MIKROBIOLOGICKÉ LABORATORNÍ METODY

VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO

FAKULTA VETERINÁRNÍ HYGIENY A EKOLOGIE Ústav hygieny a technologie mléka

MIKROBIOLOGICKÉ LABORATORNÍ METODY

MVDr. Šárka Bursová, Ph.D. Mgr. Marta Dušková, Ph.D. MVDr. Lenka Necidová, Ph.D. doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D. Mgr. Petra Myšková

BRNO 2014

Tato skripta jsou spolufinancována z Operačního programu Vzdělávání pro konkurenceschopnost:

„Inovace bakalářského a navazujícího magisterského studijního programu v oboru Bezpečnost a kvalita potravin“

(reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287)

1

Obsah

OBSAH KULTIVAČNÍ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) .............................................. Vybrané komerční kultivační soupravy ........................................................... Systém TEMPO .................................................................................................. Základní principy ................................................................................................. Provedení a vyhodnocení testu ............................................................................ Výhody, nevýhody a využití metody TEMPO v praxi ........................................

7 8 8 9 9 10

AUTOMATIZOVANÉ SYSTÉMY VYUŽÍVANÉ PŘI IDENTIFIKACI MIKROORGANISMŮ (Mgr. Marta Dušková, Ph.D.) ..................................................... 2.1. Systém VITEK® (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ............................................................... 2.1.1. Základní principy ................................................................................................. 2.1.2. Výhody, nevýhody a využití systému VITEK® v praxi ....................................... 2.2. Systém Biolog ...................................................................................................... 2.2.1. Základní principy ................................................................................................. 2.2.2. Výhody, nevýhody a využití systému Biolog v praxi .......................................... 2.3. Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF ........................................................ 2.3.1. Základní principy ................................................................................................. 2.3.1.1. Příprava izolátů .................................................................................................... 2.3.2. Výhody a nevýhody metody MALDI-TOF MS .................................................. 2.3.3. Využití metody MALDI-TOF MS v praxi ........................................................... 2.4. Biosenzory ........................................................................................................... 2.4.1. Základní principy ................................................................................................. 2.4.1.1. Biorekogniční část ................................................................................................ 2.4.1.2. Fyzikálně-chemický převodník ............................................................................ 2.4.2. Výhody a nevýhody biosenzorů ........................................................................... 2.4.3. Využití biosenzorů v praxi ...................................................................................

11 11 11 12 12 12 12 13 13 14 15 15 15 15 16 16 17 17

MIKROSKOPICKÉ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ..................................... Fluorochromy a sondy používané v mikroskopii ............................................ Fluorochromy ....................................................................................................... Využití fluorochromů při vitálním barvení .......................................................... Molekulární sondy ............................................................................................... Základní druhy mikroskopie ............................................................................ Světelná (optická) mikroskopie ........................................................................... Fluorescenční mikroskopie .................................................................................. Epifluorescenční mikroskopie .............................................................................. Elektronová mikroskopie ..................................................................................... Přímá epifluorescenční filtrační technika – DEFT ......................................... Základní principy ................................................................................................. Stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce ........................... Modifikace metody DEFT ................................................................................... Automatizace metody DEFT – systém BactoScan 8000 ..................................... Výhody, nevýhody a využití metody DEFT v praxi ............................................ Průtoková cytometrie ........................................................................................ Základní principy, složení průtokového cytometru ............................................. Výhody a nevýhody průtokové cytometrie .......................................................... Využití průtokové cytometrie v praxi .................................................................. Využití průtokové cytometrie při hodnocení kvality syrového mléka .................

18 18 18 18 19 19 19 20 20 20 21 21 21 21 22 22 22 22 23 24 24

1. 1.1. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 2.

3. 3.1. 3.1.1. 3.1.1.1. 3.1.2. 3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.2.2.1. 3.2.3. 3.3. 3.3.1. 3.3.2. 3.3.3. 3.3.4. 3.3.5. 3.4. 3.4.1. 3.4.2. 3.4.3. 3.4.3.1.

2

Obsah

4. 4.1. 4.2. 4.2.1. 4.2.2. 4.3. 4.3.1. 4.3.2. 4.3.2.1. 4.3.2.2. 4.3.2.3. 4.3.3. 4.3.4. 4.4. 4.4.1. 4.4.2. 4.4.3.

IMUNOLOGICKÉ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ....................................... Aglutinační testy ................................................................................................. Imunochromatografická metoda ...................................................................... Základní principy ................................................................................................. Výhody, nevýhody a využití imunochromatografie v praxi ................................ Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – ELISA ........................................... Základní principy ................................................................................................. Konfigurace ELISA metod používaných v mikrobiologii potravin ..................... Sendvičová ELISA ............................................................................................... Nepřímá sendvičová ELISA ................................................................................ Kompetitivní ELISA ............................................................................................ Komerčně dostupné ELISA soupravy .................................................................. Výhody, nevýhody a využití ELISA metod v praxi ............................................. Enzyme-Linked Fluorescent Assay – ELFA (MVDr. Lenka Necidová, Ph.D.) ............... Základní principy ................................................................................................. Provedení metody a vyhodnocení výsledků ......................................................... Výhody, nevýhody a využití metody ELFA v praxi ............................................

25 25 26 26 27 28 28 28 28 29 29 30 31 32 32 33 34

5. 5.1. 5.1.1. 5.1.2. 5.2. 5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. 5.2.3.1. 5.2.4. 5.2.5. 5.3. 5.3.1. 5.3.2. 5.3.3. 5.3.4.

METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE (Mgr. Marta Dušková, Ph.D.) ...................... Způsoby izolace nukleových kyselin ................................................................. Izolace nukleové kyseliny prokaryot ................................................................... Izolace nukleové kyseliny virů ............................................................................ Polymerázová řetězová reakce (PCR) .............................................................. Základní principy ................................................................................................. Detekce PCR produktů ......................................................................................... Modifikace PCR ................................................................................................... Real-time PCR (qPCR) ........................................................................................ Inhibitory polymerázové řetězové reakce ............................................................ Výhody, nevýhody a využití metody PCR v praxi .............................................. Hybridizační techniky ........................................................................................ Základní principy ................................................................................................. Hybridizace na pevném podkladu ........................................................................ Mikročipy („microarrays“) .................................................................................. Výhody, nevýhody a využití hybridizačních technik v praxi ..............................

35 35 35 35 36 36 37 37 39 40 40 41 41 42 43 43

6. 6.1. 6.1.1. 6.1.2. 6.1.2.1. 6.1.2.2. 6.1.2.3. 6.1.3. 6.1.4. 6.1.5. 6.2. 6.3. 6.3.1. 6.3.2. 6.3.3.

NEPŘÍMÉ METODY (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ...................................................... Elektrické metody .............................................................................................. Teorie impedance ................................................................................................. Základní principy ................................................................................................. Přímá metoda měření impedance ......................................................................... Nepřímá metoda měření impedance .................................................................... Faktory ovlivňující impedanční stanovení ........................................................... Měřicí systémy ..................................................................................................... Výhody a nevýhody elektrických metod ............................................................. Využití elektrických metod v praxi ...................................................................... Radiometrické stanovení 14CO2 ........................................................................ Limulus Amebocyte Lysate test – LAL test ..................................................... Detekce pozitivní reakce ...................................................................................... Zkumavkový LAL test ......................................................................................... Využití LAL testu v praxi ....................................................................................

44 44 44 44 44 45 45 46 46 47 47 48 48 48 48

3

Obsah

6.4. 6.4.1. 6.4.2. 6.4.2.1. 6.4.2.2. 6.4.3. 6.4.3.1. 6.4.4. 6.4.5.

ATP bioluminiscenční test ................................................................................. Základní principy ................................................................................................. Stanovení počtu mikroorganismů v potravinách ................................................. Využití v praxi ..................................................................................................... Výhody a nevýhody ............................................................................................. Monitoring hygieny a sanitace v potravinářských provozech .............................. Výhody a nevýhody ............................................................................................. Využití ATP bioluminiscence při detekci vybraných patogenů .......................... Měřicí přístroje .....................................................................................................

49 49 50 50 51 51 52 52 52

7. 7.1. 7.1.1. 7.1.2. 7.1.2.1. 7.1.2.2. 7.2. 7.2.1. 7.3. 7.3.1. 7.3.1.1. 7.3.1.2. 7.3.2. 7.3.2.1. 7.3.2.2. 7.3.3. 7.3.3.1. 7.3.3.2. 7.4. 7.4.1. 7.4.2.

STANOVENÍ CITLIVOSTI MIKROORGANISMŮ K AML (MVDr. Šárka Bursová, Ph.D.) ............................................................................................ Rezistence mikroorganismů k AML ................................................................ Antimikrobiální látky a jejich účinek na mikroorganismy .................................. Rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám ..................................... Mechanismy rezistence mikroorganismů k AML ................................................ Vznik a šíření rezistence mikroorganismů k AML .............................................. Semikvantitativní metody .................................................................................. Disková difúzní metoda ....................................................................................... Kvantitativní – diluční metody ......................................................................... Agarová diluční metoda ....................................................................................... Provedení a vyhodnocení testu ............................................................................ Výhody a nevýhody agarové diluční metody ...................................................... Diluční mikrometoda (mikrodiluční metoda) ...................................................... Provedení a vyhodnocení testu ............................................................................ Výhody a nevýhody diluční mikrometody ........................................................... Etest ...................................................................................................................... Provedení a vyhodnocení testu ............................................................................ Výhody, nevýhody a využití Etestu v praxi ......................................................... Genotypové metody stanovení rezistence ........................................................ Odhalování mutací spojených s rezistencí k AML .............................................. Výhody a nevýhody použití genotypových metod ..............................................

53 53 53 53 54 54 55 55 56 56 56 57 57 57 58 58 58 59 59 59 60

8. 8.1. 8.1.1. 8.1.2. 8.1.2.1. 8.1.2.2. 8.1.3. 8.1.4. 8.2. 8.2.1. 8.2.2. 8.2.2.1. 8.2.2.2. 8.2.2.3. 8.2.3. 8.2.4.

STANOVENÍ BAKTERIÁLNÍCH TOXINŮ (MVDr. Lenka Necidová, Ph.D.) ............. Toxiny Staphylococcus aureus ........................................................................... Stafylokokové enterotoxiny ................................................................................. Přímé metody detekce stafylokokových enterotoxinů ......................................... Imunologické metody .......................................................................................... Fyzikálně-chemické metody ................................................................................ Nepřímé metody detekce stafylokokových enterotoxinů ..................................... Využití v praxi ..................................................................................................... Toxiny Bacillus cereus ....................................................................................... Emetický toxin a diarhogenní enterotoxiny ......................................................... Přímé metody detekce toxinů B. cereus ............................................................... Imunologické metody .......................................................................................... Fyzikálně-chemické metody ................................................................................ Další přímé metody .............................................................................................. Nepřímé metody detekce toxinů B. cereus .......................................................... Využití v praxi .....................................................................................................

61 61 61 62 62 64 64 65 66 66 67 67 67 68 68 68

4

Obsah

8.3. 8.3.1. 8.3.2. 8.3.2.1. 8.3.2.2. 8.3.2.3. 8.3.3.

Toxiny Clostridium botulinum ........................................................................... Botulotoxiny ......................................................................................................... Metody detekce toxinů C. botulinum ................................................................... Průkaz botulotoxinu ............................................................................................. Identifikace typu botulotoxinu ............................................................................. Další metody ........................................................................................................ Využití v praxi .....................................................................................................

69 69 70 70 70 70 70

TYPIZAČNÍ METODY A JEJICH VYUŽITÍ PŘI EPIDEMIOLOGICKÉM ŠETŘENÍ ALIMENTÁRNÍCH ONEMOCNĚNÍ (doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D., Mgr. Petra Myšková) ........................................................... 9.1. Alimentární onemocnění ................................................................................... 9.2. Typizační metody ............................................................................................... 9.2.1. Sérotypizace ......................................................................................................... 9.2.1.1. Antigenní struktura .............................................................................................. 9.2.2. Fágová typizace .................................................................................................... 9.2.3. Rezistence k antimikrobiálním látkám ................................................................. 9.2.4. Makrorestrikční analýza a pulsní gelová elektroforéza (PFGE) .......................... 9.2.5. Sekvenční metody ................................................................................................ 9.3. Případové studie ................................................................................................. 9.3.1. Případová studie 1 ................................................................................................ 9.3.2. Případová studie 2 ................................................................................................ 9.3.3. Případová studie 3 ................................................................................................ 9.3.4. Případová studie 4 ................................................................................................

71 71 71 72 72 73 73 74 75 75 75 76 76 76

Použitá literatura ..............................................................................................................

77

9.

5

PŘEDMLUVA Mikrobiologická analýza má při výrobě potravin zcela nezastupitelnou roli. Význam mikroorganismů nespočívá pouze v otázce bezpečnosti potravin a ochrany konzumentů před možným vznikem alimentárního onemocnění, významná je také jejich úloha při výrobě a zpracování potravin, zejména fermentovaných výrobků, či naopak podíl na jejich kažení. Spolu se zvyšujícím se tlakem na produkci bezpečných a kvalitních potravin, vzrůstá i potřeba jednoduchých, rychlých a co nejvíce specifických metod detekce mikroorganismů, určených jako vhodná alternativa ke klasickému kultivačnímu vyšetření. Učební text je určen studentům navazujícího magisterského studijního programu Bezpečnost a kvalita potravin realizovaného na Fakultě veterinární hygieny a ekologie Veterinární a farmaceutické univerzity Brno. Cílem učebního textu bylo komplexním způsobem obsáhnout problematiku laboratorních metod používaných při mikrobiologickém vyšetření potravin a potravinových surovin. Jsou zde uvedeny všechny základní skupiny mikrobiologických metod – kultivační metody, systémy využívané při identifikaci mikroorganismů, mikroskopické metody, imunologické metody, molekulárně biologické metody a techniky používané při nepřímém stanovení mikroorganismů. V druhé části skript je zmíněna problematika rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám a metody stanovení jejich citlivosti, dále významné bakteriální toxiny a možnosti jejich stanovení v potravinách, a v neposlední řadě i typizační metody a jejich využití při epidemiologickém šetření. S některými metodami se posluchači již detailně seznámili v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody ve 2. ročníku bakalářského studijního programu Bezpečnost a kvalita potravin. Abychom předešly zbytečnému opakování, jsou tyto metody ve skriptech zmíněny pouze okrajově s odkazem na příslušné studijní materiály, ve kterých je tato problematika řešena podrobněji. Závěrem bychom rády poděkovaly recenzentkám MVDr. Marcele Faldynové, Ph.D. a RNDr. Danuši Lefnerové, Ph.D. za kritické a konstruktivní připomínky. Autorky

6

Kultivační metody

1. KULTIVAČNÍ METODY Zlatým standardem při hodnocení mikrobiologické kvality potravin stále zůstává, i přes velký rozvoj alternativních metod, kultivační vyšetření. Kultivační metody jsou obvykle metodami referenčními, umožňují jak kvantitativní tak kvalitativní stanovení. Cílem kvantitativních metod je stanovení počtu životaschopných buněk cílové skupiny mikroorganismů. Mezi základní techniky patří metoda zalití, metoda roztěru a metoda stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů (MPN, Most Probable Number). Stanovení počtu některých mikroorganismů (zejména patogenů) může být rozšířeno o krok resuscitace, jehož cílem je zachycení i stresovaných či subletálně poškozených buněk. Jednou z možností je např. využití membránových filtrů, které se po filtraci nejdříve krátce kultivují na neselektivním médiu a teprve poté se filtr umístí na selektivní agar (stanovení počtu Escherichia coli O157 v potravinách). Další možností je homogenizace vzorku v neselektivní či částečně selektivní tekuté půdě a jeho krátká resuscitace při laboratorní teplotě, jako je tomu např. při stanovení počtu Listeria monocytogenes. Kvalitativní stanovení je zaměřeno na průkaz přítomnosti či absence cílového mikroorganismu v dané navážce vzorku. Tento typ stanovení je časově i materiálově náročnější a obvykle probíhá v několika na sobě navazujících stupních – primární pomnožení (předpomnožení), sekundární pomnožení, izolace a konfirmace. Cílem předpomnožení (neselektivní tekuté médium) či primárního pomnožení (selektivní tekutá půda se sníženou koncentrací inhibičních složek) je mimo jiné resuscitace stresovaných či subletálně poškozených cílových buněk. Během sekundárního pomnožení se výrazně zvyšuje počet cílových mikroorganismů. Při stanovení některých mikroorganismů se využívá pouze jeden pomnožovací krok (např. stanovení termotolerantních druhů rodu Campylobacter). Pomnožený vzorek se izoluje na pevných selektivních či selektivně diagnostických agarech. Růst cílového mikroorganismu se projeví vznikem kolonií s typickou morfologií, příp. doplněnou o charakteristické změny živného média. Protože jenom velmi málo používaných diferenciálních živných médií je zcela specifických, je nejen při kvalitativním stanovení nezbytné provést vhodnými metodami konfirmaci suspektních kolonií cílových mikroorganismů. Problematika kultivačních metod a jejich využití v mikrobiologii potravin je detailně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie a skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení II. Metody stanovení mikroorganismů v potravinách).

Konvenční kultivační metody používané pro detekci mikroorganismů v potravinách jsou dobře zavedené, jednoduché, levné a mohou být použity pro kvantitativní i kvalitativní analýzu. Mezi jejich nevýhody, zejména při stanovení patogenních mikroorganismů, patří nezbytnost kultivace v několika různých živných médiích, detekce růstu vizuálně a potřeba provedení konfirmačních testů (biochemických a serologických). To má za následek zvýšenou pracnost, subjektivní hodnocení výsledků a zejména dlouhou dobu stanovení. Zkrácení doby stanovení a snížení požadavků na laboratorní vybavení lze dosáhnout použitím alternativních neboli rychlých metod. Mezi tzv. rychlé metody lze zařadit celou řadu technologií založených na mikroskopii, měření ATP (adenosintrifosfátu), monitoringu metabolické aktivity elektrickým měřením, stanovení nukleových kyselin či imunologii. Protože v poslední době došlo k výraznému zvýšení kvality, výkonnosti a komerční dostupnosti těchto metod, jsou rychlé metody v praxi stále více využívány. Na druhou stranu nemohou rychlé metody kompletně nahradit kultivační vyšetření, a to zejména při stanovení patogenních mikroorganismů. Je obvyklé, že se kultivační i rychlé metody používají v kombinaci, kdy např. rychlá metoda nahradí jeden krok kultivačního stanovení. 7

Kultivační metody

1.1. Vybrané komerční kultivační soupravy Jednou z možností zjednodušení klasického kultivačního vyšetření je použití tenkých rehydrovatelných kultivačních filmů (např. Petrifilm™, výrobce 3M), které jsou tvořeny dvěma plastickými filmy potaženými vysušeným kultivačním médiem a dehydratovaným gelovým činidlem rozpustným studenou vodou. Po odkrytí horního filmu (krycí folie) se 1 ml vzorku přidá do středu spodního filmu. Inokulum se horním filmem opatrně překryje a následně se roztlačí kruhovým tvořítkem do požadované plochy. Tím dojde k rehydrataci živného média a vytvoří se podmínky vhodné pro růst mikroorganismů. Kultivační podmínky se volí s ohledem na stanovované mikroorganismy. Kultivační rehydratovatelné filmy jsou vhodné pro stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM), různých indikátorových mikroorganismů i některých patogenů (např. S. aureus, Listeria spp.). Na trhu jsou dále dostupné různé formy otiskových nosičů či kontaktních Petriho misek. Otiskové nosiče (tzv. dipslides) nabízí celá řada firem – Orion Diagnostica (Hygicult®), Merck Millipore (řada Cult Dip), Oxoid Ltd., HiMedia Laboratories (řada HiDip Slide®), Accepta, atd. Obvykle se jedná o ohebný plastový nosič, který je z obou stran potažen živným médiem a umístěn ve sterilní šroubovatelné zkumavce. Vzorkování se nejčastěji děje otiskem živného média na testovaný povrch, možné je i ponoření nosiče do vyšetřované tekutiny, případně nanesení vzorku sterilním tamponem. Díky uzavření nosiče ve sterilní zkumavce jsou dipslidy lehce použitelné přímo v potravinářském provozu. Spektrum vyšetření je obvykle omezeno na indikátorové skupiny mikroorganismů. Některé sety jsou určeny pro stanovení MPN. Jedná se např. o systém SimPlate® (výrobce BioControl), což je speciálně tvarovaná kruhová plastová miska s velmi malými jamkami. Před nalitím do misky se vzorek smíchá s kultivačním médiem. V průběhu inkubace je chromogenní substrát obsažený v živném médiu hydrolyzován cílovými bakteriemi. Po ukončení inkubace se hodnotí počet jamek se změnou barvy a odhadne se hodnota MPN. Systém SimPlate umožňuje stanovení CPM, kvasinek a plísní, Enterobacteriaceae, koliformních bakterií/E. coli, Campylobacter spp. Pro stanovení koliformních bakterií, resp. E. coli ve vodě lze využít systém Colilert® (výrobce IDEXX Laboratories). Systém je tvořen speciálně tvarovanou deskou s komůrkami, do kterých se nalije směs vzorku a kultivačního média. Kultivační médium obsahuje chromogeny a fluorogeny. Přítomnost sledovaných mikroorganismů je indikována změnou barvy, fluorescencí (E. coli) a tvorbou plynu. Po ukončení inkubace je spočítán počet pozitivních komůrek a odhadnuta hodnota MPN. Ke stanovení enterokoků ve vodách lze využít podobný systém Quanti-Tray® (výrobce IDEXX Laboratories).

1.2. Systém TEMPO Při vyšetření vzorků potravin a tekutin s očekávanou nízkou úrovní kontaminace mikroorganismy, se již více než 100 let používá metoda stanovení nejpravděpodobnějšího počtu mikroorganismů. Metoda MPN patří mezi základní techniky stanovení počtu mikroorganismů při použití tekutých půd. Je založena na pravděpodobnosti záchytu mikroorganismů ze vzorku. Hodnota MPN se odečítá v tabulkách, kde jsou statisticky vypočteny nejpravděpodobnější hodnoty odpovídající počtu záchytů, tj. počtu pozitivních zkumavek ve třech po sobě jdoucích sériích ředění vzorku, pro daný počet očkovaných zkumavek v každé sérii. Klasické provedení je tří- či pětizkumavkový test. V roce 2007 uvedla firma bioMérieux na trh systém TEMPO – miniaturizovaný systém stanovení MPN. TEMPO je plně automatizovaný test založený na enzymatickém principu. Je určen pro přímé stanovení počtu vybraných mikroorganismů v potravinách.

8

Kultivační metody

1.2.1. Základní principy Systém TEMPO se skládá ze tří komponent – TEMPO kitu, plničky (tzv. filler) a čtečky (tzv. reader). TEMPO kit tvoří vialka s kultivačním médiem, do které se v průběhu testu přidává homogenát vyšetřované potraviny (ředění 10-1), a specifická karta. Vialka obsahuje lyofilizované kultivační médium, které musí být před inokulací vzorku resuspendováno v destilované vodě. Kultivační médium je po naočkování testovaným vzorkem v plničce automaticky přeneseno do specifické karty, která obsahuje 3 sady jamek po 16, vždy s jedním logaritmem rozdílu v objemu každé sady (první sadu tvoří 16 malých jamek; druhou sadu 16 větších jamek, které mají 10ti násobný objem oproti první sérii; třetí sérii 16 velkých jamek, které mají 10ti násobný objem oproti druhé sérii). Vialka i karta jsou opatřeny unikátním čárovým kódem, který slouží k přesné identifikaci jednotlivých vzorků a vylučuje jejich záměnu. Plnička je vlastně vakuová komora, ve které dochází k naplnění karet směsí ve vialce. Inkubace vzorků probíhá v běžném termostatu. K odečtu výsledků se používá čtečka. Součástí obou přístrojů (plničky i čtečky) jsou počítače vybaveny specifickým softwarem. Oba přístroje jsou vzájemně propojeny pomocí bezdrátové sítě a dochází mezi nimi k automatickému přenosu dat.

Obrázek 1: TEMPO specifická karta.

Při inkubaci karet dochází k růstu přítomných mikroorganismů, které metabolizují živiny z kultivačního média. K detekci přítomnosti mikroorganismů (pozitivní záchyt) v systému TEMPO může docházet dvojím způsobem. První možností je pokles pH, k němuž dochází při metabolizaci živin z kultivačního média, a současné vymizení fluorescenčního signálu vyzařovaného 4-methylumbeliferonem (4MU). Signál je snímačem TEMPO detekován díky fluorescenčnímu indikátoru pH pouze tehdy, je-li pH neutrální. Tento způsob vyhodnocení se používá např. při stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM). Druhá možnost detekce je založena na specifické enzymatické aktivitě stanovovaných bakterií. Při tomto způsobu dochází k enzymatickému odštěpení látky z vazby na 4MU, jenž se stává fluorescentní. Pozitivní jsou v tomto případě jamky vyzařující fluorescenční signál. Tento způsob vyhodnocení se používá např. při stanovení E. coli. Na základě počtu pozitivních zkumavek v každé řadě získáme stejně jako u klasické metody MPN trojciferný kód, který je přístrojem automaticky vyhodnocen. Konečný výsledek, včetně zohlednění stupně ředění vzorku, je uveden přímo v KTJ (kolonie tvořící jednotky, angl. Colony Forming Unit, CFU) na gram vyšetřované potraviny.

1.2.2. Provedení a vyhodnocení testu Počáteční příprava vzorku zahrnuje jeho homogenizaci v pufrované peptonové vodě (10 g a 90 ml, resp. 25 g a 225 ml, tj. ředění 10-1). Následuje resuspendace živného média ve vialce sterilní destilovanou vodou, její množství se volí podle požadovaného finálního ředění vzorku (3 ml – ředění 1:40 nebo 3,9 ml – ředění 1:400). Obsah vialky důkladně promícháme na vortexu. Homogenizovaný vzorek se asepticky dávkuje do vialky v množství 1 ml (finální ředění 1:40) nebo 0,1 ml (finální ředění 1:400), obsah vialky se opět důkladně promíchá. Následuje načtení čárového kódu vialky a načtení prázdné karty pomocí čtečky čárových kódů, jenž je součástí TEMPO systému. Po zanesení údajů do systému a jejich zobrazení na počítači, který je součástí plničky, lze doplnit název vzorku a jeho ředění (1:40 nebo 1:400,

9

Kultivační metody

příp. i vyšší). Karta i vialka se vloží do speciálního stojánku tak, aby nasávací trubička karty byla ponořena do vialky. Stojánek se následně umístí do plničky, po jejím spuštění je vzorek pod tlakem automaticky rozplněn do všech 48 jamek na kartě. Po naplnění karty je nasávací trubička automaticky odříznuta a zatavena. Před umístěním stojánku do inkubátoru se provádí vizuální kontrola, zda opravdu došlo k nasátí vzorku do karty. Inkubační podmínky se volí podle požadavků stanovovaných mikroorganismů. Po ukončení inkubace se karty přenesou do readeru, který hodnotí v každé jamce vznik (příp. zánik) fluorescence a automaticky vypočítá hodnotu MPN. Během několika minut je výsledek získaný na základě zohlednění ředění zobrazen v počítači v přehledné tabulce přímo v KTJ/g potraviny. Přístroj umožňuje i přímé vytištění výsledků nebo jejich transport do uživatelského PC.

1.2.3. Výhody, nevýhody a využití metody TEMPO v praxi Metoda TEMPO je plně automatizovaná s minimem nároků na obslužný personál. Její provedení je velmi jednoduché, výrobce uvádí maximální kapacitu více než 500 vyšetření za den. Je vhodná pro laboratoře, které pravidelně vyšetřují větší počty vzorků. Stanovené výsledky mají výbornou korelaci s klasickou metodou MPN. Určitou nevýhodou mohou být investiční náklady na pořízení nezbytného přístrojového vybavení a následně i cena TEMPO kitů. Metodu lze využít pro vyšetření celé řady mikroorganismů zahrnujících jak patogenní, tak indikátorové a technologicky významné mikroorganismy. V současné době jsou dostupné kity pro stanovení CPM, koliformních bakterií, E. coli, kvasinek a plísní, bakterií mléčného kvašení a koagulasa pozitivních stafylokoků.

10

Systémy identifikace mikroorganismů

2. AUTOMATIZOVANÉ SYSTÉMY VYUŽÍVANÉ PŘI IDENTIFIKACI MIKROORGANISMŮ Velmi oblíbenými identifikačními nástroji v mikrobiologii jsou automatizované systémy, které velmi rychle poskytují výsledek. Doplňují ostatní mikrobiologické metody běžně používané v laboratořích.

2.1. Systém VITEK®

Systém VITEK® (výrobce bioMérieux) je rychlý, plně automatizovaný systém umožňující identifikaci mikroorganismů současně se stanovením jejich citlivosti k antimikrobiálním látkám. Nachází široké uplatnění v řadě oborů. VITEK byl vyvinut koncem 60-tých let minulého století pro NASA a byl určen pro přímou detekci a identifikaci patogenů ve vzorcích moči kosmonautů. Původní systém byl označován jako MLM (Microbial Load Monitor). Koncem 70-tých let byl firmou MacDonell Douglas uveden na trh automatický systém označovaný jako Auto Microbic System určený pro klinickou mikrobiologii. Byl schopen identifikovat devět nejčastějších patogenů močového ústrojů. V roce 1977 se vytvořila samostatná divize Vitek Systems, po níž získal přístroj své konečné označení. Postupně se také rozšiřovala použitelnost systému v různých odvětvích průmyslové mikrobiologie. Novou generaci představuje modernizovaný systém VITEK® 2, který byl na trh uveden v roce 2007. Opět se jedná o plně automatizovaný systém umožňující současnou identifikaci mikroorganismů a stanovení jejich citlivosti k antimikrobiálním látkám. Úplnou novinkou je systém VITEK® MS. Identifikace mikroorganismů je zde založena na principu hmotnostní spektrometrie (MALDI-TOF), výsledky jsou k dispozici během několika minut.

2.1.1. Základní principy Systém VITEK® je integrální modulární systém skládající se z několika základních komponent. První z nich je identifikační karta (ID card) – tenká plastová karta obsahující 30 malých jamek naplněných různými dehydrovanými biochemickými substráty. Zastoupení jednotlivých biochemických testů odpovídá testované skupině mikroorganismů. K plnění identifikačních karet připravenou suspenzí mikroorganismu dochází v jednotce označované jako plnička (filler), což je v podstatě vakuová komora, do které se ve speciálním stojánku umístí identifikační karta a vialka s připravenou suspenzí. Po naplnění karty, je dávkovací trubička uříznuta a zatavena, čímž dojde k úplnému uzavření identifikační karty. Další jednotku představuje inkubátor s readerem. Identifikační karty jsou inkubovány obvykle při teplotě 35 – 37 °C. Každou hodinu je spektrofotomericky hodnocena změna barvy či tvorba zákalu uvnitř jamek na kartě. Současně je posuzována i produkce plynu. Celková doba stanovení se pohybuje v rozmezí 4 až 12 hodin. Tyto informace jsou přenášeny do počítače, kde jsou zpracovány. Výsledky biochemických testů jsou porovnány s databází známých kultur a následně je provedena identifikace testovaného mikroorganismu. Součástí vybavení počítače je i tiskárna. Při identifikaci mikroorganismů jsou využívány následující databáze známých kultur: gramnegativní mikroorganismy (GNI), grampozitivní mikroorganismy (GPI), bakterie rodu Bacillus (BAC), anaerobní mikroorganismy (ANI), kvasinky (YBC), nefermentující mikroorganismy (NFC) a rody Neisseria/Haemophilus (NHI). Při stanovení citlivosti k antimikrobiálním látkám se používají speciální karty (tzv. AST cards) obsahující více než 40 látek. Výsledky jsou vyjádřeny hodnotou MIC (minimální inhibiční koncentrace).

11


2.1.2. Výhody, nevýhody a využití systému VITEK® v praxi Jednoznačnou výhodou systému VITEK® je jednoduché a velmi rychlé provedení testu, výsledky identifikace jsou známy během několika hodin. Systém je plně automatizovaný, umožňuje současné stanovení velkých sérií vzorků. Nevýhodou jsou samozřejmě vyšší investiční náklady na pořízení nezbytného vybavení a do jisté míry i cena stanovení. Z tohoto důvodu nelze VITEK® doporučit do laboratoří s velmi malým počtem vyšetřovaných vzorků. Mimo širokého využití v klinické diagnostice se systém VITEK® používá také k hodnocení farmaceutických a kosmetických výrobků a potravin, kde nachází uplatnění zejména při stanovení patogenních mikroorganismů (Salmonella spp., Listeria monocytogenes, atd.). Velké využití má také při identifikaci klinicky významných multirezistentních bakterií.

2.2. Systém Biolog Pro identifikaci a charakterizaci mikrobiologických kultur vyvinula firma Biolog, Inc. systém Biolog – rychlý a levný prostředek pro získání velkého množství informací o analyzovaných mikroorganismech.

2.2.1. Základní principy Princip tohoto identifikačního systému spočívá ve schopnosti mikroorganismů metabolizovat sacharidové substráty umístěné v 96-ti jamkové mikrotitrační destičce. Pokud naočkované mikroorganismy mají enzymy schopné metabolizovat dané substráty, dochází k uvolnění elektronů ze substrátu a probíhá oxidace. Tyto elektrony přijímá barvivo trifenyltetrazoliumchlorid (TTC), čímž se redukuje a dochází ke vzniku trifenylformazanu (TPF), reakce je doprovázena změnou barvy. Dostatečné množství buněk v jamce mikrodestičky tak zajišťuje pozorovatelnou barevnou změnu. Tímto způsobem každý mikroorganismus získá specifický kód, díky kterému je identifikován. Postup analýzy je jednoduchý. Nejdříve se na agaru izoluje čistá kultura, poté se připraví inokulum o předepsané koncentraci buněk a naočkuje se vhodná mikrotitrační destička. V průběhu času dochází při inkubaci k vývoji barvy v jednotlivých jamkách podle toho, jak mikroorganismus využívá jednotlivé substráty. Po inkubaci je mikrodestička umístěna do mikrostanice pro analýzu, kde reader odečte absorbanci (k odečtům je použito dvou vlnových délek, 590 nm a 750 nm). Výsledky jsou zaznamenány a srovnány s širokou databází mikroorganismů, ve které je uloženo přes 2000 druhů. Systémy existují manuální (MicroLog), poloautomatické (MicroStation) – zahrnující kromě softwaru i identifikační reader, a plně automatické – systém OmniLog® (software, inkubátor/reader).

