Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci
OPTIMALIZACE POLYMERÁZOVÉ ŘETĚZOVÉ REAKCE PRO ZÍSKÁNÍ GENOTYPIZAČNÍCH DAT ZA VYHRANĚNÝCH PODMÍNEK
Habilitační práce
Mgr. Jiří Drábek, PhD. Olomouc 2007
John Donne v 17. století tvrdil, že žádný člověk není ostrov. Pro vědeckou práci ve 21. století to platí také. Děkuji proto svým mladším i starším spolupracovníkům za souhlas s použitím publikovaných článků - našich společných výsledků - pro tuto habilitační práci. Děkuji své ženě za zázemí pro sepsání této práce.
Obsah 1. SEZNAM ZKRATEK A POJMŮ .............................................................................................................. 4 2. ÚVOD ........................................................................................................................................................... 6 3. ROZSAH POUŽITÍ PCR V LIDSKÉ GENETICE.................................................................................. 9 3.1. DNA PROFILOVÁNÍ, KONTROLA PŮVODU, URČENÍ RODIČOVSTVÍ A PŘÍBUZNOSTI ................................... 9 3.2. DETEKCE DĚDIČNÝCH CHOROB A SPECIFICKÝCH POLYMORFISMŮ........................................................... 9 3.3. DETEKCE VIROVÉ, BAKTERIÁLNÍ A HOUBOVÉ INFEKCE ........................................................................... 9 3.4. GENETICKÉ INŽENÝRSTVÍ: KLONOVÁNÍ GENŮ A CÍLENÁ MUTAGENEZE ................................................. 10 3.5. KVANTIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN ................................................................................................ 10 4. OMEZENÍ PCR......................................................................................................................................... 13 4.1. CHYBOVOST POLYMERÁZY ................................................................................................................... 13 4.2. DÉLKA CÍLOVÉ SEKVENCE .................................................................................................................... 13 4.3. POČÁTEČNÍ MNOŽSTVÍ A KVALITA TEMPLÁTU ...................................................................................... 13 4.4. KONTAMINACE ..................................................................................................................................... 13 4.5. NESPECIFICKÁ VAZBA PRIMERŮ ............................................................................................................ 14 5. FAKTORY ÚSPĚŠNOSTI PCR REAKCE – PRVOČINITELÉ.......................................................... 15 5.1. PRIMERY ............................................................................................................................................... 15 5.2. HARDWARE ........................................................................................................................................... 17 5.3. POLYMERÁZA ....................................................................................................................................... 18 5.4. PUFR ..................................................................................................................................................... 18 5.5. PCR PROGRAM ...................................................................................................................................... 19 5.6. TEMPLÁT............................................................................................................................................... 19 5.7. INHIBITORY ........................................................................................................................................... 20 5.8. ENHANCERY.......................................................................................................................................... 21 6. KONCEPT UNIVERZALITY.................................................................................................................. 23 6.1. PŘÍPADOVÁ STUDIE 1: UZAMČENÁ MEZIDRUHOVÁ QPCR SONDA.......................................................... 25 6.1.1. Úvod ............................................................................................................................................... 25 6.1.2. Metody............................................................................................................................................. 25 6.1.3. Výsledky a diskuse ............................................................................................................................ 26 6.2. PŘÍPADOVÁ STUDIE 2: MULTIPLEX PCR S NASTAVOVANÝMI PRIMERY PRO IDENTIFIKACI OSOB A URČOVÁNÍ PŘÍBUZNOSTI .............................................................................................................................. 29 6.2.1. Úvod ............................................................................................................................................... 29 6.2.2. Metody............................................................................................................................................. 29 6.2.3. Výsledky a diskuse ............................................................................................................................ 31 7. ANOTOVANÉ ČASOPISECKÉ PRÁCE ................................................................................................ 33 7.1. DIVERSITY AMONG WILD TYPE AND VACCINATION STRAINS OF TRICHOPHYTON VERRUCOSUM INVESTIGATED USING RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA ANALYSIS ................................................. 33 7.2. A COMMENTED DICTIONARY OF TECHNIQUES FOR GENOTYPING ............................................................ 34 7.3. 32 BP DELETION IN CCR-5 GENE AND HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS EPIDEMIC IN THE CZECH REPUBLIC ..................................................................................................................................................... 35 7.4. CHARACTERIZATION OF A NOVEL HLA-A*24 ALLELE CONTAINING AN HLA-A*03 SEQUENCE MOTIF 36 7.5. FREQUENCY OF 657DEL(5) MUTATION OF THE NBS1 GENE IN THE CZECH POPULATION BY POLYMERASE CHAIN REACTION WITH SEQUENCE SPECIFIC PRIMERS .................................................................................. 37 7.6. A STUDY ON THE EFFECTS OF DEGRADATION AND TEMPLATE CONCENTRATION ON THE AMPLIFICATION EFFICIENCY OF THE STR MINIPLEX PRIMER SETS .......................................................................................... 38 7.7. CONCORDANCE STUDY BETWEEN MINIPLEX ASSAYS AND A COMMERCIAL STR TYPING KIT ................... 39 7.8. CLASS I TYPING BY PCR-SSP IN OLOMOUC ............................................................................................. 40 7.9. A SUGAR, LAUNDRY DETERGENT, AND SALT METHOD FOR EXTRACTION OF DEOXYRIBONUCLEIC ACID FROM BLOOD ................................................................................................................................................. 41 8. SHRNUTÍ ................................................................................................................................................... 42 9. PŘEHLED LITERATURY POUŽITÉ.................................................................................................... 43
1. Seznam zkratek a pojmů AFLP AABB Amplikon Anticipace Antigen ARMS bp BSA Delece Denaturace Deoxyribóza DNA dNTPs EDNAP EDTA EFI ELISA Enzym Eukaryota FAM FRET Genom Genotyp GMO HLA Chelát Chromozom Imunita Indel Inzerce ISSR-PCR LCN LIF LNA Lokus MGB MSP µTAS Nukleotid PCR Protilátka
ligací podmíněná amplifikace délkového polymorfismu (Amplified fragment length polymorphism) Americká asociace krevních bank (American Association of Blood Banks) namnožený úsek DNA, většinou pomocí PCR výjimka z mendelovské genetiky, kdy se neurologická nemoc způsobená zvýšeným počtem tripletů zhoršuje (nebo nastupuje dříve) v dalších generacích látka pro daný organismus cizorodá, vzbuzující imunitní odpověď PCR amplifikace podmíněná přítomností konkrétní alely/polymorfismu (Amplification refractory mutation system) páry bazí (basepairs) hovězí sérový albumin (Bovine serum albumine) odstranění nukleotidu z DNA řetězce narušení nejčastější biologické formy molekuly: zde rozpletení dvoušroubovice DNA na jednořetězce (vratná denaturace nukleových kyselin) pětiuhlíkový cukr, přítomný v DNA deoxyribonukleová kyselina, dvoušroubovicové vlákno - molekulární základ dědičnosti deoxynukleotid trifosfáty Evropský odborný panel pro DNA profilování (The European DNA Profiling Group) ethylendiamintetraacetát, chelatační činidlo – vychytává dvoumocné kationty Evropská imunogenetioká federace (European Federation for Immunogenetics) test na přítomnost antigenu, provedený pomocí specifických protilátek a enzymatické vizualizace výsledku (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) biologický katalyzátor nadříše organismů složených z buněk, obsahujících jádro a mitochondrie; jádro prochází mitózou, popřípadě meiózou 5-karboxyfluorescein fluorescenční rezonanční přenos energie (Fluorescence resonance energy transfer) kompletní soubor genů jedince, lokalizovaných v jádře soubor konkrétních forem genů jednotlivce, genetická konstituce organismu geneticky modifikované organismy; organismy kromě člověka, jejichž dědičný materiál byl změněn genetickou modifikací lidské tkáňové antigeny (Human leukocyte antigens) organická látka, vytvářející cyklický komplex s kovy vláknitá struktura v eukaryotickém jádře, sestávající z chromatinu a nesoucí lineárně seřazenou genetickou informaci obranyschopnost organismu na buněčné a subbuněčné úrovni založená na rozlišení tělu vlastního od cizího inzerce a/nebo delece vložení, vsazení, vsunutí nukleotidu do DNA řetězce PCR amplifikace úseků mezi repeticemi (Intersequence specific PCR) metody pracujícím s limitně malým množstvím templátu (Low copy number) Laserem indukovaná fluorescence uzamčená nukleová kyselina (Locked nucleic acid) umístění genu na chromozomu interkalátor menšího žlábku dvoušroubovice DNA (Minor Groove Binder) na methylaci templátu citlivá PCR (Methylation Specific PCR) analytická laboratoř na čipu (micro Total Analysis System) monomerní jednotka DNA a RNA, skládá se z purinové nebo pyrimidinové báze, pětiuhlíkového cukru a zbytku kyseliny fosforečné Polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction), molekulární kopírovací stroj pro kratší úseky DNA imunoglobulinový působek cílené imunity
Purin Pyrimidin RACE RAPD Rep Replikace RFLP Ribóza RFLP RNA SBT Sérum SSCP SNP STR Substituce TAIL PCR TWGDAM UNG VNTR
heterocyklická dusíkatá sloučenina, zásaditá část nukleotidu; adenin, guanin (výskyt v DNA i v RNA) heterocyklická dusíkatá sloučenina, zásaditá část nukleotidu; cytozin (výskyt v DNA i v RNA), uracil (v RNA), tymin (v DNA) rychlá amplifikace začátku a konce cDNA (Rapid amplification of cDNA ends) amplifikace polymorfní DNA s neznámými místy vazby primerů (Random amplification of polymorphic DNA, Random amplified polymorphic DNA) repetice (Repetitive sequences) vytváření DNA kopií in vivo, před nebo v průběhu dělení buňky polymorfismus v délce restrikčních fragmentů (Restriction fragment length polymorphism) pětiuhlíkový cukr, přítomný v RNA (riflip) polymorfismus délky restrikčních fragmentů (Restriction Fragment Length Polymorphism) ribonukleová kyselina, většinou jednořetězcové vlákno; polynukleotid s cukrem ribózou a nukleotidem uracilem na rozdíl od deoxyribózy a tyminu v DNA; meziprodukt vyjádření dědičné informace genotypizace sekvencováním (Sequencing based typing) nesrážlivá část krevní plazmy konformační polymorfismus jednořetězců (Single strand conformational polymorphism) bodový polymorfismus/mutace (Single nucleotide polymorphism) krátké tandemové repetice (Short Tandem Repeats), mikrosatelity náhrada jednoho nukleotidu jiným teplotně asymetrická prokládaná PCR (Thermal asymmetric interlaced PCR) Technical Working Group on DNA Analysis Methods uracyl-N glykosyláza Variabilní počet tandemových repeticí (Variable Number of Tandem Repeats)
2. Úvod Polymerázová řetězová reakce (Polymerase chain reaction, PCR) je způsob, jak in vitro, enzymaticky, bez účasti živého organismu (kromě lidského činitele) namnožit deoxyribonukleovou kyselinu. PCR je molekulární kopírka pro DNA, která je nedílnou součástí rutiny molekulárního biologa. Dá se říct, že přístroj pro PCR - termocyklér - sám o sobě již definuje základní molekulárně biologickou laboratoř, ať už je součástí mikrobiologického, onkologického, imunologického, kriminalistického nebo akademického pracoviště. Jaká je tedy definice PCR? Můžeme parafrázovat definici editora časopisu Science Dr. D. Koshlanda Jr. z roku 1989, kdy byla termostabilní polymeráza jmenována molekulou roku: „Nechť substrátem cílovou sekvencí, templátem - pro PCR je gen nebo úsek DNA, část celkové DNA vložené do reakce. Za několik (desítek) minut může být tato cílová sekvence milionkrát namnožená následujícím postupem: Napřed jsou komplementární řetězce dvoušroubovicové DNA rozpleteny teplem (denaturovány). Dva krátké kousky syntetické DNA, každý z nich komplementární ke specifické sekvenci na jednom konci cílové sekvence, slouží jako primery, startéry PCR. Každý z primerů se váže k cílové sekvenci dle Watson-Crickova pravidla o párování bází (vždy adenin proti thyminu, cytozin proti guaninu). Polymeráza začne z každého ukotveného primeru syntetizovat nový, dceřinný řetězec podle vzoru cílové sekvence. Za minutu je vytvořena přesná replika cílové sekvence a tím je první cyklus PCR u konce. V dalších cyklech je opětovně rozplétána dvoušroubovice cílové sekvence i jejích replik, primery se znovu komplementárně váží a polymeráza vytváří další repliky cílové sekvence. Po dokončení 30 dalších cyklů je ve směsi DNA fragmentů ve zkumavce obrovský nadbytek cílové sekvence a tato amplifikovaná genetická informace je připravena pro další analýzu.“ Z této definice vyplývá geometrický průběh amplifikace cílové sekvence (počet kopií = 2počet cyklů) za předpokladu 100% účinnosti PCR. Takovéto účinnosti se můžeme za ideálních podmínek přiblížit jen v prvních dvaceti, pětadvaceti cyklech PCR. Pak nastává fáze kvazi-lineární a nakonec fáze plató, kdy už množství amplikonu nepřibývá. Z uvedeného však na první pohled není zřejmé, že z obou stran vymezená cílová sekvence je poprvé syntetizovaná až ve třetím cyklu PCR (Obr. 1). V prvním a druhém cyklu nejméně jeden řetězec končí na nedefinovaném místě, kde se polymeráza odpojí od templátu. To bývá před dosažením konce templátu a odpovídá to jednomu z parametrů polymerázy – její procesivitě. Obrázek 1: Schéma prvních tří cyklů množení cílové sekvence pomocí PCR První cyklus Dvoušroubovicový DNA templát
Denaturace, 94°C
Hybridizace primerů, 65°C
Extenze primerů, 72°C (konec prvního cyklu)
6
Konec druhého cyklu
Dvoušroubovice z templátového řetězce a řetězce definovaného z jedné strany
Dvoušroubovice z řetězce definovaného z jedné strany a řetězce definovaného z obou stran
Konec třetího cyklu Dvoušroubovice z templátového řetězce a řetězce definovaného z jedné strany
Dvoušroubovice z řetězce definovaného z jedné strany a řetězce definovaného z obou stran
Dvoušroubovice definovaná z obou stran
Výše uvedené schéma zjednodušuje; pro představu složitosti systému a počtů složek v jediné stomikrolitrové PCR zkumavce uvádím příklad amplifikace 500 bp fragmentu fága lambda (Tab. 1). Tabulka 1: Popisná statistika počátku a konce PCR Před PCR Váha Σ molekul 7 1,9*10 Templát (50 kbp) 1 ng 7 Cílová sekvence (500 bp) 10 pg 1,8*10 14 Primery (21-mery) 1,4 µg 1,2*10 16 dNTPs 39 µg 4,8*10 2+ 16 Mg 3,6 µg 9,0*10 10 Taq polymeráza 12,5 ng 8,0*10
Po PCR Váha Σ molekul 7 1,8*10 1 ng 12 1,8*10 1 µg 14 1,3 µg 1,2*10 16 37 µg 4,6*10 16 3,6 µg 9,0*10 10 12,5 ng 8,0*10
Upraveno podle Applied Biosystems, USA. Pokud se podíváme na změnu množství reagencií v průběhu PCR, je zřejmé, že příčinou plató fáze nemohou být spotřebované reagencie, přestože se to někdy nepřesně uvádí. Příčinou plató je renaturace amplikonů a templátu (1) spolu s nespecifickou vazbou polymerázy k dvoušroubovicové DNA (2). Pokud chceme PCR ukončit a vyhodnotit před plató fází, je řešením vysoce citlivá, laserem indukovaná fluorescence (LIF) v zobrazovacím kroku. Citlivost a specifičnost ustanovila PCR jako preferovaný způsob namnožení nukleové kyseliny, jejíž sekvenci dopodrobna známe (3), jejíž sekvenci známe jen útržkovitě (4) anebo o jejíž sekvenci se můžeme jen dohadovat (5;6) (Obr.2).
