Dako EnVision+ System- HRP Jelölt polimer Anti-egér Kód: K4000 115 ml Kód: K4001 110 ml Alkalmazás
In vitro diagnosztikai felhasználásra. Ezek az elıírások érvényesek a Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP) rendszerre Ez a kit antigének egérben termelt, a felhasználó által alkalmazott, elsıdleges ellenanyagok felhasználásával történı minıségi kimutatására szolgál fénymikroszkóppal, normál és patológiás, paraffinba ágyazott szöveteken, fagyasztott metszeteken vagy sejtpreparátumokon A szövetek elıkészítéséhez számos fixáló használható, pl. etanol, B-5, Bouin fixáló, cink-formiát, és semlegesre pufferelt formalin. Hivatkozva az “Általános útmutató az immunhisztokémiai festésekhez” illetve a detektáló rendszerek IHC eljárási “Útmutatóinak” az (1) Az eljárás alapelvei (2) A szükséges – de nem biztosított – anyagok (3) Tárolás, (4) Minta elıkészítés (5) Festési eljárás (6) Minıség ellenırzés (7) Problémamegoldás (8) A festés kiértékelése (9) Általános korlátozások c. fejezeteire.
Összefoglalás és magyarázat
Az EnVision+ System-HRP egy két lépéses IHC festési technika. Ez a rendszer egy HRP-vel jelölt polimeren alapszik, amelyhez a másodlagos antitestet hozzákötötték. A jelölt polimer nem tartalmaz avidint vagy biotint. Ennek következtében a májban, lépben, limfoid szövetekben és fagyasztott metszeten fellépı endogén avidinbiotin aktivitás, mely nem specifikus festıdést okoz, kiküszöbölhetı, vagy szignifikánsan csökkenthetı. Minden reagens az EnVision+ System-HRP rendszerben használatra kész. Ez a rendszer rendkívül érzékeny módszer, ennek eredményeképpen az elsıdleges antitest optimális hígítása akár 20x nagyobb lehet, mint a hagyomásnyosan használt PAP technikákban, és jóval nagyobb, mint a hagyományos ABC vagy LSAB eljárásokban alkalmazottaknál. Ez az eljárás egy fejlett jelgenerátor rendszert kínál alacsony koncentrációban jelen lévı antigének detektálására, vagy alacsony titerő elsıdleges antitestekhez. Az egérben elıállított elsıdleges antitestek jól reagálnak a jelölt polimerrel. A pozitív festıdés vagy annak hiányának értékelését ki kell egészíteni morfológiai és hisztológiai vizsgálatokkal, megfelelı kontrollal.
Az eljárás alapelve
Az endogén peroxidáz aktivitás gátolható a minták megfelelı endogén peroxidáz blokkoló reagenssel történı inkubálásával. A mintát ezután egy megfelelıen meghatározott és hígított egér elsıdleges antitesttel inkubáljuk, majd ezt követi a jelölt polimerrel történı inkubáció, melyek egyenként 30 percig tartanak. Megjegyzendı, hogy azok az antitestek, melyek enzimes elıkezelést vagy antigén feltárást igényelnek, az elsıdleges antitesttel és a jelölt poliomerrel 5-10 perccel tovább inkubálandók. A festést egy 5-30 perces megfelelı szubsztrát – kromogén oldattal történı inkubációval fejezzük be.
Reagens
Kód: K4000: Az alábbi kitben található anyagok 150 szövetmetszet vizsgálatához elegendıek, 100 µl oldat/metszet felhasználással : Mennyiség Leírás 1x15 ml Jelölt Polimer Peroxidázzal jelölt polimer, kecske anti-egér immunoglobulinokhoz kötve, Tris-HCl pufferben, mely stabilizátor fehérjét és fertıtlenítıt tartalmaz. Kód: K4001: Az alábbi kitben található anyagok 1100 szövetmetszet vizsgálatához elegendıek, 100 µl oldat/metszet felhasználással: Mennyiség 1x110 ml
Szükséges, de nem biztosított anyagok
(111714-004)
Leírás Jelölt Polimer Peroxidázzal jelölt polimer, kecske anti-egér immunoglobulinokhoz kötve, Tris-HCl pufferben, mely stabilizátor fehérjét és fertıtlenítıt tartalmaz.