2.2.2. Výhody, nevýhody a využití systému Biolog v praxi Výhodou systému Biolog je rychlá a poměrně přesná identifikace mikroorganismů díky široké škále biochemických reakcí obsažených v mikrodestičce a komplexní databázi mikroorganismů (bakterie, kvasinky, plísně). Nevýhodou tohoto systému je možnost identifikace pouze kultivovatelných mikroorganismů, pro vhodný výběr panelu testů se musí předem nadefinovat, o jakou skupinu mikroorganismu se jedná. Dále je zde potenciální riziko křížových reakcí, u manuální verze není možné měřit absorbanci (vyhodnocení je vizuální). Původně měl systém Biolog sloužit pro snadnou identifikaci klinicky významných bakterií. Nyní jsou mikrodestičky vyvinuty pro různé skupiny mikroorganismů – aerobní bakterie, anaerobní bakterie, grampozitivní bakterie, gramnegativní bakterie, kvasinky a plísně. V nejnovější verzi tohoto systému lze identifikovat na stejném panelu jak grampozitivní, tak gramnegativní bakterie zároveň, a tím odpadá před vlastní analýzou barvení dle Grama a další testování pro výběr vhodného panelu substrátů.

12


Kromě identifikace mikroorganismů má systém Biolog také možnost sledovat funkční diverzitu mikrobiálních společenstev se speciálními testovacími panely pro ekologické a ekotoxikologické studie.

2.3. Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF Rychlou a velmi přesnou identifikaci a typizaci mikroorganismů poskytuje hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem (MALDI-TOF MS, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry). Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF patří mezi chemotaxonomické metody. Proces identifikace je založen na analýze ribosomálních a dalších proteinů v buňce. Ribosomální proteiny představují asi 20 % veškerých buněčných bílkovin a asi 3 % celkové hmoty. Tyto makromolekuly jsou specifické pro jednotlivé bakteriální druhy a díky tomu mohou být považovány za vhodné biomarkery. Hmotnostní spektrometrie je vysoce citlivá analytická technika s detekčními limity řádově až desetiny femtomolů.

Obrázek 2: Schéma přístroje MALDI-TOF MS.

2.3.1. Základní principy Jedná se o šetrnou ionizační metodu, kdy biomolekuly (proteiny buněčných extraktů) nejsou po ataku laseru štěpeny, ale pouze ionizovány pomocí matrice (obrázek 3). Nejčastěji se využívají dusíkové UV lasery, v menší míře infračervené (IR) lasery. Ozáření o vlnové délce 337 nm trvá 4 ns. Matrice zajistí kontakt analyzované molekuly s laserem tak, aby biomolekula nebyla atakována přímo a štěpena nežádoucím způsobem. Matrice dále zprostředkovává přenos energie, kdy excitované molekuly matrice za vysokého tlaku ionizují molekuly analytu (biomolekuly) přenosem protonu. Ionty, které přešly do plynné fáze, postupují přes silné elektrické pole, ve kterém jsou urychleny a zaostřeny. Vstoupí do vakuové trubice hmotnostního analyzátoru doby letu (TOF, Time of Flight), kde se pohybují

Obrázek 3: Schéma ionizace.

13


rychlostí úměrnou jejich hmotnosti a náboji (obrázek 2). Měří se doba letu částice, lehčí či více nabité ionty dorazí k detektoru dříve než těžší nebo méně nabité. Detektor je propojen s počítačem a pomocí softwaru jsou data zpracována. Pro každý kmen je vytvořeno hmotnostní spektrum, neboli profil jeho proteomu. Toto hmotnostní spektrum je zobrazením četnosti ionizovaných částic buněčného proteomu. Profily proteinů jsou pro daný druh mikroorganismu vysoce charakteristické. Vlastní identifikace mikroorganismů následně spočívá ve srovnávání Obrázek 4: Dendrogram vytvořený na základě MALDI-TOF MS proteinového spektra izolátu profilů. (autor O. Šedo) se spektry referenčních kmenů v databázi MALDI Biotyper. Z matice podobnosti spekter se provádí klastrová (shluková) analýza. Shluky podobnosti se zobrazují jako dendrogram (obrázek 4). Na základě získaného dendrogramu je založena klasifikace v rámci rodu, druhu, a v některých případech i poddruhu či typizace kmene. Míra spolehlivosti identifikace (podobnost izolátu s referenčním kmenem v databázi) se vyjadřuje jako log(score). Pokud je log(score) vyšší než hodnota 2,3, jedná se o vysoce pravděpodobnou identifikaci na úrovni druhu. Log(score) v rozmezí 2,3 – 2,0 potvrzuje vysoce pravděpodobnou identifikaci na úrovni rodu a pravděpodobnou identifikaci na úrovni druhu. Pravděpodobnou identifikaci na úrovni rodu mají kmeny s log(score) 2,0 – 1,7. Výsledky s hodnotami pod 1,7 nejsou signifikantní. Samotná analýza je velmi rychlá a výsledky jsou možné získat během několika minut. 2.3.1.1. Příprava izolátů Příprava izolátů pro analýzu MALDI-TOF MS je velmi jednoduchá. Analyzovat se mohou celé buňky nebo jejich extrakty. Nejrychlejším způsobem je nanesení mikroorganismů vykultivovaných na agaru či v bujónu, promytých deionizovanou vodou a s přídavkem matrice, přímo na MALDI destičku. Buněčné proteiny je doporučeno extrahovat zejména u grampozitivních bakterií vzhledem ke struktuře jejich buněčné stěny (silná vrstva peptidoglykanu) např. působením enzymů lysozymu či lysostaphinu, chemických rozpouštědel (ethanolu, acetonitrilu, směsi chloroform-methanol), ultrazvukové sonikace či tepelného záhřevu. Čisté 24 hodinové bakteriální kultury jsou resuspendovány a inaktivovány v 75% ethanolu. Po centrifugaci a důkladném odstranění supernatantu je k buňkám přidána matrice v poměru 1:104. Matrice musí absorbovat vlnovou délku použitého laseru, musí být fotostabilní a tvořit malé krystaly. Nejčastěji se používají deriváty kyseliny benzoové či skořicové. Výběr vhodné matrice je zcela zásadní pro kvalitu analýzy. Jako rozpouštědlo se používá acetonitril, aceton či organická kyselina ve směsi s vodou a pro zvýšení

14

Obrázek 5: MALDI destička. (autor O. Šedo)


kvality signálu je přidávána kyselina trifluoroctová (TFA) či mravenčí (FA). Směs je nanášena na speciální destičku z nerezové oceli či hliníku, která je inertní vůči matrici a rozpouštědlům. Na této kovové destičce se může analyzovat až 384 izolátů. Po vysušení vzorků při pokojové teplotě je destička umístěna do hlubokého vakua (10-4 Pa) v iontovém zdroji hmotnostního spektrometru a proběhne analýza MALDI-TOF MS. Po analýze se MALDI destička důkladně vyčistí a tím je připravena k dalšímu použití.

2.3.2. Výhody a nevýhody metody MALDI-TOF MS Tato metoda má velké přednosti díky levnému provozu, snadnosti a rychlosti provedení, vysoké rozlišovací schopnosti, snadné reprodukovatelnosti a možnosti analyzovat velký počet izolátů najednou. Pro analýzu je potřeba velmi malé množství vzorku. Je aplikovatelná pro široké spektrum mikroorganismů a obejde se bez předchozí charakteristiky izolátu a jeho zařazení do určité skupiny. Limitujícím faktorem této metody je identifikace druhů mikroorganismů, které nejsou obsaženy v databázi. Avšak hmotnostní spektra nových referenčních kmenů se neustále do databáze doplňují. Mezi další nevýhody patří vysoké pořizovací náklady přístrojového vybavení a komplikovaná identifikace některých fylogeneticky příbuzných druhů bakterií či směsných kultur.

2.3.3. Využití metody MALDI-TOF MS v praxi Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF byla v nedávné době zavedena do rutinní mikrobiologické diagnostiky. MALDI-TOF MS se začíná úspěšně využívat v různých oblastech mikrobiologie, nejen v klinické praxi. Metodou lze identifikovat bakterie, kvasinky a plísně izolované z různých biologických materiálů, potravin i vzorků prostředí. Stává se klíčovým nástrojem v rámci kontroly bezpečnosti potravin. Mikroorganismy lze identifikovat nejen do rodu, ale také na druhové úrovni a v některých případech i na úrovni poddruhů. MALDI-TOF MS lze snadno a rychle identifikovat nejen patogenní bakterie izolované z potravin, jako jsou E. coli O157:H7, Yersinia spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., jednotlivé druhy listerií včetně L. monocytogenes, Clostridium spp., Bacillus cereus, Staphylococcus aureus (včetně rozlišení meticilin rezistentních – MRSA, od meticilin senzitivních kmenů S. aureus), Enterococcus spp., ale také technologicky významnou avšak na identifikaci komplikovanou skupinu bakterií mléčného kvašení a další mikroorganismy. Hmotnostní spektrometrií MALDI-TOF se mohou analyzovat také rekombinantní proteiny, proteiny faktorů virulence, proteiny sporových stěn a S-vrstvy, enzymy, metabolity, bakteriociny, atd.

2.4. Biosenzory Biosenzor je analytický přístroj s velmi širokým využitím. Uplatňuje se v humánní i veterinární medicíně, farmaceutickém a potravinářském průmyslu, zemědělství, životním prostředí, atd. Pomocí biosenzorů jsou zkoumány interakce protilátka-antigen, DNA-DNA, DNA-protein, receptor-ligand, protein-ligand a mnoho dalších interagujících dvojic. Studium biosenzorů spadá do několika vědních oborů – biochemie, biotechnologie, analytická a fyzikální chemie, elektronika, informatika, nauky o materiálech a biologie.

2.4.1. Základní principy Biosenzor má dvě hlavní části (obrázek 6). Biorekogniční část – citlivý prvek biologického původu, který má za úkol styk s testovaným vzorkem (analytem). Biorekogniční část je buď součástí, nebo v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Ten převádí biologický nebo biochemický signál na měřitelný a kvantifikovatelný elektrický nebo optický 15


signál vhodný k dalšímu zpracování. Signál je přímo úměrný koncentraci stanovovaných látek ve vzorku. Samotné měření může probíhat buď v uzavřené nádobce, v průtočném systému nebo přímo v kontaktu Obrázek 6: Schéma složení biosenzoru. s analytem. Měření v uzavřené nádobce je velmi jednoduché a nenáročné na vybavení, avšak je potřeba manuální obsluha. Průtočné systémy měření mohou být automatizovány. Vzorek může být v průtočné cele měřen neředěný či ředěný. Pokud se biosenzor nachází přímo ve sledovaném prostředí (tkáň, krevní řečiště, fermentor), neměla by jeho přítomnost ovlivnit koncentraci analytu a snížit jeho množství v důsledku měření. 2.4.1.1. Biorekogniční část Biorekogniční část biosenzoru může být buď biokatalytická nebo bioafinitní. Pokud je analyt přeměněn v průběhu chemické reakce, obvykle vystupuje jako substrát enzymové reakce, jedná se o biokatalytický typ (biologickým prvkem je např. enzym, organela, buňka, tkáň, orgán, mikroorganismus). V případě, že je analyt specificky vázán ve vznikajícím afinitním komplexu, biorekogniční část je bioafinitní (např. lektin, protilátka, nukleová kyselina, receptor). Nejčastěji využívanou biorekogniční složkou je enzym. Ten katalyzuje přeměnu substrátu v produkt, který se může stát zároveň markerem pro elektrochemický převodník. Další rozšířenou biorekogniční složkou je protilátka, která je pevně imobilizovaná na povrch převodníku. Tento typ biosenzoru velmi připomíná techniku ELISA s tím rozdílem, že vzniklý imunokomplex je detekován pomocí převodníku, nikoliv pomocí kolorimetrické změny. Velké využití se nabízí u kombinace protilátek s křemíkovým typem převodníků – tzv. Guartz Crystal Microbalance. Mikroorganismy patří mezi velmi výhodnou biologickou složku biosenzorů. Používají se buňky bakterií (např. Bacillus subtilis, B. licheniformis), sinic, kvasinek či plísní. Mohou nahradit antigeny, enzymy, proteiny (pokud jsou exprimovány na povrchu buňky), což zjednodušuje a zvyšuje efektivitu výroby biosenzoru. 2.4.1.2. Fyzikálně-chemický převodník Pro sestavení biosenzorů se používá celá škála fyzikálně-chemických převodníků. Mohou být: - elektrochemické, tyto nejrozšířenější převodníky měří změnu napětí (amperometrie), odporu (konduktometrie), proudu (voltametrie) či elektromotorického napětí (potenciometrie); jsou velmi citlivé, levné a jednoduché ke konstrukci, - optické převodníky jsou založeny na detekci změn ve světelné adsorpci nebo emisi během reakce biorekogniční složky analytu, uplatňuje se fotometrie, fluorimetrie, luminometrie a nelineární optika, - kalorimetrické převodníky využívají změnu teploty v průběhu enzymatických reakcí, - akustické, - piezoelektrické převodníky, kde se využívá křemíkový krystal, který kmitá na určité frekvenci v závislosti na převedeném napětí. Pokud je změněna hmotnost krystalu (např. navázáním určitých látek), posouvá se i frekvence oscilace krystalu a z této změny lze určit nárůst hmotnosti na krystalu. Tento typ převodníků se využívá např. při detekci Salmonella Typhimurium.

16


2.4.2. Výhody a nevýhody biosenzorů Přednostmi biosenzorů jsou vysoká citlivost a selektivita, měření bez speciálních reagencií, rychlost analýzy, nízké náklady a snadná obsluha. Analýzy probíhají v reálném čase. Častou výhodou biosenzorů je jejich malá velikost a přenositelnost, tudíž stačí relativně malé množství vzorku a potřebných chemikálií pro analýzu. Velkým problémem je sterilizace biosenzorů. Některé typy pracují jen v úzkém rozsahu koncentrace analytu, mají pomalou odezvu, jsou citlivé na elektrický šum a jejich miniaturizace může mít vliv na velikost signálu. Při použití enzymů se obvykle liší optimální provozní pH enzymu od pH prostředí.

2.4.3. Využití biosenzorů v praxi V dnešní době nacházejí biosenzory uplatnění zejména v medicíně. V klinické diagnostice se používají pro detekci různých metabolických produktů, složek krve, ale i k identifikaci patogenních mikroorganismů. Snad úplně nejrozšířenějším biosenzorem je glukosový biosenzor pro kontrolu hladiny glukosy v krvi diabetiků. Velký potenciál využití biosenzorů je i v potravinářství při kontrole kvality potravin. Pomocí biosenzorů lze stanovit např. sacharidy, lipidy, vitaminy, ale také alergeny, rezidua inhibičních látek, antibiotika, růstové stimulátory, pesticidy či methanol. Mezi důležité aplikace patří detekce alimentárních patogenů jako Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157:H7, S. aureus, dále bakteriálních toxinů (např. stafylokokové enterotoxiny typ A a B), mykotoxinů (např. aflatoxin) a biogenních aminů (např. histamin, putrescin). Navzdory velkému rozvoji biosenzorů, jen málo systémů je komerčně vyráběných právě pro oblast analýzy potravin. Na trhu jsou k dispozici následující biosenzory určené pro detekci bakterií: Midas Pro (výrobce Biosensori SpA), Malthus 2000 (výrobce Malthus Instruments) Unilite (výrobce Biotrace) a BIACORE (výrobce Swedish BIACORE AB). V oblasti ochrany životního prostředí jsou biosenzory využívány zejména ke sledování znečištění zdrojů pitné vody a vodních toků (např. polyaromatickými uhlovodíky). Dále k monitorování půdní mikroflóry a metabolické aktivity těchto mikroorganismů. V biotechnologiích nacházejí biosenzory uplatnění při řízení procesů a při kontrole jakosti produktů (např. nežádoucí kontaminace). V neposlední řadě se biosenzory uplatňují také v armádě. Pokud má být biosenzor vhodný k použití v praxi, musí splnit následující kritéra: dostatečná selektivita pro účely dané analýzy, dostatečná stabilita v průběhu analýzy, reakce probíhající v biosenzoru by měla být nezávislá na fyzikálních parametrech (pH, teplota, atd.) což umožňuje provádět analýzu bez předchozí úpravy vzorku. Odpověď senzoru by měla být přesná, reprodukovatelná a lineární v co nejširším rozsahu koncentrací, aby nebylo nutné vzorek ředit. Biosenzor použitelný v biotechnologiích by měl být sterilizovatený (např. v autoklávu).

17

Mikroskopické metody

3. MIKROSKOPICKÉ METODY Mikroskopické hodnocení je jedním ze základních postupů při analýze mikrobiální populace a hraje důležitou roli i v mikrobiologii potravin. Mimo klasických mikroskopických metod využívajících světelnou mikroskopii, nachází stále větší uplatnění i metody moderní – fluorescenční či elektronová mikroskopie. V uvedeném textu se zaměřujeme na metody nejvíce využívané při mikrobiologickém vyšetření potravin a potravinových surovin – přímou epifluorescenční filtrační techniku (Direct Epifluorescent Filter Technique, DEFT) a průtokovou cytometrii (Flow Cytometry, FC). Obě techniky využívají spojení optické metody v kombinaci se specifickým či nespecifickým barvením mikroorganismů fluorescenčními barvivy. DEFT se opírá o přímé mikroskopické pozorování mikroorganismů, oproti tomu průtoková cytometrie kombinuje optické, fluidní a elektronické technologie při detekci a charakterizaci jednotlivých buněk či dalších malých částic. Některé průtokové cytometry jsou schopné třídit či fyzicky izolovat buňky či částice s definovanými vlastnostmi. Komerčně se tato technologie využívá od 70. let minulého století. Lze však diskutovat o tom, zda je průtoková cytometrie pravou mikroskopickou technikou, protože při ní nemusí docházet ke zdánlivému zvětšení organismů a jejich pozorování pouhým okem.

3.1. Fluorochromy a sondy používané v mikroskopii 3.1.1. Fluorochromy Některé mikroskopické techniky využívají pro odlišení vybraných buněk fluorescenční barviva. Fluorochromy mohou být použity dvojím způsobem: buď díky svým chemickým vlastnostem přímo reagují s cílovými molekulami (DNA, RNA, bílkoviny, lipidy) nebo se používají ke značení molekulárních sond, jako jsou protilátky či oligonukleotidy. Základní vlastností všech fluorochromů je schopnost absorbovat a emitovat světlo o specifické vlnové délce. Po absorpci světelné energie se fluorochromy dostávají do nestabilního excitovaného stavu, kdy jsou elektrony posunuty do vyšší energetické hladiny. Při návratu elektronů do stabilního neexcitovaného stavu dochází k uvolnění energie ve formě emitovaného světla. Vlnová délka použitá k excitaci fluorochromu je vždy kratší (vyšší energie) než vlnová délka světla emitovaného (nižší energie). Vlastnosti jednotlivých fluorochromů jsou určující pro konfiguraci měřicích přístrojů. V případě průtokové cytometrie se obvykle k excitaci používá laser, ve fluorescenční mikroskopii rtuťové či xenonové lampy. 3.1.1.1. Využití fluorochromů při vitálním barvení Vhodné fluorochromy můžeme využít i k hodnocení vitality mikrobiálních buněk. Jedním z nich je např. akridinová oranž – fluorescenční barvivo s afinitou k nukleovým kyselinám. Při vazbě na jednořetězcovou RNA vzniká červenooranžová fluorescence (mrtvé buňky), při vazbě na dvouřetězcovou DNA fluorescence zelená (živé buňky). Vzniklá barva však může být ovlivněna složením média, ve kterém došlo k resuspendaci buněk, či úrovní zpracování vzorku. Další kategorii indikátorů životaschopnosti tvoří redoxní sondy, které jsou založeny na přítomnosti fungujícího elektronového transportního systému. Redoxní sondy přijímají elektrony ze složek elektronového transportního systému respirujících buněk a hromadí se uvnitř buňky jako nerozpustné chromogeny či fluorescenční deriváty.

18


Řada vitálních barviv je založena na integritě buněčné membrány. Vyloučení určitých barviv intaktní membránou je ukazatelem životaschopnosti, zatímco pronikání barviva je známkou poškození a omezené vitality buňky. Jedná se např. o fluorescenční barviva propidium jodid či fluorescein diacetát.

3.1.2. Molekulární sondy Fluorochromy jsou používány ke značení protilátek nebo oligonukleotidů. Umožňují specifickou identifikaci mikroorganismů při mikroskopování či průtokové cytometrii. V závislosti na použité sondě lze provádět identifikaci mikroorganismů na různých taxonomických úrovních (rod, druh, kmen). Fluorochromem značené protilátky se váží na antigenní determinanty bakteriálních buněk. Jejich použití je velmi jednoduché, po přidání ke vzorku dojde k vazbě protilátek na cílové bakterie, následuje promytí a pozorování v mikroskopu. Protože se protilátky váží na povrchové struktury, není třeba buňky před jejich aplikací nijak ošetřit. Oligonukleotidy (syntetické polymery) jsou schopné vazby na specifické úseky nukleových kyselin (na základě komplementarity bazí). Podobně jako protilátky mohou být značené fluorochromy a mohou fungovat jako fluorescenční sondy pro specifické sekvence nukleových kyselin. Protože jsou syntetizovány chemicky, je produkce oligonukleotidů levnější a jednodušší. Využití nachází například v metodě FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) nebo v průtokové cytometrii (detekce patogenů v potravinách). Na rozdíl od značených protilátek, vyžaduje použití značených oligonukleotidů obvykle určitý typ úpravy buněk tak, aby sonda mohla projít skrz buněčnou stěnu a interagovat s nukleovou kyselinou (např. záhřev nebo chemická úprava).

3.2. Základní druhy mikroskopie Již bylo zmíněno, že mikroskopie je základním nástrojem při analýze mikrobiální populace. Mikroskopie má dvě základní charakteristiky, a to zvětšení a rozlišovací schopnost (tj. oddělení dvou blízkých objektů tak, aby mohly být hodnoceny individuálně). Mikroskopie je univerzální technologie umožňující rychlou detekci i stanovení počtu mikroorganismů v potravinách. Pokud je využita při identifikaci mikroorganismů, zkracuje dobu analýzy. Řada postupů mikrobiologické analýzy potravin zahrnuje mikroskopii v různých formách.

3.2.1. Světelná (optická) mikroskopie Světelná mikroskopie je základním a historicky nejstarším druhem mikroskopie. Je přímo využitelná při testování potravin v laboratořích, při identifikaci mikroorganismů (Gramovo barvení, barvení endospor, morfologie plísní) či jako kvantitativní metoda stanovení mikrobiální populace (vyšetření čistých mlékařských kultur, stanovení počtu mikroorganismů v mléce, stanovení fragmentů plísní). Obvyklé provedení zahrnuje nanesení a fixaci vzorku na podložní sklíčko a jeho barvení, aby bylo dosaženo dostatečného kontrastu nebo zviditelnění mikrobiálních buněk proti pozadí. Problematika světelné mikroskopie a jejího využití v mikrobiologii potravin je detailně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie a skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení II. Metody stanovení mikroorganismů v potravinách).

19


3.2.2. Fluorescenční mikroskopie Podstatou fluorescenční mikroskopie je excitace fluorochromu po expozici světlem o krátké vlnové délce a následná emise světla o delší vlnové délce z fluorochromu. Emisní spektrum je vůči excitačnímu posunuto do vyšších vlnových délek, protože během vzniku fluorescence je část energie ztracena. Excitační a emisní vlnové délky jsou kontrolovány a odděleny vhodnými filtry umístěnými v mikroskopu. Základní součásti fluorescenčního mikroskopu jsou: zdroj světla, systém filtrů a zrcadel, objektiv a detektor (okulár či CCD kamera). Konstrukce fluorescenčního mikroskopu je založena na jednom ze dvou typů osvětlení – a) světlo vzorkem prochází, nebo b) světlo na vzorek dopadá. 3.2.2.1. Epifluorescenční mikroskopie V mikrobiologii potravin má nepraktičtější využití epifluorescenční mikroskopie, při které silný zdroj světla (rtuťová, halogenová či xenonová lampa) osvicuje vzorek a výsledná fluorescence je následně optickou cestou poslána na detektor. Světlo ze zdroje prochází skrz excitační filtr, který usměrňuje vybrané vlnové délky na dichroické zrcadlo. Dichroické zrcadlo odráží kratší excitační záření a propouští delší emisní záření. Současně odstraňuje nežádoucí excitační záření o vysoké intenzitě, které je škodlivé pro oko. Každé zrcadlo je vždy kombinováno s vhodným excitačním a emisním filtrem (obvykle se jedná o set zrcadla a filtrů pro daný fluorochrom). Zrcadlo je umístěno pod úhlem 45° k vertikální ose mikroskopu.

Obrázek 7: Epifluorescenční mikroskop.

Záření odražené zrcadlem prochází čočkou objektivu a dopadá na vzorek (preparát) shora. Ve vzorku vyvolá excitaci elektronů a následné vyzáření světla. Emitované záření má větší vlnovou délku a šíří se všemi směry. Díky imerznímu oleji prochází přes imerzní objektiv jen část záření, která dopadá na dichroické zrcadlo. Zrcadlem emitované záření prochází na excitační (bariérový) filtr, který propouští jen záření vlnové délky odpovídající použitému fluorochromu, záření o kratší vlnové délce filtr zastaví. Vybrané fluorescenční záření můžeme pozorovat okulárem nebo snímat CCD kamerou. Epifluorescenční mikroskopie má dvě základní výhody: a) vyšší výkon při velkých zvětšeních potřebných pro mikrobiální buňky; b) světlo přichází na vzorek shora a osvětluje povrch vzorku, proto můžeme analyzovat i silné či neprůhledné vzorky.

3.2.3. Elektronová mikroskopie Elektronová mikroskopie není využitelná pro rutinní analýzu potravin. Rozlišujeme dva typy elektronových mikroskopů – transmisní a skenovací. Transmisní elektronový mikroskop má obrovské zvětšení a rozlišovací schopnost (detekční limity jsou v rozmezí nanometrů) a umožňuje podrobné zobrazení jednotlivých vnitrobuněčných struktur mikroorganismů. Při skenovací elektronové mikroskopii je vzorek potažen tenkým filmem těžkého kovu a je skenován paprskem elektronů skrz. Technika umožňuje trojdimenzionální zobrazení povrchu vzorku a může být využitelná při studiu mikroorganismů v jejich přirozeném prostředí.

20


3.3. Přímá epifluorescenční filtrační technika – DEFT 3.3.1. Základní principy Oproti běžnému mikroskopickému stanovení kombinuje metoda DEFT membránovou filtraci, fluorescenční barvení a mikroskopii. Membránová filtrace vzorku umožňuje koncentraci mikroorganismů a tím výrazně zvyšuje citlivost metody. U homogenizovaných pevných potravin se někdy zařazuje krok předfiltrace přes hrubý filtr pro usnadnění pasáže vzorku membránovým filtrem. Při průchodu vzorku skrz membránový filtr jsou mikroorganismy koncentrovány na jeho povrchu. K hodnocení povrchu filtru je použita epifluorescenční mikroskopie. K barvení se používá akridinová oranž (afinita k nukleovým kyselinám). Původně se ke koncentraci vzorků používaly černé membrány, které tvořily kontrastní pozadí pro fluorescenci. Dnes se používají polykarbonátové membrány s jednotnou velikostí pórů, které umožňují dobré stanovení počtu mikroorganismů. Při hodnocení počtu bakterií se používá nefluorescenční imerzní olej a imerzní objektiv 100 (objektiv s nejmenším zorným polem). Při detekci kvasinek nebo protozoí lze použít méně výkonné objektivy s větším zorným polem. K vyhodnocení se obvykle používá digitální fotoaparát, napojený na mikroskop, s vazbou na systém analýzy obrazu (semi-automatická metoda). Detekční limit metody DEFT je běžně řádově 103 buněk v 1 ml.

3.3.2. Stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce Původně byla metoda DEFT používána při stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM) v syrovém mléce. Nejdříve se pomocí proteolytických enzymů a povrchově aktivních látek provede lýza somatických buněk a tukových kuliček pro usnadnění filtrace vzorku. Vzorek (2 ml) je přefiltrován přes polykarbonátový membránový filtr. Bakterie soustředěné na jeho povrchu jsou obarveny akridinovou oranží, po opláchnutí barviva se filtr nechá osušit na vzduchu. Poté se umístí na podložní sklíčko, zakápne imerzním olejem a překryje krycím sklíčkem, hodnocení probíhá v epifluorescenčním mikroskopu. Metabolicky aktivní buňky fluoreskují oranžovočerveně, neaktivní zeleně. Stanovení trvá 25 minut. Před vlastním hodnocením se provede hrubý odhad počtu buněk v zorném poli, je-li větší než 100, je nutné provést naředění vzorku. Následně se počítají fluoreskující buňky v náhodně vybraných zorných polích na membránovém filtru. Počet hodnocených zorných polí je závislý na množství mikrobiálních buněk. Stanovení počtu buněk v 1 ml mléka se provede výpočtem z průměrného počtu buněk v zorném poli, faktoru mikroskopu, množství filtrovaného vzorku a jeho ředění.

3.3.3. Modifikace metody DEFT Pro hodnocení životaschopných buněk se filtr po filtraci vzorku několik hodin inkubuje na vhodném živném médiu, dojde k vytvoření mikrokolonií, které po obarvení fluoreskují. Technika mikrokolonií byla dále modifikována použitím fluorescenčně značených protilátek jako barvicího činidla. Metodu lze využít např. k rychlé detekci životaschopných buněk salmonel a L. monocytogenes v syrovém mase. Jako alternativa k barvení akridinovou oranží se dají použít fluorescenční protilátky i bez tvorby mikrokolonií, a to pro rychlou a především specifickou detekci a počítání mikroorganismů. Během jedné hodiny lze detekovat např. E. coli O157:H7 v mléce, ovocných šťávách a hovězím mase nebo L. monocytogenes v zelenině. Ke konfirmaci pozitivních vzorků lze využít imunomagnetickou separaci. Další variantou je využití fluorescenčně značených oligonukleotidů (vazba na r-RNA) např. při detekci E. coli ve vodě, odpadech či zeleninových klíčcích.

21


3.3.4. Automatizace metody DEFT – systém BactoScan 8000 BactoScan 8000 (výrobce Foss Electric) je plně automatizovaný přístroj pro přímé mikroskopické počítání mikroorganismů v syrovém mléce. Mikroorganismy jsou ze syrového mléka odstředěny a odděleny, barveny fluorescenčním barvivem a elektronicky počítány jako světelné impulsy ve fluorescenčním mikroskopu s kontinuálním prouděním. Somatické buňky, tukové kuličky a kaseinové micely jsou chemicky degradovány a poté separovány od bakteriálních buněk odstředěním v sacharoso-glycerolovém gradientu. Současně dochází k rozpuštění bakteriálních shluků, což vede k přesnější kvantifikaci mikroorganismů. Bakteriální buňky jsou po obarvení akridinovou oranží usměrněny pod objektiv epifluorescenčního mikroskopu. Při průchodu pod objektivem jsou bakterie ozářeny filtrovaným modrým světlem, které způsobí červený světelný impuls emitovaný živými bakteriemi. Fotodetektor připevněný k objektivu zachytí tyto impulsy, které jsou počítány jako individuální bakteriální buňky (IBC). Průběžně se provádí kalibrace BactoScanu za použití referenčních standardů IBC, které jsou převedeny na hodnoty KTJ.ml-1. Krok kalibrace umožňuje srovnání výsledků s dalšími technikami stanovení celkového počtu mikroorganismů. Přístroj BactoScan 8000 nachází široké využití v analýze syrového mléka, je vhodnou alternativou ke klasickému kultivačnímu stanovení CPM v syrovém mléce, a to zejména pokud CPM je v rozsahu přístroje (tj. 4.104 až 8.104 KTJ.ml-1). Jeho hlavní výhodou je rychlost stanovení (cca 80 vzorků za hodinu). Novější verzí je BactoScan FC+ pracující na principu průtokové cytometrie (viz kapitola 3.4.3.1.).

3.3.5. Výhody, nevýhody a využití metody DEFT v praxi Metoda DEFT je velmi náročná a pracná technika, která neumožňuje zpracovat velký počet vzorků a je aplikovatelná pouze při vyšších počtech mikroorganismů v potravině (103 až 104 KTJ.g-1). Pro vlastní hodnocení výsledků je zapotřebí kvalifikovaný pozorovatel. Na druhou stranu jen málo automatizovaných metod se může rovnat diskriminační síle cvičeného oka. Nespornou výhodou je rychlost stanovení. Technika DEFT je obecně použitelná pouze pro syrové potraviny a obvykle pro stanovení celkového počtu mikroorganismů. Může však být využita i pro detekci a stanovení počtu patogenních bakterií (salmonely, E. coli O157:H7, L. monocytogenes), a to např. v kombinaci s fluorescenčně značenými specifickými protilátkami či imunomagnetickou separací. Rutinní využití našla automatizovaná metoda DEFT při stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce (systém Bactoscan), dále při mikrobiologickém vyšetření masa, drůbeže, ryb, zeleniny či koření.

