Közeli infravörös spektroszkópia alkalmazása a búza érésdinamikai folyamatainak követésében

Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszék

Közeli infravörös spektroszkópia alkalmazása a búza érésdinamikai folyamatainak követésében c. PhD értekezés

Készítette:

Gergely Szilveszter okleveles biomérnök

Témavezető:

Prof. Salgó András tanszékvezető egyetemi tanár

Budapest y 2005

TARTALOMJEGYZÉK 1. Bevezetés ........................................................................................................................... 1 2. Irodalmi áttekintés ............................................................................................................. 2 2.1. A búza szemfejlődésének folyamatai ........................................................................ 2 2.1.1. Búzatermesztés hazánkban................................................................................. 2 2.1.2. A mag és a termés általános fejlődése ............................................................... 3 2.1.3. A búzaszem fejlődése......................................................................................... 5 2.1.3.1. A búzaszem szerkezete............................................................................... 5 2.1.3.2. A szemfejlődés nyomon követésének célja................................................ 7 2.1.3.3. A búzaszem érésének szintjei a hazai definíciók szerint............................ 7 2.1.3.4. A búzaszem érésének szintjei az angolszász definíciók szerint ................. 8 2.1.4. A búzaszem fő összetevői és változásuk a szemfejlődés során ......................... 9 2.1.4.1. A víz – modellek, típusok......................................................................... 10 2.1.4.2. A búzamag nedvességtartalmának változása a szemfejlődés során ......... 12 2.1.4.3. A búzamag száraz- és nedvestömegének változása a szemfejlődés során 13 2.1.4.3. A búzamag szénhidráttartalmának változása a szemfejlődés során ......... 14 2.1.4.4. A búzamag fehérjetartalmának változása a szemfejlődés során .............. 16 2.2. A közeli infravörös spektroszkópia alkalmazása a búza fő összetevőinek vizsgálataiban................................................................................................................. 19 2.2.1. A közeli infravörös spektroszkópia áttekintése................................................ 19 2.2.1.1. A közeli infravörös spektroszkópia kialakulásának története .................. 19 2.2.1.2. A közeli infravörös spektroszkópia alapjai .............................................. 21 2.2.1.3. A közeli infravörös készülékek felépítése és működése .......................... 22 2.2.1.4. A közeli infravörös technika előnyei és hátrányai ................................... 24 2.2.2. A búzaszem fő összetevői és közeli infravörös spektrumainak kapcsolata ..... 26 2.2.2.1. A víz változásának vizsgálata közeli infravörös spektroszkópiával ........ 26 2.2.2.2. A szénhidrátok vizsgálata közeli infravörös spektroszkópiával............... 28 2.2.2.3. A fehérjék vizsgálata közeli infravörös spektroszkópiával...................... 31 3. Célkitűzés ........................................................................................................................ 35 4. Anyagok és módszerek.................................................................................................... 36 4.1. A búzaminták eredete és a mintavétel ..................................................................... 36 4.2. Nedvestömeg, nedvesség- és nitrogéntartalom meghatározása............................... 37 4.3. Spektroszkópiai mérések ......................................................................................... 38 4.4. A spektroszkópiai azonosítást segítő anyagok......................................................... 39

i

4.5. A feldolgozáshoz használt számítási módszerek ..................................................... 40 4.5.1. Spektrum-transzformáció: deriváltak............................................................... 40 4.5.2. Minősítés: polár minősítő rendszer (PQS) ....................................................... 42 4.5.3. Kalibrálás: részleges legkisebb négyzetek módszere (PLS) ............................ 44 5. Eredmények és értékelés ................................................................................................. 46 5.1. A búzaminták fő összetevőinek nedveskémiai vizsgálati eredményei .................... 46 5.1.1. Nedvességtartalom, száraz- és nedvestömeg ................................................... 46 5.1.2. Nitrogén-, fehérje- és szénhidráttartalom......................................................... 51 5.2. A búzaminták fő összetevőinek spektroszkópiai vizsgálati eredményei ................. 56 5.2.1. A NIR spektrum jellegzetes víz sávjainak vizsgálata ...................................... 57 5.2.2. A NIR spektrum jellegzetes szénhidrát sávjainak vizsgálata........................... 63 5.2.3. A NIR spektrum jellegzetes fehérje sávjainak vizsgálata ................................ 67 5.2.4. Mennyiségi kalibrációk.................................................................................... 70 6. Összefoglalás ................................................................................................................... 73 7. Felhasznált irodalom ....................................................................................................... 76 8. Rövidítések jegyzéke....................................................................................................... 86 Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................ 87 Nyilatkozat .......................................................................................................................... 88 Közlemények ....................................................................................................................... 89

ii

1. BEVEZETÉS A növényi eredetű élelmi nyersanyagok minőségét, technológiai, fogyasztói felhasználhatóságát a fiziológiai állapot döntően meghatározza. A fiziológia állapot leírására bonyolult kémiai, biokémiai, enzimes, morfológiai és botanikai módszereket használnak, amelyek gyakran pontatlanok és munkaigényesek. Manapság egyre nagyobb igény merül fel a gyors, megbízható módszerek alkalmazása iránt a mezőgazdaság és az élelmiszeripar területén. Erre a kihívásra lehet válasz a gyors rutinanalízis céljára már mind a mezőgazdaságban, mind az élelmiszeriparban régóta használt közeli infravörös spektroszkópiai eljárás. A jelenlegi gyakorlatban a közeli infravörös tartományt felhasználó spektroszkópiai technikák közül a reflexiós (near-infrared reflectance, NIR), és a transzmissziós (near-infrared transmittance, NIT) vizsgálati módszerek terjedtek el széles körben. Ma már rutinszerűen alkalmazzák ezen technikákat olyan biológiai eredetű nyersanyagok minőségi paramétereinek vizsgálatára, mint a búza vagy az árpa nedvesség-, ill. fehérjetartalmának, vagy más makrojellemzőinek meghatározása, sőt a fejlődő adatfeldolgozási eljárások lehetővé teszik az egyes funkcionális tulajdonságok vagy gyártásközi paraméterek (pl. technikai szemkeménység, lisztkitermelés, vízfelvevő-képesség) analízisét is. A növényi nyersanyagok fiziológiai állapotának (érettség, postharvest folyamatok, csírázottság) mérésére ugyanakkor nincsenek megbízható gyors vizsgáló módszerek, pedig a fiziológiai állapot alapvetően meghatározza a növényi nyersanyag összetételi tulajdonságain túl annak tényleges vagy potenciális végfelhasználói minőségét (end-use quality). A növényfiziológiai státusz roncsolásmentes NIR/NIT spektroszkópiai mérése, becslése a közvetlen gyakorlati hasznon túl alapkutatási kérdések megválaszolását is segíti, amilyenek például a növényi vízháztartás változásai, növénybetegségek molekuláris és morfológiai következményei, vagy a fajtaazonosság és genetikai módosítás kérdései. Dolgozatom célja annak igazolása, hogy a közeli infravörös spektroszkópiai technika hatékony eszköz lehet a növényi rendszerekbe és folyamatokba való gyors „betekintésre”, a fiziológiai minőség monitorozására, ill. a főbb összetevők mennyiségi meghatározására.

1

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A búza szemfejlődésének folyamatai 2.1.1. Búzatermesztés hazánkban A magyar mezőgazdaság egyik legfontosabb növénye a búza. Az aggteleki és a lengyeli leletek igazolják, hogy Magyarország területén már a történelem előtti időkben termesztették. A honfoglaló magyarok a Duna völgyében és a Kárpát-medencében talált földművelő néptörzsektől is átvehették a termesztését, de valószínűbb, hogy magukkal hozták a korábban Ázsiában megismert növényt. III. Béla király okmánya 1190-től megemlíti a búzát, a hainburgi várokmányok szerint pedig a XII. században már kiviteli áru volt a magyar búza. A tatárok rohamai, majd a török háborúk csaknem teljesen elpusztították a kirabolt és leigázott országrészek lakosságát, de a másfél évszázados török hódoltság alatt némileg mégis megújult a búzatermesztés, amint annak egyes adatait a hivatalos török nyilvántartások, a defterek megőrizték. A későbbi korokban – mivel a búza termesztése jól beillett a feudális gazdálkodás keretébe – termesztése újra fellendült. Jó minősége miatt nyugati szomszédaink keresték, és szívesen vásárolták. A bécsi tőzsde 1885-ben térképet adott ki, amelyben Magyarországot a szállított búza minősége szerint körzetekre osztották. Eszerint a legjobb minőségű búzatételek az Alföld középső és déli tájairól (Tiszavidék) kerültek a bécsi malmokba, másodsorban Fejér megye, Pest-vidék és Bácska szállítottak minőségi búzát.1 Napjainkban a többi kalászos gabonával együtt a vetésterület mintegy egyharmadát foglalja el, sikeres termesztése meghatározhatja a gabonaágazat jövedelmezőségét. Fontos népélelmezési és export cikk. Viszonylag kis befektetéssel termelhető, és a legfontosabb feltételek – a jó talajadottságok, a minőségi termeléshez optimális klimatikus feltételek, a szakértelem, a korszerű fajták, technikai felszerelés és segédanyagok – mind rendelkezésre állnak. Termése könnyen szállítható, hosszú ideig tárolható és gazdaságosan értékesíthető.2 Magyarország búzatermesztésének alakulását 1921-től 2004-ig az 1. ábra szemlélteti.3,4

2

8 000 7 000 6 000 5 000 4 000 3 000 2 000 1 000 0 1920

1930

1940

vetésterület [ezer ha]

1950

1960

1970

1980

termésmennyiség [ezer t]

1990

2000

termésátlag [kg/ha]

1. ábra • A magyar búzatermelés főbb statisztikai adatai 1921 és 2004 között

2.1.2. A mag és a termés általános fejlődése A hajtásos növények fejlődésében a testépítés vegetatív időszakát az ivaros szaporodási, (generatív) időszak követi, melyben a szervezet ivari sejtek létrehozásával, és azok egyesítésével újraképezi, reprodukálja önmagát. A vegetatív és generatív időszak eseményei szoros összefüggésben vannak egymással, egymásra kölcsönösen hatást gyakorolnak: az anyanövényen végbemenő magképzés befolyásolja a vegetatív fejlődést, ill. a vegetatív fejlődési időszakban végbemenő történések megalapozzák a generatív időszak folyamatait. E két időszak történései legszembetűnőbben a morfológiai kialakulás szakaszaiban, az úgynevezett fázisokban nyilvánulnak meg. A változásokat hat fázisba sorolhatjuk – a nyugalmi állapot, a csírázás, a vegetatív fejlődés, a virágképzés, a megtermékenyítés, ill. az embrió- és magképzés fázisára –, melyek együtt alkotják az egyedfejlődés ciklusát.5 A termés kialakulása tulajdonképpen már a virágképződéssel megkezdődik, mivel virágszervek alakulnak át a termésfallá. Ez az átalakulás azonban csak a megporzás után indul meg. A termésképződés következő stádiumait különböztetjük meg: terméskötés, amely a megporzással kezdődik; sejtosztódás, amely a kettős termékenyüléssel indul meg; sejtmegnyúlás; érés és elöregedés.6 Azokat a változásokat, amelyek során a virág fiatal terméssé alakul, terméskötésnek nevezzük. Ha a megporzás elmarad, a magház fokozatosan degenerálódik, végül elhal. A megporzás által indukált fiziológiai változások egyrészt a pollen nagy auxintartalmával, másrészt a termőben a pollentömlő növekedése által indukált fokozott auxintermeléssel

3

kapcsolatosak. A megporzás után kialakuló nagyobb auxinszint az etiléntermelés serkentésén keresztül vezethet a többi virágrész elöregedéséhez, lehullásához. A termés növekedésekor bekövetkező térfogat-nagyobbodás legnagyobbrészt sejtosztódás vagy sejtmegnyúlás, vagy mindkettő eredménye. Általában a sejtosztódással való növekedés a termés növekedésének korai szakaszára, a sejtmegnyúlással való növekedés egy későbbi szakaszára jellemző. A sejtosztódás és a sejtmegnyúlás fázisai részben fedésben vannak egymással.7 A megtermékenyülést követően intenzív sejtosztódás indul meg. A zigótából kifejlődik az embrió, a megtermékenyített központi sejtből pedig a triploid belső tápláló szövet, az endospermium. A megtermékenyítés eredményeként – miközben a magkezdeményből mag lesz – a termőlevél magházi részéből termés fejlődik, amely a magot megéréséig körülveszi, védi, és elterjesztésében segíti. Kivételesen a virág más része is részt vehet a termésképzésben. A magház falából a termésfal, perikarpium lesz. Ez rendesen egy külső termésfalrétegre vagy exokarpiumra, és egy belső rétegre vagy endokarpiumra tagolódik, s a kettő között alakulhat ki a középső termésfalréteg, a mezokarpium.8 A sejtosztódási szakaszban a legmagasabb a hormonszint. Ekkor nagy mennyiségben keletkeznek serkentő és gátló hormonok. A sejtosztódás időszakában az auxinok mellett a citokininek, sejtmegnyúláskor pedig a gibberellinek magas szintje szükséges a termés normális fejlődéséhez. Sok termés, mint például az alma, körte, paradicsom, uborka és szamóca növekedése, hasonlóan más növényi szervekhez, egy szigmoid görbével jellemezhető. Más termések, mint például a füge, ribiszke, szőlő és sok csonthéjas termés növekedését kettős szigmoid görbe jellemzi. Ennél a típusnál a gyors növekedés két periódusát olyan köztes periódus választja el, amely alatt sem kisméretű növekedés, sem térfogat-gyarapodás nem történik.7 Az érési periódus során ízanyagok, vitaminok, alkaloidok, hormonok halmozódnak fel. Az érés rendesen színváltozással jár együtt: a még zöld termések klorofilja elbomlik, karotinoidok, antociánok képződnek, a termésfal parenchimasejtjeinek megváltozik a sejtnedv pH értéke, így különböző színek alakulnak ki. A termésfal érett állapota szerint megkülönböztethetünk húsos és száraz terméseket, melyek a termésfal szövettani felépítésében térnek el. Az érett állapotban húsos, lédús altípusok esetében a termésfalat parenchimatikus, azaz vékony falú, élő sejtekből álló szövet alkotja, míg az érett állapotban kiszáradó alaptípusok esetén szklerenchimatizálódott, azaz

4

megvastagodott falú, protoplazmát már nem tartalmazó sejteket formálják a termésfalat. A termésfal száraz állapotban felnyílhat, ezek a felnyíló termések (pl. hüvely, tok stb.), vagy pedig zárt marad, ezek a zárt termések (pl. szem, makk, kaszat stb.).8

2.1.3. A búzaszem fejlődése A növény-fiziológiai irodalomban elsősorban a húsos termések fejlődési és növekedési folyamatai találhatók túlsúlyban, aminek magyarázata a kertészeti igények kielégítésében keresendő.9 Dolgozatom azokat az ismereteket foglalja össze, amelyek a búza szemfejlődéséről, ill. a folyamat nyomon követéséről a szakirodalomban fellelhetők. 2.1.3.1. A búzaszem szerkezete A búzaszem, mint termés, az alábbi csoportokba sorolható. • egyszerű száraz termések

Termésfaluk érett állapotban vízvesztés következtében kiszárad. Lehetnek felnyílók és zártak. Rendesen sokmagvúak.

• száraz zárt termések

A száraz zárt termések esetében a magház csak egy magkezdeményt rejt.

• szemtermések (caryopsis)

A legtöbbször egy termőlevélből, felső állású magházból alakuló, egymagvú, száraz termés, amelyen a termésfal hozzánő a maghéjhoz. A pázsitfüvek, így a gabonafélék jellemző termése. Néha még a virágtakaróból módosult toklász is ránő a szemre: toklászos szemtermés például az árpa, rizs.8

Mielőtt a búzaszem kialakulását tárgyalnánk, röviden érdemes megismerkedni a gabonaszem szerkezetével (2. ábra). A termésfal hármas tagolódású: • epikarpium

A bőrszövet alkotja, melyet kutikula borít.

• mezokarpium

A hosszanti sejtek két rétegéből és a haránt sejtek egy rétegéből áll.

• endokarpium

Hosszanti irányú tömlősejtek alkotják, de nem képeznek önálló szövetet.

5

A barnás maghéj két, egymást ferdén keresztező, lapított sejtek rétegéből áll. Ez alatt az átlátszó hialinréteg foglal helyet. A magbelső külső rétege a fehérjetestekben gazdag aleuronréteg, amelyet a keményítővel telt endospermium követ. A belső liszttestben vagy keményítős szövetben a korong vagy lencse alakú egyszerű keményítőszemcsék fehérjedús plazmába ágyazottan helyezkednek el. A belső lisztes rész – a sikértartalomtól függően – lehet tömör („acélos búza” esetén), vagy laza szerkezetű („lisztes búza” esetén). A csíra vagy embrió a termés tompább, alsó végének külső része felé helyezkedik el. Részei: rügyecske, gyököcske, pajzsocska (sziklevél).10

2. ábra • A búzaszem szerkezete 10 A kérdés az, hogy a szemtermés kialakulása, érése az időben milyen lefutást követ, s ez a mag morfológiájában hogyan jelentkezhet. Természetesen mindenekelőtt azt kell tisztázni, miért oly fontos számunkra ezen fiziológiai folyamat nyomon követése.

6

2.1.3.2. A szemfejlődés nyomon követésének célja A különböző búzafajták értékét a belőlük készített végtermék minősége határozza meg. Ez azt jelenti, hogy abból a búzafajtából lehet gazdaságosan jó minőségű terméket előállítani, amelyet a felhasználási célnak megfelelően kiválasztottak, termesztettek és feldolgoztak.11 A célzott, végtermék orientált minőség (end-use quality) kialakítása a korszerű gabonatudomány (nemesítés, termesztés, minősítés, feldolgozás) széleskörűen kutatott területe, hiszen az optimális tulajdonságú (összetétel, funkcionális jellemzők, szerkezet-textúra stb.) termék csak ilyen rendszerszemléletű fejlesztéssel alakítható ki hatékonyan és tervezhetően. A végtermék orientált minőség kialakulásában, kialakításában a nyersanyag fiziológiai állapota döntő körülmény lehet. Az őszi búza nemesítés és termesztés technológiájának fejlesztése mindig a figyelem középpontjában állt és ennek számos kérdése – így a talajművelés, vetés, tápanyagutánpótlás, növényápolás – már jól ismert a kutatók és a gyakorlati szakemberek előtt. Természetesen még számos megoldatlan probléma áll előttünk, elsősorban a minősítés területén, ahol épp a minőség-funkcionalitás kapcsolat tisztázása, a minél magasabb színvonalú, jobb minőséget előállító és gazdaságos termelésre való törekvés folyamatos. Szembetűnő, hogy az egyéb termesztési vonatkozások mellett viszonylag kevesebb információt találhatunk a búzabetakarítás ütemezésének kérdéseiről, ezek hatásának vizsgálatáról a termés mennyiségi és minőségi összetevőire. Azért is fontos ezzel a problémakörrel foglalkozni, mert a betakarítás helyes ütemezésével különösebb beruházás nélkül, pótlólagos anyagi ráfordítások elkerülésével tehetünk szert több – és ami ma egyre fontosabbá válik –, jobb minőségű termésre, és ezzel csökkenthetjük a potenciális veszteségeket.12 Ehhez azonban ismernünk kell a búza szemfejlődésének fázisait. 2.1.3.3. A búzaszem érésének szintjei a hazai definíciók szerint A búza érésének időszaka a virágzás befejezése után kezdődik. Általában három alperiódusra bontják fel: a tejesérés, a viaszérés és a teljesérés időszakaira. Az előzőek közül a legrövidebb a teljesérés időszaka, noha több szerző ezt nem is tekinti fenofázisnak. Időtartamban hosszabb a viaszérés, majd a leghosszabb, a tejesérés. A hazai fajtáknál az egyes alperiódusok hossza – különböző időpontú vetéseket számítva – a következőképpen alakul: a tejesérés alperiódusa 12-15 nap, a viaszérés 6-8 nap.

7

A tejesérés nem közvetlenül a virágzás befejezése után kezdődik. Ez után ugyanis egy darabig még az éredő szem belseje nem „tejes” állományú. A virágzás vége és a tejesérés kezdete között ugyanis mintegy 6-8 nap van. Ezt az időszakot – amikor az éredő szem zöld és állománya is ragadós, zöldes –, a „szemképződés” időszakának nevezik, és nem sorolják a tejesérés időszakához. Tekintettel azonban arra, hogy a szemképződés a tejesérés időszakának végéig tart, helyesebb ezt a fenofázist a zöldérés időszakának nevezni. A tejesérés időszakának kezdete a magyar búzáknál a vetésidők szerint különböző mértékű ingadozást mutat. Ez a korábbi vetéseknél 7-8 nap, a középidejűeknél viszont kevesebb, 4-6 nap. A viaszérés az egész érési időszak utolsó harmadában következik be. A szemek nagysága már ekkor véglegesen kialakult, állományuk is besűrűsödik. Hazai vizsgálatok szerint a viaszérés kezdetének ingadozása a vetésidők és fajták vonatkozásában csak kis mértékű, általában 4-6 nap. A búza termésérésének időszaka a teljeséréssel fejeződik be. Ekkor a szemek már kemények, jellegzetes alakúak és színűek. Hazai vizsgálatok szerint a teljesérés országos átlagos időpontja a sokévi átlagok alapján az ingadozás földrajzi vonatkozásában kb. egy hónapot tesz ki: július 30. és augusztus 30. között.13 2.1.3.4. A búzaszem érésének szintjei az angolszász definíciók szerint A búzamag főbb szemtelítődési fázisait a 3. ábra mutatja az angolszász irodalomban megállapított fokozatok szerint.

3. ábra • Búzaszemek a szemtelítődés különböző fázisaiban a – vizes , b – késő tejes , c – puha tészta , d – kemény tészta , e – aratásérett állapot 14 A vizes érettség állapotában (watery ripe stage, 3/a ábra)a mag méretében gyorsan gyarapodik – kialakul szélessége és hosszúsága –, de ekkor még nem halmoz fel szárazanyagot magában. Egy tiszta, színtelen folyadékot lehet kinyomni az éredő magból. A növény zöld, de az alsó levelek már kezdenek elszáradni.