7
Obrázek 2: Varianty PCR
Rozepsání akronymů: AFLP Amplified fragment length polymorphism, ARMS Amplification refractory mutation system, ISSR Intersequence specific PCR, MSP - Methylation Specific PCR, RACE Rapid amplification of cDNA ends, Rep Repetitive sequences, RAPD Random amplification of polymorphic DNA, RFLP Restriction fragment length polymorphism, SSCP Single strand conformational polymorphism, STR Short tandem repeats, TAIL Thermal asymmetric interlaced PCR. Alternativní amplifikační technologie jako je Cycling probe technology, Helicase dependent amplification, Transcription based amplification system, Ramification amplification, Nucleic acid sequence based amplification (Self-sustained sequence replication), Q beta replication, Ligase chain reaction, Strand displacement amplification a Boomerang DNA amplification (7) se ve srovnání s PCR prosadily jen v úzkých vědeckých komunitách. Celkový přehled PCR modifikací a fines by vydal na knihu. Ostatně, mnoho takových knih již bylo vydáno (viz http://www.amazon.com/s/ref=nb_ss_b/002-4114556-2744068?url=searchalias%3Dstripbooks&field-keywords=pcr&Go.x=0&Go.y=0&Go=Go), proto se v další části této práce zaměřím jen na ty části teorie PCR, které se přímo dotýkají mé osobní zkušenosti s PCR. Předkládaná habilitační práce je mým holdem PCR - švýcarskému noži každého laboratorního pracovníka, který se zaobírá nukleovou kyselinou. Práce sestává ze souboru devíti původních časopiseckých prací s důležitým metodickým aspektem (kde jsem prvním nebo druhým autorem) a z nových, zatím nepublikovaných vědeckých poznatků ve formě dvou případových studií. Všechny práce se zabývají využitím polymerázové řetězové reakce ke genotypizaci lidské DNA, a proto jsou zarámovány výběrovým přehledem o PCR.
8
3. Rozsah použití PCR v lidské genetice Polymerázová řetězová reakce může být umístěna na rozdílných místech časové osy analýzy nukleové kyseliny. Může se použít jako první, amplifikační krok před důkladnější analýzou nukleotidové sekvence. Pak je to jen potlačení informačního šumu z nadbytku sekvencí, které nás nezajímají; prvotní „zaostření“ na cílovou sekvenci, kterou dále analyzujeme sekvencováním (SBT, Sequencing based typing), hybridizací se sondami (SSO, Sequence specific oligonucleotides) nebo reakcí se sekvenčněspecifickými enzymy (PCR-RFLP, Restriction fragment legth polymorphism) (7). PCR může být použita i jako druhý krok analýzy nukleové kyseliny – například tehdy, pokud je objektem našeho zájmu exprese genové informace. RNA si reverzní transkripcí nejprve přepíšeme do komplementární DNA, a tu pak teprve amplifikujeme. Jinou možností je předřazení štěpícího, popřípadě ligačního krok (AFLP, Amplified fragment length polymorphism; Ligation-mediated PCR) (8). PCR může být také použita jako jediný specifický krok analýzy DNA, jako extrakce informace, zakódované v řetězci DNA. Články 1, 2 Pokud se na PCR podíváme z pohledu specializace uživatele, můžeme aplikace PCR rozdělit na profilovací, detekční, geno-inženýrské a kvantifikační.
3.1. DNA profilování, kontrola původu, určení rodičovství a příbuznosti DNA profilování je forenzní technika identifikace osob (zvířat, rostlin, hub) porovnáním referenční DNA s DNA testovaného vzorku (z místa činu). Dříve byla tato metoda zvaná genetické otisky prstů, protože konečný krok analýzy – elektroforéza - generoval charakteristické (individuálně specifické) proužkové vzory, vzdáleně podobné papilárním liniím na prstech. Pro DNA profilování se využívají délkové polymorfismy (Short tandem repeats), dané rozdílným počtem opakování krátkého sekvenčního motivu mezi jedinci. Metoda je vhodná nejen pro kriminalistiku a určování otcovství (a to s účinností i přes uběhlá staletí (9)) ale i pro zjišťování evoluční příbuznosti (sestrojování fylogenetických stromů) a pro kontrolu původu potravinářských surovin (identifikace pytláckého úlovku, který skončil na jídelním lístku restaurace). Pro detekci geneticky modifikovaných organismů se namísto mikrosatelitů využívají sekvence vnášeného genu anebo pomocné sekvence (např. promotory) (10).
3.2. Detekce dědičných chorob a specifických polymorfismů Pokud 3´ konec primeru navrhneme tak, aby hybridizoval s templátovou DNA přesně v místě bodové mutace (Single nucleotide polymorphism, SNP), můžeme ve dvou PCR reakcích, pomocí dvou rozdílných primerů v páru s jedním společným primerem, rozlišit dvě varianty genu. Metoda je známá pod názvy PCR-SSP (PCR Sequence-specific primers), ASP (Allele specific primers), ARMS (Amplification refractory mutation system) a je použitelná k přímé diagnostice dědičných chorob nebo k nepřímé diagnostice pomocí markerů, asociovaných s genem – původcem onemocnění. Při sledování genů (alel) asociovaných s infekčními a autoimunními nemocemi celému lidskému genomu vévodí HLA systém (11), na kterém byly pro jeho důležitost při transplantacích prvotně testovány mnohé genotypizační (a bioinformatické) strategie. Články 3, 4, 5, 6 V současné době se těžiště vývoje genotypizačních metod posunulo směrem k analýze binármích bodových polymorfismů (SNP) a jejich asociací (12) pro komerčně nejperspektivnější skupiny genů (jako jsou transportéry a metabolizující enzymy v rámci farmakogenetiky (13;14) anebo nutriční receptory pro aktivizaci proliferace specifických genů v rámci nutrigenomiky http://www.nugo.org/everyone, (15)).
3.3. Detekce virové, bakteriální a houbové infekce Metody detekce mikrobů, založené na specifické vazbě protilátky, generované imunitním systémem člověka, k umělému antigenu, spojenému s vizualizační kaskádou (např. ELISA), mohou být vysoce citlivé a vysoce specifické. Mají však jednu nevýhodu – časovou prodlevu, než se protilátky vytvoří a objeví v krevním oběhu. PCR, popřípadě Reverse Transcription PCR u RNA-virů, toto období nejistoty může zkrátit a tak vést k rychlejšímu nasazení účinné léčby a epidemiologických opatření (16). Určitým diagnostickým omezením je pozitivní PCR detekce usmrcených mikroorganismů, které lze překonat použitím reverzní transkripce a detekováním exprese. PCR spolu s biosenzory je také nezastupitelná v rychlé detekci bioteroristických agens (17).
9
3.4. Genetické inženýrství: klonování genů a cílená mutageneze Při klonování genů (na rozdíl od klonování celých organismů) dochází k namnožení jednotlivého genu pomocí klonovacího vektoru (nejčastěji plazmidu). Vektorové klonování může být transgenozní (rekombinantní) technikou, pokud je gen před vložením do vektoru izolován z jednoho organismu a vložen do druhého organismu (který se tímto stává geneticky modifikovaným). Vytvářet identické kopie (klonovat) geny lze samozřejmě i pomocí PCR. Klonování pomocí plazmidu má však výhody – při produkci většího množství klonů je levnější než PCR a zároveň se dá jednoduše vyselektovat věrný, pravý klon. U PCR se pravost klonu (amplikonu) verifikuje zase jen genotypizační technikou. Přesto se ani vektorové klonování bez PCR úplně neobejde: například TA klonování (18) je na PCR přímo postavené a i v jiných případech vložení do vektoru následuje po PCR. Cílená mutageneze je provádění změn v nukleotidové sekvenci DNA, například za účelem sledování vztahů struktura-funkce u genem kódovaných proteinů. Mutageneze pomocí PCR se provádí: • inkorporací nekomplementárního nukleotidu na 5´ konci primeru • vyštěpením modifikovaných nukleotidů (19) • randomizovaně - použitím defektní polymerázy • cíleněji - pomocí Assembly PCR (20).
3.5. Kvantifikace nukleových kyselin PCR je vhodnou metodou i tehdy, pokud nám nestačí zjistit pouhou přítomnost/nepřítomnost určité nukleotidové sekvence, ale chceme znát i její množství. Může se jednat o zjišťování počtu přítomných genů (u genové amplifikace při některých nádorech), zjišťování počtu chromozomů (detekce aneuploidie) nebo zjišťování počtu genomů (kvantifikace vstupního templátu před DNA profilováním). Pokud před kvantitativní PCR zařadíme reverzní transkripci (a použijeme dostatečné kontroly), můžeme kvantifikovat i genovou expresi. Přestože semi-kvantifikovat lze i pomocí kompetitivní PCR a agarózové elektroforézy, v současné době vévodí kvantitativní PCR (qPCR) uzavřené, homogenní systémy. Zkumavka se po prvotním namíchání všech reagencií již neotevírá a v reálném čase, za použití laserem indukované fluorescence, se měří množství templátu. Srovnáním průběhu množení amplikonu testovaného vzorku a průběhu množení vnitřní nebo vnější kontroly můžeme extrapolovat k původnímu množství templátu před amplifikací. U všech qPCR platí zásada: systém můžeme považovat za optimalizovaný, pokud je kalibrační křivka diluční řady standardu lineární (r2 ≥ 0,98; směrnice ≤ -3,323), amplifikace dosahuje vysoké účinnosti (85 až 110 %) a rozptyl výsledků opakovaných vyšetření je nízký. qPCR metody se liší způsobem detekce signálu množení amplikonu, a tím i designem primerů (popřípadě sond). Nejjednodušším případem vizualizace qPCR v reálném čase jsou fluorescenční interkalační činidla, jako je SYBR Green I, který v průběhu PCR vydává signál přímo úměrný narůstajícímu množství dvoušroubovicové DNA. Artefakty PCR - primerové dimery a multimery jsou také dvoušroubovicemi, vydávajícími signál, takže po PCR je nutno amplikon verifikovat analýzou křivky tání (Obr.3) nebo na elektroforéze.
10
Obrázek 3: Disociační křivky po qPCR se SYBR Green I
Navíc není vazba SYBR Green I k DNA úplně náhodná (21),1 a proto jsou elegantnější takové kvantifikační metody, kde je generování signálu přímo svázáno se specifickou vazbou k cílové sekvenci templátu. Existuje několik komerčně dodávaných systémů s flouroforem umístěným na sondě (TaqMan, Eclipse, Molekulární majáček) nebo na jednom z primerů (Amplifluor, Scorpions, LUX, BD Qzyme, Tab. 2) (22). V principu se k vyslání signálu využívá oddálení fluorescenčního reportéru od zhášeče anebo naopak přiblížení akceptorové sondy k sondě dárcovské při fluorescenčním rezonančním přenosu energie (FRET).
1 Na rozdíl od interkalátorů nové generace (LCGreen, Syto 9), které se váží pravidelně, nezávisle na sekvenci a nepřeskakují na přilehlá místa nukleové kyseliny v průběhu denaturace. Tatonová generace interkalátorů je vhodná i pro genotypizaci analýzou disociační křivky.
11
Tabulka 2: Srovnání qPCR systémů
Název
Umístění fluoroforu
SYBR Green I
amplikon
TaqMan
sonda
Molekulární majáček sonda Hybridizační dvojice
sondy
Eclipse
sonda
Amplifluor
primer
Scorpions
primer
LUX
primer
BD Qzyme
primer
Plexor
primer
Princip tvorby signálu Volný SYBR Green I nezáří, zatímco po vmezeření do dvoušroubovicové DNA vydává fluorescenční signál. 5´→ 3´ exonukleázová funkce Taq polymerázy odštěpí z hydrolyzační sondy nukleotid se zhášečem a tím se uvolní signál reportérové molekuly, umístěné na druhé straně sondy. Vlásenková sonda se vazbou na komplementární sekvenci uvnitř amplikonu natáhne, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče fluorescence. Dárcovská fluorescenční sonda se uvnitř amplikonu naváže poblíž akceptorové sondy, a tím dojde k fluorescenční rezonanci. Vlásenková sonda se vazbou na komplementární sekvenci uvnitř amplikonu natáhne, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče fluorescence; vazba k cílové sekvenci je posílena přítomností ligandu menšího žlábku dvoušroubovice (Minor Groove Binder), což umožňuje zkrácení sondy při zachování specifičnosti. 5´ konec jednoho ze specifických primerů je prodloužen o univerzální přívěsek (tag, tail, nastavení), který má shodnou sekvenci jako vlásenkový oligonukleotid Uniprimer s fluoroforem a zhášečem; v průběhu amplifikace se Uniprimer natáhne, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče. Jeden z primerů má na 5´ konci vlásenkové nastavení s reportérem a zhášečem; v průběhu amplifikace se vlásenka rozplete a její 5´ konec se naváže uvnitř cílové sekvence, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče. Na konci specifického primeru (před nastavením) je PCR blok (uvolňovač polymerázy z templátu). Jeden z primerů je ve formě vlásenky, s reportérem umístěným uprostřed. Jako zhášeč funguje sekundární struktura vlásenky, kdy je guanin přiblížen reportéru; v průběhu amplifikace se vlásenka rozplete, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče. Jeden z primerů má na 5´ konci zymogenový ocásek (enzymový prekurzor katalytické DNázové DNA), jehož konce jsou komplementární k sondě s reportérem a zhášečem. V průběhu amplifikace zymogen štěpí sondu, a tím se dostane reportér z vlivu zhášeče. Inkorporace Dabcyl-iso-dGTP do amplikonu zhasí fluorescenci reportéru na primeru s iso-dC nukleotidem.
12
4. Omezení PCR Polymerázová řetězová reakce je biologický systém, což s sebou nese určitá omezení a možnosti chyb. Vždy musíme počítat s chybovostí inkorporace nukleotidu, s omezením délky amplifikace, omezením kvalitou a množstvím amplikonu, s možností kontaminace a s nespecifickou hybridizací primeru.
4.1. Chybovost polymerázy Nejčastěji používaná termostabilní polymeráza (Taq, z baktérie Thermus aquaticus) nemá korekturskou funkci (3' → 5' exonukleázovou aktivitu). To nemusí být na škodu (je to principem metody PCRSSP/ARMS), ale zároveň to vede k vysoké chybovosti (až 2 báze z 10000), protože nativní (nerekombinantní) Taq polymeráza po sobě nemůže opravit špatně (nekomplementárně) vložený nukleotid. Jiné termostabilní polymerázy (např.: Thermococcus kodakaraensis: polymeráza KOD1; Thermococcus litoralis: Vent, Pyrococcus furiosus: Pfu, Pyrococcus woesii: Pwo) korekturskou funkci mají a dají se použít v aplikacích, kde je vitální věrnost předloze při amplifikaci (například sekvencování). Chyby se dají i enzymaticky opravit (reparačními enzymy MutH, MutL a MutS (23)).
4.2. Délka cílové sekvence Klasická PCR (se standardní Taq polymerázou) může amplifikovat cílové sekvence do délky 2 kb. Pak se amplifikace stává neúčinnou, protože se polymeráza odpojuje od templátu před dosažením konce cílové sekvence. Ostatně, i v průběhu in vivo replikace se chromozomy duplikují z mnoha míst současně. Amplifikace 50 kb sekvence pomocí PCR je možná: vyžaduje však kombinaci dvou polymeráz (polymeráza Taq a polymeráza s korekturskou funkcí, v poměru 200:1) a graduální prodlužování doby extenze. Efektivní procesivitu polymerázy také zvyšují proteiny, které udržují DNA v jednořetězcové formě (SSB (24), recA (25); mohou být i součástí rekombinantních polymeráz) a reparační enzymy (Reparase, Sigma-Aldrich).
4.3. Počáteční množství a kvalita templátu Přestože je teoreticky možné spuštění PCR z jediné molekuly cílové sekvence (což je mnohem menší množství než DNA z jediné buňky (26;27)), dostáváme se zde ke stochastickým limitům PCR, kdy úspěšnost amplifikace následuje Poisonnovu distribuci2 (28) a ke spolehlivému výsledku je potřeba vyšetření zopakovat (29;30). Metody pracující s extrémně malým množstvím templátu (LCN, Low copy number) využívají vyšší počet cyklů PCR a detekci pomocí laserem indukované fluorescence. Jejich citlivost detekce se dá ještě navýšit předřazením amplifikace celého genomu před samotnou PCR (31-35). Z těchto Whole genome amplification metod dává nejrobustnější výsledky technika balancované PCR (36), komerčně dodávaná firmou Sigma-Aldrich pod názvem GenomePlex. Kvalita templátové DNA je rozsah, v jakém je DNA chemicky čistá, nepoškozená DNázami a fyzikálně chemickými vlivy. Zatímco existují postupy na odstranění ko-extrahovaných PCR inhibitorů v templátové DNA, s chemickými modifikacemi a fragmentací DNA se lze vypořádat jen omezeně. Článek 6
4.4. Kontaminace Kontaminace obecně znamená znečištění prostředí škodlivými látkami, zamoření. V PCR má význam užší – pod kontaminací rozumíme vstup neautorizované cílové sekvence do PCR reakce. Zde se projeví citlivost PCR jako dvousečná zbraň - amplikon předchozí PCR je největším nebezpečím.
2
Pravděpodobnost, že se cílová DNA molekula nachází ve zkumavce, je popsána vztahem:
e −m m n P(n ) = , kde P(n) je pravděpodobnost, že v alikvotu je n molekul cílové sekvence, m je n! průměrný počet molekul cílové sekvence ve vzorku, e je konstanta 2,718. Pokud je průměrně jedna molekula cílové sekvence na alikvot, tak je pravděpodobnost 37 %, že v našem testu se cílová molekula nenachází.
