Výroční zpráva o činnosti
Mikrobiologického ústavu Akademie věd České republiky za rok 2005
OBSAH 1. Vědecká činnost pracoviště a uplatnění jejích výsledků..................................................2 2. Vědecká a pedagogická spolupráce pracoviště s vysokými školami .............................. 7 3. Spolupráce pracoviště s dalšími institucemi a s podnikatelskou sférou.........................12 4. Mezinárodní vědecká spolupráce pracoviště................................................................. 13 5. Přílohy........................................................................................................................... 18 6. Tabulky.......................................................................................................................... 24
Zpracoval RNDr. Jiří Gabriel, DrSc. Mikrobiologický ústav AVČR Tel. 296 442 231 (
[email protected])
Praha, 11. ledna 2005
1. Vědecká činnost pracoviště a uplatnění jejích výsledků a) stručná charakteristika vědecké činnosti pracoviště Mikrobiologický ústav AV ČR je jednou z hlavních vědeckých institucí v České republice, která se komplexně zabývá základním výzkumem v oboru mikrobiologie. Hlavní výzkumné oblasti jsou biochemie, fyziologie, molekulární genetika bakterií, kvasinek a vláknitých hub, mikroskopických řas a témata imunologická. V rámci těchto oblastí jsou podrobně studovány otázky produkce biologicky aktivních látek, enzymů, regulační mechanizmy v řízení diferenciace růstu mikroorganizmů, mechanizmy podílející se na přenosu a modifikaci DNA, degradační aktivity mikroorganizmů, fotosyntetický systém, vývojové aspekty imunity, patologie a léčba autoimunitních onemocnění a imunologie onemocnění nádorových. b) několik nejdůležitějších výsledků vědecké činnosti a jejich aplikací Ve spolupráci s firmou Zentiva, a.s. jsou postupně dokončovány preklinické testy tzv. hydrazonových vzorků (nesměrovaný polymerní konjugát s doxorubicinem navázaným na polymerní nosič hydrazonovou vazbou), které jsou nutné pro zahájení regulérních klinických testů. Byla porovnávána cytotoxická aktivita in vitro a protinádorový efekt in vivo. Bylo zjištěno, že optimální obsah kovalentně navázaného doxorubicinu je 8,5-10,9 %. Negativní vliv volného doxorubicinu není prokazatelný až do obsahu 4,6 %. Experimenty zabývající se intracelulární lokalizací potvrdily, že z hydrazonového vzorku je léčivo uvolňováno působením nízkého pH v endosomech a lyzosomech, objevuje se během 90 minut v jádře, kde dochází k jeho interkalaci s jadernou DNA a rychlé a destruktivní apoptóze cílové buňky. (C) Terapeutická účinnost konjugátu Dox-PHPMA-HuIg (polymerní léčivo na bázi N-(2hydroxypropyl)methakrylamidu obsahující jako cytotoxickou složku doxorubicin a jako pasivně směrující molekulu IV lidský imunoglobulin (IV HUIg)) byla porovnávána s konjugátem obsahujícím místo IV HuIg lidský albumin a s polymerním konjugátem bez směrující molekuly. Velmi efektivní je léčba myšího T buněčného lymfomu EL 4, kde lze jednou aplikací vyléčit 100 % myší. Méně účinná je léčba myšího melanomu B16-F10. Nejúčinnější je konjugát obsahující IV HUIg. Winnův test prokázal rozhodující úlohu specifických CD8+ buněk jak při vlastní eradikaci nádoru tak při ustavení následné systémové protinádorové rezistence. (B,C) Byla dokončena analýza proteomu a transkriptomu meningokoka rostoucího v podmínkách limitace železem a byly identifikovány proteiny a geny, které byly v přítomnosti železa významně indukovány nebo reprimovány. Bylo prokázáno, že protein FrpD je lipoproteinem vnější membrány invazivních meningokoků a s vysokou afinitou váže RTX protein FrpC. Samoprocesující modul proteinu FrpC bakterie Neisseria meningitidis byl využit pro purifikaci rekombinantních proteinů. Tento nový systém, který umožňuje purifikaci rekombinantních proteinů v jediném chromatografickém kroku, byl úspěšně testován s několika různými rekombinantními proteiny (adenylátcyklasa, chloramfenikolacetyltransferasa, β-galaktosidasa, protein vázající maltosu nebo glutathion-S-transferasa) a dvěma různými afinitními kotvami (doména vázající chitin nebo polyHis tag). (B,C) Byl izolován a charakterizován shluk genů, nutných pro biosyntézu antibiotika celesticetinu stanovením DNA sekvence dlouhé téměř 30 tisíc párů bazí, kódující 27 proteinů. Osmnáct z nich má své homologní protějšky v biosyntéze strukturně příbuzného antibiotika linkomycinu, pět je specifických pouze pro biosyntézu celesticetinu (biosyntéza salicylátové jednotky) a jeden gen kóduje rezistenci vůči produkovanému antibiotiku. V posledních letech nacházejí deriváty tohoto antibiotika stále širší uplatnění v humánní medicíně nejen pro své účinky antibakterální, ale i jako antimalarika. (B) Ve spolupráci s ÚMCH AVČR a ÚACH AVČR byly připraveny a charakterizovány heterogenní katalyzátory na bázi ferritů a hydroxylapatitu s obsahem mědi, kobaltu a manganu. Tyto katalyzátory byly úspěšně využity pro katalýzu oxidace syntetických textilních barviv a polycyklických aromatických uhlovodíků. Jejich výhodou je vysoká chemická stabilita a snadná technologická aplikace při čištění odpadních vod z průmyslu (zejména textilního). (B,C)
2
U producentů antibiotik streptomycet byl prokázán významný vliv inaktivace genu kódujicího polyfosfátkinasu, která je zodpovědná za tvorbu energeticky bohatých zásobních molekul, na produkci enzymů podílejících se na metabolismu cukrů a aminokyselin a na některé komponenty translačního systému (EF-Tu a recyklační faktor ribosomů). Tato mutace vede k výraznému zvýšení produkce antibiotik. (B,C) Byla provedena detailní elektronmikroskopická analýza kontraktilních, fágovým bičíkům podobných bakteriocinů ze tří kmenů Pragia fontium a jednoho kmene Budvicia aquatica. HMW baktriociny byly pojmenovány aquaticin a fonticin. Všechny analyzované bakteriociny byly resistentní k působení vysoké teploty, nicméně byly vysoce citlivé na působení trypsinu. U kmene P. fontium 64613 byl poprvé popsána simultánní produkce kontraktilního i flexibilního typu HMW bakteriocinu. (B) Pomocí DNA čipů byl prokázán vliv signalizačního proteinu StkP lidského patogenu Streptococcus pneumoniae na expresi proteinů účastnících se základních buněčných funkcí této bakterie. Dále bylo zjištěno, že obdobný unikátní protein PpkA jiného lidského patogenu Pseudomonas aeruginosa má významný vliv na jeho patogenitu. Studium signálních drah, kterých se tyto proteiny účastní, by mohlo přinést poznatky využitelné pro návrh nových antibakteriálních látek. (C) Byl charakterizován úplný soubor genů pro degradaci fenolu u bakterie Rhodococcus erythropolis včetně určení sekvence nukleotidů. Poznání struktury a funkce těchto genů je předpokladem pro genové manipulace u této bakterie s cílem zvýšit její schopnosti degradovat škodlivé aromatické látky v životním prostředí. (B,C) Mutagenezí tří konzervovaných aminokyselinových zbytků (D151, E165 a K167) v endonukleasovém motivu podjednotky HsdR restrikčního enzymu EcoR124I byl připraven biologický motor neschopný štěpit DNA, který je potenciálně využitelný v bionanotechnologiích. Translokační aktivita mutantních enzymů (550 párů bazí/sec), stanovená jak pomocí stopped flow spektrometru, tak prostřednictvím magnetické pinzety, odpovídá standardnímu enzymu. (B) Pomocí nejmodernějších molekulárně-biologických metod intragenového značení, deleční analýzy a fyzikálně-chemických technik byly studovány mechanismy funkce strukturních interakcí v dopravování, umísťování a obměně proteinů kvasinky Saccharomyces cerevisiae za normálních podmínek i za podmínek teplotního či osmotického stresu. Bylo zjištěno, že delece genu ISW2 vede u S. cerevisiae ke zvýšené expresi genů indukovaných feromonem. Mezi geny se zvýšenou expresí byly nalezeny též geny kódující proteiny mající vztah k syntéze a složení buněčné stěny. Bylo prokázáno, že po teplotním stresu kolokalizují podjednotky translačního iniciačního komplexu eIF3 ve fluoreskujících granulích především v okolí buněčného jádra a v kortexu stresované buňky. Jedná se zřejmě o translační stresové granule, které jsou známy především u vyšších eukaryotických buněk, ale dosud nebyly pozorovány u S. cerevisae. Bylo zjištěno, že interakce komplexu eIF3a/Rpg1p s jedním z hlavních proteinů endocytické dráhy, proteinem Sla2, je zřejmě zodpovědná za rozpouštění stresových granulí. (B) Byly vyvinuty metody extrakce znalostí dat z proteomických a transkriptomických experimentů. Základem byly tři přístupy – první založený na principech modelování genetických sítí, druhý na principech evolučního programování, třetí na statistické analýze dat. Je průběžně aktualizován server SWICZ, který v současné době registruje více než 600 000 přístupů k jednotlivým stránkám a patří k vyhledávanému zdroji proteomických dat. (B) Podrobné studium mangan-dependentní peroxidasové (MnP) aktivity houby Irpex lacteus, která se podílí na biodegradaci xenobiotik ukázalo, že aktivita je indukována limitací N a dostupností O2 a rovněž závisí na koncentraci Mn2+. Mikroorganismus je schopen syntetizovat tři izoformy enzymu, což jsou glykoproteiny s vysokým stupněm homologie s peroxidasami ostatních hub bílé hniloby. Při studiu degradace polyaromatických uhlovodíků bylo zjištěno, že enzym je schopen štěpit aromatický kruh. Studie rozkladu benz[a]antracenu vedla k identifikaci 10 nových biodegradačních produktů. (B,C) Byla studována genotoxicita azo- a antrachinonových barviv, přítomných v odpadních vodách z textilního průmyslu. Jak bylo zjištěno, barvivo Disperse Blue 3 bylo nejtoxičtější z hlediska biologického působení a vykazovalo mutagenní účinek po metabolické aktivaci in vitro se všemi použitými kmeny (Salmonella typhimurium, Vibrio fischeri, Selenastrum capricornutum) (B)