8

A tejesérés időszakában (milk stage, 3/b ábra) egy fehér, tejszerű folyadékot lehet kipréselni a fejlődő magból. Ezen állapot végén az embrió formája teljesen kialakul és mintegy 1/32 inch (0,8 mm) hosszú. A fejlődési folyamat menete során az alsó levelekben felhalmozódott tápanyagok a növény felső részeiben – így az éredő magokban is – újra szétosztásra kerülnek több alsó levél pusztulását okozva. A puha tészta állapotban (soft dough stage, 3/c ábra) a mag vízkoncentrációja lecsökken arra a pontra, amelynél ha a szemből kinyomjuk a tartalmát, akkor az többé már nem folyékony, hanem tészta állagú. A szem gyorsan akkumulálja a keményítőt és a tápanyagokat, és ezen szint végén a zöld szín elkezd halványulni. A legtöbb mag száraztömege ekkor halmozódik fel. A szem nedvességtartalma 75 % körüli értékre csökken le. A kemény tészta állapot (hard dough stage, 3/d ábra) végén a mag eléri fiziológia érettségét, melynél a toklászok és a szár felső – a kalász és az ez alatti első levél közti – része már nem zöld. A szem nedvességtartalma 40 %-os szintről 30 %-ra csökken le. Ekkor főként a betakarítási veszteségek és a környezeti károk – mint például a csapadékos időjárás vagy a csírázás – eredményezik a terméshozam csökkenését. A magkemény állapotban (kernel hard stage) a növény teljesen sárgává, a szem pedig keménnyé válik. A magot a hüvelykujj körmével fizikailag nehéz kettéosztani, de a szem felszínét be lehet rovátkálni a köröm élével. A mag nedvességtartalma 20-25 %. Az aratásérett állapot (harvest ripe storage, 3/e ábra) során a növény szárazzá és törékennyé, míg a szem keménnyé válik. A magot nem lehet szétmorzsolni, s a felszínét nehéz rovátkálni a köröm élével. Ha más eszközzel szét lehet morzsolni, akkor darabokra törik. Mikor a szem eléri a 13-14 %-os nedvességtartalmat, akkor készen áll a betakarításra, ill. a betárolásra.15

2.1.4. A búzaszem fő összetevői és változásuk a szemfejlődés során A szemfejlődés során a búzaminőség leírásakor rendszerint a fő összetevők meghatározásához, azok időbeli változásának vizsgálatához fordulnak a szakemberek: egy biológiai rendszerről a fizika és kémia módszereivel, eszközeivel alkotnak képet. Ez a szemlélet már a XX. század első harmadában született közleményekben is tükröződik,16–18 melyben a szerzők – a kor által nyújtotta lehetőségek keretein belül – a búzamag több kémiai összetevőjének szemfejlődés során bekövetkező változásáról adnak sok-

9

rétű leírást. Ezek a korai publikációk egyben tanúskodnak az érésdinamikai vizsgálatok fontosságának korai felismeréséről is a búza esetén. Már ekkor szerepel a szemtömeg, a nedvesség-, a nitrogén-, a tartalékfehérje-, a szénhidrát-, a nyerszsír-, a rost- és a hamutartalom meghatározása. Amely komponensek esetén lehetőség nyílt, mélyrehatóbb vizsgálatok is történtek (pl. fehérje és nem fehérje eredetű nitrogén, aminosavak, lipid savszám mérése).16,17 A következő lépésben a szemfejlődés különböző fázisaiban lévő magokból készült lisztek, ill. a belőlük sütött kenyerek vizsgálatára is sor került.18 Természetesen időről időre megjelennek újabb tanulmányok megőrizve a különböző összetevők együttes vizsgálatára fenntartott hagyományos igényeket.19–24 A vizsgálati módszerek fejlődésével, a szerteágazó tudományos ismeretek bővülésével az érésdinamika területén felhalmozott ismereteket ma már szinte lehetetlen csak a szűken értelmezett biológia, kémia, fizika keretei között tárgyalni. A „tudományköziség”, az interdiszciplinaritás sűrű szövevényét valamelyest mégis átláthatóbbá tehetjük, ha a kémiai öszszetevők változásának fonalát követjük. Ezen „önkényesen” kiragadott szempont ellenére nem szabad elfeledkeznünk arról, hogy az érő mag kémiai összetételét leginkább jellemző fő komponensek – azaz a víz, a szénhidrátok és a fehérjék – változásai egymással minden tekintetben szoros, olykor szétválaszthatatlan kapcsolatban vannak. Ezek a kölcsönhatások óhatatlanul felbukkannak az egyes összetevők további, részletesebb, kategorikus tárgyalása során is. 2.1.4.1. A víz – modellek, típusok A fejlődő magban összetett metabolikus, enzimatikus, morfológiai és szerkezeti változást létrehozó folyamatok mennek végbe, melyek a nagy nedvességtartalom nélkül elképzelhetetlenek lennének. A víz elengedhetetlen a teljes szemfejlődési folyamat során, nem csak úgy, mint aktív összetevő, hanem mint oldószer, mely „félfolyékony” közeget biztosít az anyagcsere folyamataihoz.25,26 Mindamellett az a részletesebb szerep, melyet a víz molekuláris szinten a kémiai és biológiai rendszerek működésében játszik, homályosan rajzolódik ki és még mindig számos tudományos vita tárgya.27 Hasonlóképpen számos kérdés vár válaszra maga a víz fizikai-kémiai tulajdonságaival kapcsolatban. Ez az oka a változatos víz modelleknek, melyeket nagyjából két csoportra oszthatunk: az ún „keverék” (vagy „két állapotú”) és a „folytonos” modellekre.28,29 A „keverék” modellek különböző jellemzővel bíró vízmolekula típusok (pl. szabad és hidrogénkötésekben résztvevő hidroxilcsoportúak30,31) vagy aggregátumok (pl. többgyűrűs okta10

vagy dekamerek és egygyűrűs tetra- vagy pentamerek32) egyensúlyi keverékét tételezik fel. A „folytonos” modellek a hidrogénkötésekkel kapcsolódó vízmolekulák egy összefüggő hálózatát sugalmazzák.33 Az utóbbi időben úgy tűnik, hogy a két modell típus közti különbség egyre csökken, épp ezért megpróbálják ezeket egy modellben egyesíteni, nyilvánvalóvá téve a különböző megközelítések előnyeit.34 A hidrogénkötés vízalapú oldatokban nem csak a hőmérséklettől, hanem az oldott anyagtól is függ. Az oldott anyag jelenléte a szolvatáció két állapotát hozhatja létre: az oldott anyag által befolyásolt vizet (hidratációs víz) és a szabad vizet (4/a ábra). A hidratációs és a szabad víz két típusú víz egyensúlyával közelíthető: a kevesebb, „gyengébb”, „hajlított” hidrogénkötésekkel rendelkező nagy sűrűségű vízzel (high density water, HDW, 4/b ábra), ill. a több, „erősebb”, „egyenesebb” hidrogénkötésekkel jellemezhető kis sűrűségű vízzel (low density water, LDW, 4/c ábra). Ezt az egyensúlyt a töltéssel rendelkező vagy poláris (hidrofil) csoportok a kevesebb hidrogénkötéssel rendelkező HDW, a nem poláris (hidrofób) csoportok a több hidrogénkötéssel jellemezhető LDW felé tolják el.35

4. ábra • Vízmolekulák elrendeződésének lehetséges típusai a – szabad víz , b – nagy sűrűségű víz (HDW) , c – kis sűrűségű víz (LDW) 36 Azokat az anyagokat, melyek a vízmolekulák közti hidrogénkötések számának csökkentésén keresztül növelik az entrópiát – azaz csökkentik a vízmolekulák közti rendezettséget, HDW-t eredményezve –, kaotróp (struktúra bontó) anyagoknak nevezzük. E tekintetben kaotróp például a karbamid vagy a glükóz. A kozmotróp (struktúra építő) anyagok viszont növelik a vízmolekulák közti hidrogénkötések számát csökkentve az entrópiát, azaz növelve a vízmolekulák közti rendezettséget, LDW jelleghez vezetve. Jellemzően a hidrofób típusú anyagokat sorolhatjuk ide.37–39 A fenti modelleket egyesítették, aláhúzva az LDW szerepét a hidrofób csoportok víz által történő átalakulása kapcsán, mely az élő sejtekben fontos szerepet játszik a fehérje szerkezetének kialakításában (folding), a polinukleotidok stabilizációjában és egyéb biopolimerek aggregációjában.40,41

11

Az eddigiekből kiviláglik: a biológia által felvetett kérdésekre a fizikai-kémiai kutatások válaszai egyre inkább megfelelnek. Az egyik kutató szavaival élve összegzésként elmondható: jóformán az összes kölcsönhatás esetén a résztvevő molekulák először a víz szerkezetükön keresztül „látják” egymást.42 Ez alól a búzamagban kölcsönható molekulák sem kivételek. 2.1.4.2. A búzamag nedvességtartalmának változása a szemfejlődés során A valódi, sejtekből álló rendszerekben, mint amilyenek a növényi szövetek, a víz migrációja gátolt, mind a membránok, sejtszervecskék által, mind a különböző makromolekulákkal, oldott anyagokkal létrejövő kölcsönhatás miatt. A növényfiziológia is előszeretettel foglalkozik a vízzel, hisz olyan makromolekulák, mint a fehérjék, a poliszacharidok, vagy akár a nukleinsavak biológiai aktivitása nagyban függ a vízfelvétel (vagy épp vízvesztés) hatására bekövetkező (de)hidratációs változásoktól. Ha a búzaszem nedvességtartalmát a teljes szemtömeg százalékában (%) adjuk meg, akkor a virágzást követő első héten megduzzadt, 70-75 % víztartalmat elért szemek egy folyamatos, lineáris csökkenést mutatnak a szemfejlődés előrehaladtával. Ez a szakasz mintegy 30-32 napig tart, és a nedvességtartalom 30-35 %-ra csökken. Ezután – az éréskor fennálló hőmérséklet és csapadék viszonyoktól függően – a vízleadás fokozódhat. Az érés végső szakaszában, 15-20 % víztartalom alatt a további vízleadás mérséklődik.43–45 Egyes szerzők a vízleadás ütemében különbségeket tapasztaltak a korai és a középérésű búzafajták között, melyet a fajták endogén biológiai ritmusával magyaráztak.46 Érdemes megjegyezni, hogy szoros, szignifikáns korrelációt találtak a teljes kalász és a szemek százalékos nedvességtartalma között, így a kalász vizsgálatával biztonságosan lehet a szemek nedvességtartalmára következtetni.43 Ez különösen a szemfejlődés korai szakaszában lehet fontos, amikor a szemek még olyan kis méretűek, hogy eltávolításuk a kalászból nehézkes. Ezen preparálási probléma miatt a szemfejlődéssel foglalkozó tanulmányok gyakran csak a virágzás utáni 10-15. naptól követik nyomon a búzaszem változásait. Az 1970-es években a gabonakémikusok arra jutottak, hogy adott összetevő mennyiségét a szemtermésre vonatkoztatva (mg/szem) az adatok sokkal világosabban megfeleltethetőek a szemfejlődés különböző szintjeinek, mintha százalékosan adnák meg azokat. Ennek oka, hogy a fejlődő mag száraz- és nedvestömege – melyekhez a százalékos számítás során viszonyítunk – folyamatosan változik, elrejtve az anyagcsere-folyamatok lényeges tendenciáit.20,47,48 12

Ha a nedvességtartalmat mg/szem alapon ábrázoljuk, akkor a szemfejlődés során időrendben három fázist különböztethetünk meg: az első szakaszban a víz mennyisége folyamatosan növekszik, a másodikban közel állandó marad, a harmadikban gyorsan csökken.16,17,19,21,23,49 A konkrét esetekben az első és második szakasz (vízfelvétel és stagnálás), ill. a második és harmadik szakasz (stagnálás és vízleadás) közti átmenetek a virágzás utáni 22./40.,16 26./43.,23 28./44.,49 30./35.,19 34./44.17 napokon következtek be. Az irodalmi adatokban tapasztalható eltérések a kísérletekben résztvevő fajták, az éghajlat, az időjárás, a termőhely és az agrotechnika különbségeiből adódhatnak. Egyes szerzők a nedvességtartalom hirtelen csökkenését a szemfejlődés során elért maximum szemtömeg 95 %-ánál figyelték meg.50 Az esetek többségében a nedvességtartalom szemfejlődés során bekövetkező változásai gyakorlati megfontolásokból a szem száraz- és nedvestömegével együtt kerül tárgyalásra. 2.1.4.3. A búzamag száraz- és nedvestömegének változása a szemfejlődés során A szénhidrátok és fehérjék szemfejlődés folyamán tapasztalt változásainak részletezése előtt mindenképpen érdemes kitérni a szem száraz anyagának mennyiségi vizsgálatára, melyet szinte teljesen az előbb említett két fő komponens tesz ki.51,52 A száraz szemtömeget mg/szem alapon ábrázolva a szem növekedésének szigmoid dinamikáját figyelték meg.23,24,43,53 A szárazanyag-tartalom időbeni változásának vizsgálata során két fő szakaszt különíthetünk el. Az első szakaszt – néhány napos kezdeti lag periódus után – lineáris növekedés jellemzi, egészen a maximum szárazanyag-tartalom eléréséig. Ezt tekinthetjük a mag szárazanyagának felhalmozódási, akkumulációs periódusának. A második szakaszban az elért szárazanyag-tartalom gyakorlatilag nem változik – esetleg kis mértékben csökkenhet – az érés befejeztéig.17,22–24,43,45 A két fő szakasz közti átmenetet a virágzás utáni 34., 37.,43 46., 47.,23,49 48.24 napokon figyelték meg. Az eltérések ez esetben is a nedvességtartalom változásával foglalkozó, előző alfejezetben felsoroltok okokra vezethetőek vissza. A szárazanyag- és a nedvességtartalom adatok együttes elemzése alapján a búzaszem fejlődését három fázisra lehet osztani: a sejtosztódás, a sejtmegnyúlás és szárazanyagfelhalmozódás, ill. az érés (azaz vízvesztés) fázisaira.54 Egyes tanulmányokban négy fázissal találkozhatunk: a sejtmegnyúlás és szárazanyag-felhalmozódás közös fázisa megbontva jelenik meg, bár ezekben az esetekben az is kiderül, hogy a sejtmegnyúlás gyakorlatilag a szárazanyag-felhalmozódás első felét takarja.23,49 13

A búzaszem nedvesség- és szárazanyag-tartalmának szemfejlődés során bekövetkező változásának megismerése után a nedvestömeg időbeni lefutása már könnyebben értelmezhető. A szemek nyerstömege a virágzástól az érésig parabola alakú görbével jellemezhető. A sejtosztódás fázisában, a kezdeti lag szakaszban a szemtömeg kismérvű gyarapodása főként a magkezdemény víztartalom növekedésének eredménye. A parabola felszálló ágának kezdeti, nagyobb meredekségű szakasza az intenzív szárazanyag-felhalmozódás és vízfelvétel együttes hatásának köszönhető, mely a sejtmegnyúlás és szárazanyag-felhalmozódás közös fázisának feleltethető meg. A parabola felszálló ágának ellaposodásáért a megszűnő vízfelvétel a felelős. A maximum elérése után a parabola leszálló ágának kisebb meredekségű szakaszát az okozza, hogy a szembe kevesebb asszimiláta áramlik, mint amennyi vizet a szem veszít, így a teljes szemtömeg érésig fokozatosan csökken. Az érés során megszűnő szárazanyag-felhalmozódás, ill. a további vízvesztés hatására a parabola leszálló ága meredekebben ível, végül a nedvestömeg maximum értékének mintegy kétharmadánál zárul.22,43,45 2.1.4.3. A búzamag szénhidráttartalmának változása a szemfejlődés során Táplálkozási szokásainknak köszönhetően a szénhidrátok nagymértékben hozzájárulnak energiaellátásunkhoz. Az Egyesült Királyságban elfogyasztott élelmiszerek tömegének közel 30 %-a keményítő, melynek fő forrása – mint Európában és Észak-Amerikában általában – a búzalisztből készült pék- és tésztaáruk.55 De nemcsak keményítőforrásként tekinthetünk a búzára. Felvetődött az éretlen búzaszemek funkcionális élelmiszerként történő felhasználása, mivel a szemfejlődés kezdeti szakaszában jelentős mennyiségben tartalmaznak fruktóz polimereket és más vízoldható szénhidrátokat – ráadásul az éretlen búzamag aminosav-összetétele kiegyensúlyozottabb az éretténél.56 Ezért talán nem érdektelen számunkra, ha ismerjük a búzamag szénhidráttartalmának változását a szemfejlődés során. A vízoldható szénhidrátok (különböző monoszacharidok, szacharóz, fruktánok) menynyisége közvetlenül a terméskötés kezdete után megnő, s a virágzás utáni 12./14. napon értéke maximumot ér el. Ezt követően egy folyamatos csökkenés figyelhető meg a virágzás utáni 26/28. napig, majd egy viszonylag állandó szintet fenntartva szolgálnak monoszacharid forrásként, ill. közbenső poolként a folyamatos keményítő-előállításhoz.19,20,24,47,48,57–59 A szemfejlődés korai stádiumában a szárazanyag-tartalom nagy részét kitevő mono-, di- és oligoszacharidok19,20,59 vízbeáramlást indukálva megnövelik a fiatal sejtek ozmózisnyomását, és így hozzájárulnak a sejtek megduzzadásához.23,60 Az

14

endospermium sejtjeiben a keményítő-szintézis a vízoldható szénhidrátok mennyiségében nagymérvű csökkenést idéz elő, de a keményítő-előállítás befejeztekor még mindig jelentős mennyiségben megtalálhatóak a vízoldható komponensek. Ez arra utal, hogy a monoszacharidok prekurzorként nem korlátozzák a tartalékszénhidrátok felhalmozódását.57,60–62 A keményítő előállítása az endospermium sejtjeiben röviddel a megtermékenyülés után megindul, és mennyisége csaknem lineárisan növekszik.19,59 Nagyméretű (10-35 µm átmérőjű), lencse alakú, ún. A típusú, ill. kisméretű (10 µm átmérő alatti), gömb alakú, ún. B típusú keményítőszemcséket különböztethetünk meg,63 melyek közül az A típusúak a sejtosztódás fázisában, körülbelül a szemfejlődés első két hétben alakulnak ki (5/a, 5/b, 5/c ábra), míg a B típusúak a sejtmegnyúlás fázisában, megközelítően a virágzás utáni második hét után jelennek meg (5/d, 5/e, 5/f ábra).64 Létrejöttük után az érésig folytatják növekedésüket.

5. ábra • Keményítőszemcsék a búza szemfejlődése során a virágzás utáni a – 5. , b – 8. , c – 10. , d – 15. , e – 20. napon , f – érett mag esetében 64 Kezdetben a búzamagban kialakult nagy nedvességtartalmú környezet lehetővé teszi a keményítőszemcsékben található keményítőmolekulák közti laza kapcsolat meglétét, mely kapcsolat később egyre szorosabbá válik a nedvességtartalom érés alatt bekövetkező csökkenésével. Ezt támasztja alá az a tény is, hogy érés során mérséklődik a keményítő vízkötő képessége, ugyanis a keményítőmolekulák egyre szorosabb kapcsolata folytán a vízmolekulákkal hidrogénkötést létrehozó szabad hidroxilcsoportok megközelíthetősége csökken, és ezzel egy időben az intramolekuláris, azaz keményítőmolekulán belüli hidrogénkötések kialakításában résztvevő hidroxilcsoportok száma nő.65

15

Egyes tanulmányok kiemelik, hogy a szárazanyag felhalmozódása nagymértékben követi a keményítő-felhalmozódás mintázatát, ütemét,24,57,59,66 ami a mag kémiai összetételének ismeretében nem meglepő, hiszen a szárazanyag 75-85 %-át a keményítő teszi ki.61 2.1.4.4. A búzamag fehérjetartalmának változása a szemfejlődés során A szemfejlődés folyamán a mag endospermiumában felhalmozódott tartalékfehérjék csírázáskor fontos szerepet játszanak a fejlődő magonc tápanyagellátásában. A tartalékfehérjéknek nemcsak azért van különleges jelentőségük, mert nagymértékben meghatározzák a mag teljes fehérjetartalmát, hanem azért is, mert a végfelhasználást befolyásoló minőségi paraméterekre is – mint például a tészta reológiájára, sütési minőségére, funkcionális tulajdonságaira – hatással vannak. Ezért a fehérjék mennyiségi és minőségi változásainak nyomon követése a búza szemfejlődése idején elengedhetetlen. A gabonafehérjék fontosságát mutatja az is, hogy az összes fehérje közül róluk adták a legkorábbi leírásokat: Beccari 1745-ben elsőként publikálta a sikér kinyeréséről szóló tanulmányát.67 Osborne 1907-ben megjelent művével megteremtette a búzafehérjék – azóta hagyományossá lett – oldhatóság alapján történő osztályozását, mely szerint a búzamag fehérjéit vízoldható albuminokra, sóoldható globulinokra, alkohololdható gliadinokra, sav-, ill. lúgoldható gluteninekre, és végül ezen oldószerekben nem oldódó maradék fehérjékre oszthatjuk.68 Az Osborne-féle oldhatósági csoportosítás jórészben lefedi a biokémiai felosztást: a gliadinok és a gluteninek nagyrészt a tartalékfehérjéknek, míg a többi fehérje a funkcionális fehérjéknek – mint például az enzimeknek, membrán-, riboszomális, szabályozó és védő fehérjéknek – feleltethető meg. Az elválasztástechnikai módszerek és eszközök fejlődésével, ill. a genetika és a molekuláris biológia e területen való megjelenésével az Osborneféle kép árnyaltabbá, ezzel párhuzamosan még összetettebbé vált: a fehérjék osztályozásánál az oldhatósági tulajdonságokon kívül az aminosav-összetételüket, a gélelektroforetikus mobilitásukat, ill. az őket kódoló gének szekvenciáit is figyelembe veszik.69–71 E szempontok alapján mutatja be a búzafehérjék csoportosíthatóságát a 6. ábra.

16

6. ábra • A búzafehérjék csoportosítási szempontrendszereinek összefoglalása 72 17

A szemfejlődés során a búzamag nitrogén- és szárazanyag-tartalma között erős korreláció áll fenn.66,73 Az előzetes megfigyelések alapján a búzaszem nitrogéntartalma a sejtosztódás fázisában túlnyomóan nemfehérje nitrogénből (pl. szabad aminosavakból) és nem tartalék jellegű fehérjékből származik, míg ezt követően a sejtmegnyúlás és szemtelítődés fázisa alatt a nitrogéntartalom alapján meghatározott fehérjemennyiség elsősorban a tartalékfehérjék felhalmozódását tükrözi.19,20,22,74–76 A teljes fehérjetartalom a virágzástól a szem dehidratációjának kezdetéig lineárisan halmozódik,19,20,77 majd mennyisége közel állandó marad a teljes érésig. A kisebb molekulatömegű fehérjék (albuminok és globulinok) aránya csökken a szemfejlődés során, míg a tartalék- vagy sikérfehérjék (gliadinok és gluteninek) különböző méretű és oldhatóságú polimerekké kapcsolódnak össze.78–81 Ezeket a polimereket nátriumdodecilszulfát (sodium dodecyl sulfate, SDS) híg oldatában való oldékonyságuk alapján csoportosíthatjuk. Az ún. SDS-oldható, ily módon extrahálható polimer fehérjék (extractable polymeric proteins, EPP) kisebb aggregátumokból és monomer fehérjékből – főként gliadinokból, részben víz- és sóoldható fehérjékből – állnak. Ellenben az ún. SDS-ben nem oldható, ily módon nem extrahálható polimer fehérjék (unextractable polymeric proteins, UPP) javarészt gluteninek és gliadinok alkotta nagy aggregátumokat tartalmaznak. Az EPP frakció lineáris felhalmozódást mutat a búzaszem dehidratációs fázisának kezdetéig, míg az UPP frakció ugyanezen idő alatt csak egy lassú, de szintén lineáris jellegű növekedéssel írható le. A mag száradásának kezdetével hirtelen változás következik be a fehérjeoldhatóságban: az EPP mennyisége lecsökken, míg az UPP mennyisége sebesen emelkedik.79–82 Következésképpen a szemfejlődés során legalább két, tisztán elhatárolható fehérjeaggregációs szintet különböztethetünk meg a magban, melyet az ún. hiperaggregációs modellel írhatunk le.83 A modell első (molekuláris) szintje az EPP kialakulására vonatkozik, mely a sejtosztódás és a sejtmegnyúlás fázisára tehető. Ekkor a polimerek kovalens kötésekkel, jellemzően diszulfid hidakkal kapcsolódnak össze kisebb aggregátumokká, mely folyamat a szem száradásának kezdetéig tart. A második (mezoszkópikus) szinten UPP, azaz nagyobb aggregátumok alakulnak ki az előző szint kisebb aggregátumainak (EPP) összecsapódásával, melyeket hidrogénkötések és további diszulfidhidak stabilizálnak, és végül ez vezethet a sikérhálózat kialakulásához. Ezen hipotézis szerint a mag dehidratációja úgy segíti elő az első (molekuláris) szintű aggregátumok további szerveződését, hogy megkönynyíti a glutenin alegységek ismétlődő, β-redőzött szakaszai közti láncközi hidrogénkötések kialakulását, amelyek a még szabad tiol csoportokat olyan közelségbe hozza, hogy azok

18

további diszulfidhidak létrejöttét teszik lehetővé.84 A diszulfid kötések alapvető jelentősége mellett85–87 épp ezért gyakran kiemelik az intra- és intermolekuláris hidrogénkötések lényeges szerepét is a sikérszerkezet stabilizálásában,71 hangsúlyozva a glutenin alegységek ismétlődő, β-redőzött szakaszainak ebbéli fontosságát.88,89 A két szint közti átmenet a különböző kísérletek során a virágzás utáni 31.,81 32.,80 33.,84 35.,79,82,90 37., 45.81 napokon következett be, attól függően, milyen búzafajtákat tanulmányoztak, ill. milyen hőmérsékleti, vízadagolási stb. feltételek voltak adottak a vizsgálatok folyamán.