3.4. Průtoková cytometrie 3.4.1. Základní principy, složení průtokového cytometru Průtokový cytometr je přístroj, který analyzuje částice (buňky, bakterie, jádra) pohybující se v proudu kapaliny, který protíná soustředěný, stabilní a vysoce intenzivní paprsek světla, obvykle tvořený laserem. Přístroj zaznamenává charakteristiky každé buňky unášené proudem a je schopný analyzovat tisíce buněk ve vzorku během sekundy. Mezi vlastnosti (charakteristiky) částic lze zařadit velikost, tvar, obsah nukleových kyselin, přítomnost povrchových antigenů, schopnost odrážet či rozptylovat světlo a fluorescenci. V nejjednodušším typu průtokového cytometru prochází tekutý vzorek přes průtokovou štěrbinu a je osvětlen laserem. Částice jsou automaticky detekovány mikroskopem

22


zaostřeným na průtokovou štěrbinu. Moderní průtokový cytometr se skládá ze tří hlavních částí: fluidiky, optiky a elektroniky. Pro analýzu je nezbytné, aby se buňky nacházely ve formě suspenze, protože musí přístrojem procházet jedna za druhou konstantní rychlostí. Suspenze buněk se dávkuje do zkumavky, ze které vychází na dolním konci kapilára. Zkumavka je uložena v nádobce s tzv. plášťovou tekutinou, která odtéká laminárním prouděním a strhává s sebou z kapiláry jednotlivé buňky. To, aby prošla měřícím bodem právě jedna částice, je zajištěno tzv. hydrodynamickou fokusací. Ideální je, aby rozdíl tlaku mezi vzorkem a unášející tekutinou byl malý, v tomto případě je proud vzorku úzký a v plošném průřezu projde právě jedna buňka (lepší rozlišení). Proudění vzorku musí být laminární nikoli turbulentní. Analyzované buňky nebo detekovaná látka uvnitř buněk se vhodnou metodou označí tak, aby ji mohl rozpoznat detekční systém přístroje. Nejčastěji se tak děje pomocí specifických fluorochromů. Je vhodné, aby se absorpční maximum fluorochromu co nejvíce blížilo vlnovým délkám běžně používaných laserů. Vzorek procházející kapilárou je ozářen monochromatickým zářením laseru. Průtokové cytometry bývají dvoulaserové nebo třílaserové. Nejčastěji používaným laserem je vzduchem chlazený argonový laser, který emituje záření s vlnovou délkou 488 nm (modrá oblast spektra). Sběrnou optiku tvoří soustava filtrů, zrcadel a čoček. Filtry a zrcadla rozdělují emitované fotony podle vlnové délky na příslušné detektory. V případě bočního rozptylu (SSC) a fluorescence je intenzita signálu nízká, a proto je potřeba signál zesilovat fotonásobičem. Při bočním rozptylu je světlo emitováno v úhlu přibližně 90° k dráze paprsku laseru. U přímého rozptylu (FSC) je intenzita signálu dostatečná, světlo je emitováno v malém úhlu ke směru dráhy laserového paprsku. Intenzita paprsků FSC je přímo úměrná velikosti buňky, intenzita poprsků SSC odráží vnitřní komplexitu buněk a je úměrná granularitě buňky (stav cytosolu, buněčné inkluze, granula, atd.). Podle intenzity paprsků FSC je možné rozlišit živé a mrtvé buňky, podle SSC buňky granulózní a agranulózní. Signály z optiky jsou v detektorech převedeny na elektrické impulsy, které jsou zpracovány počítačovým programem. Pro jednotlivé buňky jsou generována multiparametrická data, která se ukládají do počítače. Výsledek je vyjádřen graficky v podobě jednoparametrového histogramu (osa x – intenzita signálu, osa y – četnost) nebo dvouparametrově pomocí dot plotů. V jednom grafu je tedy možno pozorovat přímý rozptyl, boční rozptyl a fluorescenci (u částic s navázanou fluorochromem značenou protilátkou). Z grafu se tzv. gatováním vybere populace buněk, která bude předmětem další analýzy a vytvoří se pro ni dot plot histogram.

3.4.2. Výhody a nevýhody průtokové cytometrie Průtoková cytometrie umožňuje kvalitativní i kvantitativní analýzu. Jako automatizovaná metoda nabízí zejména následující výhody: rychlost analýzy (minuty), jednoduchá příprava a vyšetření velkého počtu vzorků. V rámci jednoho vzorku analyzuje průtokový cytometr mnoho tisíc jednotlivých částic, což není manuálně možné. Zřejmou výhodou je také schopnost shromažďovat data o jednotlivých buňkách. Problémy mohou vzniknout při detekci zřídka se vyskytujících buněk (např. patogenů) na pozadí velkého množství buněk či částic. Pokud jsou k dispozici specifická fluorescenční barviva pro selektivní značení vybraných druhů mikroorganismů, je metoda potenciálně velmi specifická. Jednoznačnou nevýhodou je finanční náročnost, zejména investiční náklady na pořízení průtokového cytometru. Vzorky nelze dlouhodobě uchovávat, pevné vzorky musí být nejprve upraveny tak, aby došlo k separaci buněk od sebe. K obsluze cytometru je zapotřebí školený personál. Jednou z nevýhod použití v mikrobiologii potravin je nedostatečná diskriminace mezi živými a mrtvými buňkami a rušení stanovení potravinovou matricí.

23


3.4.3. Využití průtokové cytometrie v praxi Základní principy průtokové cytometrie se dají aplikovat i na mikroorganismy, přesto je její využití v mikrobiologii potravin poměrně malé. V případě bakterií narážíme na několik specifických problémů, jedním z nich je relativně malá velikost bakteriálních buněk. Většina komerčně dostupných průtokových cytometrů je vytvořena pro analýzu částic o velikosti eukaryotních buněk (např. lymfocytů), které jsou několikanásobně větší než bakterie. Při stanovení počtu mikroorganismů v potravinách, musí být zařazen krok filtrace, který je nezbytný pro odstranění částic potraviny (hrozí ucpání cytometru). Ke stanovení počtu bakterií, kvasinek, plísní a spor lze využít např. technologii CHEMUNEX® (automatizované přístroje D-Count®, BactiFlow®ASL, semi-automatický přístroj BactiFlow®, výrobce bioMérieux), která umožňuje mikrobiologickou analýzu potravin (např. syrového mléka, mléčných výrobků, nápojů), vody, výživových doplňků, léčiv a kosmetických přípravků. Technologie kombinuje fluorescenční značení životaschopných buněk s digitální průtokovou cytometrií. Průtoková cytometrie může být využita i k multiparametrické analýze startovacích kultur a probiotických produktů, kdy se hodnotí přítomnost a) kultivovatelných (životaschopných), b) metabolicky aktivních, ale nekultivovatelných a c) neživotaschopných bakterií mléčného kvašení. Při stanovení patogenů se průtoková cytometrie kombinuje s imunofluorescencí. Barvení buněk musí být provedeno před vlastní analýzou na průtokovém cytometru. Po přídavku optimálního množství fluorescenčně značených protilátek následuje krátká inkubace vzorku a poté promytí k odstranění nenavázaných protilátek. Pokud je stanovení patogenů kvantitativní, musí být zjištěn objem vzorku, který prošel detekčním bodem přístroje. K tomu lze použít např. mikrosyrinky s kontrolovaným průtokem. Tímto způsobem lze detekovat např. L. monocytogenes, salmonely či E. coli O157:H7. Asi největší využití nachází průtoková cytometrie v lékařství, konkrétně v klinické imunologii, hematoonkologii, nádorové biologii a v oblasti molekulární biologie. 3.4.3.1. Využití průtokové cytometrie při hodnocení kvality syrového mléka Širší využití nachází průtoková cytometrie při rutinní analýze kvality syrového mléka, konkrétně se jedná o stanovení počtu somatických buněk a celkového počtu mikroorganismů. Pro stanovení počtu somatických buněk se v naší republice často používají průtokové cytometry Fossomatic™ FC (výrobce Foss) či přístroje řady Somacount (dodavatel BentleyCzech). V obou případech je fluorochrom navázán na DNA somatických buněk. Při průchodu buněk kapilárou a po osvitu laserem dojde k emisi záření, které je přístrojem detekováno. Ke stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce lze použít BactoCount IBC (dodavatel BentleyCzech). Vzorek mléka je natažen do karuselu temperovaného na 50 °C, kde na něj působí směs pufru, proteolytického enzymu a fluorescenčního barviva. Tento roztok způsobí rozklad somatických buněk, rozpuštění tukových globulí a bílkovin, současně podpoří propustnost bakterií k obarvení jejich DNA. Během inkubace je vzorek ošetřen speciálním ultrazvukovým způsobem. Po inkubační periodě je část vzorku přemístěna do průtokového cytometru, kde jsou jednotlivé bakterie vystaveny laseru a fluoreskují. Fluorescenční signál je zaostřen optikou, filtrován, a detekován fotonásobičem. Intenzita a šířka pulsů je zaznamenána a použita jako vstupní parametr. Po kalibraci jsou vytříděné pulsy přepočítány na individuální počty bakterií. Výsledky i cytogramy jsou archivovány. Různé modely zpracují 50 až 150 vzorků za hodinu. Na podobném principu pracuje i BactoScan™ FC+ (výrobce Foss), kterým lze během jedné hodiny vyšetřit až 200 vzorků syrového mléka.

24

Imunologické metody

4. IMUNOLOGICKÉ METODY Imunologické metody jsou obecně založeny na vysoce specifické reakci mezi protilátkou a antigenem. Tvoří základ celé řady testů, které mohou být v mikrobiologii potravin použity k detekci a konfirmaci specifických mikroorganismů, zejména alimentárních patogenů, a některých toxinů. Antigen je molekula schopná vyvolat v živých organismech produkci specifických protilátek. Jako antigen mohou sloužit specifické části cílového mikroorganismu (např. lipopolysacharidy v buněčné stěně gramnegativních bakterií, bičíkové proteiny), nebo toxin či jiný produkt vznikající při růstu mikroorganismu. Protilátky jsou proteiny produkované bílými krvinkami (aktivované B-lymfocyty) živočichů po jejich infekci cizí molekulou nebo mikroorganismem. V mikrobiologii potravin se používají v testech určených k detekci specifických mikroorganismů, proteinů či toxinů. Uvádí se, že u některých mikroorganismů může docházet ke zkříženým reakcím jejich somatických antigenů, a proto, i když jsou imunologické metody relativně specifické, nelze je k potvrzení přítomnosti určitého mikroorganismu použít samostatně. Z tohoto důvodu jsou výsledky imunologických testů označovány jako presumptivní a musí být potvrzeny konvenční kultivací s následnou konfirmací sledovaného mikroorganismu. Některé imunologické metody, jako aglutinační testy, se staly nedílnou součástí řady konfirmačních postupů (stanovení Salmonella spp., E. coli O157, atd.). Pravděpodobně nejrozšířenější metodou detekce specifických mikroorganismů v potravinách je technika ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Využití nachází také metoda imunomagnetické separace, která umožňuje oddělení cílových mikroorganismů z homogenátů potravin či pomnožených vzorků a tím snižuje negativní vliv potravinové matrice a doprovodné mikroflóry. Běžně se používá při stanovení E. coli O157, kde je nejen součástí referenční kultivační metody, ale i dalších alternativních metod. Technika imunomagnetické separace je detailně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody , proto není v této kapitole dále uvedena.

Využití imunologických metod při vyšetření potravin má některá úskalí. Jedním z nich je doprovodná mikroflóra, která může inhibovat růst sledovaného mikroorganismu nebo zkříženě reagovat s použitými protilátkami (falešně pozitivní výsledky). Řada technologických postupů při výrobě potravin může způsobit subletální poškození mikroorganismů, které potom nejsou schopny růstu v selektivních médiích. Z tohoto důvodu je nezbytné zařazení kroku neselektivního pomnožení vzorku před vlastní imunologickou detekci. Na trhu je v současné době řada testovacích souprav umožňujících detekci běžně se vyskytujících alimentárních patogenů a jejich toxinů.

4.1. Aglutinační testy Aglutinační testy se řadí do skupiny serologických metod, asi největší využití nachází při serologické konfirmaci bakterií. Aglutinace je in vitro reakce antigenu se specifickou protilátkou, která se makroskopicky projevuje viditelným shlukováním. Reakce je obvykle rychlá, vykazuje vysokou afinitu, vzniklý aglutinát se nerozpadá. Již řadu let se aglutinační testy využívají v klinické diagnostice infekcí či při serologické klasifikaci bakterií (např. identifikace Salmonella spp. – Kauffmann-White Antigenic Scheme). V potravinářské mikrobiologii je důraz kladen především na rychlou konfirmaci suspektních izolátů. Standardně je aglutinace součástí stanovení Salmonella spp. a E. coli O157. Trend při vývoji aglutinačních testů je použití nosičů (např. latexových částic), které umožňují jednodušší odečítání pozitivních reakcí než klasická antiséra. Při vyšetřování potravin lze úspěšně používat i testovací soupravy určené pro klinickou diagnostiku.

25


Asi nejběžnějším alimentárním patogenem, při jehož identifikaci se používá aglutinační test, je Staphylococcus aureus. Komerční aglutinační testy umožňují identifikaci S. aureus detekcí vázané koagulasy (clumping faktor) a proteinu A, a to samostatně nebo v kombinaci. K průkazu proteinu A se obvykle používají latexové částice s navázanými specifickými monoklonálními protilátkami, pro detekci vázané koagulasy potom ovčí erytrocyty senzitivované fibrinogenem – při pozitivní reakci dochází k hemaglutinaci. Rutinní využití má aglutinace i při identifikaci Escherichia coli O 157:H7 či bakterií rodu Salmonella. Při konfirmaci salmonel využívají běžné laboratoře obvykle pouze polyvalentní antiséra, bližší typizaci jednotlivých izolátů provádí specializované laboratoře. Některé komerční latex-aglutinační soupravy umožňují nejen screening, ale i presumptivní identifikaci suspektních izolátů, např. Wellcolex® Colour Salmonella Test (výrobce Oxoid Ltd.). Při detekci bakteriálních toxinů se využívá metoda pasivní reverzní latexové aglutinace (RPLA). Test se provádí v mikrotitračních destičkách, výsledky jsou k dispozici za cca 24 hodin. Mezi komerčně dostupné testy patří např. SET-RPLA pro stanovení stafylokokových enterotoxinů A až D, BCET-RPLA pro stanovení diarhogenních enterotoxinů B. cereus či VTEC-RPLA pro detekci Shigatoxinů ST1 a ST2 (výrobce Oxoid Ltd.). Problematika serologických metod a jejich využití v mikrobiologii potravin je detailně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie).

4.2. Imunochromatografická metoda Praktické využití v mikrobiologii potravin nachází také imunochromatografické metody, označované též jako LFIA (Lateral Flow Immuno Assay).

4.2.1. Základní principy Nejběžnějším formátem je plošná imunochromatografie. Na trhu je celá řada různých provedení testu, jeho základní formát zůstává však stejný. Typicky se test skládá z porózní nitrocelulózové membrány, na které jsou imobilizovány vazebné proteiny pro cílovou detekovanou molekulu. Ve většině případů se jedná o specifické protilátky schopné navázat antigeny přítomné ve vzorku.

Obrázek 8: Schéma imunochromatografického testu. (McMeekin, 2003 – upraveno) 26


Určené množství pomnoženého vzorku se otvorem v krytu testu napipetuje do tzv. okna pro vzorek, kde je obvykle papírová vrstva umožňující absorpci vzorku. Pod touto vrstvou je vrstva skleněných vláken obsahující vysušený konjugát – částice s navázanými specifickými protilátkami proti cílovému antigenu (mohou to být např. částice zlata nebo barevné latexové částice). Vrstva s konjugátem je připojena k nitrocelulózové membráně. Po aplikaci vzorku proniká tekutina kapilární difúzí do vrstvy konjugátu a rehydratuje jej. Současně dochází ke specifické reakci mezi konjugátem a cílovými antigeny. Vytvořený komplex antigen-konjugát projde až na membránu a putuje směrem k linii vazebných proteinů (tzv. vazebná nebo testovací linie). Vazebné proteiny jsou specifické protilátky proti cílovému antigenu, které migrující komplex zachytí a imobilizují. V testovacím okně dojde v místě vazebné linie k vytvoření zřetelného pruhu či linky, což indikuje pozitivní výsledek. V závislosti na rychlosti průniku kapaliny porózní membránou, trvá tento proces obvykle 15 – 20 minut. Přebytečný (nenavázaný) konjugát vzlíná dál membránou a je zachycen na dalším místě membrány, tzv. kontrolní linii, kde jsou navázány specifické protilátky proti konjugátu. Jejich hromadění opět vyvolá vznik barevného proužku. Tato linie slouží ke kontrole funkčnosti testu. Pokud nedojde k jejímu zvýraznění, je test neplatný i když vznikne proužek na testovací linii.

Obrázek 9: Výsledek testu.

Vyhodnocení testu:  pozitivní výsledek – zřetelný barevný pruh v místě vazebné i kontrolní linie (2 proužky)  negativní výsledek – pruh je vytvořen pouze v místě kontrolní linie (1 proužek).

4.2.2. Výhody, nevýhody a využití imunochromatografie v praxi Jedná se o velmi rychlou, jednoduše proveditelnou metodu, která nevyžaduje zvláštní přístrojové vybavení či školený personál a je proveditelná v provozních podmínkách. Určitým omezením je požadavek na pomnožení vzorku před vlastním stanovením, což samozřejmě prodlužuje dobu stanovení. Podobně jako u dalších imunologických technik, je nezbytné potvrdit pozitivní výsledky konvenční metodou. V klinické diagnostice jsou imunochromatografické metody rutinně používány. Využívají se při detekci specifických složek moči, krve a ostatních tělních tekutin, dále hormonů, léčiv, virů či dalších infekčních agens. V potravinářské mikrobiologii nachází své uplatnění při detekci reziduí antibiotik, hormonů a alimentárních patogenů. Nečastěji se imunochromatografická metoda používá k detekci Salmonella spp., E. coli O157 a Shigatoxinů ST1 a ST2, L. monocytogenes či Campylobacter spp., a to v různých potravinách či environmentálních vzorcích. Komerční soupravy dodává na trh řada firem, např. Merck KGaA (řada Singlepath či Duopath), Oxoid Ltd, BioControl Inc. (řada VIP), Neogen Corp (řada Reveal) či Celsis Ltd (řada Path-Stick). Některé testy byly validovány organizací AOAC (Association of Official Chemists).

27


4.3. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – ELISA ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), známá také jako EIA (Enzyme Immunoassay), je široce používaná imunologická technika nejen pro detekci patogenních mikroorganismů. Je alternativou ke kroku detekce či izolace mikroorganismů na živném agaru. Je relativně jednoduchá, může být i semi-automatická, výsledky poskytuje dostatečně rychle. Podle zaměření umožňuje detekovat konkrétní rod, druh či serotyp. Na druhou stranu je to stále metoda screeningová, pozitivní výsledky musí být potvrzeny klasickým způsobem.

4.3.1. Základní principy Jako všechny imunologické metody, je i ELISA založena na principu specifické vazebné reakce mezi antigenem a protilátkou. V ELISA testech se používají monoklonální nebo polyklonální protilátky. Polyklonální protilátky jsou produkovány při imunitní odpovědi hostitele na infekci organismu relativně velkou molekulou (protein, mikroorganismus), jsou produktem mnoha aktivovaných klonů B lymfocytů, a proto jsou namířeny proti více epitopům určitého antigenu. Monoklonální protilátky jsou produkované jedním klonem Blymfocytů po styku s jedním konkrétním antigenním epitopem, připravují se na tkáňových kulturách. Ke značení protilátek se v ELISA metodě používá enzym, obvykle schopný katalyzovat přeměnu bezbarvého substrátu na barevný produkt (případně může dojít i ke změně barvy substrátu). Díky tomu je hodnocení testu vizuální nebo spektrofotometrické. Nejčastěji se využívá enzym alkalická fosfatasa reagující s para-nitrofenyl fosfátem nebo křenová peroxidasa reagující s tetramethylbenzidinem. V obou případech vzniká barvený produkt. Reakce probíhající v průběhu ELISA testu vždy vyžadují nějaký pevný nosič, na který jsou kovalentně vázány či adsorbovány protilátky, příp. antigen. Nejčastěji se jedná o mikrotitrační destičky či mikrozkumavky, lze použít i papírové membrány nebo polystyrenové tyčinky.

4.3.2. Konfigurace ELISA metod používaných v mikrobiologii potravin V mikrobiologii potravin je detekce obvykle zaměřena na průkaz antigenu (bakterie, toxin) pomocí známých protilátek. Tomu odpovídají i typy ELISA metod, které se používají. Prvním krokem je vždy pokrytí pevného nosiče specifickými protilátkami nebo antigeny. V případě, že test používá statický nosič (např. mikrotitrační destičku),jsou vzorek a další reagencie v několika fázích postupně přidávány do jamek. Při použití polystyrenových tyčinek (tzv. dipstick) je pevný nosič navržen tak, aby byl přenosný. Antigeny navázané na pevném nosiči (tyčince) mohou být přenášeny do různých živných médií (podpora růstu a namnožení cílových buněk), po přenesení do roztoku substrátu dojde k barevné reakci. 4.3.2.1. Sendvičová ELISA Nejjednodušším a nejčastěji používaným formátem v komerčních testech používaných při vyšetření potravin je sendvičová (angl. sandwich) ELISA. „Sendvič“ v tomto případě znamená, že je cílový antigen obalen dvěma protilátkami. V průběhu testu je antigen nejprve zachycen a poté detekován. Prvním krokem každého sendvičového ELISA testu je pomnožení vyšetřované potraviny. Vazebné (imobilizované) protilátky, specifické pro cílový antigen, jsou navázány na povrch pevného nosiče, např. jamky mikrotitrační destičky. Po přídavku pomnoženého vzorku potraviny dojde, v případě přítomnosti cílových antigenů, k jejich vazbě na protilátky. Po promytí, kterým se odstraní zbytky vzorku, následuje přídavek detekčních, enzymaticky značených protilátek. Detekční protilátky se váží na cílové antigeny a vytvoří se „sendvič“. Několikanásobným promytím se odstraní nenavázané protilátky. Po přídavku substrátu

28


katalyzuje enzym jeho přeměnu na barevný produkt. Na závěr lze přidat tzv. stop roztok, který ukončí enzymovou aktivitu. Vzniklá barevná reakce je hodnocena vizuálně nebo spektrofotometricky. Celková doba trvání testu je asi 2 až 3 hodiny. Metodu lze využít nejen ke kvalitativnímu, ale i semikvantitativnímu či kvantitativnímu stanovení (kalibrací koncentrace antigenu proti intenzitě barvy).

Obrázek 10: Hlavní kroky sandwich-ELISA testu. 4.3.2.2. Nepřímá sendvičová ELISA V tomto typu ELISA metody nejsou detekční protilátky značené enzymem, ale nesou marker – molekulu se specifickou vazebnou kapacitou pro jinou molekulu, např. protein. Nejčastěji je jako marker používán biotin, který má vazebné proteinové místo pro avidin. Po přídavku komplexu avidinu a enzymu (např. streptavidin-křenová peroxidasa), dojde k jeho navázání na biotin. Tímto způsobem vznikne enzymaticky značená protilátka. Přítomný enzym opět katalyzuje přeměnu substrátu na barevný produkt.

Obrázek 11: Nepřímá sendvičová ELISA – schéma. 4.3.2.3. Kompetitivní ELISA V tomto případě jsou na dno testovací jamky (pevný nosič) navázány antigeny. Vzorek a enzymaticky značené protilátky jsou do jamky přidány současně. Jsou-li ve vzorku přítomny cílové antigeny, nastává kompetice (soutěžení) o vazebná místa. Značené protilátky se přednostně váží na cílové antigeny ve vzorku, část protilátek se může vázat i na antigeny imobilizované na dně jamky (čím více je cílových antigenů, tím méně protilátek se naváže na imobilizované antigeny). Během následného promývání je komplex cílový antigen-protilátka z jamky odstraněn. Už bylo zmíněno, že změna barvy na konci testu je způsobena výhradně přítomností komplexu protilátka-imobilizovaný antigen na dně jamky. Při pozitivním průkazu cílových antigenů ve vzorku je tedy výsledné zbarvení velmi slabé nebo zcela bezbarvé. Což je zcela naopak oproti sendvičové ELISA metodě (pozitivní výsledek – intenzivní barva, negativní výsledek – bezbarvé nebo velmi slabě zbarvené).

29


Obrázek 12: Kompetitivní ELISA – pozitivní průkaz cílového antigenu. Naopak nejsou-li ve vzorku přítomny cílové antigeny, značené protilátky se váží na imobilizovaný antigen na dně jamek. Po přídavku substrátu katalyzuje enzym jeho přeměnu na barevný produkt. Negativním výsledkem je tedy změna barvy.

Obrázek 13: Kompetitivní ELISA – negativní průkaz cílového antigenu. Podobně jako sendvičová ELISA, může být kompetitivní ELISA přímá či nepřímá a může sloužit nejen ke kvalitativnímu, ale i kvantitativnímu stanovení. Tento typ se nejčastěji používá pro detekci malých molekul.

4.3.3. Komerčně dostupné ELISA soupravy V mikrobiologii potravin se nejčastěji využívají ELISA sety určené pro detekci alimentárních patogenů či jejich toxinů – zejména se jedná o Salmonella spp., Listeria spp., E. coli O157:H7, Campylobacter spp., stafylokokové enterotoxiny, diarhogenní enterotoxiny B. cereus, Shigatoxiny a neurotoxiny C. botulinum. Nejčastěji jsou to soupravy na bázi sandwich ELISA využívající jako pevný nosič mikrotitrační destičky. Jamky jsou obvykle samostatné, před testem se vždy potřebný počet zasune do rámu destičky. Typická souprava mimo jamek s navázanými protilátkami, zahrnuje koncentrovaný promývací roztok, lyofilizované enzymaticky značené protilátky (konjugát), lyofilizovaný substrát, ředicí roztoky a pozitivní a negativní kontrolu. K vizuálnímu hodnocení je k dispozici barevná šablona, případně lze použít reader mikrotitračních destiček. Promývací kroky lze provádět ručně nebo automaticky. Na trhu jsou dostupné i zcela automatizované systémy vyžadující minimum ruční práce. Nově jsou vyvíjeny formáty, do kterých jsou začleněny kroky využívající další imunologické techniky, např. separace bakterií za použití imunomagnetických částic (IMS). Takto koncentrované antigeny jsou následně využity jako vzorek pro ELISA test. 30


Produkcí ELISA testů se zabývá řada výrobců – TECRA (řada TECRA-VIA se provádí v mikrotitračních destičkách, v řadě UNIQUE je pevným nosičem přenosná polystyrenová tyčinka), bioMérieux (řada TEK, pevnou fází je mikrotitrační destička, uvedený systém je kombinovatelný také s imunomagnetickými částicemi), Merck, BioControl a další. Plně automatizovaným systémem je EiaFoss (výrobce FossElectric) se zařazenou fází imunokoncentrace pomocí Obrázek 14: ELISA souprava. magnetických částic. Dostupné jsou soupravy pro detekci Salmonella spp., Listeria spp., E. coli O157 a Campylobacter spp.

4.3.4. Výhody, nevýhody a využití ELISA metod v praxi Citlivost většiny ELISA testů je přibližně 105 buněk v ml, což je jednou z hlavních nevýhod této metody. Při stanovení patogenních mikroorganismů v potravinách je obecně požadavkem detekce 1 buňky ve 25 g (ml) potraviny, z tohoto důvodu je nezbytné před vlastním ELISA testem provést pomnožení vzorku ve vhodném živném médiu. Současně krok pomnožení umožňuje resuscitaci subletálně poškozených buněk (účinek tepelného ošetření, mrazení, nízkého pH či chemických konzervantů). To je významné zejména při stanovení patogenů s nízkou infekční dávkou, jako je E. coli O157:H7 nebo C. jejuni. Další možností zvýšení citlivosti metody je již zmíněné využití imunomagnetické separace. ELISA metody mají dostatečnou specifitu, a to díky používaným protilátkám, které mají vysokou afinitu k cílovým antigenům a vykazují nízkou úroveň zkřížených reakcí s jinými mikroorganismy. Více specifické jsou soupravy obsahující monoklonální protilátky. U některých typů potravin může docházet k nespecifickým reakcím, tomu se lze vyhnout jejich vhodnou úpravou před vlastním stanovením. Provedení ELISA metody je jednoduché a rychlé, u většiny testů trvá asi 2 až 3 hodiny. Největší výhodou je využití ELISA metody při negativním screeningu vzorků, její zařazení umožní zvýšení počtu vyšetřených vzorků a podstatné zkrácení doby vyšetření (negativní výsledky jsou k dispozici cca za 24 – 30 hodin). Na druhou stranu se jedná o screeningovou metodu, takže pozitivní výsledky musí být vždy potvrzeny klasickou metodou. Náklady na provedení ELISA metody jsou nepochybně vyšší než u ekvivalentního konvenčního testu, na druhou stranu je ale vyvažují poskytované výhody (např. nižší požadavky na pracovní sílu či rychlejší uvolňování výrobků s negativním průkazem sledovaného mikroorganismu či toxinu). Určité problémy mohou nastat při stanovení stafylokokových enterotoxinů, kdy součástí soupravy je i pozitivní kontrola – čistý toxin. Stafylokokové enterotoxiny patří mezi vysoce rizikové toxiny a pro jejich použití platí v České republice přísné legislativní předpisy, které musí každá laboratoř pracující s touto látkou respektovat (více kapitola 8.1.4.). Jak již bylo zmíněno výše, hlavní využití ELISA metod v potravinářské mikrobiologii je detekce vybraných alimentárních patogenů či jejich toxinů. Stanovení může být prováděno v různých druzích potravin. Příslušné ELISA soupravy jsou na trhu běžně dostupné.

31


4.4. Enzyme-Linked Fluorescent Assay – ELFA Plně automatický systém založený na fluorescenční imunologické metodě ELFA (EnzymeLinked Immunofluorescent Assay) využívá přístroj VIDAS® (Vitek Immuno Diagnostic Assay System) vyvinutý francouzskou firmou bioMérieux.

4.4.1. Základní principy ELFA je založena na specifické reakci antigen-protilátka a princip reakce je podobný jako u ELISA metody. Rozdíl spočívá v použitém substrátu, který je enzymem štěpen na fluorescenční produkt. Vzniklé chemické změny detekuje fotodiodový fluorimetr.

Obrázek 15: VIDAS souprava (reagenční strip, SPR® a kontroly) a přístroj miniVIDAS®. Testy využívané přístrojem VIDAS® se skládají ze dvou částí. První částí jsou tzv. „pipety“, označované jako komůrka s pevnou fází (SPR®), jejichž vnitřní část je potažena protilátkou specifickou k hledanému antigenu. Druhou částí je reagenční strip složený z deseti jamek. První z nich je prázdná, do ní se pipetuje upravený vzorek – zpravidla o objemu 500 µl. Dalších osm jamek obsahuje promývací roztoky nebo reagenční roztoky, konjugát z části tvořený alkalickou fosfatasou a substrát 4-methyl-umbeliferyl fosfát. Hledaný antigen (bakterie nebo např. stafylokokový enterotoxin SEA – SEE) se naváže na protilátku uvnitř SPR® a v průběhu promývacích kroků se odstraní nenavázané složky vzorku. Fluorogenní substrát 4-methyl-umbeliferyl fosfát, používaný v testu, je enzymem alkalickou fosfatasou navázanou na komplex antigen-protilátka konvertován na fluorescenční produkt 4methyl-umbeliferon. Poslední jamka stripu je optická kyveta, ve které je změřena intenzita fluorescence při 450 nm pomocí fotodiodového fluorimetru. Na konci analýzy je pro každý vzorek stanovena relativní fluorescenční hodnota (RFV) a přístroj tyto výsledky automaticky analyzuje. Stanovená hodnota se porovná s interními referenčními hodnotami a provede se interpretace jednotlivých výsledků (pozitivní/ negativní), které jsou následně přístrojem vytištěny. Novinkou a významnou inovační technologií firmy bioMérieux je využití rekombinantních fágových proteinů v systému VIDAS. V současnosti se tato technologie používá při detekci salmonel, listerií a E. coli O157:H7 v potravinách. U takto inovovaných testů není vnitřek SPR komůrky potažen protilátkou proti detekovaným bakteriím, ale specifickými fágovými proteiny. Rekombinantní fágové proteiny jsou části bakteriofágů (používá se tzv. „tail fiber protein“), které mají schopnost se specificky navázat na receptory bakterií. Nová technologie je jedinečná díky své citlivosti. Další postup enzymové metody zůstává zachován jako v případě použití protilátek. 32


4.4.2. Provedení metody a vyhodnocení výsledků Soupravy se skládají z reagenčních stripů (zpravidla 30 – 60 ks) a příslušného počtu SPR® komůrek, standardů a pozitivní i negativní kontroly. K dispozici je také ředicí roztok. Nezbytnou součástí každé soupravy je MLE karta (Master Lot Entry) s čárovými kódy, která je před vlastním využitím soupravy vkládána do přístroje. Karta umožní načtení dat potřebných pro kalibraci testu a závěrečné vyhodnocení analýzy a současně dohlíží na to, aby v testu nebyly použity stripy po uplynutí doby exspirace. Kalibrace přístroje pomocí karty, standardů, pozitivních a negativních kontrol je nutná u každé nové soupravy. Vlastní analýze na přístroji VIDAS® předchází vždy zpracování vzorků. V případě průkazu stafylokokových enterotoxinů se vzorky nejprve homogenizují s destilovanou vodou, upravuje se pH na hodnotu v rozmezí 3,5 – 4,0 pomocí 5 M HCl, po odstředění se upravuje pH čirého supernatantu 1M NaOH na hodnotu v rozmezí 7,5 – 8,0 a znovu se vzorek odstřeďuje. Pro analýzu se použije získaný supernatant. V případě detekce patogenních bakterií spočívá příprava vzorků v jejich homogenizaci v pufrované peptonové vodě s přídavkem suplementů a inkubaci. Může následovat pomnožení v dalších pomnožovacích půdách. Takto zpracované vzorky se pipetují vždy v množství 500 µl do první jamky stripu.

Obrázek 16: Schéma reagenčního stripu s pevnou fází (SPR®). (McMeekin, 2003 – upraveno) Reagenční stripy s aplikovanými vzorky se vloží do přístroje VIDAS®. Vložení každého stripu musí být doplněno zasunutím špičky (SPR® fáze) na příslušnou pozici shodnou s dráhou proužku (obrázek 15). Každý vyšetřovací set má své barevné označení. Je nutné, aby si barevné štítky s kódem testu na SPR® fázi a stripu odpovídaly a bylo zřejmé, že pochází z jednoho typu testu. Poté se přístroj spustí a na displeji se označí názvy vzorků v jednotlivých drahách. V průběhu testu se SPR® postupně zasunuje do jamek s reagenciemi. Ty jsou vždy nasáty do špičky a po ukončení daného kroku opět vypuštěny do příslušné jamky stripu (obrázek 16). V závěru analýzy je SPR®, obsahující v případě pozitivního výsledku komplex imobilizovaná protilátka-antigen-konjugát, naplněna fluorogenním substrátem z poslední jamky. Proběhne enzymatická reakce a obsah je uvolněn zpět do optické kyvety, kde je změřena hladina fluorescence. Výsledky jsou k dispozici za 48 – 90 minut, podle typu testu. Výsledky pro jednotlivé vzorky (pozitivní/negativní) přístroj vytiskne. 33

Obrázek 17: Vyhodnocení.