13
Veškeré odborné validace laboratoře (které jsou součástí ISO 17025 akreditací) pro použití PCR (např. imunogenetická European Federation for Immunogenetics nebo forenzní Technical Working Group on DNA Analysis Methods) (37) vyžadují dodržování striktního antikontaminačního režimu pro: • místnosti – pre-PCR přetlaková místnost s vyhrazenou sadou pomůcek, PCR/post-PCR podtlaková místnost s vyhrazenou sadou pomůcek; dekontaminační místnost; pravidelná eliminace kontaminace (UV+(iso)psoralen, UNG (38), chloristan, vyhrazený autokláv); kontrola tvorby antistatického náboje, individuální klimatizace. • plastový materiál – bez DNáz, bez DNA, jednorázový • chemikálie – v kvalitě pro molekulární biologii, manipulace bez kontaminace v laminárním boxu • roztoky – alikvotování, manipulace bez kontaminace v laminárním boxu, použití špiček s filtrem nebo pístem, otevírání zkumavek až po krátkém stočení na centrifuze • přístroje – se zábranou proti tvorbě aerosolu • personál – častá výměna jednorázových rukavic; jednosměrný pohyb mezi místnostmi (prePCR → post-PCR → dekontaminace); při práci s limitním množstvím lidské DNA je nutné zahalení laboratorního pracovníka od hlavy až k patě • vzorky – fyzikální bariéry proti křížové kontaminaci, několik druhů negativních kontrol (39). Pro paleogenetické zkoumání jsou požadavky ještě přísnější (40-42). Přesto se i v neprecizněji vedených laboratořích kontaminační události stávají – zdroj kontaminace je však rychle odhalen a eliminován (43). Článek 8 Pro eliminaci kontaminace je nejúčelnějším postupem čištění pracovních povrchů a náčiní 10% chloristanem (Savo) anebo 5% kyselinou fosforečnou v roztoku detergentu. Sofistikovaným přístupem k identifikaci kontaminace je označení každé (kontaminující) molekuly před započetím PCR (44).
4.5. Nespecifická vazba primerů Spuštění polymerace po vazbě primerů má v sobě prvek náhody a 100% specificita je nedosažitelná. V laboratorních podmínkách je cílem, aby nespecifická vazba primerů nezhoršila analýzu amplikonu v následných krocích: aby se na elektroforetickém gelu neobjevily nespecifické proužky (popřípadě nespecifické píky na fragmentačním elektroforeogramu), popřípadě aby signál jednotlivých nukleotidů při sekvencování nebyl potláčen šumem. V PCR je obrovský nadbytek primerů. Pokud nejsou plně vysyceny vazbou na templát, může jejich částečná komplementarita na 3´ konci vést k tvorbě primerových dimerů a oligomerů. Specifičnost reakce můžeme modulovat složením PCR směsi, návrhem primerů a teplotními podmínkami amplifikace (viz Faktory úspěšnosti PCR). Nezamýšlenou aktivitu polymerázy, schopnou prodlužovat nespecificky navázané primery při pokojové teplotě (ještě v průběhu míchání reakční směsi), můžeme eliminovat horkým startem. Při horkém startu je některá z nezbytných složek PCR (většinou polymeráza nebo hořčík) sekvestrována až do dosažení denaturační teploty prvního cyklu PCR. Sekvestrace je dosaženo: • vazbou protilátky, aptameru nebo termolabilního inhibitoru (anhydridu kyseliny dikarboxylové) do aktivního místa polymerázy, • uměle vytvořenými disulfidickými můstky v rekombinantní polymeráze (45), • zkrácením polymerázy z N-konce (45), • nespecifickou vazbou polymerázy na krátké dvoušroubovicové DNA (46), • přidáním helikázy, která separuje řetězce v nově vznikající dvoušroubovici, dokud není sama tepelně inaktivována (47), • zalitím některých složek PCR do parafínové kuličky (48), • tepelně uvolňovaným hořčíkem, vázaným ve šťavelanu hořečnatém (49). Další modifikace pro navýšení specificity a citlivosti, Uhnízděná PCR (Nested PCR), se používá jako „dvojí síto“, kdy vnitřní část amplikonu prvotní PCR (s případnými nespecificky namnoženými sekvencemi) je specificky amplifikována pomocí druhé PCR s novou dvojicí primerů. Manipulace s otevřenou zkumavkou po prvotní PCR je však náchylná ke kontaminaci.
14
5. Faktory úspěšnosti PCR reakce – prvočinitelé Úspěch PCR je jen podmíněný. Do správné PCR praxe patří: • • • • •
Alikvotování reagencií, aby se ohraničil dopad případné kontaminace a zamezilo opětovnému zamražování/rozmražování reagencií. Ustálené pořadí pipetování, kdy se hořečnaté kationty mají setkat s polymerázou dříve, než případné inhibitory z templátu. Tvorba PCR koktejlů (premixů) snižující počet pipetovacích kroků a tím snižující možnost chyby. Monitorování kvality všech PCR reagencií (včetně vody). Častá výměna rukavic (které jsou bez pudru), snižující riziko kontaminace.
Na nejdůležitější parametry PCR – specifičnost a citlivost – mají vliv (kromě vlastností templátu, reakční směsi a laboratorního pracovníka) i nechemické faktory. Proto jsou zde uvedeny spolu s chemickými parametry.
5.1. Primery Primery jsou cíleně uvedeny na prvním místě prvočinitelů PCR. Důležitost designu oligonukleotidů je v molekulárně biologických aplikacích obecná – špatný design vede k nízké spolehlivosti a nízké reprodukovatelnosti i u DNA mikromatic (50). U primerů sledujeme tyto základní parametry (51): • Teplota tání celého primeru a z ní odvozená teplota hybridizace o Hrubý odhad lze provést podle vzorce Tm= 2AT + 4GC. o Přesnější odhad Tm je vypočitatelný dle termodynamických parametrů (52-56). o V průběhu PCR dochází i k nekomplementární vazbě primerů (síla vazby pro jednotlivé nukleotidy klesá ve směru: GC > AT > GG > GT = GA > TT = AA > TC > AC > CC (57;58)). Dokonce lze neshodu v rámci PCR-SSP/ARMS využít cíleně, pokud přidáním druhého neshodného nukleotidu více destabilizujeme nekomplementární primer (59-61) (Obr. 4). Obrázek 4: Cílená neshoda v PCR-SSP/ARMS
• •
Teplota tání 3´ konce primeru, dolaďující specifičnost vazby Délka
15
21 nukleotidů (ve speciálních případech minimum 8 nukleotidů nebo maximum 40 nukleotidů) Podíl guaninů a cytozinů o 40-60 %; mimo tento rozsah je nutné použít PCR enhancer Tendence k tvorbě dimerů a vlásenek o Obecně je lépe se dimerům a vlásenkám vyhnout. Ve výjimečných případech se dají využít ve prospěch PCR. Vlásenka na 5´ konci primeru může být regulátorem fluorescence anebo neproduktivní dimer funguje jako záchytné „depo“ (Obr. 5) (62), zvyšující specificitu PCR. o
• •
Obrázek 5: Srovnání primerových dimerů
Primerové depo
Amplifikovatelný primerový dimer
5´gACACCTTCTgCTTCCACCT 3´ 3´CCTgCTgTggAAgACgAAgg 5´
5´gACACCTTCTgCTTCCACCT 3´ 3´AAggTggACCTTgAAggTggA 5´
Přestože lze navrhnout primerové páry pro základní PCR pouhým započtením 4GC+2AT pravidla pro Tm a dosáhnout 93% úspěšnosti amplifikace (60), tak při PCR, která má vyhraněné podmínky na vstupu nebo výstupu, se neobejdeme bez specializovaného software (Tab. 3). Pro design multiplexní PCR reakce je náročnost výpočtů taková, že se musejí využívat postupy počítačové vědy (63-68), pokud se nepoužije nějaký nivelizující trik (viz Koncept univerzality).
16
Tabulka 3: Software pro design a kontrolu primerů
Název Účel PDA Primer Nejjednodušší PCR design. Design Assistant Primer3 Zlatý standard pro základní PCR. FastPCR Pokročilý PCR design. VectorNTI
GenoFrag PROBEmer SSP Manager Tm utility CODEHOP AutoDimer MixPCR
Gene2Oligo
SNPbox e-PCR MethPrimer
Webový odkaz http://dbb.nhri.org.tw/primer/
http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi www.biocenter.helsinki.fi/bi/progra ms/fastpcr.htm Pokročilý PCR design http://www.invitrogen.com/conten v rámci bioinformatického t.cfm?pageid=10373 balíku, dostupného po registraci k nekomerčním účelům. LongPCR design. http://genouest.noip.org/Services/GenoFrag/ PCR SSP/ARMS design. http://probemer.cs.loyola.edu PCR-SSP/ARMS design pro
[email protected] lidské tkáňové antigeny. Kontrola teploty tání http://www.idahotec.com/downloa ds_up/Tmutility_form.htm amplikonu. Design degenerovaných http://bioinformatics.weizmann.ac.il /blocks/codehop.html primerů. Kontrola dimerizace a http://www.cstl.nist.gov/div831/str vlásenkování v PCR base/AutoDimerHomepage/AutoD imerProgramHomepage.htm multiplexu. Výběr maximálního http://www.dnabased.com/eng/ind multiplexu z primerových ex.html párů, prefabrikovaných programy FastPCR nebo AutoDimer. Pro syntézu dlouhých DNA http://berry.engin.umich.edu/gene2 pomocí Ligase chain oligo/#form reaction anebo Assembly PCR. Pro PCR-ARMS/SSP. http://www.SNPbox.org Pro kontrolu specificity www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/e-pcr v rámci genomu. Pro návrh primerů k detekci http://www.urogene.org/methprim er/ methylace.3
Ref. (69) (70)
(71)
(72) (73) (74)
(75) (76)
(77;78)
(79) (80;81) (82)
5.2. Hardware Všechny zavedené molekulárně genetické firmy na trhu dodávají cykléry a plasty v kvalitě dostatečné pro základní PCR. Ale opět platí: pokud chceme mířit k limitům PCR, je lépe pamatovat na následující: • Cyklér o Peltierovy pumpy třetí generace se stříbrnými jamkami mají dosahovat přesnosti ± 0,1 °C přes 96 jamek cykléru. Nižší přesnost může vést k nehomogenním výsledkům u citlivých aplikací. o Zahřívání a chlazení na karuselu rotujících zkumavek vzduchem může zrychlit cykly PCR, ale zbavíme se možnosti použít 12-tikanálovou pipetu při míchání PCR směsí. Nutnost specálního software pro design primerů k PCR detekci methylace lze obejít i použitím MS Wordu, pokud se sekvencí templátové DNA provedeme následující manipulaci: změň CG na CF, pak změň G na A, pak změň F na G.
3
17
Gradientový cyklér může usnadnit hledání teploty hybridizace, ale mnohdy vystačí použít Touchdown (viz Koncept univerzality). Mikrozkumavky o Je výhodnější zakoupit mikrozkumavky s certifikátem (bez DNA a DNáz), než autoklávovat nesterilní zkumavky. o Kvalitní mikrozkumavky z polypropylenu anebo polykarbonátu (s kontrolovanou tloušťkou mikrozkumavky i u dna) se rozsahem použitelnosti neliší (pokud máme odpovídající víčka nebo zavírací plátky). Větší rozdíl je mezi kvalitním (inertním) a nekvalitním plastem (s nabitými, antistatickými a hydrofobními místy nebo se zbytky kovů u barevných zkumavek). o Pro nižší přilnavost polymerázy ke stěnám mohou být mikrozkumavky potažené teflonem. o Skleněné kapiláry ve vzduchem chlazeném/ohřívaném cykléru vyžadují úpravu složení reakční směsi (přídavek BSA a MgCl2). Pipety o Kalibrovaná pipeta je přesná jen tehdy, pokud použijeme odpovídající špičky. o Je výhodnější zakoupit špičky s certifikátem (bez DNA a DNáz), než autoklávovat nebo ozařovat nesterilní špičky. Autokláv může být zdrojem kontaminace fragmentovanou DNA, zkumavky zkřehnou a ztratí své vlastnosti po iradiaci. o Low copy number aplikace vyžadují použití špiček s protikontaminační zábranou (filtr ze zesíťovaného polyethylenu s 16 µm póry nebo posuvný jednorázový píst). o
•
•
5.3. Polymeráza Jednotka polymerázy je definována jako množství enzymu, potřebné k převedení 10 nmol nukleozidů do produktu nerozpustného v kyselém prostředí za 30 minut při použití M13mp18 DNA jako templátu a při daných reakčních podmínkách. Je zřejmé, že taková definice jednotky je vzdálená použití polymerázy v reálných podmínkách a může sloužit pro titrování množství polymerázy jen orientačně; každá nová šarže polymerázy musí být otestována. U polymerázy můžeme sledovat: • fidelitu4 - věrnost originálu (1/104 ÷ 1/106) • přítomnost korekturské funkce (je vhodná u sekvencování nebo u Long PCR, kde má polymeráza s korekturskou funkcí minoritní podíl ve směsi polymeráz) • adenylaci, přidání beztemplátového adeninu na konec nascentního řetězce u polymeráz bez korekturské funkce • procesivitu – délku nakopírovaného úseku templátu na jedno navázání polymerázy; procesivita může být navýšena metodami genetického inženýrství (připojení domén proteinů jako je Sso7d (83), substitucí Asn → Ser543 (84)) • rychlost pohybu po templátu (60 nukleotidů za sekundu) • poločas rozpadu při 95 °C (40 min až 2 hodiny) • aktivitu při pokojové teplotě (zabudovaný horký start) • odolnost vůči inhibitorům (Tth je robustnější než Taq).
5.4. Pufr Molekulárně biologické firmy dodávají polymerázu i s optimalizovaným pufrem, ale se zachovanou možností titrovat hořečnaté kationty. Standardní pufr se skládá z těchto reagencií: • KCl o 50 mM • MgCl2 o 1,5 nebo 2,0 mM • dNTPs o 200 nmol každý Chybovost 1/10000 generuje pro Y cyklů a x párů bazí pravděpodobnost n nepřesných fragmentů = (Y!/((Y-n)!*n!))*(0.9999X)Y-n * (1-(0.9999) X)n; po 25 cyklech amplifikace 100 bp fragmentu je 22 % amplikonů s chybou. 4
18
o Citlivé aplikace (Multiplexní PCR) vyžadují nukleotidy nejvyšší kvality o Hliníkové soli nukleotidů jsou nejodolnější vůči zamražování/rozmražování • Želatina 0,01% (w/v) • TrisCl 10 mM, pH 8,3 až 8,8 (měřeno při pokojové teplotě) • Taq o 30 mU/µl o V izolovaném Taq proteinu mohou být zbytky DNA T. aquaticus a E.coli, což může interferovat s citlivou PCR analýzou bakteriální DNA. Složením pufru můžeme modulovat citlivost a specifičnost. Citlivost a výtěžek zvýšíme změnou koncentrací ve směru šipky: MgCl2 ↑, Taq ↑, primery ↑, dNTPs ↑, (také počet cyklů ↑, teplota hybridizace ↓). Naopak specificitu posílíme těmito změnami: MgCl2 ↓, Taq ↓, primery ↓, dNTPs ↓, (také počet cyklů ↓, teplota hybridizace ↑, optimalizace návrhu primerů, Nested PCR). Pokud standardní podmínky měníme, měli bychom sledovat vzájemně závislé složky (přidání nukleotidů vyžaduje současné přidání hořčíku, aby množství hořčíku dostupného pro vazbu do aktivního místa polymerázy zůstalo zachováno).
5.5. PCR program Na PCR programu můžeme měnit tyto parametry: • Počet cyklů o Pro agarózovou elektroforézu dostačuje 30 cyklů. o Pro laserem indukovanou fluorescenci dostačuje 28 cyklů i s redukovaným množstvím templátové DNA. o Pro reamplifikaci (Nested PCR) dostačuje 20 cyklů. o Pro zvýšení citlivosti můžeme použít až 50 cyklů, ale to už namnožíme i neodstranitelnou, všudypřítomnou kontaminující DNA. • Čas cyklu o U cyklérů vyhřívaných a chlazených vzduchem můžeme časy jednotlivých PCR kroků zkrátit na sekundy. o I v průběhu změny teploty z jednoho kroku na druhý se dějí polymerační procesy. Pokud přecházíme na novější a rychlejší cyklér, můžeme podmínky prvního cykléru simulovat zpomalením zahřívání a chlazení (změnou ramp time). • Denaturace o Před prvním cyklem PCR je vhodné templát denaturovat delší dobu (5 minut při 95 °C), aby se rozpletly všechny dvoušroubovice a uvolnily případné histony z DNA. o Pokud máme polymerázu se zabudovaným horkým startem, je prvotní denaturaci nutno prodloužit na 11 minut. o V jednotlivých PCR cyklech při použití Peltierova článku dostačuje zahřátí na 96 °C po dobu 10 sekund. o U některých programů se teplota denaturace v pozdějších cyklech snižuje na 90 °C. Je to snahou snížit „reaktivitu“ dlouhých fragmentů templátové DNA (jejichž renaturace je jednou z příčin nástupu plató). • Hybridizace o Teplota hybridizace má být o 5 °C vyšší než je teplota tání primeru, vypočtená na základě termodynamických parametrů. Termodynamické rovnice jsou jen modelem existují primery, jejichž predikovaná Tm se liší od skutečné o 4 °C. • Extenze o 72 °C nemusí být optimální pro jiné polymerázy než Taq; snížení na 65 °C neznatelně sníží výtěžek (což se využívá u dvoustupňové PCR) o U Long (range) PCR čas pro extenzi v pozdějších cyklech graduálně navyšujeme.