2.2. A közeli infravörös spektroszkópia alkalmazása a búza fő összetevőinek vizsgálataiban 2.2.1. A közeli infravörös spektroszkópia áttekintése Bár az 1990-es évek második felében a közeli infravörös spektroszkópia elérte azt az analitikai érettségi szintet, hogy a legtöbb kutató, felhasználó számára inkább vizsgálatainak eszközeként, mint tárgyaként szolgál,91 ettől függetlenül érdemes kialakulásáról, elméleti alapjairól, főbb tulajdonságairól rövid áttekintést nyújtani, mielőtt szerepe a búza fő komponenseivel kapcsolatban tárgyalásra kerülne. 2.2.1.1. A közeli infravörös spektroszkópia kialakulásának története A kezdetek a XIX. századra tehetőek. Sir Frederic William Herschel, angol csillagász 1800-ban kelt tanulmányában számolt be kísérletéről, mely során azt a színt kereste a látható spektrumban, amely a napfény melegéért felelős. Egy üvegprizmával szétválasztotta a napfény „fehér” sugarát a szivárvány színeire, majd befeketített tartályú hőmérőkkel megmérte hőmérsékletüket (7. ábra). Herschel feljegyezte, hogy az így leolvasott hőmérséklet a kék színtől a zöldön át a vörösig emelkedett, de ami meglepőbb volt, hogy a vörösön túli meg nem világított terüle7. ábra • Herschel kísérlete 91

ten ez a tendencia folytatódott.91,92 Tekintve azt,

19

hogy ez a tartomány az emberi szem számára láthatatlan, vörös alatti, azaz infravörös (infrared, IR) néven került feljegyzésre. Mivel a látható tartományban sokkal könnyebb volt dolgozni, ezért az IR technika csak a fényképlemezek feltalálása után került ismét előtérbe: 1881-ben Abney és Festing a 700-1200 nm-ig terjedő közeli IR tartományt vizsgálta fényképezéssel.93 A XX. század legelején Coblentz munkáságát kell kiemelni, aki a maga építette IR spektrométerrel gyűjtött adatok mintázata alapján megállapította, hogy nincs két vegyület, amelynek egyforma lenne az IR spektruma, ha még ugyanazokból az atomokból állnak is (pl. etil-alkohol és dimetil-éter). Szintén hozzá kapcsolódik az a megfigyelés, mely szerint a hasonló kémiai csoportokkal rendelkező vegyületek hasonló IR elnyelési sávokat adnak (pl. hidroxilcsoport elnyelése az alkoholok, fenolok, karbonsavak esetén).92 Ellis az 1920as évek végén – még mindig tiszta, folyékony, szerves vegyületeket vizsgálva – a C–H csoportok elnyelésének segítségével alátámasztotta Coblentz sejtését a harmonikus rezgésekről. Ebben az időszakban Brackett a szénhidrogének vizsgálata során lejegyezte, hogy a szénatomokhoz kapcsolódó primer, szekunder és tercier hidrogénatomok azonosítható sávokat hoznak létre 1200 nm körül.91 Az 1940-50-es években tovább folytatódtak a folyadékok transzmissziós vizsgálatai, ill. ekkor került a közeli IR erős elméleti alapokra: megszületett a magyarázat a két- és háromatomos molekulák spektrumára a csoportelmélet és a kiválasztási szabályok által.91,94 A 1950-es évek közepétől megjelent műszerek az elektromágneses spektrum ibolyántúli (ultraviolet, UV), látható (visible, VIS) és közeli IR tartományait egyszerre vizsgálták.94 Bár Kubelka és Munk már a 1930-as években felvetette a diffúz reflexión alapuló mérés lehetőségét,92 de ez a mérési módozat gyakorlatilag csak Karl Norris 1960-as évek közepén publikált eredményei után kapott nagyobb figyelmet. Egyébiránt Norrist méltán nevezik a „modern közeli IR atyjának”,95 hisz főként neki köszönhető, hogy a közeli IR technikát bevezette az analitika világában.94 Az 1970-es évek elején már a kereskedelmi forgalomban is kaphatóak voltak szűrős készülékek, elsősorban gabonaipari célokra.91,96 A kezdeti időkben a technika alkalmazásának elterjedését jelentősen gátolta a számítástechnika kis teljesítménye, ill. hiánya Az 1980-as évek elején a szűrős készülékek mellett már egyre szélesebb körben jelentek meg a billegő holografikus ráccsal felszerelt mérőműszerek, és erre az évtizedre tehető a kemometria nagyobb léptékű fejlődése a közeli IR területén. Ennek köszönhetően az 1990-es években a már bevált mezőgazdasági és az élelmiszeripari területeken kívül megnőtt az egyéb ipari

20

(pl. petrolkémiai, polimerkémiai, gyógyszerkémiai stb.) alkalmazások száma. Az új évezred első évtizede a hordozható készülékek és a képalkotó eljárásokon alapuló „imaging” rendszereknek ad esélyt a térhódításra.91 2.2.1.2. A közeli infravörös spektroszkópia alapjai A közeli IR hullámhossztartománya 800-2500 nm között helyezkedik el.97 Pontos optikai jelet két tartományban kaphatunk: a transzmissziós méréseknél rendszerint a 8001100 nm-es, míg a reflexiós méréseknél általában az 1100-2500 nm-ig terjedő régiót használják fel. A NIR/NIT technika a minta és az infravörös fotonok kölcsönhatását használja fel: a fénykvantum hatására a molekulák rezgési és forgási állapotai gerjesztődnek, eközben a fotonok egy része visszaverődhet (reflexió), elnyelődhet (abszorpció) vagy áthaladhat a mintán (transzmisszió),97,98 ill. bizonyos részük más utat járhat be (8. ábra).

8. ábra • A fény és az anyag egymással való kölcsönhatásai a – spekuláris reflexió , b – diffúz reflexió , c – abszorpció , d – transzmisszió , e – diffrakció , f – diszperzió A spektrum a szerves molekulák kötéseinek különböző hullámhosszaknál való fényabszorpciójának eredményeképp jön létre.99 A kétatomos molekulákon belüli kötések alaprezgéseit

harmonikus rezgést végző rugókkal modellezik, melyek viselkedését a Hooke-

törvény írja le.97,99,100 A többatomos molekulákat ideális esetben úgy lehet felfogni, mint független, kétatomos harmonikus oszcillátorok sorozatát.99 A rezgési módok száma N ato-

21

mos molekula esetén 3N–6 lehet, melyekhez egy-egy önálló potenciális energia görbét rendelhetünk.100 A klasszikus rugómodellel szemben, a kvantummechanikai modell értelmében a kétatomos molekulák rezgési energiaszintjeinek száma véges: az energiák folytonos eloszlása helyett itt diszkrét energiaszintek vannak, mely szintek egyenlő távolságra vannak egymástól.97,99,100 Mivel az atomok elektronfelhője a Coloumb-taszítás miatt határt szab a két atom közeledésének, ill. nyújtáskor a kötés elszakadhat, ezért a potenciális energia görbe torzul. Ennek eredményeként az energiaszintek az energia növekedésével egyre közelebb kerülnek egymáshoz, anharmonikussá válnak.99,100 Abban az esetben, ha egy rezgési mód energiaállapota a 0. energiaszintről az 1. energiaszintre kerül, alaprezgésről beszélünk. Ha az átmenet az alapállapotból a 2., 3. stb. szintre történik – és nincs más átmenet –, akkor első, második stb. felhangról beszélhetünk. Ha az átmenet az alapállapotból két különböző szintre történik, akkor az kombinációs sávot eredményez. A spektroszkópiai kiválasztási szabályok szerint a felhangok és kombinációk megjelenése tiltott, de az anharmonicitás és a Fermi-rezonancia miatt megjelennek a spektrumban.99 Míg a különböző alaprezgéseket a távoli és közép, addig a felhangokat és a kombinációs rezgéseket a közeli IR tartományban tanulmányozhatjuk (9. ábra).97 2.2.1.3. A közeli infravörös készülékek felépítése és működése A közeli IR tartományban működő általános, ill. alkalmazás specifikus (dedikált) berendezéseket többek között az alábbi szempontok szerint jellemezhetjük:95,101 alkalmazott technika, eljárás, módszer szerint • szűk sáváteresztésű interferencia szűrő, • billegő, konkáv, holografikus, diffrakciós rács, • fénykibocsátó dióda (light emitting diode, LED) szűrővel, • fotodiódasor, • interferométer (Michelson-féle vagy kristálypolarizációs), • akuszto-optikusan hangolható szűrő (acousto-optical tunable filter, AOTF), • folyadékkristály által hangolható szűrő (liquid crystal tunable filter, LCTF), • többdimenziós képalkotó eljárások (hyper-spectral imaging); fényforrás szerint • volfrám-halogén izzó, • LED, • hangolható lézer;

22

9. ábra • A közeli IR tartomány jellegzetes elnyelési sávjai 97

23

detektor szerint • félvezető anyaga alapján (pl. Si, PbS, InGaAs), • elrendezése alapján (pl. lineáris, fókuszsík); optikai elemek sorrendje szerint • prediszperzív (hullámhosszválasztás, mielőtt a fény elérné a mintát), • posztdiszperzív (hullámhosszválasztás, miután a fény elhagyta a mintát); mérési elrendezés, mintával való érintkezés szerint • transzmissziós, • diffúz reflexiós, • transzflexiós. Mivel munkám során diffúz reflexiós elrendezést használtam, ezért most csak ennek alapjaira térnék ki. Ha a mérendő minták zavarosak, átlátszatlanok vagy túl nagy mértékben abszorbeálják a rajtuk áteső fényt, akkor használható a diffúz reflexiós elrendezés. A reflektancia tényező a minta felületéről reflektált sugárzás fluxusának és annak a fluxusnak a hányadosa, amit egy ideális (azaz veszteségmentes) standard felület reflektálna ugyanolyan beeső sugárzási fluxus és azonos geometriai elrendezés mellet. Ilyen ideális standard sajnos nincsen, de ha egy reális standard reflektanciájának tudjuk az ideálistól való eltérését, akkor ez a probléma orvosolható.102 Reális standardként alkalmaznak többek között fehér kerámiát, magnézium-oxidot, bárium-szulfátot, magnézium-karbonátot, kénport, aranyfóliát, ritkaföldfémek oxidjainak keverékét.103 Ezek segítségével megállapíthatjuk a reflektométer értéket (R), mely a mintáról és egy, a készülékhez adott reális standardról a detektorra reflektált sugárzási fluxus hányadosa (1).102 R=

φr φ st

(1)

Olyan reflexiós mérések során, ahol a fény nem halad át a „végtelenül vastag” mintán, az abszorbancia (A) az alábbi módon (2) számítható.97

A = − lg R = lg

1 R

(2)

2.2.1.4. A közeli infravörös technika előnyei és hátrányai A közeli infravörös technika előnyös tulajdonságai miatt az utóbbi évtizedekben széles körben terjedt el analitikai feladatkörök elvégzésére. Viszonylag egyszerű, gyors mérések-

24

kel lehetőség nyílik nagy fontosságú és gazdasági jelentőségű mennyiségi és minőségi vizsgálatok elvégzésére. A közeli infravörös technika előnyei: • A spektrumok komplex információk hordozói, és így több összetevő egyidejű meg-

határozására adnak lehetőséget. • A minták fő kémiai alkotóelemein túl lehetőség nyílik azok minor komponenseinek

(pl. klorofill, pigment), valamint fizikai jellemzőinek (pl. részecskeméret, keménység) mérésére is. • A mérés időigénye jelentősen lecsökken a klasszikus, „nedves kémiai” módszerek-

hez képest. A minta állapotáról szinte azonnal kaphatunk információt, mely jelentősége egyes esetekben számottevő (pl. a gabona-betakarítás optimális idejének meghatározásánál, vagy a betárolási feltételek optimálásánál). • A mintaelőkészítés olyan mértékben egyszerűsödik (pl. teljes szem vizsgálata), hogy

a mérés a mintavétel helyszínén is elvégezhető. • Azáltal, hogy a vizsgálat roncsolásmentes, nagyon kis mértékben avatkozunk be a

mintában lejátszódó folyamatokba, így alkalom nyílhat arra, hogy fiziológiai folyamatokat kövessük nyomon, ill. élő rendszereket vizsgálhassunk. A közeli infravörös technika hátrányai: • A mennyiségi meghatározás minden esetben kalibrációt igényel. A mérés pontossága

teljes mértékben a kalibrációs adatok – azaz a hagyományos analízis – mérési pontosságától függ, ugyanis a közeli infravörös spektroszkópia összehasonlító (korrelatív) vagy másodlagos mérési technika, mely statisztikai alapokon nyugszik, és egy előzetesen validált laboratóriumi eljárás eredményeire épül. Míg a gyógyszerkémia területén találunk példákat mesterségesen előállított standardok használatára, addig a mezőgazdasági alkalmazások során a legtöbb kalibrációs minta természeti eredetű. • A sokkomponensű, természeti eredetű minták NIR/NIT spektrumai bonyolultak,

„zsúfoltak”, ezért gyakran előfordul az, hogy az egyik alkotóelem csoportrezgéseinek (lokális) abszorbancia-maximuma egybeesik a másikéval, és az intenzitások arányától függően többé-kevésbé elfedik egymást. (Az egybeesés egyik legegyszerűbb oka az lehet, hogy mindkét alkotóelem ugyanazt az atomcsoportot tartalmazza. Ilyen például a hidroxilcsoport a víz és a szénhidrátok esetén.) A karakterisztikus vibrációs 25

frekvenciák felhangjai olyan közel esnek egymáshoz, hogy a spektrum általában burkológörbe jellegű, a csatolt széles sávok miatt. Ez nehezíti az egyes csoportok azonosítását a spektrumban jelentkező elnyelési sávok értékelésénél. A hiteles mérések kivitelezése és kiértékelése ezért elképzelhetetlen statisztikai módszerek, ill. számítógépek segítsége nélkül. • Reflexiós mérés esetén a mintatartóban levő minta felülete szolgáltatja az adatokat az

adott mintáról, így az inhomogenitás, mintaszerkezet, felületi nedvesség, általában a minta változékonysága jelentős mértékben befolyásolhatja a mért adatokat.

2.2.2. A búzaszem fő összetevői és közeli infravörös spektrumainak kapcsolata Az első közeli IR spektroszkópiával történő búzavizsgálatra az 1950-es évek legvégén került sor: transzmissziós készülékkel a szemes búza üszögtartalmát mérték. A reflexiós elrendezésű berendezések első sikertörténete egyértelműen az őrölt búza nedvesség-, fehérjeés olajtartalmának vizsgálatához köthető. Már az 1970-es évek második felében Kanadában bevezették az előbb említett paraméterek NIR technikával mért értékei alapján történő búzakereskedést. Ez volt a NIR technológia első jelentősebb térhódítása a világon, mely a további fejlesztések motorjaként hatott.91 Az elmúlt, közel 40 év eredményeinek számbavétele ezen a szűknek tűnő tudományterületen – köszönhetően a búza fontosságának és a közeli IR technológia fejlődésének – meghaladják e dolgozat kereteit. Elég, ha csak a búzamezők műholdas közeli IR fényképezésre gondolunk a precíziós mezőgazdaság kapcsán,104 de említhetnénk a nem túl távoli jövőbe tekintve a búzaszem közeli IR mikrospektroszkópiás vizsgálatát is105 – ha csak az „óriások és törpék” világából ragadunk ki egy-egy példát. Ennek okán az elkövetkező sorokban megpróbálom a búzaszem fő összetevőihez kapcsolódó, de a közeli infravörös technikát alapul vevő tanulmányokat úgy összefoglalni, hogy azok biztos hátteréül szolgáljanak eredményeim egyszerűbb megértéséhez. 2.2.2.1. A víz változásának vizsgálata közeli infravörös spektroszkópiával A kutatások azon ágában, melyben a víz fizikai-kémiai tulajdonságait a vízmolekulák közt kialakuló hidrogénkötés-rendszeren keresztül vizsgálták, számos különféle spektroszkópiai technikát használtak. Annak ellenére, hogy a közeli IR tartomány információtartalma potenciálisan nagy, mégis viszonylag kevés publikáció született e területen. Ezekben

26

a tanulmányokban az 1100-2500 nm-es közeli IR tartományban jellemzően a víz három legnagyobb intenzitású elnyelési sávját vizsgálják, melyek elnyelési maximumát 20 °C-on 1940, 1450 és 1190 nm-re tették az első megfigyelések során.106 A legerősebb, 1940 nmnél megfigyelt csúcs a vízmolekulák O–H kötéshosszúságának változásában megmutatkozó szimmetrikus és aszimmetrikus húzó mozgások (ν1,3), valamint a kötésszög megváltozásával járó hajlító mozgások (ν2) kombinációjaként jön létre (ν1,3 + ν2). Míg az 1450 nm-es csúcs a húzó mozgások által generált elnyelési sáv első felharmonikusaként (2ν1,3), addig a legkisebb intenzitással rendelkező1190 nm-es csúcs a húzó mozgások első felharmonikusa és a hajlító mozgások kombinációjaként (2ν1,3 + ν2) jelenik meg.31,34,107–109 A víz hidrogénkötés-rendszerének legegyszerűbb tanulmányozási módja az, mikor különböző hőmérsékleteken a víz (adott esetben a jég és/vagy a gőz) közeli IR spektrumait rögzítik, összehasonlítják.31,34,107–112 Ekkor azt tapasztalták, hogy a hőmérséklet emelésének hatására a hidrogénkötések meglazulnak, elszakadnak, ami a víz közeli IR tartományban található elnyelési sávjait a kisebb hullámhosszak fele tolja el (10. ábra). Hasonló jelenséget tapasztaltak a kaotróp és kozmotróp anyagok oldatainak vizsgálatánál is.37,38 A töltéssel rendelkező kaotróp anyagok jobban eltorzították a hidrogénkötéseket, ami a kisebb hullámhosszak fele tolta el a spektrum víz csúcsait. Ellenben az ozmolit jellegű kozmotróp anyagok „jégszerűbb” hidrogénkötés-rendszer kialakítását elősegítve csökkentették a torzított hidrogénkötések számát, mely folyamat a víz csúcsok nagyobb hullámhosszak fele történő eltolódásában jelentkezett. ▼ ▼

▼ ▼

▼ ▼

10. ábra • A víz NIT spektrumának hőmérsékletfüggése a 700-2200 nm-es tartományban + ▼ = jég ,

= víz (rendre 10 °C, 30 °C, 60 °C, 80 °C) ,

+ ▼ = gőz (375 °C) 31

27

Ezeknek a tapasztalatoknak az ismeretében az utóbbi időben számos közeli IR alkalmazást fejlesztettek ki a víz állapotának és változásának nyomon követésére biológiai rendszerekben és élelmiszerekben egyaránt.113,114 Ezek a módszerek ma már elég kifinomultak ahhoz, hogy a víz tulajdonságait ne csak önmagában, hanem összetett, makromolekulákat tartalmazó rendszerekben is érzékelje, mint például a búzalisztből vagy annak összetevőiből (búzakeményítőből, sikérfehérjékből) és vízből álló tésztában.115,116 A közeli IR lehetőséget ad arra is, hogy biológiai minták esetén gyorsan és roncsolásmentesen „bepillanthassunk” különböző fiziológiai események (de)hidratációs folyamataiba, és így hozzájárul a vízhez kapcsolódó biokémiai változások megértéséhez. Ilyen fiziológiai esemény lehet a búzaszemek vízfelvételével járó csírázás,117 vagy a rovarfertőzésre adott stressz válasz,118 ill. a búzanövényben gombafertőzések hatására bekövetkező vízháztartási zavarok.119 2.2.2.2. A szénhidrátok vizsgálata közeli infravörös spektroszkópiával A búzakeményítő első műszeres vizsgálata Antoni Van Leeuwenhoek nevéhez fűződik, aki a XVIII. század elején az általa elsőként megépített fénymikroszkóppal figyelte meg a keményítőszemcséket és viselkedésüket.55 Bár ő csak az elektromágneses spektrum egy kis részét – a látható fényt – használta, de ez óriási lépés volt a természettudományok történetében. Néhány évszázaddal később, napjainkban, a látható tartomány közvetlen „szomszédja”, a közeli IR tartomány már általánosan elterjedt eszközéül szolgál a gabonafélék kémiai, fizikai, technológiai és fiziológiai folyamatainak nyomon követésére, melyek nagyrészt a szénhidrátok szerkezetében, összetételében vagy kölcsönhatásaiban okoznak változásokat.120 A búza és szénhidrátjellegű összetevői (pl. keményítő, pentozánok, fruktozánok) közeli IR elnyelési sávjait először az 1970-es évek végén azonosították.121 A következő húsz évben számos tanulmány született, mely a közeli IR spektrumok és a búza szénhidrátkomponensei között keresett kapcsolatot. A keményítő kémiai hidrolízisét az eljárás során felszabaduló monomereken keresztül a közeli IR tartomány kombinációs szakaszában érzékenyen lehet követni.122 Az olyan fizikai műveletek, mint a búza őrlése vagy az extrúzió a keményítőben erőteljes intra- és intermolekuláris változásokat okozhatnak, melyek a közeli IR technikákkal jól kísérhetők.123,124 Hasonlóképpen – a keményítő hidroxilcsoportjainak különböző állapotú hidrogénkötéseinek révén – a gélesedés, ill. a keményítő degradációja is mérhető.125 A közeli IR technikával történő folyamatos figyeléssel (monitorozással) pedig megérthetővé válik a tésztakialakulás, mely a pékáruk gyártásának egy alapvető jelentősé-

28

gű lépése.115 A fiziológiai folyamatok (pl. növekedés, érés) valószínűleg a legbonyolultabb – és még számos részletében máig sem tisztázott – részei a gabonatermékek életciklusnak, amelyek erősen befolyásolják az előbb felsorolt kémiai, fizikai és technológiai folyamatokat. A roncsolásmentes, valósidejű közeli IR módszerek segítségünkre lehetnek abban, hogy jobban megértsük a fejlődés során a szénhidrátokban, ill. más növényi anyagokban bekövetkező változásokat.126 A szénhidrátokhoz kapcsolódó elnyelési sávokat az alábbi tartományokban figyelhetünk meg: 1195-1205 nm, 1585-1595 nm, 1695-1700 nm, 1775-1780 nm, 2110-2120 nm, 2195-2200 nm, 2270-2280 nm és 2325-2335 nm (11/a ábra).100,127 Ha részletesebben megvizsgáljuk ezeket a sávokat a búza (vagy a fehérjék) közeli IR spektrumában, akkor azt tapasztaljuk, hogy számosat közülük nehéz értelmezni, mivel adott hullámhosszon a szénhidrátokon kívül az elnyelésért a fehérjék, de búza esetén például a keményítő-fehérje kölcsönhatások is felelősek lehetnek (11/b ábra).115

a

b

11. ábra • A keményítő és a fehérje NIR spektruma az 1600-2400 nm-es tartományban a – a keményítő alap (alsó rész) és 2. derivált (felső rész) NIR spektruma b – a fehérje alap (alsó rész) és 2. derivált (felső rész) NIR spektruma 128

29

Így a legtöbb esetben a keményítő és a fehérjék jellemző csúcsai átfednek egymással, mint például az 1195-1205 nm és a 1695-1700 nm közti szakaszokban, ahol a C–H rezgések második, ill. első felhangjai jelentkeznek.100 Az 1775-1780 nm-es keményítő csúcs hasonlóképpen rejtve marad a víz hajlító és aszimmetrikus húzó mozgásainak kombinációs sávja miatt.112 A búzakeményítő esetében egy széles, két lokális szélső értékkel rendelkező elnyelési sávot lehet megfigyelni 2100 nm körül,129,130 mely az O–H kötések deformációs és a C–O kötések húzómozgásának kombinációjaként jön létre.100 Ezt a széles sávot gyakran használják különféle termékek keményítőtartalmának meghatározására, de sajnos a búzasikér fehérjéinek 2110 nm-nél karakterisztikus elnyelése van.120,132 Ez utóbbiért feltehetően a sikérfehérjékben nagy arányban található glutamin és aszparagin aminosavak oldalláncainak amidcsoportjai a felelősek az N–H kötések szimmetrikus húzómozgása és egy peptidkötésre jellemző (amid III) rezgés kombinációján keresztül,100 de itt nyel el a lizin εaminocsoportja is,133 bár mennyisége alapján szerepe ez esetben csekély lehet. A keményítő, a fehérjék és valószínűleg a víz is elnyelési sávval rendelkezik a 2195-2200 nm-es tartományban,132,133 így a szénhidrátok elemzésében sajnos ezt a régiót sem használhatjuk a búzamag vizsgálata esetén. Az előzőekben taglalt problémák miatt a búzavizsgálatok során a közeli IR spektrumban ezért csak három jellegzetes szénhidrát régió lehetséges használata merül fel. Az 1585 nm körül jelentkező elnyelési sáv a hidrogénkötések folyományaképpen létrejövő O–H húzó mozgások első felhangja.123,131 Ezt a csúcsot a keményítőben a hidrogénkötésben résztvevő hidroxilcsoportok jelenlétének tudják be, s így alkalmas lehet olyan szerkezeti változások nyomon követésére, mint a keményítő sérülése.100,123 A közeli IR tartomány kombinációs részében 2275 nm körül a vízoldható szénhidrátok – mint például a glükóz, fruktóz, szacharóz – jól megkülönböztethető elnyelési sávval rendelkeznek,122 mely csúcs az O–H kötések és a C–C kötések húzó mozgásai révén jelentkezik.100 Végül a 2330 nm-es sávot lehet kiemelni, ahol a búza többi fő összetevője (a fehérjék és a víz) nem nyel el. A szénhidrátok itt a C–H kötések húzó és deformációs rezgéseinek kombinációja miatt mutatnak abszrorpciós csúcsot.100,121,122,131 Az e fejezetben elmondottakból kiviláglott, hogy a közeli IR technikával történő búzavizsgálatok során a szárazanyag-tartalom két fő összetevőjének (azaz a keményítőnek és a fehérjének) egymás melletti megléte számos – de nem megoldhatatlan – problémát vet fel. A következő részben a fehérjék aspektusából vizsgáljuk meg, mire képes a közeli IR eszköze.