3
Bylo zjištěno, že gamma tubulin se účastní nukleace mikrotubulů mimo centrosom. Jedná se o nukleaci z disperzních center, která jsou lokalizována na mikrotubulech samotných a na dalších místech, zřejmě asociovaných s membránami. Podařilo sa nám izolovat a identifikovat některé proteiny, interagující s gamma-tubulinem. Geny pro dva z těchto dosud necharakterizovaných proteinů byly již klonovány. (B) Byl prokázán vliv zvýšené koncentrace atmosférického CO2 (60 Pa) na složení společenstva půdních mikroskopických hub v polních podmínkách. Souhrnná početnost (CFU) těchto mikroorganismů závisela na koncentraci atmosférického CO2, ale tato závislost měla odlišný charakter podle toho, zda bylo aplikováno minerální dusíkaté hnojení či nikoliv. Tento výsledek potvrzuje význam dostupného N pro akumulaci organického uhlíku v půdě, neboť sledované skupiny půdních mikroskopických hub se účastní rozkladu odolných forem půdní organické hmoty a změny ve složení jejich společenstva tudíž mohou rozklad ovlivnit. (B) Při studiu enzymových aktivit dřevokazných basidiomycetů byla kompletována analýza reakčních produktů pyranosadehydrogenasy (nově přiděleno EC 1.1.99.29) s redukujícími mono- a oligosacharidy metodami přímé NMR spektroskopie. Některé z těchto produktů byly poprvé připraveny užitím biotransformačních postupů (např. 2-dehydro-L-arabinosa) či jsou popsány jako nové cukerné deriváty. (B) Z kmene Nostoc sp. SV byl izolován nový inhibitor acetylcholinestrasy. Chemická struktura byla určena pomocí instrumentálních technik (HPLC/MS/MS, UV-VIS, IR, NMR). Molekulová hmotnost a sumární vzorec aktivní látky je 798, resp. C50H38O10. (B,C) Byly izolovány geny řasy Chlamydomonas reinhardtii, kódující cyklin dependentní kinasy (CDKA a CDKB), které jsou zodpovědné za regulaci buněčného cyklu. Těmito geny byly komplementovány teplotně-citlivé mutanty kvasinky Saccharomyces cerevisiae, které mají poškozený gen pro cyklin dependentní kinasu (CDC28) a nejsou schopné se dělit při vysoké teplotě. Výsledky sekvenční analýzy a komplementačního testu potvrdily, že CDKA i CDKB jsou funkčními homology kvasinkového proteinu Cdc28. (B) Byla vyvinuta původní metoda kryoprezervace použitelná pro dlouhodobé uchovávání taxonomicky širokého spektra kultur hub (makromycetů, mikromycetů a kvasinek), která může sloužit jako obecná metoda ve sbírkách, popř. provozech. (B) U řasy Scenedesmus quadricauda bylo při zablokovaném dělení jader (inhibitor fluorodeoxyuridin) studováno dělení chloroplastů. Bylo zjištěno, že oproti dělení jader není rozdělení chloroplastů závislé na poklesu aktivity cyklin-dependentní kinasy. Protein FtsZ, který při dělení chloroplastů u jiných organismů vytváří dělicí prstenec, byl lokalizován v mnoha menších kroužcích a v růstové fázi byl akumulovaný kolem pyrenoidu. (B) Ve spolupráci s Ústavem pro péči o matku a dítě byla sledována přítomnost cytokinů a sCD14 v kolostru a mateřském mléce. Screenig cytokinů byl proveden pomocí techniky protein microarray, která umožňuje detegovat široké spektrum cytokinů. Ve 22 vzorcích kolostra byla zjištěna přítomnost řady dosud nepopsaných cytokinů – růstových faktorů a chemokinů. (B) Při studiu vlivu různých nepatogenních bakterií na vývoj kolitidy u imunodeficitních myší u dextransulfátového modelu střevního zánětu bylo zjištěno, že ochranný účinek bakterií působících proti zánětu je rovněž závislý na způsobu podávání těchto bakterií. Zjistili jsme, že bakterie E. coli Nissle 1917 a Clostridium tyrobutyricum výrazně zmírňuje experimentálně vyvolaný zánět, pokud jsou podány intrarektálně. Tyto výsledky byly potvrzeny sníženou hladinou prozánětlivého cytokinu TNF-α ve střevě a změněným složením spektra krátkořetězcových nasycených mastných kyselin. (B) Bylo popsáno 12 subpopulací γδ thymocytů prasat na základě jejich exprese CD1, CD2, CD4, CD8 isoforem a CD45RC. Výsledky ukázaly, že γδ thymocyty mohou být rozděleny do dvou hlavních skupin. První velkou skupinu tvoří rodina CD4- γδ thymocytů, které mohou být dále děleny na další podskupiny na základě CD2/CD4αα fenotypu. Druhá, menší skupina, je tvořena CD4+ γδ thymocyty nesoucími CD8 αβ fenotyp a má, v porovnání s ostatními γδ thymocyty, neobvyklé charakteristiky. (B) Na základě našich zjištění můžeme konstatovat, že za primární cílovou populaci imunitních buněk ovlivněnou glykokonjugáty s terminálními N-acetyl-β-D-glukosaminy lze považovat regulační NKT lymfocyty, které následně spouští kaskádu dějů vedoucích k diferenciaci NK buněk, jejich migraci do nádorového mikroprostředí a následnou stimulaci výkonné funkce. Glykokonjugáty
4
aktivované NKT lymfocyty rovněž zvyšují B buněčnou tvorbu protilátek v součinnosti s Tzávislými i T-nezávislými antigeny (KLH, DNP-E. coli). U nádorových myší navíc dochází k produkci IgM specifických proti autologním melanomovým buňkám B16F10. Pokusy na NKRP1+ buněčných liniích, NKR-P1 depletovaných populacích stejně jako NKR-P1 deficientních myších prokázaly zapojení tohoto antigenu do aktivačního procesu. (B) Rovněž bylo potvrzeno, že glykokonjugáty vazbou na NKR-P1 antigen aktivují Gq-proteinovou signalizační dráhu. Lektinový receptor NKR-P1 po specifické vazbě GlcNAc8 nespouští aktivaci buněk zprostředkovanou tyrosinkinasami, je však zapojen v signalizaci lymfocytů navozené současně funkcí receptoru CD16. V takovém případě je imunitní odpověď potencována GlcNAc8 dendrimery a lze detekovat účast některých členů rodiny Src a Syk tyrosinkinas. Vedle kompetitivního účinku glykodendrimeru na aktivaci lymfocytů in vitro byla zjištěna také účast koreceptoru NKG2D. (B) Byl popsán zvláštní mechanismus vzniku a vývoje parasitoforní vakuoly jako výsledek experimentální interakce mezi invazním stadiem parasita (Mattesia dispora) a obrannou odpovědí hostitelského hmyzu Galleria mellonella. Elektronová mikroskopie spolu s rtg-mikroanalýzou poskytla zcela unikátní pohled na vývoj parasitoforní vakuoly při obraně neadekvátního hostitele proti extrémně invaznímu parasitu v experimentálních podmínkách. (B,C) Studium molekulárních motorů. Byla studována orientace S1 podjednotky myosinu (část vázající aktin, tzv. 'páka') v akto-myosinovém molekulárním motoru. Experimenty byly provedeny přímo v živých myocytech (časové rozlišení < 0.1 ms, rozlišení v periodicitě cca 1 µ) pomocí rentgenstrukturní analýzy za použití synchrotronového záření. Výsledky ukazují, že S1 podjednotka se podílí i na té fázi cyklu molekulárního motoru, při které je vazba aktin-myosin jen slabá. Elastickými vlastnostmi disponuje nejen S1 podjednotka samotná, ale i zbývající část myosinové molekuly. (B) c) nejvýznamnější popularizační aktivity pracoviště Den otevřených dveří v MBÚ AV ČR se konal dne 9. listopadu 2005. Zúčastnilo se ho přes 130 návštěvníků, zejména z řad středoškoláků. Pro střední školy také ústav zorganizoval několik exkursí v průběhu školního roku. V rámci projektu Otevřená věda ústav zorganizoval v říjnu ve spolupráci s Československou společností mikrobiologickou přednáškový den „Pokroky v mikrobiologii“, kterého se zúčastnilo 75 středoškoláků včetně mimopražských. Čtyři z nich dále pracují na projektech v laboratořích MBÚ. Prof. B. Říhová přednášela na kurzu Biologie v Nových Hradech v srpnu 2005 a přispěla kapitolou „Protinádorová imunita a nové přístupy při léčení nádorových onemocnění“ do vydaného sborníku. V dubnu se uskutečnil celoevropský Den imunologie, v rámci jehož proběhlo přednáškové odpoledne pro všechny zájemce o pokroky v imunologii z řad vědecké i laické veřejnosti. Pracovníci ústavu se podíleli na organizaci soustředění výherců Chemických olympiád v Běstvině. Jako každý rok, řada pracovníků ústavu vystoupila v televizních či rozhlasových pořadech a přispěla do denního či populárního tisku mnoha příspěvky. Ústav zahájil spolupráci s rozhlasovou stanicí Leonardo několika příspěvky (B. Říhová, T. Mrkvan, P. Baldrian, M. Gryndler, T. Hubálek). Příklady příspěvků jsou uvedeny níže: Příspěvky do denního tisku Říhová B., MF Dnes „Změní se postoj Čechů k chudým zemím?“ 10. 1. 2005 Říhová B., MF Dnes „Vládli byste z milosti KSČM?“ 1. 4. 2005 Říhová B., Právo „Český lék na rakovinu čekají klinické zkoušky“, 12. 5. 2005 Říhová B., MF Dnes „Češi našli unikátní lék proti rakovině“, 12. 5. 2005 Říhová B., MF Dnes „Čeští géniové budou lákat cizí investory“, 17. 5. 2005 Říhová B., MF Magazín DNES „Co právě dělám“, 21. 3. 2005 (26. 5. 2005) Říhová B., MF Magazín DNES 24, 20 – 24, 2005 (9. 6. 2005) Tlaskalová H., Lidové noviny Den imunologie – článek „Na buňku může zaútočit mouka", (30.4.2005)
5