Nedvszívó kendık Kontroll szövet, pozitív és negatív Magfestı anyag, víz bázisú, mint pl. a Mayer’s Hematoxylin, vagy a Lillie szerint módosított Mayer’s hematoxilin. (kód S3309) Fedılemezek Desztillált víz Abszolút és 95%-os etanol Fénymikroszkóp (20x–800x)
302059HU_003 p. 1/5
Fedıanyag, mint pl Glycergel® fedıanyag (kód C0563) vagy Faramount, vízbázisú fedıanyag használatra kész (kód S3025) vagy nem vízbázisú tartós fedıanyag, Ultramount (kód S1964) Elsıdleges antitestek és negatív kontroll reagens Tárgylemezek, poli-L-lizinnel fedett vagy szilanizált tárgylemez (kód S3003) Festı edények vagy kádak Idımérı (3-40 perces intervallumban mérjen) Öblítı palackok Mosó pufferoldat Xilol, toluol, vagy xilol helyettesítık A K4000 vagy K4001 EnVision+, Peroxidase rendszerekhez az alábbi reagensek szükségesek a fent felsoroltakon túl: Endogén peroxidáz blokkoló reagens, pl. Dual Endogenous Enzyme Block (kód: S2003) Szubsztrát kromogén oldat, pl. AEC+ Substrate-Chromogen, Ready-to-Use 110 mL (kód: K3469) vagy Liquid DAB+ (kód: S2002) Esetlegesen szükséges, de nem biztosított anyagok Ammónium-hidroxid, 15 mol/l 0.037 mol/l-re hígítva PAP toll (kód S2002) Óvintézkedések
1. Megfelelı szakmai képzettséggel alkalmazható 2. Ne használjuk a reagenst a lejárati idı után. Ha a reagenst más körülmények közt tároltuk, mint ami a termékleírásban szerepel, akkor a felhasználónak magának kell validálnia. 3. Ne helyettesítsük a reagenst más lot számú, vagy más gyártó kitjébıl származó oldattal. 4. Az enzimek és a szubsztrát kromogén károsodik, ha erıs fény éri. Ezért ne tároljuk a kit részeit , illetve ne végezzük a festést nagyon erıs fényben, direkt napon. 5. A leírttól eltérı inkubációs idık és hımérsékletek hibás eredményt adhatnak, ilyen változtatások validálása a felhasználóra hárul. 6. Mint minden biológiai eredető termék, megfelelı kezelést igényel az alkalmazás során.. 7. Használjunk megfelelı egyéni védıfelszerelést, hogy elkerüljük a bır vagy a szem sérülését. 8. A fel nem használt oldatot a jogszabályi elıírásoknak megfelelıen semmisítsük meg.