30

2.2.2.3. A fehérjék vizsgálata közeli infravörös spektroszkópiával A mezőgazdasági termékek esetén a jelenleg elfogadott referencia módszerek (Kjeldahlféle roncsolás vagy Dumas-féle égetés) a teljes redukált nitrogéntartalmat mérik. A nyersfehérje-tartalmat egy, a vizsgált termék átlagos aminosav-összetételétől függő konstans és a nitrogéntartalom szorzataként számíthatjuk. Ez a konstans általánosan 6,25, a búza esetében 5,7.134 Összhangban azzal az elméleti állásponttal, hogy a nitrogénnek nincs elnyelése a közeli IR tartományban, azonban az N–H rezgéseket érzékelni tudjuk, lehetőség nyílik a fehérjék közeli IR technikával történő mérésére. Ugyanis a N–H kapcsolat a peptidkötés által (–CO–NH–) az összes fehérje elemi része, ill. néhány esetben megtalálható az aminosavak szabad oldalláncaiban is, mint például az amid- (Gln, Asn), guanido- (Arg) és aminocsoportokban (Lys, Orn).100,127 A szövetekben az anyagcsereutak korlátozott száma miatt csak adott mennyiségű és minőségű funkciós csoport fordulhat elő, így okkal feltételezhetjük, hogy az N–H kötések elnyelése a közeli IR tartomány egy adott részén nagymértékben a fehérjéknek köszönhető.135 Mivel a további elemzésekben a peptidcsoport rezgéseire való utalás többször előfordul, ezért érdemes összefoglalni a legkisebb, trans-peptid csoportot tartalmazó molekula, az N-metil-acetamid (12. ábra) ilyen jellegű normál rezgéseit (I. táblázat).136 H3C

H C

O

N CH3

12. ábra • Az N-metil-acetamid szerkezeti képlete a peptidkötés kiemelésével

A jellegzetes fehérje elnyelési sávokat a búza kapcsán – a keményítővel párhuzamosan – az 1970-es évek végén határozták meg.121 Az elmúlt harminc évben sokan vizsgálták a közeli IR spektrumok és a búzafehérjék tulajdonságai közti összefüggést. Az olyan fizikai kezelések, mint a magas nyomás és hőmérséklet alkalmazása mélyreható szerkezeti változásokat okozhat a búza sikérfehérjéinek szerkezetében, melyek a közeli IR módszerekkel jól követhetők.137 A technológiai folyamatok során alkalmazott IR technikák közül – a víz és a szénhidrátok kapcsán már említésre került – tésztakialakulási folyamatok, ill. a búzakeményítőből, sikérfehérjékből és vízből álló modellrendszerek vizsgálatát hozhatjuk fel példaként.115,116

31

rezgés amid A amid B

leírás N–H húzás N–H síkban hajlítás felhangja

amid I

C=O húzás

amid II

N–H síkban hajlítás és C–N húzás fázisból kiesett kombinációja

amid III

N–H síkban hajlítás és C–N húzás fázisbéli kombinációja

amid IV

C=O síkban hajlítás és C–C húzás

amid V amid VI

C–N torzió N–H síkra merőleges hajlítással C=O síkra merőleges hajlítás

amid VII

N–H síkra merőleges hajlítás C–N torzióval

I. táblázat • Az N-metil-acetamid peptidkötésének normál rezgései 136

Az előző fejezetben részletezett, a közeli IR spektrumban jelentkező keményítő-fehérje(és olykor víz-) átlapolások miatt a búzafehérjék vizsgálatára a kombinációs tartomány 2000-2450 nm-es szakasza a legmegfelelőbb (13. ábra). Ennek fő okai a következők.127 Elsősorban: ebben a régióban a víznek nincs komoly IR elnyelése, mely különösen biológiai minták elemzésénél válik fontos szemponttá.113 Másodsorban: ebben a hullámhossztartományban jelentős különbségek vannak a búzaszem fő alkotói – a keményítő és a fehérjék – jellegzetes abszorpciós csúcsai között. Harmadsorban: a felhangok tartományához képest a spektrum kombinációs szakasza erősebb jelet szolgáltat, ami jobb elkülönülést tesz lehetővé a tiszta komponensek spektrumai között. Negyedsorban: a fehérjék szerkezetében molekuláris kölcsönhatások útján bekövetkező finom változásokat a legjobb esetben is csak a kisebb energiájú (azaz nagyobb hullámhosszú) rezgésekre érzékeny régióban érzékelhetjük – tudván, a detektorok jel/zaj aránya itt már romolhat.

13. ábra • A búza fő összetevőinek 2. derivált spektruma a 2050-2450 nm-es tartományban = gliadin ,

= glutenin ,

= keményítő ,

= víz 120

32

A közeli IR technikával por formában vizsgált homopolipeptidek esetén a kombinációs tartomány elnyelési sávjait eredet alapján két csoportba osztották: azokra, melyek alapvetően a fehérjék vázának rezgéseiből fakadnak, ill. azokra, melyek fehérje-oldallánc eredetűek. A szerzők megállapítása szerint a vázrezgésekre érzékeny, 2000-2220 nm közti, N–H kötések húzómozgásainak kombinációit tartalmazó szakasz információt hordozhat a fehérjék másodlagos szerkezetével kapcsolatban, míg a fehérje-oldalláncok rezgéseire érzékeny, 2130-2500 nm közti, C–H kötések húzómozgásainak kombinációit tartalmazó szakasz a fehérjék elsődleges szerkezetéről, ill. az oldalláncok kémiai környezetéről árulkodik.138 Az eddig elmondottak alapján a búza esetében így három, fehérjékhez kapcsolódó szélesebb sávot figyelhetünk meg a közeli IR kombinációs tartományában: a vázrezgésekre jellemző 2040-2160 nm és 2160-2220 nm, ill. az oldalláncokra jellemző 2300-2370 nm szakaszokat. A búzafehérjék kialakulásának sajátságai és az in vivo biokémiai kölcsönhatások bonyolultsága okán továbbiakban a vázrezgésekre – azaz a fehérjék magasabb szintű szerkezetére – érzékeny szakaszok jellemzőit veszem górcső alá. A 2040-2160 nm-es tartományban három fehérje csúcs ismerhető fel. Az első elnyelési sáv 2055 nm-nél található, melyet a búzasikérben az N–H kötések húzó mozgása és az amid II rezgések kombinációjaként (amid A/II) azonosítottak.121 Fehérje eredetét fotoakusztikus közeli IR technikával bizonyították: adott fehérje és az azt felépítő aminosavak keverékének összehasonlításakor ez a sáv hiányzott az utóbbi esetben.139 A kombinációs tartományban az amid A/II csúcsnak van a legnagyobb intenzitása a fehérje sávok közül, aminek oka az N–H kötések húzó és hajlító mozgásának kombinációja,138 ahogy ez az I. táblázatból is kitűnik. Az 1930-as évek végén publikált első, ilyen mozgásokra visszaveze-

tett magyarázata e sávnak lényegében a mai napig elfogadott.140 Megfigyelték, hogy fehérjék hődenaturációja során az amid A/II csúcs intenzitása a natív, „összehajtogatott” fehérjék koncentrációja emelkedésének hatására változott a legjelentősebben.141,142 De nem csak az abszorbancia értéke változhat, hanem a lokális maximum helye is. Beszámoltak arról is, hogy a denaturáció során a hőmérséklet emelésével jelentős sáveltolódást tapasztaltak az alacsonyabb hullámhosszak irányába. Az amid A/II csúcs ezen eltolódása a peptidkötések hidrogénhídjai meggyengülésének, megszűnésének az eredménye, s hogy ez ilyen jól nyomon követhető, az feltételezhetően az amid A rezgés érzékenységének tudható be, mely a hidrogénhidak erősségével áll kapcsolatban.143,144 Hasonló kísérleti feltételek esetén ez a tendencia a búzafehérjék esetében is megfigyelhető.137 A következő elnyelési sáv 2110 nm-nél jelentkezik, melynek eredete az előző, szénhidrátokkal kapcsolatos fejezetben

33

már tárgyalásra került a 2100 nm körüli széles keményítő csúccsal való átlapolás kapcsán. A harmadik sávot 2145 nm körül jellemzően lipid csúcsnak azonosítják,100,127 de találkozhatunk az amid II eredettel is – igaz csak műanyagok (pl. amorf poliamid) kapcsán.145 A 2160-2220 nm-es tartományban általában két vagy három fehérje csúcsot vizsgálnak, függően a matematikai kezelésektől (pl. a derivált paramétereinek beállításától). Számos szakirodalomban megtaláljuk a 2180 nm-es sávot, melyet széleskörűen alkalmaznak a fehérjetartalom meghatározására. Ezt a fehérjeeredetű csúcsot139 az 1950-es évek közepén az első felharmonikus amid I és az amid III kombinációjaként (amid I/III) azonosították,146 bár az elmúlt évtizedben más alternatívák is nyilvánosságra kerültek (pl. amid B/II,138 ill. amid A/III147). Ez a 2180 nm-nél található csúcs feltételezhetően két átfedő elnyelési sáv eredménye: egy 2170 nm-es fehérje- és egy 2190 nm-es amideredetű csúcsot tételeznek fel, mely a búza esetén annak magas glutamintartalma miatt teljesen reális.133 A 2180 nmes csúcs „felhasadását” más tanulmányok is megerősítik,148 s talán ez a hatás okozza az asszignációban való bizonytalanságokat. A harmadik sáv 2205 nm körül valószínűleg a guanidocsoport elnyelése okán jön létre, melyet az arginin oldallánca végén találhatunk meg.133

34

3. CÉLKITŰZÉS Dolgozatomban egy nagy élelmiszeripari jelentőségű gabonaféle, a búza virágzás utáni szemkialakulásának NIR technikával történő nyomon követését tűztem ki célul. Vizsgálataim arra irányultak, hogy • megbízható információkat nyerjek a búza érése során a makrokomponensek változásairól és a párhuzamosan detektálható spektroszkópiai jellemzőkről; • a spektrumok segítségével nyomon kövessem az érés előrehaladtával a biológiai objektumban bekövetkező fiziológiai-biokémiai változások dinamikáját, különös tekintettel a víz, a szénhidrátok és a fehérjék minőségi és mennyiségi változásaira; • megkíséreljem a spektroszkópiai megfigyelések finom részleteinek elemzését, a rezgési állapotváltozások asszignációját a búza főbb összetevőinek tekintetében; • megpróbáljak olyan kalibrációkat kidolgozni, amelyek további elemzése, bővítése és finomítása lehetőséget nyújt egy olyan fontos paraméter gyors és roncsolásmentes meghatározására, mint a szemtermés érési stádiuma. Összességében bizonyítani kívántam a NIR módszer alkalmazhatóságát az aratás előtti (preharvest) folyamatok gyors, megbízható kimutatására.

35

4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. A búzaminták eredete és a mintavétel A vizsgált őszi búza (Triticum aestivum L.) minták az 1996/97-es év terméséből származtak a régebbi és a jelenlegi köztermesztésben álló fajtákat reprezentálva. A kiválasztásnál figyelembe vettük azt is, hogy különböző tenyészidejű búzafajták legyenek képviselve (II. táblázat). A mintákat a Magyar Tudományos Akadémia Mezőgazdasági Kutatóintézete (Martonvásár) bocsátotta rendelkezésemre. fajta

tenyészidőcsoport

fajta

tenyészidőcsoport

GK Öthalom

korai

Mv 23

közép

Bánkúti 1201

korai

Fatima

közép

Jubilejnaja 50

középkorai

Mv 15

középkésői

II. táblázat • A vizsgált búzafajták A kísérleti telepen az intézet munkatársai kalászoláskor a vizsgált fajták parcelláiban megjelöltek 100-100 kalászt, melyek közül mintavételenként és fajtánként 6-6 darabot vágtam le – a szárból 2-5 cm-t meghagyva a kalász alatt –, melyeket feliratozott hűtőtasakba helyeztem, amiket ezután lezártam. A mintavételek ideje a virágzás utáni 12. naptól (1997. június 6.) az aratásig (1997. július 17.) terjedő időtartamot lefedte (III. táblázat). hétfő

kedd

szerda

csütörtök

2

3

4

5

10

11 18

№2

9

15

16

№4

17

23

péntek

szombat

vasárnap

№1

6

12

7

8

12

№3

13

19

14

15

19

№5

20

26

21

22

№6

23

29

24

№7

25

31

26

№8

27

33

28

29

№9

30

36

1

№10

2

38

3

№11

4

40

5

6

№12

7

43

8

№13

9

45

10

47

12

13

50

15

19

20

№15 14

16

№16 17

№14 11 53

18

III. táblázat • Mintavételi időpontok 1997 június és júliusában №1-№16

: mintavétel sorszáma , 12-53 : virágzás utáni napok száma

36

Természetesen a virágzási idő fajtánként eltérhet – sőt fajtán belül kalászonként, ill. kalászon belül a szemek közt is különbség lehet a virágzás idejében –, melyek 2-3 napos differenciát okozhatnak a virágzás utáni napok száma tekintetében. E biológiai variancia átlagolására az előbbiekben ismertetett mintavétel megfelelő lehet. Így az időskála kezdeti pontjául a virágzás utáni 12. napot kiindulási alapként elfogadhatjuk, de az eltérés hatásával mindig számolni kell.

4.2. Nedvestömeg, nedvesség- és nitrogéntartalom meghatározása A minták a mintavétel napján feldolgozásra kerültek a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszékén. A laboratóriumban kivettem egy kalászt a szobahőmérsékleten tartott hűtőtasakok egyikéből. Erről leválasztottam a terméshéjjal, ill. toklásszal borított búzaszemeket, melyeket ezektől megszabadítottam. Itt meg kell jegyeznem, hogy az első mérési időpontban (a virágzás utáni 12. napon) az éretlen, zöld kalászokból csak a terméshéjjal együtt nyílott mód a szemek további vizsgálatára, mivel ekkor még olyan kicsik voltak, hogy rövid időn belüli, sérülés nélküli eltávolításuk nem volt lehetséges. Az egy kalászról származó megtisztított búzaszemeket összeszámoltam, majd összegyűjtve őket össztömegüket analitikai mérlegen meghatároztam. Az így kapott össztömeg és a magok számának hányadosa megadta a kalászban található búzaszemek átlagos nedvestömegét. Ezt a műveletsort a kiválasztott fajta többi kalászával is elvégeztem, így mintavételenként és fajtánként 6-6 párhuzamos nedvestömeg-mérés eredménye állt rendelkezésemre. Ezután a kiválasztott fajta 6 kalászáról származó szemeket összegyűjtöttem, s összekevertem, a NIR spektroszkópiához szolgáltatva megfelelő mennyiségű homogén mintát a statisztikus jelleg biztosítása céljából. A spektroszkópiai méréseket követően– lásd majd a következő, 3.3. fejezetet – a nedvességtartalmat gravimetriásan határoztam meg, a hagyományos MSZ szabványt149 alapul véve. Azért kellett a NIR felvételek után közvetlenül meghatározni a nedvességtartalmat, mert a közeli IR technikák nagyon érzékenyen követik e paraméter változását, s különösen a kísérlet első szakaszában – a nagy nedvességtartalmú minták esetén – a spektroszkópiai és a referencia mérések közti nagy időeltolódás a két módszer közti kapcsolat feltérképezését nehezítette volna a minták állapotának megváltozása miatt. Az adott fajta mintáiból két párhuzamos mérést végeztem: analitikai mérlegen 1-1 g körüli tömeget bemértem, melyet 4 órán át 105 ± 2 °C-os szárítószekrényben szárí-

37

tottam, majd a min. 20 perces exszikkátorban való hűlést követően visszamértem. Ezt a műveletsort a többi fajta búzamintáival is elvégeztem, így mintavételenként és fajtánként 2-2 párhuzamos nedvességtartalom-mérés eredménye állt rendelkezésemre. Az átlagolt nedvestömeg és nedvességtartalom adatok továbbiakban lehetőséget nyújtottak a búzaszemek száraztömegének kiszámítására. A nedvességtartalom-meghatározáshoz fel nem használt magvakat üvegfiolákba helyeztem, melyeket gumidugóval lezártam, majd -15 °C-os fagyasztóba tettem. A nedvességtartalom-meghatározás eredményeként kapott kiszárított magvakat hasonló módon, de szobahőmérsékleten tároltam. A nitrogéntartalom meghatározására később került sor, ami praktikus okok miatt a kiszárított szemekből történt. Ugyanis a fagyasztóban tárolt minták felületére felengedésük során pára csapódhat le, megnehezítve a nitrogéntartalom-meghatározás előtti tömegmérést, ill. a felületi nedvesség miatt a szemek összetapadhatnak. A Dumas-féle égetési eljáráson alapuló, a teljes redukált nitrogéntartalmat mérő módszer kivitelezésében egy LECO FP-528 Nitrogen/Protein Determinator (LECO Corp., St Joseph, MI, USA) készülék volt segítségemre. Mintavételenként és fajtánként 3-3 párhuzamos nitrogéntartalom-mérést végeztem.

4.3. Spektroszkópiai mérések Amint az előző fejezetben utaltam rá, adott mintavétel esetén a kiválasztott fajta 6 kalászáról származó szemeket összegyűjtöttem, s összekevertem, azért, hogy megfelelő menynyiségű, homogén mintához jussak a spektroszkópiai mérésekhez. A teljes búzaszemekből álló minták reflexiós spektrumait az alábbi paraméterek mellett vettem fel: • spektrofotométer

Model 6500 Scanning Monochromator*

• optikai elrendezés

prediszperzív

• fényforrás

volfrám-halogén izzó

• hullámhosszválasztó elem

billegő, konkáv, holografikus rács

• mérési hullámhossztartomány

1100-2498 nm

• lépésköz

2 nm

• hullámhosszpontosság

< ± 0,5 nm

• hullámhosszprecizitás

< 0,015 nm

• spektrum adatpontjainak száma

700

• spektrumfelvétel sebessége

1,8 spektrum másodpercenként

• mintakezelő egység

Sample Transport Module*

38

• mintatartó

standard sample cup

• mérési elrendezés

reflexiós

• referencia

kerámia

• detektor

4 db termosztált PbS

• spektrumok száma (referencia/minta)

32/32

• műszer vezérlése

PC, NSAS 3.30 szoftver*

* (Foss NIRSystems, Inc., Silver Spring, MD, USA) – Lásd még a 14. ábrát! Mintavételenként és fajtánként 5-5 párhuzamos spektroszkópiai mérést végeztem az előzőekben felsorolt feltételekkel. Mivel adott mintavétel és fajta esetén a búzaszemek mennyisége a 6 kalász termésének összegyűjtése után sem tette lehetővé az 5 független betöltést, ezért amíg lehetett, független almintákkal töltöttem meg a mintatartót (refill), majd ezeket összekeverve újabb almintákat alkottam, 14. ábra • Foss NIRSystems 6500 spektrofotométer Sample Transport Module mintakezelő egységgel

így nem kellet ugyanazokat az almintákat újra betölteni (repack).

4.4. A spektroszkópiai azonosítást segítő anyagok Az érő búza NIR spektrumainak összetett volta miatt az irodalmi adatok felhasználása mellett a búza fő összetevőinek spektrumait is megmértem, mely így biztosabb alapot képzett a jellegzetes elnyelési sávok azonosításához. A nem módosított búzakeményítő (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) és a búzasikér (ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA) NIR spektrumainak összegyűjtését ugyanazokkal a beállításokkal végeztem el, mint a búza minták esetében. Ezen kívül a desztillált víz, ill. a fruktóz, glükóz, szacharóz (Reanal Finomvegyszergyár Rt., Budapest, Magyarország) vizes hígítási sorainak (40, 100, 200 és 400 g/l) NIT spektrumait is felvettem. Ebben az esetben annyival tértem el a búzaminták esetében megadott

39

spektroszkópiai körülményektől, hogy folyadékokról lévén szó transzmissziós elrendezésben, 1 mm-es kvarcküvettával mértem. Mind a szilárd, mint a folyékony komponensek esetében 3-3 párhuzamos spektroszkópiai mérést végeztem.

4.5. A feldolgozáshoz használt számítási módszerek A referencia adatok és a spektrumok kiértékelését a Statistica 6.1 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, USA), az NSAS 3.30 (Foss NIRSystems, Inc., Silver Spring, MD, USA), a Vision 3.10 (Foss NIRSystems, Inc., Silver Spring, MD, USA), a PQS32 1.37 (Metrika Kutató, Fejlesztő és Szolgáltató Kft., Budapest, Magyarország) és a Microsoft® Excel 2002 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) programcsomagok segítségével készítettem el.

4.5.1. Spektrum-transzformáció: deriváltak Az irodalmi részben többször szó esett a széles, átlapoló csúcsokról, a spektrum burkoló görbe jellegéről. E probléma megoldását megközelíthetjük a derivált spektrumok használata felöl is. Az első derivált függvénynek (15. ábra) ott van (lokális) maximuma, ahol az eredeti függvény felfelé irányuló meredeksége maximumot ér el. Hasonlóképpen: ott kapunk (lokális) minimumot, ahol az eredeti függvény lefelé irányuló meredeksége maximumot mutat. Az eredeti függvény (lokális) minimumai, ill. maximumai helyén az első derivált függvény nulla értéket vesz fel. 5 4 3 2 1 0 y' -1 -2 -3 -4 -5

45 40 35 30 y

25 20 15 10 5 0 0

5

10

15

20

25

30

35

40

x

15. ábra • Az első derivált hatása az alapfüggvényre = alapfüggvény: y = f(x) ,

= első derivált: y’ = dy/dx

40

Sokkal érdekesebb a második derivált függvény (16. ábra), melyet az első derivált függvény további deriválásával kaphatunk. Ahol ez eredeti függvényben csúcs volt, az a második derivált függvényben völgyként jelentkezik, és viszont. 45

2

40 35

1,5 1

30 y

0,5

25 20

0

y''

-0,5

15

-1

10 5

-1,5

0

-2 0

5

10

15

20

25

30

35

40

x

16 ábra • A második derivált hatása az alapfüggvényre = alapfüggvény: y = f(x),

: második derivált: y’’ = dy’/dx = d2y/dx2

Hogy mit nyerhetünk ezzel, az az előző ábrán jól látható: az eredeti függvényben lényegileg átlapoló csúcsok tisztán szétválnak, és azok a csúcsvállak, ill. inflexiós pontok, melyek korábban szinte észrevehetetlenek voltak, most könnyen láthatóvá válnak, és kiértékelésre alkalmasak lesznek. Ráadásul a függőleges irányú alapvonal-eltolódást és a változó meredekséget is eliminálja ez a matematikai kezelés, de meg kell jegyeznünk: annak megítélése, hogy ez előny-e vagy hátrány, a spektrumfeldolgozás céljaitól függ. Előny például akkor, ha a reflexióban összegyűjtött spektrumpopuláció szemcseméret-eloszlás hatására bekövetkező alapvonal-eltolódását ki akarom küszöbölni, mely változékonyság zavarja vagy elfedi valamely beltartalmi komponens meghatározásához szükséges spektruminformációt (pl. lisztek nedvesség-, fehérje- vagy hamutartalmának meghatározása esetén). Hátrányos például akkor lehet, ha éppen az előzőekben említett alapvonal-eltolódás hordozza azt a változékonyságot, amelyet a minta modellezendő fizikai és/vagy kémiai tulajdonságai okoznak a spektrumban (pl. műanyag pelletek átmérőjének meghatározása esetén). Általánosságban a deriválások további előnye, hogy matematikailag lineáris műveletek, ezért ha a Lambert–Beer-törvény érvényes az eredeti spektrumra, akkor mennyiségi meghatározásra bármely rendű deriváltat ugyanúgy fel lehet használni. A deriválásból fakadó előnyök mellett a negatívumokról is szót kell ejteni. Mivel a deriválás felnagyíthatja a zajt és fokozza a spektrum összetettségét, a jel-zaj arány romlik. Többek között ez az oka annak, hogy a harmadik, negyedik vagy magasabb rendű deriváltak

41

használata ritka – annak ellenére, hogy elvi akadálya nincs –, hisz minden egyes további deriválás erősíti az imént felsorolt kedvezőtlen hatásokat. A zaj növekedése miatt sokszor a deriválást valamilyen más transzformációval (pl. simítással) kombinálják. Általában ennek is ára van: mivel legtöbbször valamilyen átlagképzést használnak, ezért veszteség léphet fel azokban az információkban, amelyek a spektrumsávok finom struktúrájában rejlenek.98 A második derivált képzésének leírása előtt egy-két fogalmat definiálni kell: • kapu (segment)

meghatározza azoknak az adatpontoknak a számát, melyet a deriválás előtt átlagolni kell;

• rés (gap)

meghatározza azoknak az adatpontoknak a számát, melyet a deriválás során a kapuk között ki kell hagyni.

Ezen paraméterek megadása után az általam használt szoftvercsomag a második derivált számítása során először három kaput jelöl ki a spektrum elején (A kapu, B kapu és C kapu), melyeket a rések választanak el egymástól (17. ábra). A szoftver kapunként kiszámítja az abszorbanciaértékek átlagát (A, B és C), majd az A-2B+C összefüggés alapján kapott értéket a B kapu középső pontjához rendeli. Ezután az egész – három kapuból és két résből álló – szekvencia egy adatponttal eltolódik, s a számítás mindaddig folytatódik, míg az utolsó adatpont is sorra nem kerül.150,151 45 C kapu

40 35 A kapu

30 25 y 20

B kapu

15 10 5

rés

0

rés 0

10

20

30

40

x

17. ábra • Második derivált számítása 3 adatpontos kapu és 0 adatpontos rés esetén

4.5.2. Minősítés: polár minősítő rendszer (PQS) A polár minősítő rendszert (polar qualification system, PQS), mint új adatredukciós és minősítő módszert, először az 1990-es évek elején mutatták be.152,153 A PQS terminológiája alapján definiálhatók a minták „minőségpontjai” a kétdimenziós „minőségsíkon”. A 42

vizsgált anyag minőségpontja a polár koordinátarendszerben ábrázolt spektrumának középpontjaként határozható meg (18. ábra).

a 18. ábra • Egy alacsony (

) és egy magas (

b ) zsírtartalmú tejporminta NIR spektruma

a – derékszögű , b – polár koordinátarendszerben ábrázolva 153 A spektrumot a polár koordináta-rendszerben ábrázolva a sugár a spektrumérték, míg a szög a hullámhossz függvénye. A polár spektrum abszorpciós csúcsai természetesen ugyanazon hullámhosszértékeknél vannak, mint a derékszögű koordinátarendszerben. A minta összetételének változásával a minőségpont a változó komponens abszorpciós csúcsával párhuzamos irányba tolódik el, így a minőségpont eltolódásának irányából következtetések vonhatók le a változás okáról. A minőségsíkon minden egyes mintához egy minőségpont tartozik, de elméletileg különböző összetételű minták minőségpontja azonos lehet – ez azonban rendkívül ritka. A minőségpont koordinátáinak meghatározására három lehetőség van (19. ábra).