Tlaskalová H., „Letošní nositelé Nobelovy ceny" (redakce Lidových novin, ČTK, Radiožurnál) Tlaskalová H., účast při přípravě článku MF Dnes „Z batohu mezi vědeckou elitu", (16.12.05) Příspěvky do rozhlasového a televizního vysílání Říhová B., ČT 2 „Ta naše povaha česká“, 7. 2. 2005 pořad o vědě a ústavu jako takovém Říhová B., ČT 1 „Sama doma“ 9. 2. 2005, pořad o prof. B. Říhové Tupá B. a kolektiv: Vlastní pokoj: 10 pohledů, Národní a kontaktní centrum-ženy a věda; Sociologický ústav AV ČR 2005 Říhová B., ČT 1, seriál České hlavy „ Česká věda: Lék na rakovinu“, 10. 5. 2005 Říhová B., „Studio 2010 – Cesta k lékům“ stanice Praha, partner prof. Václav Pačes, redaktor Stanislav Kužel, 6. 6. 2005 Říhová B., BBC Radiocom (Praha), s.r.o.“ Interview BBC-rozhovor s Václavem Moravcem“, 30.6.2005, také vysílá televizní kanál ČT 24 Říhová B., Radiožurnál „Rozhovor o podpoře vědy“ partnerka Anna Čurdová, sociální demokracie; redaktorka B. Kroužková, 1. 7. 2005 Říhová B., ČT 1: Otázky Václava Moravce, 7. 8. 2005 Říhová B., ČR1: Meteor-Medailonek o Milanovi Haškovi, 1. 10. 2005 Říhová B., Cesty labyrintem: proč je stále tak málo žen ve vědě. Konference v Poslanecké sněmovně Parlamentu České republiky, 10.10.2005. Panelová diskuze na téma harmonizace vědecké kariéry a rodiny Říhová B., Rozhovor pro 6. rámcový program, Project No. SAS6-CT2004-003582 v rámci projektu „Central European Centre for Women and Youth in Science“, říjen 2005 Cajthaml T., ČT 1 dne 6. 4. 2005, České hlavy – Houby čistí zamořenou půdu. Zachleder V., pořad ČT České hlavy dne 27. května 2005, „Řasy proti globálnímu oteplování“ Pažoutová S., pořad České hlavy na ČT2, Námel pod drobnohledem, 9. 9. 2005 Havlíček V., Popularis ČT2, únor 2005, „Na stopě houbové invaze“ Šíma P.: Imunita, pitné programy a výživa. Český rozhlas 2, 30.9.2005 Šíma P.: Prevence infekčních chorob a skladba výživy. Český rozhlas 2, 2.11.2005 Šíma P.: Prevence virových onemocnění. Český rozhlas 2, 16.11.2005 Tlaskalová H., „Střevní mikroflora a střevní záněty" a „Celiakie" (Český rozhlas Radiožurnál) Tlaskalová H.,“Náš život s mikroby“ (Český rozhlas 2 – Meteor) Práce v popularizačních časopisech Kolařík M. (2005) O houbách na kůrovcích a jejich studiu v terénu. Bulletin Československé mikrobiologické společnosti 46: 109-114 Šplíchal I.: Základy gnotobiologie –Bulletin ČSSM, čís. 4/2005. Kovářová H., Trebichavský I., Bezouška K.: Odkud a kam míří proteomika, Živa, č. 1, 2005. Šíma P.: Co je imunita. Liga proti rakovině 16 (1), 10-13, 2005 Trebichavský I., Šíma, P.: Nitrobuněčné rozpoznávání bakterií. Vesmír 84 (9), 541-542, 2005 Šíma P.: Opět výživa pro 21. století. Živa 5, LXVI, 2005 Šíma P.: Imunita a výživa. Profit 52, 2005 Přednášky, semináře Prell A., Seminář: Podnikání a výzkum v biotechnologiích, hotel ADALBERT, Břevnovský klášter, Markétská 1, Praha 6, 06.12. 2005, Praha Tlaskalová H., spoluorganizace semináře „Současný stav v oblasti celiakie a bezlepkové diety z pohledu lékařů, chemiků-analytiků, výrobců potravin a pacientů", 19.10.05 MBÚ AV ČR Tlaskalová H., organizace minisymposia na oslavu 80.narozenin prof. Šterzla, 13.5.05, MBÚ AV ČR Tlaskalová H., organizace pracovní schůze ČSAKI na oslavu 85. narozenin prof. Johna, 8.9.05, Lékařský dům Šíma P.: Imunita a výživa. Přednáška pro středoškolské studenty v rámci Programu Nebojte se vědy, AV ČR, Praha, 13. 12. 2005
6
Šíma P.: Suplementace nápojů pro pitné programy. Tiskové konference – Adria, Praha, 14.11.2005 d) domácí a zahraniční ocenění zaměstnanců pracoviště (řády, medaile, ceny, čestné doktoráty apod.) Medaile Senátu Parlamentu České republiky (B. Říhová) Česká hlava, Cena Invence za Polymerní léčiva s cytostatickými a imunomodulačními účinky (B. Říhová, K. Ulbrich) Medaile za zásluhy udělená Přírodovědeckou fakultou UK (B. Říhová) Cena Spolku Karolinum za práci v oblasti životního prostředí s názvem: „Application of supercritical fluid extraction (SFE) to predict bioremediation efficacy of long-term composting of PAHcontaminated soil“. (T. Cajthaml) Wichterlova Cena (P. Halada, P. Novák) Titul: „Rytíř řádu akademických zásluh (palem)“ (P. Šebo) Cena AV ČR za zvláště úspěšné řešení programových a grantových projektů udělena Akademickou Radou AV ČR autorskému týmu ve složení: Peter Šebo – vedoucí týmu, Radim Osička, Jiří Mašín, Marek Basler, Jana Vodolánová za vědecký výsledek Studium mechanismu průniku adenylát-cyklasového toxinu přes biologické membrány Stipendium FEMS pro účast na 13th International Biodeterioration & Biodegradation Symposium, Madrid, Španělsko, 2005 (K. Svobodová). Stipendium FEMS pro 3-měsíční stáž na University of Leeds, Anglie (A. Jirásková). Stipendium IUMS pro účast na kongresu IUMS v San Franciscu (K. Procházková). Cena České imunologické společnosti (sponzorováno společností BIOMEDICA) – ocenění za práci „Gliadin stimulates human monocytes to production of IL-8 and TNF-alpha through a mechanism involving NF-kappaB“ (FEBS Lett. 571: 81-85, 2004) (L. Palová-Jelínková).
e) další specifické informace o pracovišti, změnách v jeho struktuře a vědecké orientaci, o výsledcích atestací a o překážkách a problémech v činnosti pracoviště atd. V roce 2005 vznikly rozdělením stávající Laboratoře Fysiologie a genetiky aktinomycetů (J. Spížek) tři nové laboratoře: Laboratoř biologie sekundárního metabolismu, Laboratoř molekulární biologie aktinomycet a Středisko sekvenování DNA. Dále byly v roce 2005 zprovozněny nové Internetové stránky Mikrobiologického ústavu na adrese http://www.biomed.cas.cz/mbu.
2. Vědecká a pedagogická spolupráce pracoviště s vysokými školami a) nejvýznamnější vědecké výsledky pracoviště vzniklé ve spolupráci s vysokými školami Bylo prokázáno, že specificky lokalizovaná regulovaná buněčná smrt je důležitá pro dlouhodobý vývoj kvasinkových kolonií. Amoniak, sloužící jako signál vysílaný stárnoucími koloniemi kvasinek, spouští metabolické změny, které lokalizují tuto programovanou buněčnou smrt pouze do středu kolonie. Ostatní buňky kolonie využívají komponenty uvolněné z mrtvých buněk jako zdroje výživy. Nepřítomnost metacaspasy Mca1p nebo proteinu Aif1p (homolog savčího faktoru indukujícího apoptosu) nezabrání regulované buněčné smrti uvnitř kvasinkových kolonií (spolupráce s Lab. biologie kvasinkových kolonií, Přírodovědecká fakulta UK, Praha). (B) Mezi devadesáti osmi kmeny koagulasa negativních stafylokoků izolovaných z českých nemocnic (rezistentních k methicilinu a navíc k makrolidům či linkosamidům) byla ve spolupráci s 3. LF UK zjištěna neobvykle vysoká frekvence genů udílejících rezistenci pouze k jednotlivým členům obvykle rezistenčně propojené skupiny antibiotik MLSB (makrolidy-linkosamidy-streptograminy B) U deseti klonálně příbuzných kmenů Staphylococcus haemolyticus byl nalezen zcela nový LC fenotyp (rezistence k linkomycinu a klindamycinu, avšak citlivost k makrolidům), který naznačuje přítomnost u stafylokoků zcela nové genetické determinanty. U všech kmenů této skupiny byl
7
identifikován a sekvenován nový gen vysoce podobný rezistenčnímu genu vgaA popsanému u stafylokoků. České izoláty s genem nazvaným vgaALC jsou vysoce rezistentní vůči oběma skupinám strukturně odlišných antibiotik. (B) Bylo zjištěno, že aktivita transportérů mnohočetné lékové resistence (MDR) u kvasinek silně závisí nejen na růstové fázi buněk, typu zdroje uhlíku a na hyperexpresi kódujících genů, ale je silně ovlivněna složením kultivačního média v pozdějších fázích růstu. Byl vypracován kombinovaný fluorimetrický/zónový test, pomocí nějž lze stanovit, zda cizorodá látka je substrátem MDR pump, kompetuje s dalšími látkami o transport nebo je skutečným inhibitorem (spolupráce s MFF UK Praha). (B) Ve spolupráci s PřF UK, 1. a 3. LF UK a s Univerzitou obrany v Hradci Králové bylo zjištěno, že syntetické molekuly penta- a hepta-peptidovů odvozených od mykobakteriálního HSP65 (GroEL) podobně jako rekombinantní GroES (Francisella tularensis) aktivují především populaci monocytů/makrofágů, u nichž zvyšují zastoupení MHC II atigenů nezbytných pro prezentaci a indukují dozrávání dendritických buněk (CD80, CD86). Na rozdíl od mikrobiálních HSP, nádorové HSP 72 produkované transformovanými buňkami v době zvýšeného rozpadu (apoptóza, nekróza) např. vlivem hypertermické terapie aktivují především NKT buňky, které ve zvýšené míře exprimují CD69 antigen a následně aktivují další subpopulace lymfocytů (NK, T, B). (B) Ve spolupráci s Lékařskou fakultou UK v Plzni pokračoval výzkum významu mutací genu pro leukemický inhibiční faktor při idiopatické infertilitě. Potenciálně funkční mutace tohoto genu byla identifikována u šesti žen z celkové populace 176 neplodných žen. Kontrolní populace zahrnovala 75 zdravých plodných žen. Výsledky ukazují, že mutace genu LIF mají vliv na fertilitu. (B) Celiakie, chronické zánětlivé onemocnění, charakterizované jako trvalá nesnášenlivost pšeničného lepku (glutenu) a příbuzných prolaminů, vzniká u geneticky vnímavých jedinců nesoucích HLAHLA-DQ2 antigeny. Ve spolupráci s 2. lékařskou fakultou UK jsme zjistili, že gliadin (monomerní frakce glutenu) a jeho peptické fragmenty, na rozdíl od stejně opracovaných bílkovin sóji a ovalbuminu stimulují funkční a fenotypové vyzrávání lidských dendritických buněk (DC), připravených kultivací krevních monocytů. Stimulace nezralých DC peptickými fragmenty gliadinu vyvolala zvýšenou expresi HLA-DR antigenů, kostimulačních molekul CD80 a CD86 a aktivačních znaků CD83 a zvýšenou produkci chemokinů a cytokinů jako jsou IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α. Současně byla maturace DC provázena snížením endocytární aktivity a zvýšením schopnosti stimulovat proliferaci allogenních T buněk. Dále jsme ukázali, že působení gliadinu vyvolává fosforylaci tří členů rodiny MAPK: ERK1/2, JNK a p38. Významné je především zapojení MAPK p38, protože její inhibitor SB203580 spolu s gliadinem , výrazně snižoval jak expresi maturačních znaků tak produkci cytokinů. Kultivace DC s gliadinovými peptidy také zvyšovala DNA vazebnou kapacitu NF-κB podjednotek p50 a p65. Můžeme shrnout, že gliadinové peptidy mohou svým působením překonávat neodpovídavost nezralých DC, stimulovat jejich fenotypové a funkční vyzrávání a vést k účinnější prezentaci gliadinových peptidů a zvýšení imunitní odpovědi specifických T lymfocytů centrálních buněk při vzniku a vývoje celiakie. (B) Podařilo se dokončit optimalizaci protokolů pro rekombinantní expresi rozpustných forem receptorů CD69 a NKR-P1A a B. Získané preparáty o kocentraci až 20 mg/ml se staly základem krystalizačních experimentů, měření dvojrozměrných NMR spekter a jiných typů měření s využitím spektroskopických a hmotnostně spektrometrických technik (UV spektroskopie, FT-IR a Ramanova spektroskopie, hmotnostní spektrometrie). Z CD69 proteinu bylo připraveno velké množství krystalů difrakční kvality, a byly úplně rozřešeny čtyři proteinové struktury, z toho jedna na úrovni rozlišení 1.8 Å. Strukturní studie umožnily identifikovat vazebná místa pro vápník a sacharidové ligandy. Z biologických aktivit CD69 stojí za zmínku schopnost některých ligandů tohoto receptoru chránit přirozené zabíječské buňky před nádorově vyvolanou apoptosou. Veškeré výsledky byly získány v těsné spolupráci s katedrou biochemie PřFUK, a to v rámci společné laboratoře nazvané „Centrum molekulárních interakcí a biotransformací léčiv“. Ve spolupráci s VŠCHT byla u nově syntetizovaných aromaticko-alifatických kopolymerů sledována jejich biodegradovatelnost pomocí hub a kompostování. Z nově zkoušených lignikolních hub byla u druhu Inonotus hispidus zjištěna mimořádná biodegradační účinnost, a to bez ohledu na poměr jednotlivých komponentů kopolymeru. Kompostování ukázalo, že biodegradace syntetických polymerů pokračuje i ve fázi maturace kompostu, což má často za následek výraznou destrukci polymerního materiálu. (C)
