, 763:1, 1997. 111

Bibliografie [50] B.E. Leonard V. Neuhoff N.N. Osborne. British Journal of Pharmacology, 49:178, 1973. [51] Min Yang Sterling A. Tomellini. An HPLC detection Scheme for Underivatized Amino Acids based on Tryptophan Fluorescence Recovery. Analytical Chimica Acta, 409:45, 2000.

112

Development of a Fast LC-MS/MS Method to Study Tryptophan-Depletion in Patients Diagnosed with Inflammatory Bowel Disease P.-J. Sabbea, V. Malanchina, F. Lynena , H. Peetersb and P. Sandraa a

Department of Organic Chemistry, Ghent University, Krijgslaan 281, S4-Bis, 9000 Ghent, Belgium b Department of Gastroenterology, Ghent University, De Pintelaan 185, K12, 9000 Ghent, Belgium An accurate method was developed to determine tryptophan (TRP) and kynurenine (KYN) concentrations in human plasma of patients diagnosed with inflammatory bowel disease (IBD). Reversed phase liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) was used to obtain precise quantitative data based on internal standard calibration. By determining the KYN/TRP-ratio, which is representing the activity of Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), a new approach was investigated in an attempt to explain the constant sleepiness and apathy observed in IBD-patients. Deproteinized plasma was separated by gradient elution on a Kinetex C18-column. Detection was performed by mass spectrometry in the multiple reaction monitoring mode (MRM). Calibration curves with excellent linearity, good reproducibility and satisfactory LOD/LOQ-values were obtained for both KYN and TRP. Data of 104 IBD-patients and 45 controls were collected and subjected to chemometrical analysis. Although significant changes in the ratios of both concentrations were measured for both IBD-patients and controls, the proposed explanations for sleepiness of IBD-patients were not convincingly proven. 1. Introduction

Chron’s disease and ulcerated colitis are the most distinct variants of inflammatory bowel disease (IBD). Chronic inflammations on the mucosa of the gastrointestinal tract evolve due to the uncontrollable activity of the intestinal immune system (1) resulting in severe abdominal pain, loss of weight, fever, diarrhea, etc. However, the most common symptoms of Chron’s disease and ulcerated colitis are the continuous sleepiness and listlessness of the patient, even when the disease is in remission. Previous attempts to provide an explanation for this phenomenon remained unsuccessful. In this project a new approach is evaluated where depleted tryptophan (TRP) levels, as a consequence of the upregulation of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), are considered to be a possible cause of sleepiness and apathy observed in IBD-patients. Tryptophan, a precursor of the central neurotransmitter serotonin (5-HT), is metabolized into kynurenine (KYN) in the presence of IDO (Figure 1). Elevated production of the cytokines IFN-γ and TNF-α, due to the unstopped activity of the intestinal immune system in IBD-patients, result in the overexpression of IDO and by this the activation of the kynurenine-pathway (2). Consequently KYN- levels increase, while depleted TRPconcentrations leads to decreased serotonin levels. This decreased levels of 5-HT and

higher concentrations of the KYN and its brain toxic metabolites are believed to be possible causes of the observed sleepiness and apathy in IBD-patients. The objective of this project was to determine the KYN/TRP-ratio in the plasma of 104 IBD-patients and 45 controls. Methods using LC hyphenated with UV- (3), FLD -(4), ELSD -(5) and electrochemical detection (6) have been described. However these approaches cannot compete with the selectivity, sensitivity and robustness of LC-MS/MS for underivatized analytes in complex biological matrices such as plasma, especially for the analysis of large datasets such as were the case in this work (7). The obtained data of both the IBD-patients (104 samples in triplicate) and the control group (45 samples in triplicate) were treated with various statistical tools including the ttest, principal component analysis (PCA) and partial least squares regression (PLS) .