Reagens elıkészítés
Mosó puffer oldat A TBST, 0.05 mol/L Tris pufferelt sóoldat Tween-nel (kód S3006) a javasolt mosó puffer oldat automatához és manuális IHC festésekhez is. A TBS, 0.05 mol/L Tris pufferelt sóoldat (kód S1968) és a PBS, 0.02 mol/l foszfát pufferelt sóoldat (kód S3024) szintén alkalmas mosó puffer oldat manuális festésekhez. Nátrium-azid tartalmú mosó puffer oldatok alkalmazása nem ajánlott. A nátrium-azid inaktiválja a peroxidázt (HRP-t), így negatív festést eredményez. A fel nem használt puffert 2-8 °C-on kell tárolni. Ha az oldat zavaros lesz, ki ke ll önteni. A peroxidáz blokkoló, a szubsztrát, és a magfestı anyag leöblítésére desztillált víz használható. Elsıdleges antitest Az NP-sorozatú, “Plus” használatra kész antitestek a Dako “Plus” nagy érzékenységő detektáló rendszer alkalmazására vannak opitimalizálva, és használatuk azzal javasolt. A Dakonál koncentrált antitestek is elérhetıek. A koncentrált antitestek optimalizálása a végfelhasználó feladata. A hígítások elkészíthetık az antitest hígítóval (Antibody Diluent (kód S0809)) vagy más hígítószerrel, mely 0.05 mol/L Tris-HCl puffert, és 1% borjú szérum albumint (BSA) tartalmaz. A Dako N sorozatú használatra kész antitestjei nincsenek a “Plus” detektáló rendszerekre optimalizálva Ezen kit alkalmazásakor a legtöbb elsıdleges antitestnek 30 perc inkubációs idı szükséges. Negatív kontroll reagens A Dako NP sorozatú, “Plus” használatra kész antitestjeihez javasolt az Universal Negative Control+, mint negatív kontroll reagens, mely optimalizálva van egér (kód NP015) NP sorozatú “Plus” antitestekhez. Ideális esetben a negatív kontroll reagens olyan antitestet tartalmaz, amely nem mutat specifikus reakciót emberi szövetekkel vagy normál/nem-immun szérummal a hígított elsıdleges antitesttel azonos oldatban/mátrixban. A negatív kontroll antitestnek azonos alosztályba kell tartoznia és azonos állatfajból kell erednie, mint az elsıdleges antitest, azonos koncentrációban kell tartalmaznia immunoglobulint vagy fehérjét, mint az elsıdleges antitest, azonos hígítószerrel végezve a hígítást. A negatív kontroll és az elsıdleges antitest inkubációs idejének is hasonlónak kell lennie. Magfestés A festési reakció színes végterméke alkoholban oldhatatlan, és használható alkohol vagy vízbázisú magfestı anyagokkal, mint a Mayer hematoxilin, vagy a Lillie féle módosított Mayer hematoxilin (kód S3309). A hematoxilines magfestés után öblitsük le a lemezt alaposan desztillált vízzel, majd merítsük a szövetmetszetet 0.037 mol/l koncentrációjú ammónia fürdıbe, vagy hasonló kékítı anyagba. A 0.037 molos ammónia oldat készíthetı 2.5 ml tömény (15 mol/l) ammónia-hidroxid oldat 1 liter vízben való elkeverésével. A fel nem használt 0.037 mol/l-s ammónia szobahımérsékleten (20-25 °C) tárolható jól záró üvegben 1 2 hónapig. Alternatív magfestési módokról informálódjon a gyártók leírásából.
(111714-004)
302059HU_003 p. 2/5
Fedıanyag Vízbázisú fedıanyagként ajánlott a Glycergel Mounting Medium (kód C0563) vagy a használatra kész Faramount Aqueous Mounting Medium (kód S3025). A Glycergelt közvetlenül a használat elıtt legalább 50 °C-ra fel kell melegíteni. Nem-vízbázisú fed ıanyag (Ultramount, kód S1964) szintén használható. Tárolás
EnVision+ System-HRP reagenseit 2-8 °C-on kell táro lni, fagyasztani nem szabad. Nem használható fel a jelzett lejárati idın túl. Bármely reagens érzékelhetı megváltozása, mint pl kicsapódás, instabilitást vagy minıség romlást jelez. Ilyen esetekben a reagens(ek) nem használható(k). Nincs egyértelmő jele a termék instabilitásának. Ezért pozitív és negatív kontrollt is végezni kell a a beteg mintájával egyidıben. Váratlan eredmény esetén, mely nem magyarázható a laboratóriumban alkalmazott módszerekkel, illetve a termékkel kapcsolatos probléma felmerülésekor forduljon a Dako technikai szervízhez.