19. ábra: A minőségpont három számítási alapelve 153 Az ún. „pont módszer” alkalmazása egy olyan rendszer tömegközéppontjának meghatározását jelenti, ahol az egyes spektrumpontokban egységnyi tömegeket helyeztünk el. Az ún. „vonal módszer” egy a spektrum alakjára meghajlított huzal tömegközéppontjának megha43

tározását jelenti, míg az ún. „felület módszer” alkalmazásakor a minőségpont a spektrum által körülzárt terület – egy a spektrumalakra kivágott lemez – tömegközéppontja.152,153

4.5.3. Kalibrálás: részleges legkisebb négyzetek módszere (PLS) Az (előkezelt) spektrumok és a referencia eredmények birtokában különböző matematikai-statisztikai eszközökkel megvizsgálhatjuk az összefüggést a két adathalmaz (értsd: spektroszkópiai, ill. fizikai és/vagy kémiai adatkészlet) között. Az idők folyamán – főként a megoldandó problémák jellege és a számítástechnika fejlődésének köszönhetően – számos matematikai módszer került át a közeli infravörös spektroszkópia területére. Napjainkban a lineáris regresszióval dolgozó technikáktól kezdve, a főkomponens analízisen át, a nemlineáris feladatok kidolgozására alkalmas mesterséges neurális hálózatokig megannyi lehetőség közül választhatunk. Dolgozatomban a spektrumok és a referencia adatok kapcsolatát a részleges legkisebb négyzetek (partial least squares, PLS) módszerével vizsgálom. A PLS egy regressziós módszer, mely megengedi számos hullámhossz – akár széles szegmensek, akár az egész spektrum – használatát, mialatt elkerüli a kollinearitás problémáját. A hagyományos legkisebb négyzetek módszereitől eltérően a PLS nem azt tételezi fel, hogy a spektrum adatok pontosak, és az összes hiba a referencia értékekben van. A spektrum és a referencia adatokat egyidejűleg modellezi, egyfajta iteratív úton: mindegyik lépésben az adatkészletből kivonja a spektrum és referencia adatok egy részét, maradékokat képezve. A modell a látens változók (vagy faktorok) számának növelésével egyre nagyobb mértékben írja le az adathalmaz varianciáját. A PLS ezekre a faktorokra – spektrumoknál az ún. loading-okra, a referencia adatoknál az ún. score-okra – részleges kalibrációkat alkalmaz a variancia összegének modellezésére, amelyeket a művelet végén egy átfogó kalibrációs egyenletbe összegyűjt. Általában több PLS faktor kerül kiszámításra, mint ahány a végső kalibrációhoz kell. Az optimális faktorszám meghatározása a PLS kalibráció fontos része: túl kevés faktor esetén a kalibráció kevés információt hordoz és nagy predikciós hibával dolgozik, míg túl sok faktor alkalmazásakor a modell túlilleszti a kalibrációs adatokat, és az így elveszti robosztusságát, stabilitását. Az optimális faktorszámot rendszerint keresztvalidálással vagy a kalibráló mintapopulációtól független, predikciós mintasereg segítségével határozzuk meg.

44

A keresztvalidálás során a kalibráló mintapopulációt alcsoportokba osztjuk. Ezen alcsoportok közül egyet visszatartunk addig, míg a maradék mintákkal megtörténik a kalibráció. Az így nyert kalibrációs egyenlettel úgy analizáltatjuk a visszatartott alcsoportot, mintha független, ismeretlen minták lennének benne. A statisztikai értékelés után a visszatartott alcsoport visszakerül a kalibráló mintaseregbe. Ezt követően a keresztvalidálás során az előbbiekben ismertetett műveletsor a többi alcsoporttal megismétlődik, majd az alcsoportokra kapott részeredmények összegződnek. Az egyes mintákra kiszámíthatjuk a kalibráció módszeres hibáját (standard error of calibration, SEC). A SEC a spektroszkópiai adatok és a hagyományos módszerrel kapott adatok különbségének szórása:

SEC =

∑ (Y

lab

− YNIR / NIT )

n − m −1

2

(3)

ahol Ylab a referencia érték, YNIR/NIT a NIR/NIT-tel meghatározott érték, n a mintaszám, m a független változók száma. Az r korrelációs koefficienst szintén az adatok illeszkedésének jellemzésére használjuk, értéke lineáris összefüggés esetén kifejezi az optikai és referencia adatok kapcsolatát. Minél szorosabb a kapcsolat, r értéke annál jobban megközelíti az 1-et, ha pedig nincs összefüggés, úgy r értéke 0.154

45

5. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉS 5.1. A búzaminták fő összetevőinek nedveskémiai vizsgálati eredményei 5.1.1. Nedvességtartalom, száraz- és nedvestömeg A három jellemző közti összefüggést akkor tudjuk a legjobban áttekinteni, ha a virágzás utáni napok száma (days after flowering, DAF) függvényében ábrázolt lefutásukat, melyek egy-egy ábrán kerülnek bemutatásra, együtt ábrázoljuk (20. ábra). A részletesebb elemzés előtt azonban két dologra ki kell térni: a párhuzamos mérések kérdésére, ill. a mért paraméterek vonatkoztatási alapjainak (mg/szem, ill. %) gyakorlati nézőpontjaira. Ezen az ábrasoron (20. ábra) a korábban ismertetett módszerek párhuzamos méréseinek átlaga, ill. az azokkal végzett számítások eredményei szerepelnek a hat búzafajta esetén. Mivel a búzaszemek nedvességtartalom és nedvestömeg mérései esetén 2-2, ill. 6-6 párhuzamos eredmény állt mintavételenként és fajtánként rendelkezésemre, ezért búzafajtánként bemutatom az átlagok mellett a szórások és a standard hibák változását a virágzás utáni napok számának függvényében (21., 22. ábra). A száraztömeg számításához az előbb említett paraméterek átlagait kellett használnom, mert míg adott mintavétel és fajta esetén a nedvestömeg 6 párhuzamos mérése egy-egy kalász szemeiből történt, addig a nedvességtartalom 2 párhuzamos méréséhez a magok a hat kalász szemeit magában foglaló mintából véletlenszerűen lettek kiválasztva, azaz nem feleltethetők meg egymásnak. (Ez az oka annak is, hogy a nedvességtartalom a nedvestömeg százalékában van megadva a 21. ábrán, hisz ha mg/szem alapon ábrázolnánk, akkor szintén az imént vázolt esettel találjuk magunkat szembe.) Ha visszatérünk a 20. ábrára, akkor látható, hogy a búzaszemek nedvességtartalmát és száraztömegét mind a szemtermésre (mg/szem), mind a nedvestömegre (%) vonatkoztatva bemutattam, melynek három gyakorlati oka van. Elsősorban: ez esetben jól láthatóak a két vonatkoztatási alap közti különbségek. Másodsorban: az ismert, irodalmi áttekintésben leírt tendenciák jobban áttekinthetőek. (Itt elég, ha visszagondolunk a mg/szem alapú ábrázolás és a szemfejlődés szintjeinek világosabb összefüggéseire.) Harmadsorban: a spektroszkópiai méréseim esetében, feltételezve a Lambert–Beer-törvény érvényességét, a vizsgálandó nedves minta adott komponensének koncentrációja (%) és a kapott abszorbanciaértékek között tudok kapcsolatot keresni, míg az abszolút mennyiség (mg/szem) erre alkalmatlan. 46

80

(a)

35

nedvességtartalom [%]

nedvességtartalom [mg/szem]

40 30 25 20 15 10 5 0

(b)

70 60 50 40 30 20 10 0

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

virágzás utáni napok száma

100

(c)

40 30 20 10

(d)

90

50 száraztömeg [%]

száraztömeg [mg/szem]

60

virágzás utáni napok száma

80 70 60 50 40 30

0

20 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

virágzás utáni napok száma

nedvestömeg [mg/szem]

90

virágzás utáni napok száma

(e)

80 70 60 50 40 30 20 10

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

20. ábra • A búzaszemek átlagos nedvességtartalmának és átlagos száraz- és nedvestömegeinek változása a szemfejlődés során a – nedvességtartalom [mg/szem] , b – nedvességtartalom [%] , c – száraztömeg [mg/szem] , d – száraztömeg [%] , e – nedvestömeg [mg/szem] = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

47

21. ábra • A búzaszemek nedvességtartalmának változása fajtánként

a virágzás utáni napok száma, mint kategóriák szerint, a nedvestömeg %-ában kifejezve

48

nedvességtartalom [nedvestömeg %]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

GK Öthalom

faj ta:

Mv 23

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

faj ta:

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

Mean±SE

Mean±SD

Bánkúti 1201

faj ta:

Fatima

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

faj ta:

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

Mean

Jubilejnaja 50

faj ta:

Mv 15

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

faj ta:

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

nedvességtartalom [nedvestöm eg %] (m intavételenként és fajtánként 2-2 párhuzam os m érés)

22. ábra • A búzaszemek nedvestömegének változása fajtánként

a virágzás utáni napok száma, mint kategóriák szerint, mg/szem-ben kifejezve

49

nedvestömeg [mg/szem]

10

20

30

40

50

60

70

80

90

10

20

30

40

50

60

70

80

90

GK Öthalom

faj ta:

Mv 23

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

faj ta:

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

Mean±SE

Mean±SD

Bánkúti 1201

faj ta:

Fatima

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

faj ta:

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

Mean

Jubilejnaja 50

faj ta:

Mv 15

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

faj ta:

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

nedvestöm eg [m g/szem ] (m intavételenként és fajtánként 6-6 párhuzam os m érés)

Ha a nedvességtartalom változását mg/szem alapon követjük nyomon (20/a ábra), akkor jól kirajzolódik az irodalmi áttekintésben ismertetett három szakasz: 15-23 DAF között a víz mennyisége folyamatosan növekszik, 23-38 DAF között közel állandó szinten marad, majd 38-53 DAF között gyorsan csökken. Természetesen az időpontok nem éles határokat jelentenek a szakaszok között, egyes fajták esetében egy-egy mintavételnyi eltolódás megfigyelhető – mint ahogy a következőkben tárgyalásra kerülő jellemzőknél is. Meg kell jegyeznem azonban, hogy a szakaszok hosszát, ill. az azokat elválasztó időpontokat (23/38 DAF) tekintve az irodalmi adatokhoz képest az esetek egy részében nagyon jó (pl. 22/40 DAF16), más részében viszont kevésbé jó (pl. 30/35 DAF19) megfelelést tapasztaltam. Ezt a kísérletek közti különbségeknek tudom be, mely oka a különböző búzafajták genetikai eltérésében, ill. a különböző környezeti feltételekben (összefoglalóan „évjárathatásban”) keresendő. A mintavételek gyakoriságának növelésével (pl. mintavétel minden második napon) talán pontosabban meg lehetne határozni a szakaszok közti átmenetet, és a fajták közti különbségeket. A nedvességtartalom változását %-os alapon vizsgálva (20/b ábra) rögtön szembe tűnik a szakirodalomból ismerős lineáris lefutás. Érdekes, amint a 15 DAF idején 73-76 % víztartalmat mutató szemek a 38 DAF elértekor 39-40 %-on „összezárnak”, majd ezt követően fajtától függő módon jutnak el az 50 DAF időpontjában tapasztalt 9-10 %-os víztartalomig, jelezve a száradási folyamatokban mutatkozó különbségeket. A száraztömeg változása mg/szem alapon (20/c ábra) szépen követi a szakirodalomban leírt szigmoid jelleget. A néhány napos lag periódus után, lineáris felhalmozási, akkumulációs szakasz figyelhető meg (15-38 DAF). A szárazanyag-tartalom a maximum elérése után közel állandó értéken maradt (38-53 DAF). A két fő szakasz közti átmenet időpontja esetén (38 DAF) – a nedvességtartalomnál fentebb részletezett okok miatt – az irodalmi adatokhoz képest hol kisebb (34., 37.43), hol nagyobb (46., 47.,23,49 48.24) eltérések figyelhetők meg. A száraztömeg változása %-os alapon történő elemzése (20/d ábra) a nedvességtartalomhoz hasonló eredményre vezet, mivel ha a teljes mag nedvestömegét 100 %-nak, a nedvesség arányát ehhez lépest x %-nak vesszük, akkor a szárazanyagot a 100-x % összefüggéssel számíthatjuk. Természetesen, amikor a nedvesség aránya növekszik, ott a száraztömeg aránya csökken – és fordítva.

50

A nedvestömeg változása mg/szem alapon (20/e ábra) a szakirodalomban ismert parabola jellegű lefutást követi, mely gyakorlatilag a mg/szem alapon ábrázolt nedvességtartalom (20/a ábra) és száraztömeg (20/c ábra) eredője. Ezen ábrasor (20/a, 20/c, 20/e ábra) segítségével világosan nyomon követhetőek a szemfejlődés fázisai a konkrét kísérlet során. A sejtosztódás fázisának befejeztével (15 DAF) megindul az intenzív vízfelvétel és száraztömeg-gyarapodás – ez tekinthető a sejtmegnyúlás és a szárazanyag-felhalmozódás közös fázisának. A 23 DAF idején a lassan megszűnő vízfelvétel és a tovább folytatódó száraztömeg-növekedés hatására a parabola felívelő ága kissé ellaposodik – ekkor már csak a szárazanyag-felhalmozódás fázisáról beszélhetünk. A parabola maximuma akkor jelenik meg, amikor a nedvességtartalom még nem csökken, a száraztömeg pedig már nem nő (36-38 DAF). Érdemes ekkor megfigyelni az egyes fajták közti különbségeket: az ábrákon is jól látható, hogy a Jubilejnaja 50 és a Fatima búzafajták esetében mind a nedvességtartalom, mind a száraztömeg a többi fajtához képest magasabb értéket mutat, s ez természetesen a nedvestömegükben is megmutatkozik. Ezt követően az érés fázisában a megszűnő szárazanyag-felhalmozódás és a vízvesztés hatására a nedvestömegek végül maximum értékük mintegy kétharmadánál zárulnak – ami összhangban van a szakirodalom ez irányú megfigyeléseivel.

5.1.2. Nitrogén-, fehérje- és szénhidráttartalom Az irodalmi rész tárgyalási sorrendjétől – szénhidrátok, majd fehérjék változása a szemfejlődés során – most gyakorlati okok miatt eltérek. Amint az az anyagok és módszerek részletezésekor kiderült, a búzamintákból nitrogéntartalom mérésére került sor. Ebből számíthatom nyersfehérje-mennyiséget, mely segítségével következtethetek az összes szénhidrát mennyiségére. Ennek menetét, eredményeit az alábbiakban foglalom össze. Mivel a nitrogéntartalom meghatározását a kiszárított szemekből végeztem el, ezért a 3-3 párhuzamos mérés átlagát, szórását és standard hibáját magában foglaló 23. ábra a száraztömeg százalékában mutatja a nitrogéntartalom változását a virágzás utáni napok számának függvényében, elkerülvén az előző fejezetben felvázolt problémát a nedvességtartalom és a nedvestömeg esetén előforduló más-más mintavételi gyakorlat okán. A nitrogéntartalom mg/szem és nedvestömeg % alapra történő átszámítására a nedvességtartalom és a nedvestömeg adatok segítségével nyílott lehetőség (24. ábra).

51

23. ábra • A búzaszemek nitrogéntartalmának változása fajtánként

a virágzás utáni napok száma, mint kategóriák szerint, a száraztömeg %-ában kifejezve

52

nitrogéntartalom [száraztömeg %]

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

3,2

3,4

3,6

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0

3,2

3,4

3,6

GK Öthalom

faj ta:

Mv 23

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

faj ta:

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

Mean±SE

Mean±SD

Bánkúti 1201

faj ta:

Fatima

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

faj ta:

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

Mean

Jubilejnaja 50

faj ta:

Mv 15

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

faj ta:

12 DAF 26 DAF 36 DAF 45 DAF 19 DAF 31 DAF 40 DAF 50 DAF

nitrogéntartalom [száraztöm eg %] (m intavételenként és fajtánként 3-3 párhuzam os m érés)

2,5 nitrogéntartalom [%]

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 (a)

0

2 1,5 1 (b)

0,5

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

virágzás utáni napok száma

virágzás utáni napok száma

24. ábra • A búzaszemek átlagos nitrogéntartalmának változása a szemfejlődés során a – nitrogéntartalom [mg/szem] , b – nitrogéntartalom [%] = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

Ha a mg/szem alapú ábrázolást vesszük szemügyre (24/a ábra), akkor a száraztömeghez hasonlóan (20/c ábra) a nitrogéntartalom lineáris felhalmozódási szakasza itt is 15-38 DAF között észlelhető. A különböző fajták esetében a szemfejlődés e szakaszában a lineáris korrelációs koefficiens (r) értéke 0,977 < r < 0,995 közti tartományban mutatkozott, mely alátámasztja a nitrogén- és a teljes fehérjetartalomra vonatkozó ez irányú irodalmi megfigyeléseket. 38 DAF után a nitrogéntartalom mennyisége teljes érésig közel állandó marad. Mind a mg/szem, mind a %-os alapú ábrázolási mód esetében feltűnő a száraztömeg időbeli lefutásához való hasonlóság (20/c, 20/d ábra). A szemfejlődés során a nitrogén- és szárazanyag-tartalom közti, erős korreláció kísérletemben is megfigyelhető (25. ábra). 3 nitrogéntartalom [%]

1,5 nitrogéntartalom [mg/szem]

nitrogéntartalom [mg/szem]

1,4

1,2 0,9 0,6 0,3 (a)

0 0

10

20

30

40

2,5 2 1,5 1 (b)

0,5

50

száraztömeg [mg/szem]

20

35

50

65

80

95

száraztömeg [%]

25. ábra • A búzaszemek átlagos nitrogéntartalma az átlagos száraztömegek függvényében a – nitrogéntartalom vs. száraztömeg [mg/szem] , b – nitrogéntartalom vs. száraztömeg [%] = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15 53

A különböző fajták esetében a mg/szem alapú összevetés során (25/a ábra) a lineáris korrelációs koefficiens 0,984 < r < 0,992, ill. %-os alapon történő összehasonlításkor (25/b ábra) 0,982 < r < 0,990 közti értékeket vett fel. A nyersfehérje-tartalmat a nitrogéntartalom és a búza esetében elfogadott 5,7-es ún. Kjeldahl-faktor szorzataként kaptam meg. Mivel csak egy konstanssal való szorzás történt, ezért az így számított nyersfehérje lefutását nem mutatom be önálló ábrákon, hisz az a nitrogéntartalom diagramjaitól (24. ábra) csak az ordináta skálázásában térne el. Azonban azt mindenképpen meg kell jegyeznem, hogy a szemfejlődés során a búzafehérjék mennyiségi és minőségi változásai együtt járnak aminosav-összetételük változásával, ami hatással lehet a Kjeldahl-faktorra is. Ennek ellenére a fiziológiai irodalomban a teljes szemfejlődési periódus alatt az eredeti 5,7-es értéket használják, s munkám során én is ezt a gyakorlatot követtem. Ismerve a búzaszem kémiai összetételét – melyet nagy mennyiségű szénhidrát mellett jelentős mennyiségű fehérje, ill. egy kis mennyiségű lipid- és hamutartalom jellemez – a nedvesség- és fehérjetartalom adatainak megléte lehetőséget ad a szénhidráttartalom becslésére a hagyományos különbség módszer szerint. Ennek értelmében, ha a nedvestömegből kivonjuk a nedvesség- és fehérjetartalmat, akkor a szénhidráttartalomra nézve információhoz jutunk, azzal a közelítésmóddal, amely során a lipid- és hamutartalom együttes, szárazanyagra vonatkoztatott 4 % alatti mennyiségét elhanyagoljuk. Az így származtatott

50

90

(a) szénhidráttartalom [%]

szénhidráttartalom [mg/szem]

szénhidráttartalom időbeli lefutását a 26. ábra szemlélteti.

40 30 20 10 0

(b)

80 70 60 50 40 30 20 10

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

virágzás utáni napok száma

26. ábra • A búzaszemek átlagos szénhidráttartalmának változása a szemfejlődés során a – szénhidráttartalom [mg/szem] , b – szénhidráttartalom [%] = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

54

A görbék lefutását tekintve természetesen szembetűnő a száraztömeghez való hasonlóság (20/c, 20/d ábra), amely a búzamag előbb említett kémiai összetételi arányaival magyarázható, ugyanis a száraztömeg változását például a szárazanyag-tartalom 75-85 %-át kitevő keményítő akkumulációja nagymértékben meghatározza. Mivel a szénhidráttartalom értéke számításon alapul, ezért inkább csak a változások arányaira, jellegére, mintsem az abszolút mennyiségekre hívnám fel a figyelmet. A száraztömeg, ill. a nitrogéntartalom elemzésénél már megfigyelt két fő szakasz – felhalmozódás (15-38 DAF) és stagnálás (38-53 DAF) – ez esetben is jól nyomon követhető. A búzaminták beltartalmi paramétereinek tárgyalását zárva a három fő összetevő (a nedvesség, a fehérje és a szénhidrátok) változását összefoglaló ábrasort mutatom be, a hat búzafajta közül kiragadva egyet (27. ábra). Mind az abszolút mennyiséget tükröző mg/szem alapú, mind a viszonylagos mennyiséget mutató, a mindenkori nedvestömegre vonatkoztatott %-os ábrázolási módon jól látszódik a nedvesség- és a szárazanyag-tartalom viszonya. Ha a magot egy „oldatnak” tekintjük, akkor látható, hogy az adott komponens (pl. fehérjék, szénhidrátok) koncentrációja (27/b ábra) nem csak az „oldott anyag”, hanem az „oldószer” (nedvesség) pillanatnyi mennyiségétől (27/a ábra) is függ. Ez magyarázza azt a jelenséget, hogy 38 DAF után akár a fehérjék, akár a szénhidrátok esetén a koncentráció nő, holott az „oldott anyag” bevitele, felhalmozódása megszűnt, ellenben az „oldat” töményedik az „oldószer” mennyiségének csökkenése révén. Ez a jelenség a most következő spektroszkópiai fejezetben is kulcsfontosságú körülmény, az elemzések alapját jelenti. 100

(a)

80

80

60

60

[%]

[mg/szem]

100

40

(b)

40

20

20

0

0

12 15 19 23 26 29 31 33 36 38 40 43 45 47 50 53

12 15 19 23 26 29 31 33 36 38 40 43 45 47 50 53

virágzás utáni napok száma

virágzás utáni napok száma

27. ábra • A búzaszemek fő összetevőinek változása a szemfejlődés során a Jubilejnaja 50 búzafajta esetében a – mg/szem alapon , b – a nedvestömeg %-ában = nedvességtartalom ,

= fehérjetartalom ,

= szénhidráttartalom

55

5.2. A búzaminták fő összetevőinek spektroszkópiai vizsgálati eredményei Az előző fejezetben nedveskémiai módszerekkel követhettük nyomon a fő komponensek (nedvesség, szénhidrátok, fehérjék) mennyiségi változásait a vizsgált búzaszemekben. Arra a kérdésre, hogy ezen összetevők tekintetében a roncsolásmentes NIR technikával többlet – vagy más jellegű, kiegészítő – információkhoz juthatunk-e, a következő fejezetek adnak választ. Mivel az alább következő vizsgálatoknál mind a hat búzafajtánál ugyanúgy jártam el, ezért csak az egyik (Jubilejnaja 50) elemzésén keresztül mutatom be a kiértékelés lépéseit, de természetesen ott, ahol a gondolatmenet logikája megköveteli, ill. az ábrázolásmód megengedi, a nedveskémiai eredményekhez hasonlóan a többi búzafajtára kapott eredményt is ismertetem. Mivel mintavételenként és fajtánként 5-5 párhuzamos spektroszkópiai mérést végeztem – így kiküszöbölve a minták biológiai változékonyságából és a betöltésből adódó inhomogenitást –, a kapott NIR spektrumokat átlagoltam. Ezek az ún. átlagspektrumok, ill. transzformáltjaik kerülnek bemutatásra, melyek szemléletesen tükrözik a szemfejlődés során bekövetkező változásokat a magon belül. A szemfejlődés folyamata alatt a NIR spektrumok a teljes hullámhossztartományban nagy változékonyságot mutattak mind a kezeletlen, ún. alapspektrumok, mind a kezelt,

1,8

0,08

1,6

0,06

1,4

0,04

2. derivált log(1/R)

log(1/R)

második derivált spektrumok esetében (28. ábra).

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1100

(a) 1300

1500

1700

1900

2100

2300

2500

0,02 0 -0,04

‡

†

-0,02

‡

†

†

*

-0,06 *

-0,08 -0,1 1100

(b)

* 1300

hullámhossz [nm]

1500

1700

1900

2100

2300

hullámhossz [nm]

28. ábra • A búzaszemek NIR spektrumainak változása a szemfejlődés során a Jubilejnaja 50 búzafajta esetében a – alap spektrumok , b – 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm) = 12 DAF minta ; vizsgált * = nedvesség , † = szénhidrát , ‡ = fehérje elnyelések

56

2500

Az alapspektrumok esetében (28/a ábra) jól elkülönül az első mintavétel (12 DAF) során gyűjtött, terméshéjjal együtt vizsgált búzamagok NIR spektruma, melyet az elkövetkező ábrákon eltérő vonaltípussal, ill. színnel jelölök, ekképp utalva a többi mintától való eltérésre. Az alapspektrumoknál megfigyelhető alapvonal-eltolódás a felület, a szemgeometria, ill. a szemtérfogat változásának tudható be. A széles, „átlapolódó” elnyelési sávok miatt a továbbiakban főként a transzformált spektrumok bemutatására, elemzésére kerül sor. A 2. derivált képzésének köszönhetően az alapvonal-eltolódások hatása csaknem eliminálódott, ill. éles, jól elkülönülő elnyelési sávok jelentek meg, melyek eddig az alapspektrum burkológörbe jellege miatt nem látszottak (28/b ábra). A búza fő összetevői és a közeli IR spektroszkópia kapcsolatát tárgyaló fejezetekben leírtak alapján három víz, három szénhidrát, ill. két fehérje eredetű elnyelési sáv részletesebb elemzésére volt lehetőségem.