Figure 1. (L)-Tryptophan, precursor of serotonin in healthy persons, is metabolized into (L)-Kynurenine in case of upregulation of IDO. 2. Experimental 2.1 Materials L-tryptophan and DL- kynurenine were purchased from Sigma. L-tryptophan-indoled5 was purchased from Isotec, while heptafluorobutyric acid (HFBA) was obtained from Fluka. Water (LC-MS purity), methanol (MeOH) and acetonitrile (ACN) were purchased from Biosolve. Chromatographic analysis was performed with a Kinetex C18-column (50 x 2.1 mm; p.s. 1.7 µm) purchased from Phenomenex, on the 1200 series of Agilent and the Alliance 2690 of Waters. Detection on the Alliance was performed with an API 2000 mass spectrometer of Applied Biosystems. 104 plasma samples of IBD patients and 45 controls were provided by the Department of Gastroenterology of the UZ Gent and were approved by the independent commission for Medical Ethics. 2.2 Standard and sample preparation Stock solutions of 1000 µg/ml of TRP, KYN and TRP-D5 were prepared in a 50/50 MeOH/H2O mixture and stored in the fridge. Calibration solutions of 0.5, 1, 5, 10, 50 and 100 µg/ml were prepared from this stock solutions for every new batch. Frozen plasma was thawed at room temperature. Each plasma sample was split into three aliquots (each 50 µl) and spiked with 50 µl of a 10 µg/ml solution of the internal standard (TRP-D5) and deproteinized by adding 300 µl of MeOH. The mixture was vortexed at high speed for 3 minutes and centrifuged for 10 min at 12000 RPM. The

supernatant was filtered with PVDF syringe filters (0.45 µm) and transferred to an inlet vial. 5 µl of the sample, stored at 4°C, was injected on the column which was thermostated at 30°C. 2.3 Chromatography A gradient elution method was developed on the Agilent 1200 series and further optimized for the Waters Alliance 2690. The best peak shapes were obtained with ACN/H2O (+ 0.5 % HFBA) as mobile phase. The initial conditions of the gradient elution program where set at 10/90 ACN/H2O (+ 0.5 % HFBA) and kept isocratic for 1 minute. A linear gradient was subsequently applied to 30/70 in 5 minutes, followed by a gradient up to 90/10 in 1 minute. This composition was held for 1 minute before cleaning the column at 100/0 for 3 minutes and re-equilibration for 12 minutes at initial conditions. In order to keep pressure under 400 bar, a flow rate of 0.2 ml/min was applied. A chromatogram of a standard mixture of 10 µg/ml separated with the presented gradient elution method on the Alliance 2690 is shown in Figure 2. 2.4 Mass spectrometry Extra selectivity and low limits of detection provided by the multiple reaction monitoring (MRM) mode, make the MS the most suitable detector to screen KYN and TRP in a complex biological matrix like plasma. Parameters dependent on the analyzed components and electrospray formation were optimized via a ramping procedure. The mass spectrometer was operated in the positive ion mode and dwell time for all molecules was set at 150 ms. The first quadrupole was set to transmit the protonated molecular ions at m/z 205.2 for TRP, 210.2 for TRP-D5 and 209.2 for KYN. The protonated molecular ions were fragmented by collision-induced dissociation in the collision cell. The most abundant fragment ions; m/z 188.2 for TRP; m/z 192.1 for TRP-D5 and m/z 192.1 for KYN were selected for detection.

Figure 2. Chromatogram of a standard mixture of 10 µg/ml of KYN, TRP and TRP-D5 obtained after separation with the developed gradient elution and MRM detection method.

2.5 Quantitatioon An internal staandard (I.S.,, TRP-D5) was used fo for the quanntitative anaalysis to corrrect for posssible lossess of materiaal during vaarious sampple preparaation steps. Calibrationn curves werre constructed ranging from 0.5 to o 100 µg/m ml of each annalyte, for ffurther quanntitation of thhe unknownns. 3. Resu ults and Discussion 3.1 Kynureninee Figuure 3 (left) depicts thee obtained calibration c c curve of KY YN. The reelative peakk area of KYN N for 0.5, 1, 5, 10, 50 and 100 µg/ml are plotted. Goood linearityy and repeaatability werre obtained as reflectedd by a correllation coeffficient of R²² = 0,998 annd RSD%’s (for the corrrected peak area) below w 5% respeectively. Thhe obtained value for L LOD (S/N = 3) was 0.1002 µg/ml while w LOQ (S/N ( = 10) was set at 0.342 µg/m ml. Both LO OD and LO OQ were beloow publisheed KYN-conncentrationss in plasma (± 0,7 µg/m ml). 3.2 Tryptophann Figuure 3 (righht) depicts the obtaineed I.S. corrrected calibbration currve of TRP P. Good lineearity (as represented r by the co orrelation factor f R² = 0,999) allong with a good repeeatability (R RSD ≤ 5%) in the intennded range of TRP (± 10 µg/ml) w were obtainned. The LOD D value waas 0.119 µgg/ml and LO OQ was 0.3396 µg/ml. Both LOD and LOQ are also beloow publisheed concentraations of TR RP in plasm ma (± 10 µg//ml).