Minta elıkészítés
Paraffinba ágyazott szövet Hivatkozva az “Általános útmutató az immunhisztokémiai festésekhez” és/vagy az antitest leírására. Az IHC festés elıtt a szövetet fixálni kell és elı kell készíteni a festésre. A fixálás megakadályozza az autolízist, és a metszet bomlását és megörzi az antigenitását. Fokozza a szövet alkotórészek refraktív indexét és a sejtes elemek ellenállóképességét az elıkészítés (víztelenítés) során. A szövet elıkészítés lépései a dehidratálás, a dehidratáló anyag eltávolítása, a beágyazó anyag infiltrálása, a beágyazás és a szövet metszése. Az IHC szövetelıkészítésben használt legalapvetıbb fixáló anyagokról az “Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez” c. kiadványban található információ. Ezek csak útmutatások. Az optimális eljárást a felhasználó határozza meg, és a rendszer validálást is ı végzi. (A szövet fixálásával és elıkészítésével kapcsolatosan bıvebb információt ld. az 1. és 2. referencia irodalomban.)
Festési eljárás
Megjegyzések az eljáráshoz A felhasználónak gondosan át kell olvasnia ezeket az útmutatókat, hogy közelebbrıl megismerje a termék tartalmát a felhasználás elıtt. A reagensek és az útmutatások a termék optimális használatára vonatkoznak. A reagensek további hígítása illetve az inkubációs idık vagy hımérsékletek megváltoztatása hibás eredményt okozhat. Minden reagenst szobahımérsékletőre kell melegíteni (20–25°C) az immunfestés el ıtt. Hasonlóképpen minden inkubációt szobahımérsékleten kell végezni. Ne hagyjuk a szövetmetszeteket kiszáradni a festési eljárás alatt. A kiszáradt szövetmetszetben gyakoribb a nem-specifikus festések megjelenése. A fedjük be a lemezeket, ha huzatnak vannak kitéve. Ha elhúzódó inkubáció szükséges, tegyük a szöveteket nedves környezetbe. Az EnVision+ System-HRP érzékenysége tovább növelhetı az inkubációs lépések (2. és 3. lépés) hosszának 5-10 perces növelésével. Festési eljárás 1. lépés PEROXIDÁZ BLOKKOLÁS Itassuk fel a felesleges puffert. Szálmentes anyag felhasználásával (mint pl. Kimwipe vagy gézlap) Óvatosan töröljük körbe a mintát, hogy a maradék folyadékot eltávolítsuk, és az oldat csak az elıírt területen maradjon. Használjon elegendı mennyiségő peroxidáz blokkolót az 1. palackból a minta befedéséhez. Inkubációs idı 5 (±1) perc. Óvatosan öblítsük le mosópalackból desztillált vízzel vagy puffer oldattal (ne irányítsuk közvetlenül a szövetre), és helyezzük friss puffer fürdıbe. 2. lépés ELSİDLEGES ANTITEST VAGY NEGATÍV KONTROLL REAGENS Itassuk fel a felesleges puffert, mint az elıbb. Használjunk elegendı mennyiségő, optimálisan hígított elsıdleges antitest vagy negatív kontroll reagenst a minta fedésére. Inkubációs idı 30 (±1) perc. Óvatosan öblítsük le mosópalackból desztillált vízzel vagy puffer oldattal. (ne irányítsuk közvetlenül a szövetre), és helyezzük friss pufferfürdıbe. Ha a festési eljárást meg kell szakítani, a lemezek a puffer fürdıben maradhatnak az elsıdleges antitesttel történı inkubáció (2. lépés) után egy órán keresztül szobahımérsékleten (20–25°C) anélkül, hogy ez hatással lenne a festési eredményre. 3. lépés PEROXIDÁZZAL JELÖLT POLIMER Itassuk fel a felesleges puffert, mint az elıbb. Használjunk elegendı mennyiségő jelölt polimert a 2. palackból a minta befedéséhez. Inkubációs idı 30 (±1) perc. Öblítsük a lemezeket, mint a 2. lépésben.