5.2.1. A NIR spektrum jellegzetes víz sávjainak vizsgálata A víz változása és a közeli IR technika kapcsolatát részletező fejezetben áttekintést nyertünk az 1100-2500 nm-es hullámhossztartomány három legnagyobb intenzitású, vízelnyelési sávjának viselkedéséről a hőmérsékletváltozás, ill. a kaotróp és kozmotróp anyagok hatására. A szemfejlődés során a búzamagok alap spektrumában is jól azonosíthatóak, jellegzetesek ezek a sávok – szinte az egész spektrumot uralják (28/a ábra). Ennek fő oka az, hogy rezgés közben a víz O–H kötéseinek – a szerves vegyületekben, biopolimerekben előforduló egyéb kötésekhez képest – nagy a dipólusmomentum-változása (mivel az oxigén elektronegativitása és tömege is jelentősen nagyobb a hidrogénnél), ill. a vízmolekula összes atomjával képes hidrogénkötések kialakítására. A 2. derivált spektrumok alapján (28/b ábra) kiválasztottam azokat a szűkebb spektrumrégiókat, amelyek magukban foglalják a vizsgálandó vízcsúcsokat (IV. táblázat). név víz I víz II

tartomány 1890-1920 nm 1400-1420 nm

azonosítás az irodalom szerint O–H húzó és hajlító mozgások kombinációja O–H húzó mozgások első felhangja

víz III

1150-1165 nm

víz II és O–H hajlító mozgások kombinációja

IV. táblázat • A vizsgált vízcsúcsok A legerősebb elnyeléssel rendelkező, víz I régió 2. derivált spektrumának szemfejlődés során bekövetkező változása a 29/a ábrán látható. A víz koncentrációja arányos a negatív csúcs nagyságával, míg a hullámhossz-eltolódás a vízmolekulák közti asszociáció megvál57

tozására utal. Megkerestem a víz I spektrumszakasz 2. derivált log(1/R) értékeinek lokális minimumát, melyeket a fiziológiai változás idejét követve összekötöttem, elősegítve a csúcsváltozások könnyebb nyomon követhetőséget. A szemfejlődés korai szakaszában (15-26 DAF) a víz I csúcs kisebb hullámhosszak felé történő eltolódása, ill. az alacsony 2. derivált log(1/R) értékek a magban a szabad vizek magasabb koncentrációjára engednek következtetni. Ha visszalapozunk a 20/b vagy 27/b ábrákhoz, ahol a nedvestömeg %-ában kifejezett nedvességtartalmakat láthatjuk, akkor leolvasható, hogy ekkor 75 %-ről 55 %-ra csökken a nedvesség aránya. Ez a koncentrációtartomány önmagában is kedvez a szabad vizeknek. A 26-33 DAF közti szakaszban a szabad vizek szintjének csökkenése kissé lelassul (55 %-ról 45 %-ra esik a nedvességtartalom), de jelentősebb hullámhossz-eltolódás nem figyelhető meg. Az érési periódushoz közeledve megkezdődik a magok kiszáradása (33-53 DAF), mely során a víz I csúcs nagyobb hullámhosszak fele történő karakteres, 15-20 nm-es eltolódásával párhuzamosan a csúcs nagyságának csökkenését is nyomon követhetjük, ami a 45 %-ról 10 %-ra történő vízvesztéssel összhangban van. 2. derivált vízcsúcsról lévén szó ábrázoltam a lokális minimumok inverz értékeit a virágzás utáni napok függvényében a mennyiségi viszonyok tisztázása végett (29/b ábra). Ez olyan lefutást követ, mint amit a nedvességtartalom eredményei is mutatnak (20/b ábra). Ez bizonyítja a víz I csúcs érzékenységét a nedvesség mennyiségi változásaira. 0,1000 lokális minimum inverze

2. derivált log(1/R)

0,0000 53 DAF

-0,0200 -0,0400 33 DAF

-0,0600

26 DAF 12 DAF

-0,0800 -0,1000 1890

(a)

15 DAF

1895

1900

1905

1910

1915

1920

0,0800 0,0600 0,0400 0,0200 (b)

0,0000

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

hullámhossz [nm]

29. ábra • A víz I csúcs változása a szemfejlődés során a – 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm; Jubilejnaja 50) , b – lokális minimumok inverze (6 fajta) = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

58

De a víz I csúcs lokális minimumának nem csak az ordinátáról leolvasható értéke, hanem az abszcisszára vetített hullámhossza, ill. ezek dinamikája, időbeli változása is sok információt hordoz – különös tekintettel a hidrogénkötésben résztvevő vízmolekulák arányára. A szemfejlődés korai szakaszában (15-26 DAF) a magas nedvességtartalom miatt a szabad vizek túlsúlya feltételezhető. A relatív magas koncentrációban megjelenő prekurzorok (mint például a poláris jellegű vízoldható mono- és oligoszacharidok vagy a töltéssel rendelkező aminosavak) kaotrópoknak tekinthetők, s így hidratációjuk során a kötött vizek egyensúlyát a kevesebb, „gyengébb” hidrogénkötésekkel rendelkező HDW felé tolja el. E két tényező (azaz a szabad vizek nagyobb aránya, ill. a kötött vizek HDW jellege) okozza a vízmolekulák „gőz” szerű állapotát, ill. a víz I csúcs alacsonyabb hullámhosszak fele történő eltolódását. A középső, átmeneti szakaszban (26-33 DAF) a nedvességtartalom 50 % alá kerül, s immár a szárazanyag-tartalom aránya nagyobb a szemben. Az utolsó szakaszban (33-53 DAF) nem csak a szabad vizek aránya csökken le a kiszáradás következtében, hanem a túlsúlyba kerülő tartalék szénhidrátok és fehérjék, mint apoláris jellegű kozmotró– pok, a kötött vizek egyensúlyát a több, „erősebb” hidrogénkötésekkel rendelkező LDW felé tolja el. Tehát itt is két hatás eredője (azaz a szabad vizek kisebb aránya, ill. a kötött vizek LDW jellege) tehető felelőssé a vízmolekulák „jég” szerű állapotáért, ill. a víz I csúcs magasabb hullámhosszak fele történő eltolódásáért. Két magyarázó mondat erejéig érdemes kitérni a tartalék szénhidrátok és fehérjék apoláris jellegére. A keményítő szárazanyaga 20-30 % amilózt és 70-80 % amilopektint tartalmaz, s ezek a biopolimerek szerkezetüknek köszönhetik, hogy kevésbé hidrofóbbak, mint az őket felépítő glükóz monomerek. A gliadinok és gluteninek szintén tömör, szorosan hajtogatott makromolekulák, melyek másodlagos (vagy magasabb szintű) szerkezetüktől függően felszínükön számos hidrofób csoporttal rendelkezhetnek. A víz I csúcs további vizsgálatához a PQS módszerét használtam fel, mely során mind a hat búzafajta 2. derivált spektrumának teljes víz I tartományát (1890-1920 nm) figyelembe vettem, vonal módszert alkalmazva. A kétszeres szórásellipszisek az azonos mintavételhez tartozó minőségpontokra kerültek kiszámításra (30. ábra). A szemfejlődés korai szakaszában (15-26 DAF) adott mintavétel esetén az origóból a minőségpontokba mutató vektorok mind irányukban, mind hosszukban nagy varianciát mutatnak a fajták között, mely a szabad vizek jelenlétére és varianciájára enged következtetni. A második szakaszban (26-53 DAF) a víz I csúcs eltolódása a nagyobb hullámhosszak fele a vektorok szögének óramutató járásába történő elmozdulásában, míg a nedvességtartalom csökkenése a vekto-

59

rok rövidülésében jelentkezik. Az ellipszisek mérete számottevően kisebb ebben a fázisban, mely a fajták közti különbségek, a biológiai variabilitás mérséklődését jelzi.

30. ábra • PQS minőségpontok a víz I csúcs vizsgálata alapján (1890-1920 nm, 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm), vonal módszer) □ = 12 , □ = 15 , □ = 19 , □ = 23 , □ = 26 , □ = 29 , □ = 31 , □ = 33 , □ = 36 , □ = 38 , □ = 40 , □ = 43 , □ = 45 , □ = 47 , □ = 50 , □ = 53 DAF A víz I csúcs nagyfokú érzékenysége kisebb energiaszintjével, ill. kombinációs sávjának (ν1,3 + ν2) hajlító mozgásokra jellemző (ν2) tagjával függhet össze. Ezt a feltételezést erősítheti meg a víz II csúcs vizsgálata. A három elemzett vízcsúcs közül a víz II régiója középen helyezkedik el az intenzitás tekintetében. A szemfejlődés során bekövetkező változását a 31. ábra foglalja össze. Az szemfejlődés korai szakaszában (15-23 DAF) a negatív csúcs mérete megnagyobbodik, jelentékeny nedvességtartalom-növekedésre utalva, majd ezt követően (23-45 DAF) gyors vízvesztés zajlik le. Ezek a változások az 1405-1410 nm-es tartományban figyelhetők meg. Csak az utolsó három-négy mintavételi pontban, az érés késői fázisában (45-53 DAF) tapasztalható jelentősebb, 10-15 nm-es hullámhossz-eltolódás. Az eredmények arról tanúskodnak, hogy a víz II csúcs a vízmolekulák O–H kötéseinek szimmetrikus és aszimmetrikus húzó mozgása által generált elnyelési sáv első felharmonikusaként (2ν1,3) bizonyos fokig „látja” a mennyiségi és minőségi változásokat, de ezek mértéke és érzékenysége (külö60

nösen a szemfejlődés korai szakaszában) nem olyan határozott, mint a víz I esetén, amely tartalmazza a hajlító mozgásokra jellemző (ν2) tagot. A PQS elemzés megerősítette a víz II csúcs aránylag kis érzékenységét. 0,0900

-0,0200

53 DAF 45 DAF

12 DAF

-0,0400

15 DAF

-0,0600

lokális minimum inverze

2. derivált log(1/R)

0,0000

23 DAF (a) -0,0800 1390 1395 1400 1405 1410 1415 1420 1425 1430

0,0700 0,0500 0,0300 (b)

0,0100

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

hullámhossz [nm]

31. ábra • A víz II csúcs változása a szemfejlődés során a – 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm; Jubilejnaja 50) , b – lokális minimumok inverze (6 fajta) = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

A legkisebb intenzitással bíró víz III csúcs a víz I-hez hasonlóan szintén egy kombinációs elnyelési sáv, mely változását a szemfejlődés során a 32. ábra szemlélteti. Az első szakaszban (15-33 DAF) csak a negatív csúcs nagysága változik, nem történik hullámhossz-eltolódás. A második szakaszban (33-53 DAF) viszont egy 10 nm körüli eltolódás észlelhető, amely a folyamatos vízleadást kíséri. 0,0450 lokális minimum inverze

2. derivált log(1/R)

0,0000 53 DAF

-0,0100 12 DAF

-0,0200 -0,0300

15 DAF 33 DAF

26 DAF (a) -0,0400 1140 1145 1150 1155 1160 1165 1170 1175 1180

0,0350 0,0250 0,0150 (b)

0,0050

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

hullámhossz [nm]

32. ábra • A víz III csúcs változása a szemfejlődés során a – 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm; Jubilejnaja 50) , b – lokális minimumok inverze (6 fajta) = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

61

A korábbi feltételekkel a víz III tartományára (1150-1165 nm) is elvégeztem a PQS elemzést (33. ábra). A szemfejlődés első felében (15-33 DAF) az origóból az ellipszisekbe mutató vektorok iránya hasonló, de hosszuk a jelenlevő nedvesség mennyiségének függvényében változik, míg a második szakaszban (33-53 DAF) a vektorok mind irányukban, mind hosszukban jelentékeny mértékben változnak.

33. ábra • PQS minőségpontok a víz III csúcs vizsgálata alapján (1150-1165 nm, 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm), vonal módszer) □ = 12 , □ = 15 , □ = 19 , □ = 23 , □ = 26 , □ = 29 , □ = 31 , □ = 33 , □ = 36 , □ = 38 , □ = 40 , □ = 43 , □ = 45 , □ = 47 , □ = 50 , □ = 53 DAF A víz III csúcs (2ν1,3 + ν2) a víz I (ν1,3 + ν2) és víz II (2ν1,3) elnyelési sávok jellegzetességeit is magán viseli. A kezdeti érzéketlenség legvalószínűbb oka az O–H húzómozgás első felharmonikusa (2ν1,3), mint a víz II esetében, amit felvált a hajlító mozgás (ν2) válasza, hasonlóan a víz I csúcshoz. Lezárva a vízcsúcsok elemzését összefoglalásként elmondhatjuk, hogy a NIR spektrumok segítségével a búza szemfejlődése során nem csak a nedvességtartalom mennyiségi változásáról kaptunk információt, hanem a szabad és kötött vízmolekulák állapotáról, ill. hidrogénkötés-rendszerükről is, melyeket az oldószer abszolút mennyiségén kívül az oldott anyagok mennyisége és minősége is nagymértékben befolyásol.

62

5.2.2. A NIR spektrum jellegzetes szénhidrát sávjainak vizsgálata A szénhidrátok vizsgálata és a közeli IR technika kapcsolatát részletező fejezetben láthattuk, hogy a fő komponensek – különösen a szénhidrátok és a fehérjék – elnyelési sávjai sok esetben átfednek egymással, jelentősen csökkentve a további elemzés alá vonható szénhidrátcsúcsok számát. A szénhidrátkomponensek elemzésére lehetőségeket adó elnyelési sávokat foglalja össze az V. táblázat. név szénhidrát I

tartomány 1585-1595 nm

azonosítás az irodalom szerint O–H húzó mozgások első felhangja (H-kötés)

szénhidrát II

2270-2280 nm

O–H és C–C húzó mozgások kombinációja

szénhidrát III

2325-2335 nm

C–H húzó és hajlító mozgások kombinációja

V. táblázat • A vizsgált szénhidrátcsúcsok A szénhidrát I sávot a keményítő hidrogénkötésben résztvevő hidroxilcsoportjainak elnyelésének tulajdonítják a szakirodalomban. E csúcs változását a búzamag szemfejlődése során a 34. ábra foglalja össze. 0,0040

0,0030

lokális minimum inverze

15 DAF

2. derivált log(1/R)

0,0020 26 DAF

0,0010

12 DAF

0,0000

38 DAF

-0,0010 -0,0020 53 DAF

-0,0030 1540

1560

1580

(a) 1600

1620

0,0030 0,0020 0,0010 0,0000 -0,0010 -0,0020 (b)

-0,0030

1640

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

hullámhossz [nm]

34. ábra • A szénhidrát I csúcs változása a szemfejlődés során a – 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm; Jubilejnaja 50) , b – lokális minimumok inverze (6 fajta) = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

A 34/a ábrán látható, hogy a 2. derivált log(1/R) értékeinek lokális minimumát összekötő vonal gyakorlatilag hullámhossz-eltolódás nélkül egyenletesen halad, egy lineáris koncentrációnövekedést sugallva. Ha megtekintjük a lokális minimumok inverz értékeit a virágzás utáni napok függvényében (34/b ábra), akkor a lineáris növekedést most már tényként kezelhetjük. Ugyanezzel a lefutással találkozhatunk, ha visszalapozunk a szénhidrátok (26/b ábra) és a száraztömeg (20/d ábra) nedvestömeg %-ában kifejezett mennyisé63

gét bemutató grafikonokhoz. A szénhidrát I. csúcs lokális minimumainak inverz értékei (34/b ábra) és a % alapú szénhidráttartalom (26/b ábra) közti összevetés eredményeként a különböző fajták esetében az általam vizsgált szemfejlődési szakaszában a lineáris korrelációs koefficiens értéke 0,964 < r < 0,988 közti tartományban mutatkozott. A fiziológiai ismeretekből tudjuk, hogy a szénhidrát-felhalmozódás nagy részét a keményítő teszi ki, ill. hogy az érés előrehaladtával a keményítő intramolekuláris hidrogénkötéseiben résztvevő hidroxilcsoportok száma nő. A közeli IR irodalmából pedig az ismeretes, hogy a szénhidrát I csúcs a hidrogénkötésben résztvevő hidroxilcsoportokra érzékeny. E két tudományterület tényeit egybevetve arra a következtetésre juthatunk, hogy a szénhidrát I csúcs segítségével a szemfejlődés során nyomon követhetőek a keményítő mennyiségi változásai annak intramolekuláris hidrogénkötésein keresztül. A szénhidrát II régiót a vízoldható szénhidrátok (pl. fruktóz, glükóz, szacharóz) kombinációs sávjáként tartjuk számon, melyben az O–H és C–C kötések húzó mozgásai nyelnek el. E csúcs alakulását a búzaszemek fejlődése folyamán a 35. ábra szemlélteti. 0,0130 38 DAF

-0,0050

lokális minimum inverze

2. derivált log(1/R)

-0,0030 26 DAF

53 DAF 12 DAF

-0,0070 -0,0090 -0,0110 -0,0130 2265

15 DAF

(a) 2270

2275

2280

2285

0,0110 0,0090 0,0070 0,0050 (b)

0,0030

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

hullámhossz [nm]

35. ábra • A szénhidrát II csúcs változása a szemfejlődés során a – 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm; Jubilejnaja 50) , b – lokális minimumok inverze (6 fajta) = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

Mivel kísérletem során a búzaszemek vízoldható szénhidráttartalmáról közvetlen nedveskémiai adatok nem születtek, ezért a szénhidrát II csúcs lefutását csak a növényfiziológiai és közeli IR spektroszkópiai irodalom tükrében tudom megvilágítani. Arról, hogy a vizsgált csúcs elég érzékenyen és koncentrációarányosan követi a vízoldható szénhidráttartalmat, úgy győződtem meg, hogy az érő búzában leginkább előforduló fruktóz, glükóz és szacharóz hígítási sorait NIT elrendezésben megmértem (36. ábra).

64

log(1/T)

2,5 2 1,5

0,8

1,1 1 0,9 × 0,8 2200 2250 2300 2350

Ø

0,6 2. derivált log(1/T)

3

1 0,5

0,4 0,2

Ø

-0,05 2200 2250 2300 2350

0 -0,2

(a) 1300

1500

1700

1900

2100

2300

-0,6 1100

2500

(b) 1300

1500

hullámhossz [nm]

log(1/T)

2 1,5

0,8

1,1 1 0,9 × 0,8 2200 2250 2300 2350

Ø

0,6

1 0,5

0,4 0,2

Ø

(c)

1,5

2300

2500

0,05 0

0 -0,2

1300

1500

1700

1900

2100

2300

-0,6 1100

2500

(d) 1300

1500

1700

1900

2100

2300

2500

hullámhossz [nm]

0,8

1,1 1 0,9 × 0,8 2200 2250 2300 2350

Ø

0,6 2. derivált log(1/T)

log(1/T)

2

2100

-0,05 2200 2250 2300 2350

hullámhossz [nm]

2,5

1900

-0,4

0 1100

3

1700

hullámhossz [nm]

2. derivált log(1/T)

2,5

0

-0,4

0 1100

3

0,05

1 0,5

0,4 0,2

Ø

0,05 0

-0,05 2200 2250 2300 2350

0 -0,2 -0,4

0 1100

(e) 1300

1500

1700

1900

2100

2300

2500

-0,6 1100

(f) 1300

1500

hullámhossz [nm]

1700

1900

2100

2300

hullámhossz [nm]

36. ábra • Jellegzetes vízoldható szénhidrátok egykomponensű hígítási sorainak NIT spektrumai a – fruktóz, alap spekrum , b – fruktóz, 2. derivált spektrum (kapu: 10 nm, rés: 0 nm) , c – glükóz, alap spekrum , d – glükóz, 2. derivált spektrum (kapu: 10 nm, rés: 0 nm) , e – szacharóz, alap spekrum , f – szacharóz, 2. derivált spektrum (kapu: 10 nm, rés: 0 nm) A bal felső sarokban kinagyított ábrákon a spektrumok a nyilak irányában rendre 0, 40, 100, 200, 400 g/l koncentrációkat követik.

65

2500

Az ábrasor azt igazolja, hogy a 2250-2280 nm-es régióban a fruktóz, a glükóz és a szacharóz koncentráció arányos elnyelési sávokkal rendelkeznek. Mivel a hígítási sorok igazolták a szénhidrát II régió alkalmazhatóságát a vízoldható szénhidrátok vizsgálatában, ezért viszszatérek a 35. ábra elemzéséhez. Ha megfigyeljük a lokális minimumok inverz értékeit a virágzás utáni napok függvényében (35/b ábra), akkor az indirekt spektroszkópiai bizonyítékok (i.e. hígítási sorok) mellé felsorakoznak a növényfiziológiai bizonyosságok. Az irodalmi adatokkal egyezően a vízoldható szénhidrátok maximum értéküket 15 DAF időpontra érik el, amit egy folyamatos csökkenés követ 26 DAF eléréséig. Ezután egy viszonylag állandó szintet fenntartva szolgálnak forrásként a keményítő-előállításhoz. A 35/b ábrán 26 DAF után kisebb hullámokat láthatunk, de ezek véleményem szerint a nedvességtartalom változásának százalékos összetételre gyakorolt hatásával hozható összefüggésbe. A búzafajták között általában nem volt nagy különbség a lefutást illetően. Az eredmények azt jelzik, hogy a mono- és diszacharidok nagy mennyiségben képződnek a 15-26 DAF periódusban, majd később felhasználódnak a keményítőszintézisben. A szénhidrát III régió esetében a 2. derivált képzése során a kapu méretét 10 nm-ről 4 nm-re kellett csökkentenem, mivel 2300-2370 nm között egy hármas elnyelési sáv figyelhető meg, s csak így lehetett a sávokat elválasztani egymástól. A szénhidrát III csúcs változását a búzamag szemfejlődése során a 37. ábra mutatja be.

26 DAF

0,0005 0,0000

lokális minimum inverze

2. derivált log(1/R)

0,0010

15 DAF

38 DAF

-0,0005

12 DAF

-0,0010 53 DAF

-0,0015 2320

2325

2330

(a) 2335

0,0015 0,0010 0,0005 0,0000 -0,0005 -0,0010 (b)

-0,0015

2340

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

hullámhossz [nm]

37. ábra • A szénhidrát III csúcs változása a szemfejlődés során a – 2. derivált spektrumok (kapu: 4 nm, rés: 0 nm; Jubilejnaja 50) , b – lokális minimumok inverze (6 fajta) = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

66

Ha megfigyeljük a lokális minimumok inverz értékeit a virágzás utáni napok függvényében (37/b ábra), akkor úgy tűnik, mintha a szénhidrát I és szénhidrát II esetén kapott hasonló jellegű ábrák (34/b, 35/b ábra) szuperpozícióját látnánk. Ennek magyarázata a szénhidrát III régiót jellemző C–H kötések húzó és hajlító mozgásaiban keresendő. Ez a kötés minden szénhidrátban megtalálható, legyen szó akár mono-, oligo- vagy poliszacharidokról, s feltételezhetően kevésbé érzékeny arra a folyamatosan változó környezetre, ami a szemfejlődés alatt álló magot jellemzi. Összefoglalva a szénhidrátok jellemző régióinak elemzését elmondható, hogy mind a szemfejlődés első szakaszában nagyobb mennyiségben megtalálható vízoldható szénhidrátok, mind az akkumulációs periódusban folyamatosan gyarapodó keményítő változása jól nyomon követhető a NIR technikával, köszönhetően a közeli IR elnyelési sávok specifikus eredetének.

5.2.3. A NIR spektrum jellegzetes fehérje sávjainak vizsgálata A fehérjék és a közeli IR technika kapcsolatát részletező fejezetéből kitűnt, hogy a kombinációs tartományban a fehérjék vázrezgéseiből eredő elnyelési sávok érzékenyek a fehérjék magasabb szintű szerkezetére. Két ilyen elnyelési sáv elemzésére nyílik lehetőség a fejlődő mag esetén, amelyeknek intenzitása elég nagy, ill. ahol a szénhidrátok zavaró hatása sem jelentkezik (VI. táblázat). név fehérje I

tartomány 2055-2065 nm

azonosítás az irodalom szerint amid A és amid II kombinációja (amid A/II)

fehérje II

2175-2180 nm

változó: amid I/II, amid B/II, amid A/III

VI. táblázat • A vizsgált fehérjecsúcsok A fehérje I sáv amid A/II kombinációs asszignációja széleskörűen elfogadott. Változását a búzaszem fejlődése folyamán a 38. ábra foglalja össze. Ahogy azt a közeli IR irodalmi áttekintésében láthattuk, ez a csúcs a fehérjék hődenaturációja során a natív, hidrogénkötésekkel stabilizált forma esetén mutatat nagyobb elnyelést. A fiziológiai irodalom áttekintésében a fehérjékkel kapcsolatban szintén előkerültek a hidrogénkötések: a hiperaggregációs modell második, mezoszkópikus szintjén az első, molekuláris szinten kialakult kisebb aggregátumok (EPP) asszociációjával nagyobb aggregátumok (UPP) alakulnak ki, amelyek stabilizációs folyamataiban az intra- és intermolekuláris hidrogénkötéseknek lé-

67

nyeges szerep jut. Ezen tények ismeretében a fehérje I csúcs lokális minimumának inverz értékének időbeli lefutása sokkal könnyebben értelmezhető (38/b ábra).