8
Dřevokazní kůrovci žijí často v mutualistickém vztahu s ambrosiovými houbami a jsou intenzivně studováni jak z hlediska fytopatologického tak mykologického. V roce 2005 byla ve spolupráci s entomology z Texaské státní univerzity a pracovníky Přírodovědecké fakulty UK v Praze analyzována mykoflóra nově objeveného kůrovce Scolytodes sp. z Kostariky. Pomocí morfologické a molekulárně genetické analýzy byly objeveny dva nové druhy hub rodu Gondwanomyces, jejichž asociace s hmyzem byla zcela neznámá. Další houby této mykoflory, které vykazují znaky ambrosiových hub představují dokonce jeden rod nový pro vědu a jeden nový druh rodu Ambrosiella. U jedné z těchto hub byla zjištěna výrazná akumulace živin v kapkách exudátu na konci hyf, což v rámci říše hub představuje dosud neznámý způsob poskytování živin hmyzímu přenašeči. (B) Dřevokazné larvy pilořitek rodu Xiphydria žijí v symbióze s xylariálními houbami, které samičky uchovávají ve speciálních orgánech a inokulují společně s vajíčky do dřeva, nejčastěji u dubů. Ve spolupráci s fakultou lesnickou a environmentální ČZU v Praze bylo zjištěno, že některé izoláty byly blízké nebo identické s druhem Entonaema cinnabarina, který je pokládán za tropický a subtropický druh a ve střední Evropě nebyl dosud popsán. (C) Sinice Prochlorothrix hollandica je jedna ze tří známých zástupců zvláštní skupiny sinic, které obsahují molekuly chlorofylu a a b, navázané v membránových světlosběrných anténních komplexech. Elektronovou mikroskopií a analýzou obrazu jednotlivých částic byla ve spolupráci s Ústavem fyzikální biologie JčU a ÚMBR AVČR popsána struktura doposud neznámých supramolekulárních komplexů, které se skládají z trimeru komplexu fotosystému I a osmnácti anténních proteinů. Vytvoření kruhu anténních proteinů okolo trimeru PSI patrně zvyšuje účinnost zachycení světla u sinic, které obsahují chlorofyl b. (B) Chlorofyl a hem patří mezi nejdůležitější kofaktory proteinů energetického metabolismu. Obě strukturně příbuzné molekuly mají společnou biosyntetickou dráhu, a to až do místa, kdy je vytvořen prázdný tetrapyrolový kruh – protoporfyrin IX. Ten je substrátem pro dvě odlišné chelatasy; ferochelatasa (FeCH) vkládá železo za vzniku hemu, Mg-chelatasa hořčík za vzniku prekurzoru chlorofylu. Jak bylo zjištěno, akumulace chlorofylu u řas souvisí s aktivitou ferochelatasy. Regulační role FeCH patrně souvisí s její koncovou doménou, která se vyskytuje pouze u fotosyntetických organismů a obsahuje motiv pro vazbu chlorofylu. Ve spolupráci s Ústavem fyzikální biologie JčU bylo zjištěno, že mutace v této doméně vedla k omezené schopnosti regulovat aktivitu FeCH v závislosti na syntéze chlorofylu. (B) Počátkem roku 2005 byla dokončena sekvenace genomu našeho isolátu fotoheterotrofní baktérie Erythrobacter sp. NAP1. Sekvenační projekt byl financován americkou Mooreovou nadací, vlastní sekvenování provedl Ventrův Institut metodou shotgun. Na jeho další charakterizaci se podílí Parazitologický ústavu AVČR v Českých Budějovicích. (B) b) nejvýznamnější výsledky činnosti výzkumných center a dalších společných pracovišť ústavu AV s vysokými školami 1M0505 Centrum cílených terapeutik Proléčiva na bázi HPMA s doxorubicinem uvolňovaným vlivem změny pH prostředí patří mezi velmi slibná chemoterapeutika nové generace. Bylo prokázáno, že léčba těmito konjugáty je u experimentálních myších solidních nádorů EL4 a 38C13 vysoce účinná a že se v průběhu terapie ustavuje rezistence vůči původnímu nádoru, která je schopná léčeného jednice uchránit před rozvojem onemocnění při opakovaném podání letální dávky nádorových buněk. Byly provedeny experimenty dokazující, že se tato rezistence ustavuje velmi časně po započetí léčby a je pravděpodobné, že se jedná o jeden z mechanizmů podílejících se, spolu s přímým cytotoxickým působením léčiva, na eradikaci nádoru. Struktura molekuly proléčiva na bázi HPMA s doxorubicinem uvolňovaným vlivem změny pH prostředí může být připravena v řadě modifikací, lišících se např. velikostí molekuly nebo obsahem léčiva v konjugátu. Byla připravena proléčiva s různým obsahem doxorubicinu a ukázalo se, že proléčiva obsahující ve své molekule větší podíl léčiva jsou v in vivo modelu nádorového onemocnění terapeuticky účinnější. Podobně byla studována terapeutická účinnost proléčiva
9
lišících se molekulovou hmotností. Domníváme se, že proléčiva s vyšší molekulovou hmotností by se mohla výrazněji akumulovat v nádoru díky tzv. EPR efektu (Enhanced Permeation and Retention effect), což by mělo vést k lepšímu léčebnému účinku. Ukázalo se však, že tato léčiva zároveň vykazují v námi použitém terapeutickém schématu vyšší toxicitu vůči nenádorovým tkáním, a proto probíhají pokusy, jejichž cílem je nalezení optimálního terapeutického schématu pro tyto nové typy konjugátů. Mitogenem aktivované protein kinasové (MAPK) signalizační dráhy regulují nejrůznější buněčné děje jako například růst, proliferaci, diferenciaci nebo buněčnou smrt. U savců se vyskytují tři hlavní MAPK signalizační dráhy – JNK, p38 a ERK. Signály přenášené těmito dráhami se podílí i na zprostředkování buněčné smrti nádorových buněk způsobené chemoterapeutiky. V našich pokusech jsme porovnali vliv volného doxorubicinu a konjugátů obsahujících doxorubicin navázaný na HPMA nosič pomocí enzymaticky nebo hydrolyticky degradovatelné vazby na MAPK signalizační dráhy. Pomocí specifických inhibitorů těchto drah jsme zjistili, že MAPK dráhy kontrolující proliferaci a smrt buněk se liší v závislosti na použitém léčivu. V našich podmínkách měla největší vliv na proliferaci a smrt buněk dráha JNK a to zejména u buněk inkubovaných s volným doxorubicinem. Pokusy detekující aktivaci těchto drah navíc ukazují, že buněčná proliferace a smrt nejsou zdaleka jedinými ději, které tyto dráhy kontrolují. Výsledky potvrzují, že intracelulární působení doxorubicinu se výrazně liší od intracelulárních dějů, které spouští HPMA konjugáty. Prokázali jsme poměrně překvapivý vliv doxorubicinu a HPMA konjugátů na změnu povrchové glykosylace buněk, což může souviset s intracelulární akumulací těchto léčiv v Golgiho aparátu. Na zkoumanou sacharidovou sekvenci na povrchu buněk mají zásadní vliv postranní oligopeptidické řetězce HPMA konjugátů. Zjistili jsme aminokyselinovou sekvenci, která má na změnu povrchové glykosylace největší vliv. Dále byla syntetizována velká množství dvojnásobně a čtyřnásobně větvených uhlíkových koster s koncovou amino- a karboxylovou skupinou, na které jsou nyní připojovány oba ligandy (léčiva) karbodiimidovou kondenzací. Byly ověřovány imunologické aktivity peptidu LELTE a kontrolního peptidu imobilizovaného na polylysin (MAP technologie) jednak na normálních, jednak na aktivovaných lidských lymfocytech. U scMEM97 protilátky byl s použitím bifunkčního činidla DSS úspěšně připraven a isolován dimer této protilátky, který je připraven pro průtokově cytometrickou analýzu. 1M0506 Centrum molekulární a buněčné imunologie Ukázali jsme, že toxoidu adenylát cyklasy (ACT) lze použít jako nosiče antigenů pro vylepšení diagnostického testu pro detekci latentní tuberkulosy u lidí a skotu. Prokázali jsme, že pro vazbu ACT na myeloidní buňky exprimující integrin CD11b/CD18 postačuje jediná acylace (modifikace palmitátem) interního lysinového zbytku, buďto v pozici 860, nebo v pozici 983. Ovšem pro plnou aktivitu toxinu, tedy schopnost po vazbě na receptor pronikat buněčnou membránou a zvyšovat hladinu cyklického AMP je důležitější modifikace zbytku v pozici 983. Dále jsme ukázali, že vytvořené cAMP indukuje výraznou reorganizaci aktinového cytoskeletu fagocytů, čímž inhibuje jejich schopnost pohlcovat a zabíjet bakterie. Jedná se o principiálně nový mechanismus signalizace vedoucí od cAMP přes malé GTP-vazebné proteiny k reorganizaci cytoskeletu, jež dosud nebyl popsán a budeme jej dále analyzovat v příštích letech. LC531 Centrum molekulární biologie a fyziologie společenstev kvasinek Na základě předchozích zjištění předpokládáme, že zdrojem amoniaku jsou amonné ionty exportované Ato1p, Ato2p a Ato3p potenciálními transportery. Pomocí fluorescenční a konfokální mikroskopie a na základě frakcionace membrán bylo zjištěno, že se všechny Ato proteiny nalézají v raftových doménách plasmatické membrány. Ato1p-GFP a Ato3p-GFP jsou přítomny ve shlucích raftů, Ato2p-GFP protein je rozmístěn rovnoměrně v drobných mikrodoménách. Produkce Ato-GFP proteinů v mladé kolonii může být předčasně vyvolána působením arteficiálního amoniaku. Dále byly zjištěny výrazné odlišnosti v průběhu změn koncentrace intracelulárních aminokyselin u mutantního kmene sok2, který není schopen vyslat a přijmout signál amoniaku. To podporuje náš předpoklad, že amoniak vzniká na úkor intracelulárních aminokyselin.