(111714-004)
302059HU_003 p. 3/5
4. lépés SZUBSZTRÁT CHROMOGÉN Itassuk fel a felesleges puffert, mint az elıbb. Használjunk elegendı mennyiségő elıkészített DAB+ szubsztrát-kromogén oldatot a minta befedéséhez. (lásd a Reagens elıkészítés c. részt). Inkubációs idı 5-10 perc. Óvatosan öblítsük le mosópalackból desztillált vízzel (ne irányítsuk közvetlenül a szövetre). A szubsztrát kromogént győjtsük veszélyes anyag győjtı konténerben a további megsemmisítésig. 5. lépés HEMATOXILINES MAGFESTÉS (OPCIONÁLIS) Merítsük a lemezeket vízbázisú hematoxilines (kód S3309) fürdıbe. Az inkubáció hossza a használt hematoxilin erısségétıl függ. Óvatosan öblítsük le desztillált vízfürdıben. Mártsuk a lemezeket 10-szer 0.037 molos ammónia oldatba vagy hasonló kékítı anyagba. Öblítsük a lemezeket desztillált vagy ioncserélt vízfürdıben, 2-5 percig. 6. lépés FEDÉS A mintákat fedhetjük vízbázisú fedıanyaggal, mint pl. Glycergel Mounting Medium (kód C0563) vagy a Faramount (kód S3025), és nem-vízbázisú fedıanyaggal mint pl Ultramount (kód S1964). Megjegyzés: A lemezek a megfelelı idıben értékelhetık. Bár néha homályosodás elıfordulhat, ha a lemezt erıs fény éri egy hétnél tovább. Hogy elkerüljük a homályosodást, tároljuk a lemezeket szobahımérsékleten, sötét helyen. Minıség ellenırzés
A szövetfeldolgozás és a felhasználók laboratóriumi technikai eljárásainak különbségei miatt az eredmények szignifikánsan változóak lehetnek, ami szükségessé teszi a rendszeres ‘házon-belüli’ ellenırzést a következı folyamatokkal együtt. További információkért lásd az Amerikai Patológus Kollégium (CAP) Tanusítási Program az immunhisztokémiában c kiadványának minıség ellenırzési útmutatóját, és a 3-5 referencia irodalmat. Minden antitesthez tartozó specifikációs lapon további részletek találhatók az érzékenységrıl és az immunreaktivitásról. Pozitív és negatív kontrollal kapcsolatos további információk az “Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez” c. kiadványban találhatók.
Festés kiértékelése
Értékelési útmutatók a “Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez” c. kiadványban találhatók.
Korlátozások
Hivatkozva a “Általános útmutató az immunhisztokémiai festéshez” c. kiadványban található általános korlátozásokra. Régi vagy nem pufferolt fixáló anyagok használata, vagy extrém hımérséklet (több mint 60 °C) a szövetelıkészítés során csökkenti a festés érzékenységét. Endogén peroxidáz vagy pszeudoperoxidáz aktivitás, ami megtalálható vérfehérjékben mint pl. hemoglobin, myoglobin, citokróm és kataláz illetve eozinofil sejtekben.6,7 Ez az aktivitás gátolható a minták peroxidáz blokkoló anyaggal történı inkubálásával, 5 perc az elsıdleges antitest alkalmazása elıtt. Vér és csontvelı kenetek valamint fagyasztott szövetek is kezelhetık ezzel a reagenssel, noha ez az eljárás nem szünteti meg a vérfehérjék vörösesbarna színét. Alternatív megoldásként metanol-hidrogénperoxid alkalmazható. Ezen eljárás során néhány antigén denaturálódhat. Olyan betegek szövetmintáinál, akik Hepatitis B-vel fertızöttek, és a Hepatitis B felületi antigén (HbsAg) jelen van, megjelenhet nem specifikus festıdés a peroxidázzal (HRP-vel).8 A másodlagos antitesttel azonos állatból eredı normál/nem-immun szérumokat alkalmazva a blokkoló lépésnél, téves negatív vagy pozitív festéseket okozhatnak, az auto-antitestek vagy a természetes antitestektıl függıen. A kitben biztosított reagensek optimálisan vannak hígítva. A további hígitással elveszhet az antigén detektálhatósága.