4.4.3. Výhody, nevýhody a využití metody ELFA v praxi Významnou výhodou této automatizované metody je velká časová úspora v případě detekce patogenních bakterií, což platí pro všechny vyšetřovací soupravy z oblasti mikrobiologie potravin. Nejlépe to lze demonstrovat na průkazu salmonel a listerií. Běžná detekce salmonel nebo L. monocytogenes pomocí časově náročných kultivačních metod trvá zpravidla až 5 dní. ELFA metoda jejich průkaz zjednodušuje a zrychluje, což uvítají zvláště výrobci potravin, pro něž je negativní výsledek testů podmínkou pro expedování potravin do tržní sítě. Nejnovější testy, které využívají rekombinantní fágový protein, umožní obdržet výsledek průkazu salmonel dokonce do 27 hodin. Výjimku tvoří mléčné výrobky, kde je součástí standardního postupu vyžadován krok pomnožení vzorku v selektivním bujonu a tím se celá analýza prodlouží o 6 – 8 hodin. I přesto je však doba získání výsledků zkrácena o polovinu. Vyhodnocování mikrobiologických analýz při použití kultivačních metod včetně provedení konfirmačních testů vyžaduje vždy velké zkušenosti pracovníků mikrobiologické laboratoře. U VIDAS testů pracovníci obdrží jednoznačný výsledek v podobě automaticky vytištěného zápisu s pozitivním nebo negativním výsledkem. Odpadá tak riziko subjektivního hodnocení výsledků. Příprava vzorků určených pro analýzy ve VIDAS přístroji je jednoduchá. I v případě detekce stafylokokových enterotoxinů (SEs) je za výhodu považována rychlost získání výsledků (do 3 hodin) a jednoduchá příprava vzorků. Nevýhodou je, že SEs (SEA – SEE) přítomné ve vzorku jsou detekovány jako suma a z výsledků nelze vyvodit, který typ enterotoxinu je v potravině přítomen. Legislativou požadovaná citlivost pro průkaz SEs ve vzorcích potravin umožňuje metodu ELFA k těmto analýzám použít (viz kapitola 8.1.4.). Citlivost metody ELFA se v případě detekce SEs pohybuje od 0,5 ng.g-1 (ml-1) (pro SEA a SEB) do 1,0 ng.g-1 (ml-1) (pro SEC, SED a SEE). Pro srovnání lze uvést citlivost ELISA testů, které detekují 0,1 – 1,0 ng enterotoxinu na 1 g (ml) potraviny. Možnost využití všech výhod, které automatizovaný systém VIDAS nabízí, je spojena s finanční investicí mikrobiologických laboratoří do nákupu přístroje. Časová úspora oproti kultivačním metodám bývá taktéž spojena s vyšší cenou vyšetření z důvodu nákupu vyšetřovacích souprav. Automatizovaný přístroj VIDAS má široké uplatnění v klinické medicíně při diagnostice virové hepatitidy, viru EBV (Epstein-Barrová virus známý také jako lidský herpesvirus 4 způsobující infekční mononukleózu) a HIV (původce nemoci AIDS), dále při stanovení Clostridium difficile, biochemických markerů (onkologická onemocnění, nemoci kardiovaskulárního systému) a dalších. V mikrobiologii potravin je přístroj VIDAS využíván při detekci Listeria spp., Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli O157:H7, Campylobacter spp. a stafylokokových enterotoxinů typu A – E.

34

Metody molekulární biologie

5. METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Ke konci 20. století se začaly velmi rychle rozvíjet genotypové metody. Ty se zaměřují na studium polymorfizmu molekul DNA nebo RNA (rozdílností v primární struktuře nukleových kyselin). Poskytují velmi přesné, objektivní a reprodukovatelné výsledky a umožňují také identifikovat nekultivovatelné mikroorganismy. Dále eliminují speciální růstové požadavky a zkracují čas potřebný ke správné identifikaci. Tyto metody významně zvýšily kvalitu identifikace mikroorganismů. Genotypové metody jsou zaměřeny buď na celkovou DNA, na určitý úsek DNA či RNA nebo na analýzu plazmidové DNA. V dnešní době je pro rodovou a druhovou identifikaci bakterií k dispozici celá řada molekulárně biologických metod. U některých je potřeba velkého množství DNA či RNA ve vzorku, neboť nedochází k amplifikaci (namnožení) cílových nukleových kyselin. Mezi tyto klasické metody řadíme např. Southern blot a nothern blot. Oproti tomu amplifikační metody (založené na polymerázové řetězové reakci) se vyznačují vysokou sensitivitou a specifitou a jsou dobře funkční i při nízkém množství cílových nukleových kyselin v analyzovaném vzorku.

5.1. Způsoby izolace nukleových kyselin Prvním krokem v provedení genotypových metod je extrakce nukleové kyseliny a její oddělení od ostatních složek buňky. Může se izolovat chromosomální DNA, plasmidová DNA a virová DNA či RNA, a to přímo ze vzorku, pomnožovacího média nebo z kolonií mikroorganismu na agarové půdě. Existuje celá řada metod extrakce a purifikace nukleových kyselin. Při výběru izolační techniky se zohledňuje požadavek na kvalitu a množství nukleové kyseliny, neboť ve velké míře rozhoduje o úspěšnosti navazujících molekulárně biologických metod. Také je brána v potaz časová náročnost, finanční nákladnost metody a zdroj nukleové kyseliny (typ vzorku či druh mikroorganismu).

5.1.1. Izolace nukleové kyseliny prokaryot Obecný postup získání nukleových kyselin zahrnuje narušení buněčných membrán a uvolnění buněčného obsahu, separaci nukleové kyseliny a v případě izolace DNA také odstranění RNA. K ruptuře buňky se využívají detergenty iontové povahy (např. soli žlučových kyselin či dodecylsulfát sodný – SDS), neionogenní detergenty (např. Triton X100), nebo fyzikálněchemické postupy (např. ultrazvuk). K oddělení nukleové kyseliny z roztoku buněčného obsahu se používá teplotní denaturace (záhřev), srážení organickými rozpouštědly, vysolování, fenol-chloroformová extrakce, chelatační iontoměničové pryskyřice, silikátové kolonky nebo paramagnetické nosiče. Molekuly RNA je možné degradovat enzymem ribonukleasou (RNasou), proteiny např. enzymem proteinasou. Problematika izolace nukleové kyseliny prokaryot je podrobně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie).

5.1.2. Izolace nukleové kyseliny virů Viry představují zvláštní kategorii živých soustav. Vyznačují se nebuněčnou strukturou a závislostí na hostitelské buňce. V laboratoři se mohou kultivovat na tkáňových kulturách, avšak u většiny alimentárních virů (např. noroviry, viry hepatitidy A a E) je tato kultivace velmi obtížná nebo dokonce nemožná. Proto je detekce v potravinách založena na molekulárně biologických metodách (PCR u DNA virů, reverzně transkripční PCR u RNA virů). Tyto metody však neumožní jednoznačně rozlišit infekční virové částice od neinfekčních. Zatím jen velmi málo mikrobiologických laboratoří analyzujících potraviny je

35


vhodně vybaveno pro rutinní práci s viry a také je velmi málo standardizovaných postupů izolace a detekce virů. Nukleová kyselina se může z potravinové matrice izolovat buď přímo, nebo až po izolaci a zakoncentrování virových částic. Existuje celá řada postupů, u kterých se jednotlivé kroky dají kombinovat, avšak ne všechny jsou vhodné pro použití na všechny typy potravin a všechny viry, které způsobují alimentární onemocnění. Technika izolace virových částic se vybírá podle typu matrice (liší se pro potraviny s vysokým obsahem sacharidů, nebo tuků a bílkovin, mořské živočichy s exoskeletem, vzorky vody, prostředí nebo fekálií). Používá se elučních technik (pomocí pufrů) s následným zakoncentrováním virových částic (pomocí polyethylenglykolu – PEG, imunomagnetické separace, ultracentrifugace nebo filtrace elektricky nabitými filtry) a ošetření proteinasou K. Po zakoncentrování virových částic je potřeba uvolnit nukleovou kyselinu z virových obalů, odstranit nežádoucí zbytky hrubých lyzátů a nukleové kyseliny zakoncentrovat. Pro narušení virových obalů lze použít specifické enzymy či detergenty (SDS, laurylsulfát sodný), sonifikaci ultrazvukem nebo speciální přístroj „bead beater“, který protřepává biologický materiál se skleněnými či zirkonovými kuličkami, které mechanicky narušují virový obal. Pro alimentární viry, které nejsou obalené a mají pouze proteinovou kapsidu, stačí působení fenolu (případně ve směsi s chloroformem). Nežádoucí proteiny z hrubého lyzátu se odstraňují proteinasami, RNA (v případě izolace DNA) RNasami a DNA (v případě izolace RNA) DNasami. Manipulaci s RNA je nutno provádět v ledové lázni, používat ochranné rukavice a pracovat za aseptických podmínek. Pro přímou extrakci nukleové kyseliny z potravinové matrice lze použít guanidin isothiokyanát (GITC), který má destruktivní účinek na všechny komponenty vzorku kromě nukleových kyselin. V potravinách živočišného původu se pro uvolnění nukleové kyseliny z tkáně dá použít také přístroj „bead beater“. Poté následuje extrakce fenolem nebo ultracentrifugace v chloridu cesném a precipitace nukleové kyseliny ethanolem či izopropylalkoholem (u RNA v přítomnosti LiCl). Existují komerční soupravy (silikátové kolonky, chromatografické systémy, atd.), které mají výhodu snadného provedení, avšak jsou finančně nákladnější a hlavně nejsou vhodné pro každou izolaci virové DNA či RNA.

5.2. Polymerázová řetězová reakce (PCR) Základem pro mnohé molekulárně biologické metody je polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction). Pomocí této techniky může být za podmínek in vitro rychle a vysoce selektivně namnožena konkrétní nukleotidová sekvence obsažená v DNA. Problematika polymerázové řetězové reakce, včetně detekce PCR produktů, je podrobně studována v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie).

5.2.1. Základní principy Principem PCR je opakované kopírování (amplifikace) templátové (vzorové) molekuly DNA pomocí enzymu DNA-polymerasy. Syntéza DNA je řízena dvěma krátkými oligonukleotidy (primery), které se komplementárně párují s templátovou DNA na počátku a na konci amplifikovaného fragmentu, každý s jiným vláknem původní dvouřetězcové molekuly DNA. V průběhu polymerázové řetězové reakce se opakovaně střídají 3 kroky. Prvním krokem je denaturace, kdy obvykle při 95 °C dojde k uvolnění vodíkových můstků a z dvouřetězcové DNA (dsDNA) vzniknou dvě jednořetězcové DNA (ssDNA). Následuje annealing – připojení (hybridizace) primerů k templátové ssDNA. Tím dojde k ohraničení cílové

36


sekvence, která bude amplifikována. Tento krok probíhá při teplotě 50 až 65 °C. Ta závisí na bodu tání primerů (Tm), jejich délce a nukleotidové sekvenci. U tohoto kroku je nutné provést optimalizaci. Poté následuje poslední krok, syntéza nového vlákna DNA (vznik dsDNA), tzv. elongace. Probíhá obvykle při teplotě 72 °C a kromě DNA-polymerasy jsou nutné všechny čtyři 2´-deoxyribonukleosid-5´-trifosfáty (dNTPs – adenin, guanin, cytosin a thymin). Přesné hodnoty teploty a dobu trvání jednotlivých kroků je třeba optimalizovat. Tyto kroky se 25 až 35 cyklicky opakují. Optimální počet cyklů je závislý na výchozí koncentraci templátové DNA. Nově vytvořená DNA se v dalším cyklu stává matricí (templátovou DNA). Celý proces amplifikace probíhá v přístroji termocykler, v němž se teplota mění automaticky v naprogramovaných časových intervalech. Aby byl zabezpečen správný průběh PCR, je potřeba připravit reakční směs (master mix) obsahující templátovou DNA, primery, dNTPs, reakční pufr, hořečnaté kationty, PCR H2O a DNA-polymerasu (nejčastěji se používá termostabilní Taq polymerasa izolovaná z termofilní bakterie Thermus aquaticus). Výsledným produktem polymerázové řetězové reakce jsou amplikony, úseky DNA s definovanou délkou, o velikosti obvykle desítky až tisíce párů bazí (bp). Koncentrace a množství jednotlivých komponent reakční směsi hraje rozhodující roli při tvorbě PCR produktu a stanovuje se empiricky. Správný průběh reakce se sleduje systémem kontrol. Ty nám mohou indikovat např. kontaminaci PCR komponent (negativní kontrola) nebo funkčnost všech složek reakce (pozitivní kontrola). Aby nedocházelo ke křížovým kontaminacím, je potřeba mít od sebe oddělené prostory pro izolaci DNA, přípravu reakční směsi (nejlépe laminární box) a manipulaci s PCR produkty, včetně samostatných pomůcek pro každou z těchto činností. Tyto místnosti by se měly pravidelně dekontaminovat UV světlem. Pro rutinní provádění polymerázové řetězové reakce jsou dostupné komerčně předpřipravené PCR master mixy (např. od firmy Top-Bio, s.r.o. či Qiagen, GmbH) obsahující DNApolymerasu, reakční pufr, MgCl2, barvivo a aditiva potřebná pro detekci amplikonů agarózovou gelovou elektroforézou.

5.2.2. Detekce PCR produktů K analýze produktů polymerázové řetězové reakce mohou být použity různé metody. Např. hybridizace, ELISA nebo sekvenční analýza. Avšak snadná, levná a asi nejužívanější je separace amplikonů pomocí agarózové gelové elektroforézy (ELFO). PCR produkty migrují agarózovým gelem na základě jejich záporného náboje od katody ke kladně nabité anodě, rychlost pohybu molekul DNA je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Amplikony jsou obarveny např. ethidium bromidem (barvivo interkalující se mezi vlákna dsDNA). V ultrafialovém světle obarvený fragment DNA oranžově fluoreskuje. Bezpečnější alternativou ke karcinogenní, mutagenní a teratogenní látce ethidium bromid je barvení PCR produktů pomocí látky Midori Green, která emituje zelenou fluorescenci. Podle velikosti amplifikovaného fragmentu, určené porovnáním s markerem, tj. velikostním standardem obsahujícím různě dlouhé fragmenty DNA, usuzujeme na přítomnost specifického genu ve vzorku.

5.2.3. Modifikace PCR Polymerázová řetězová reakce je používána v široké škále variant, které jsou upraveny podle účelu analýzy. U mnohonásobné multiplex PCR je možná detekce více genů v jedné reakci současně. Podle počtu požadovaných amplikonů, obsahuje master mix počet párů primerů. Primery musí být navrženy tak, aby se výsledné PCR produkty daly odlišit svou velikostí nebo byly značeny různými fluorofory (u real-time PCR). Tato varianta PCR je výhodnější 37


než provedení samostatných amplifikací, zejména z hlediska časového i ekonomického (ušetření komponent reakční směsi). Avšak optimalizace metody je náročnější než s jednou sadou primerů. Obecně platí, že jsou amplifikovány maximálně 4 různé cílové sekvence pro zajištění adekvátní citlivosti, specifičnosti a snadné interpretace dat. Využívá se často pro stanovení několika bakteriálních druhů současně (např. Campylobacter jejuni a C. coli) nebo při detekci genů kódujících stafylokokové enterotoxiny či genů rezistence. Odstupňovaná PCR (nested PCR) neboli PCR využívající vnějších a vnitřních primerů. Tento typ PCR probíhá ve dvou krocích a vyznačuje se vysokou citlivostí. V prvním kroku dochází k amplifikaci za účasti prvního, vnějšího páru primerů, poté se PCR produkt stává matricí další polymerázové řetězové reakce a amplifikuje s druhým, vnitřním párem primerů. Zpětná neboli reverzní PCR (RT-PCR) je metoda určená k amplifikaci molekul RNA. RNA je nejprve přepsána na cDNA (komplementární DNA) enzymem zpětná transkriptasa. Tento enzym je termolabilní (již nad 40 °C ztrácí svoji funkčnost), stringence (podmínky ovlivňující sílu a specifitu hybridizace) reakce je poměrně nízká (dochází k nekomplementárnímu párování bazí a transkripce tak není dokonalá). Proto se nyní využívá enzym Tth DNApolymerasa (RNA-dependentní DNA-polymerasa), která umožňuje nejen přepis RNA do DNA při teplotě 72 °C, ale i vlastní amplifikaci a tvorbu PCR produktu. Speciálním typem polymerázové řetězové reakce je in situ-PCR. Při této metodě probíhá amplifikace specifické sekvence nukleové kyseliny přímo v buňce či tkáni. Postup zahrnuje šetrnou fixaci buněk k podložnímu sklu a nastavení podmínek pro permeabilitu nezbytných PCR reagencií do buňky. Detekce probíhá pomocí in situ hybridizace nebo imunochemicky. Jak prokaryotické, tak eukaryotické genomy obsahují repetitivní (opakující se) sekvence. Mezi těmito dlouhými repetitivními elementy se v genomu prokaryot nacházejí také relativně krátké nekódující sekvence. Při interrepetitivní (repetitivní) PCR (REP-PCR) dochází právě k amplifikaci těchto sekvencí oddělujících v genomu různé typy repeticí. Tímto typem PCR se získá soubor různě dlouhých amplikonů charakteristický pro daný mikroorganismus (obrázek 18). Profil genomu konkrétního mikroorganismu zobrazený spektrem PCR produktů (případně restrikčních fragmentů) se nazývá fingerprint. Pomocí počítačového softwaru se amplikony jednotlivých izolátů porovnávají s typovými kmeny, vytvoří se dendrogram a izoláty se identifikují. Touto metodou za použití různých primerů (např. (GTG)5) lze rozlišit některé druhy bakterií mléčného kvašení, např. při studiu diversity startovacích a doplňkových kultur. Velké využití má tato metoda jako typizační technika při genotypizaci izolátů mikroorganismů.

Obrázek 18: Agarózová gelová elektroforéza amplikonů vzniklých pomocí rep-PCR. (U izolátů v běhu č. 3, 5 a 6 se vytvořily stejné amplikony, jedná se o stejný bakteriální druh).

Další fingerprintovou metodou založenou na PCR, pomocí níž lze zobrazit profil DNA konkrétního organismu, je náhodná PCR (RAPD). Tato rychlá a jednoduchá metoda se používá k identifikaci a typizaci některých druhů bakterií. U RAPD se krátký oligonukleotidový primer náhodně váže k templátové DNA a vzniká soubor amplikonů charakteristický pro daný mikroorganismus (podobně jako u rep-PCR). Pomocí agarózové gelové elektroforézy jsou detekovány amplifikované fragmenty různé velikosti a tím se vytvoří specifický fingerprint pro testovaný mikroorganismus.

38


5.2.3.1. Real-time PCR (qPCR) Dnes velmi využívaným typem polymerázové řetězové reakce je real-time PCR (qPCR), která umožňuje přímou detekci a kvantifikaci PCR produktu „v reálném čase“ (v průběhu celé PCR reakce), nikoliv až po jeho skončení. Při stanovení PCR produktů se využívá sledování fluorescenčního signálu. Jeho intenzita je permanentně snímána a analyzována speciálním přístrojem, ve kterém zároveň probíhá PCR, tudíž se amplikony nemusí detekovat elektroforeticky. Tím je tato technika zjednodušena a urychlena. Stanovení množství molekul nukleových kyselin ve vzorku se využívá při studiu detekce patogenních mikroorganismů a virů a také exprese genů (zejména studium transkripce – zda je a v jaké míře daný gen přepisován z DNA do mRNA). Předností metody qPCR je zejména rychlost bez nutnosti detekce PCR produktu (výsledek do několika hodin), jednoduchost provedení, přesnost a citlivost. K detekci vznikajícího PCR produktu lze využít fluorescenční barviva, fluorescenčně značené hybridizační sondy nebo fluorescenčně značené primery. V prvním případě se používají barviva (např. SYBR® Green I), která fluoreskují po vazbě na dsDNA. Fluorescenční signál se zvyšuje se vzrůstajícím množstvím PCR produktu. Nevýhodou fluorescenčního kyaninového barviva SYBR® Green I je to, že nelze rozlišit PCR produkt od nespecificky naamplifikovaných sekvencí a nedá se použít u multiplex PCR. Druhý způsob detekce amplikonů je prostřednictvím fluorescenčně značených hybridizačních sond (krátké oligonukleotidy), které se komplementárně vážou na vnitřní část amplifikované sekvence. Existuje celá řada těchto sond, které mohou obsahovat kromě různých typů fluoroforů (např. FAM), také zhášeč (např. TAMRA). U sondy TaqManTM je možné fluorescenci snímat až po ukončení zhášení, kdy se zhášeč oddálí od fluoroforu, a to rozložením sondy pomocí enzymu Taq DNA-polymerasy při elongaci (obrázek 19). Mezi další typy sond patří tzv. molekulární majáky. Je možné také využít přenosu energie fluorescenční rezonance – technologie FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Třetí způsob detekce amplionů při qPCR je pomocí fluorescenčně značených primerů, např. technologie AmpliFluorTM Obrázek 19: Technologie TaqManTM. nebo LUX. U klasické PCR je velmi obtížná kvantifikace. Korelace mezi počátečním množstvím templátu a konečným množstvím PCR produktu (i přes známý počet cyklů) není spolehlivá. Spolehlivější je vztah mezi množstvím templátu a počtem amplifikačních cyklů nutných pro vytvoření detekovatelného PCR produktu (čím více templátu ve vzorku, tím dříve je možné PCR produkt detekovat). Cyklus, ve kterém je již PCR produkt detekovatelný se nazývá jako prahový cyklus CT (treshold cycle). A právě tato kvantifikace může být prováděna metodou qPCR, která zaznamenává vznik amplikonů v průběhu celé reakce. Existují dva způsoby kvantifikace. Relativní kvantifikace, při které dochází pouze ke srovnání dvou vzorků a získání informace, ve kterém vzorku a kolikrát je více templátu. Při „absolutní“ kvantifikaci je množství templátu vztaženo k externímu templátu a kvantifikováno přesné množství. V tomto případě je nutné ze standardů sestrojit kalibrační křivku vyjadřující závislost CT na známém množství DNA standardního vzorku, ze které se určuje počet kopií DNA v templátu.

39


5.2.4. Inhibitory polymerázové řetězové reakce Teoreticky umožňuje technika PCR detekovat jednu jedinou buňku či molekulu DNA. Avšak správný průběh reakce může být narušen přítomností celé řady inhibitorů. Zejména potravinová matrice se vyznačuje jejich velkým množstvím. Za snížení citlivosti či úplné selhání reakce mohou být zodpovědné bakteriální enzymy (nukleasy, proteasy), polysacharidy, proteiny, lipidy a další složky potravin (např. ionty Ca2+ u mléčných výrobků, myoglobin u masných výrobků), pudr z laboratorních rukavic, složky kultivačních médií, detergenty, antibiotika, aj. Již při izolaci nukleové kyseliny může dojít k selhání buněčné lýzy nebo degradaci templátové DNA či RNA. Poškozeny mohou být také primery (zejména ty s nižší teplotou tání), případně může dojít k obsazení jejich cílových míst. Termostabilní DNA-polymerasu mohou inhibitory inaktivovat. K inhibici dojde snáze, pokud je nízká koncentrace templátové nukleové kyseliny a pokud se tvoří dlouhý amplikon nebo amplikon s nižším obsahem G+C bazí. U real-time PCR může být inhibován také fluorescenční signál. Tyto nežádoucí vlivy se mohou projevit jako falešně negativní výsledek.

5.2.5. Výhody, nevýhody a využití metody PCR v praxi Polymerázová řetězová reakce je nejpoužívanější amplifikační technika. Má však i svá omezení. Její citlivost je tak vysoká (umožňující detekci jediné buňky), že u kontaminovaných vzorků se mohou vyskytnout falešně pozitivní reakce. Naopak v přítomnosti kontaminujících látek, které PCR inhibují, může dojít k falešně negativní reakci. V potravinářské mikrobiologii se polymerázová řetězová reakce využívá jednak k rychlé detekci alimentárních patogenů přímo ze vzorku, jako jsou Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Shigella spp., Campylobacter jejuni/coli, patogenní serotypy E. coli, Vibrio spp., Yersinia enterocolitica/pseudotuberculosis, Clostridium perfringens, Cronobacter sakazakii, S. aureus, Bacillus cereus, atd. Využití nachází také při rodové konfirmaci a druhové identifikaci mnoha bakterií (např. enterokoky a další bakterie mléčného kvašení) a dále při průkazu genů kódujících faktory virulence, genů rezistence k antimikrobiálním látkám a genů zodpovědných za tvorbu enterotoxinů, biogenních aminů či bakteriocinů. Ve vzorcích potravin se obvykle patogenní mikroorganismy vyskytují v nízkých počtech a při jejich průkazu standardními metodami je nutné je nejprve pomnožit, čímž se prodlužuje doba identifikace. Využití PCR tedy významně zkracuje potřebnou dobu stanovení. Na druhou stranu, stejně jako u jiných alternativních metod, musí být pozitivní výsledek (průkaz patogenního mikroorganismu přímo ve vzorku) potvrzen standardní kultivační metodou. Metoda PCR se může přímo využít k detekci mikroorganismů, avšak nestanovíme jí přítomnost toxinů a dalších metabolitů schopných ovlivnit bezpečnost potravin (např. stafylokokové enterotoxiny). Stanoví se pouze geny kódující tyto látky nebo jejich exprese. Problémem při detekci alimentárních virů je to, že mohou být detekovány i inaktivované virové částice, které již nepředstavují žádné riziko. Jejich nukleová kyselina může v potravinové matrici přetrvat i po narušení funkce kapsidy viru. V takové formě ztrácí viry schopnost vázat se na hostitelskou buňku. Molekulárně biologické metody mohou být použity i při identifikaci pomalu rostoucích či velmi obtížně kultivovatelných mikroorganismů, kde významně zvýšily kvalitu jejich identifikace. Dále se jimi mohou detekovat alergeny či geneticky modifikované organismy. Na druhou stranu, některé molekulární techniky jsou poměrně nákladné, časově náročné a pracné, a proto nejsou vždy vhodné pro rutinní identifikaci.

40


5.3. Hybridizační techniky Hybridizace je proces vytváření dvouřetězcových (ds, angl. double stranded) molekul z jednořetězcových (ss, angl. single stranded) molekul nukleových kyselin (DNA či RNA). Hybridizovat mohou jakékoliv ssDNA či ssRNA za předpokladu, že se jejich sekvence vyznačují úplnou nebo částečnou komplementaritou bazí. Mezi párovými bazemi dochází k tvorbě vodíkových můstků. Podle typu molekul, které se mohou párovat, existuje DNA/DNA hybridizace, DNA/RNA hybridizace a RNA/RNA hybridizace.

5.3.1. Základní principy Před hybridizací se musí dvouřetězcové molekuly nukleových kyselin denaturovat (působením vysoké teploty, enzymaticky nebo chemicky např. NaOH). Při vlastní hybridizaci se smíchá hybridizační sonda s vyšetřovanou nukleovou kyselinou a zajistí se vhodné podmínky pro hybridizaci, a to koncentrace iontů a vhodná teplota, které lze s určitou přesností odvodit od tzv. teploty tání sondy. Poté se odmyje sonda, která se nenavázala na vyšetřovanou nukleovou kyselinu a detekuje se hybridizační produkt. Nastavení různých hybridizačních podmínek umožňuje vytvoření hybridizačních produktů obsahujících i nespárované úseky. Čím jsou tyto podmínky přísnější, tzv. vyšší stringence (vyšší teplota, blížící se teplotě tání), tím se docílí dokonalejší vazby sondy na vyšetřovanou Obrázek 20: Hybridizace při nastavení různé nukleovou kyselinu a hybridy jsou stabilnější. stringence – podmínek přísnosti. Čím je stringence nižší (nižší teplota (Alberts et al., 2005 – upraveno) hybridizace), tím častěji vznikají nestabilní hybridy s nedokonale spárovanými nukleotidy (obrázek 20). Kromě teploty ovlivňuje stabilitu hybridů i jejich délka a zastoupení GC a AT párů, pH a koncentrace solí v roztoku a přítomnost látek destabilizujících vodíkové můstky mezi řetězci. Záleží také na tom, které molekuly spolu hybridizují – stabilita klesá v pořadí RNA-RNA, RNA-DNA, DNA-DNA. Výchozím krokem pro hybridizaci je příprava hybridizační sondy. Sondou se rozumí jednořetězcová radioaktivně nebo chemicky značená nukleotidová sekvence DNA (RNA), vázající se komplementárně k cílové sekvenci, která je takto identifikována. Aby měla sonda požadovanou sekvenci, může být uměle připravena např. polymerázovou řetězovou reakcí. Původně byly sondy pro hybridizaci značeny radioaktivně. Radioaktivní sondy mají ve své sekvenci začleněny nukleotidy obsahující radioaktivní izotop (32P, 33P, 35S, 3H). Signálem sondy je radioaktivní záření, které lze detekovat autoradiograficky na vrstvě fotografického filmu, papíru nebo emulze.Tento způsob detekce cílové sekvence je velmi citlivý, ale kvůli bezpečnosti práce dnes převažují sondy značené chemicky. Do sekvence těchto sond jsou zabudovány chemicky modifikované nukleotidy dUTP (do DNA se začleňují místo dTTP) nesoucí molekulu digoxigeninu (DIG) nebo biotinu. Tyto molekuly působí jako antigen a jsou rozpoznávány protilátkami. Sonda s digoxigeninem je detekována protilátkou specifickou pro digoxigenin (Anti-DIG). U biotinu se mohou použít kromě specifické protilátky také avidin nebo streptavidin. Na protilátkách je navázán buď enzym (alkalická fosfatasa, peroxidasa, luciferasa) nebo fluorescenční barvivo (fluorescein, rhodamin). Po přidání substrátu

41


katalyzuje příslušný enzym reakci, jejímž výsledkem je změna barvy substrátu nebo jeho rozpustnosti, emise světla, případně fluorescence. Uspořádání hybridizačních experimentů je velmi variabilní. Provádí se např. hybridizace v roztoku, gelu, na filtrech, čipech, v elektronovém mikroskopu nebo in situ hybridizace (obrázek 21). K nejcitlivějším technikám patří hybridizace v roztoku. Cílová molekula i sonda volně plavou v reakční směsi a dochází k rychlé tvorbě hybridizačního produktu. Pro tento typ hybridizace stačí velmi málo vzorku. Kombinací hybridizace v roztoku a na pevném podkladu vznikla hybridizace, kdy jsou využity kovové kuličky s imobilizovanými sondami. Hybridizace in situ umožňuje detekovat přítomnost specifických sekvencí nukleových kyselin (Šmarda et al., 2010 – upraveno) v cytologických preparátech chromosomů, buněk nebo řezech tkání a s vysokou přesností stanovit jejich prostorovou lokalizaci. Využití má zejména k detekci genů na polytenních chromosomech hmyzu, metafázních chromosomech savců a rostlin, k detekci specifických molekul RNA uvnitř buněk a tkání nebo k detekci RNA či DNA virů. Obrázek 21: Možnosti experimentálního hybridizace nukleových kyselin.

provedení

Pokud sondy obsahují fluorescenčně značené nukleotidy, technika se nazývá fluorescenční hybridizace in situ (FISH, Fluorescent In Situ Hybridisation). Vizualizace navázaných sond se provádí fluorescenční mikroskopií. Mohou se použít sondy s různou sekvenční specifičností značené látkami fluoreskujícími různými barvami, což umožňuje identifikaci polohy několika genů současně. Tuto metodu lze použít při detekci či konfirmaci bakterií.

5.3.2. Hybridizace na pevném podkladu Hybridizace na pevném podkladu je jednou z nejčastěji používaných technik. Denaturovaná DNA nebo RNA je přenesena na nitrocelulózový filtr nebo nylonovou membránu. Tato technika je méně citlivá než hybridizace v roztoku, ale její výhodou je možnost testování většího množství vzorků najednou. Pokud je potřeba zjistit, která kolonie nese hledané sekvence, provádí se hybridizace bakteriálních kolonií. Nejprve jsou kolonie přeneseny z agaru v Petriho misce na membránu (otisk je zrcadlově otočený). Potom jsou buňky lyzovány a uvolněná dsDNA je denaturována na ssDNA. Jednořetězcová bakteriální DNA je např. pomocí UV přichycena k membráně a po přidání ssDNA sondy hybridizována. Hybridizační produkt je vizualizován a podle jeho polohy je detekována kolonie s hledanou cílovou sekvencí (obrázek 22). U „dot blot“ (tečkové/kapkové) hybridizace je na hybridizační membránu nakápnuta a přichycena přímo denaturovaná nukleová kyselina. Pomocí hybridizace se mohou také vyhledávat a lokalizovat geny u restrikčních fragmentů, které jsou elektroforézou rozděleny na základě velikosti. Po elektroforetické separaci se tyto fragmenty přenáší z agarózových případně polyakrylamidových gelů na pevný podklad. Podle typu přenášené molekuly se rozlišuje Southernův přenos DNA (Southern blotting) a

42


nothernový přenos RNA (nothern blotting). Přenášet se mohou i proteiny (např. stafylokokové enterotoxiny), potom hovoříme o tzv. westernovém přenos (western blotting). Při těchto technikách se na gel položí membrána a na ni vrstva filtračního papíru, která nasává denaturační pufr prostupující přes gel a hybridizační membránu. Zdenaturované nukleové kyseliny jsou z gelu unášeny společně se vzlínajícím pufrem a zachyceny na membráně. Přenos probíhá díky kapilárním silám. Poté se pevně přichytí nukleové kyseliny na membránu a provede se hybridizace s vizualizací. Vzorky nukleových kyselin mohou být po odmytí sondy opětovně hybridizovány s jinou sondou. Tento postup se nazývá rehybridizace.