5.6. Templát Kvalitu DNA templátu ovlivníme izolačním postupem. Přestože lze provést PCR bez izolace DNA (například in situ na skleněném sklíčku (85), po lýze rostlinného vzorku ethylxanthogenátem draselným (86), po lýze krve DMSO, po krátkém povaření vzorku, přidáním bakteriální kolonie z párátkového stěru přímo do PCR směsi), pro robustní výsledky a v případech s potenciálně přítomnými PCR inhibitory musíme DNA zbavit peptidů, cukrů, tuků, RNA a minerálních látek. Čistota DNA je vitální
19
zvláště u profilujích metod (87). Izolačních metod je nepřeberné množství, přesahující rozsah této práce. Skládají se z některých z těchto procedur: • Chaotropní a detergentová lýza buněk (guanidin isothiokyanát, Chelex, cetyltrimethylamonium bromid, sodium dodecyl sulfát) • Enzymatické štěpení proteinů (proteináza K) • Organická extrakce proteinů (fenol-chloroform-isoamylalkohol) • Neorganická extrakce proteinů (vysolení) (88) • Kolonky o Iontoměničové o Triplexové (89) • Magnetické kuličky • Srážení alkoholem Kvalita templátu nezávisí jen na izolačním postupu. Za zmínku stojí složitost templátu (je nutný větší počet PCR cyklů pro větší nadbytek necílových sekvencí), oba extrémy podílu GC v cílové sekvenci (vyžadují rozdílné hybridizační teploty a rozdílné enhancery), fragmentace templátu (nelze namnožit úsek, který není mezi primery celistvý). Články 7, 8
5.7. Inhibitory Již Theophrastus Bombastus von Hohenheim, zvaný Paracelsus, tvrdil, že „Všechny sloučeniny jsou jedy. Neexistuje sloučenina, která by jedem nebyla. Rozdíl mezi lékem a jedem tvoří dávka“, takže není překvapením, že některé látky fungují jako PCR enhancery při nižších koncentracích a jako PCR inhibitory při vyšších koncentracích (90). Inhibitory mohou pocházet ze vzorku a jeho okolí (91-93), z izolačních, odběrových a pre-PCR reagencií (94-98); souhrnně viz Obr. 6.
20
Obrázek 6: Inhibitory PCR
S inhibitory se lze vypořádat následujícími způsoby: • naředěním templátové DNA • navýšením množství Taq polymerázy • změnou polymerázy Taq na odolnější Tth • promytím templátu NaOH (99) • re-extrakcí o flokulací s AlNH4(SO4)2(100) o selektivní precipitací pomocí DextranBlue (101) nebo isopropanolu (102), o centrifugační iontově výměnnou kolonkou Sephadex G-200 (103), Sepharose 2B, Disposaflex (104); lektinová kolonka o Thiopropyl Sepharose 6B kuličkami (105) o (fenol)chloroformem • promýváním templátu po zachycení v agaróze (106;107) • vysokou teplotou před PCR (108) • použitím enhancerů (v první řadě hovězího sérového albuminu).
5.8. Enhancery Enhancery, posilovače PCR, jsou látky, které zvyšují účinnost amplifikace. Liší se mechanismem působení:
21
•
Potlačení sekundární struktury templátu vedlejší vazbou o gene 32 protein (109) o Single strand binding protein o recA (110;110) o T4 gene 32 (25;111). • Potlačení sekundární struktury templátu denaturačním činidlem o 10% glycerol (60) o nízkomolekulární amidy a sulfony (112): 10% dimethyl sulfoxid (60;113), tetramethylen sulfoxid (114), 10% polyethylen glykol 6000, osmoprotektant betain (115) a 5% (dimethyl)formamid (116), trimethylamin N-oxide, 50 µM tetramethylamonium chlorid, tetramethyl amonium oxalát (117), spermidin (118) o 1% neiontový detergent Tween 20 o trehaloza (119). • Potlačení sekundární struktury amplikonu vlastnostmi nukleotidů o náhrada části dGTP pomocí 7 deaza dGTP. • Potlačení nespecifické vazby Taq na dsDNA o spermidin (118). • Zlepšení tepelného přenosu o koloidní zlato (120). • Vyvázání PCR inhibitorů, reagujích s Taq na: o hovězí sérový albumin (BSA) (111) o polyvinyl pyrolidon (121) o dithiothreitol (122) o minerální olej. Dlužno podotknout, že snaha o nalezení opravdu univerzální směsi enhancerů (123) se míjí účinkem – jak zjistí každý, kdo se pokusí zopakovat nadějné výsledky autorů článků o enhancerech na svém templátu a se svými vyzkoušenými chemikáliemi. Přesto současná industrializace genotypizace vede ke snahám o zjednodušení, které můžeme nazvat konceptem univerzality.
22
6. Koncept univerzality Obecným současným trendem při zjišťování genotypu je miniaturizace, automatizace a vysoká propustnost. Poslední cíl bývá kritizován jako necílené „rybářské expedice“ oproti tradičnímu výzkumu vedeného hypotézami. Začíná však přinášet zajímavá data, která nejsou tradičními postupy získatelná (124). Zmíněný trend může být v PCR sledován změnou standardního pufru a protokolu, plynulou integrací jednotlivých kroků, zvýšením počtu paralelních testů a multiplexováním. •
•
Univerzální pufr a protokol o Milníkem ve snaze o robustní pufr a PCR protokol je „Phototyping“ Mike Bunce a spolupracovníků (3). Jejich optimální protokol byl použit pro tisíce rozdílných duplexních PCR při genotypizaci lidských genů tkáňové slučitelnosti (HLA) a dosáhl zatím 562 citací v ISI. o Používají metodu PCR-SSP/ARMS spolu s principem Touchdown, nebo přesněji Stepdown (125;126), kdy teplota hybridizace primerů je v počátečních cyklech tak vysoká, že dochází jen k prodlužování primerů, dokonale navázaných na cílovou sekvenci po celé své délce (rozhodující je 3´ konec). V dalších cyklech je teplota hybridizace graduálně snížena, čímž se dramaticky zvýší účinnost amplifikace, která probíhá již jen na vytvořených věrných cílových sekvencích. Ve zkráceném zápise zní jejich PCR protokol takto: 96°C 1´, (96°C 20´´/70°C 45´´/72°C 25´´)*5, (96°C 25´´/65°C 50´´/72°C 30´´)*21, (96°C 30´´/55°C 1´/72°C 1´30´´)*4, 25°C 1´´. o Další změna je ve standardním pufru: draselné ionty, které stabilizují sekundární struktury templátu a snižují procesivitu polymerázy, jsou nahrazeny ionty amonnými (10*koncentrovaný pufr má složení: 0,67 M TrisCl pH 8.8; 0,166 M (NH4)2SO4; 1% Tween 20; 20 mM MgCl2). Integrace jednotlivých kroků o S narůstajícím počtem lidských zásahů a kroků procedury roste složitost a křehkost systému, proto má jednokroková analýza své příznivce. Zatímco objem reakční směsi v PCR mikrozkumavce lze ztěží zmenšit pod 6 µl (kdy už se negativně projeví i permeabilita stěny zkumavky, Obr. 7), v mikročipových podmínkách lze pracovat v nanolitrových množstvích (127-129). Cirkulace PCR reakční směsi oblastmi s rozdílnou teplotou v nanoškálových rozměrech vede k dalšímu zrychlení cyklů PCR (patent firmy Thermal Gradient). Pokud integrujeme další kroky analýzy (izolaci DNA, kapilární elektroforézu (130)), dostáváme se k přístupu miniaturizované integrované laboratoře (µTAS - micro Total Analysis System, Lab-on-chip (131)).
23
Obrázek 7: Srovnání výsledku profilování mikrosatelitů v rozdílných reakčních objemech
•
•
Multiparalelismus o Souběžné testování mnoha vzorků je nutné pro velké populační projekty anebo pro projekty sekvenací genomů. Ze sekvenačních přístupů nové generace zmíním jen formát PCR na magnetických kuličkách v emulzi (132). Multiplexing o Pokud nás nezajímá jediný polymorfismus u velkého množství vzorků, ale spíše více cílů u omezeného množství vzorků, můžeme využít multiplexing (multitasking v komplexním systému). Původní optimalizace PCR multiplexu vyžadovala zdlouhavé testování reakčních podmínek pro nalezení kompromisních podmínek pro všechny kombinace primerový pár – cílová sekvence (133-136). Inovativním přístupem bylo využití potlačované PCR (PCR suppression) (137-139), počítačových modelů a nastavovaných, přívěskových primerů (tagged, tailed primers; viz Případová studie 2).
Koncept univerzality je téma, jehož aplikací se v současné době zabývám. Proto v následujících dvou případových studiích uvedu čerstvá data, která ještě nedosáhla stadia připravenosti k zaslání do impaktového časopisu.
24
6.1. Případová studie 1: uzamčená mezidruhová qPCR sonda 6.1.1. Úvod Uzamčené sondy (locked nucleic acid, LNA, (140)) jsou modifikované oligonukleotidy vedené obdobnou myšlenkou jako peptidové nukleové kyseliny (62;141), 2´ fluoro N3-P5´fosforamiditové nukleové kyseliny a 1´,5´-anhydrohexitolové nukleové kyseliny: že Watson-Crickovu vazbu mezi nukleotidy lze posílit a učinit více diskriminující změnou v cukrfosfátové kostře DNA. Zatímco jiné deriváty nukleových kyselin se šířeji neujaly, LNA (142) získává na popularitě po masívní reklamní kampani firmy Roche. Drobná modifikace cukru u LNA (methylenová vazba u ribózy a deoxyribózy) „uzamyká“ cukr v N-konformaci, odpovídající A-formě DNA. V čem je to výhodné? První srovnání naznačují, že LNA sondy jsou citlivější než tradiční TaqMan sondy (143). Navíc uzamčené sondy dosahují při délce 8 nukleotidů stejné specificity, jaká je možná při délce 20 nukleotidů u standardních, nemodifikovaných sond, a tak jsou použitelné i v případech, kdy tradiční sondy selhávají (144). Osminukleotidová sonda má obrovské množství komplementárních sekvencí v lidském genomu. To vedlo firmu Roche k následujícímu marketingovému tahu: dodává knihovnu sond pro kvantifikaci exprese většiny lidských genů. Jednotlivé sondy pak mohou být použity v rámci genomu vícekrát, vždy se specifickým párem primerů. Můj současný odborný zájem (genotypizace degradované DNA) mě vedl k paralelní práci na dvou grantových projektech, věnujících se lidské degradované DNA z kostí z archeologických vykopávek a révové degradované DNA z vína. V následující části popíši výsledky snahy o zatím nevyzkoušený unifikační přístup - o využití stejné LNA sondy mezi genomy pro kvantifikaci množství jaderné DNA u Vitis vinifera a Homo sapiens.
6.1.2. Metody Jako kvantifikační standard byla použita diluční řada DNA, jejíž čistota a koncentrace byla zjištěna spektrofotometrií (A260/A280 = 1,9; koncentrace 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml, (0,001 ng/ml)). U vzorků révy byla provedena izolace DNA z listu, vína a peciček (n = 20) metodou s cetyltrimethyl amonium bromidem (145); u vzorků kostí člověka (n = 10) byla provedena izolace DNA z krve a kosti metodou s guanidin isothiokyanátem (146). Vitis vinifera Pro návrh primerů a sondy byly vybrány takové geny, které se již pro kvantifikaci révové DNA osvědčily: Vitis epoxycarotenoid dioxygenáza (147) a resveratrol syntháza (148). Nukleotidové sekvence cDNA byly načteny do firemního software na webové stránce https://www.roche-appliedscience.com/sis/rtpcr/upl/adc.jsp a potom byl spuštěn automatický design primerů. U navržených primerů bylo zkontrolováno pomocí software Softberry-RNASPL zda-li se http://softberry.com/berry.phtml?topic=rnaspl&group=programs&subgroup=gfind, nenacházejí na exonech, příliš vzdálených od sebe. Specificita primerů v rámci genomu Vitis vinifera a jeho parazitů byla zkontrolována programem BLAST (149) Homo sapiens Jelikož pro návrh primerů, specifických pro Homo sapiens, nebylo již možno použít firemní software (nedokáže nalézt primery na základě známé sondy) ani BLAST (vyhledává v GenBanku jen sekvence delší než 10 nukleotidů), musel být postup modifikován. Sekvence sondy byla nejprve (neúspěšně) vyhledávána uvnitř sekvencí, které se osvědčily pro kvantifikaci lidské DNA (například Alu repetice (150;151)), pak byla vytvořena v MS Word databáze většiny forenzně zajímavých sekvencí a přítomnost sondy byla hledána i zde. Po nalezení sondy v rámci sekvence genu pro koagulační faktor 13 byl k designu primerů použit program FastPCR www.biocenter.helsinki.fi/bi/programs/fastpcr.htm a Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi. Nakonec byla specificita primerů zkontrolována programem BLAST. Pro PCR byl použit protokol, doporučený výrobcem LNA sond (95 °C 11 min, (95 °C 20´´/65 °C 1´ se sběrem fluorescenčních dat ve FAM kanálu na konci extenze)*50, 25°C 1´´. Výsledky byly vyhodnoceny firemním software Stratagene Mx3000 za využití algoritmů vyhlazujících křivku.
25
6.1.3. Výsledky a diskuse Pro Vitis vinifera byla nalezena tato kombinace oligonukleotidů: Primer dopředný: gACACCTTCTgCTTCCACCT Primer zpětný: ACCACCACTTCgTTggTCTC Uzamčená sonda UPL probe: #52, cat.no. 04688490001: gggAggAg. Umístění primerů a sondy na cílové sekvenci je zobrazeno na Obr. 8 (žlutě je vymezen 62 bp amplikon, tučně sonda): Obrázek 8: Umístění Vitis vinifera primerů a sondy na cDNA
AY337614 Vitis vinifera 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase 2 (NCED2) mRNA >gi|38112199|gb|AY337614.1| Vitis vinifera 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase 2 (NCED2) mRNA, AgAAATgATCACCggAggTTCCCCCgTTATCTACCACAAAAACAAgAAATCTCggTTTggAATTCTCgCCAAA AATgCTCAAACCgCCTCTgATATCATTTgggTggAgTCACCAgACACCTTCTgCTTCCACCTCTggAATgCTT gggAggAgCCggAgACCAACgAAgTggTggTgATCggATCATgCATgACgCCCgCggACTCCATTTTTAACgA ATgCgAggAgAATTTACAgAgCgTgCTATCAgAgATCAggCTCAATTTgAAAACCggTgAgTCCACTCgCCgC CCCATAgTTCCggCgTCggAgCAAgTgAACCTggAAgCAggCATggTggATCgAACCCgACTCggACgAAAAA CCCAATACgCCTATCTCgCCATTgCCgAgCCATggCCCAAggTTTCgggTTTTgCCAAggT
Přestože nástup geometrické fáze PCR byl oproti metodám TaqMan a SybrGreen I opožděn (28. cyklus místo 20. cyklu), při amplifikaci bylo dosaženo kvalitních výsledků (Obr. 9) ve smyslu linearity, citlivosti a odstupu od šumu. Zpoždění nástupu geometrické fáze může být způsobeno častou vazbou krátké sondy (a pak polymerázy) na necílová místa v genomu, což navyšuje hodnoty fluorescenčního pozadí v prvních cyklech PCR. Systém byl použit pro kvantifikaci révové DNA ve víně a v pecičkách révy z archeologických vykopávek (publikace v přípravě). Obrázek 9: Amplifikační křivky standardů (Vitis vinifera)
Legenda: Červeně 10 ng/ml, zeleně 1 ng/ml, žlutě 0,1 ng/ml, modře 0,01 ng/ml, šedě negativní kontrola.