Hibaelhárítás
Probléma 1. Nincs festés egy lemezen sem.
2. Gyenge festıdés minden lemezen.
Lehetséges ok 1a. A reagenseket nem megfelelı sorrendben használták 1b. Nátrium azid van a puffer fürdıben. 2a. A metszetek túl sok folyadékot tartalmaznak a vízfürdı után.
3. Erıs háttérfestıdés minden lemezen.
2b. A lemezeket nem inkibálták elég sokág az antitestben vagy a szubsztrát keverékben. 3a. A minta magas endogén peroxidáz aktivitást mutat. 3b.A paraffin nincs tökéletesen eltávolítva..
(111714-004)
Javasolt intézkedés 1a. A reagnes felhasználás áttekintése. 1b. Használjunk friss, azid mentes puffert.. 2a. Óvatosan öntsük le a felesleges oldatot, mielıtt felitatnánk a metszet körül. 2b. Tekintsük át a javasolt inkubációs idıket. 3a. Alkalmazzunk hosszabb inkubációs idıt a peroxidáz blokkoló oldattal (1. flakon). 3b. Használjunk friss xilol vagy toluol fürdıt. Ha sok metszetet festünk egyszerre, a második xilol fürdı tartalmazzon friss xilolt.
302059HU_003 p. 4/5
3c. A lemezek nincsenek elég alaposan leöblitve.
3d. A normálisnál gyorsabb szubsztrát festıdés, például szobahımérsékletnél magasabb hımérséklet miatt. 3e. A metszetek kiszáradtak a festés alatt.
3f. A reagensek nem specifikus kötıdése a szövetmetszethez.
3c. Alkalmazzunk friss oldatokat a pufferfürdıkben és a mosópalackokban. Alternatív megoldás: TBST 0.05 mol/LTris puffer, mely tartalmaz 0.3 mol/L NaCl-t és 0.1% Tween-t (kód S3306). 3d. Alkalmazzunk rövidebb inkubációt a szubsztrát kromogén oldattal..
3e. Használjunk nedves kamrát. Csak 3-4 lemezt töröljünk szárazra egyszerre a reagens alkalmazása elıtt. 3f. Alkalmazzunk irreleváns fehérjét tartalmazó blokkoló oldatot.
3g. Az antitest túl koncentrált.
3g. Alkalmazzuk az elsıdleges antitestet nagyobb hígításban. MEGJEGYZÉS: Ha a probléma nem azonsítható a fentiek alapján, vagy a javasolt intézkedések nem hoznak megoldást, további segítségért kérjük forduljon a Dako technikai szervízéhez További információk a festési technikákról és a minta elıkészítésrıl megtalálhatók az Immunkémiai festési eljárások - Kézikönyv9 (elérhetı a Dako-nél), az Immunhisztológiai atlasz10, az Immunperoxidáz technikák, a tumor diagnózis gyakorlati megközelítése11 c. kiadványokban. Referenciák
1. Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; 81 2. Naish SJ (ed). Handbook - immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako 1989 3. Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92:836 4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order kód: C24-A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66:194 6. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35:213 7. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; 46 8. Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 9. Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 10. Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986
További referenciák
Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25 Bisgaard K. EnVision Plus-Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct 20-25
Edition 11/12
(111714-004)
302059HU_003 p. 5/5