Figure 3. I.S. corrrected calibration curvees of KYN (Left) and T TRP (right) TABLE I. Reprresentative TRP T P- and KYN-cooncentrations S Sample KYN (µg/ml)) RSD D (%) P Patient 1 0,822 1,,307 P Patient 94 0,486 4,,732 1,897 C Control 1 9,,904 1,895 C Control 25 100,626

TRP (µg/ml) 10,113 8,321 10,207 17,857

RSD (%)) 5,095 4,788 7,886 10,9577

Rattio 0,081 0,058 0,186 0,106

All samples (149) were subsequently analyzed in series of about 20 – 25 samples. Each series was preceded by reconstruction of the calibration curves and each sample set (consisting of the 3 samples obtained from the three aliquots for each sample) was followed by a blank analysis. This to ensure maximal reliability of the method. 3.3 Data analysis Table I is giving some representative results for TRP- and KYN-concentrations, and the corresponding ratio of both values, for 2 IBD-patients and 2 controls. Figure 4.a is representing the distribution of the average value (of 3 aliquots) of TRP- and KYNconcentration for every sample, while Figure 4.b depicts the ratio-distribution for IBDpatients and controls.

Figure 4. (a) Distribution of IBD-patients and controls for KYN and TRP (left). (b) Distribution of KYN/TRP-ratio for IBD-Patients and controls (right). As seen in Figure 4.a a clear distinction can be made between IBD-patients and controls based on the concentration of both KYN and TRP, better than the distinction made in Figure 4.b based on the KYN/TRP-ratio. As depicted in Figure 4.b, higher ratios (postulated as higher IDO-activity) are observed in controls rather than in IBD-patients. This was not in correspondence with the original assumption. These findings were confirmed after data subjecting the data to a t-test. The KYN- and TRP-concentration as well as the KYN/TRP-ratio appeared to be significantly higher for controls than for IBD patients. The results of the t-test are tabulated in Table II. TABLE II. t-test results for IBD-patient N KYN TRP Ratio

IBD-patient Control IBD-Patient Control IBD-patient Control

104 45 104 45 104 45

Average conc. (µg/ml) 0.894 1.78 9.88 15.2 0.101 0.129

St. Dev. 0.376 0.407 3.19 6.13 0.0564 0.0461

Sig. 4.76 . 10-26 2.16 . 10-20 1.09 . 10-10 1.01 . 10-6 2.32 . 10-3 1.10 . 10-3

For the chemometrical analysis, PCA and PLS, of the data we refer to the thesis.

4. Conclusion In the presented work the objective of developing a method for the analysis of underivatized tryptophan and kynurenine in plasma of IBD-patients and controls based on LC-MS/MS was achieved. The KYN/TRP-ratio was determined in 104 IBD-patients and 45 controls. Although significant distinction between IBD-patients and controls could be made, the hypothesis that sleepiness observed in IBD-patients could be the consequence of tryptophan depletion was not convincingly proven. Acknowledgments Analytical R&D, Pfizer Limited, Sandwich, Kent UK is gratefully acknowledged for providing the Alliance-API2000 LC-MS/MS system. References 1. D.C. Baumgart and S.R. Carding, The Lancet: Gastroenterology, 369, 1627 (2007). 2. A.M. Wolf and D. Wolf, Overexpression of Indoleamine 2,3-dioxygenase in Human Inflammatory Bowel Disease, Clin Immunol, 113, 47 (2004). 3. R.Wang and A.Tang, Chinese J of Chromatogr , 24, 140 (2006) 4. Pi Lan-Gan and Tang Ai-Guo, Clin Biochem, 42, 420 (2009) 5. K. Petritis, Chromatographia, 60, 293 (2004) 6. Y.V. Tcherkas and L.A. Kartsova, J Chromatography A, 913; 303 (2001) 7. E. Gelpi, J Chromatogr A, 703, 59 (1995)