26
Homo sapiens Pro Homo sapiens a sondu UPL probe: #52, cat.no. 04688490001 (gggAggAg) byla nalezena tato oligonukleotidová dvojice: Primer dopředný: CCAAgCCACAgTAgCAgC Primer zpětný: gACTTCCTCAAACggACTCg Umístění primerů a sondy na cílové sekvenci je zobrazeno na Obr. 10. Stojí za povšimnutí, že sonda se na cílové sekvenci váže třikrát. Toto umístění primerů bylo zvoleno se snahou zrychlit nástup geometrické fáze PCR (a tím zvýšit citlivost a zrychlit qPCR). Obrázek 10: Umístění Homo sapiens primerů a sondy na cDNA >gi|15987820|gb|AF418272.1|AF418272 Homo sapiens coagulation factor XIII, A1 polypeptide (F13A1) gene, complete cds TCACTgCATgCATggTCACAACTgTCTgTgTgACCTgTCTgTgggAgggCAgACCCCCCTCCTgCCAAgCCAC AgTAgCAgCTgACCTgCCAggCAAAAgCATTCCTTTgTAAAggAAACCCTCCCAgACCCTCTgACCAAAgggg ACgggTggggACTTCCTggCACTgCAgggCCCCTTgCCTggTACTCCCAgCAACTggTTgCggTggggAgggC AgATCTAggggTggggATggggAggAgAAgTgggAATgggAAATTgggAgTCAgAggggCAAgTgggAgAgAA gggCgCACCTgCCgggATAACAggCCAgATgAAgTAAATAgAAAATCCTCTgAgCTCCCCTACTggCTCCAgC TgTggAgAAgggggAggAgAAAACCCTgTgggACAggggAggAgggTgAgggCTCCTCTTAggAAgTTATTTA AgAgCCAACTgTCTTgTCTTTCCCgAgTCCgTTTgAggAAgTCCCCgAggCgCACAgAgCAAgCCCACgCgAg ggCACCTCTggAggggAgCgCCTgCAggTAAgCCACCgCCCCTgCACCCTATgAgCCAgggCCCgCTgCgTCC ACCTT
Ukázalo se však, že nástup geometrické fáze amplifikace je naopak ještě více zpomalen (32. cyklus) a průběh křivek standardů poukazuje na inhibici PCR (Obr.11). Obrázek 11: Amplifikační křivky standardů (Homo sapiens)
Legenda: Modře 10 ng/ml, červeně 1 ng/ml, šedě 0,1 ng/ml, zeleně negativní kontrola. Sonda není k žádnému primerovému páru kompatibilní natolik, aby mohla být její účinnost snížena vazbou k primeru. Podle výsledku in silico PCR http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgPcr?org=Rat&db=rn4&hgsid=74915418 a agarózové elektroforézy po in vitro qPCR (Obr. 12) je délka amplikonu 417 bp, jak odpovídá cDNA sekvenci. Proto se v úseku mezi primery v cílové gDNA nenachází intron, který by délku amplikonu zvětšil nad mez, únosnou pro podmínky standardní qPCR a vyžadoval by podmínky Long PCR.
27
Obrázek 12: Elektroforéza v agarózovém gelu
žebřík
vzorek
500 bp 400 bp
417 bp amplikon
300 bp 200 bp 100 bp
Na obr.12 lze rozeznat ještě další tři amplikony, kratší než 417 bp, což je jednak důsledek extrémně velkého počtu cyklů PCR (50 cyklů), jednak poukazuje na nižší úroveň optimalizace PCR. Zvýšení teploty hybridizace primerů ani prodloužení času extenze výsledek nezlepšilo. Je možné, že přítomnost tří uzamčených sond na cílové sekvenci je pro standardní Taq polymerázu obtížně překonatelnou překážkou a změna polymerázy za procesivnější by mohla účinnost amplifikace zvýšit. Výhodnější však bude nový design primerů, protože nelze vyloučit sekvenační chybu anebo zatím nepopsaný bodový polymorfismus v databázi GenBank.
28
6.2. Případová studie 2: multiplex PCR s nastavovanými primery pro identifikaci osob a určování příbuznosti 6.2.1. Úvod Nastavování primerů univerzální sekvencí na 5´ konci bylo již dříve použito pro konstrukci umělého restrikčního místa v průběhu PCR (152), pro zjednodušení qPCR (153-156), pro balancovanou PCR při amplifikaci celého genomu (36), pro sekvencování krátkých fragmentů DNA (157), dokonce i pro konstrukci zjednodušeného fluorescenčního značení (158-161) v rámci multiplexní PCR (162) a redukci tvorby primerových dimerů (138;163). Přesto není doposud popsán žádný multiplex s nastavovanými primery pro STR, validovaný pro forenzní účely. V této případové studii je univerzálním prodloužením (160) modifikován jeden z každého primerového páru oligonukleotidů podle setu PowerPlex16 (164) firmy Promega (kromě pentanukleotidových repetic Penta D a Penta E, které mají dlouhé amplikony a nejsou proto vhodné k analýze degradované DNA). Modifikace je provedena nastavením 5´ konce primerů třemi přívěsky o univerzální sekvenci. Na sekvence komplementární k sekvenci přívěsků primerů, vytvořené v průběhu prvních cyklů PCR, se váže univerzální fluorescenčně značený primer, který v následujících cyklech dominuje nad prodlouženým primerem. Tato studie má i ekonomický aspekt. Zatímco bez modifikace nastavováním jsou náklady na pořízení primerů v hexadekaplexu rovny 16*(cena obyčejného primeru) + 16*(cena fluorescenčně značeného primeru) = 16*500 Kč + 16*6000 Kč = 104 000 Kč, při použití nastavování 5´ konce primerů jsou náklady rovny 8*(cena obyčejného primeru) + 8*(cena nastavovaného primeru) + 3*(cena univerzálního, fluorescenčně značeného primeru) = 8*500 Kč + 8*1000 Kč + 3*6000 Kč = 30000 Kč. Náklady se ještě více sníží, pokud stejné univerzální značené primery použijeme pro více multiplexních reakcí.
6.2.2. Metody K testování byly použity DNA z výtěrů bukální sliznice (n = 20), izolované metodou s guanidin isothiokyanátem a s referenčně získaným DNA profilem (firma Genomac, s.r.o.). Pět s čárkou konec primerů byl modifikován nastavením dle Tab. 4.
29
Tabulka 4: Sekvence primerů s barevným naznačením druhu fluoroforu FAM, HEX, NED
Nastavená sekvence původní sekvence primerů ggCTgCAgggCATAACATTA FGA ATCTgTgCCgAggCTCAggCATTCTATgACTTTgCgCTTCAggA ATCTgTgCCgAggCTCAggCACAgAACAggCACTTAgg TPOX CgCTCAAACgTgAggTTg ATCTgTgCCgAggCTCAggCATTgCAACTTATATgTATTTTTgTATTTCATg D8S1179 ACCAAATTgTgTTCATgAgTATAgTTTC ATCTgTgCCgAggCTCAggCCCTAgTggATgATAAgAATAATCAgTATgTg vWA ggACAgATgATAAATACATAggATggATgg ATCTgTgCCgAggCTCAggCCCTgggCTCTgTAAAgAA Amelogenin ATCAgAgCTTAAACTgggAAgCTg TTCTTgAgCCCAgAAggTTA D18S51 gTCggTgCAgAgCATCATgCATTCTACCAgCAACAACACAAATAAAC gTCggTgCAgAgCATCATgCATATgTgAgTCAATTCCCCAAg D21S11 TgTATTAgTCAATgTTCTCCAgAgAC gTgATTCCCATTggCCTgTTC TH01 gTCggTgCAgAgCATCATgCATTCCTgTgggCTgAAAAgCTC gTCggTgCAgAgCATCATgCACTgCAgTCCAATCTgggT D3S1358 ATgAAATCAACAgAggCTTgC CCggAggTAAAggTgTCTTAAAgT CSF1PO gACTTCgAggACCTgACACgATTTCCTgTgTCAgACCCTgTT gACTTCgAggACCTgACACgggggTCTAAgAgCTTgTAAAAAg D16S539 gTTTgTgTgTgCATCTgTAAgCATgTATC ATgTTggTCAggCTgACTATg D7S820 gACTTCgAggACCTgACACgATTCCACATTTATCCTCATTgAC gACTTCgAggACCTgACACgATTACAgAAgTCTgggATgTggAggA D13S317 ggCAgCCCAAAAAgACAgA gACTTCgAggACCTgACACggTgATTTTCCTCTTTggTATCC D5S818 AgCCACAgTTTACAACATTTgTATCT FAM univerzální ATCTgTgCCgAggCTCAggC primer HEX univerzální gTCggTgCAgAgCATCATgC primer NED univerzální gACTTCgAggACCTgACACg primer Lokus
Prodloužení primerů nastavením může vést k nutnosti změny PCR parametrů. Byly proto srovnány tři protokoly: postupné snižování hybridizační teploty v průběhu každého cyklu PCR (Ramp down (165)), postupné zvyšování hybridizační teploty s každým dalším cyklem PCR (Touch-up (166;167)) a postupné snižování hybridizační teploty s každým cyklem PCR (Touchdown (125)). Zkrácený zápis PCR protokolů zní takto: • Ramp down (95 °C 11´, (95 °C 20´´/68 °C 5´ klesat na 60 °C/ 72 °C 1´)*5, (95 °C 20´´/58 °C 3´ klesat na 50 °C/ 72 °C 1´)*5, (95 °C 20´´/47 °C 75´´/ 72 °C 1´)*5, 65 °C 45´, 25°C 1´´. • Touch-up (95 °C 11´, (95 °C 20´´/(60 °C 15´´/ 72 °C 15´´)*3, 72 °C 15´´)*6, (95 °C 20´´/76 °C 95´´ )*29, (94 °C 1´/60 °C 30´´/ 76 °C 1´)*3, 65 °C 45´, 25°C 1´´. • Touchdown (95 °C 11´, (96 °C 10´´/59 °C -1 °C na cyklus/ 72 °C 1´)*10, (96 °C 10´´/50 °C 50´´/ 72 °C 50´´)*18, 65 °C 45´, 25°C 1´´.
30
6.2.3. Výsledky a diskuse Zatímco PCR protokol Touch-up preferoval amplifikaci dlouhých amplikonů a protokol Touchdown preferoval amplifikaci kratších amplikonů, protokol Ramp down poskytl nejsilnější signál pro krátké a dlouhé amplikony (Obr. 12). U krátkých amplikonů Ramp down byl však zvýšený šum. Metoda Touch-up měla nejnižší signál amplikonů. Vzhledem k tomu, že metoda Touchdown použila nejmenší počet cyklů (Touchdown 28 cyklů, Ramp down 38 cyklů, Touch-up 37 cyklů), jeví se pro optimalizaci jako nejnadějnější. Je možné, že prodloužení hybridizačních časů nebo navýšení počtu prvních cyklů s vysokou hybridizační teplotou u metody Touchdown povede ke zlepšení signálu u dlouhých amplikonů. Obrázek 13: Srovnání PCR protokolů
Metoda generovala ještě jeden artefakt, který jsme nepozorovali u multiplexní PCR s délkově nemodifikovanými primery – přítomnost alel navíc (Obr. 14), allele drop-in. Přestože přítomnost tří alel na jednom lokusu je biologicky možná (různé typy chimér nebo duplikační retrotranspozice repetice na nové místo genomu), srovnáním s referenčními výsledky jsme zjistili, že alela 08 (242 bp) u mikrosatelitu D7S820 je artefakt. Stejně tak jsou artefaktem alely D21S11_27.1 (235 bp) a D8S1179_12 (242 bp) a alela TPOX_06 u jiného vzorku. Přitom separované (singleplexní) PCR reakce tyto artefakty negenerují. Po prozkoumání vnitřní sekvence těchto mikrosatelitů vyslovuji hypotézu, že ke vzniku artefaktu nedochází mechanismem vzniku templátové vlásenky na původním místě vazby prodlouženého primeru, ale spíše vazbou primeru na jiné, neznámé místo genomu. Jedná se nejspíše o mechanismus obdobný principu metody Random amplification of polymorphic DNA (RAPD), kdy se primery naváží na templát v opačných směrech na neznámá místa a ohraničí tak sekvenci, která se pak může v průběhu PCR množit geometrickou řadou.
31
Obrázek 14: DNA profil zobrazený separovaně ve čtyřech barevných kanálech
Pomocí BLASTu lze nalézt v lidském genomu k univerzálním primerům částečně komplementární sekvence. Pro 3´ konec přívěsku FAM-ATC TgT gCC gAg gCT CAg gC jsou úplně komplementární 16-ti nukleotidové úseky na chromozomu 2, 6, 7, 12; pro 3´ konec přívěsku HEX-gTC ggT gCA gAg CAT CAT gC je úplně komplementární 17-ti nukleotidový úsek na chromozomu 10; pro střed přívěsku NED-gAC TTC gAg gAC CTg ACA Cg je komplementární 15 nukleotidový úsek na chromozomu 22. Je možné, že vazba nastavovaných primerů svými 5´ a 3´ konci na neplánované místo templátu je dostatečně pevná na to, aby z těchto míst spustila nechtěnou amplifikaci. Pro přesné určení původu nadbytečných píků je nutné sekvencovat jednotlivé amplikony. Přestože jiné publikované „univerzální“ přívěskové sekvence mají v lidském genomu ještě větší počet nechtěných komplementarit5, domnívám se, že lze zvolit univerzální sekvence lépe a zaměřím na tuto část designu primerů svou pozornost v dalších experimentech. Uzavírám, že primery pro mikrosatelity D7S820, D21S11, TPOX a D8S1179 nejsou k nastavování danými univerzálními primery vhodné. Primerové páry pro ostatní mikrosatelity fungovaly na omezeném testovacím vzorku uspokojivě, ale před jejich použitím ve forenzní praxi je nutné provést důkladnou validační studii.
5
Pro M13 přívěsek dle Schuelkeho: TgT AAA ACg ACg gCC AgT (158) nalezl BLAST komplementární místa se skóre nad 28 na chromozomech 12, 1, 18, 16; pro přívěsek dle Nuova: CCT gCA ggC TgA ggT (159) nalezl BLAST místa se skóre nad 30 na chromozomech 8, 7, 5, 4, 3, 20, 2, 19, 16, 15, 14, 11, 1.
32
7. Anotované časopisecké práce 7.1. Diversity among wild type and vaccination strains of Trichophyton verrucosum investigated using random amplified polymorphic DNA analysis Hajdúch M, Drábek J, Raclavský V, Kotala V, Michálek T, Zelenková I.. Folia Biologica 1999; 45(4):151-156. IF=0,5 Metoda Random amplified polymorphic DNA analysis (RAPD) je vhodná k testování nedostatečně odsekvencovaných genomů. Po standardizaci izolace DNA, koncentrace templátové DNA, koncentrace Mg2+, koncentrace dNTP, délky/sekvence/koncentrace použitého primeru, teploty nasedání primeru, počtu cyklů v RAPD reakci, typu použitého termocykléru a zkumavek, koncentrace a druhu polymerázy metoda RAPD reprodukovatelně generuje individuální proužky na gelu (otisk prstu, fingerprint). Testovali jsme 20 primerů pro použití ke RAPD genotypizaci původce infekčního mykotického onemocnění - trichofytózy skotu - Trichophyton verrucosum. Šest testovaných primerů detekovalo polymorfismus, a bylo proto vybráno k dalšímu testování. Sledovali jsme, zda-li tyto RAPD primery umožňují rozlišit standardní (volně žijící) a vakcinační kmeny T. verrucosum. Každý z kmenů poskytl na elektroforéze individuální proužkový vzor. Výsledky shlukové analýzy potvrdily společný původ avirulentních vakcinačních kmenů (T. verrucosum TV-M9 a T. verrucosum TVM-130), které byly připraveny ze standardního kmene T. verrucosum Strážnice mutagenezí ultrafialovým zářením. Mezi RAPD proužky nebyl nalezen marker virulence. Metoda je použitelná k epidemiologickým analýzám, k autentizaci jednotlivých vakcín a ke studiu houbových populací v infikovaném a/nebo vakcinovaném hostiteli. Současný komentář: přestože poslední krok RAPD analýzy – elektroforéza – může být nahrazen modernějšími a pohodlnějšími přístupy, jako je analýza křivky tání amplikonů (168), celosvětově je od metody RAPD sledovatelný ústup směrem k metodám, které jsou robustnější a reprodukovatelnější. Genom Trichophytonu není zatím dostupný (http://www.genomesonline.org/, 3.3.2007), ale i tak jsou již popsány spolehlivější PCR metody, založené na známé sekvenci (169-171). Objevují se také nonPCR přístupy k identifikaci kmenů Trichophytonu (např. pachové otisky (172)).