10
Podobně jako u kvasinkových kolonií dochází i ve statických tekutých kulturách ke změnám okolního pH. Zvýšení pH je provázeno produkcí Ato proteinů i NH3/NH4+ do média. Již dříve bylo zjištěno, že během adaptace kolonií vyvolané amoniakem dochází ke snížení exprese genů obecné obrany vůči stresu. Byl proto studován vývoj kolonií kmenů s defektem v produkci cytosolické katalasy (Ctt1p), cytosolické (Sod1p) a mitochondriální (Sod2p) superoxiddismutasy. Zjistilo se, že absence Sod2p (nikoliv však Sod1p) vede k výrazné poruše produkce amoniaku i ke změnám exprese některých genů souvisejících s adaptací kolonií. Při absenci Ctt1p jsou poruchy méně výrazné. Specificky lokalizovaná regulovaná buněčná smrt vykazující znaky apoptosy je důležitá pro dlouhodobý vývoj kvasinkových kolonií. Jak bylo zjištěno, amoniak, sloužící jako signál vysílaný stárnoucími koloniemi kvasinek, spouští metabolické změny, které lokalizují tuto programovanou buněčnou smrt pouze do středu kolonie. Ostatní buňky kolonie využívají komponenty uvolněné z mrtvých buněk jako zdroje výživy. Nepřítomnost metacaspasy Mca1p nebo proteinu Aif1p nezabrání regulované buněčné smrti uvnitř kvasinkových kolonií. Kmeny S. cerevisiae isolované z přírody tvoří výrazně strukturované kolonie. Jejich hlavním znakem je výrazná exprese genu FLO11 (flokulin) a přítomnost extracelulární matrix s výraznou glykosidickou složkou. Pouze u některých z nich byl přítomen glykosylovaný protein s Mw nad 200 kDa. Během pasážování na bohatých půdách bylo možno vyisolovat „domestikované“ varianty přírodních kmenů tvořící hladké, nestrukturované kolonie. LC545 Centrum funkční organizace buňky Hlavním výsledkem práce v rámci tohoto projektu bylo zjištění, že lipidické rafty v membránách kvasinek mohou být zapojeny do některých buněčných procesů, včetně třídění a dopravování proteinů. Navíc v tomto procesu jsou zapojeny také neraftové lipidy jako např. fosfatidylethanolamin. Vymizení tohoto fosfolipidu vede k akumulaci argininového transporteru Can1p, který se typicky nachází v raftech a v membránách Golgiho aparatu, zatímco dopravování dalšího membránového transporteru, Pma1p, je přerušeno na úrovni endoplasmatického retikula. 1M0570 Výzkumné centrum pro studium obsahových látek ječmene a chmele Ve spolupráci s Matematicko-fyzikální fakultou University Karlovy, Praha, byl zkonstruován citlivý přístroj (Yeast Acidification Power/Turbidity Analyzer – YATA) umožňující za standardních (nastavitelných) podmínek měření vitality průmyslových i laboratorních kmenů kvasinek pomocí jejich acidifikační schopnosti jak tradičním (kontinuální měření pH kvasničné suspenze), tak titračním způsobem (kontinuální měření toku protonů přes buněčnou membránu). Technické možnosti přístroje byly podstatně zvýšeny tím, že byl doplněn o možnost kontinuálního měření zákalu měřené kvasničné suspenze – nezávislého parametru odrážejícího změny v počtu, metabolických a/nebo povrchových vlastnostech buněk v průběhu testu acidifikační schopnosti (i nezávisle na něm). Přístroj YATA byl vyzkoušen a jeho parametry testovány za použití laboratorních i pivovarských kmenů kvasinek. Byla vypracována základní standardní metoda přípravy vzorků pro měření na přístroji YATA a přístroj byl využit ke stanovení acidifikačních schopností a zákalových charakteristik 10 kmenů pivovarských kvasnic (kmeny 3,6, 8, 9, 11, 12, 26, 32, 95 a 98) ze sbírky RIBM 655 jako parametrů vitality. Acidifikační charakteristiky jednotlivých kmenů za podmínek AP testu zahrnovaly AP - acidifikační sílu; βinit pufrační kapacitu bez substrátu a βglc v přítomnosti glukosy; ∆[H+]app(A) zdánlivé množství protonů vypuzených na 1 l buněčné suspenze (protony vypuzené za 5 min bez substrátu); ∆[H+]app(B) protony vypuzené za 30 min po glukose; Σ∆[H+]app celkové množství vypuzených protonů (∆[H+]app(A) + ∆[H+]app(B), µmol H+/l susp.); ∆[H+]act skutečné množství vypuzených protonů (spotřebované množství NaOH, µmol OH-/l susp.) za 30 min po glukose u jednotlivých kmenů. Bylo stanoveno pořadí jednotlivých kmenů v těchto parametrech pro potřeby pivovarské praxe. Byla zdokonalena fluorescenční metoda využívající potenciometrické sondy diS-C3(3) ke stanovení buněčné energetiky (membránového potenciálu) a schopnosti kvasinek vypuzovat cizorodé látky prostřednictvím membránových transportérů zodpovědných za tzv. mnohočetnou látkovou resistenci (tzv. MDR pump).
11
Pomocí této metody a dalších technik byl stanoven relativní význam MDR pump a dalších faktorů v odolnosti laboratorních kmenů kvasinek vůči modelovým cizorodým látkám (ionofory, konzervační prostředky) za různých růstových podmínek.
c) spolupráce s vysokými školami na uskutečňování doktorských studijních programů (DSP) a magisterského a bakalářského studia Pracovníci ústavu se podílejí na pregraduální i postgraduální výuce na Univerzitě Karlově (Přírodovědecké fakultě, 1., 2. a 3. lékařské fakultě a Matematicko-fyzikální fakultě), VŠCHT, Biologické fakultě Jihočeské univerzity, Lékařské fakultě a Přírodovědecké fakultě Palackého univerzity v Olomouci, resp. na Univerzitě třetího věku Lékařské fakulty UK v Plzni a na dvou zahraničních univerzitách (Salzburg, Utah). MBÚ AV ČR má rozšířenou akreditaci těchto DSP: Mikrobiologie, Imunologie, Molekulární a buněčná biologie, genetika a virologie (Přírodovědecká fakulta UK Praha), Chemie s oborem Organická chemie, Biochemie, DSP Biochemie a biotechnologie s oborem Biotechnologie (VŠCHT Praha), Fyzika, obor Biofyzika, chemická a makromolekulární fyzika (MFF UK Praha). V roce 2005 ústav získal rozšíření akreditace DSP Fyzika s oborem Biofyzika z Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích a Ústavu fyzikální biologie Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích.
3. Spolupráce pracoviště s dalšími institucemi a s podnikatelskou sférou
a) společné projekty výzkumu a vývoje podpořené z veřejných prostředků V roce 2005 bylo v ústavu řešeno ve spolupráci s dalšími mimovysokoškolskými a mimoakademickými pracovišti celkem 30 projektů, financovaných z veřejných prostředků. Mezi nejdůležitější poskytovatele patřila Grantová agentura České republiky (8 projektů), Grantová agentura Akademie věd ČR (8 projektů) a resortní grantové agentury (MŠMT, MZd, MZe, MŽP, MO a MPO).