Obrázek 22: Hybridizace kolonií. (Alberts et al., 2005 – upraveno)

5.3.3. Mikročipy („microarrays“) Hybridizace může probíhat i opačně, kdy jsou na pevném podkladě připevněny neznačené sondy, ke kterým se přidá fluorescenčně značená testovaná nukleová kyselina. Je to tzv. zpětná (reverzní) hybridizace. Příkladem tohoto typu hybridizace je mikročip. Nejhustější mikročipy obsahují desítky až tisíce fragmentů ssDNA na jedné skleněné mikroskopické destičce. Dochází tedy k několika tisícům hybridizací současně. Detekci fluorescence po hybridizaci zajišťuje konfokální laserový skener spojený s počítačem provádějícím analýzu. Intenzita fluorescenčního signálu je závislá na množství nukleové kyseliny, proto je možné kvalitativní i kvantitativní stanovení specifických úseků cílových molekul v jedné reakci. 5.3.4. Výhody, nevýhody a využití hybridizačních technik v praxi Pomocí oligonukleotidových sond, které při hybridizaci komplementárně nasedají na specifické úseky bakteriálního genomu, lze identifikovat velké množství druhů bakterií. Mezi nevýhody hybridizačních metod patří pracnost a časová náročnost, nižší citlivost než u amplifikačních metod a možnost falešně pozitivních výsledků, kdy za podmínek nízké stringence dojde k navázání sondy i na sekvenci, která není plně komplementární. Výroba mikročipů je poměrně nákladná, avšak samotná analýza je levná a rychlá. Mikročipy se mohou využít při studiu genové exprese (jsou měřeny rozdíly v počtu RNA transkriptů jednotlivých vzorků), k porovnávání genů blízce příbuzných mikroorganismů, detekci genů antimikrobiální rezistence a k identifikaci zejména patogenních bakterií, kdy jedna mikročipová sada může obsahovat hybridizační DNA sondy celé řady bakteriálních druhů. Dále se mohou DNA/RNA čipy využít při detekci virů. 43

Nepřímé metody

6. NEPŘÍMÉ METODY Nepřímé metody nám umožňují stanovit určitou složku, enzym, metabolit nebo změnu prostředí způsobenou růstem mikroorganismů. Zjištěná hodnota sledovaného znaku může být následně využita k průkazu či odhadu počtu mikroorganismů ve vzorku. Existují různé druhy nepřímých metod, v této kapitoly jsou zmíněny ty nejčastěji aplikované při mikrobiologickém vyšetření potravin.

6.1. Elektrické metody Elektrické metody jsou založeny na měření odezvy mikrobiálních kultur na střídavý elektrický proud v určitých frekvencích. Měřicí elektrody se umisťují přímo do živného média nebo homogenátu potraviny. Sledují se následující parametry – impedance, vodivost a kapacitance, a to buď samostatně nebo v kombinaci. Elektrické metody lze využít ke kvantitativnímu i kvalitativnímu stanovení mikroorganismů. Elektrické metody patří mezi tzv. růstové testy. U konvenčních růstových testů je výsledkem nárůst viditelných, dobře ohraničených kolonií na povrchu pevných živných médií, příp. zakalení tekutých médií někdy doprovázené i změnou barvy. V případě elektrických metod se jedná o metabolizaci elektricky neutrálních substrátů na vodivé molekuly a následné změny hodnocených elektrických parametrů.

6.1.1. Teorie impedance Impedanci lze zjednodušeně definovat jako odpor vůči toku střídavého proudu při průchodu vodivým materiálem. Impedance má vždy dvě složky – kapacitanci a vodivost (konduktanci), přičemž kapacitance více odráží vlastnosti a změny na elektrodách, zatímco vodivost změny prostředí (roztoku, gelu) mezi elektrodami. Obě složky jsou závislé na frekvenci střídavého proudu aplikovaného na elektrodový systém. Při nízkých frekvencích je impedance do značné míry ovlivněna kapacitancí, zatímco při vysokých frekvencích převážně vodivostí. Je-li roztok elektrolytu vystaven elektrickému poli, kationty migrují k záporné elektrodě (katodě) a anionty k elektrodě kladné (anodě). Pohyb iontů vytváří v roztoku proud, přičemž každý iont nese zlomek proudu, a to v poměru ke své pohyblivosti a koncentraci. Vodivost je definována jako převrácená hodnota odporu. Každé její zvýšení má za následek snížení impedance a zvýšení proudu. Impedance je měřena v jednotkách Siemens (S).

6.1.2. Základní principy Každé růstové médium má určitou hodnotu impedance, která závisí na jeho chemickém složení (obsahu makromolekul) a také na složení inokula. Největší vliv mají soli. Měřicí přístroje obecně nedostatečně reagují na vysoký obsah soli v živném médiu nebo velmi slané potraviny, pokud nejsou dostatečně naředěny. Protože má impedance vysoký teplotní koeficient, je pro správné měření nezbytná velmi přesná kontrola teploty stanovení. 6.1.2.1. Přímá metoda měření impedance Substráty používané v živných médiích jsou obvykle bez náboje nebo mají jen slabý náboj. Při jejich metabolizaci mikroorganismy vznikají vysoce vodivé metabolity a dochází ke zvýšení vodivosti média (např. aminy a amoniak vzniklé štěpením bílkovin či kyselina mléčná vznikající při štěpení sacharidů). Složení živného média je tedy pro impedanční mikrobiologii velmi důležité. Musí být pro testovaný mikroorganismus selektivní, podporovat jeho růst a musí být optimalizováno pro elektrický signál. Po inokulaci vzorku jsou testovací zkumavky inkubovány při teplotě odpovídající sledovanému mikroorganismu. Impedanční systém měří v pravidelných intervalech (obvykle 6 minut) změny impedance živného média. 44

Nepřímé metody

Na začátku testu uživatel definuje kriteria testu. Počítač zobrazuje na displeji průběh měření každého vzorku a také překročení hodnoty zvoleného parametru u pozitivních vzorků či překročení časového limitu u vzorků negativních. Získaná data mohou být archivována a dále zpracována. Měřicí systém je obvykle tvořen inkubační a měřicí jednotkou napojenou na počítač. Vybraný ukazatel je primárně zobrazen jako závislost změny daného parametru v čase (růstová křivka). Místo na křivce a tomu odpovídající čas, kdy byla poprvé zaznamenána odchylka růstové křivky, se označuje jako detekční čas. Detekční čas je funkcí velikosti počáteční mikrobiální populace, růstové kinetiky testovaného mikroorganismu a vlastností růstového média. Je nepřímo úměrný počáteční mikrobiální kontaminaci vzorku. V okamžiku detekce se obvykle předpokládá přibližně 105 až 106 KTJ.ml-1 sledovaných mikroorganismů v testované kultuře. Vzniklé křivky jsou reprodukovatelné pro jednotlivé druhy i kmeny mikroorganismů. Doba stanovení je řádově několik hodin, a to v závislosti na stupni kontaminace vzorku. Vyjádřením detekčních časů proti počtu mikroorganismů v inokulu vznikne lineární křivka. Díky tomu může být detekční čas, po provedení příslušných kalibračních testů, využit ke stanovení počtu mikroorganismů. Při kvalitativním stanovení, které můžeme provádět bez nebo s předpomnožením vzorku, se vzorek inokuluje do selektivního média vhodného pro daný mikroorganismus. Detekční čas v tomto případě indikuje průkaz cílového mikroorganismu. Po ukončení testu můžeme pozitivní kulturu podrobit konfirmačním testům. 6.1.2.2. Nepřímá metoda měření impedance Řada selektivních živných médií obsahuje vysokou koncentraci soli, stejně tak jako některé potraviny. Výsledné vysoké hodnoty impedance těchto médií jsou mimo běžný pracovní rozsah přímé impedanční metody. Tento problém lze eliminovat použitím nepřímé metody měření impedance, kdy je mikrobiální metabolismus hodnocen na základě produkce oxidu uhličitého. Do zkumavky s elektrodami je přidán hydroxid draselný, v této zkumavce dochází k měření impedance. Zaočkované kultivační médium je v samostatné komoře, bez přímého kontaktu s elektrodami či KOH. Celý systém je pevně uzavřen tak, aby všechen CO2, vznikající při metabolické činnosti mikroorganismů, byl absorbován do roztoku KOH, což způsobuje výsledný pokles impedance. Metoda nepřímého stanovení impedance má oproti metodě přímé několik výhod. Lze použít i média určená pro klasické kultivační stanovení, která nemusí být optimalizována pro stanovení impedance, a to i média s vysokou koncentrací soli, které jsou jinak mimo rozsah měření přímé metody. Metodou lze detekovat i některé mikroorganismy, jejichž růst vyvolává pouze malé či nezjistitelné změny impedance (např. kvasinky a plísně). Nepřímou metodu lze využít také u vzorků, které mohou při přímém kontaktu nepříznivě ovlivňovat elektrody. Metoda je dobře využitelná při stanovení S. aureus, L. monocytogenes, E. faecalis, B. subtilis, E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Salmonella spp., kvasinek a plísní. 6.1.2.3. Faktory ovlivňující impedanční stanovení Detekční čas je nepřímo úměrný počtu mikroorganismů ve vzorku, proto prvním faktorem ovlivňujícím detekční čas je koncentrace testovaných mikroorganismů. Impedanční signál je dále ovlivněn koncentrací živného média. Zředěná média mají nízkou iontovou sílu, a proto změna vodivosti vyvolaná metabolismem mikroorganismů je poměrně velká. Navíc nízká koncentrace živného média nemusí plně podporovat nutriční potřeby testovaného mikroorganismu, výsledkem může být pomalejší růst.

45

Nepřímé metody

Dalšími faktory jsou složení živného média. a teplota, která ovlivňuje generační dobu mikroorganismů a také složky impedančního signálu – kapacitanci a vodivost. Je proto nezbytné, aby byla teplota v průběhu testu konstantní.

6.1.3. Měřicí systémy V současnosti jsou na trhu k dispozici 4 měřicí systémy – Bactometer® (výrobce bioMérieux), BacTrac (výrobce Sy-Lab), Malthus (výrobce Malthus Instruments Ltd.) a RABIT (Rapid Automated Bacterial Impedance Technique; výrobce Don Whitley Scientific Ltd.). Všechny přístroje umožňují automatizované kvalitativní i kvantitativní stanovení vybraných mikrobiologických ukazatelů. Vyznačují se jednoduchou obsluhou a možností současného vyšetření velkých sérií vzorků. Přístroje pracují v poměrně širokém teplotním rozmezí (stanovení různých skupin či druhů mikroorganismů), teplota stanovení je velmi přesně kontrolována. Tabulka 1: Systémy měření impedance – základní charakteristiky.

Bactometer® BacTrac Malthus RABIT

Typ měření impedance přímé přímé i nepřímé přímé i nepřímé přímé i nepřímé

Maximální počet vzorků 512 512 240 512

Typ inkubátoru suchý suchý vodní suchý

Teplotní rozsah 8 – 55 °C 0 – 55 °C 5 – 55 °C 3 – 50 °C

6.1.4. Výhody a nevýhody elektrických metod Elektrické metody patří mezi uznávané rychlé automatické metody používané v mikrobiologii potravin. Mohou být vzájemně propojeny s dalšími mikrobiologickými metodami. Jedná se např. o separaci a koncentraci cílových mikroorganismů v přípravné fázi testu za použití specifických imunomagnetických částic či konfirmaci pozitivních výsledků molekulárně biologickými metodami. Jednou z hlavních výhod je výrazná úspora času oproti klasickému kultivačnímu stanovení (zejména v případě více kontaminovaných vzorků). Možnost využití selektivních médií a optimálních teplot růstu rozšiřuje spektrum stanovovaných mikroorganismů. Díky minimální manipulaci se vzorkem (např. není potřeba připravit řadu ředění) je validita a reprodukovatelnost elektrických metod vysoká. Elektrické metody nevyžadují použití čirých vzorků či médií. Stanovení lze provést i ve vzorku obsahujícím částečky potraviny. Je pouze nutné vzorek naředit tak, abychom minimalizovali vliv případných antimikrobiálních látek v potravině (např. u čerstvého mléka). Provedení testů je velmi jednoduché, po inokulaci vzorku probíhá vlastní stanovení zcela automaticky. Získaná data jsou automaticky ukládána, vyhodnocována a mohou být dále zpracována. Další výhodou je možnost vyšetření velkých sérií vzorků. Po skončení testu lze z testovacích zkumavek odebrat kulturu obsahující velké množství cílových mikroorganismů pro provedení konfirmačních testů. Současně screening negativních vzorků umožňuje minimalizaci nákladů na další testy. Hlavní nevýhodou elektrických metod je vyšší počáteční investice na pořízení přístrojového vybavení, na druhou stranu vlastní provozní náklady i výsledná cena stanovení jsou poměrně nízké.

46

Nepřímé metody

6.1.5. Využití elektrických metod v praxi Elektrické metody patří mezi nejpoužívanější automatizované systémy v aplikované mikrobiologii, jejich použití bylo schváleno řadou akreditačních organizací po celém světě. Mezi validovaná stanovení patří např. detekce Salmonella spp. (validace AOAC, ISO); Mezinárodní mlékařská federace (IDF) schválila využití měření impedance při vyšetření mléka a mléčných výrobků, ve Francii se tato metoda používá při úřední kontrole ústřic na obsah střevních bakterií. Využití nachází elektrické metody při hodnocení mikrobiologické kvality potravin a potravinových surovin (syrové mléko a mléčné výrobky, jatečně upravená drůbež, čerstvé maso a masné výrobky, mořské plody, nápoje), testování vody, krmiv, environmentálních vzorků či produktů kosmetického průmyslu. Mezi nejpoužívanější testy patří stanovení celkového počtu mikroorganismů (CPM), bakterií čeledi Enterobacteriaceae, koliformních bakterií a Escherichia coli, bakterií rodu Salmonella, dále stanovení Vibrio spp., Campylobacter spp. či listerií. Přehled možných stanovení na jednotlivých přístrojích je uveden v tabulce 2. Tabulka 2: Systémy měření impedance – stanovované mikrobiologické ukazatele. aerobní mezofilní MO (CPM) psychrotrofní mikroorganismy termofilní mikroorganismy anaerobní mikroorganismy sporotvorné mikroorganismy gramnegativní bakterie Enterobacteriaceae koliformní bakterie Escherichia coli Salmonella spp. Campylobacter spp. Listeria spp. Bacillus cereus Enterococcus spp. bakterie mléčného kvašení kvasinky a plísně

Bactometer® + + +

+ +

BacTrac +

+ + + + + + + + +

+ +

+

Malthus +

RABIT +

+ +

+ + + + +

+ + +

+

+

+

Pozn.: MO – mikroorganismy

6.2. Radiometrické stanovení 14CO2 Radiometrická metoda detekuje mikrobiální růst měřením metabolitů, vznikajících z radioaktivních substrátů. Je obecně založena na principu měření množství 14CO2 uvolněného metabolickou činností bakterií utilizujících živiny s obsahem značeného uhlíku 14C. Pro mikroorganismy utilizující glukosu se používá značená glukosa, pro ostatní potom značený glutamát nebo jiný podobný zdroj uhlíku. Doba potřebná k tvorbě plynu (detekční čas) je nepřímo úměrná počtu mikroorganismů ve vzorku. Citlivost metody je závislá na počtu mikroorganismů nezbytných pro produkci detekovatelného množství 14CO2, obvykle je to 104 mikroorganismů v g či ml vzorku. Délka stanovení je v hodinách, nejčastěji 4 – 6 hodin. Radiometrické stanovení je rychlou a jednoduchou alternativou ke klasickému kultivačnímu vyšetření. Jedná se o screeningovou metodu umožňující výrazné zkrácení doby potřebné k získání výsledků. Vlastní stanovení je automatizované, nezbytné jsou tedy počáteční 47

Nepřímé metody

náklady pro pořízení potřebného přístrojového vybavení. Na druhou stranu, používání radioaktivních chemikálií je omezeno přísnými předpisy, což nedovoluje širší využití této metody. V potravinářství se tato metoda používá při mikrobiologickém hodnocení mražených potravin, tepelně ošetřených potravin (např. masných výrobků) či ovocných šťáv. V klinické mikrobiologii se radiometrické stanovení využívá např. k detekci Mycobacterium tuberculosis v klinických vzorcích (BACTEC 460TB System, výrobce Becton, Dickinson and Company).

6.3. Limulus Amebocyte Lysate test – LAL test V 50. letech minulého století bylo zjištěno, že lyzát amebocytů z hemolymfy členovce ostrorepa amerického (Limulus polyphenus) se sráží v přítomnosti endotoxinu gramnegativních bakterií. Bakteriální endotoxin (lipopolysacharid) je součástí buněčné stěny gramnegativních bakterií a je uvolňován do okolního prostředí po smrti a lýze bakteriální buňky. Toto zjištění vedlo následně k vývoji in vitro testu pro detekci pyrogenů kontaminujících přípravky určené k injekčnímu podávání. Od roku 1972 se v lékařském prostředí začal LAL test masivně používat. Současné medicínské využití spočívá zejména v detekci gramnegativních bakterií při meningitidách či infekcích močového traktu.

6.3.1. Detekce pozitivní reakce Klasickým způsobem detekce pozitivní reakce je vizuální posouzení tvorby gelu, jako je tomu u zkumavkového testu. Další možností je spektrofotometrické či turbidimetrické vyhodnocení, kdy se hodnotí změny v optické denzitě. Příkladem tohoto typu testu je modifikace automatizovaného systému MS-2 (výrobce Abbott Laboratories), tzv. MS-2 LAL, který se využívá např. při vyšetření moči. K vyhodnocení testu lze využít i chromogenní substrát. Vzniklá barevná reakce se odečítá spektrofotometricky, intenzita barvy je přímo úměrná množství endotoxinu. Test probíhá v mikrotitračních destičkách, pomocí speciálního readeru je vzniklá barevná změna hodnocena v pravidelných časových intervalech po celou dobu trvání testu (celkem 241 měření za 60 minut). Koncentrace endotoxinu ve vzorcích jsou vypočteny automaticky na základě standardní křivky odvozené z naměřených hodnot. Test je vysoce citlivý.

6.3.2. Zkumavkový LAL test K provedení zkumavkového testu se používá standardizovaný lyzát (obvykle 0,1 ml na jeden test). Citlivost činidla se nejdříve testuje za použití standardizovaného endotoxinu. Poté se stanoví obsah endotoxinu ve vzorcích. Ty se naředí a 0,1 ml každého ředění se přidá do zkumavky s LAL činidlem. Zaočkované zkumavky jsou po promíchání inkubovány 1 hodinu ve vodní lázni při teplotě 37 °C. Pozitivní reakcí je vznik pevného gelu, který zůstává ve zkumavce i po jejím otočení o 180°. Jako titr se označí nejvyšší ředění s pozitivním výsledkem. Ke stanovení množství endotoxinu v titru, se titr násobí předem stanovenou citlivostí LAL činidla zjištěnou při reakci se standardizovaným endotoxinem. Počet gramnegativních bakterií ve vzorku lze odhadnout na základě výpočtu počtu buněk, který odpovídá zjištěnému množství endotoxinu. 6.3.3. Využití LAL testu v praxi Mimo široké využití ve farmakologii a klinické mikrobiologii, lze LAL test použít také při mikrobiologickém hodnocení potravin. Metoda je dobře použitelná při screeningu mikrobiální kontaminace. Například při vyšetření čerstvého masa indikuje nízký obsah endotoxinu maso výborné mikrobiální kvality (vztaženo k obsahu gramnegativních bakterií – nejvýznamnější

48

Nepřímé metody

skupině mikroorganismů v čerstvém mase). Na druhou stranu vysoký obsah endotoxinu, zjištěný metodou LAL, nemusí vždy korespondovat s vysokou hodnotou CPM zjištěnou plotnovou metodou. A to třeba v případě, kdy došlo k destrukci gramnegativních bakterií záhřevem či účinkem bakteriofágů, nebo když je přítomný endotoxin reprezentován gramnegativními bakteriemi, které nerostou za podmínek stanovení CPM. Protože v čerstvých potravinách zpracovaných za standardních podmínek existuje více méně konstantní poměr gramnegativních a grampozitivních bakterií, lze výsledky LAL testu využít nejen k odhadu celkového počtu mikroorganismů, ale i počtu bakterií grampozitivních. Podobným způsobem lze odhadnout i počet plísní. Na druhou stranu LAL test nelze využít k odhadnutí „celkového“ počtu mikroorganismů v tepelně ošetřených výrobcích, protože gramnegativní bakterie jsou mnohem citlivější k záhřevu než bakterie grampozitivní. LAL test lze využít při hodnocení mikrobiální kvality syrového a pasterovaného mléka, mléčných výrobků, masa a masných výrobků, ryb, atd. Endotoxiny jsou termostabilní, proto lze u tepelně opracovaných výrobků zpětně posoudit výchozí kontaminaci suroviny. Výhodou LAL testu je především rychlost a jednoduchost provedení, dostupnost komerčně připraveného lyzátu či kompletních testovacích souprav a vysoká citlivost (detekuje ng endotoxinu, přítomného u gramnegativních bakterií). Na druhou stranu nelze rozlišit přítomnost živých či mrtvých buněk.

6.4. ATP bioluminiscenční test 6.4.1. Základní principy Každá živá buňka obsahuje ATP (adenosintrifosfát), který je univerzálním donorem energie pro její metabolické reakce. Množství ATP v buňkách je relativně konstantní, a proto může intracelulární koncentrace ATP sloužit ke stanovení biomasy nebo počtu životaschopných buněk. Po smrti buňky obsah ATP v důsledku autolytických procesů prudce klesá, veškeré ATP je rozloženo během několika minut. ATP bioluminiscenční metoda je založena na principu enzymové reakce mezi luciferinem (substrát) a luciferasou (enzym). Enzym luciferasa, přirozeně se vyskytující u světlušek (Photuris pyralis), katalyzuje za přítomnosti luciferinu, kyslíku a hořečnatých iontů přeměnu chemické energie ATP ve světlo pomocí oxidačně-redukční reakce (obrázek 23).

Obrázek 23: Schéma ATP bioluminiscenční reakce. (McMeekin, 2003 – upraveno) Luciferin je přeměňován na oxiluciferin, ATP na AMP (adenosinmonofosfát) za uvolnění pyrofosfátu (PPi), CO2 a současné emise světla o vlnové délce v rozmezí 470 – 700 nm (vrchol při 562 nm). Emitované světlo je měřeno pomocí luminometru, jeho množství se stanovuje v relativních světelných jednotkách (RLU; Relative Light Units). Dostupné luminometry jsou schopné detekovat méně než 0,1 pg ATP v kyvetě, což odpovídá počtu 102 bakteriálních buněk.

49

Nepřímé metody

Množství produkovaného světla je přímo úměrné koncentraci ATP vstupujícího do reakce a souvisí s počtem metabolicky aktivních buněk ve vzorku. Metodu lze tedy využít i ke stanovení celkového počtu mikroorganismů ve vzorku, protože mezi intracelulárním obsahem ATP a počtem KTJ bakterií či kvasinek je lineární vztah. I když lze teoreticky při použití vhodné techniky a činidel o vysoké čistotě stanovit množství ATP odpovídající přibližně stu mikrobiálních buněk, v praxi je to obvykle množství odpovídající asi 103 – 104 KTJ.g-1. Široké použití má při hodnocení čistoty povrchů přicházejících do kontaktu s potravinami.

6.4.2. Stanovení počtu mikroorganismů v potravinách ATP bioluminiscenční test byl původně vyvinut k odhadu celkového mikrobiálního zatížení potravin. V potravinách je ATP přítomno v somatických buňkách, jako volné ATP nebo v mikroorganismech. Při stanovení počtu mikroorganismů musí být mikrobiální ATP nejprve separováno od ostatních zdrojů. Původní techniky spoléhaly na selektivní lýzu somatických buněk neionogenním detergentem (např. Triton X-100) následovanou enzymatickou či chemickou destrukcí uvolněného ATP. Zbylý mikrobiální ATP byl poté extrahován pomocí kationaktivního detergentu a jeho obsah stanoven za použití luciferin-luciferázového komplexu. Počet buněk byl vypočítán z kalibračních přímek koncentrace ATP nebo emitovaného světla (RLU) k počtu buněk (KTJ.ml-1). Tato metoda byla jednoduchá a rychlá, ale nedostatečně citlivá. Další možností je využití koncentrace a separace mikroorganismů z potraviny ještě před provedením ATP bioluminiscenčního testu. Využívá se filtrace nebo centrifugace vzorku následovaná uvolněním mikrobiálního ATP a jeho kvantifikací. Nutnost dvou-krokové procedury pro bioluminiscenční detekci mikroorganismů byla dána určitou nestabilitou luciferasy v lyzačním činidle. Nově bylo vyvinuto činidlo pro jedno-krokovou analýzu. Jedná se o mutantní formu luciferasy světlušek, která je více odolná k lytickým činidlům. Stabilní luciferasa je použita v činidle kombinujícím lytické složky s luciferin-luciferázovým komplexem a umožňuje tak nový zjednodušený formát testu. Pro filtrovatelné roztoky byl zaveden systém MicroStar™ (výrobce Millipore Corp.) umožňující stanovení počtu kvasinek (trvání testu několik minut) a bakterií (trvání testu několik hodin). Nejprve dochází k filtraci vzorku přes speciální membránový filtr schopný zadržet mikroorganismy. Systém umožňuje detekci jediné buňky kvasinek ihned po filtraci. Detekce bakterií vyžaduje krátkou inkubaci membránového filtru na povrchu vhodného živného média. Poté se na filtr nastříká činidlo uvolňující ATP a po krátkém sušení je přidáno bioluminiscenční činidlo. To vyvolá vznik „světelných spotů“ korespondujících s každou buňkou kvasinek či bakteriální mikrokolonií. CCD kamerou lze vytvořit obraz membránového filtru s prostorovou distribucí světelných skvrn. Získané výsledky jsou srovnatelné se standardní plotnovou metodou. Moderní verzí je automatizovaný systém Milliflex® Rapid Microbiology Detection and Enumeration System (výrobce Merck Millipore). 6.4.2.1. Využití v praxi Při stanovení celkového počtu mikroorganismů v syrovém mléce se nejčastěji používá filtrační technika, která je vhodná pro screening cisternových vzorků mléka ve zpracovatelských závodech a monitoring kvality během prodlouženého skladování mléka. Metodu lze využít také k hodnocení kvality pasterovaného mléka, kontrole sterility UHT výrobků, k detekci antibiotik v mléce nebo při sledování aktivity bakterií mléčného kvašení při hodnocení čistých mlékařských kultur. Testovací soupravy a potřebné přístrojové vybavení nabízí v současnosti několik firem. Jedná se například o RapidScreen Dairy

50

Nepřímé metody

(výrobce Celsis Inc.) nebo 3M™ Microbial Luminescence System II (výrobce 3M) určený pro testování sterility UHT mléka a mléčných výrobků. Při hodnocení povrchové kontaminace jatečně opracované drůbeže se testuje oplachová voda nebo se provede stěr sterilním tamponem, v případě prasat a skotu se stěr provádí sterilní testovací houbičkou zvlhčenou fyziologickým roztokem s přídavkem Tweenu 80. Tekutina z houbičky je dále zpracována pomocí filtračního zařízení Filtravette™ (výrobce New Horizont Diag. Corp.). Jedná se o speciální luminometrickou kyvetu jejíž dno slouží jako membránový filtr pro záchyt bakterií. Další možností je odebrání a zpracování vzorku svaloviny z povrchu jatečně opracovaného těla. Systém Filtravette™ je využitelný také pro stanovení mikrobiální kontaminace mletého masa. ATP bioluminiscenční metoda je využitelná také při hodnocení vařených či vakuově balených masných výrobků. Při detekci bakterií způsobujících kažení piva (Lactobacillus brevis) byl aplikován systém MicroStar™ (výrobce Millipore Inc.), k vyšetření sycených nápojů lze použít např. filtrační systém Haemocell Rapid Microbial Quality Assurance (RMQA) (výrobce GEM Biomedical, Inc). Reagenční kit Bev-Trace™ (výrobce Biotrace Ltd.) je určený pro rychlou detekci mikroorganismů kažení ve všech filtrovatelných nápojích, ať už pasterovaných či sterilizovaných filtrací. Další možností je např. RapidScreen Food & Beverage (výrobce Celsis Inc.). 6.4.2.2. Výhody a nevýhody Vzhledem k tomu, že existuje vědeckými studiemi podložená korelace mezi množstvím ATP a počtem mikroorganismů, je ATP bioluminiscenční test vhodnou alternativou k tradiční plotnové metodě při rutinním mikrobiologickém hodnocení potravin a nápojů. Výhodou je relativně jednoduché a rychlé provedení testu, v porovnání s klasickou kultivační metodou je úspora času značná. Naměřené výsledky jsou archivovány a mohou být dále zpracovávány. Naopak nevýhodou je nutnost počáteční úpravy vzorku tak, aby bylo mikrobiální ATP separováno od ATP z jiných zdrojů (např. somatických buněk). Dále je to samozřejmě počáteční investice do přístrojového vybavení. Test sám o sobě není specifický, v případě detekce vybrané skupiny mikroorganismů je nezbytné zařazení vhodného specifického postupu (např. imunomagnetická separace pro zachycení cílových bakterií či lýza buněk druhově specifickými bakteriofágy).

6.4.3. Monitoring hygieny a sanitace v potravinářských provozech ATP bioluminiscenční techniky nachází široké uplatnění při hodnocení účinnosti sanitace provozních povrchů a zařízení a monitoringu hygieny v rámci systémů HACCP, a to v celé řadě potravinářských provozů (mlékárenství, výroba nápojů, masný průmysl, atd.) po celém světě. Běžné stěrové či otiskové techniky kombinované se stanovením počtu mikroorganismů plotnovou metodou mohou detekovat pouze povrchovou kontaminaci mikroorganismy, ale neposkytují informace o tom, zda byl povrch dostatečně očištěn. Metoda ATP bioluminiscence, provedená po rutinní sanitaci povrchu či zařízení, umožňuje během několika minut posouzení celkové úrovně organického znečištění povrchu. V tomto případě je detekován veškerý ATP přítomný na testovaném povrchu (mikrobiální ATP, ATP ze somatických buněk, příp. volné ATP). Z vyšetřované plochy se provede stěr speciálním sterilním tamponem, ten je vložen do zkumavky obsahující všechna potřebná činidla pro vlastní bioluminiscenční reakci. Po vložení do přenosného luminometru je změřeno množství emitovaného světla v RLU. Získané výsledky jsou následně hodnoceny jako vyhovující či nevyhovující, a to podle předem nastavených limitních hodnot RLU pro každé kontrolované místo. Provedení testu je velmi jednoduché, příprava vzorku a měření trvá pouze několik

51

Nepřímé metody

minut. Podobným způsobem lze testovat i oplachovou vodu. V tomto případě se k odběru vzorku používají speciálně upravené odběrové tyčinky se žlábkem umožňující zachycení konstantního množství vzorku. Testovací soupravy a měřicí přístroje dodává na trh celá řada výrobců – např. 3M (3M™ Clean-Trace™ Hygiene Monitoring Systems), Merck Millipore (HY-LiTE® Plus), Charm Science Inc., Promega. 6.4.3.1. Výhody a nevýhody Nespornou výhodou je jednoduché a rychlé provedení testu, při použití přenosného luminometru se stanovení provádí přímo v místě kontroly. Naměřené výsledky lze ihned porovnat se zadanými hraničními hodnotami, archivovat či dále zpracovávat. Nezbytná je počáteční investice na pořízení měřicího přístroje, vlastní stanovení již není finančně náročné. Pro záchyt ATP je důležité správné provedení stěru, vliv má také charakter stíraného povrchu. Dalším omezením je případná přítomnost detergentů, sanitačních a dalších čistících prostředků na testovaném povrchu. Tyto látky mohou interferovat s luminiscenční reakcí a vyvolávat falešně pozitivní či negativní výsledky.

6.4.4. Využití ATP bioluminiscence při detekci vybraných patogenů Metodu ATP bioluminiscence lze využít také při detekci vybraných původců alimentárních onemocnění. Obecný postup stanovení je následující: 1) rozeznání cílových bakterií, 2) lýza cílových bakterií a uvolnění ATP a 3) vlastní ATP bioluminiscenční test. Rozeznání cílových bakterií se provádí pomocí specifických protilátek nebo specifických bakteriofágů. Výhodou fágů, oproti použití specifických protilátek, je vyšší specifita a rychlejší vazba na cílové buňky. Masivní produkce bakteriofágů je také výrazně levnější než produkce protilátek. Využití bakteriofágů umožňuje současnou koncentraci a detekci cílových buněk. Bakteriální buňky jsou zachyceny na biosorbent obsahující fágy, následná lýza buněk je detekována ATP bioluminiscenční metodou. Lze stanovit počet navázaných bakterií. Jiným přístupem je využití rekombinantních fágů. Fágy specifické pro sledovanou bakterii jsou geneticky upraveny vložením genů pro bakteriální luciferasu (tzv. lux geny). Samotné fágy nejsou schopné gen exprimovat a zůstávají „tmavé“. Po infekci hostitelské buňky dojde k syntéze luciferasy, bakteriální buňky se „rozsvítí“ a mohou být detekovány luminometrem. Byly připraveny rekombinantní fágy pro detekci bakterií čeledi Enterobacteriaceae, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. či Mycobacterium tuberculosis.

6.4.5. Měřicí přístroje Na trhu jsou k dispozici 3 hlavní skupiny přístrojů schopných měřit nízké hladiny bioluminiscence. První z nich jsou trubicové luminometry, které jsou uzpůsobeny k měření intenzity luminiscence v jednotlivých zkumavkách, obvykle využívají fotonásobiče. Mohou být víceúčelové pro široké spektrum vzorků či specifické pro určitý typ zkumavek a činidel určených pro daný přístroj. Přenosné bateriové luminometry jsou vhodné pro monitoring hygieny v potravinářském průmyslu. Vzhledem k popularitě mikrotitračních destiček našli své uplatnění na trhu i luminometry umožňující automatické odečítání destiček. Měření luminiscence je zde však doprovázeno určitými konstrukčními problémy. V některých případech jsou kromě intenzity luminiscence zapotřebí i informace o jejím prostorovém uspořádání. Pro tento účel se používají zobrazovací zařízení pro hodnocení objektů různého tvaru a velikosti jako jsou Petriho misky či blottovací membrány, mezi nejpoužívanější patří CCD kamery různého typu. 52

Stanovení rezistence k AML

7. STANOVENÍ CITLIVOSTI MIKROORGANISMŮ K AML Rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám (AML) je dnes celosvětově jedním z největších problémů nejen klinické a veterinární praxe. Velký zájem o tuto problematiku je i v oblasti mikrobiologie potravin, protože řada rezistentních bakterií je šířena nebo má svůj rezervoár právě v potravinách a potravinových surovinách. Z tohoto důvodu se při vyšetření potravinových izolátů stále častěji využívají i metody stanovení citlivosti k antimikrobiálním látkám. V současnosti jsou klinické laboratorní standardy pro testování citlivosti pravidelně aktualizovány např. americkou organizací CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute; dříve NCCLS – National Committee for Clinical and Laboratory Standards). Metody stanovení citlivosti, resp. rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám lze rozdělit na semikvantitativní (disková difúzní metoda) a kvantitativní (tzv. diluční metody – např. agarová diluční metoda, diluční mikrometoda, Etest).