33
7.2. A commented dictionary of techniques for genotyping Drábek J. Electrophoresis 2001; 22(6):1024-1045. IF=3,74 Tento článek je rešerší možností a strategií, jak genotypizovat. Soustřeďuje se na analýzu bodových polymorfismů (SNP). Je nad rámec možností autora osobně otestovat všechny popsané metody, a proto je článek do určité míry interpretací publikovaných údajů. Genotypizace umožňuje identifikaci taxonomického druhu, jedince, genu, alely a změn v genetické informaci. Tím genotypizace slouží při diagnóze dědičného onemocnění, při detekci genetické predispozice k onemocnění, při kriminalistické analýze, při určování otcovství a při identifikaci mikroorganismů rezistentních vůči antimikrobiální terapii. Genotypizace je expandující obor, který vznikl v 70. letech objevem polymorfismu v délce restrikčních fragmentů (RFLP), v 80. letech akceleroval uvedením PCR a intenzifikoval se v 90. letech nástupem metod s vysokou propustností (High throughput screening). Rozvoj genotypizace je svázán s úspěchem projektu mapování lidského genomu, i když není omezen jen na lidskou genetiku. Tento článek se zabývá genotypizací SNPů a opomíjí detekci chromozomových přestaveb, satelitů, methylace, expanze tripletů a velkých indelů. Abecedně seřazený slovník metod je následován diskusí nad rozdílnými parametry (diskriminační princip, citlivost, specifičnost) a praktickými aspekty (citační úspěšnost) genotypizace. Diskriminační principy jsou rozděleny do čtyř širokých kategorií: vazba oligonukleotidu, štěpení nukleové kyseliny, inkorporace nukleotidu, separace molekuly nukleové kyseliny v elektrickém poli. Pro podrobný návod k provedení metody je čtenář odkázán na primární údaje. Současný komentář: vývoj genotypizačních metod se nezastavil v roce 2001 (173;174), i když principiálně nových metod na výběr (175) příliš nepřibylo: spíše se rozvinuly metody s komerčním apelem vysoké výkonnosti (multiplex (176), propustnost (177), miniaturizace (178), čipy, průtoková cytometrie s kódovanými kuličkami (179)).
34
7.3. 32 bp deletion in CCR-5 gene and human immunodeficiency virus epidemic in the Czech Republic Drábek J, Petřek M.. Acta Virologica 1998; 42(2):121-122. IF=0,6 CCR-5 je chemokinový receptor, ke kterému se fyziologicky váží chemokiny RANTES, MIP-1α a MIP-1β. CCR5 je exprimovaný v T lymfocytech, makrofázích, dendritických buňkách a mikrogliích a podílí se na proti-infekční zánětlivé reakci. Některé kmeny viru HIV používají CCR5 jako koreceptor pro vstup do cílových buněk. 32 bp delece v genu pro chemokin CCR-5 je asociovaná s menším rizikem nákazy virem HIV s progresí do AIDS. Česká populace byla v roce 1997 ve srovnání se západními státy málo promořená virem HIV. V této práci jsme testovali, zda-li není nižší podíl lidí, nakažených virem HIV, asociovaný s vyšší frekvencí CCR5-∆32 v naší populaci. Použili jsme jediný primerový pár, Touchdown PCR a elektroforézu v agarózovém gelu, která umožnila rozlišit 182 bp a 150 bp amplikon. Ukázalo se, že frekvence CCR5-∆32 v naší populaci není vyšší než v okolních zemích a nižší záchyt infekce HIV je způsoben jinými faktory, nejspíše svázanými s doznívajícím efektem „železné opony“. Současný komentář: Náš závěr je nepřímo potvrzen dalším vývojem – nárůstem počtu infikovaných pacientů od roku 1998.
35
7.4. Characterization of a novel HLA-A*24 allele containing an HLA-A*03 sequence motif Drábek J, Bunce M, Faé I, Ambrůzová Z, Dunn P, Ross J et al.. Tissue Antigens 1999; 54(1):98-101. IF=1,99 V této práci je popsána nová alela genu tkáňové slučitelnosti člověka (HLA-A*2418), objevená na Ústavu imunologie Fakultní nemocnice Olomouc. Alela v rodinné studii segreguje dle Mendelova zákona; na sérologické úrovni je zajímavá tím, že obsahuje zároveň epitopy HLA-A9 a HLA-A3. Na úrovni typizace metodou PCR-SSP se alela rovněž chová nezařaditelně. Sekvenační analýza amplikonu z genomické a komplementární DNA potvrzuje, že alela nejspíše vznikla rekombinací mezi HLA-A9 a HLA-A3 a nomenklaturně patří mezi alely skupiny A*24 (na sérologické úrovni do skupiny A9). Současný komentář: pravděpodobnost záchytu nové alely roste se zpřesněním detekční metody a s rozšiřováním počtu testovaných osob - zvláště z geneticky zajímavých populací. Přestože naše populace se z hlediska genetické zajímavosti nemůže rovnat s africkými populacemi, kvalitní práce olomoucké HLA laboratoře vedla v následujících letech k objevu dalších nových alel, a to i bez mého přispění (180-182).
36
7.5. Frequency of 657del(5) mutation of the NBS1 gene in the Czech population by polymerase chain reaction with sequence specific primers Drábek J, Hajdúch M, Gojová L, Weigl E, Mihál V. Cancer Genetics and Cytogenetics 2002; 138(2):157-159. IF=1,58 Nijmegen breakage je spolu s Bloomovým syndromem, Fanconiho anémií a ataxia telangiectasií vzácným, autozomálně recesivním syndromem chromozomální nestability. Nijmegen breakage syndrom je charakterizován mikrocefalií, imunodeficiencí, radiosensitivitou a náchylností ke tvorbě lymfomů. Nemoc je způsobena mutací genu pro nibrin (NBS1), který se podílí na opravě dvoušroubovicových zlomů DNA a na kontrole buněčného cyklu. Delece v šestém exonu nibrinového NBS1 genu [657del(5)], která vede ke kratšímu peptidovému produktu, je nejčastější příčinou tohoto onemocnění. Je známo, že ve slovanských populacích je tato mutace zastoupena ve zvýšené míře. Zde prezentujeme námi vyvinutou PCR-SSP/ARMS metodu detekce této mutace. Zároveň potvrzujeme, že je tato mutace častá i v české populaci (1/106, 95% CI = 1/331 až 1/46). Současný komentář: Čeští pacienti s Nijmegen breakage syndromem jsou nadále intenzivně sledováni týmem prof. E.Seemanové (183-186).
37
7.6. A study on the effects of degradation and template concentration on the amplification efficiency of the STR miniplex primer sets Chung DT, Drábek J, Opel KL, Butler JM, McCord BR.. Journal of Forensic Sciences 2004; 49(4):733-740. IF=0,9 Ve forenzní analýze DNA se často setkáváme se vzorky z místa činu, jejichž DNA je vysoce degradovaná. Komerční primerové sety pro analýzu krátkých tandemových repeticí (PowerPlex16, Identifiler) dosahují u nejdelších amplikonů délky kolem 450 bp. U degradovaných vzorků nelze zjistit DNA mikrosatelitový profil, pokud délka amplikonu přesahuje 200 bp. Abychom toto omezení překonali, vyvinuli jsme STR markery s pozměněnými primerovými sekvencemi (vazebná místa jsou více přiblížená k repeticím), které vedou ke tvorbě kratších amplikonů (primerové sety byly nazvány Miniplex 1, 2, 3). Účinnost těchto tří Miniplexových setů jsme testovali na kontrolovaně, enzymaticky degradované DNA a na dvou forenzních vzorcích neznámého lidského skeletonu. Výsledky jsme srovnali s účinností komerčního setu. Sledovali jsme parametry citlivosti a vyváženosti heterozygotních píků. Pro testovanou degradovanou DNA jsme byli schopni získat úplná data při limitní koncentraci 30 pg/µl, což předčilo komerční set. Naše data potvrdila, že Miniplexy mohou přinést relevantní informaci v situacích, kdy standardní komerční sety selhávají. Současný komentář: správnost našeho Miniplexového přístupu ověřuje nejen úspěch Miniplexů při analýze vzorků po teroristickém útoku na World Trade Centrum (187), ale i nynější vývoj na komerční scéně: firma Applera začala po doporučení the European DNA Profiling Group (EDNAP) (188) distribuci miniplexu pod názvem Minifiler.
38
7.7. Concordance study between Miniplex assays and a commercial STR typing kit Drábek J, Chung DT, Butler JM, McCord BR.. Journal of Forensic Sciences 2004; 49(4):859-860. IF=0,9 Baterie miniplexových primerových setů, zmíněná v Článku 8.6., musí být před použitím ve forenzní praxi (se vzorky z kriminalistického případu) plně validovaná. Součástí validace je i rozšířená populační studie na vzorcích, které byly již dříve otypovány standardními STR sety – konkordanční studie. V tomto článku prezentujeme rozdíly, nalezené při retypizaci šesti set vzorků našimi Miniplexy. Objevili jsme jak templátové polymorfismy v místě komplementárním k 3´ konci primeru (generujícími nulové alely), tak delece v místech vně úseku vymezeného našimi primery (generujícími rozdíly v určených alelách). Tyto specifické údaje pro každý primerový pár jsou nezbytné pro možnost databázového srovnání vzorků, jejichž profil byl zjištěn rozdílnými metodami. Současný komentář: práce názorně ukazuje to, co je sice odvoditelné statistickými výpočty, ale vzpírá se obecnému uvažování při zavádění nových metod: pokud chceme s určitou spolehlivostí nalézt drobné rozdíly mezi „zlatým standardem“ a novou metodou (nebo pokud chceme deklarovat mezi metodami shodu), musí být testovaný srovnávací vzorek dostatečně velký. Zároveň práce ukazuje (spolu s dalšími pracemi na téma využití Miniplexů), že rozdíl mezi novou metodou a standardem není dostatečným důvodem pro zamítnutí nové metody – nutností je však dostatečná charakterizace nové metody, aby mohla být upravena interpretace výsledku. Zde se jedná o úpravu vyhledávacího algoritmu v databázích DNA profilů zločinců a o úpravu pravděpodobnostního modelu (věrohodnostního poměru) při výpočtu síly důkazu.
39
7.8. Class I typing by PCR-SSP in Olomouc Drábek J.; Vranova K.; Ambruzova Z.; Petrek M.; Bartova A.; Weigl E.. Bone Marrow Transplantation 1998, 22, S23. IF=2,6 V tomto článku jsou popsány naše zkušenosti s metodou Phototyping (na bázi PCR-SSP/ARMS), použité ke genotypizaci I. třídy HLA antigenů. Genotypizace I. třídy HLA byla provedena ke dvěma účelům: ke zjišťování shody mezi dárcem a příjemcem před transplantací ledvin a jako první krok genotypizace následovaný sekvencováním před transplantací kostní dřeně. Phototyping je robustní metoda ke genotypizaci malého až středního množství vzorků DNA. Je dostatečně rychlý, aby mohl být použit pro transplantační službu na telefonu; rozlišení je vyšší než u kvalitní sérologie, i když je cena se sérologií srovnatelná. Prezentujeme metodická vylepšení pre-PCR a post-PCR kroků PCR-SSP analýzy a zároveň tabulky frekvencí alel genů HLA-A, -B, -Cw, platné pro českou populaci. Současný komentář: PCR s elektroforézou v agarózovém gelu je metodou, vyučovanou v každém molekulárně genetickém praktiku. Ve svém základním rozestavění – při použití jednokanálové pipety může zacilování pipety do stovek jednotlivých jamek na gelu navodit u laboratorních pracovníků averzi vůči všem metodám, které vyžadují v posledním kroku agarózovou elektroforézu. Je možné, že metody genotypizace s použitím PCR v reálném čase anebo hmotnostní spektrometrie byly primárně vyvíjeny tímto popudem.
Prezentujeme zde metodická vylepšení (např. uzpůsobení všech manipulací pro použití 12ti kanálové pipety), která o řád navyšují účinnost laboratorního pracovníka při genotypizaci pomocí PCR-SSP a tím metodu rehabilitují. Některá z vylepšení jsou nezávisle na nás již nabízena komerčně.
40
7.9. A sugar, laundry detergent, and salt method for extraction of deoxyribonucleic acid from blood Drábek J., Petřek M. Biomedical Papers 146(2), 37-39. Pro izolaci savčí DNA z periferní krve existují kromě tradiční fenol-chloroform-isoamylalkoholové extrakce také metody, které nepoužívají toxické organické chemikálie: jsou to kolonkové adsorbční metody a metody vysolovací. Tyto metody jsou neustále zdokonalovány (např. Miller et al. (189) nahradili chloristan ve vysolovací metodě Wilcocksona (190) chloridem sodným). V našem článku prezentujeme další zjednodušující a zlevňující modifikace: pro lýzu erythrocytů používáme roztok cukru (sacharózy, využívající osmózu), pro štěpení proteinů prášek na praní (Persil, ve kterém jsou robustní proteinázy), pro vysolení kuchyňskou sůl. Metoda splňuje kritéria malé laboratoře akreditované Evropskou Federací pro Imunogenetiku na výtěžek, čistotu DNA, netoxicitu chemikálií, spolehlivost, rychlost a cenu. Současný komentář: metoda poskytuje překvapivě dobré výsledky s nezmražovanou krví v EDTA. Pokud je kvalita vzorku nižší, je výhodnější použít komerční kolonkovou metodu izolace.
41
8. Shrnutí Tato habilitační práce je úvodem do problematiky využití polymerázové řetězové reakce při genotypizaci. Výběrově prochází PCR-genotypizační metody z uživatelských a metodických aspektů, aby zařadila autorské publikace, které jsou součástí habilitační práce. Zabývá se rozsahem použití PCR převážně v lidské genetice, vyjmenovává omezení PCR a z praktického hlediska zmiňuje činitele úspěchu PCR. V závěru teoretické části práce přichází s konceptem metodické univerzality, ilustrovaným na dvou případových studiích. Přestože interpretace výsledků je navýsost důležitým krokem PCR a může být také podrobena univerzálnímu, unifikujícímu pohledu (například bayesovským přístupem (191)), je v této práci s ohledem na její soudržnost opomenuta. Zařazené autorské publikace popisují genotypizační techniky nejprve obecně a souhrnně (Článek 2). Pak se zaměřují na profilování lidské DNA (Články 6,7), profilování DNA houbových parazitů (Článek 1) a asociační studie. Mezi „asociačními“ publikacemi jsou takové, které podrobněji charakterizují polymorfismy spojené s funkcemi imunity při transplantacích (Články 4, 8), při rakovině (Článek 5) a při infekci (Článek 3). Prvním krokem každé PCR genotypizační metody je izolace DNA, proto je zde zařazena také autorská modifikace vysolovací metody s použitím snadno dostupných chemikálií (Článek 9).
42
9. Přehled literatury použité (1) Lee JY, Lim HW, Yoo SI, Zhang BT, Park TH. Simulation and real-time monitoring of polymerase chain reaction for its higher efficiency. Biochemical Engineering Journal 2006; 29(1-2):109-118. (2) Kainz P. The PCR plateau phase - towards an understanding of its limitations. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression 2000; 1494(1-2):23-27. (3) Bunce M, O'Neill CM, Barnardo MC, Krausa P, Browning MJ, Morris PJ, Welsh KI. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens 1995; 46(5):355-367. (4) Hui EK, Wang PC, Lo SJ. Strategies for cloning unknown cellular flanking DNA sequences from foreign integrants. Cellular & Molecular Life Sciences 1998; 54(12):1403-1411. (5) Welsh J, McClelland M. Genomic fingerprinting using arbitrarily primed PCR and a matrix of pairwise combinations of primers. Nucleic Acids Res 1991; 19(19):5275-5279. (6) Kersulyte D, Woods JP, Keath EJ, Goldman WE, Berg DE. Diversity among clinical isolates of Histoplasma capsulatum detected by polymerase chain reaction with arbitrary primers. Journal of Bacteriology 1992; 174(22):7075-7079. (7) Drabek J. A commented dictionary of techniques for genotyping. Electrophoresis 2001; 22(6):1024-1045. (8) Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, Zabeau M. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res 1995; 23(21):4407-4414. (9) Gill P, Ivanov PL, Kimpton C, Piercy R, Benson N, Tully G, Evett I, Hagelberg E, Sullivan K. Identification of the remains of the Romanov family by DNA analysis. Nat Genet 1994; 6(2):130-135. (10) Ahmed FE. Detection of genetically modified organisms in foods. Trends in Biotechnology 2002; 20(5):215-223. (11) Ghodke Y, Joshi K, Chopra A, Patwardhan B. HLA and disease. Eur J Epidemiol 2005; 20(6):475-488. (12) Jegga AG, Gowrisankar S, Chen J, Aronow BJ. PolyDoms: a whole genome database for the identification of non-synonymous coding SNPs with the potential to impact disease. Nucleic Acids Res 2007; 35(Database issue):D700-D706. (13) Roots I, Laschinski G, Arjomand-Nahad F, Kirchheiner J, Schwarz D, Brockmoller J, Cascorbi I, Gerloff T. Genotype and phenotype relationship in drug metabolism. Ernst Schering Res Found Workshop 2007;(59):81-100. (14) Shastry BS. Pharmacogenetics and the concept of individualized medicine. Pharmacogenomics Journal 2006; 6(1):16-21. (15) Ferguson LR. Nutrigenomics: integrating genomic approaches into nutrition research. Mol Diagn Ther 2006; 10(2):101-108. (16) Watzinger F, Ebner K, Lion T. Detection and monitoring of virus infections by real-time PCR. Mol Aspects Med 2006; 27(2-3):254-298.