b) výsledky výzkumu a vývoje pro ekonomickou sféru V roce 2005 ústav evidoval celkem 20 hospodářských smluv. Za nejdůležitější je možno považovat smlouvy s firmami Zentiva, a.s., IVEX, s.r.o., MEGA, a.s., BEMER MEDIZIN TECHNIK, CZ, popř. s firmou Altracell Laboratories, s.r.o. Za nejvýznamnější výsledek spolupráce s ekonomickou sférou považujeme spolupráci s firmou Zentiva, a.s. při vývoji cílených protinádorových léčiv. Podrobnější popis výsledku je uveden v části 1b, resp. v anotaci č. 1. Z dalších výsledků spolupráce s firmami uvádíme tyto příklady: Při studiu fixace dusíku hlízkovými bakteriemi rodu Rhizobium byla nedestruktivní metodou sledována přítomnost a aktivita hlízkových bakterií inokulační skupiny hrachu v symbiotických hlízkách hostitelské rostliny pomocí kmenů nesoucích gen pro tvorbu fluorescentního proteinu GFP. Postup využívá výhod nově introdukovaného modelového hostitele Vicia tetrasperma. Byl identifikován ortholog symbiotického genu dmi u hrachu. Jedná se o gen, který umožňuje vznik ekonomicky významné symbiózy mezi rostlinnými hostiteli z čeledi vikvovitých a půdními hlízkovými bakteriemi. Došlo k praktickému využití patentu CR 294504 týkajícího se využití mutantní asymbiotické linie hrachu Budfix2 pro polní diagnostiku symbiotické fixace dusíku firmou Hakona CZ. (C) Ve spolupráci s firmou BVT Technologies a.s. Brno, Univerzitou J. E. Purkyně v Ústí nad Labem a Výzkumným ústavem zemědělským Kroměříž, s.r.o. byla sledována kinetika degradace fotosyntetického herbicidu isoproturonu v různých hloubkách půdy v polních pokusech pomocí prototypu nového detekčního zařízení – elektrochemického biosenzoru založeného na komplexu PS
12
II imobilizovaném na tištěných elektrodách. Výsledky byly pomocí biosenzoru získány za hodinu, zatímco klasické měření růstovými biotesty trvalo deset dnů. Inhibiční aktivita isoproturonu byla srovnávána s detekcí pomocí klasických růstových testů. Při srovnatelnosti výsledků byl výrazný rozdíl v trvání testů: metoda měření biosenzorem dala výsledky v řádu hodiny, zatímco měření růstovými biotesty trvalo 10 dnů. (C) Probiotická E. coli Nissle 1917 indukovala v tenkém střevě vyšší hodnoty antimikrobiálního peptidu ve srovnání s nepatogenní E. coli O86 a enteropatogenní E. coli Nissle 1917, což může být jeden z mechanismů jejího probiotického působení. Výsledky byly dosaženy ve spolupráci s firmou ARDEYPHARM, Herdecke, SRN. (B,C) Ve spolupráci s německou firmou Westfalia Separator byla ověřena technika separace řas od tekuté fáze v solárních fotobioreaktorech s tenkou vrstvou pomocí dekantéru, talířové a tryskové odstředivky. Nejvyššho stupně zahuštění za nejnižších provozních nákladů a možnost kontinuálního provozu umožňuje trysková odstředívka. Vypracovali jsme pro tuto odstředivku postupy opakovaných promyvů, které dovolují snížit v produktu o několik řádů počet bakterií, doprovázejících rostoucí kulturu řas. Fotosyntetická účinnost takového systému je vyšší než 6 %. (C)
c) nové firmy, které vznikly na základě výsledků činnosti ústavu v oblasti aplikovaného výzkumu V roce 2005 nebyla žádná firma založena.
d) odborné expertizy zpracované v písemné formě pro státní orgány a instituce V roce 2005 byla na žádost Obecního úřadu Panenský Týnec provedena mykologická prohlídka objektu kláštera a byl vydán odborný posudek, konstatující rozsáhlou přítomnost dřevomorky domácí (Serpula lacrymans) v knihovně hlavní budovy. Dále byla vypracována studie přítomnosti peptidů v jednom vzorku, dodaném Policií České republiky.
4. Mezinárodní vědecká spolupráce pracoviště
a) přehled mezinárodních projektů, které pracoviště řeší v rámci mezinárodních vědeckých programů V roce 2005 bylo celkem řešeno 7 projektů, financovaných ze zdrojů Evropské unie (1 projekt typu IST, dva projekty typu IP, dva projekty typu STREP a po jednom projektu typů NoE, MC). Dále byl řešen jeden projekt NATO Collaborative Linkage Grant.
b) nejvýznamnější vědecké výsledky dosažené v rámci mezinárodní spolupráce V rámci 6. RP-EU v projektu Bioferm ve spolupráci s ČVUT FS Praha, byl studován vliv intenzity ultrazvukového pole na kinetiku růstu vybraných aerobních (C. utilis) a anaerobních mikroorganismů (S. cerevisiae). Pro měření byla použita energie ultrazvuku o velikosti 50 W, tj. 10 W/L. Energie byla dodávána v půlhodinových intervalech s půlhodinovou přestávkou vždy po ukončení lag-fáze. Z výsledků vyplývá, že při frekvenci ultrazvuku 20 kHz a výkonu 5 W bylo dosaženo při aerobní kultivaci C. utilis zkrácení doby fermentace o 10-15 %. což představuje při velkoobjemových fermentací značné finanční úspory. (C) Ve spolupráci s pracovištěm v USA (Department of Biological Sciences, University of Louisiana, Baton Rouge) byla provedena charakteristika genového klastru pro biosyntézu antibiotika asukamycinu. V MBÚ byl pak charakterizován podobný klastr pro biosyntézu potenciálního kancerostatika manumycinu A. V obou případech byly určeny kompletní sekvence genových shluku a provedena analýza in-silico. Získané výsledky jsou spolu s metodou použitou pro isolaci a screening těchto genových klastrů zpracovány pro podání patentové přihlášky v USA a v ČR. (B,C)
13
Pomocí elektronové mikroskopie byla prokázána oligomerizace adenylátcyklasového toxinu bakterie Bordetella pertussis (původce černého kašle) v buněčných membránách. Ve spolupráci s Univerzitou ve Würzburgu byly detailně charakterizovány struktury adenylátcyklasového toxinu odpovědné za tvorbu iontových kanálů. Ve spolupráci s katedrou genetiky a mikrobiologie PřF UK byl objeven nový mechanismus vstupu iontů vápníku do buněk spojený s průnikem adenylátcyklasového toxinu a byl prokázán význam kanálotvorné aktivity adenylátcyklasového toxinu při jeho působení na buňky imunitního systému. (B) Bylo prokázáno, že toxoid adenylátcyklasy z Bordetella pertussis je vhodným nosičem pro dopravu nádorových antigenů při imunoterapii experimentálních nádorů u myší. Tento toxoid lze použít i jako nosiče antigenů pro vylepšení diagnostického testu pro detekci latentní tuberkulosy u lidí a skotu. V tomto směru probíhá spolupráce s Imperial College v Londýně a s Institut Pasteur v Paříži. (C) Ve spolupráci s Institut Pasteur v Paříži byl charakterizován genom probiotické bakterie Escherichia coli O83:K24:H31 používané pro obnovení střevní flóry u kojenců. (B,C) Při studiu dextran sulfátem indukované kolitidy u myší bylo zjištěno, že nejúčinnější formou v protekci střevního zánětu byla membránová frakce sonikátu z kmene bakteroides. Ve spolupráci s nizozemskými pracovišti v Utrechtu a Amstrodamu bylo zjištěno, že protektivní účinek mají i některé typy tzv. heat-shock proteinů. Dále se zjistilo, že denní podávání 6-thioguaninu chrání myši před vznikem experimentální kolitidy. Histopatologické sledování neprokázalo toxické změny v játrech myší, avšak indukce kolitidy pomocí DGEE vedla ke změnám ve složení střevní mikroflory. (B) Byly studovány vlastnosti receptoru, rozpoznávajícího mikrobiální vzory dešťovek Eisenia fetida (CCF). Molekula CCF vykazuje řadu podobností se savčím TNF, přestože nebyla prokázána žádná sekvenční homologie. Podobnost je založena na shodné lektinové aktivitě se specificitou pro N,N´diacetylchitobiosu, která je např. zodpovědná i za interakci s iontovými kanály makrofágů a jejich následnou aktivaci. Ve spolupráci s Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie v Bruselu bylo zjištěno, že tato aktivace makrofágů prostřednictvím iontových kanálů (Na/H) je signalizována NF-κB a existuje paralelně s klasickou aktivační drahou využívající TNF receptory. Je pravděpodobné, že aktivace prostřednictvím iontových kanálů je evolučně mnohem starší a v průběhu evoluce byla překonána receptorovou aktivací. (B) Orální osazení nevirulentním hrubým mutantem Salmonella typhimurium 24 hodin před infekcí virulentním kmenem LT2 mělo ochranný vliv před působením virulentního kmene. Ochranný vliv může být, jak bylo zjištěno ve spolupráci s Institute for Animal Health ve Velké Británii, zprostředkován změnou v produkci zánětových cytokinů jako součásti mechanismů přirozené imunity. (B) Ve spolupráci s National Institute of Animal Health (Tsukuba) bylo zjištěno, že enteropatogenní E. coli O55 indukovala vyšší hladiny prozánětlivého cytokinu IL-18 ve srovnání s nepatogenní E.coli O86. Patologické změny v amniové membráně, která je jedním ze zdrojů IL-18 v amniové tekutině, korelují s virulentností bakterií. (B)
c) akce s mezinárodní účastí, které pracoviště organizovalo nebo v nich vystupovalo jako spolupořadatel Větší akce mezinárodního významu jsou plánovány na rok 2006. V roce 2005 ústav zorganizoval v Praze konferenci Cukrblik 2005, který navštívilo 57 účastníků (z toho 12 zahraničních). Akce navazovala na předchozí setkání pracovníků v chemii a biotechnologii sacharidů. Pracovníci ústavu se podíleli i na pořádání 33. Výroční konference o kvasinkách (Smolenice, Slovensko). Ústav se podílel i na přípravě 2. České proteomické konference v jihomoravské Lednici, které se zúčastnilo devadesát účastníků, z toho čtrnáct zahraničních.