2. derivált log(1/R)

15 DAF

lokális minimum inverze

0,0015 12 DAF

0,0005 23 DAF

38 DAF

-0,0005 -0,0015 53 DAF

-0,0025 2040

(a) 2050

2060

2070

0,0025 0,0015 0,0005 -0,0005 (b)

-0,0015

2080

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

hullámhossz [nm]

38. ábra • A fehérje I csúcs változása a szemfejlődés során a – 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm; Jubilejnaja 50) , b – lokális minimumok inverze (6 fajta) = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

A szemfejlődés első szakaszában kezdeti bizonytalanságok mutatkoznak 26 DAF eléréséig, melyet elsősorban a nagy víztartalmú környezett maszkírozó hatásával lehet magyarázni. A középső szakaszban, 26 DAF után kisfokú, közel lineáris növekedés figyelhető meg, amely az utolsó szakasz kezdetéig, 38 DAF eléréséig tart. Az utolsó szakaszban intenzív növekedés tapasztalható, mely annál sokkal nagyobb mértékű, hogy csak a vízvesztésből eredő koncentrációnövekedésnek legyen tulajdonítható. Ezt támasztja alá az a fiziológiai területen elfogadott megfigyelés, mely szerint a mag száradásának kezdetére tehető a fehérjeoldhatóság hirtelen megváltozása az UPP frakció mennyiségének gyors emelkedése által. Ha visszalapozunk a mag nedvességtartalmát mg/szem alapon bemutató 20/a ábrára, akkor jól látható, hogy 38 DAF után drasztikusan csökken a szemek nedvessége, méghozzá fajtánként kissé eltérő dinamikát követve. Ez az eltérés a vízvesztésben, mint egyfajta indukciós hatásban, tovább gyűrűzhet az UPP frakció felhalmozódásának sebességében, s talán ez okozza a 38 DAF utáni különbségeket a búzafajták között a 38/b ábrán. A 2180 nm körül jelentkező fehérje II régió szemfejlődés során bekövetkező változása a 39. ábrán látható. A közeli IR irodalma szerint a fehérjék hődenaturációja folyamán ez a elnyelési sáv – a fehérje I csúccsal ellentétben – a stabilizáló hidrogénkötések részleges vagy teljes hiánya miatt natív szerkezetüket elvesztő, denaturált, „kicsomagolt” fehérjékre érzékeny. A fiziológiai irodalomban az EPP frakció állapota hasonló ehhez, legalábbis ha a

68

hidrogénkötés-rendszerét a sikér kiterjedt, végső hidrogénkötés-hálózatához hasonlítjuk. Ennek fényében érdemes megvizsgálni a fehérje II csúcs lokális minimumának inverz értékének időbeli lefutását (39/b ábra). 0,0000

0,0022

lokális minimum inverze

2. derivált log(1/R)

15 DAF

0,0018 0,0014

12 DAF 23 DAF

0,0010

38 DAF

0,0006 0,0002 2160

53 DAF

(a) 2165

2170

2175

2180

2185

-0,0005 -0,0010 -0,0015 (b)

-0,0020

2190

12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 virágzás utáni napok száma

hullámhossz [nm]

39. ábra • A fehérje II csúcs változása a szemfejlődés során a – 2. derivált spektrumok (kapu: 10 nm, rés: 0 nm; Jubilejnaja 50) , b – lokális minimumok inverze (6 fajta) = GK Öthalom ,

= Bánkúti 1201 ,

= Jubilejnaja 50 ,

= Mv 23 ,

= Fatima ,

= Mv 15

A fehérje I régióhoz képest a különbség szembeszökő: ez a csúcs 38 DAF időpontig intenzíven nő, majd utána közel állandó értéket mutat. Az intenzív növekedés szakaszát hozzárendelhetjük a hiperaggregációs modell első, molekuláris szintjéhez, ahol az EPP alegységek jönnek létre, főként kovalens kötőerők (diszulfidhidak) által stabilizálva. A második, mezoszkópikus szint kezdetekor – mely egybeesik a vízleadás megindultával – az EPP mennyisége elkezd csökkeni, a nagyobb aggregátumok, az UPP frakció mennyisének növekedése következtében. Ez a mennyiségi csökkenés a 39/b ábrán rejtve marad, mivel ekkor a nedvességtartalom is csökken, s a koncentráció közel azonos szinten stabilizálódik. Jogosan merül fel az a kérdés, hogy mi lehet a spektroszkópiai háttere a fehérje I és a fehérje II csúcsok ily különböző időbeli lefutásának. A fehérje I régió amid A/II kombinációjának amid A része az N–H húzó mozgásokat takarja, ahogy ezt a fehérjék és a közeli IR technika kapcsolatát részletező fejezet I. táblázata is mutatja. Ugyanitt látható, hogy az amid II maga is egy kombináció, amelyben az N–H hajlító mozgások is szerepet kapnak. Ezért ha egy peptidkötésben résztvevő N–H csoport hidrogénje kötést létesít egy másik peptidkötés C=O csoportjának oxigénjével, akkor a relatív nagy dipólusmomentum-változással rendelkező N–H rezgések érzékenyen követik ezt a változást. A fehérje II esetén nem ilyen egyszerű a helyzet, mivel itt több magyarázat is született a csúcs asszignálására

69

(amid I/II, amid B/II, amid A/III). A meglevő modellek alapján feltehetően az N–H hajlító és/vagy a C=O húzó mozgások okoznak a fehérje I régiótól eltérő specificitást. Összefoglalva a fehérjék jellemző régióinak elemzését elmondható, hogy a nedveskémiai módszerrel mért nyersfehérje-tartalomhoz képest sokkal árnyaltabb képet kaptunk a magban lejátszódó folyamatokról. A közeli IR technikával nyomon követhetőek a tartalékfehérjék hiperaggregációs szintjei, legyen szó akár a kisebb aggregátumokból álló EPP, akár a nagyobb aggregátumokból álló UPP frakciókról.

5.2.4. Mennyiségi kalibrációk A spektroszkópiai eredmények eddigi ismertetése során, a jellegzetes elnyelési sávok elemzése által inkább egy minőségi kép rajzolódott ki, mivel csupán tendenciákat állapíthattam meg a különböző komponensek mennyiségét, koncentrációját illetően. Az elkövetkezendőkben a NIR spektrumok és a referencia adatok közti kapcsolat kvantitatív bemutatására vállalkozom. A tágan értelmezett „referencia adatok” kifejezés alatt most olyan paraméterek is szerepelnek, mint a kémiai összetétellel összefüggő nedvesség- és nitrogéntartalom (% alapon, nedvestömegre vonatkoztatva), vagy az inkább fizikai információt hordozó nedves- és száraztömeg (mg/szem alapon), ill. a jelen esetben a biológiai, fiziológiai állapotot leíró idő, a virágzás utáni napok számában kifejezve. A kalibrációk a PLS módszerével készültek 96 átlagspektrum (6 fajta × 16 mintavételi időpont) felhasználásával. Teljes keresztvalidálást alkalmaztam, 16 maximális faktort megengedve, az esetleges túlillesztés észlelése végett. Követve a minőségi elemzésben alkalmazott spektrum-transzformációt, 2. deriváltakat képeztem 10 nm-es kapu és 0 nm-es rés beállításokkal. A kalibrációk eredményeit a VII. táblázatban és a 40. ábrán foglaltam össze. név nedvességtartalom [% nedvestömeg] nitrogéntartalom [% nedvestömeg]

faktor 9 11

r/r2 0,9972 / 0,9945 0,9942 / 0,9884

SEC 1,5516 0,0589

nedvestömeg [mg/szem]

11

0,9809 / 0,9621

3,3609

száraztömeg [mg/szem]

10

0,9872 / 0,9745

2,3414

idő [DAF]

10

0,9947 / 0,9895

1,3123

VII. táblázat • A PLS kalibrációk főbb statisztikai eredményei

70

3

80

2,5

NIR

NIR

60 40 20

2 1,5 1

(a)

0 0

20

40

60

(b)

0,5

80

0,5

1

1,5

referencia

2

2,5

3

referencia

60 80 45 NIR

NIR

60 40

30 15

20 (c)

0 0

20

40

60

(d)

0 0

80

15

30

45

60

referencia

referencia

55

NIR

40

25

(e)

10 10

25

40

55

referencia

40. ábra • A PLS kalibráció által a NIR spektrum alapján becsült érték a referencia érték függvényében a – nedvességtartalom [% nedvestömeg] , b – nitrogéntartalom [% nedvestömeg] , c – nedvestömeg [mg/szem] , d – száraztömeg [mg/szem] , e – idő [DAF]

71

A statisztikai adatok tükrében az látszik, hogy mindegyik vizsgált jellemző esetén a korrelációs koefficiens 0,98 feletti értéket mutat, amely egy olyan varianciát produkáló biológiai minta esetén, mint az érő búza, nem rossz eredmény. A nedvesség- és nitrogéntartalom meghatározására nyert kalibrációs összefüggések pontossága és teljes tartományú lineáris illeszkedése igazolja a két makroösszetevő gyors mérhetőségét (40/a, 40/b ábra), ugyanakkor a mag kémiai és fizikai állapotát együttesen leíró nedves- és száraztömeg jellemzők valamivel pontatlanabbul prediktálhatók a spektrumok alapján (40/c, 40/d ábra). A biológiai szempontból fontos paramétert, az érési időt – vagyis az érő mag státuszát – másfél napos hibahatáron belül lehet megállapítani a felállított kalibrációk segítségével (40/e ábra). Ezt az értéket a vizsgálatok reprodukálhatóságára korlátozza a 4.1. fejezetben ismertetett tény, mely szerint a referencia adatként szolgáló időskála kezdeti pontjául a virágzás utáni 12. napot kiindulási alapként elfogadhatjuk, de az eltérés hatásával mindig számolni kell. Az érési folyamat tehát közvetve követhető, monitorozható a NIR/NIT spektroszkópiai módszerekkel és ezen monitorozás az érő mag kémiai, fizikai, biológiai állapotát egyaránt tükrözi.

72

6. ÖSSZEFOGLALÁS Munkám során a búza élettani folyamatai közül a magkialakulás szakaszait vizsgáltam közeli infravörös reflexiós (near infrared reflectance, NIR) spektroszkópiai technika alkalmazásával. Célom az volt, hogy igazoljam ezen roncsolásmentes mérőmódszer alkalmazhatóságát a búzamag aratás előtti (preharvest) folyamatainak gyors, megbízható kimutatására. A NIR technika mellett szól számos előnyös tulajdonsága: a mérések roncsolásmentes volta, mely lehetővé teszi a minták előkészítés nélküli és gyors analízisét a minta minőségi és/vagy mennyiségi megváltoztatása nélkül; a spektrumok által hordozott sokrétű információ több beltartalmi tulajdonságról (pl. nedvesség-, fehérje-, szénhidráttartalom) ad egyidejű felvilágosítást; a rövid analízisidő kiválóan alkalmassá teszi ezt a technikát rutinmérések végzésére; a metodika lehetőséget nyújt dinamikus biológiai rendszerekbe való „betekintésre”. Kísérleteim során 6 különböző, eltérő tenyészidejű búzafajta (GK Öthalom, Bánkúti 1201, Jubilejnaja 50, Mv 23, Fatima, Mv 15) mintáinak spektrumait gyűjtöttem össze 1997. június 6-tól, a virágzás utáni 12. naptól (days after flowering, DAF) egész a betakarításig, 1997. július 17-ig, a virágzás utáni 53. napig, 16 mintavétel alkalmával. A NIR spektrumokat az 1100-2500 nm-es hullámhossztartományban vettem fel, fajtánként és mintavételenként n = 5 ismétléssel. A spektrumok felvételével párhuzamosan olyan fizikai és kémiai tulajdonságokat is meghatároztam, mint a nedvestömeg (n = 6), nedvességtartalom (n = 2), ill. ezek átlagából számított száraztömeg. A szárított szemekből nitrogéntartalmat határoztam meg Dumasféle égetéses eljárással (n = 3). A mért adatok alapján a teljes szénhidráttartalmat számítottam. A mért és számított jellemzőket mind mg/szem, mind nedvestömeg % alapon ábrázoltam. A nedvesség- és szárazanyag-tartalom lefutása alapján elkülöníthetőek voltak a szemfejlődési periódusok: 12-15 DAF a sejtosztódás fázisa, 15-38 DAF a sejtmegnyúlás és a szárazanyag-felhalmozódás közös szakasza, míg 38-53 DAF az érés időszaka.

73

Részletesen megvizsgáltam és elemeztem az átlapoló, „elkent” csúcsokat tartalmazó spektrális adatokban rejlő minőségi információkat, amelyhez a második derivált transzformált spektrumok nyújtottak segítséget. A szemfejlődés folyamata alatt a NIR spektrumok a teljes hullámhossztartományban nagy varianciát mutattak mind a kezeletlen, ún. alapspektrumok, mind a kezelt, második derivált spektrumok esetében. Kimutattam és asszignációs módszerekkel igazoltam, hogy három jellemző víz, három szénhidrát, ill. két fehérje eredetű elnyelési sáv részletesebb elemzése alkalmas az érésdinamikai folyamatok érzékeny követésére, a komplex változások elemzésére. A NIR spektrumok víz sávjai segítségével – víz I (1890-1920 nm), víz II (1400-1420 nm), víz III (1150-1165 nm) – a búza szemfejlődése során nem csak a nedvességtartalom menynyiségi változásáról kaptam új információkat, hanem a szabad és kötött vízmolekulák állapotáról, ill. hidrogénkötés-rendszerükről is árnyalt képet tudtam alkotni. A polár minősítő rendszer (polar qualification system, PQS) felhasználásával kimutattam az érés során bekövetkező nagyfokú minőségi változásokat a víz tekintetében. A szénhidrát régiók mind a szemfejlődés első szakaszában nagyobb mennyiségben megtalálható vízoldható szénhidrátok [szénhidrát II (2270-2280 nm)], mind az akkumulációs periódusban folyamatosan gyarapodó keményítő [szénhidrát I (1585-1595 nm)] változását jól nyomon követték. Vízoldható szénhidrátok hígítási sorával bizonyítottam a szénhidrát II abszorpciós sáv koncentrációarányos mivoltát. A spektrumrészletek alapján igazoltam a mono-, oligo- és poliszaharidok változásainak kinetikáját, a képződés és felhasználás körülményeit. A fehérjék jellemző régióinak elemzése során a nedveskémiai módszerrel mért nyersfehérje-tartalomhoz képest sokkal árnyaltabb képet kaptam a magban lejátszódó folyamatokról. A közeli IR technikával nyomon követhetőek voltak a tartalékfehérjék hiperaggregációs szintjei, legyen szó akár a kisebb aggregátumokból álló extrahálható polimer fehérjékről (extractable polymeric proteins, EPP) [fehérje II (2175-2180 nm)], akár a nagyobb aggregátumokból álló nem extrahálható polimer fehérjék (unextractable polymeric proteins, UPP) frakciójáról [fehérje I (2055-2065 nm)]. Összességében a minőségi elemzésekről elmondható, hogy a hidrogénkötések nagy szerepet játszanak akár a víz, akár a szénhidrátok, akár a fehérjék változásának nyomon követé-

74

sében, s a NIR technika, mint erre érzékeny eszköz, kiváló választásnak bizonyult akár alapkutatási szintű kérdések megválaszolásához. A mennyiségi összefüggések meghatározására alkalmas kalibrációk közül a részleges legkisebb négyzetek (partial least squares, PLS) módszerét használtam fel. A nedvesség- és nitrogéntartalom meghatározására nyert kalibrációs összefüggések pontossága és teljes tartományú lineáris illeszkedése igazolta a két makroösszetevő gyors mérhetőségét, ugyanakkor a mag kémiai és fizikai állapotát együttesen leíró nedves- és száraztömeg jellemzők valamivel pontatlanabbul prediktálhatók. A biológiai szempontból fontos paramétert, az érési időt másfél napos hibahatáron belül lehet megállapítani a felépített kalibrációk segítségével, de mivel a referencia adatként szolgáló időskálában a biológiai varianciából eredő eltérés hatásával mindig számolni kell, ezért ez az érték a vizsgálatok reprodukálhatóságára nyújt információt. Dolgozatom igazolta, hogy a közeli infravörös spektroszkópiai technika hatékony eszköz lehet a növényi rendszerekbe és folyamatokba való gyors „betekintésre”, a fiziológiai minőség gyors monitorozására.

75

7. FELHASZNÁLT IRODALOM 1 Papp Zs.: Magyarország búzatermesztése. In A búza (Triticum aestivum L.), Ed by Máthé I. et al., Akadémiai Kiadó, Budapest, pp. 25–27 (1963). 2 Bedő Z. et al.: Előszó. In Kalászos gabonák, MTA MGKI, Martonvásár, pp. 3–4 (1993). 3 Központi Statisztikai Hivatal: Búza- és kukoricatermelés. In Magyarország népessége és gazdasága – Múlt és jelen, Központi Statisztikai Hivatal, Budapest, pp. 104– 105 (1996). 4 Központi Statisztikai Hivatal: Mezőgazdaság. In Magyar statisztikai évkönyv – 1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003*, 2004*, Ed by Ligeti Cs. (1997-2000), Féli J.-né (2001-2003), Központi Statisztikai Hivatal, Budapest, (1997-2003). Kivéve * portal.ksh.hu 5 Haraszty Á., Hortobágyi T., Fridvalszky L., Kiss I., Pólya L.: A fejlődési folyamat főbb szakaszainak áttekintése. In Növényszervezettan és növényélettan, Tankönyvkiadó, Budapest, pp. 701–703 (1988). 6 Hess D.: A mag és a termés képződése. In Növényélettan – Az anyagcsere és a fejlődés molekuláris és biokémiai-fiziológiai alapjai, Natura, Budapest, pp. 350–353 (1979). 7 Köves E., Nagy M.: A termés növekedése. In Növényélettan II – A növények növekedése és fejlődése, Tankönyvkiadó, Budapest, pp. 214–219 (1990). 8 Haraszty Á., Hortobágyi T., Fridvalszky L., Kiss I., Pólya L.: A termés fejlődése. In Növényszervezettan és növényélettan, Tankönyvkiadó, Budapest, pp. 389–399 (1988). 9 Szalai I.: A termés növekedése. In Növényélettan II – Növekedés és fejlődés, Kertészeti Egyetem, Termesztési Kar, Budapest, pp. 173–175 (1985). 10 Salgó A.: Gabonafehérjék. In Élelmiszerkémia és táplálkozástan, Műegyetemi Kiadó, Budapest, pp. 67–72 (2001). 11 Pollhamer E.-né: Bevezetés. In A búza – legújabb minőségvizsgálati eredmények, Akadémiai Kiadó, Budapest, pp. 7–8 (1988). 12 Vajdai I., Szentpétery Zs., Barkóczi O., Varga J., Hidvégi M., Lásztity R.: Az őszi búza érésdinamikai vizsgálata, a betakarítás ütemezésének hatása a termés mennyiségi és minőségi jellemzőire. Növénytermelés 38(1), 27–36 (1989). 13 Mándy Gy.: A búza fenológiája. In A búza (Triticum aestivum L.), Ed by Máthé I. et al., Akadémiai Kiadó, Budapest, pp. 125–140 (1963). 14 Simmons S.R., Oelke E.A., Anderson P.M.: Growth and development guide for spring wheat. www.extension.umn.edu/distribution/cropsystems/DC2547.html (1995). 15 Nelson J.E., Kephart K.D., Bauer A., Connor J.F., Schlepp J.: Growth staging of wheat, barley and wild oat. www.plantsci.missouri.edu/wheatx/growth.html (1992). 16 Brenchley W.E., Hall A.D.: The development of the grain of wheat. J. Agric. Sci. 3, 195–217 (1909).

76

17 Woodman H.E., Engledow F.L.: A chemical study of the development of the wheat grain. J. Agric. Sci. 14, 563–586 (1924). 18 Safta I.: Über die Qualität der Weizensorten in verschiedenen Reifestadien. Fortschr. Landwirtsch. 7(23), 577–580 (1932). 19 Jennings A.C., Morton R.K.: Changes in carbohydrate, protein and non-protein nitrogenous compounds of developing wheat grain. Aust. J. Biol. Sci. 16(2), 318–331 (1963). 20 Kapoor A.C., Heiner R.E.: Biochemical changes in developing wheat grains. I. Changes in proteins, carbohydrates, and nucleic acids. Can. J. Plant Sci. 56(2), 385– 391 (1976). 21 Donovan G.R., Lee J.W., Hill R.D.: Compositional changes in the developing grain of high- and low-protein wheats. I. Chemical composition. Cereal Chem. 54(3), 638– 645 (1977). 22 Dell’Aquila A., Taranto G., Colaprico G.: Biochemical changes in developing hexa-, tetra-, and diploid wheat seeds. Genet. Agrar. 36(3-4), 353–364 (1982). 23 Chanda S.V., Singh Y.D.: Biochemical analysis of developing wheat grains. J. Agron. Crop Sci. 176(2), 131–139 (1996). 24 Chanda S.V., Narmada K., Singh Y.D.: Dry matter accumulation and associated changes in biochemical parameters during wheat grain development. J. Agron. Crop Sci. 182(3), 153–159 (1999). 25 Simon E.W.: Early events in germination. In Seed Physiology, Volume 2, Germination and Reserve Mobilization, Ed by Murray D.R., Academic Press Australia, North Ride, pp. 77–115 (1984). 26 Wiggins P.M.: Role of water in some biological processes. Microbiol. Rev. 54(4), 432–449 (1990). 27 Robinson G.W., Zhu S.-B., Singh S., Evans M.W.: Introduction. In Water in Biology, Chemistry and Physics, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., Singapore, pp. 1– 10 (1996). 28 Eisenberg D., Kauzmann W.: Models for liquid water. In The Structure and Properties of Water, Oxford University Press, London, pp. 254–267 (1969). 29 Némethy G.: Recent structural models for liquid water. In Structure of Water and Aqueous Solutions, Ed by Luck W.A.P., Verlag Chemie GmbH and Physik Verlag GmbH, Weinheim, pp. 73–91 (1974). 30 Walrafen G.E.: Raman and infrared spectral investigations of water structure. In Water – A Comprehensive Treatise, Volume 1, The Physics and Physical Chemistry of Water, Ed by Franks F., Plenum Press, New York, pp. 203–214 (1972). 31 Luck W.A.P.: Infrared overtone region. In Structure of Water and Aqueous Solutions, Ed by Luck W.A.P., Verlag Chemie GmbH and Physik Verlag GmbH, Weinheim, pp. 247–284 (1974). 32 Benson S.W., Siebert E.D.: A simple two-structure model for liquid water. J. Am. Chem. Soc. 114(11), 4269–4276 (1992). 33 Chaplin M.F.: A proposal for the structuring of water. Biophys. Chem. 83(3), 211– 221 (1999).

77

34 Angell C.A., Rodgers V.: Near infrared spectra and the disrupted network model of normal and supercooled water. J. Chem. Phys. 80(12), 6245–6252 (1984). 35 Chalikian T.V.: Structural thermodynamics of hydration. J. Phys. Chem. B 105(50), 12566–12578 (2001). 36 Hoppert M., Mayer F.: Prokaryotes. Am. Sci. 87(6), 518–525 (1999). 37 Galinski E.A., Stein M., Amendt B., Kinder M.: The kosmotropic (structureforming) effect of compensatory solutes. Comp. Biochem. Physiol. A 117(3), 357– 365 (1997). 38 Lever M., Blunt J.W., Maclagan R.G.A.R.: Some ways of looking at compensatory kosmotropes and different water environments. Comp. Biochem. Physiol. A 130(3), 471–486 (2001). 39 Wiggins P.M.: Water in complex environments such as living systems. Physica A 314(1-4), 485–491 (2002). 40 Wiggins P.M.: Hydrophobic hydration, hydrophobic forces and protein folding. Physica A 238(1-4), 113–128 (1997). 41 Wiggins P.M.: High and low density intracellular water. Cell. Mol. Biol. 47(5), 735– 744 (2001). 42 Clegg J.S.: Properties and metabolism of the aqueous cytoplasm and its boundaries. Am. J. Physiol. 246(2), R133–R151 (1984). 43 Láng L., Balla L.: A búza tenyészidejének meghatározása a virágzási idő alapján. Növénytermelés 36(6), 409–414 (1987). 44 Varga J., Kemény Á., Kárpáti M., Szentpéteri Zs., Vajdai I.: A búza fehérje- és nedvességtartalmának változása a szemfejlődés szakaszaiban. Növénytermelés 38(3), 221–229 (1989). 45 Morris P.C., Jewer P.C., Bowles D.J.: Changes in water relations and endogenous abscisic acid content of wheat and barley grains and embryos during development. Plant Cell Environ. 14(4), 443–446 (1991). 46 Pepó P., Pepó P.: Az őszi búzafajták kalászának és szemtermésének napi vízleadása, érésdinamikai folyamatok. Növénytermelés 35(2), 109–117 (1986). 47 Cerning J., Guilbot A.: Changes in the carbohydrate composition during development and maturation of the wheat and barley kernel. Cereal Chem. 50(2), 220–232 (1973). 48 Escalada J.A., Moss D.N.: Changes in nonstructural carbohydrate fractions of developing spring wheat kernels. Crop Sci. 16(5), 627–631 (1976). 49 Chanda S.V., Singh Y.D.: Changes in peroxidase and IAA oxidase activities during wheat grain development. Plant Physiol. Biochem. 35(3), 245–250 (1997). 50 Hanft J.M., Wych R.D.: Visual indicators of physiological maturity of hard red spring wheat. Crop Sci. 22(3), 584–588 (1982). 51 Lásztity R.: The chemical composition of cereals. In Cereal Chemistry, Akadémiai Kiadó, Budapest, pp. 20–24 (1999). 52 Triboi E., Triboi-Blondel A.-M.: Productivity and grain or seed composition: a new approach to an old problem—invited paper. Eur. J. Agron. 16(3), 163–186 (2002).