43
(17) Edwards KA, Clancy HA, Baeumner AJ. Bacillus anthracis: toxicology, epidemiology and current rapid-detection methods. Anal Bioanal Chem 2006; 384(1):73-84. (18) Zhou MY, Gomez-Sanchez CE. Universal TA cloning. Curr Issues Mol Biol 2000; 2(1):1-7. (19) Muller KM, Stebel SC, Knall S, Zipf G, Bernauer HS, Arndt KM. Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling: a robust method for DNA fragmentation and directed evolution. Nucleic Acids Res 2005; 33(13). (20) Harayama S. Artificial evolution by DNA shuffling. Trends Biotechnol 1998; 16(2):76-82. (21) Giglio S, Monis PT, Saint CP. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res 2003; 31(22). (22) Bio-Rad Laboratories. Real-Time PCR. Applications Guide. Rev A, 05-0531, 0805, Sig 1204[Bulletin 5279], 1-100. 2005. (23) Smith J, Modrich P. Removal of polymerase-produced mutant sequences from PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1997; 94(13):6847-6850. (24) Olszewski M, Rebala K, Szczerkowska Z, Kur J. Application of SSB-like protein from Thermus aquaticus in multiplex PCR of human Y-STR markers identification. Mol Cell Probes 2005; 19(3):203-205. (25) Rapley R. Enhancing PCR amplification and sequencing using DNA-binding proteins. Molecular Biotechnology 1994; 2(3):295-298. (26) Jiang Z, Zhang X, Deka R, Jin L. Genome amplification of single sperm using multiple displacement amplification. Nucleic Acids Res 2005; 33(10):e91. (27) Braslavsky I, Hebert B, Kartalov E, Quake SR. Sequence information can be obtained from single DNA molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2003; 100(7):3960-3964. (28) Lo YM. Detection of minority nucleic acid populations by PCR. Journal of Pathology 1994; 174(1):1-6. (29) Gill P. Application of low copy number DNA profiling. Croat Med J 2001; 42(3):229-232. (30) Kloosterman AD, Kersbergen P. Efficacy and limits of genotyping low copy number (LCN) DNA samples by multiplex PCR of STR loci. J Soc Biol 2003; 197(4):351-359. (31) Dean FB, Hosono S, Fang L, Wu X, Faruqi AF, Bray-Ward P, Sun Z, Zong Q, Du Y, Du J, Driscoll M, Song W, Kingsmore SF, Egholm M, Lasken RS. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002; 99(8):5261-5266. (32) Dietmaier W, Hartmann A, Wallinger S, Heinmoller E, Kerner T, Endl E, Jauch KW, Hofstadter F, Ruschoff J. Multiple mutation analyses in single tumor cells with improved whole genome amplification. American Journal of Pathology 1999; 154(1):83-95. (33) Hanson EK, Ballantyne J. Whole genome amplification strategy for forensic genetic analysis using single or few cell equivalents of genomic DNA. Analytical Biochemistry 2005; 346(2):246-257. (34) Guillaud-Bataille M, Valent A, Soularue P, Perot C, Inda MDM, Receveur A, Smaili S, Crollius HR, Benard J, Bernheim A, Gidrol X, Danglot G. Detecting single DNA copy
44
number variations in complex genomes using one nanogram of starting DNA and BACarray CGH. Nucleic Acids Res 2004; 32(13). (35) Hosono S, Faruqi AF, Dean FB, Du Y, Sun Z, Wu X, Du J, Kingsmore SF, Egholm M, Lasken RS. Unbiased whole-genome amplification directly from clinical samples. Genome Res 2003; 13(5):954-964. (36) Wang G, Brennan C, Rook M, Wolfe JL, Leo C, Chin L, Pan H, Liu WH, Price B, Makrigiorgos GM. Balanced-PCR amplification allows unbiased identification of genomic copy changes in minute cell and tissue samples. Nucleic Acids Res 2004; 32(9). (37) Malkoc E, Neuteboom W. The current status of forensic science laboratory accreditation in Europe. Forensic Sci Int 2006. (38) Pruvost M, Grange T, Geigl EM. Minimizing DNA contamination by using UNG-coupled quantitative real-time PCR on degraded DNA samples: application to ancient DNA studies. Biotechniques 2005; 38(4):569-575. (39) Kwok S, Higuchi R. Avoiding false positives with PCR [published erratum appears in Nature 1989 Jun 8;339(6224):490]. Nature 1989; 339(6221):237-238. (40) Cooper A, Poinar HN. Ancient DNA: do it right or not at all. Science 2000; 289(5482):1139. (41) Eshleman J, Smith DG. Use of DNase to eliminate contamination in ancient DNA analysis. Electrophoresis 2001; 22(20):4316-4319. (42) Rochelle PA, Weightman AJ, Fry JC. DNase I treatment of Taq DNA polymerase for complete PCR decontamination. Biotechniques 1992; 13(4):520. (43) Matthews JLK, Chung M, Matyas RJ. Persistent DNA contamination in competitive RTPCR using cRNA internal standards: identity, quantity, and control. Biotechniques 2002; 32(6):1412-1417. (44) Miner BE, Stoger RJ, Burden AF, Laird CD, Hansen RS. Molecular barcodes detect redundancy and contamination in hairpin-bisulfite PCR. Nucleic Acids Res 2004; 32(17). (45) Kermekchiev MB, Tzekov A, Barnes WM. Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR. Nucleic Acids Res 2003; 31(21):6139-6147. (46) Kainz P, Schmiedlechner A, Strack HB. Specificity-enhanced hot-start PCR: addition of double-stranded DNA fragments adapted to the annealing temperature. Biotechniques 2000; 28(2):278-282. (47) Kaboev OK, Shevelev IV, Luchkina LA, Tret'iakov AN, Shcherbakova OG. [Hot start of the polymerase chain reaction using DNA helicase]. Bioorg Khim 1999; 25(5):398-400. (48) Hebert B, Bergeron J, Potworowski EF, Tijssen P. Increased PCR sensitivity by using paraffin wax as a reaction mix overlay. Mol Cell Probes 1993; 7(3):249-252. (49) Ignatov KB, Miroshnikov AI, Kramarov VM. [A new approach to enhance PCR specificity]. Bioorg Khim 2003; 29(4):403-407. (50) Draghici S, Khatri P, Eklund AC, Szallasi Z. Reliability and reproducibility issues in DNA microarray measurements. Trends in Genetics 2006; 22(2):101-109. (51) Dirks RM, Lin M, Winfree E, Pierce NA. Paradigms for computational nucleic acid design. Nucleic Acids Res 2004; 32(4):1392-1403.
45
(52) Allawi HT, SantaLucia J. Thermodynamics and NMR of internal GT mismatches in DNA. Biochemistry 1997; 36(34):10581-10594. (53) Breslauer KJ, Frank R, Blocker H, Marky LA. Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1986; 83(11):3746-3750. (54) Sugimoto N, Nakano S, Yoneyama M, Honda K. Improved thermodynamic parameters and helix initiation factor to predict stability of DNA duplexes. Nucleic Acids Res 1996; 24(22):4501-4505. (55) SantaLucia J, Allawi HT, Seneviratne A. Improved nearest-neighbor parameters for predicting DNA duplex stability. Biochemistry 1996; 35(11):3555-3562. (56) von Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E. Oligonucleotide melting temperatures under PCR conditions: nearest-neighbor corrections for Mg(2+), deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas. Clin Chem 2001; 47(11):1956-1961. (57) Peyret N, Seneviratne PA, Allawi HT, SantaLucia J, Jr. Nearest-neighbor thermodynamics and NMR of DNA sequences with internal A.A, C.C, G.G, and T.T mismatches. Biochemistry 1999; 38(12):3468-3477. (58) Kwok S, Kellogg DE, McKinney N, Spasic D, Goda L, Levenson C, Sninsky JJ. Effects of primer-template mismatches on the polymerase chain reaction: human immunodeficiency virus type 1 model studies. Nucleic Acids Res 1990; 18(4):999-1005. (59) Roux KH. Using mismatched primer-template pairs in touchdown PCR. Biotechniques 1994; 16(5):812-814. (60) Drabek J. Study of human genetics in MHC region: application of PCR-based molecular genetics methods to HLA class I and II typing. University of Palacky, Olomouc, 1999. (61) Guo Z, Liu Q, Smith LM. Enhanced discrimination of single nucleotide polymorphisms by artificial mismatch hybridization. Nat Biotechnol 1997; 15(4):331-335. (62) Fiandaca MJ, Hyldig-Nielsen JJ, Gildea BD, Coull JM. Self-reporting PNA/DNA primers for PCR analysis. Genome Res 2001; 11(4):609-613. (63) Doi K. A Greedy Algorithm for minimizing the number of primers in multiple PCR experiments. Genome Inform Ser Workshop Genome Inform 1999; 10:73-82. (64) Gorelenkov V, Antipov A, Lejnine S, Daraselia N, Yuryev A. Set of novel tools for PCR primer design. Biotechniques 2001; 31(6):1326-1330. (65) Kampke T, Kieninger M, Mecklenburg M. Efficient primer design algorithms. Bioinformatics 2001; 17(3):214-225. (66) Nicodeme P, Steyaert JM. Selecting optimal oligonucleotide primers for multiplex PCR. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol 1997; 5:210-213. (67) Huang YC, Chuang HY, Tsail HK, Chang CF, Kao CY. Designing multiple-use primer set for multiplex PCR by using compact GAs. Parallel Problem Solving from Nature - Ppsn Viii 2004; 3242:511-521. (68) Rachlin J, Ding CM, Cantor C, Kasif S. MuPlex: multi-objective multiplex PCR assay design. Nucleic Acids Res 2005; 33:W544-W547.
46
(69) Chen SH, Lin CY, Cho CS, Lo CZ, Hsiung CA. Primer Design Assistant (PDA): a webbased primer design tool. Nucleic Acids Res 2003; 31(13):3751-3754. (70) Rozen S, Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol 2000; 132:365-386. (71) Gorelenkov V, Antipov A, Lejnine S, Daraselia N, Yuryev A. Set of novel tools for PCR primer design. Biotechniques 2001; 31(6):1326-1330. (72) Ben Zakour N, Gautier M, Andonov R, Lavenier D, Cochet MF, Veber P, Sorokin A, Le Loir Y. GenoFrag: software to design primers optimized for whole genome scanning by long-range PCR amplification. Nucleic Acids Res 2004; 32(1):17-24. (73) Emrich SJ, Lowe M, Delcher AL. PROBEmer: a web-based software tool for selecting optimal DNA oligos. Nucleic Acids Res 2003; 31(13):3746-3750. (74) Bunce M, Barnardo MCNM, Welsh KI. The PCR-SSP Manager computer program: a tool for maintaining sequence alignments and automatically updating the specificities of PCRSSP primers and primer mixes. Tissue Antigens 1998; 52:158-174. (75) Rose TM, Henikoff JG, Henikoff S. CODEHOP (COnsensus-DEgenerate hybrid oligonucleotide primer) PCR primer design. Nucleic Acids Res 2003; 31(13):3763-3766. (76) Vallone PM, Butler JM. AutoDimer: a screening tool for primer-dimer and hairpin structures. Biotechniques 2004; 37(2):226-231. (77) Rouillard JM, Lee W, Truan G, Gao XL, Zhou XC, Gulari E. Gene2Oligo: oligonucleotide design for in vitro gene synthesis. Nucleic Acids Res 2004; 32:W176-W180. (78) Shevchuk NA, Bryksin AV, Nusinovich YA, Cabello FC, Sutherland M, Ladisch S. Construction of long DNA molecules using long PCR-based fusion of several fragments simultaneously. Nucleic Acids Res 2004; 32(2). (79) Weckx S, De Rijk P, Van Broeckhoven C, Del Favero J. SNPbox: web-based highthroughput primer design from gene to genome. Nucleic Acids Res 2004; 32:W170-W172. (80) Rotmistrovsky K, Jang W, Schuler GD. A web server for performing electronic PCR. Nucleic Acids Res 2004; 32:W108-W112. (81) Rubin E, Levy AA. A mathematical model and a computerized simulation PCR using complex templates. Nucleic Acids Res 1996; 24(18):3538-3545. (82) Li LC, Dahiya R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics 2002; 18(11):1427-1431. (83) Wang Y, Prosen DE, Mei L, Sullivan JC, Finney M, Vander Horn PB. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. Nucleic Acids Res 2004; 32(3):1197-1207. (84) Ignatov KB, Bashirova AA, Miroshnikov AI, Kramarov VM. Mutation S543N in the thumb subdomain of the Taq DNA polymerase large fragment suppresses pausing associated with the template structure. FEBS Lett 1999; 448(1):145-148. (85) Mitra RD, Church GM. In situ localized amplification and contact replication of many individual DNA molecules. Nucleic Acids Res 1999; 27(24):e34. (86) Nakahara K, Hataya T, Uyeda I. A simple, rapid method of nucleic acid extraction without tissue homogenization for detecting viroids by hybridization and RT-PCR. J Virol Methods 1999; 77(1):47-58.
47
(87) Boiteux LS, Fonseca MEN, Simon PW. Effects of plant tissue and DNA purification method on randomly amplified polymorphic DNA-based genetic fingerprinting analysis in carrot. Journal of the American Society for Horticultural Science 1999; 124(1):32-38. (88) Drabek J, Petrek M. Sugar, laundry detergent, and salt method of extraction of deoxyribonucleic acid from blood. Biomedical Papers 2002; 146(2):37-39. (89) Kishida T, Fukuda M, Okazaki K, Wang W, Tamaki Y. DNA typing by triplex affinity capture (TAC) PCR. Nippon Hoigaku Zasshi 1996; 50(4):255-257. (90) Wilson IG. Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification. Appl Environ Microbiol 1997; 63(10):3741-3751. (91) Akane A, Matsubara K, Nakamura H, Takahashi S, Kimura K. Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains, a major inhibitor of polymerase chain reaction (PCR) amplification. J Forensic Sci 1994; 39(2):362372. (92) Al Soud WA, Radstrom P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J Clin Microbiol 2001; 39(2):485-493. (93) Cogswell FB, Bantar CE, Hughes TG, Gu Y, Philipp MT. Host DNA can interfere with detection of Borrelia burgdorferi in skin biopsy specimens by PCR. Journal of Clinical Microbiology 1996; 34(4):980-982. (94) Chandler DP, Wagnon CA, Bolton H, Jr. Reverse transcriptase (RT) inhibition of PCR at low concentrations of template and its implications for quantitative RT-PCR. Applied and Environmental Microbiology 1998; 64(2):669-677. (95) Suslov O, Steindler DA. PCR inhibition by reverse transcriptase leads to an overestimation of amplification efficiency. Nucleic Acids Res 2005; 33(20). (96) Lewis GD, Molloy SL, Greening GE, Dawson J. Influence of environmental factors on virus detection by RT-PCR and cell culture. J Appl Microbiol 2000; 88(4):633-640. (97) Wadowsky RM, Laus S, Libert T, States SJ, Ehrlich GD. Inhibition of PCR-based assay for Bordetella pertussis by using calcium alginate fiber and aluminum shaft components of a nasopharyngeal swab. Journal of Clinical Microbiology 1994; 32(4):1054-1057. (98) Rossen L, Norskov P, Holmstrom K, Rasmussen OF. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNA-extraction solutions. International Journal of Food Microbiology 1992; 17(1):37-45. (99) Bourke MT, Scherczinger CA, Ladd C, Lee HC. NaOH treatment to neutralize inhibitors of Taq polymerase. J Forensic Sci 1999; 44(5):1046-1050. (100) Braid MD, Daniels LM, Kitts CL. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods 2003; 52(3):389-393. (101) Kalmar T, Bachrati CZ, Marcsik A, Rasko I. A simple and efficient method for PCR amplifiable DNA extraction from ancient bones. Nucleic Acids Res 2000; 28(12):E67. (102) nni C, Brousseau T, Laudet V, Stehelin D. Isopropanol precipitation removes PCR inhibitors from ancient bone extracts. Nucleic Acids Res 1995; 23(5):881-882. (103) Miller DN, Bryant JE, Madsen EL, Ghiorse WC. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples. Applied and Environmental Microbiology 1999; 65(11):4715-4724.