d) výčet jmen nejvýznamnějších zahraničních vědců, kteří navštívili pracoviště AV
14
Argentina Prof. Diego de Mendoza, Institute of Molecular and Cellular Biology of Rosario, Argentina Belgie Prof. P. De Baetselier a A. Beschin, Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie, Vrije Universiteit Brussel; Dánsko John Larsen, Research Institute Flakkebjerg, Flakkebjerg, Slagelse; Finsko Antti Hesso, Finnish Institute of occupational Health, Helsinki; Kari Steffen, University of Helsinki; Francie Carmen Buchrieser, Institut Pasteur, Paris; Prof. Xavier Nassif, INSERM U570 – Faculte Necker, Paris; Prof. Graham Bentley, Institut Pasteur, Paris; Philippe Mazodier, Institut Pasteur Paris; Christian Mougin, Institut National de la Recherche Agronomique, Versailles; J.M. Ducruet, Saclay, CEA, Saclay; A.Sciandra, CNRS, Villefranche-sur-Mer; Israel I. Berman-Frank, Univerzita Bar Ilan, Tel Aviv; Prof. Ron Apte, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva; Italie Daniela Monti, Istituto di Chimica del Riconoscimento Molecolare –CNR,Via Mario Bianco, 9, 20131 Milano Italy Prof. Sergio Riva a Dr. Daniela Monte – Istituto di Chimica del Riconoscimento Molecolare, CNR, Milano, Italy. Claudio Arra, National Cancer Institute “G. Pascale”, Neaples, Italy Japonsko Prof. S. Kawano Tokijská univerzita, Kashiwa; Lotyšsko Prof. Maija Ruklisha,Institute of Microbiology and Biotechnology, University of Latvia, Riga; Maďarsko Zoltan Takats, Hungarian Institute for Chemistry, Budapest; Nizozemí Prof.W.Vredenberg, Zemědělská univerzita Wagenningen; Prof. W. van Eden, University of Utrecht; Prof. C. Mulder, University Medical Center, Vrije Universiteit Amsterdam; Polsko Doc. Bozena Cukrowska, The Children’s Memorial Health Institute, Warsaw; Portugalsko Prof. Margarida Casal, Universidade do Minho, Braga; Prof. José Teixeira, University of Minho, Braga; Rakousko
15
Prof. Dietmar Haltrich, University of Natural Resources and Applied Life Sciences, Dept. of Food Sciences and Technology, Vienna; Slovensko Doc. Ladislav Petruš, Chemický ústav SAV, Bratislava; Eliška Gálová Bratislava, Univerzita Komenského; Andrea Ševčovičová, Bratislava, Univerzita Komenského; Slovinsko Prof. Saso Pavko, University of Ljubljana, Ljubljana; Vanja Kokol, University of Maribor, Slovenija; SRN Prof. Roland Benz, Theodor Boveri Institut, Biozentrum, University of Würzburg; Thomas Jacobs, Bernard Nochte Institut für Tropische Medizin, Hamburg; Prof. Inngo Just, Institut of Toxicology, Medical School Hannover; Andrzej Majcherczyk, Georg-August-University of Goettingen, Goettingen; Prof. Martin Hofrichter, International Graduate School Zittau; Prof. T. Mothes, University of Leipzig; Doc. E. Kauschke, University of Greifswald; H. Kupper, Kostnice, Univerzita v Kostnici; Švédsko Professor Salam Al-Karadaghi, Lunds Universitet, Molecular Biophysics, Lund; Prof. Geoffrey Daniel, Swedish University of Agricultural Sciences, Dept. of Wood Science, Uppsala; Prof. K. Söderhäll, University of Uppsala; Švýcarsko Prof. M. Ackerman, ETH Zurich; Prof. Jaroslav Dbalý, BEMER Medizin Technik, Zürich; USA Grazia Isaya, Associate Professor of Pediatrics, Mayo Clinic College of Medicine, Rochester; Prof. František Tureček, University of Washington; Prof. Donald Morrison , University of Chicago, Chicago; Prof. Jindřich Kopeček, University of Utah, Salt Lake City; Prof. Pavla Kopečková, University of Utah, Salt Lake City; Prof. Ivan Gitsov, Polymer Research Institute, SUNY College of Enviromental Science and Forestry, State University of New York; Prof. Erik Hewlett, University of Virginia Medical School, Charlottesville, VA; Prof.Paul Falkowski G. Falkowski, Institute of Marine and Coastal Sciences, Rutgers University, New Brunswick, NJ; Prof. B. Dvořák, Univerzity of Arizona, Tucson; B.Van Mooy , Woods Hole Oceanographic Institution, Massachussets; Gary Kruppa, vicepresident of Bruker Daltonics Velká Británie Prof. Dlawer Ala`Aldeen, Division of Microbiology University Hospital, Nottingham; Laszlo Bogre, Royal Holloway College., Univ. of London; Keith Firman, School of Biological Sciences, University of Portsmouth; D.Suggett, University of Essex; Prof. John Monaghan, president of the International mass spectrometry society
16
e) počet fungujících meziústavních dvoustranných dohod (tj. dohod, které plně financuje pracoviště a které nesouvisí s mezinárodní spoluprací v rámci dvoustranných meziakademických dohod). Žádná taková dohoda nebyla uzavřena.
17
Anotace 1 Indukce systémové protinádorové rezistence směrovanými polymerními léčivy (B. Říhová)
Konjugáty na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) představují novou generaci protilátkou směrovaných polymerních protinádorových léčiv s cytotoxickou a imunoprotektivní/imunomobilizační aktivitou. Konjugáty HPMA kopolymeru a doxorubicinu s uvolňováním léčiva závislým na pH jsou vysoce účinné v zabíjení nádorových buněk in vitro a eradikaci nádorů in vivo. Předpokládá se, že hlavní aktivita polymerních léčiv bezprostředně po podání je díky jejich vysoké koncentraci cytotoxická a cytostatická. Ve srovnání s nízkomolekulárními léčivy, vykazují makromolekulární terapeutika nižší akutní i pozdní nespecifickou toxicitu vůči nenádorovým tkáním. Důležité je, že polymerní konjugáty spouštějí specifickou protinádorovou imunitní odpověď a umožňují přenos této protinádorové imunity pomocí splenocytů na naivního příjemce, což bylo ověřeno s využitím Winnova neutralizačního testu. Jinými slovy, chemoterapie založená na konjugátech HPMA s doxorubicinem vykazuje imunomodulační vlastnosti. Tento fakt může mít význam pro léčbu pacientů s relabujícími nádory. Podobné vlastnosti byly pozorovány také u dalšího konjugátu obsahyjícího jako cytotoxickou složku doxorubicin a jako pasivně směrující molekulu IV lidský imunoglobulin. Doposud bylo toto léčivo v rámci pilotní klinické studie podáno sedmi pacientkám s generalizovaným karcinomem a léčba vedla ke stabilizaci onemocnění trvající 6-18 měsíců.
CH3
CH3
H2C C
H2C C
C O
x
C O
NH
X
CH2
NH
HC OH CH3
y
N O
OH
C CH2OH OH
OMe O
OH H
O O
CH3 OH NH2.HCl Struktura konjugátu s pH-řízenou aktivací léčiva Říhová B., Strohalm J. Kovář L., Mrkvan T., Šubr V., Hovorka O., Šírová M., Rozprimová L., Kubáčková K., Ulbrich K.: Induction of systemic antitumour resistance with targeted polymers. Scand. J. Immunol. 62 (Suppl. 1): 100-105, 2005. Review Mrkvan T., Šírová M., Etrych T., Chytil P., Strohalm J. Plocová D., Ulbrich K., Říhová B.: Chemotherapy based on HPMA copolymer conjugates with pH-controlled release of doxorubicin triggers anti-tumor immunity. J. Control. Release 110: 119-129, 2005.
18
Induction of systemic anticancer resistance by targeted polymeric drugs (B. Říhová) Conjugates based on N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide (HPMA) represent a new generation of antibody-targeted polymeric anticancer drugs with both cytotoxic and immunoprotecting/immunomobilizing activity. Conjugates of HPMA copolymers and doxorubicin with pH-controlled release of the drug are highly efficient in killing tumor cells in vitro and potent in eradicating growing tumors in vivo. It is suggested that the main activity of the polymeric drug, directly after application is – due to the high level of the drug – of cytotoxic and cytostatic nature. Moreover, in comparison with low-molecular-weight drugs, the macromolecular therapeutics show decreased acute as well as delayed adverse sidetoxicity. More importantly, the polymeric conjugates trigger the onset of specific anti-tumor immune response and this anti-tumor immunity can be transferred with splenocytes to naive recipients that was proved by Winn’s tumor neutralization assay. In other terms, chemotherapy based on conjugates of HPMA copolymer with doxorubicin possesses immunomodulating properties. This finding might also have wider implications for the management of relapsing tumors in human patients. Similar properties exhibited different conjugate containing doxorubicin as the cytostatic moiety and passively targeted by IV human immunoglobulin. Until now, seven patients with generalized carcinoma were treated with doxorubicin-HPMA-human immunoglobulin conjugate in a pilot clinical trial. Disease stabilization, lasting from 6 to more than 18 months, was recorded.
CH3
CH3
H2C C
H2C C
C O
x
C O
NH
X
CH2
NH
HC OH CH3
y
N O
OH
C CH2OH OH
OMe O
OH H
O O
CH3 OH NH2.HCl Structure of the conjugate with pH-controlled activation of the drug Říhová B., Strohalm J. Kovář L., Mrkvan T., Šubr V., Hovorka O., Šírová M., Rozprimová L., Kubáčková K., Ulbrich K.: Induction of systemic antitumour resistance with targeted polymers. Scand. J. Immunol. 62 (Suppl. 1): 100-105, 2005. Review Mrkvan T., Šírová M., Etrych T., Chytil P., Strohalm J. Plocová D., Ulbrich K., Říhová B.: Chemotherapy based on HPMA copolymer conjugates with pH-controlled release of doxorubicin triggers anti-tumor immunity. J. Control. Release 110: 119-129, 2005.
19
Anotace 2: Faktory firulence Neisseria meningitidis (P. Šebo)
Invazivní meningokoky Neisseiria meningitidis produkují řadu faktorů virulence, jejichž exprese je regulována koncentrací volných železitých iontů v prostředí. V této práci jsme na celogenomové úrovni analyzovali složení proteomu a transkriptomu lokálního izolátu invazního meningokoka a to pomocí kombinace dvou komplementárních technik – analýzy proteomu metodou dvourozměrné elektroforézy s identifikací proteinů hmotovou spektrometrií a pomocí analýzy transkriptomu metodou charakterizace expresních profilů na DNA microarray. Tato kombinace přístupů umožnila dosáhnout vysoce komplexního popisu steady-state profilů přítomných proteinů a genů exprimovaných genů za podmínek růstu v prostředí s limitující koncentrací železitých iontů. Díky tomu bylo identifikováno 85 genů, jejichž exprese je významně zvýšena za podmínek napodobujících nízkou dostupnost železa na lidské sliznici. Zjistili jsme, že naopak za podmínek vysoké dostupnosti železa je exprese 114 genů potlačena. V souboru nalezených proteinů, jejichž produkce podléhá regulaci závislé na koncentraci železa, jsme pak identifikovali celou řadu potenciálně nových komponent drah pro získávání železa, faktorů virulence a antigenů potenciálně využitelných pro vývoj nových vakcín proti meningitidě. Srovnávací analýza s publikovanými výsledky získanými za jiných experimentálních podmínek na jiných kmenech meningokoků ukazuje, že až 20% všech genů meningokoka podléhá regulaci v závislosti na koncentraci železa v prostředí.
547 Neisseria genes appear to be regulated by iron levels Neisseria meningitidis group B 235 genes found by Grifantini R., et al.
154 24
141
Neisseria gonorrhoeae 203 genes found by Ducey TF., et al.
17 21
40
150
Neisseria meningitidis group C 228 genes/proteins found by Basler M., et al.)