7.1. Rezistence mikroorganismů k AML 7.1.1. Antimikrobiální látky a jejich účinek na mikroorganismy Jako antimikrobiální látky se označují léčiva používaná k profylaxi či terapii infekčních onemocnění. Tyto látky mohou být v podstatě dvojího druhu – antibiotika, která jsou přírodního původu (dnes často chemicky modifikovaná či synteticky vyráběná) a chemoterapeutika, která jsou připravená pouze chemicky. Působení antimikrobiálních látek může být mikrobistatické (reverzibilní zastavení růstu a množení mikroorganismů) nebo mikrobicidní (usmrcení mikroorganismů). Účinek mikrobistatických látek nastupuje později, mikrobicidní látky působí ireverzibilně a rychle. Mezi mikrobistatické látky patří např. tetracykliny, makrolidy, sulfonamidy; mikrobicidní účinek mají např. β-laktamy, aminoglykosidy či polypeptidy. Mimo antibiotika a chemoterapeutika mohou mít antimikrobiální účinek také další skupiny látek. Jedná se o látky působící na mikrobiální enzymy (např. oxidační činidla, chelatační látky, těžké kovy), látky reagující s DNA (např. chemické mutageny či cytostatika) či látky působící jako imunosupresiva. Antibiotika a chemoterapeutika mohou zasahovat různými způsoby na různých místech mikrobiální buňky. Mezi hlavní mechanismy patří: - inhibice syntézy buněčné stěny (např. β-laktamy, glykopeptidy), - poškození syntézy cytoplasmatické membrány (např. polypeptidy – polymyxin B), - inhibice proteosyntézy (např. aminoglykosidy, tetracykliny, chloramfenikol), - porucha syntézy nukleových kyselin (např. chinolony, nitroimidazoly), - antagonismus a kompetitivní inhibice (např. sulfonamidy).

7.1.2. Rezistence mikroorganismů k antimikrobiálním látkám Jako rezistenci obecně označujeme schopnost mikrobiální populace přežít účinek inhibiční koncentrace dané antimikrobiální látky. Některé mikroorganismy jsou přirozeně (primárně) rezistentní k některým antimikrobiálním látkám. Přirozená rezistence je geneticky podmíněná necitlivost k dané látce, a to bez ohledu na to, zda došlo k předchozímu kontaktu mikroorganismu s touto látkou. Příkladem může být rezistence gramnegativních střevních tyčinek vůči penicilinu a makrolidům, rezistence streptokoků k aminoglykosidům či enterokoků a listerií k cefalosporinům.

53


Příčinou primární rezistence může být nepropustnost zevní membrány gramnegativních bakterií pro danou antimikrobiální látku, produkce enzymů schopných antimikrobiální látku inaktivovat, absence cílové struktury nebo její necitlivost k působení antimikrobiální látky. U mikroorganismů se stále více setkáváme se získanou (sekundární) rezistencí. Tento typ rezistence vzniká při působení antimikrobiální látky na populaci mikroorganismů, kdy se pod selekčním tlakem antimikrobiální látky selektují rezistentní kmeny. Může se jednat o rezistenci negenetického i genetického původu. V prvním případě může rezistence vzniknout např. v důsledku ztráty specifických receptorových struktur. Sekundární rezistence genetického původu může být chromosomální (např. spontánní mutace) či extrachromosomální (reprezentovaná např. plasmidy či transpozony, viz též kapitola 9.2.3.). Velkým problémem je multirezistence (mnohočetná rezistence), kdy je mikroorganismus současně rezistentní k většímu počtu antimikrobiálních látek. Dále potom zkřížená rezistence – současná necitlivost mikroorganismů na antibiotika s podobnou chemickou strukturou a stejným mechanismem účinku. 7.1.2.1. Mechanismy rezistence mikroorganismů k AML Jednou z možností je změna cílové struktury, tedy změna v místě působení antimikrobiální látky. Mikroorganismy jsou schopné změnit strukturu cílové molekuly zásahu antimikrobiální látky (obvykle esenciálního enzymu) nebo exprimovat alternativní cílovou molekulu, která není antimikrobiální látkou inhibována. Dalším mechanismem je změna propustnosti (permeability). Jde buď o úplnou nepropustnost – impermeabilitu pro danou antimikrobiální látku, nebo dochází k jejímu aktivnímu vyloučení z buňky. Ke změně propustnosti dochází např. změnou molekuly přenašeče či alterací aktivního transportního proteinu, může se jednat i o omezení tvorby ATP v případech, kdy je antimikrobiální látka přenášena aktivním transportem. Příkladem aktivního vyloučení již nakumulované antimikrobiální látky je efflux systém, kdy prostřednictvím transmembránové pumpy dochází k transportu antimikrobiální látky ven z buňky. Effluxní systém je schopen zachytit molekuly AML nejen v periplasmatickém prostoru, ale i v cytoplasmě. Mezi mechanismy rezistence patří i velmi častá změna antimikrobiální látky, kdy mikroorganismus produkuje enzymy, které antimikrobiální látku pozmění nebo štěpí a tím ji inaktivují. V některých případech mikroorganismus produkuje cílový enzym v takovém množství, že jej nelze danou koncentrací antimikrobiální látky vyblokovat – hovoří se o tzv. hyperprodukci cílové struktury. 7.1.2.2. Vznik a šíření rezistence mikroorganismů k AML Rezistence genetického původu může vznikat v podstatě dvojím způsobem – modifikací genu na chromosomu nebo převzetím genetického materiálu. K modifikaci chromosomálního genu dochází obvykle spontánní mutací bez ohledu na předchozí kontakt s antimikrobiální látkou. Vzniklá rezistence má trvalý charakter a přenáší se do další generace v populaci. Jinou možností vzniku rezistence je převzetí genetického materiálu neseného na mobilních elementech, jako jsou R plasmidy, transpozony, integrony či genové kazety, příp. i bakteriofágy. Geny rezistence získávají mikroorganismy vertikálně (dědí je) nebo horizontálně (od jiných buněk v ekosystému), mimo to tyto geny vznikají i mutacemi. Mezi základní způsoby přenosu genetického materiálu řadíme konjugaci, transdukci a transformaci. Při konjugaci dochází k přenosu plasmidu z donorové buňky (F+) do buňky recipientní (F-) pomocí tzv. sex-pilů, konjugace může probíhat v rámci jednoho druhu mikroorganismu nebo i mezidruhově. Transdukce představuje přenos pomocí bakteriofága, do jehož genetické informace je včleněna chromosomální či plasmidová DNA, která je následně

54


s bakteriofágem přenesena do další bakteriální buňky. Transformace je přenos uvolněné DNA (např. z lyzované buňky) vedoucí ke vzniku nových forem rezistence.

7.2. Semikvantitativní metody Semikvantitativní metody nachází uplatnění zejména při rutinním screeningu citlivosti mikroorganismů k antimikrobiálním látkám. Do této skupiny náleží disková difúzní metoda, která se používá zejména pro vyšetření citlivosti u rychle rostoucích, nenáročných bakterií a některých náročnějších bakterií. Hodnocení se provádí na základě měření velikosti inhibičních zón vzniklých okolo disků s antimikrobiální látkou. Podle velikosti inhibiční zóny jsou vyšetřované kmeny mikroorganismů zařazeny do kategorie citlivý (S), intermediálně rezistentní (I) (kmeny na rozmezí mezi citlivými a rezistentními) nebo rezistentní (R) k dané antimikrobiální látce. Při správném provedení prokazují výsledky diskové difúzní metody a výsledky kvantitativních dilučních metod vysokou shodu.

7.2.1. Disková difúzní metoda První metodou hodnocení účinku antibiotik na bakterie byla disková difúzní metoda. Poprvé byla standardizována jako paper disk method v roce 1954. Navzdory své jednoduchosti, je disková difúzní metoda založena na sofistikovaných fyzikálně-chemických principech, které upravují dynamiku šíření (difúze) antibiotika ve vztahu k růstu bakterií v agarovém systému. Po kontaktu disku napuštěného antibiotikem s povrchem inokulovaného agaru, začnou molekuly antibiotika okamžitě difundovat do agaru a vytváří dynamicky se měnící gradient koncentrace antimikrobiální látky. Mikroorganismy se začínají dělit, jejich počet vzrůstá až do kritického množství. Okraj inhibiční zóny vzniká v okamžiku, kdy je koncentrace antibiotika ještě schopná inhibovat mikroorganismus narůstající do velké buněčné masy. Současně je hustota buněk dostatečně vyšší než absorbovatelné množství antibiotika v bezprostřední blízkosti, subinhibiční množství antibiotika dovoluje mikroorganismu růst. Difúzní koeficient antimikrobiální látky je ovlivněn nejen její molekulovou hmotností, velikostí, iontovým nábojem či rozpustností ve vodě, ale také viskozitou a výškou agaru, teplotou a dalšími inkubačními podmínkami. Růst mikroorganismu ovlivňuje zejména dostupnost živin, hustota populace, růstová fáze inokula a inkubační teplota. Výsledky in vitro testů citlivosti mohou být použity jako kvalifikovaný odhad k predikci léčebného výsledku běžných dávek antibiotik u zdravých pacientů. Na druhou stranu potenciální klinická účinnost antibiotika může být ovlivněna řadou dalších faktorů, proto výsledky kvalitativních testů musí být v korelaci s kvantitativními hodnotami MIC (minimální inhibiční koncentrace). Některé disky mohou být využity i pro screening některých speciálních mechanismů rezistence. Jedná se např. o detekci rezistence k vysokým hladinám aminoglykosidů u enterokoků nebo detekci přítomnosti širokospektré β-laktamasy (ESBL) u izolátů E. coli, Klebsiella pneumoniae či K. oxytoca. Mezi hlavní výhody diskové difúzní metody patří jednoduché provedení bez nutnosti náročného vybavení, flexibilní změna spektra vyšetřovaných antimikrobiálních látek a nízká cena. Hlavní nevýhodou, mimo toho, že se nejedná o kvantitativní metodu, je do jisté míry časová náročnost, zahrnující zejména přípravu agarových ploten a dobu potřebnou k manuálnímu odečítání inhibičních zón a interpretaci výsledků. Přesto má v klinické praxi disková difúzní metoda svou nezastupitelnou roli. Provedení a využití diskové difúzní metody je detailně studováno v rámci předmětu Mikrobiologie potravin a mikrobiologické laboratorní metody (viz skripta Mikrobiologie potravin – praktická cvičení I. Obecná mikrobiologie).

55


7.3. Kvantitativní – diluční metody Diluční metody jsou kvantitativní metody určené ke stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC), tedy nejnižší testované koncentrace daného antibiotika, která inhibuje viditelný růst mikroorganismu. MIC se obvykle vyjadřuje v mg.l-1, příp. v µg.ml-1. Odečtené hodnoty MIC se porovnávají s interpretačními kriterii a testovaný mikroorganismus se označí jako citlivý (S), intermediárně rezistentní (I) či rezistentní (R) k danému antibiotiku. Vyšetření se provádí na agarových nebo bujonových půdách, které obsahují zvolené koncentrace antibiotika, obvykle v dvojnásobné geometrické řadě. Do půd se očkuje standardní inokulum testovaného mikroorganismu. Kvalita získaných výsledků závisí na přesném dodržení metody a ověřuje se systémem kontrol. Stanovení hodnoty MIC je důležité pro určení terapeutické dávky antimikrobiální látky. Mezi nejpoužívanější metody patří agarová diluční metoda, diluční mikrometoda a Etest.

7.3.1. Agarová diluční metoda Agarová diluční metoda je referenční metodou stanovení citlivosti mikroorganismů k antimikrobiálním látkám, používá se mimo jiné pro ověřování spolehlivosti ostatních metod. 7.3.1.1. Provedení a vyhodnocení testu Jako živné médium se používá Mueller-Hinton agar, který je obohacený o testovanou antimikrobiální látku. Antimikrobiální látka se naředí a jednotlivá ředění se přidávají k rozpuštěnému a vytemperovanému agaru (45 – 50 °C), který je po promíchání rozléván do Petriho misek tak, aby výsledná vrstva agaru byla 3 – 4 mm. Po ztuhnutí lze připravené plotny skladovat při chladničkové teplotě po dobu několika dnů. Obvykle se připravuje 12 – 15 koncentrací jednoho antibiotika ředěných dvojnásobně geometrickou řadou. Inokulum vyšetřovaných bakterií se aplikuje na povrch předsušeného agaru formou spotů speciálním vzorkovačem. Na jedné Petriho misce (tj. jedné koncentraci antibiotika) můžeme testovat až 20 různých kmenů bakterií. Soubor vyšetřovaných kmenů takto naočkujeme na všechny připravené koncentrace testovaného antibiotika. Po příslušné době inkubace odečteme pro každý testovaný bakteriální kmen hodnotu MIC. Inkubační podmínky se volí tak, aby odpovídali testovanému mikroorganismu. Příklad provedení a vyhodnocení agarové diluční metody je uveden na obrázku 24.

1.

2.

Obrázek 24: Agarová diluční metoda: 1. inokulované plotny, 2. plotny po inkubaci s nárůstem mikroorganismů. (Engelkirk and Duben-Engelkirk, 2008 – upraveno) V uvedeném příkladu se jedná se o testování rezistence k penicilinu, kdy bylo připraveno 5 ředění antibiotika. Na agarových plotnách bylo současně testováno šest různých kmenů, každý z nich byl vždy aplikován na stejnou pozici. Po ukončení inkubace se hodnotí nárůst

56


mikroorganismů na jednotlivých plotnách. Jako MIC se odečte první koncentrace bez viditelného růstu mikroorganismu, tj. kmen 1 – 32 U/ml, kmen 2 – 16 U/ml, kmen 3 – 4 U/ml, kmen 4 – 4 U/ml, kmen 5 – více než 32 U/ml, kmen 6 – 32 U/ml. 7.3.1.2. Výhody a nevýhody agarové diluční metody Nespornou výhodou agarové diluční metody je vysoká standardizovanost provedení (referenční metoda). Můžeme jí vyšetřit velký soubor kmenů za standardních podmínek. Využívá se také k hodnocení účinku nových antibiotik. Ve srovnání s mikrodiluční metodou spolehlivěji odhaluje kontaminaci kmenů a lépe detekuje heterorezistenci, tj. rezistentní subpopulaci bakterií. Na druhou stranu je tato metoda poměrně pracná, časově a ekonomicky náročná, a proto není praktická pro vyšetření citlivosti malého počtu nebo jednotlivých kmenů. Agarová diluční metoda může selhat v průkazu klinicky významné rezistence některých bakterií, problém mohou být i mikroorganismy s plazivým růstem (např. Proteus spp.).

7.3.2. Diluční mikrometoda (mikrodiluční metoda) Původní provedení bujonového dilučního testu bylo ve zkumavkách (tzv. makrodiluční metoda), v současnosti se upřednostňuje varianta v mikrotitračních destičkách (tzv. diluční mikrometoda nebo též mikrodiluční metoda). 7.3.2.1. Provedení a vyhodnocení testu Antimikrobiální látka je ředěna dvojnásobnou ředící řadou v tekuté živné půdě (např. Mueller-Hinton bujon). Půdy s antibiotiky se rozplňují mechanickými rozplňovači do jamek mikrotitrační destičky s 96 jamkami s kulatým nebo kónickým dnem. Rozplňovaný objem je obvykle 100 μl/jamku. Počet koncentrací antibiotika závisí na uspořádání destičky. Obvykle se připravuje 8 koncentrací jednoho antibiotika v dvojnásobné geometrické řadě a na jedné destičce se vyšetřuje MIC 12 antibiotik na jeden kmen. Jedna jamka obvykle slouží jako kontrola růstu testovaného mikroorganismu (zaočkované živné médium bez antibiotika), příp. se jedna jamka vůbec mikroorganismem nezaočkuje a slouží jako kontrola kontaminace bujonu. Destičky lze připravit v laboratoři nebo získat od komerčního výrobce. K jednotlivým ředěním se následně přidává standardní inokulum testovaného kmene. Po příslušné době inkubace se odečítají pro jednotlivá antibiotika hodnoty MIC. Odečet může probíhat vizuálně nebo za použití readeru, který změří hodnotu absorbance v každé jamce. Při vizuálním hodnocení se odečítá koncentrace, která zřetelně inhibuje růst mikroorganismu. V případě trimethoprimu, sulfonamidu nebo jejich kombinace se odečítá koncentrace, která inhibuje 80 % růstu ve srovnání s růstem v kontrolní jamce bez antibiotika. Při spektrofotometrickém hodnocení na hodnotu MIC ukazuje skoková změna hodnoty absorbance. Obrázek 25: Diluční mikrometoda.

Jedna čirá jamka v řadě jamek se zřetelným růstem se ignoruje, pokud se nejedná o poslední jamku s nejvyšší koncentrací antibiotika. Dvě čiré jamky v řadě jamek se zřetelným růstem se ignorují, pokud jsou následovány alespoň dvěma jamkami se zřetelným růstem (obrázek 26). Jiné kombinace jamek se zřetelným nebo částečně potlačeným růstem a čirými jamkami, podezření na kontaminaci či nedostatečný růst v kontrolní jamce jsou indikací k opakování vyšetření.

57


sloupec 1 – MIC jamka D sloupec 2 – MIC jamka C sloupec 3 – MIC jamka D sloupec 4 – MIC jamka C sloupec 5 – MIC jamka D (trimethoprim a sulfonamidy – 80% inhibice) sloupec 6 – MIC je menší než nejnižší použitá koncentrace sloupec 7 – MIC je vyšší než nejvyšší použitá koncentrace

 růst Obrázek 26: Diluční mikrometoda – pravidla pro stanovení hodnoty MIC. (jamka A – nejvyšší koncentrace AML, jamka H – nejnižší koncentrace AML)

7.3.2.2. Výhody a nevýhody diluční mikrometody Výhodou mikrodiluční metody je vysoká shoda s výsledky agarové diluční metody. Klinické laboratoře ocení pružnou a snadnou přípravu velkého množství destiček s různými půdami, antibiotiky a jejich koncentracemi, které lze dlouhodobě uchovávat, aniž by došlo ke snížení jejich kvality (obvykle 1 měsíc při teplotě -20 °C). Další výhodou je jednoduché provedení a možnost automatizace odečítání výsledků a jejich vyhodnocení. Na rozdíl od ostatních metod koncentrace inokula neovlivní významně výsledek. Mezi omezení mikrodiluční metody patří zejména obtížné rozpoznání případné kontaminace testovaného bakteriálního kmene a neschopnost detekce rezistentní subpopulace. Metodu nelze použít u kmenů, které v tekutém prostředí autolyzují. Stabilní sestava a koncentrace antibiotik v komerčních destičkách nemusí vyhovovat potřebám dané laboratoře.

7.3.3. Etest Etest je moderní gradientová metoda kombinující principy diskové difúzní a agarové diluční metody. Byla vyvinuta ve Švédsku a poprvé prezentována v roce 1988. Pro vysoký stupeň shody s výsledky MIC získanými referenční agarovou diluční metodou je Etest vhodný ke stanovení MIC u řady mikroorganismů, včetně náročných bakterií a anaerobů. Vlastní Etest je plastový proužek, na jehož spodní straně je imobilizovaný předdefinovaný koncentrační gradient daného antibiotika ve vysušeném stavu. Koncentrační gradient je kalibrován jako odpovídající hodnoty MIC, jedná se o stupnici nejméně 15-ti dvojnásobných geometrických ředění, která je umístěna na horní straně Etestu.

Obrázek 27: Schéma Etestu. (Schwalbe et al., 2007 – upraveno)

7.3.3.1. Provedení a vyhodnocení testu Nejdříve se připraví inokulum – suspenze vyšetřovaného mikroorganismu o stanovené denzitě. Inokulum se aplikuje na povrch předsušené agarové plotny buď sterilním tamponem, nebo se provede přelití, kdy se inokulum sterilní pipetou nanese na povrch agaru a po přelití celého povrchu se přebytečná tekutina odsaje pryč. Inokulum se nechá krátce zaschnout.

58


Na klasické Petriho misky o průměru 90 mm se umísťují 1 až 2 Etesty, u velkých misek (průměr 150 mm) lze paprskovitě umístit až 6 stripů. Proužky se umísťují ručně nebo pomocí automatického dispenzoru. Nanesený gradient antibiotika musí být v přímém kontaktu s povrchem agaru (stupnice je nahoře). Inkubační podmínky se volí podle nároků testovaného mikroorganismu. Po umístění na povrch plotny, dochází k uvolňování antibiotika do agaru. Pod proužkem a v jeho bezprostřední blízkosti se vytvoří stabilní a kontinuální gradient antibiotika, který je udržován po dobu 18 – 20 hodin. Hodnota MIC se odečte v místě křížení eliptické inhibiční zóny se stupnicí gradientu. 7.3.3.2. Výhody, nevýhody a využití Etestu v praxi Podobně jako v případě diskové difúzní metody, je provedení Etestu velmi rychlé a jednoduché. Výhodou Etestu je dále lepší možnost odhalení kontaminace testovaných kmenů mikroorganismů a detekce heterorezistence. Hlavní nevýhodou, která brání masivnímu rozšíření Etestu, je bezesporu vysoká cena testovacích proužků. Podobně jako u ostatních metod, mohou být výsledky stanovení ovlivněny koncentrací inokula. Test lze provádět na různých živných půdách a za různých inkubačních podmínek, a proto nachází široké využití v klinické diagnostice aerobních i anaerobních mikroorganismů (streptokoky, pneumokoky, hemofily, gonokoky, atd.). Mimo antibiotik jsou k dispozici i Etesty s některými antifungálními látkami umožňující např. testování citlivosti izolátů Candida spp. Upravené Etesty lze použít k detekci speciálních mechanismů rezistence, např. širokospektrých β-laktamas či metalo-β-laktamas.

7.4. Genotypové metody stanovení rezistence Standardizované metody využívané k určení fenotypu rezistence bakterií (diluční metody či disková difúzní metoda) nejsou schopny rozlišit mechanismus rezistence. Ačkoli ke vzniku rezistence může dojít v důsledku mutace v klíčových genetických lokusech bakteriálního genomu, za většinu rezistencí k antimikrobiálním látkám jsou zodpovědné geny získané prostřednictvím mobilních genetických elementů, jako jsou plasmidy a transpozony. Identifikace genotypů rezistence se provádí pomocí detekce genů rezistence a charakterizace mutací ve specifických genech. Při detekci genů rezistence se nejčastěji využívají metody na bázi DNA sond, polymerázová řetězová reakce či další amplifikační techniky. Nové technologie umožňující rychlou sekvenční analýzu DNA výrazně zvyšují schopnost detekce mutací a genů rezistence u řady mikrobiálních patogenů.

7.4.1. Odhalování mutací spojených s rezistencí k AML V posledních letech dramaticky vzrostl počet molekulárních metod schopných identifikovat specifické DNA nebo RNA sekvence či mutace v konkrétních lokusech. Pokud vznikle rezistence jako důsledek mutace genu přítomného v citlivém kmeni, je přesná analýza mutace zcela nezbytná. V molekulární diagnostice mutací se rozlišují dvě skupiny metod – metody pro skenování mutací a metody sloužící ke screeningu mutací. Cílem skenovacích metod je najít neznámé mutace v potenciálních genech rezistence, což může zahrnovat posouzení širokého či mnohočetného genetického regionu a pečlivé posouzení identifikovaných polymorfismů. Referenční metodou je v tomto případě kompletní genová sekvenace, mezi další metody patří SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism), denaturační gradientová gelová elektroforéza, DNA čipy, atd.

59


Cílem screeningových metod je najít známé mutace, které již byly určeny jako relevantní a užitečné genotypové markery. Nejpoužívanější techniky jsou založeny na použití oligonukleotidových čipů a fluorescenčních technik. Metody mohou být rozděleny do dvou skupin: 1) vysoce účinné automatické zařízení schopné detekovat řadu cílů (tzv. „genetický antibiogram“) a 2) jednoduché metody pro použití při práci v terénu nebo v méně technologicky náročných situacích. První skupinu reprezentují mikroarray technologie, druhou potom např. real-time PCR. Tabulka 3: Vybrané geny rezistence u potravinářsky významných mikroorganismů. Aminoglykosidy Enterococcus spp. β-laktamy S. aureus gramnegativní MO

produkce modifikujících enzymů

ant6, aac6-aph2

inhibice vazby β-laktamů díky produkci pozměněného Penicilin-binding proteinu 2a produkce různých typů β-laktamas včetně širokospektrých β-laktamas (ESBL)

mecA

Glykopeptidy Enterococcus spp.

změna cílového místa díky produkci modifikovaných prekurzorů peptidoglykanu Makrolidy, linkosamidy a streptogramin S. aureus produkce modifikujících enzymů efflux systém změna cílového místa na ribosomu Chinolony a fluorochinolony změna cílového místa – gyrasa změna cílového místa – topoizomerasa II Tetracykliny E. coli efflux systém Enterococcus spp. efflux systém produkce proteinů chránících ribosomy Chloramfenikol gramnegativní MO produkce modifikujících enzymů Clostridium spp. produkce modifikujících enzymů

blaTEM, blaSHV, blaOXA

vanA, vanB, vanC1, vanC2, vanC3, vanD mphC, vatA msrA, mefA ermA, ermC gyrA, gyrB parC, parE tetA, tetB, tetC, tetD, tetG tetK, tetL tetM, tetO, tetS catI, catII, catIII catP, catQ, catD

(zpracováno podle Lewis et al., 2002)

7.4.2. Výhody a nevýhody použití genotypových metod Důvody, proč identifikovat geny rezistence a mutace vyvolávající rezistenci mikroorganismů jsou následující. Rychlá detekce rezistence může optimalizovat terapii sepsí a meningitid před tím, než jsou k dispozici výsledky kultivace. Přímá analýza klinických vzorků umožňuje detekci nekultivovatelných forem mikroorganismů nebo organismů s náročnými růstovými požadavky. Jsou užitečné také pro posouzení hraničních výsledků MIC (na úrovni breakpointu), které mohou mít dopad na terapeutické rozhodnutí. Poskytují zlatý standard pro přehodnocení stávajících breakpointů nebo stanovení nových breakpointů pro nové antimikrobiální látky, které je založené na mechanismu rezistence. Nevýhodou je omezená citlivost v přítomnosti nízkého počtu mikroorganismů nebo směsné populace citlivých a rezistentních kmenů. Vícečetné mechanismy rezistence u některých mikroorganismů omezují typy determinant, které mohou být detekovány. V současné době je nedostatek univerzálních metod pro testování všech genů rezistence. K provedení analýzy je potřeba speciální laboratorní vybavení.

60

Stanovení bakteriálních toxinů

8. STANOVENÍ BAKTERIÁLNÍCH TOXINŮ Alimentární intoxikace představují významnou skupinu onemocnění z potravin ohrožující zdraví konzumentů. Příčinou vzniku onemocnění jsou toxiny přítomné v potravině, které vznikají jako metabolické produkty při množení patogenních bakterií. Mezi významné původce alimentárních intoxikací se řadí Staphylococcus aureus, Bacillus cereus a Clostridium botulinum. Zdrojem kontaminace potravin ve výrobním procesu mohou být suroviny, prostředí nebo i člověk. Také nevhodné podmínky skladování a manipulace s potravinami během přípravy v domácnostech nebo stravovacích zařízeních, kde nejsou důsledně dodržovány zásady správné hygienické praxe, mohou negativně ovlivnit zdravotní nezávadnost potravin.

8.1. Toxiny Staphylococcus aureus Bakterie Staphylococcus aureus, jako hlavní zástupce koagulasa pozitivních stafylokoků, je jedním z nejvýznamnějších patogenních mikroorganismů a původců alimentárních intoxikací. Je to fakultativně anaerobní, nepohyblivý, grampozitivní kok. Významná je jeho schopnost produkovat celou řadu toxických exoproteinů, faktorů virulence a především enterotoxinů. Velké riziko kontaminace je u potravin s vysokým podílem ruční práce. Dále stafylokoky nejčastěji kontaminují mléčné výrobky, lahůdky, pudinky a salátové dresinky, také maso, šunky, ryby a mořské plody. Rizikové množství S. aureus v potravině, které je schopno vyprodukovat dostatečné množství stafylokokových enterotoxinů (SEs) – alespoň 1 ng. g-1 potraviny, je 105 KTJ.g-1. Podle ČSN EN ISO 6888-1 (1999) je pro izolaci koagulasa pozitivních stafylokoků užíván selektivně-diagnostický agar Baird-Parker, kde S. aureus vytváří charakteristické černé kolonie (redukce teluričitanu), které jsou obklopeny zónou projasnění, což je výsledkem působení lecitinasy na suplement žloutkovou emulzi. V současné době se pro stanovení stafylokokových enterotoxinů (SEs) používají především imunologické metody, které jsou snadno dostupné formou různých komerčně vyráběných setů. Kromě nich existuje také možnost detekce pomocí metod založených na fyzikálněchemických principech, které jsou označované jako alternativní. Uvedené metody detekují toxin přímo z potraviny a označují se tedy jako metody přímé. Molekulárně biologické metody jsou označovány jako metody nepřímé, protože pomocí nich nejsme schopni stanovit přítomnost SEs přímo ve vyšetřované potravině. Nepřímé metody spočívají v detekci genů zodpovědných za produkci SEs. K analýze se používá DNA, která byla získána z bakterie S. aureus, izolované z vyšetřované potraviny.

8.1.1. Stafylokokové enterotoxiny V současnosti je známo 22 typů stafylokokových enterotoxinů – SEs (SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEF, SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SEO, SEP, SEQ, SER, SES, SET, SEU, SEV), přičemž SEC lze dále rozdělit na jednotlivé subtypy (SEC1, SEC2, SEC3, SEChovězí, SECovčí, SECkozí) podle odlišných izoelektrických bodů (pI). Těchto 22 typů SEs se rozděluje do dvou skupin. Toxiny SEA – SEE se označují jako skupina tzv. klasických SEs, ostatní SEs se označují jako tzv. nové typy. SEs jsou proteiny o molekulové hmotnosti pohybující se v rozmezí 24 – 29 kDa, složené z jednoduchých polypeptidových řetězců s podobným zastoupením aminokyselin u jednotlivých typů SEs. Polypeptidové řetězce obsahují jednu disulfidickou vazbu a jsou bohaté na lysin, kyselinu asparagovou, glutamovou a tyrosin.

61


Schopnost produkovat stafylokokové enterotoxiny lze prokázat asi u poloviny kmenů S. aureus izolovaných z potravin. SEs jsou termostabilní (snesou i půlhodinový var) a jsou odolné vůči trávicím enzymům. Lze obecně říct, že podmínky vhodné pro pomnožování S. aureus jsou vhodné i pro produkci SEs (tabulka 4). Tabulka 4: Limity pro růst S. aureus a produkci enterotoxinů. (Roberts et al., 1996 – upraveno) Faktor teplota (°C) pH aktivita vody – aw

Růst bakterií Rozmezí 7 – 48 4,0 – 10,0 0,83 – > 0,99

Produkce enterotoxinů Optimum Rozmezí 40 – 45 10 – 48 7,0 – 8,0 4,5 – 9,6 0,98 0,87 – > 0,99

Na druhou stranu ne všechny SEs vyvolávají u konzumentů intoxikaci z potravin. Jako toxiny schopné vyvolat gastroenterický syndrom byly prokázány vedle klasických SEs (SEA – SEE) pouze SEH, nicméně i u SEG a SEI byla stanovena emetická aktivita. Minimální toxická dávka se u nejvíce účinných SEs pohybuje okolo 0,5 ng.g-1 (ml-1) potraviny. Stafylokoková enterotoxikóza má rychlý nástup (2 – 6 hodin po konzumaci potraviny obsahující SEs) i průběh. Příznaky onemocnění jsou zvracení, bolesti hlavy a břicha, někdy také průjem. Onemocnění probíhá zpravidla bez zvýšené teploty. Symptomy obvykle samovolně vymizí po 24 hodinách, maximálně do 48 hodin.

8.1.2. Přímé metody detekce stafylokokových enterotoxinů 8.1.2.1. Imunologické metody Základem imunologických metod je specifická reakce mezi protilátkou a antigenem. Antigenem je stafylokokový enterotoxin přítomný v potravině a produkovaný bakterií S. aureus během růstu. Reverzní pasivní latexová aglutinace – RPLA RPLA využívá latexové částice potažené protilátkami proti příslušným toxinům. Latexové částice nehrají aktivní roli při reakci antigen-protilátka. Ve vzorku přítomný toxin (rozpustný antigen) reaguje (aglutinuje) s navázanou protilátkou za vzniku pouhým okem viditelné mřížkové struktury. Není-li antigen ve vzorku přítomen nebo je pod detekčním limitem testu, mřížková struktura se nevytvoří a latexové částice vytvoří na dně jamky mikrotitrační destičky kompaktní sediment v podobě „knoflíku“. Posuzování přítomnosti či nepřítomnosti toxinu ve vzorku závisí také na množství testovaného toxinu. Výsledky mohou být vyhodnoceny jako falešně negativní a to v případě, kdy množství toxinu ve vzorku je nižší, než mez detekce RPLA.

Obrázek 28: Vyhodnocení RPLA. Jako pozitivní je hodnocena reakce (+) až (+++).