48
(104) Miller DN. Evaluation of gel filtration resins for the removal of PCR-inhibitory substances from soils and sediments. J Microbiol Methods 2001; 44(1):49-58. (105) Shutler GG, Gagnon P, Verret G, Kalyn H, Korkosh S, Johnston E, Halverson J. Removal of a PCR inhibitor and resolution of DNA STR types in mixed human-canine stains from a five year old case. J Forensic Sci 1999; 44(3):623-626. (106) Moreira D. Efficient removal of PCR inhibitors using agarose-embedded DNA preparations. Nucleic Acids Res 1998; 26(13):3309-3310. (107) Monteiro L, Gras N, Megraud F. Magnetic immuno-PCR assay with inhibitor removal for direct detection of Helicobacter pylori in human feces. J Clin Microbiol 2001; 39(10):37783780. (108) Ruano G, Pagliaro EM, Schwartz TR, Lamy K, Messina D, Gaensslen RE, Lee HC. Heatsoaked PCR: an efficient method for DNA amplification with applications to forensic analysis. Biotechniques 1992; 13(2):266-274. (109) Schwarz K, Hansen-Hagge T, Bartram C. Improved yields of long PCR products using gene 32 protein. Nucleic Acids Res 1990; 18(4):1079. (110) Shigemori Y, Mikawa T, Shibata T, Oishi M. Multiplex PCR: use of heat-stable Thermus thermophilus RecA protein to minimize non-specific PCR products. Nucleic Acids Res 2005; 33(14). (111) Kreader CA. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Applied and Environmental Microbiology 1996; 62(3):1102-1106. (112) Chakrabarti R, Schutt CE. The enhancement of PCR amplification by low molecular-weight sulfones. Gene 2001; 274(1-2):293-298. (113) Demeke T, Adams RP. The effects of plant polysaccharides and buffer additives on PCR. Biotechniques 1992; 12(3):332-334. (114) Chakrabarti R, Schutt CE. Novel sulfoxides facilitate GC-rich template amplification. Biotechniques 2002; 32(4):866-874. (115) Spiess AN, Ivell R. A highly efficient method for long-chain cDNA synthesis using trehalose and betaine. Analytical Biochemistry 2002; 301(2):168-174. (116) Chakrabarti R, Schutt CE. The enhancement of PCR amplification by low molecular weight amides. Nucleic Acids Res 2001; 29(11):2377-2381. (117) Kovarova M, Draber P. New specificity and yield enhancer of polymerase chain reactions. Nucleic Acids Res 2000; 28(13):E70. (118) Wan CY, Wilkins TA. Spermidine facilitates PCR amplification of target DNA. PCR Methods & Applications 1993; 3:208-210. (119) Spiess AN, Mueller N, Ivell R. Trehalose is a potent PCR enhancer: lowering of DNA melting temperature and thermal stabilization of taq polymerase by the disaccharide trehalose. Clin Chem 2004; 50(7):1256-1259. (120) Li M, Lin YC, Wu CC, Liu HS. Enhancing the efficiency of a PCR using gold nanoparticles. Nucleic Acids Res 2005; 33(21). (121) Singh RP, Nie X, Singh M, Coffin R, Duplessis P. Sodium sulphite inhibition of potato and cherry polyphenolics in nucleic acid extraction for virus detection by RT-PCR. J Virol Methods 2002; 99(1-2):123-131.
49
(122) Ralser M, Querfurth R, Warnatz HJ, Lehrach H, Yaspo ML, Krobitsch S. An efficient and economic enhancer mix for PCR. Biochem Biophys Res Commun 2006; 347(3):747-751. (123) Ralser M, Querfurth R, Warnatz HJ, Lehrach H, Yaspo ML, Krobitsch S. An efficient and economic enhancer mix for PCR. Biochem Biophys Res Commun 2006; 347(3):747-751. (124) Poinar HN, Schwarz C, Qi J, Shapiro B, MacPhee RDE, Buigues B, Tikhonov A, Huson DH, Tomsho LP, Auch A, Rampp M, Miller W, Schuster SC. Metagenomics to paleogenomics: large-scale sequencing of mammoth DNA. Science 2006; 311(5759):392394. (125) Rithidech KN, Dunn JJ, Gordon CR. Combining multiplex and touchdown PCR to screen murine microsatellite polymorphisms. Biotechniques 1997; 23(1):36-44. (126) Hecker KH, Roux KH. High and low annealing temperatures increase both specificity and yield in touchdown and stepdown PCR. Biotechniques 1996; 20(3):478-485. (127) Shoffner MA, Cheng J, Hvichia GE, Kricka LJ, Wilding P. Chip PCR. I. Surface passivation of microfabricated silicon-glass chips for PCR. Nucleic Acids Res 1996; 24(2):375-379. (128) Cheng J, Shoffner MA, Hvichia GE, Kricka LJ, Wilding P. Chip PCR. II. Investigation of different PCR amplification systems in microbabricated silicon-glass chips. Nucleic Acids Res 1996; 24(2):380-385. (129) Zou QB, Sridhar U, Chen Y, Singh J. Miniaturized, independently controllable multichamber thermal cycler. Ieee Sensors Journal 2003; 3(6):774-780. (130) Goedecke N, McKenna B, El Difrawy S, Carey L, Matsudaira P, Ehrlich D. A highperformance multilane microdevice system designed for the DNA forensics laboratory. Electrophoresis 2004; 25(10-11):1678-1686. (131) Poliski I. Lab-on-chip technology gains ground. Research & Development 2002; 44(2):4244. (132) Kojima T, Takei Y, Ohtsuka M, Kawarasaki Y, Yamane T, Nakano H. PCR amplification from single DNA molecules on magnetic beads in emulsion: application for highthroughput screening of transcription factor targets. Nucleic Acids Res 2005; 33(17). (133) Edwards MC, Gibbs RA. Multiplex PCR: advantages, development, and applications. PCR Methods & Applications 1994; 3(4):S65-S75. (134) Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH, Vogt PH. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques 1997; 23(3):504-511. (135) Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE. Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. Clinical Microbiology Reviews 2000; 13(4):559-570. (136) Markoulatos P, Siafakas N, Moncany M. Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach. Journal of Clinical Laboratory Analysis 2002; 16(1):47-51. (137) Broude NE, Zhang L, Woodward K, Englert D, Cantor CR. Multiplex allele-specific target amplification based on PCR suppression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2001; 98(1):206-211. (138) Brownie J, Shawcross S, Theaker J, Whitcombe D, Ferrie R, Newton C, Little S. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR. Nucleic Acids Res 1997; 25(16):32353241.
50
(139) Broude NE, Driscoll K, Cantor CR. High-level multiplex DNA amplification. Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2001; 11(5):327-332. (140) Kennedy B, Arar K, Reja V, Henry RJ. Locked nucleic acids for optimizing displacement probes for quantitative real-time PCR. Analytical Biochemistry 2006; 348(2):294-299. (141) Demidov VV, Kuhn H, Lavrentieva-Smolina IV, Frank-Kamenetskii MD. Peptide nucleic acid-assisted topological labeling of duplex dna. Methods 2001; 23(2):123-131. (142) Latorra D, Arar K, Hurley JM. Design considerations and effects of LNA in PCR primers. Molecular and Cellular Probes 2003; 17(5):253-259. (143) Reynisson E, Josefsen MH, Krause M, Hoorfar J. Evaluation of probe chemistries and platforms to improve the detection limit of real-time PCR. J Microbiol Methods 2006; 66(2):206-216. (144) Levin JD, Fiala D, Samala MF, Kahn JD, Peterson RJ. Position-dependent effects of locked nucleic acid (LNA) on DNA sequencing and PCR primers. Nucleic Acids Res 2006; 34(20):e142. (145) Drabek J, Stavek J, Jaluvkova M, Jurcek T, Frebort I. Quantification of DNA during winemaking by fluorimetry and Vitis vinifera L.-specific quantitative PCR. Eur Food Res Technol 2007; in press. (146) Chomczynski P, Mackey K, Drews R, Wilfinger W. DNAzol(R): A reagent for the rapid isolation of genomic DNA. Biotechniques 1997; 22(3):550-553. (147) Savazzini F, Martinelli L. DNA analysis in wines: Development of methods for enhanced extraction and real-time polymerase chain reaction quantification. Anal Chim Acta 2006; 563(1-2):274-282. (148) Valsesia G, Gobbin D, Patocchi A, Vecchione A, Pertot I, Gessler C. Development of a high-throughput method for quantification of Plasmopara viticola DNA in grapevine leaves by means of quantitative real-time polymerase chain reaction. Phytopathology 2005; 95(6):672678. (149) Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 1990; 215(3):403-410. (150) Nicklas JA, Buel E. Simultaneous determination of total human and male DNA using a duplex real-time PCR assay. J Forensic Sci 2006; 51(5):1005-1015. (151) Nicklas JA, Buel E. An Alu-based, MGB Eclipse real-time PCR method for quantitation of human DNA in forensic samples. J Forensic Sci 2005; 50(5):1081-1090. (152) Lin Z, Cui X, Li H. Multiplex genotype determination at a large number of gene loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1996; 93(6):2582-2587. (153) Wittwer CT, Herrmann MG, Gundry CN, Elenitoba-Johnson KS. Real-time multiplex PCR assays. Methods 2001; 25(4):430-442. (154) Hernandez M, Rodriguez-Lazaro D, Esteve T, Prat S, Pla M. Development of melting temperature-based SYBR Green I polymerase chain reaction methods for multiplex genetically modified organism detection. Anal Biochem 2003; 323(2):164-170. (155) Zhang YL, Zhang DB, Li WQ, Chen JQ, Peng YF, Cao W. A novel real-time quantitative PCR method using attached universal template probe. Nucleic Acids Res 2003; 31(20).
51
(156) Li J, Wang FF, Mamon H, Kulke MH, Harris L, Maher E, Wang LL, Makrigiorgos GM. Antiprimer quenching-based real-time PCR and its application to the analysis of clinical cancer samples. Clinical Chemistry 2006; 52(4):624-633. (157) Binladen J, Gilbert MTP, Campos PF, Willerslev E. 5´- tailed sequencing primers improve sequencing quality of PCR products. Biotechniques 2007; 42(2):174-176. (158) Schuelke M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments. Nature Biotechnology 2000; 18(2):233-234. (159) Nuovo GJ, Hohman RJ, Nardone GA, Nazarenko IA. In situ amplification using universal energy transfer-labeled primers. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 1999; 47(3):273-279. (160) Guo DC, Milewicz DM. Methodology for using a universal primer to label amplified DNA segments for molecular analysis. Biotechnology Letters 2003; 25(24):2079-2083. (161) Shuber AP, Grondin VJ, Klinger KW. A simplified procedure for developing multiplex PCRs. Genome Res 1995; 5(5):488-493. (162) Pemov A, Modi H, Chandler DP, Bavykin S. DNA analysis with multiplex microarrayenhanced PCR. Nucleic Acids Res 2005; 33(2). (163) Ailenberg M, Silverman M. Controlled hot start and improved specificity in carrying out PCR utilizing touch-up and loop incorporated primers (TULIPS). Biotechniques 2000; 29(5):1018-1024. (164) Krenke BE, Tereba A, Anderson SJ, Buel E, Culhane S, Finis CJ, Tomsey CS, Zachetti JM, Masibay A, Rabbach DR, Amiott EA, Sprecher CJ. Validation of a 16-locus fluorescent multiplex system. J Forensic Sci 2002; 47(4):773-785. (165) Oetting WS, Armstrong CM, Ronan SM, Young TL, Sellers TA, King RA. Multiplexed short tandem repeat polymorphisms of the Weber 8A set of markers using tailed primers and infrared fluorescence detection. Electrophoresis 1998; 19(18):3079-3083. (166) Dixon LA, Murray CM, Archer EJ, Dobbins AE, Koumi P, Gill P. Validation of a 21-locus autosomal SNP multiplex for forensic identification purposes. Forensic Sci Int 2005; 154(1):62-77. (167) Drobinskaya I, Gabbert HE, Moeslein G, Mueller W. A new method for optimizing multiplex DNA microsatellite analysis in low quality archival specimens. Anticancer Res 2005; 25(5):3251-3258. (168) Plachy R, Hamal P, Raclavsky V. McRAPD as a new approach to rapid and accurate identification of pathogenic yeasts. Journal of Microbiological Methods 2005; 60(1):107-113. (169) Sugita T, Shiraki Y, Hiruma M. Real-time PCR TaqMan assay for detecting Trichophyton tonsurans, a causative agent of tinea capitis, from hairbrushes. Med Mycol 2006; 44(6):579581. (170) Kano R, Hirai A, Muramatsu M, Watari T, Hasegawa A. Direct detection of dermatophytes in skin samples based on sequences of the chitin synthase 1 (CHS1) gene. J Vet Med Sci 2003; 65(2):267-270. (171) Turin L, Riva F, Galbiati G, Cainelli T. Fast, simple and highly sensitive double-rounded polymerase chain reaction assay to detect medically relevant fungi in dermatological specimens. Eur J Clin Invest 2000; 30(6):511-518.
52
(172) Sahgal N, Monk B, Wasil M, Magan N. Trichophyton species: use of volatile fingerprints for rapid identification and discrimination. Br J Dermatol 2006; 155(6):1209-1216. (173) Stuber F. Human genotyping. Crit Care Med 2005; 33(12 Suppl):S453-S456. (174) Strerath M, Marx A. Genotyping--from genomic DNA to genotype in a single tube. Angew Chem Int Ed Engl 2005; 44(48):7842-7849. (175) Imle P. Aspects influencing genotyping method selection. Methods Mol Biol 2005; 311:6372. (176) Tong AK, Ju J. Multiplex single-nucleotide polymorphism detection by combinatorial fluorescence energy transfer tags and molecular affinity. Methods Mol Biol 2006; 335:201214. (177) Gunderson KL, Steemers FJ, Ren H, Ng P, Zhou L, Tsan C, Chang W, Bullis D, Musmacker J, King C, Lebruska LL, Barker D, Oliphant A, Kuhn KM, Shen R. Wholegenome genotyping. Methods Enzymol 2006; 410:359-376. (178) Handal MI, Ugaz VM. DNA mutation detection and analysis using miniaturized microfluidic systems. Expert Rev Mol Diagn 2006; 6(1):29-38. (179) Dunbar SA. Applications of Luminex xMAP technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection. Clin Chim Acta 2006; 363(1-2):71-82. (180) Elsner HA, Drabek J, Rebmann V, Ambruzova Z, Grosse-Wilde H, Blasczyk R. Nonexpression of HLA-B*5111N is caused by an insertion into the cytosine island at exon 4 creating a frameshift stop codon. Tissue Antigens 2001; 57(4):369-372. (181) Mrazek F, Fae I, Ambruzova Z, Raida L, Indrak K, Petrek M, Fischer GF. A novel HLAB*420502 allele identified by PCR-SSO/SSP routine typing and confirmed by Sequencingbased typing. Tissue Antigens 2005; 65(3):275-277. (182) Mrazek F, Fae I, Ambruzova Z, Raida L, Kriegova E, Indrak K, Fischer GF, Petrek M. A single amino acid exchange shifts the serological reactivity of the novel HLA-B*4442 allele product from HLA-B44 to HLA-B21. Int J Immunogenet 2006; 33(3):197-200. (183) Seemanova E, Hoch J, Herzogova J, Kawaciuk I, Janda J, Kohoutova M, Seeman P, Varon R, Sperling K. [Mutations in tumor suppressor gene NBS1 in adult patients with malignancies]. Cas Lek Cesk 2006; 145(3):201-203. (184) Seemanova E, Jarolim P, Seeman P, Varon R, Sperling K. [Increased risk of malignancies in heterozygotes in families of patients with Nijmegen breakage syndrome]. Cas Lek Cesk 2006; 145(2):138-143. (185) Seemanova E, Sperling K, Neitzel H, Varon R, Hadac J, Butova O, Schrock E, Seeman P, Digweed M. Nijmegen breakage syndrome (NBS) with neurological abnormalities and without chromosomal instability. J Med Genet 2006; 43(3):218-224. (186) Seeman P, Gebertova K, Paderova K, Sperling K, Seemanova E. Nijmegen breakage syndrome in 13% of age-matched Czech children with primary microcephaly. Pediatr Neurol 2004; 30(3):195-200. (187) Alonso A, Martin P, Albarran C, Garcia P, Fernandez DS, Jesus IM, Fernandez-Rodriguez A, Atienza I, Capilla J, Garcia-Hirschfeld J, Martinez P, Vallejo G, Garcia O, Garcia E, Real P, Alvarez D, Leon A, Sancho M. Challenges of DNA profiling in mass disaster investigations. Croat Med J 2005; 46(4):540-548.
53
(188) Gill P, Fereday L, Morling N, Schneider PM. The evolution of DNA databases Recommendations for new European STR loci. Forensic Sci Int 2006; 156(2-3):242-244. (189) Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988; 16(3):1215. (190) Wilcockson J. The use of sodium perchlorate in deproteinization during the preparation of nucleic acids. Biochem J 1973; 135(3):559-561. (191) Foreman LA, Smith AF, Evett IW. A Bayesian approach to validating STR multiplex databases for use in forensic casework. Int J Legal Med 1997; 110(5):244-250.
54