Marek Basler, Irena Linhartová, Petr Halada, Jiří Vohradský, Jana Novotná, Silvie Bezoušková, Radim Osička, Jaroslav Weiser and Peter Šebo. Analysis of the iron regulated transcriptome and proteome of a serogroup C Neisseria meningitidis strain 10/96. manuscript in preparation.
20
Virulence factors in Neisseria meningitidis (P. Šebo)
The pathogenic Neisseria species produce a number of iron regulated proteins that are important in virulence. We analyzed the composition of the iron-regulated proteome and transcriptome of a local serogroup C invasive meningococcal isolate 10/96 on the whole genome level. The steady-state proteome of meningococci grown under iron-depleted and iron-replete conditions was analyzed by 2-D electrophoresis and the proteins exhibiting significantly enhanced or reduced expression levels at either condition were identified by MALDI-TOF MS analysis. In parallel, total RNA was isolated from the same cultures and screened for iron-regulated mRNA expression profiles using commercial spotted wholegenome DNA microarrays. In total, we identified 85 genes that were significantly upregulated in cells from iron-replete cultures and 114 genes that were up-regulated upon growth in iron-depleted media. The overlap between the iron-regulated transcriptome and proteome data sets was, however, found to be rather low and only 18 open reading frames were detected by both methods as being subject to regulation in response to iron availability in the media. The various categories of identified iron-regulated genes suggest possible new mechanisms of iron acquisition and adaptation of meningococci to low iron conditions, which may play a role in virulence.
547 Neisseria genes appear to be regulated by iron levels Neisseria meningitidis group B 235 genes found by Grifantini R., et al.
154 24
141
Neisseria gonorrhoeae 203 genes found by Ducey TF., et al.
17 21
40
150
Neisseria meningitidis group C 228 genes/proteins found by Basler M., et al.)
Marek Basler, Irena Linhartová, Petr Halada, Jiří Vohradský, Jana Novotná, Silvie Bezoušková, Radim Osička, Jaroslav Weiser and Peter Šebo. Analysis of the iron regulated transcriptome and proteome of a serogroup C Neisseria meningitidis strain 10/96. manuscript in preparation.
21
Anotace 3: Nové enzymové aktivity v biosyntéze linkosamidových antibiotik a nový typ rezistence vůči linkosamidům; Cesta k účinnějším hybridním látkám s antibakteriálními a antimalarickými účinky (J. Janata) Byla vyřešena kompletní genetická informace biosyntetické dráhy linkosamidového antibiotika celesticetinu, nového zdroje genů pro přípravu hybridních látek s antibakteriálnmi a antimalarickými účinky. V linkomycinovém i nově charakterizovaném celesticetinovém biosyntetickém shluku genů byly prokázány funkce produktů dvojice homologních genů, proteinů LmbC, resp. CcbC. V klíčových enzymech obou příbuzných biosyntetických drah, multimerních syntetázách řídících kondenzaci dvojic stavebních kamenů, zodpovídají za substrátovou specifitu enzymu. Modifikace jejich vlastností je cestou k novým látkám. U klinických izolátů stafylokoků byl nalezen a funkčně prokázán nový rezistenční gen vgaALC, patřící do téže rodiny jako geny producentů linkosamidových antibiotik. Gen udílí rezistenci vůči linkosamidům linkomycinu a klindamycinu i vůči strukturně odlišným streptograminům. Byl izolován a sekvenčně charakterizován kompletní shluk 24 genů kódující biosyntézu antibiotika celesticetinu. Osmnáct z nich má své homologní protějšky v biosyntéze strukturně příbuzného antibiotika linkomycinu, pět je specifických pouze pro biosyntézu celesticenu a odráží strukturní odlišnosti nově charakterizovaného antibiotika (biosyntéza salicylátové jednotky), jeden gen kóduje rezistenci vůči produkovanému antibiotiku. Dvojice genů obklopující biosyntetický shluk (kóduje transpozázy) dokumentuje způsob jeho začlenění do genomu producenta mechanismem horizontálního přenosu. Toto zjištění je významným argumentem podporujícím hypotézu o horizontálním šíření celých biosyntetických shluků a hlavním výstupem projektu z pohledu základního výzkumu. Nově nalezené biosyntetické geny mohou být kombinovány pro přípravu hybridních látek na bázi linkomycinu, což je hlavní aplikační potenciál výzkumu. V poslední době nacházejí deriváty linkomycinu širší uplatnění v humánní medicíně nejen pro své účinky antibakterální, ale i jako antimalarika. Jsou známy i účinnější deriváty než v současnosti nejpoužívanější semisyntetický derivát klindamycin. K biotechnologické přípravě účinnějších látek otevírá cestu hlavně identifikace a charakterizace enzymů řídících klíčové kroky biosyntézy, případně genetická modifikace jejich vlastností. Průlomovým poznatkem roku 2005 byl proto funkční průkaz proteinů LmbC a CcbC, podjednotek multimerního enzymového komplexu (syntetázy), řídící ústřední krok biosyntézy linkosamidových antibiotik. Ovládnutí a modifikace vlastností této syntetázy umožní řízenou přípravu účinnějších látek s antibakteriálními a zejména s antimalarickými vlastnostmi. U deseti klonálně příbuzných kmenů Staphylococcus haemolyticus izolovaných v českých nemocnicích byl nalezen zcela nový LC fenotyp (rezistence k linkomycinu a klindamycinu, avšak citlivost k makrolidům), který naznačil přítomnost u stafylokoků nepopsané genetické determinanty. V roce 2005 byl u všech kmenů této skupiny identifikován a sekvenován nový gen vysoce podobný rezistenčnímu genu vgaA popsanému u stafylokoků. Gen vgaA uděluje vysokou rezistenci vůči streptograminům A, avšak pouze prahovou rezistenci vůči linkosamidům. České izoláty s genem nazvaným vgaALC jsou však vysoce rezistentní vůči oběma skupinám strukturně odlišných antibiotik. Geny vgaALC i vgaA byly přeneseny do citlivého kmene Staphylococcus aureus, kde byl prokázán rozdíl v míře rezistence udílené oběma homologními geny vůči linkosamidovým antibiotikům. Studium nových rezistenčních genů, důkaz jejich účinku i sledování míry rozšíření v klinických izolátech je velmi důležitým podkladem pro definování antibiotické politiky státu i pro přípravu diagnostických metod pro volbu vhodné antibiotické léčby v konkrétních případech. Novotná, G., Adámková, V., Janata, J., Melter, O. and Spížek. J. Prevalence of resistance mechanisms to macrolides and lincosamides in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci in the Czech Republic and Occurrence of an undefined resistance to lincosamides. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 3586-3589 (2005) Kadlčík, S., Chalupská, D., Koběrská M., Kopecký, J. , Najmanová, L., Lichá, I., Spížek, J., Janata, J.: LmbC and CcbC proteins specifically activate proline aglycones for condensation step of lincosamide biosynthesis (in preparation).
22
New enzyme activities in the biosynthesis of lincosamide antibiotics and a new type of lincosamide resistance: A gate to new hybrid compounds with improved antibacterial and antimalarial effects (J. Janata) The complete genetic information has been deciphered of the biosynthetic pathway of the lincosamide antibiotic celesticetin, a new source of genes for the preparation of hybrid compounds with antibacterial and antimalarial effects. Both in the lincomycin and the newly characterized celesticetin biosynthetic gene clusters the functions of products of two homologous genes, the proteins LmbC and CcbC, were determined. In the key multimeric synthetase, these proteins define substrate specificity of the enzyme. Modification of their properties open the way to new compounds. A new resistance gene, vgaALC, has been found and its function determined in clinical isolates of staphylococci; the gene belongs to the same family as the genes present in the producers of lincosamide antibiotics. The complete cluster of 24 genes encoding the biosynthesis of the antibiotic celesticetin was isolated and characterized by DNA sequence determination. Eighteen of them have their homologous counterparts in the biosynthesis of the structurally related antibiotic lincomycin, five are specific solely for celesticetin biosynthesis and reflect the structural differences of the newly characterized antibiotic (biosynthesis of the salicylate subunit), and one gene encodes the resistance to the produced antibiotic. The additional genes at the rime of the biosynthetic cluster, which encode transposases, document the type of its incorporation into the genome of the producer by the mechanism of horizontal transfer. This finding is an important argument supporting the hypothesis of the horizontal transfer of whole biosynthetic gene clusters, and is the main outcome in terms of basic research. The newly identified biosynthetic genes can be combined in order to prepare new hybrid lincomycin-based compounds – the main practical spin-off of the research. Lincomycin derivatives have recently found an ever-increasing use in human medicine not only for their antibacterial effects but also as antimalarial agents. Some derivatives are more potent than the currently most widely used semisynthetic derivative clindamycin. The opening of the way to the biotechnological preparation of these potent compounds depends on the identification and characterization of enzymes governing the key steps of the biosynthesis, or a genetic modification of their properties. In 2005, a breakthrough has been the functional determination of the first subunit of the multimeric enzyme complex (synthetase) controlling the central step of biosynthesis of lincosamide antibiotics. The determination and modification of properties of this synthetase will permit the directed preparation of highly efficient compounds with antibacterial and especially antimalarial properties. A set of ten clonally related strains of Staphylococcus haemolyticus isolated in Czech hospitals has been found to display a completely new LC phenotype (resistance to lincomycin and clindamycin and sensitivity to macrolides), which pointed to the presence of as yet unknown genetic determinant in staphylococci.In 2005, a new gene vgaALC highly related to the resistance gene vgaA described in staphylococci was identified and sequenced in all strains of this group. The gene vgaA confers high resistance to streptogramins A but only a threshold resistance to lincosamides. By contrast, Czech isolates having the gene named vgaALC are highly resistant to both groups of the structurally distinct antibiotics. Both vgaA and vgaALC genes were transferred into a sensitive strain of Staphylococcus aureus in which a difference was documented in the extent of resistance to lincosamide antibiotics conferred by the two homologous genes. The study of new resistance genes, proof of their effect and the monitoring of the scope of their spreading in clinical isolates forms a supremely important basis for defining the state antibiotic policy and for the preparation of diagnostic methods for the selection of suitable antibiotic treatment in specific cases. References: Novotná, G., Adámková, V., Janata, J., Melter, O. and Spížek. J. Prevalence of resistance mechanisms to macrolides and lincosamides in methicillin-resistant coagulase-negative staphylococci in the Czech Republic and Occurrence of an undefined resistance to lincosamides. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 3586-3589 (2005) Kadlčík, S., Chalupská, D., Koběrská M., Kopecký, J. , Najmanová, L., Lichá, I., Spížek, J., Janata, J.: LmbC and CcbC proteins specifically activate proline aglycones for condensation step of lincosamide biosynthesis (in preparation).
23