78

53 Morrison W.R., Gadan H.: The amylose and lipid contents of starch granules in developing wheat endosperm. J. Cereal Sci. 5(3), 263–275 (1987). 54 Wang Y.P., Gifford R.M.: A model of wheat grain growth and its application to different temperature and carbondioxide levels. Aust. J. Plant Physiol. 22(5), 843–855 (1995). 55 Wang T.L., Bogracheva T.Ya., Hedley C.L.: Starch: as simple as A, B, C? J. Exp. Bot. 49(320), 481–502 (1998). 56 D’Egidio M.G., Cecchini C., Corradini C., Donini V., Pignatelli V., Cervigni T.: Innovative uses of cereals for fructose production. In Cereals: Novel Uses and Processes, Ed by Campbell G.M., Webb C., McKee S.L., Plenum Press, New York, pp. 143–151 (1997). 57 Kumar R., Singh R.: Free sugars and their relationship with grain size and starch content in developing wheat grains. J. Sci. Food Agric. 32(3), 229–234 (1981). 58 Housley T.L., Daughtry C.S.T.: Fructan content and fructosyltransferase activity during wheat seed growth. Plant Physiol. 83(1), 4–7 (1987). 59 Agrawal P.K., Kaur S.: Changes in water, dry matter, starch and sugars in developing wheat seed and their relation to maturity. Seed Sci. Technol. 5(3), 479–488 (1977). 60 Dhaliwal A.S., Sharma H.L.: Changes in some carbohydrate fractions and some related enzymic activities in plump and shrivelled triticale and in wheat grains. Aust. J. Plant Physiol. 13(2), 249–255 (1986). 61 Jenner C.F., Ugalde T.D., Aspinall D.: The physiology of starch and protein deposition in the endosperm of wheat. Aust. J. Plant Physiol. 18(3), 211–226 (1991). 62 Randhawa R., Singh R.: Alternate routes for starch synthesis in developing grains of wheat and sorghum: indirect evidence through its regulation by inorganic phosphates and organic acids. N. Z. J. Crop Hortic. Sci. 26(2), 75–87 (1998). 63 Lindeboom N., Chang P.R., Tyler R.T.: Analytical, biochemical and physicochemical aspects of starch granule size, with emphasis on small granule starches: a review. Starch/Stärke 56(3-4), 89–99 (2004). 64 Peng M., Gao M., Båga M., Hucl P., Chibbar R.N.: Starch-branching enzymes preferentially associated with A-type starch granules in wheat endosperm. Plant Physiol. 124(1), 265–272 (2000). 65 Kulp K., Mattern P.J.: Some properties of starches derived from wheat of varied maturity. Cereal Chem. 50(4), 496–504 (1973). 66 Guedira M., Paulsen G.M.: Accumulation of starch in wheat grain under different shoot/root temperatures during maturation. Funct. Plant Biol. 29(4), 495–503 (2002). 67 Zanotti F.M., Beccari J.B.: De frumento. De Bononiensi Scientiarum et Artium Instituto atque Academia Commentarii 2(1), 122–127 (1745). diglib.cib.unibo.it 68 Osborne T.B.: The Proteins of the Wheat Kernel, Carnegie Institution of Washington, Washington, D.C. (1907). chla.library.cornell.edu 69 Shewry P.R., Tatham A.S., Forde J., Kreis M., Miflin B.J.: The classification and nomenclature of wheat gluten proteins: a reassessment. J. Cereal Sci. 4(2), 97–106 (1986).

79

70 Shewry P.R., Napier J.A., Tatham A.S.: Seed storage proteins: structures and biosynthesis. Plant Cell 7(7), 945–956 (1995). 71 Gianibelli M.C., Larroque O.R., MacRitchie F., Wrigley C.W.: Biochemical, genetic, and molecular characterization of wheat endosperm proteins. www.aaccnet.org/cerealchemistry/onlinereviewarticles.asp (2001). 72 Cunsolo V., Foti S., Saletti R.: Mass spectrometry in the characterisation of cereal seed proteins. Eur. J. Mass Spectrom. 10(3), 359–370 (2004). 73 Johansson E., Oscarson P., Heneen W.K., Lundborg T.: Differences in accumulation of storage proteins between wheat cultivars during development. J. Sci. Food Agric. 64(3), 305–313 (1994). 74 Huebner F.R., Kaczkowski J., Bietz J.A.: Quantitative variation of wheat proteins from grain at different stages of maturity and from different spike locations. Cereal Chem. 67(5), 464–470 (1990). 75 Kárpáti M., Szentpétery Zs., Jolánkai M., Varga J., Örsi F., Simonné Sarkadi L.: Az őszi búza tartalékfehérjéinek és aminosav-összetételének tanulmányozása a szemkialakulás során. Növénytermelés 45(3), 255–263 (1996). 76 Triboï E., Martre P., Triboï-Blondel A.-M.: Environmentally-induced changes in protein composition in developing grains of wheat are related to changes in total protein content. J. Exp. Bot. 54(388), 1731–1742 (2003). 77 El Haddad L., Aussenac T., Fabre J.L., Sarrafi A.: RP-HPLC determination of the SDS-unextractable protein fraction composition during the ripening period for the common wheat cultivar Soissons. J. Sci. Food Agric. 73(4), 477–484 (1997). 78 Bénétrix F., Kaan F., Autran J.-C.: Changes in protein complexes of durum wheat in developing seed. Crop Sci. 34(2), 462–468 (1994). 79 Stone P.J., Nicolas M.E.: Varietal differences in mature protein composition of wheat resulted from different rates of polymer accumulation during grain filling. Aust. J. Plant Physiol. 23(6), 727–737 (1996). 80 Carceller J.L., Aussenac T.: Accumulation and changes in molecular size distribution of polymeric proteins in developing grains of hexaploid wheats: role of the desiccation phase. Aust. J. Plant Physiol. 26(4), 301–310 (1999). 81 Daniel C., Triboï E.: Changes in wheat protein aggregation during grain development: effects of temperatures and water stress. Eur. J. Agron. 16(1), 1–12 (2002). 82 Carceller J.L., Aussenac T.: SDS-insoluble glutenin polymer formation in developing grains of hexaploid wheat: the role of the ratio of high to low molecular weight glutenin subunits and drying rate during ripening. Aust. J. Plant Physiol. 28(3), 193–201 (2001). 83 Hamer R.J., van Vliet T.: Understanding the structure and properties of gluten: an overview. In Wheat Gluten, Ed by Shewry P.R., Tatham A.S., The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 125–131 (2000). 84 Rhazi L., Cazalis R., Aussenac T.: Sulfhydryl-disulfide changes in storage proteins of developing wheat grain: influence on the SDS-unextractable glutenin polymer formation. J. Cereal Sci. 38(1), 3–13 (2003). 85 Shewry P.R., Tatham A.S.: Disulphide bonds in wheat gluten proteins. J. Cereal Sci. 25(3), 207–227 (1997). 80

86 Gobin P., Ng P.K.W., Buchanan B.B., Kobrehel K.: Sulfhydryl-disulfide changes in proteins of developing wheat grain. Plant Physiol. Biochem. 35(10), 777–783 (1997). 87 Rhazi L., Cazalis R., Lemelin E., Aussenac T.: Changes in the glutathione thiol– disulfide status during wheat grain development. Plant Physiol. Biochem. 41(10), 895–902 (2003). 88 Shewry P.R., Popineau Y., Lafiandra D., Belton P.: Wheat glutenin subunits and dough elasticity: findings of the EUROWHEAT project. Trends Food Sci. Technol. 11(12), 433–441 (2001). 89 Shewry P.R., Halford N.G., Belton P.S., Tatham A.S.: The structure and properties of gluten: an elastic protein from wheat grain. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 357(1418), 133–142 (2002). 90 Hussain A., Lukow O.M.: Transient changes in wheat endosperm polymeric proteins during the later stages of grain development. Can. J. Plant Sci. 75(1), 195–198 (1995). 91 McClure W.F.: 204 years of near infrared technology: 1800–2003. J. Near Infrared Spectrosc. 11(6), 487–518 (2003). 92 Burns D.A.: Historical development. In Handbook of Near-Infrared Analysis, Ed by Burns D.A., Ciurczak E.W., Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 1–5 (1992). 93 Osborne B.G., Fearn T.: Introduction. In Near Infrared Spectroscopy in Food Analysis, Longman Scientific & Technical, Harlow, pp. 1–19 (1986). 94 Barton F.E. II: Progress in near infrared spectroscopy the people, the instrumentation, the applications. In Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference, Ed by Davies A.M.C., Garrido-Varo A., NIR Publications, Chichester, pp. 13–18 (2004). 95 Workman J.J. Jr., Burns D.A.: Commercial NIR instrumentation. In Handbook of Near-Infrared Analysis, Ed by Burns D.A., Ciurczak E.W., Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 37–51 (1992). 96 Rosenthal R.D.: Bevezetés a közeli infravörös tartományban végzett mennyiségi elemzésbe. Élelmezési Ipar 33(10), 371–382 (1979). 97 Murray I.: Scattered information: philosophy and practice of near infrared spectroscopy. In Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference, Ed by Davies A.M.C., Garrido-Varo A., NIR Publications, Chichester, pp. 1– 12 (2004). 98 Osborne B.G., Fearn T.: Physics of the interaction of radiation with matter. In Near Infrared Spectroscopy in Food Analysis, Longman Scientific & Technical, Harlow, pp. 43–56 (1986). 99 Ciurczak E.W.: Principles of near-infrared spectroscopy. In Handbook of NearInfrared Analysis, Ed by Burns D.A., Ciurczak E.W., Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 7–11 (1992). 100 Osborne B.G., Fearn T.: Theory of near infrared spectrophotometry. In Near Infrared Spectroscopy in Food Analysis, Longman Scientific & Technical, Harlow, pp. 20–42 (1986).

81

101 Stark E., Luchter K.: Diversity in NIR instrumentation. In Near Infrared Spectroscopy: Proceedings of the 11th International Conference, Ed by Davies A.M.C., Garrido-Varo A., NIR Publications, Chichester, pp. 55–66 (2004). 102 Központi Élelmiszeripari Kutató Intézet: A közeli infravörös reflexiós és transzmiszsziós technika méréstechnikai alapjai. Központi Élelmiszeripari Kutató Intézet, Budapest (1985). 103 Osborne B.G., Fearn T.: Instrumentation for near infrared spectroscopy. In Near Infrared Spectroscopy in Food Analysis, Longman Scientific & Technical, Harlow, pp. 57–85 (1986). 104 Lelong C.C.D., Pinet P.C., Poilvé H.: Hyperspectral imaging and stress mapping in agriculture: a case study on wheat in Beauce (France). Remote Sens. Environ. 66(2), 179–191 (1998). 105 Mills E.N.C., Parker M.L., Wellner N., Toole G., Feeney K., Shewry P.R.: Chemical imaging: the distribution of ions and molecules in developing and mature wheat grain. J. Cereal Sci. 41(2), 193–201 (2005). 106 Curcio J.A., Petty C.C.: The near infrared absorption spectrum of liquid water. J. Opt. Soc. Am. 41(5), 302–304 (1951). 107 McCabe W.C., Subramanian S., Fisher H.F.: A near-infrared spectroscopic investigation of the effect of temperature on the structure of water. J. Phys. Chem. 74(25), 4360–4369 (1970). 108 Libnau F.O., Kvalheim O.M., Christy A.A., Toft J.: Spectra of water in the near- and mid-infrared region. Vibr. Spectrosc. 7(3), 243–254 (1994). 109 Segtnan V.H., Šašić Š., Isaksson T., Ozaki Y.: Studies on the structure of water using two-dimensional near-infrared correlation spectroscopy and principal component analysis. Anal. Chem. 73(13), 3153–3161 (2001). 110 Iwamoto M., Uozumi J., Nishinari K.: Preliminary investigation of the state of water in foods by near infrared spectroscopy. In Near Infrared Diffuse Reflectance/Transmittance Spectroscopy, Ed by Holló J., Kaffka K.J., Gönczy J.L., Akadémiai Kiadó, Budapest, pp. 3–12 (1987). 111 Lin J., Brown C.W.: Universal approach for determination of physical and chemical properties of water by near-IR spectroscopy. Appl. Spectrosc. 47(10), 1720–1727 (1993). 112 Ozaki Y., Wang Y.: Two-dimensional near infrared correlation spectroscopy: principle and its applications. J. Near Infrared Spectrosc. 6(1-4), 19–31 (1998). 113 Norris K.H.: Possible medical applications of NIR. In Making Light Work: Advances in Near Infrared Spectroscopy, Ed by Murray I., Cowe I.A., VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim and VCH Publishers, New York, pp. 596–602 114 (1992). Iwamoto M., Kawano S.: Advantages and disadvantages of NIR applications for the food industry. In Making Light Work: Advances in Near Infrared Spectroscopy, Ed by Murray I., Cowe I.A., VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim and VCH Publishers, New York, pp. 367–375 (1992). 115 Wesley I.J., Larsen N., Osborne B.G., Skerritt J.H.: Non-invasive monitoring of dough mixing by near infrared spectroscopy. J. Cereal Sci. 27(1), 61–69 (1998).

82

116 Wesley I.J., Blakeney A.B.: Investigation of starch–protein–water mixtures using dynamic near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc. 9(3), 211–220 (2001). 117 Salgó A., Dely-Szabó Gy., Fábián Z.: Monitoring of wheat germination by the NIR method. In Leaping Ahead with NIR Spectroscopy, Ed by Batten G.D., Flinn P.C., Welsh L.A., Blakeney A.B., NIR Spectroscopy Group, RACI, North Melbourne, pp. 506–509 (1995). 118 Ridgway C., Cowe I.A., Chambers J.: Detection of grain weevils inside single wheat kernels by a very near infrared two-wavelength model. J. Near Infrared Spectrosc. 7(4), 213–221 (1999). 119 Nicolas H.: Using remote sensing to determine of the date of a fungicide application on winter wheat. Crop Prot. 23(9), 853–863 (2004). 120 Osborne B.G.: Recent developments in NIR analysis of grains and grain products. Cereal Foods World 45(1), 11–15 (2000). 121 Law D.P., Tkachuk R.: Near infrared diffuse reflectance spectra of wheat and wheat components. Cereal Chem. 54(2), 256–265 (1977). 122 Chung H., Arnold M.A.: Near-infrared spectroscopy for monitoring starch hydrolysis. Appl. Spectrosc. 54(2), 277–283 (2000). 123 Guy R.C.E., Osborne B.G., Robert P.: The application of near infrared reflectance spectroscopy to measure the degree of processing in extrusion cooking processes. J. Food Eng. 27(3), 241–258 (1996). 124 Evans A.J., Huang S., Osborne B.G., Kotwal Z., Wesley I.J.: Near infrared on-line measurement of degree of cook in extrusion processing of wheat flour. J. Near Infrared Spectrosc. 7(2), 77–84 (1999). 125 Osborne B.G.: Near infrared spectroscopic studies of starch and water in some processed cereal foods. J. Near Infrared Spectrosc. 4(1-4), 195–200 (1996). 126 Batten G.D., Blakeney A.B., McGrath V.B., Ciavarella S.: Non-structural carbohydrate: analysis by near infrared reflectance spectroscopy and its importance as an indicator of plant growth. Plant Soil 155/156, 243–246 (1993). 127 Shenk J.S., Workman J.J. Jr., Westerhaus M.O.: Application of NIR spectroscopy to agricultural products. In Handbook of Near-Infrared Analysis, Ed by Burns D.A., Ciurczak E.W., Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 383–431 (1992). 128 Hruschka W.R.: Spectral reconstruction. In Handbook of Near-Infrared Analysis, Ed by Burns D.A., Ciurczak E.W., Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 365–382 (1992). 129 Olinger J.M., Griffiths P.R.: Effects of sample dilution and particle size/morphology on diffuse reflection spectra of carbohydrate systems in the near- and mid-infrared. Part I: single analytes. Appl. Spectrosc. 47(6), 687–694 (1993). 130 Kokaly R.F., Clark R.N.: Spectroscopic determination of leaf biochemistry using band-depth analysis of absorption features and stepwise multiple linear regression. Remote Sens. Environ. 67(3), 267–287 (1999). 131 Apruzzese F., Balke S.T., Diosady L.L.: In-line colour and composition monitoring in the extrusion cooking process. Food Res. Int. 33(7), 621–628 (2000).

83

132 Kim H.-O., Williams P.C.: Determination of starch and energy in feed grains by near-infrared reflectance spectroscopy. J. Agric. Food Chem. 38(3), 682–688 (1990). 133 Yamashita H., Takamura H., Matoba T.: Effect of non-peptide and non-protein nitrogen compounds for the determination of protein content by near infrared spectroscopy. J. Near Infrared Spectrosc. 2(3), 145–151 (1994). 134 Kays S.E., Barton F.E. II, Windham W.R.: Predicting protein content by near infrared reflectance spectroscopy in diverse cereal food products. J. Near Infrared Spectrosc. 8(1), 35–44 (2000). 135 Foley W.J., McIlwee A., Lawler I., Aragones L., Woolnough A.P., Berding N.: Ecological applications of near infrared reflectance spectroscopy – a tool for rapid, costeffective prediction of the composition of plant and animal tissues and aspects of animal performance. Oecologia 116(3), 293–305 (1998). 136 Krimm S., Bandekar J.: Vibrational spectroscopy and conformation of peptides, polypeptides, and proteins. Adv. Protein Chem. 38, 181–364 (1986). 137 Cho R.K., Lee J.H., Ozaki Y., Iwamoto M.: FT-NIR monitoring system for the study of denaturation of proteins at elevated pressures and temperatures. In Leaping Ahead with NIR Spectroscopy, Ed by Batten G.D., Flinn P.C., Welsh L.A., Blakeney A.B., NIR Spectroscopy Group, RACI, North Melbourne, pp. 483–486 (1995). 138 Wang J., Sowa M.G., Ahmed M.K., Mantsch H.H.: Photoacoustic near-infrared investigation of homo-polypeptides. J. Phys. Chem. 98(17), 4748–4755 (1994). 139 Sadler A.J., Horsch J.G., Lawson E.Q., Harmatz D., Brandau D.T., Middaugh C.R.: Near-infrared photoacoustic spectroscopy of proteins. Anal. Biochem. 138(1), 44–51 (1984). 140 Ellis J.W., Bath J.: Modifications in the near infra-red absorption spectra of protein and of light and heavy water molecules when water is bound to gelatin. J. Chem. Phys. 6(11), 723–729 (1938). 141 Wang Y., Murayama K., Myojo Y., Tsenkova R., Hayashi N., Ozaki Y.: Twodimensional Fourier transform near-infrared spectroscopy study of heat denaturation of ovalbumin in aqueous solutions. J. Phys. Chem. B 102(34), 6655–6662 (1998). 142 Ozaki Y., Murayama K., Wang Y.: Application of two-dimensional near-infrared correlation spectroscopy to protein research. Vibr. Spectrosc. 20(2), 127–132 (1999). 143 Liu Y., Cho R.-K., Sakurai K., Miura T., Ozaki Y.: Studies on spectra/structure correlations in near-infrared spectra of proteins and polypeptides. Part I: a marker band for hydrogen bonds. Appl. Spectrosc. 48(10), 1249–1254 (1994). 144 Liu Y., Sakurai K., Miura T., Cho R.K., Ozaki Y.: Can NIR spectroscopy monitor secondary structure changes in proteins? In Leaping Ahead with NIR Spectroscopy, Ed by Batten G.D., Flinn P.C., Welsh L.A., Blakeney A.B., NIR Spectroscopy Group, RACI, North Melbourne, pp. 71–74 (1995). 145 Wu P., Yang Y., Siesler H.W.: Two-dimensional near-infrared correlation temperature studies of an amorphous polyamide. Polymer 42(26), 10181–10186 (2001). 146 Hecht K.T., Wood D.L.: The near infra-red spectrum of the peptide group. Proc. R. Soc. Lond. A 235(1201), 174–188 (1956). 147 Wu P., Siesler H.W.: The assignment of overtone and combination bands in the near infrared spectrum of polyamide 11. J. Near Infrared Spectrosc. 7(2), 65–76 (1999). 84

148 Yuan B., Murayama K., Wu Y., Tsenkova R., Dou X., Era S., Ozaki Y.: Temperature dependent near-infrared spectra of bovine serum albumin in aqueous solutions: spectral analysis by principal component analysis and evolving factor analysis. Appl. Spectrosc. 57(10), 1223–1229 (2003). 149 Magyar Szabványügyi Testület: MSZ 6367-3:1983 Élelmezési, takarmányozási, ipari magvak és hántolt termények vizsgálata. Nedvességtartalom meghatározása. (1983). 150 Norris K.H.: Extracting information from spectrophotometric curves. Predicting chemical composition from visible and near-infrared spectra. In. Food Research and Data Analysis, Ed by Martens H., Russwurm H. Jr., Applied Science Publishers Ltd, Barking, pp. 95–113 (1983). 151 Foss NIRSystems: Second Derivative. In Vision® Manual: Theory, pp. 12–14 (2002). 152 Kaffka K.J., Gyarmati L.S.: Investigating the polar qualification system. J. Near Infrared Spectrosc. 6, A191–A200 (1998). 153 Kaffka K.J., Seregély Zs.: PQS (polar qualification system) the new data reduction and product qualification method. Acta Alimentaria 31(1), 3–20 (2002). 154 Foss NIRSystems: Partial Least Squares (PLS). In Vision® Manual: Theory, pp. 4–5 (2002).

85

8. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AOTF

acousto-optical tunable filter

akuszto-optikusan hangolható szűrő

DAF

days after flowering

virágzás utáni napok (száma)

EPP

extractable polymeric proteins

kivonható polimer fehérjék

HDW

high density water

nagy sűrűségű víz

IR

infrared

infravörös

LCTF

liquid crystal tunable filter

folyadékkristály által hangolható szűrő

LDW

low density water

kis sűrűségű víz

LED

light emitting diode

fénykibocsátó dióda

NIR

near-infrared reflectance

közeli infravörös reflexió

NIT

near-infrared transmittance

közeli infravörös transzmisszió

PLS

partial least squares

részleges legkisebb négyzetek (módszere)

PQS

polar qualification system

polár minősítő rendszer

SDS

sodium dodecyl sulfate

nátrium-dodecilszulfát

SEC

standard error of calibration

kalibráció módszeres hibája

UPP

unextractable polymeric proteins

nem kivonható polimer fehérjék

UV

ultraviolet

ibolyántúli

VIS

visible

látható

86

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom… … Dr. Salgó András tanszékvezetőnek, egyben témavezetőmnek, hogy szakmai és emberi támogatásával, belém vetett bizalmával és megértésével lehetővé tette dolgozatom elkészítését a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszékén; … a Varga József Alapítványnak az évek során nyújtott anyagi támogatásáért; … a Magyar Tudományos Akadémia Mezőgazdasági Kutatóintézet munkatársainak a búzamintákért; … Ian A. Cowe-nak és David B. Funknak, akik szakmai jótanácsaikkal, ismereteik átadásával segítették doktori tanulmányaim előrehaladását; … Seregély Zsoltnak a PQS technika alkalmazásához nyújtott segítségéért és baráti együttműködéséért; … Révay Tamásnak, barátomnak, kivel már egy ideje hasonló lábnyomokban botladozunk; … Scholz Évának, munkatársamnak, aki megtölti e szó jelentését őszinteségével, türelmével, tudományos kíváncsiságával; … és természetesen a Biokémiai és Élelmiszertechnológiai Tanszék minden dolgozójának az elmúlt évek során együtt töltött időért, a szakmai és emberi segítségért. Szeretném megköszönni a szakmai és emberi „alapokat” általános iskolai és gimnáziumi osztályfőnökeimnek, akik belém plántálták a kémia és biológia szeretetét. Név szerint, Bálint Erzsébetnek és Koncz Istvánnak a Nyugat-Magyarországi Egyetem Apáczai Csere János Tanítóképző Főiskolai Karának Gyakorló Általános Iskolájából, illetve Dubraviczky Dénesnének a Révai Miklós Gimnáziumból. Végül szeretnék köszönetet mondani azoknak, akik minden ilyen esetben a köszönetnyilvánítás végére kerülnek, de akiktől a legtöbbet kaptam: családomnak, kedvesemnek.

87

NYILATKOZAT Alulírott Gergely Szilveszter kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést magam készítettem és abban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, amelyet szó szerint, vagy azonos tartalomban, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelműen, a forrás megadásával megjelöltem.

Budapest, 2005. szeptember 20. .............................................. aláírás

88

KÖZLEMÉNYEK Az értekezés témakörében megjelent idegen nyelvű folyóiratcikkek: 1.

Gergely Sz., Salgó A.: Changes in moisture content during wheat maturation— what is measured by near infrared spectroscopy? J. Near Infrared Spectrosc. 11(1), 17–26 (2003).

2.

Gergely Sz., Salgó A.: Changes in carbohydrate content during wheat maturation—what is measured by near infrared spectroscopy? J. Near Infrared Spectrosc. 13(1), 9–17 (2005).

3.

Gergely Sz., Salgó A.: Changes in protein content during wheat maturation—what is measured by near infrared spectroscopy? J. Near Infrared Spectrosc. (benyújtva).

4.

Juhász R., Gergely Sz., Gelencsér T., Salgó A.: Relationship between NIR spectra and RVA parameters during wheat germination. Cereal Chem. 82(5), 488–493 (2005).

5.

Salgó A., Gergely Sz.: Characterizing the status of water during maturation and germination processes in wheat. Acta Aliment. 32, S55–S66 (2003).

89