62


Příkladem této metody je testovací souprava SET-RPLA (výrobce Denka-Seiken), která slouží k detekci SEA, SEB, SEC, SED přímo ve vzorcích potravin nebo v kultivačních médiích. Mezi SEA a SEE může docházet ke křížové reakci, a proto SET-RPLA neobsahuje specifickou protilátku pro SEE a kmeny s produkcí SEE jsou klasifikovány jako SEA produkující. Citlivost této metody se pohybuje kolem 1 – 2 ng.g-1 (ml-1) vzorku. Po nanesení vzorků a příslušných protilátek do jamek se mikrotitrační destička inkubuje při teplotě 20 – 24 hodin. Výsledky reakce lze hodnotit semikvantitativně podle mřížkové struktury vzniklé na dně jamek mikrotitrační destičky (obrázek 28). Výhodou testu je možnost detekce SEs bez potřeby komplikovaného laboratorního vybavení. Metoda ELISA ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) patří mezi rychlé a citlivé imunologické techniky využívající vysoce specifické reakce mezi protilátkou a antigenem. Principem metody je vazba antigenu a protilátky značené enzymem, který štěpením substrátu vyvolá barevnou změnu. Komerčně dostupný 3M™ Tecra™ Staph Enterotoxins VIA set (výrobce TECRA) funguje na principu sendvičové ELISA metody. Detekuje SEA – SEE jako sumu. Specifická identifikace jednotlivých enterotoxinů A, B, C, D a E je možná podobnou soupravou s názvem 3M™ Tecra™ Staph Enterotoxins Identification Test. Výhodou TECRA setu oproti ostatním je použití antisér zaměřených proti všem pěti základním enterotoxinům Obrázek 29: ELISA – vyhodnocení. SEA – SEE. V současnosti byly již vyvinuty soupravy pro stanovení nového typu SEH, který byl také popsán jako původce alimentární intoxikace. ELISA testy detekují 0,1 – 1,0 ng enterotoxinu na 1 g (ml) potraviny, čas potřebný pro provedení a vyhodnocení metody jsou 3 – 4 hodiny. Metoda ELFA Plně automatický systém založený na metodě ELFA (Enzyme Linked Immunofluorescent Assay) využívá přístroj miniVIDAS® (výrobce bioMérieux). Pro detekci klasických SEs (SEA – SEE) v potravinách se používá testovací souprava VIDAS SET 2. Nevýhodou této metody je skutečnost, že SEs přítomné ve vzorku jsou detekovány jako suma a přístroj určí pouze jejich přítomnost či nepřítomnost. Z výsledků nelze vyvodit, který typ SE je ve vzorku přítomen. Detekční limit je od 0,5 ng.g-1 (ml-1) (pro SEA a SEB) do 1,0 ng.g-1 (ml-1) (pro SEC, SED a SEE). Velkou výhodou metody je rychlost stanovení (asi 2 h) a jednoduchá příprava vzorků. Další imunologické metody K imunologickým metodám, které byly úspěšně použity k detekci SEs, ale bez jejich širšího využití v běžné každodenní laboratorní praxi, patří např. imunomagnetická separace (IMS) v kombinaci s průtokovou cytometrií. IMS využívá magnetické částice potažené specifickou protilátkou proti hledanému antigenu (toxinu). Tyto protilátky jsou označeny fluorescenčním barvivem. Vzniklý komplex je detekován průtokovým cytometrem. Tento postup byl zatím testován pouze pro detekci SEB, s detekčním limitem 100 pg. ml-1 za dobu méně než 45 min. Možnou nevýhodou bránící širšímu využití tohoto testu jsou investiční náklady nezbytné pro pořízení přístrojového vybavení.

63


Princip metody western blotting je založen na kombinaci metody elektroforetického rozdělení proteinů v polyakrylamidovém gelu, následném přenesení těchto proteinů na nitrocelulosovou membránu a převrstvení protilátkami značenými chromoforem. Vazba protilátky na antigen se projeví barevnou skvrnou. Detekční limit metody je 100 pg. ml-1 (g-1). 8.1.2.2. Fyzikálně-chemické metody Biosenzory (biochips, chips, protein microarrays) jsou založeny na interakci mezi bakteriálním toxinem a povrchově vázaným imobilizovaným receptorem (většinou protilátkou), ale využívají i interakce mezi proteiny, případně vazby mezi DNA a proteinem (tzv. záchytné sondy, capture probe). Pro bližší určení jednotlivých toxinů lze použít metodu hmotnostní spektrometrie MALDITOF/MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry). Tato metoda umožní přesnou analýzu testovaného toxinu, a to stanovením jeho molekulární hmotnosti a sekvencí jednotlivých aminokyselin. Princip spočívá v přenesení energie laseru do matrice. Tento přenos způsobí rozštěpení bílkovin na menší části, které jsou poté analyzovány hmotnostní spektrometrií. Metodu lze využít pro detekci SEs, pro které zatím nebyly připraveny vhodné protilátky využitelné v imunologických metodách. Dále lze využít elektrické proteinové microarrays. Princip je založen na metodě sendvičové ELISA, kdy po navázání enzymaticky značené protilátky s antigenem a následném přidání substrátu dojde k enzymové přeměně neaktivního substrátu a tato interakce je transformována do elektrického signálu, který je následně analyzován. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je jednou z dalších metod detekce SEs. V současné době byly chromatografickými metodami stanoveny pouze SEA a SEB. Metodu lze využít pro kvalitativní i kvantitativní stanovení. Vlastní analýze předchází časově náročná příprava vzorků, zahrnující složité extrakční postupy a následné čištění extraktů. Metoda LC-MS kombinuje fyzikální separaci pomocí kapalinové chromatografie (LC) s detekcí hmotnostní spektrometrií (MS). Princip spočívá v přesném stanovení hledaného proteinu na základě jeho molekulové hmotnosti a také na základě pořadí aminokyselin po enzymatickém štěpení. Touto metodou byl stanoven SEB ve vzorku vody již v koncentraci 3 pmol.ml-1. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) je elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS). Umožňuje separaci proteinů na základě jejich pohyblivosti v elektrickém poli. SDS uděluje proteinům uniformní záporný náboj, a ty se pak všechny pohybují k anodě, přičemž pohyblivost je dána velikostí molekuly. Proteiny v gelu mohou být přeneseny na nitrocelulosovou, nylonovou nebo jinou membránu a mohou být poté analyzovány imunologicky protilátkami, které se specificky navážou na daný protein a mohou být zviditelněné různými technikami. Pomocí SDS-PAGE byly úspěšně detekovány i některé nové typy stafylokokových enterotoxinů.

8.1.3. Nepřímé metody stanovení stafylokokových enterotoxinů Využití nepřímých metod detekce SEs u tepelně opracovaných potravin může představovat specifický problém. Na rozdíl od stafylokoků, jež jsou v průběhu tepelného ošetření zničeny, jsou SEs termostabilní proteiny, které nedegraduje běžné tepelné ošetření při kulinární úpravě potravin a pokrmů. Z tepelně ošetřených potravin nemusí být možné získat izolát S. aureus ani DNA pro vlastní detekci genů. V tomto případě je nutné použít přímé metody stanovení toxinů.

64


Polymerázová řetězová reakce – PCR Principem metody PCR je klonování (opakovaná amplifikace) specifického úseku DNA. Metoda PCR se používá pro stanovení genů zodpovědných za tvorbu toxinů (např. sea, seb, sec), tedy pro potvrzení toxigenity kmenů S. aureus. V současné době jsou známy primery pro jednotlivé typy enterotoxinů. Nevýhodou metody PCR je, že potvrzení přítomnosti genu automaticky neznamená, že příslušný enterotoxin bude bakteriálním kmenem produkován. Absence přítomnosti SEs v potravinách, kde byla přítomnost kmenů S. aureus s geny kódujícími tvorbu klasických SEs prokázána, lze vysvětlit tak, že nedošlo k expresi genu nebo produkované množství toxinu bylo pod detekční mezí použitých metod (ELISA, RPLA). PCR metoda je nejpoužívanější metodou v případě detekce tzv. nových SEs, neboť pro všechny nové typy nejsou dostupné specifické protilátky využitelné při imunologickém stanovení. Real-time PCR Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (real-time PCR) je založena na principu klasické PCR s tím rozdílem, že speciální přístroj umožňuje kontinuálně monitorovat přírůstky DNA během každého cyklu (u klasické PCR se detekuje až finální produkt). Základní podmínkou je přítomnost nespecifického nebo specifického fluorescenčního substrátu (tzv. detekční sondy), který se váže na syntetizovanou DNA. Úroveň detekované fluorescence odráží množství syntetizované nukleové kyseliny. Metoda umožňuje nejen detekci, ale také kvantifikaci syntetizovaného produktu. Při hodnocení platí skutečnost, že čím vyšší je obsah nukleové kyseliny v testovaném vzorku, tím rychlejší je přírůstek fluorescence. Velkou výhodou metody real-time PCR je možnost určení exprese hledaného genu. Metoda má vysokou specifitu a citlivost. Ve srovnání s klasickou PCR je doba vlastního stanovení kratší, protože odpadá nutnost provedení elektroforézy v závěru analýzy. DNA microarrays Tato metoda je založena na principu hybridizace, probíhá na membráně nebo skleněné destičce, na které jsou mikrodávkovačem naneseny jednotlivé oligonukleotidy (DNA sondy). Po převrstvení testovaným vzorkem dojde v případě pozitivní reakce k navázání cílové DNA na DNA sondu. Cílová DNA je označená fluoroforem schopným emitovat světlo, vazba cílové DNA na sondu se tedy projeví fluorescencí. Intenzita fluorescenčního signálu odpovídá množství navázané cílové DNA. Metoda umožňuje kvalitativní i kvantitativní stanovení a sledování až stovek specifických úseků DNA v jedné reakci.

8.1.4. Využití v praxi V praxi jsou z uvedených metod běžně používány imunologické metody – reverzní pasivní latexová aglutinace, ELISA a ELFA, pomocí kterých lze detekovat klasické stafylokokové enterotoxiny (SEA, SEB, SEC, SED, SEE). Nařízení (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny ve znění pozdějších předpisů zahrnuje požadavky pro stanovení SEs u vybraných potravin (sýry, sušené mléko a sušená syrovátka). Referenční metody podle tohoto nařízení jsou ELISA a ELFA. Používá se ELISA test (Ridascreen® SET Total, výrobce R-Biopharm AG) s dialyzační metodou zakoncentrování SEs a s detekčním limitem 0,25 ng.ml-1 (g-1). Nízkého detekčního limitu 1 ng.ml-1 (g-1) můžeme dosáhnout i pomocí přístroje miniVIDAS® využívajícího metodu ELFA při využití zakoncentrování vzorku před vlastním stanovením toxinu. Obě metody se však omezují pouze na detekci klasických enterotoxinů SEA – SEE. Stafylokokové enterotoxiny jsou platnou legislativou (zákon č. 281/2002 Sb.) zařazeny do skupiny vysoce rizikových biologických toxinů. Jedná se o povinné opatření související se zákazem bakteriologických (biologických) a toxinových zbraní a možnosti jejich případného

65


zneužití. Pracoviště, které se analýzou SEs zabývají, mají povinnost žádat Státní úřad pro jadernou bezpečnost (SÚJB) o udělení povolení nakládat s těmito vysoce rizikovými biologickými toxiny. Nákup vyšetřovacích setů, jejichž součástí jsou SEs v podobě pozitivní kontroly, je možný pouze na základě udělení zmíněného povolení. Pracoviště je vedeno v evidenci, podléhá dozorové činnosti SÚJB a musí plnit povinnosti držitelů povolení v souladu s platnou legislativou.

8.2. Toxiny Bacillus cereus Bacillus cereus je fakultativně anaerobní, sporotvorná, grampozitivní tyčinka. Je producentem celé řady toxinů a enzymů, z pohledu alimentárních onemocnění jsou nejvýznamnější emetický toxin a diarhogenní enterotoxiny. Konzumace potravin kontaminovaných bakteriemi B. cereus může vyústit ve 2 různé formy alimentárního onemocnění – emetický a diarhogenní syndrom. Spory B. cereus se běžně vyskytují v prostředí a často kontaminují potraviny. Bakterie je také běžnou součástí střevní mikroflory člověka. K alimentárním otravám dochází po pomnožení bakterií v potravinách na množství přibližně 107 buněk v gramu (v případě dětí 105 v gramu). Pro stanovení B. cereus je podle ČSN EN ISO 7932 (2005) určen Mannitol Yolk Polymyxine B agar (MYP), kde B. cereus roste ve velkých suchých drsných koloniích s nepravidelnými okraji, růžové barvy (negativní manitol), obklopených růžovou zónou precipitace (lecitinázová aktivita). Pro izolaci B. cereus lze využít i chromogenní média. Toxiny B. cereus lze opět prokazovat přímými i nepřímými metodami. Nejčastěji se uvedené metody používají na hodnocení toxinogenity izolátů B. cereus. Komerčně dostupné kity jsou určeny k detekci přítomnosti diarhogenních enterotoxinů B. cereus. Emetický toxin se zpravidla detekuje nepřímo metodou PCR.

8.2.1. Emetický toxin a diarhogenní enterotoxiny Emetický toxin (cereulid) je termostabilní lipofilní cyklický polypeptid o velikosti 1152 Da. Odolává záhřevu až 121 °C po dobu 90 minut. Aktivitu si zachovává při pH 2 – 11, je odolný vůči působení proteolytických enzymů (pepsin, trypsin). Maximální produkce cereulidu je pozorována během stacionární fáze růstu bakterií v potravině a může být vázána na sporulaci. Emetický syndrom je alimentární intoxikace a vzniká po konzumaci potravin obsahujících vyprodukovaný emetický toxin. Toxická dávka je přibližně 30 μg na kg živé váhy. Toxin cereulid se váže na receptory nervus vagus v žaludku a indukuje zvracení. Typické symptomy – nauzea a zvracení, se objevují 1 – 6 hodin po konzumaci kontaminované potraviny a nepřetrvávají obvykle déle než 24 hodin, poté onemocnění spontánně odezní. Průběh onemocnění připomíná stafylokokovou enterotoxikózu. Emetický syndrom bývá obvykle spojen s konzumací těstovin a rýže, dále masa (hovězí, vepřové), mléčných pudinků a kojenecké výživy. B. cereus produkuje tři základní diarhogenní enterotoxiny – hemolysin BL (HBL toxin), nehemolytický enterotoxin (NHE) a cytotoxin K, nově byly izolovány i enterotoxin T (BceT) a enterotoxin FM. HBL toxin je jedním z nejvýznamnějších faktorů virulence a skládá se ze tří komponent: vazebného proteinu B a lytických komponent L1 a L2. Proteinový komplex nehemolytických enterotoxinů (NHE) se také skládá ze tří komponent: NheA, NheB, NheC. Diarhogenní enterotoxiny jsou zpravidla produkovány během pozdní exponenciální a na začátku stacionární fáze růstu při množení bakterií ve střevě, tedy až po kolonizaci bakterií v tenkém střevě. Jsou stabilní při pH 4 – 11 a termolabilní (účinně jsou inaktivovány teplotou 56 °C po dobu 5 minut). Proteolytické enzymy je štěpí. Pokud dojde k produkci enterotoxinů

66


v potravině, obvykle jsou tedy inaktivovány nízkým pH a účinkem proteolytických enzymů v žaludku. Diarhogenní syndrom se objevuje 8 – 16 hodin po konzumaci kontaminované potraviny. Mezi klinické příznaky patří vodnatý průjem, nauzea a abdominální bolesti, příležitostně se může objevit i zvracení. Potíže přetrvávají 12 – 24 hodin, potom spontánně odezní. Kmeny zodpovědné za diarhogenní syndrom jsou obvykle izolovány z masa a masných výrobků, ryb, omáček, zeleniny (např. kukuřice), vařených brambor a mléčných výrobků.

8.2.2. Přímé metody detekce toxinů B. cereus 8.2.2.1. Imunologické metody

Obrázek 30: BCET-RPLA – vyhodnocení.

Reverzní pasivní latexová aglutinace Princip metody je identický s testem na průkaz stafylokokových enterotoxinů. Po nanesení vzorků a příslušných protilátek do jamek se mikrotitrační destička inkubuje při laboratorní teplotě 18 – 24 hodin. Výsledky reakce lze hodnotit semikvantitativně podle mřížkové struktury na dně jamek. Citlivost testu je kolem 1 – 2 ng.g-1 (ml-1) vzorku. Komerčně dostupný test BCET-RPLA (výrobce Oxoid Ltd) detekuje L2 komponentu proteinového komplexu hemolyzinu BL (HBL toxinu).

Metoda ELISA Komerčně dostupný Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immunoassay (BDE-VIA™, výrobce TECRA) funguje na principu sendvičové ELISA metody. Je určen pro detekci průjmového enterotoxinu, konkrétně A komponenty (NheA) proteinového komplexu nehemolytických enterotoxinů (NHE) v potravinách, příbuzných vzorcích a pomnožovacích kulturách. Metoda detekuje toxin přítomný v koncentracích až 1 ng na 1 ml extraktu vzorku. Výsledky testu prováděného v mikrotitračních destičkách lze obdržet během 4 hodin. Test je běžně využíván u izolátů Bacillus spp. k posouzení jejich schopnosti tvořit enterotoxiny. V tomto případě se testovaná kultura inkubuje v pomnožovacím bujónu při teplotě 35 – 37 °C po dobu 16 – 18 hodin a průkaz toxinů se provádí v odstředěném supernatantu. V průběhu analýzy a přípravy vzorku je nutné brát na zřetel, že diarhogenní toxin BDE se váže na sklo. Nádoby a ostatní vybavení musí být vyrobeny z materiálu, na který se toxin neváže, proto je doporučeno použití polypropylenových nádob a lakmusových papírků místo sondy pH metru. 8.2.2.2. Fyzikálně-chemické metody Mezi moderní fyzikálně-chemické metody patří vysoce citlivá a specifická metoda hmotnostní spektrometrické detekce HPLC-MS, která kombinuje vysoceúčinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) s detekcí hmotnostní spektrometrií (MS). Lze jí využít pro stanovení cereulidu (emetického toxinu) v potravinách, a to i kvantitativně. Nevýhodou je nutnost přípravy vysoce čistého vzorku a standardu. Jako standard se využívá syntetický cereulid. Kromě HPLC-MS byly k detekci cereulidu použity metody s tandemovou hmotnostní detekcí (LC-MS/MS) a kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií s analyzátorem doby letu (LC-TOF-MS).

67


Příkladem využití fyzikálně-chemických metod při detekci diarhogenních toxinů je metoda MALDI-TOF/MS, kterou byl detekován cytotoxin K (CytK1) a nehemolytické enterotoxiny (NHE) produkované patogenními kmeny B. cereus. 8.2.2.3. Další přímé metody Pro detekci emetického toxinu se kromě již zmiňované HPLC-MS používají metody využívající tkáňové kultury (HEp-2 cell assay), biologický pokus (myši) či kančí sperma. Vizuálním hodnocením motility kančího spermatu bývá posuzována přítomnost cereulidu v testovaných vzorcích a jeho toxická aktivita. Metoda je doporučována jako rychlá, (výsledek je znám za 5 - 20 minut), na rozdíl od testů HEp-2 prokazujících mitochondriální toxicitu, jejichž trvání je více než 15 hodin. Další výhodou je nenáročnost na laboratorní vybavení a možnost množství cereulidu kvantifikovat. Metodu tak lze použít pro rychlé hodnocení toxinogenních schopností izolátů B. cereus. Hodnocení motility kančího spermatu využívá např. automatizovaná metoda CASA (Computer-Aided Semen Analysis).

8.2.3. Nepřímé metody stanovení toxinů B. cereus Polymerázová řetězová reakce, za použití specifických primerů, se používá pro stanovení genů zodpovědných za tvorbu toxinů u kmenů B. cereus. Emetický toxin cereulid je kódován ces geny a jeho nepřímý průkaz bývá založen na detekci genu cereulid syntetasy (cesB). Nehemolytické enterotoxiny (NHE) jsou kódovány geny nheA, nheB a nheC. U hemolysinu BL (HBL) jsou to geny hblA (pro komponentu B), hblC (pro komponentu L2) a hblD (pro komponentu L1). Dále lze metodou PCR detekovat gen cytK zodpovědný za tvorbu cytotoxinu K nebo gen bceT kódující enterotoxin T. I v tomto případě platí, že detekce genů metodou PCR je metoda nepřímá, protože geny kódující tvorbu toxinů nemusí být exprimovány. Při genotypové charakterizaci izolátů B. cereus lze mimo různých modifikací PCR (např. RAPD, RFLP-PCR, real-time PCR) využít i metodu MLST (Multilocus Sequence Typing), ribotypizaci či microarrays.

8.2.4. Využití v praxi K posouzení schopnosti tvorby enterotoxinů u kmenů B. cereus se v praxi využívají nejčastěji vyšetřovací sety ELISA nebo RPLA. Výskyt nehemolytických enterotoxinů – komponenty A (NheA), která je detekovatelná ELISA soupravou, je u toxinogenních kmenů B. cereus častější než L2 komponenta HBL toxinu detekovatelná soupravou RPLA. Využití obou setů je jednoduché a vhodné pro laboratoře vybavené k základnímu mikrobiologickému testování. Vzhledem k tomu, že toxiny B. cereus nejsou vedeny v kategorii bakteriologických (biologických) a toxinových zbraní, není nákup souprav omezen žádným speciálním povolením. Nároky na vybavení laboratoří využívajících nepřímé metody k detekci toxinů B. cereus, jsou vyšší, včetně nezbytných zkušeností pracovníků s prováděním molekulárně biologických metod. V případě průkazů cereulidu nejsou dostupné imunologické metody. Specializovaná pracoviště mohou využít metodu kombinující vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii s detekcí hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS). Pro své rychlé a jednoduché provedení je doporučován test s hodnocením aktivity kančího spermatu.

68


8.3. Toxiny Clostridium botulinum Clostridium botulinum je grampozitivní, endospory tvořící, obligátně anaerobní bakterie. Patogenní působení je vyvoláno nervovým toxinem nazývaným botulotoxin. Kmeny C. botulinum způsobující botulinové intoxikace u lidí produkují jeden nebo více botulotoxinů typů A, B, E, F. Hlavním rezervoárem C. botulinum je půda a prach, vodní sedimenty (typ E), ve velmi nízkých koncentracích může být obsaženo v zažívacím traktu hospodářských zvířat a následně kontaminovat potraviny živočišného původu. Detekce C. botulinum z potravin nebo jiného materiálu se provádí po pomnožení v tekutých půdách za anaerobních podmínek a následném vyočkování na krevní agar a selektivní půdy. Na krevním agaru vytváří C. botulinum 1 – 4 mm velké ploché kolonie se zónou hemolýzy. Předpokládá-li se přítomnost spor, je vhodné před analýzou vzorek zahřát na 80 °C.

8.3.1. Botulotoxiny Patogenní působení C. botulinum vyvolávají toxiny, které se uvolňují z bakteriální buňky po její lýze. Celkově bylo popsáno 7 hlavních botulotoxinů a řada subtypů (např. typ A zahrnuje subtypy A1, A2, A3, A4 a A5), které se od sebe liší aminokyselinovým složením. Humánní botulismus vyvolávají především typy A, B a E. Botulotoxin bývá nazýván jako klobásový jed, protože v minulosti býval spojován s otravami způsobenými nedokonale tepelně opracovanými klobásami (klobása – latinsky botulus). Botulotoxin je jednoduchý polypeptid o velikosti 150 kDa produkovaný jako protoxin. Tato forma botulotoxinu je relativně neškodná, patogenní působení nastává až po změně terciální struktury bílkovinného řetězce vyvolané působením extracelulárních proteas, k čemuž dochází po uvolnění z bakteriální buňky. Po rozpadu protoxinu na dva bílkovinné řetězce – těžký (100 kDa), který má vazebně receptorovou funkci a lehký (50 kDa), který má endopeptidázovou aktivitu, začíná botulotoxin patogenně působit. Těžký řetězec má dvě funkční oblasti s odlišnými funkcemi. C-konec bílkovinného řetězce umožňuje vazbu toxinu na nervová zakončení, N-konec pak přenos lehkého řetězce do cytosolu nervových buněk. Lehký bílkovinný řetězec má endopeptidázovou aktivitu, obsahuje molekuly zinku a zabraňuje uvolňování acetylcholinu, což je neurotransmiter ve vegetativním nervovém systému a také jediný neurotransmiter v somatickém systému. Po inaktivaci uvolnění acetylcholinu je znemožněn přenos vzruchů a rozvíjí se postupná paralýza. Botulotoxin patří mezi nejsilnější známé jedy. LD50 se pro člověka pohybuje okolo 5 – 50 ng/kg ž. hm., pro myši je letální dávka menší než 0,1 ng/kg ž. hm. Toxin je rezistentní k nízkému pH (je aktivní v rozmezí 3,5 – 6,5), ale inaktivují ho alkalie (např. 0,1N NaOH). Botulotoxin je termolabilní, tepelnou úpravou při 85 °C je zničen za 15 minut. Botulismus je charakterizován jako postupná symetrická paralýza nervů, která nastává po botulotoxiny vyvolaném přerušení nervosvalových spojení. Toxiny C. botulinum mohou mít různé místo působení a podle toho jsou rozeznávány jednotlivé typy botulismu: alimentární otrava, botulismus u dětí, u dospělých a traumatický botulismus po infekci ran. Příznaky onemocnění jsou u různých typů shodné. Alimentární intoxikace se projevuje za 12 – 36 hodin po pozření kontaminovaného jídla, podle množství bakterií a toxinů se příznaky mohou objevit už za 6 hodin, ale také za 8 – 10 dní. Rizikovými potravinami jsou domácí masozeleninové konzervy, nedostatečně tepelně opracované maso, syrové solené ryby nebo ryby uzené studeným kouřem. Prvotní příznaky jsou nevolnost, zvracení, bolest břicha a průjem, typické je rozmazané a dvojité vidění. Postupná paralýza začíná od hlavy ochablostí očních víček a mimických svalů, řeč je špatně srozumitelná, zhoršuje se dýchání a polykání. Smrt bývá vyvolána ochrnutím dýchacích svalů. 69


8.3.2. Metody detekce toxinů C. botulinum Přítomnost botulotoxinů v potravinách lze zjistit biologickým pokusem na myších, k určení typu toxinu se používají diagnostická séra. 8.3.2.1. Průkaz botulotoxinu Průkaz botulotoxinu z potravin, zvratků, krve, střevního obsahu je založen na zjištění onemocnění a úhynu bílých myší za klinických příznaků botulismu (zježená srst, ztížené dýchání, ochablé svaly břišní stěny = vosí pas, křeče, paralýza zadních končetin). Vzorek v bujonu po anaerobní inkubaci (výchozí tekutina) se aplikuje intraperitoneálně třem skupinám obsahujícím alespoň 2 myši. První skupině je aplikována výchozí tekutina bez úpravy, druhé skupině výchozí tekutina po zahřátí na 100 °C po dobu 10 minut a třetí skupině myší výchozí tekutina po 1 hodinovém účinku proteolytického enzymu (trypsin, pankreatin). Jako průkaz botulotoxinu je považováno onemocnění a úhyn myší první skupiny. 8.3.2.2. Identifikace typu botulotoxinu Stanovení typu botulotoxinu lze provádět neutralizační reakcí na bílých myších. Používají se antibotulinická séra pro jednotlivé typy botulotoxinu. Ve zkumavce se k výchozí tekutině přidá antisérum, jež inaktivuje příslušný typ botulotoxinu a po 45 minutách se aplikuje myším. Posuzuje se onemocnění a úhyn myší za klinických příznaků botulismu. 8.3.2.3. Další metody V roce 1999 byl v Anglii vyvinut ELISA test pro detekci neurotoxinu B s obchodním názvem BoNT, který je nyní komerčně dostupný. Detekci mikroorganismu i jeho toxinu lze dále provést také polymerázovou řetězovou reakcí (nevýhodou je detekce i mrtvých buněk), ribotypizací nebo pulzní gelovou elektroforézou.

8.3.3. Využití v praxi Počty hlášených případů botulismu v České republice se podle databáze Epidat pohybovaly v letech 2004 – 2013 v rozmezí 0 až 4 případy ročně. Z tohoto pohledu není stanovení botulotoxinu pro většinu laboratoří rutinní záležitostí, na druhou stranu je, vzhledem k jeho závažnosti, znalost vhodných vyšetřovacích postupů zcela nezbytná. Přestože je výskyt botulotoxinu v potravinách vzácnou záležitostí, musí riziko jeho možné přítomnosti v potravinách výrobci potravin akceptovat. Jde především o oblast konzervárenství a masozpracujícího průmyslu. Svého velkého významu dosáhl botulotoxin v posledních letech v kosmetickém průmyslu díky schopnosti paralyzovat mimické svaly a eliminovat činnost potních žláz. Clostridium botulinum a botulinové toxiny jsou vedeny v kategorii bakteriologických (biologických) a toxinových zbraní, a proto musí být laboratoře, které s nimi pracují, dozorovány SÚJB.

70

Typizační metody

9. TYPIZAČNÍ METODY A JEJICH VYUŽITÍ PŘI EPIDEMIOLOGICKÉM ŠETŘENÍ ALIMENTÁRNÍCH ONEMOCNĚNÍ 9.1. Alimentární onemocnění Onemocnění z potravin jsou velmi významnou skupinou nemocí lidí. Každoročně je v České republice hlášeno několik desítek tisíc případů a několik pacientů v důsledku tohoto onemocnění ročně zemře. Skutečná nemocnost je však oproti hlášené mnohonásobně vyšší. Velká část dospělých pacientů při mírnějších klinických příznacích nenavštíví lékaře a infekce tak uniká systému hlášení. Nejvyšší nemocnost je zaznamenávána u dětí (u kojenců a batolat zejména kvůli nezralosti imunitního systému, rychlé dehydrataci a možnosti selhání oběhového systému). Rodiče dětí této věkové kategorie častěji navštěvují lékaře kvůli jakýmkoli klinickým příznakům onemocnění svých dětí. Alimentární onemocnění dělíme podle mechanismu působení na infekce a intoxikace, nebo podle původu etiologického agens na onemocnění bakteriální, virové a parazitární. Nejčastějšími alimentárními infekcemi bakteriálního původu u nás jsou kampylobakterózy a salmonelózy. K alimentárním infekcím dále řadíme listeriózy, které jsou vyvolávány bakteriemi Listeria monocytogenes a které postihují především imunosuprimované jedince, seniory a gravidní ženy. Závažná onemocnění vyvolávají i některé toxigenní kmeny bakterií druhu Escherichia coli (Shiga Toxin produkující E. coli – STEC), které způsobují různé formy onemocnění od krvavých průjmů až po život ohrožující hemolyticko-uremický syndrom (HUS). Další velmi významnou skupinou infekcí jsou virové nákazy, které způsobují onemocnění explozivního charakteru s rychlou úpravou zdravotního stavu, což omezuje možnosti jejich diagnostiky a hlášení. Také alimentární intoxikace se mohou podílet na vzniku velkých epidemií, zejména pokud vzniknou ve stravovacích zařízeních. Toxin, který onemocnění vyvolává, se vytváří již v potravině v důsledku nesprávné manipulace nebo skladování potravinových surovin nebo potravin a pokrmů. K nejvýznamnějším bakteriím produkujícím toxiny patří Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus a Bacillus cereus. Původci alimentárních infekcí se vyznačují potenciálem pro způsobování epidemických výskytů a vysokou tenacitou (schopnost přežívat v prostředí), či schopností množení se i v nepříznivých podmínkách, např. Listeria monocytogenes při chladírenských teplotách. Při vzniku epidemií alimentárního původu hrají významnou úlohu také asymptomatičtí nosiči (osoby bez klinických příznaků onemocnění, ale vylučující ve stolici původce alimentárních onemocnění), kteří mohou při nedodržování zásad osobní hygieny potraviny či pokrmy kontaminovat. Zdroje jednotlivých původců alimentárních onemocnění se mohou lišit. V případě salmonel jsou to nejčastěji potraviny živočišného původu a výrobky z nich, u kampylobakterů je to zejména drůbeží maso a droby (hlavně chlazené), u listerií zrající sýry, některé masné výrobky a lahůdkové saláty, u STEC syrové maso a mléko přežvýkavců a u Yersinia enterocolitica zejména vepřové maso.

9.2. Typizační metody Metody typizace jsou využívány k detailní identifikaci bakterií (např. na úroveň druhu, poddruhu, sérotypu, subtypu) a jsou založeny na sledování jejich fenotypových a genotypových vlastností. Od konce minulého století se rozvíjí zejména molekulárně biologické metody, které umožňují detailní porovnání kmenů až na úroveň klonu. Původně byly tyto metody vyvíjeny ke sledování zdrojů a cest šíření infekčních agens epidemiologicky významných antroponóz. V posledním desetiletí se tyto metody již využívají i při rutinním šetření alimentárních onemocnění a společně s jejich aplikací se vytvořil nový obor – 71

Typizační metody

molekulární epidemiologie. Současně lze tyto metody použít i ke sledování výskytu nežádoucích (patogenních i technologicky významných) bakterií a jejich šíření v potravinářských provozovnách či v tržní síti. Postupně se tyto metody začínají uplatňovat i v České republice. Z fenotypových metod se pro účely typizace používají například biotypizace, sérotypizace, fágová typizace a rezistence k antimikrobiálním látkám. Z genotypových metod se využívají metody založené na principu PCR (např. PCR sérotypizace) nebo zlatý standard v typizačních metodách makrorestrikční analýza (PFGE) a dále metody založené na principu sekvenace, jednak specifického úseku bakteriální DNA nebo tzv. celogenomová sekvenace.

9.2.1. Sérotypizace Sérotypizace je metoda založená na reakci antigenu neseného mikroorganismem a protilátky ve formě antiséra. Tato metoda je velmi významná např. u bakterií rodu Salmonella, který sice má pouze dva druhy a 6 poddruhů, ale zahrnuje podle Kauffmann-White-LeMinor schématu více než 2500 sérotypů (tabulka 5). Dále je tato metoda využívána i pro další původce alimentárních onemocnění, např. Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica a Cronobacter sakazakii. Tabulka 5: Zastoupení druhů, poddruhů a sérotypů bakterií rodu Salmonella. Název druhu S. enterica S. enterica S. enterica S. enterica S. enterica S. enterica

Název poddruhu enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica

S. bongori Celkem

Počet sérotypů 1531 505 99 336 73 13 22 2579

(Grimont and Weill, 2007)

9.2.1.1. Antigenní struktura Buňky bakterií rodu Salmonella vykazují na svém povrchu tři typy antigenů. Těmi jsou somatický, bičíkový a kapsulární antigen (typický především pro sérotyp Typhi a Paratyphi). Detekce antigenní struktury je závislá na fenotypovém projevu buňky, a pokud například buňka v některé životní fázi netvoří bičíky, pak není možné bičíkový antigen pomocí fenotypové sérotypizace prokázat. Existují ovšem sérotypy, které přirozeně postrádají geny kódující některé antigeny. Pak je nutné odlišit kmen, který je přirozeně bez antigenu a kmen, který je v daném antigenu defektní. Somatický antigen Somatický antigen (O antigen) je představován polysacharidy přítomnými na povrchu gramnegativních buněk, je typický pro zástupce čeledi Enterobacteriaceae. Je součástí vnější lipopolysacharidové vrstvy. U rodu Salmonella se vyskytuje 46 různých somatických antigenů, na jejichž základě jsou sérotypy rozděleny do několika skupin. Flagelární antigeny Flagelární neboli bičíkové antigeny (H antigen) se mohou vyskytovat ve dvou takzvaných fázích (jsou kódovány geny fliC a fljB). Některé sérotypy přirozeně postrádají gen pro jednu nebo druhou fázi (například u salmonel se to týká nejčastějšího sérotypu v České republice

72

Typizační metody

Salmonella Enteritidis, který ve svém genomu nenese gen fljB, nekóduje tudíž protein druhé bičíkové fáze). Kapsulární antigen Kapsulární antigen (Vi antigen) je přítomný např. u E. coli a některých sérotypů salmonel. Názvy sérotypů Dříve byly sérotypy salmonel pojmenovávány podle symptomů onemocnění, které vyvolávaly (S. Abortusequi, S. Choleraesuis, S. Typhimurium, S. Bovismorbificans), ale posléze byl tento systém již neudržitelný a přešlo se na pojmenovávání podle místa první izolace (S. London, S. Kentucky, S. Zanzibar, S. Praha). Z důvodů velkého množství sérotypů je typizační schéma založeno na postupném zařazení kmene do skupin pomocí polyvalentních antisér. Bližší dourčení se provádí pomocí monovalentních antisér pro jednotlivé somatické antigeny a antigeny dvou bičíkových fází. Nakonec dostáváme tzv. antigenní strukturu. Například struktura pro S. Enteritidis je následující: somatické antigeny - 9,12; bičíkové antigeny první fáze - g,m; druhá fáze není vyjádřena. Antigenní struktura se uvádí jako: 9,12:g,m:-. Pro S. Typhimurium, druhý nejfrekventněji se vyskytující sérotyp, je antigenní struktura následující: 4,[5],12:i:1,2. U vzácných sérotypů salmonel je sérotypizace dostatečnou metodou pro odhalení hromadného výskytu onemocnění. U bakterií rodu Listeria rozlišujeme pouze 13 sérotypů (označované číselným a písmenným kódem např. 1/2a, 1/2b, 4b). Tato metoda je proto pouze prvním typizačním krokem a vždy je potřeba pokračovat dalšími metodami, např. detailnější charakteristikou metodou PCR sérotypizace, makrorestrikční analýzou a případně i sekvenačními metodami. U bakterií E. coli jsou sérotypy uváděny číselným kódem např. O157:H7.

9.2.2. Fágová typizace Fágová typizace je metoda sledující rezistenci bakterií k sadám standardně naředěných fágových suspenzí. Tato metoda se používá při typizaci bakterií S. aureus, L. monocytogenes, STEC, ale nejčastěji je využívána k typizaci nejfrekventnějších sérotypů salmonel (Enteritidis a Typhimurium). Fágy jsou aplikovány ve formě kapek na živný agar inokulovaný přes noc pomnoženou kulturou testovaného bakteriálního kmene. K provedení je potřeba použít také kontrolní kmeny se známými reakcemi. Pozitivní reakce se projeví tvorbou plaků viditelných jako tečkovité projasnění svrchní vrstvy agaru s narostlou bakteriální kulturou. Pro sérotyp Enteritidis se využívá 17 fágů, jejichž reakce s bakteriálním kmenem jsou schopny rozlišit 96 fágových typů. Pro sérotyp Typhimurium pak testovaná sada fágů obsahuje 30 fágů a rozlišují 208 fágových typů. Výsledné reakce fágů a testovaných bakterií jsou odečítány podle příslušného schématu a určí se příslušný fágový typ (tabulka 6). V některých případech jsou fágové typy signifikantní pro určitou zemi (například S. Enteritidis PT3 pro Polsko) nebo druh zvířat (S. Typhimurium DT2 pro holuby). Pomocí této metody lze snadno sledovat ovlivňování epidemické situace turismem, globálním obchodem s potravinami nebo lze naznačit původ vehikula i u dominantních sérotypů. Pokud jsou u více izolátů zaznamenány shodné fágové typy, které jsou navíc v dané zemi považovány za vzácné, je tato metoda dostatečnou při epidemiologickém šetření.

9.2.3. Rezistence k antimikrobiálním látkám Sledování rezistence k antimikrobiálním látkám se u střevních bakterií využívá jako epidemiologický marker. U některých sérotypů salmonel jsou některé rezistenční vzorce

73

Typizační metody

typické pro daný sérotyp, například S. Typhimurium fágový typ DT104 má typickou rezistenci k ampicilinu, chloramfenikolu, streptomycinu, sulfonamidům a tetracyklinu. Vzhledem k tomu, že významná část alimentárních onemocnění se řadí mezi zoonózy (onemocnění přenosná ze zvířete na člověka), je rezistence také dobrým ukazatel šíření genů rezistence v potravinovém řetězci. Bakterie kromě mutací v jednotlivých genech také ochotně přijímají geny rezistence pomocí horizontálního přenosu. V poslední době jsou často sledovány plasmidově vázané rezistence k chinolonovým antibiotikům, které navíc bývají často přenášeny společně s geny pro ESBL (širokospektré betalaktamasy). K dalším významným enzymům zodpovědným za vznik rezistencí řadíme i karbapenemasy a metalobetalaktamasy. Tabulka 6: Ukázka fagotypizačního schématu pro bakterie sérotypu Salmonella Enteritidis. Reakce fágů v pracovním ředění Typ 1b 1d 1 1a 1c 1e 43 32 32a 44 41 21c 21 21a 21b 49 17 60 2 37 20 20a 22 3

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

OL

SCL

CL

CL

SCL

CL

OL

OL

CL

CL

CL

CL

OL

SCL

SCL

+++

SCL

SCL

++

SCL

OL

OL

+

OL

+++

CL

SCL

OL

SCL

OL

SCL

CL

CL

SCL

CL

OL

OL

OL

CL

CL

CL

CL

–

–

OL

SCL

CL

CL

OL

CL

OL

OL

OL

CL

CL

CL

+++m

–

–

OL

SCL

CL

SCL

OL

++

–

–/SCL

SCL

OL

OL

OL

+

CL

–

–

OL

SCL

SCL

CL

SCL

OL

OL

OL

SCL +++ /SCL –

–

SCL

CL ++ /SCL CL

CL

SCL

+++ + /SCL CL

OL

OL

CL ++ /SCL CL

CL

–

–

OL

OL

SCL

CL

SCL

CL

SCL

+

OL

OL

–

OL

–

CL

CL

CL

CL

OL

SCL

OL

SCL

CL

SCL

–

OL

SCL

–

SCL

–

CL

–

-/+

CL

OL

SCL

CL

–

CL

OL

–

OL

SCL

CL

CL

CL

–

–

–

OL

SCL

SCL

–

CL

SCL

OL

–

OL

++

CL

CL

–

–

–

–

OL

SCL

–

–

SCL

OL

OL

–

–

–

CL

SCL

OL

SCL

–

–

OL

OL

OL

–

–

–

CL

–

/+

OL

OL

–

–

–

–

–

–

SCL

OL

OL

–

–

–

++

–

–

SCL

OL

+++

–

SCL

–

SCL

++/
+++

–

SCL

–

SCL

SCL /+m /+m /+m –

CL

+

CL

SCL

CL

SCL

CL

OL

+++

OL

CL

CL

CL

+

–

–

+++

++

SCL

+

SCL

–

CL

–

OL

–

+++

CL

+++

–

–

OL

–

CL

–

CL

SCL

–

OL

–

OL

–

CL

CL

CL

–

–

–

OL

–

CL

SCL

SCL

CL

OL

OL

CL

–

CL

–

–

OL

–

CL

–

OL

SCL

OL

OL

–

CL

CL

CL

CL

–

–

–

OL

–

CL

–

CL

–

+

OL

–

OL

+

CL

+

CL

CL

–

OL

–

CL

–

CL

–

CL

OL

–

OL

CL

CL

+

CL

–

+

–

OL

–

–

SCL

–

SCL

–

OL

OL

–

–

–

CL

–

–

SCL

OL

–

–

–

–

++

–

OL

–

OL

–

–

–

CL

–

–

–

Legenda: OL – opalescentní lýza, CL – splývavá lýza, SCL – polosplývavá lýza

(HPA, Colindale, 2008)

9.2.4. Makrorestrikční analýza a pulsní gelová elektroforéza (PFGE) Makrorestrikční analýza a následná pulsní gelová elektroforéza jsou považovány za zlatý standard při konfirmaci epidemických kmenů různých patogenních agens. Jedná se o izolaci DNA ukotvenou v agarózových bločcích a její štěpení v místech specifických pro daný restrikční enzym, který štěpí pouze na limitovaném počtu míst v genomu. Používány jsou restrikční enzymy izolované z různých mikroorganismů a pro každé agens je vhodný jiný restrikční enzym, například XbaI pro salmonely nebo E. coli, SmaI pro kampylobaktery, ApaI pro listerie. Rozdělení fragmentů probíhá v agarózovém gelu ve speciálně upravené elektroforetické vaně hexagonálního tvaru. Gel je poté obarven v roztoku ethidium bromidu a fragmenty DNA jsou vizualizovány v UV světle. Gely jsou analyzovány vhodným software například programem BioNumerics (Applied Maths, Belgie), který vypočítá podobnost srovnávaných kmenů.

74

Typizační metody

Metoda makrorestrikční analýzy je poměrně náročná na čas (postup podle standardního protokolu trvá 2-3 dny). I přesto je tato metoda považována za standard v typizačních metodách a umožňuje mezilaboratorní (mezinárodní) porovnávání kmenů.

9.2.5. Sekvenační metody Nejmodernější typizační metody jsou založeny na principu sekvenace, ať už se jedná o sekvenování určitého úseku DNA (MLVA, MLST) nebo celého bakteriálního genomu. Při metodě MLVA (Multi-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis, multilokusová analýza tandemových repetic) jsou zjišťovány sekvence určitých oblastí obsahující různé počty tandemových repetic. Podle počtu těchto repetic je pak definována příbuznost kmenů. Tato metoda umožňuje detailní rozlišení kmenů, protože ke změnám v repeticích dochází velmi snadno a často. Tato metoda je vhodná k porovnávání blízce příbuzných kmenů jednoho sérotypu, například v rámci jedné epidemie v jedné lokalitě. Při metodě MLST (Multi-Locus Sequence Typing, multilokusová sekvenační typizace) jde naopak o sekvenaci oblastí tzv. housekeeping – provozních genů, kdy jsou oblasti těchto genů obvykle konzervativní. Metoda je vhodná například po porovnání kmenů jednoho sérotypu z různých zdrojů nebo různých států pro vytvoření fylogenetických stromů. Celogenomová sekvenace poskytuje maximální diskriminační schopnost. Z výsledné sekvence lze zjistit například celkové údaje o genech rezistence (rezistom) anebo genech virulence (virulom). Tyto metody umožňují získání detailních informací o genetické stavbě bakterií, odpadá při tom tedy vybírání nejvhodnějších cílů analýz. Získaná data poskytují velkou variabilitu výběru porovnávaných vlastností. Nicméně je tato metoda a především pak nové rychlé variace sekvenování (např. pyrosekvenace) velmi drahá a tudíž nevhodná k rutinní typizaci bakterií. Do budoucna však metody celogenomové sekvenace budou představovat jedinou možnost, jak v krátkém čase zjistit o daném patogenu co nejvíce informací a tím zrychlit diagnostiku a typizaci při šetření hromadných výskytů.

9.3. Případové studie 9.3.1. Případová studie 1 Na luxusní lodi při plavbě po středomoří došlo k hromadnému výskytu alimentárního onemocnění. Na lodi cestovalo 850 cestujících, délka výletu byla naplánována na 5 dní. Šéfkuchař den před vyplutím trpěl střevními potížemi, ale v den plavby nastoupil do práce. Šéfkuchař se svým týmem připravoval stravu pro pasažéry i posádku, prvním společným pokrmem byla večeře. Téže noci se objevily trávicí obtíže u 150 cestujících, problémy se vyznačovaly rychlým nástupem nevolnosti a prudkým průběhem onemocnění, z příznaků bylo zaznamenáno zvracení, bolesti břicha, průjem, schvácenost, bolest celého těla. Už druhý den většina příznaků u postižených osob ustoupila a třetí den po onemocnění došlo k úpravě zdravotního stavu. Postupně se však onemocnění šířilo na další cestující, především na příbuzné a nejbližší spolucestující osob, kteří již onemocnění prodělali. Na základě explozivního charakteru epidemie, klinických příznaků postižených osob a anamnézy kuchaře lze usuzovat na onemocnění virového původu. Přenos se obvykle děje fekálně orální cestou. U pacientů by mělo být provedeno bakteriální a virologické vyšetření stolice či zvratků. Pokud jsou k dispozici zbytky potravin, pak je indikováno jejich virologické vyšetření.

75

Typizační metody

9.3.2. Případová studie 2 Na svatební hostině se podávala polévka s játrovými knedlíčky, svíčková na smetaně s karlovarským knedlíkem a jako moučník tiramisu z domácích vajec. Druhý den večer 10 lidí z 50 přítomných začalo trpět bolestmi břicha, průjmem bez příměsi krve, nevolností a teplotou. Všech 50 účastníků konzumovalo polévku a hlavní jídlo. Do týdne došlo k úpravě zdravotního stavu postižených osob. Klinické příznaky onemocnění (včetně teploty) naznačují, že se jedná o bakteriální infekci. Přenos se děje obvykle kontaminovaným vehikulem (potravinou). U pacientů by mělo být provedeno bakteriální vyšetření stolice. Pokud jsou k dispozici zbytky potravin, pak je indikováno jejich bakteriologické vyšetření. Podezřelými potravinami jsou zejména játrová zavářka, houskový knedlík a tiramisu. Možným etiologickým agens je salmonela.

9.3.3. Případová studie 3 V restauraci nižší cenové skupiny s nízkým hygienickým standardem bylo podáváno jednotné menu – těstoviny se sýrovou omáčkou. Pokrm byl připravován v době od 10 do 11 hodin a poté byl uchováván při pokojové teplotě až do doby vydání (od 12. do 14. hodiny). Porce byly vydávány postupně a ohřívány v mikrovlnné troubě. U části strávníků (porce vydané mezi 13. a 14. hodinou) došlo přibližně hodinu po konzumaci k náhlé nevolnosti a zvracení, u části postižených se přidal i průjem. Během několika hodin došlo k samovolné úpravě zdravotního stavu postižených. Podle klinických příznaků a rychlého nástupu onemocnění lze usuzovat na alimentární intoxikaci. Pravděpodobně došlo k pomnožení toxinogenních bakterií v průběhu nesprávného uchovávání pokrmu (těstoviny se sýrovou omáčkou). U pacientů by mohlo být provedeno vyšetření zvratků či stolice na přítomnost toxinů (např. metodou ELFA). Pokud jsou k dispozici zbytky potravin, pak je indikováno jejich vyšetření na přítomnost toxinů, případně i bakteriologické vyšetření na počty S. aureus a B. cereus.

9.3.4. Případová studie 4 V průběhu letní dovolené někteří rekreanti kempu konzumovali grilované kuře prodávané z pojízdného stánku. Do 48 hodin se u některých konzumentů projevily horečka, křeče v břiše, průjem, u některých postižených s příměsí krve a celková slabost. Přidružila se horečka, a zatímco u části pacientů došlo k samovolné úzdravě, u několika pacientů (děti předškolního věku a jeden senior) klinické příznaky neustupují a museli navštívit zdravotní středisko, jedna osoba byla pro závažné potíže hospitalizována v místním zdravotnickém zařízení. V nemocnici byla provedena rehydratace a lékaři podali postiženému antibiotika ze skupiny makrolidů. Klinické příznaky onemocnění (včetně teploty) naznačují, že se jedná o bakteriální infekci. Přenos se děje obvykle kontaminovaným vehikulem (potravinou). U pacientů by mělo být provedeno bakteriální vyšetření stolice. Pokud jsou k dispozici zbytky potravin, pak je indikováno jejich bakteriologické vyšetření. Podezřelým pokrmem je grilované kuře. U pacientů by mělo být provedeno bakteriální vyšetření stolice. Pokud jsou k dispozici zbytky potravin, pak je indikováno jejich bakteriologické vyšetření. Klinické příznaky (křeče v břiše) a suspektní vehikulum naznačují, že by se mohlo jednat o kampylobakterovou infekci.

76

Použitá literatura

POUŽITÁ LITERATURA ALBERTS, B., BRAY, D.; JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M., ROBERTS, K., WALTER, P. (eds.) Základy buněčné biologie (Úvod do molekulární biologie). 1. vyd. Ústí nad Labem, CZ: Espero Publishing, s.r.o. 2005. 630 s. ANDERSON, E.S., WARD, L.R., DE SAXE, M.J., DE SA, J.D. Bacteriophage typing designations of Salmonella typhimurium. The Journal of Hygiene, 1977, vol. 78, no. 2, p. 297-300. BABACAN, S., PIVARNIK, P., LETCHER, S., RAND, A.. Piezoelectric flow injection analysis biosensor for the detection of Salmonella Typhimurium. Journal of Food Science, 2002, vol. 67, no. 1, p. 314-320. BAERT, L., UYTTENDAELE, M., DEBEVERE, J. Evaluation of viral extraction methods on a broad range of Ready-To-Eat foods with conventional and real-time RT-PCR for Norovirus GII detection. International Journal of Food Microbiology, 2008, vol. 123, no. 1-2, p. 101-108. BARBOSA-CANOVAS, G.V., MORTIMER, A., LINEBACK, D., SPIESS, W., BUCKLE, K., COLONNA, P. (eds.) Global Issues in Food Science and Technology. 1st ed. Burlington, USA: Academic Press. 2009. 520 p. BRITZ T., ROBINSON, R.K. (eds.) Advanced Dairy Science and Technology. 1st ed. Oxford, UK: Blackwell Publishing Ltd. 2008. 312 p. CARBONNELLE, E., MESQUITA, C., BILLE, E., Day, N., DAUPHIN, B., BERETTI, J., FERRONI, A., GUTMANN, L., NASSIF, X. MALDI-TOF mass spectrometry tools for bacterial identification in clinical microbiology laboratory. Clinical Biochemistry, 2011, vol. 44, no. 1, s. 104-109. ČSN EN ISO 6888-1. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení počtu koagulázopozitivních stafylokoků (Staphylococcus aureus a další druhy) – Část 1: Technika s použitím agarové půdy podle Baird-Parkera. Praha: Český normalizační institut. 1999.16 s. ČSN EN ISO 7932. Mikrobiologie potravin a krmiv – Horizontální metoda stanovení počtu presumptivního Bacillus cereus – Technika počítání kolonií vykultivovaných při 30 °C. Praha: Český normalizační institut. 2005. 20 s. DASEN, A., BERTHIER, F., GRAPPIN, R., WILLIAMS, A.G., BANKS, J. Genotypic and phenotypic characterization of the dynamics of the lactic acid bacterial population of adjunct-containing Cheddar cheese manufactured from raw and microfiltered pasteurised milk. Journal of Applied Microbiology, 2003, vol. 94, no. 4, p. 595-607. DEMNEROVÁ, K. Microbiological Food Safety: Current Strategy of Efficient Control. Chemické listy, 2012, vol. 106, no. 10, p. 920-925. DOSTÁLEK, P., BRÁNYIK, T. Prospects for Rapid Bioluminescent Detection Methods in the Food Industry – a Review. Czech Journal of Food Sciences, 2005, vol. 23, no. 3, p. 85-92. DUŠKOVÁ, M., ŠEDO, O., KŠICOVÁ, K., ZDRÁHAL, Z., KARPÍŠKOVÁ, R. Identification of lactobacilli isolated from food by genotypic methods and MALDI-TOF MS. International Journal of Food Microbiology, 2012, vol. 159, no. 2, s. 107-114. EASTER, M.C. (ed.) Rapid Microbiological Methods in the Pharmaceutical Industry. 1st ed. Boca Raton, USA: Interpharm/CRC Press. 2003. 288 p. EDWARDS-JONES, V., CLAYDON, M.A., EVASON, D.J., WALKER, J., FOX, A.J., GORDON D.B. Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry. Journal of Medical Microbiology, 2000, vol. 49, no. 3, p. 295-300. ENGELKIRK, P.G., DUBEN-ENGELKIRK, J. Laboratory Diagnosis of Infectious Diseases: Essentials of Diagnostic Microbiology. Baltimore, USA: Lippincott Williams & Wilkins. 2008. 754 p. FENSELAU, C., DEMIREV, P.A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews, 2001, vol. 20, no. 4, p. 157-171. FRATAMICO, P.M., BHUNIA, A.K., SMITH, J.L. Foodborne pathogens: Microbiology and molecular biology. Norfolk, UK: Caister Academic Press, 2005. 454 p.

77

Použitá literatura GOYAL, S.M. (ed.) Viruses in Foods. 1st ed. New York, USA: Springer. 2006. 331 p. GRIMONT, P., WEILL, F.-X. Antigenic formulae of the Salmonella serovars [online]. 9th ed. Paris: Pasteur Institute, 2007, 166 p. [cit. 2013-01-20]. Dostupný na www: http://www.pasteur.fr/ip/portal/action/WebdriveActionEvent/oid/01s-000036-089 GRUENWEDEL, D.W., WHITAKER, J.R. (eds.) Food Analysis: Principles and Techniques. Volume 3 Biological Techniques. 1st ed. New York, USA: Marcel Dekker, Inc. 1985. 397 p. HANSEN, K., MIKKELSEN, T., MØLLER-MADSEN. Use of the Limulus test to determine the hygienic status of milk products as characterized by levels of Gram-negative bacterial lipopolysaccharide present. The Journal of Dairy Research, 1982, vol. 49, no. 2, p. 323-328. HATCHER, W.S., DIBENEDETTO, S., TAYLOR, L.E., MURDOCK, D.I. Radiometric analysis of frozen concentrated orange juice for total viable microorganisms. Journal of Food Science, 1977, vol. 42, no. 3, p. 636-639. HEWITT, W. Microbiological Assay for Pharmaceutical Analysis: A Rational Approach. 1st ed. Boca Raton, USA: Interpharm/CRC Press. 2003. 260 p. HOLST, O. (ed.) Microbial Toxins. Methods and Protocols. 1st ed. Borstel, Germany: Humana Press. 2011. 239 p. HUI, Y.H. (ed.) Handbook of Food Science, Technology, and Engineering, Volume 4. 1st ed. Boca Raton, USA: CRC Press. 2006. 928 p. IKNER, L.A., GERBA, C.P., BRIGHT, K.R. Concentration and Recovery of Viruses from Water: A Comprehensive Review. Food and Environmental Virology, 2012, vol. 4, no. 2, p. 41-67. JACKSON, K.A., EDWARDS-JONES, V., SUTTON, C.W., FOX A.J. Optimisation of intact cell MALDI method for fingerprinting of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Microbiological Methods, 2005, vol. 62, no. 3, p. 273-84. JAY, J.M., MARGITIC, S., SHEREDA, A.L., COVINGTON, H.V. Determining Endotoxin Content of Ground Beef by the Limulus Amoebocyte Lysate Test as Rapid Indicator of Microbial Quality. Applied and Environmental Microbiology, 1979, vol. 38, no. 5. p. 885-890. JEßBERGER, N., DIETRICH, R., BOCK, S., DIDIER, A. Bacillus cereus Enterotoxin Act as Major Virulence Factors and Exhibit Distinct Cytotoxicity to Different Human Cell Lines. Toxicon, 2014, vol. 77, p. 49-57. LAY, J.O. MALDI-TOF mass spectrometry and bacterial taxonomy. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 2000, vol. 19, no. 8, p. 507-516. LAY, J.O. MALDI-TOF mass spectrometry of bacteria. Mass Spectrometry Reviews, 2001, vol. 20, no. 4, p. 172– 194. LEWIS, K., SALYERS, A.A., TABER, H.W., WAX, R.G. (eds.) Bacterial Resistance to Antimicrobials. 1st ed. New York, USA: Marcel Dekker, Inc. 2002. 495 p. LI, X.H., MA, H.M., DONG, S.Y., DUAN, X.J., LIANG, S.C. Selective labeling of histidine by a designed fluorescein-based probe. Talanta, 2004, vol. 62, no. 2, p. 367-371. LINSTEDT, B.A., VARDUND, T., AAS, L., KAPPERUD, G. Multiple-locus variable-number tandemrepeats analysis of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium using PCR multiplexing and multicolor capillary electrophoresis. Journal of Microbiological Methods, 2004, vol. 59, no. 2, p.163-172. LÓPEZ-CAMPOS, G., MARTÍNEZ-SUÁREZ, J.V., AQUADO-URDA, M., LÓPEZ-ALONSO, V. Microarray Detection and Characterization of Bacterial Foodborne Pathogens. 1st ed. New York, USA: Springer. 2012. 135 p. LORENCOVÁ, A., VAŠÍČKOVÁ, P. Viry jako původci alimentárních onemocnění. Maso, 2013, vol. 24, no. 2, s. 34-40. MAZZEO, M.F., SORRENTINO, A., GAITA, M., CACACE, G., DI STASIO, M., FACCHIANO, A., COMI, G, MALORNI, A., SICILIANO, R.A. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight

78

Použitá literatura mass spectrometry for the discrimination of food-borne microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, 2006, vol. 72, no. 2, p. 1180-1189. MCMEEKIN, T.A. (ed.) Detecting pathogens in food. 1st ed. Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited. 2003. 384 p. MELLO, L.D., KUBATO, L.T. Review of the use of biosensors as analytical tools in the food and drink industries. Food Chemistry, 2002, vol. 77, no. 2, p. 237-256. Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Úřední věstník Evropské unie, 2005, L 338, s. 1-26. OLSON, W.P. (ed.) Automated Microbial Identification and Quantification: Technologies for the 2000s. 1st ed. Boca Raton, USA: CRC Press. 1996. 424 p. PECK, M.W., STRINGER, A.T., CARTER, A.T. Clostridium botulinum in the Post-genomic Era. Food Microbiology, 2011, vol. 28, no. 2, p. 183-191. PILIARIK, M., PÁROVÁ, L., HOMOLA, J. High-throughput SPR sensor for food safety. Biosensors & Bioelectronics, 2009, vol. 24, no. 5, 1399-1404. PREVITE, J. Radiometric Detection of Some Food-Borne Bacteria. Applied Microbiology, 1972, vol. 24, no. 4, p. 535-539. RAJKOVIC, A., UYTTENDAELE, M., VERMEULEN, A., ANDJELKOVIC, M., FITZ-JAMEZ, I., VELD P. in 't DENON, Q., VERHE, R., DEBEVERE, J. Heat Resistant of Bacillus cereus Emetic Toxin, Cereulid. Letters in Applied Microbiology, 2008, vol. 46, p. 536-541. RAUGEL, P-J. Rapid Food Analysis and Hygiene Monitoring: Kits, Instruments and Systems. 1st ed. Berlin, Germany: Springer-Verlag. 1999. 921 p. RAY, B., BHUNIA, A. Fundamental Food Microbiology. 5th ed. Boca Raton, USA: CRC Press. 2013. 663 p. REIWALD, A., SAUER, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nature Protocols, 2009, vol. 4, p. 732-742. RIBOT, E.M., FAIR, M.A., GAUTOM, R., CAMERON, D.N., HUNTER, S.B., SWAMINATHAN, B., BARRETT, T.J. Standardization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for the subtyping of Escherichia coli O157:H7, Salmonella and Shigella for PulseNet. Foodborne Pathogens and Disease, 2006, vol. 3, no. 1, p. 59-67. ROBERTS, T.A., BAIRD-PARKER, A.C., TOMPKIN, R.B. Microorganisms in food: Characteristics of microbial pathogens. 1st ed. London, UK: Blackie Academic & Professional. 1996. 524 p. ROWLEY, D.B., PREVITE, J.J., SRINIVASA, H.P. A radiometric metod for rapid screening of cooked foods for microbial acceptability. Journal of Food Science, 1978, vol. 43, no. 6, p. 1720-1722. RYZHOV, V., FENSELAU, C. Characterization of the protein subset desorbed by MALDI from whole bacterial cells. Analytical Chemistry, 2001, vol. 73, no. 4, p. 746-750. SEDLÁČEK, I. Taxonomie prokaryot. 1. vyd. Brno, CZ: Masarykova Univerzita. 2007. 278 s. SCHWALBE R., STEELE-MOORE, L., GOODWIN, A.C. (eds.) Antimicrobial Susceptibility Testing Protocols. 1th ed. Boca Raton, USA: CRC Press. 2007. 432 p. SHAMA, G., MALIK, D.J. The uses and abuses of rapid bioluminescence-based ATP assays. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 2013, vol. 216, no. 2, p. 115-125. SINGHAL, R., KULKARNI, P.R., REGE, D.V. Handbook of indices of food quality and authencity. 1st ed. Cambridge, UK: Woodhead Publishing Limited. 1997. 561 p. SKLÁDAL, P. Biosenzory [online]. [cit. 2014-03-20]. Dostupný na www: http://orion.chemi.muni.cz/pskl/vyuka/Biosensory.pdf SOBEL, J. Botulism. Clinical Infectious Diseases, 2005, vol. 41, no. 8, p. 1167-1173. STALS, A., BAERT, L., VAN COILLIE, E., UYTTENDAELE, M. Extraction of food-borne viruses from food samples: A review. International Journal of Food Microbioly, 2012, vol. 153, no. 1-2, p. 1-9.

79

Použitá literatura SVOBODOVÁ, I. Clostridium botulinum: vlastnosti a význam v oboru zpracování masa. Maso, 2014, roč. 25, č. 1, s. 50-55. ŠEDO, O., SEDLÁČEK, I., ZDRÁHAL, Z. Sample preparation methods for MALDI-MS profiling of bacteria. Mass Spectrometry Reviews, 2011, vol. 30, no. 3, p. 417-434. ŠMARDA, J., DOŠKAŘ, J., PANTŮČEK, R., RŮŽIČKOVÁ, V., KOPTÍKOVÁ, J. Metody molekulární biologie. 1. vyd. Brno, CZ: Vydavatelství Masarykova Univerzita. 2005. 188 s. ŠŤÁSTKOVÁ, Z., KARPÍŠKOVÁ, R., BORKOVCOVÁ, I. Možnosti detekce stafylokokových enterotoxinů. Chemické Listy, 2012, vol. 106, s. 745-749. TAYLOR, A.D., LADD, J., YU, Q.M., CHEN, S., HOMOLA, J., JIANG S. Quantitative and simultaneous detection of four foodborne bacterial pathogens with a multi-channel SPR sensor. Biosensors & Bioelectronics, 2006, vol. 22, no. 5, 752-758. URBÁŠKOVÁ, P. Rezistence bakterií k antibiotikům – vybrané metody. 1. vyd. Praha: Trios, spol. s r.o. 1999. s. 1.1-10.2.8. VOTAVA, M. Lékařská mikrobiologie obecná. 1. vyd. Brno, ČR: Neptun. 2001. 247 s. WALKER, J., FOX, A.J., EDWARDS-JONES, V., GORDON, D.B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. Journal of Microbiological Methods, 2002, vol. 48, no. 2-3, p. 117-126. WELKER, M., MOORE, E.R.B. Applications of whole-cell matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in systematic mikrobiology. Systematic and Applied Microbiology, 2011, vol. 34, no. 1, p. 2-11. WARD, L.R., DE SA, J.D.H., ROWE, B. A phage-typing scheme for Salmonella enteritidis. Epidemiology and Infection, 1987, vol. 99, no. 2, p. 291-294. WICTOME, M., NEWTON, K., JAMESON, K., HALLIS, B., DUNNIGAN, P., MACKAY, E., CLARKE, S., TAYLOR, R., GAZE, J., FOSTER, K., SHONE, C. Development of an In Vitro Bioassay for Clostridium botulinum Type B Neurotoxin in Foods That Is More Sensitive than the Mouse Bioassay. Applied and Environmental Microbiology, 1999, vol. 65, no. 9, p. 3787-3792. WILSON, CH.L. (ed.) Microbial Food Contamination, Second Edition. 2nd ed. Boca Raton, USA: CRC Press. 2007. 632 p. YAO, C.Y., ZHU, T.Y., QI, Y.Z., ZHAO, Y.H., XIA, H., FU, W.L. Development of a Quartz Crystal Microbalance Biosensor with Aptamers as Bio-recognition Element. Sensors, 2010, vol. 10, no. 6, p. 5859-5871. YENI, F., ACAR, S., POLAT, Ö.G., SOYER, Y., ALPAS, H. Rapid and standardized methods for detection of foodborne pathogens and mycotoxins on fresh produce. Food Control, 2014, vol. 40, p. 359-367. Zákon č. 281/2002 Sb. o některých opatřeních souvisejících se zákazem bakteriologických (biologických) a toxinových zbraní a o změně živnostenského zákona. Sbírka zákonů České republiky, 2002, částka 102, s. 6025-6032.

80

Autoři:

MVDr. Šárka Bursová, Ph.D. Mgr. Marta Dušková, Ph.D. MVDr. Lenka Necidová, Ph.D. doc. MVDr. Renáta Karpíšková, Ph.D. Mgr. Petra Myšková

Název:

Mikrobiologické laboratorní metody

Ústav:

Ústav hygieny a technologie mléka

Počet stran:

80

Vydání:

1.

Povoleno:

Rektorátem VFU Brno

Podpořeno:

Projektem OP VK reg. č. CZ.1.07/2.2.00/28.0287

Vydavatel:

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

ISBN 978-80-7305-676-6

MIKROBIOLOGICKÉ LABORATORNÍ METODY

Recommend Documents