BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI ÉS BIOMÉRNÖKI KAR SZERVES KÉMIA ÉS TECHNOLÓGIA TANSZÉK
Kismolekulás hatóanyagok és glükózaminoglikánok komplexálódási folyamatainak azonosítása Tudományos diákköri dolgozat
Merkei Viktória Gyógyszer-vegyészmérnök MSc, BME
2014
Készült: a Richter Gedeon Nyrt. Szintézistámogató Laboratóriumában Témavezető: Dr. Balogh György Tibor, c. egyetemi docens Belső konzulens: Dr. Nagy József, egyetemi docens
Merkei Viktória
2014
Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás................................................................................................................ 4 1.
Bevezetés...................................................................................................................... 5
2.
Irodalmi rész................................................................................................................. 6
Vegyületek fizikai-kémiai paramétereinek módosítása .......................................................... 6 Glükózaminoglikánok ............................................................................................................ 8 A HA szerkezete, előfordulása ............................................................................................... 9 A HA biológiai szerepe ........................................................................................................ 11 A szulfatált GAG-ok HA-tól eltérő jellemzői ...................................................................... 12 3.
A felszívódást leíró fizikai-kémiai paraméterek ........................................................ 13
Sav-bázis tulajdonság, proton-disszociációs állandó (pKa) .................................................. 13 Permeabilitás, mint a felszívódás jellemző értéke ................................................................ 15 Passzív transzport ................................................................................................................. 15 A permeabilitás ..................................................................................................................... 16 A PAMPA kinetikai leírása .................................................................................................. 18 Oldhatóság ............................................................................................................................ 19 Kvázi-termodinamikai oldhatóság mérés ............................................................................. 20 4.
Célkitűzés ................................................................................................................... 21
5.
Kísérleti rész............................................................................................................... 22
A kismolekulás hatóanyagok ................................................................................................ 22 A GAG-ok és CD-k .............................................................................................................. 23 A pKa mérés során felhasznált anyagok, eszközök .............................................................. 24 A permeabilitás mérések során felhasznált anyagok és eszközök ........................................ 25 Az oldhatóság mérés során alkalmazott anyagok és eszközök............................................. 25 Az abszorbncai-változások detektálásához használt eszközök ............................................ 26 A pKa mérés összeállítása ..................................................................................................... 26 A PAMPA rendszer összeállítása ......................................................................................... 26 2
Merkei Viktória
2014
Az oldhatóság mérés összeállítása ........................................................................................ 27 6.
Eredmények................................................................................................................ 27
pKa mérés eredményei, előzetes CD mérések ...................................................................... 28 pKa mérés eredményei - a GAG és hatóanyag együttesei .................................................... 30 PAMPA mérés eredményei .................................................................................................. 34 Oldhatóság mérés ................................................................................................................. 39 7.
Összefoglalás.............................................................................................................. 40
8.
Mellékletek ................................................................................................................. 42
9.
Irodalomjegyzék ......................................................................................................... 47
3
Merkei Viktória
2014
Köszönetnyilvánítás
Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőmnek, Dr. Balogh György Tibornak minden segítségéért és végtelen türelméért. Köszönöm, hogy lehetőséget adott, hogy a Szintézistámogató Laboratóriumban dolgozzam, és tanácsaival, útmutatásával sok hasznos szakmai tapasztalatot szerezhessek. Köszönöm egyetemi konzulensemnek, Dr. Nagy Józsefnek a dolgozat létrejöttéhez nyújtott segítségét. Köszönöm Müller Juditnak, hogy kérdéseimmel hozzá is fordulhattam, és mindig készségesen segített. Köszönöm továbbá Dargó Gergőnek a mérések kivitelezésében nyújtott együttműködését és segítségét.
„Nekem azt tanították, hogy a haladás
útja se nem gyors, se nem könnyű.” Marie Curie
4
Merkei Viktória
2014
1. Bevezetés Az elmúlt évtizedekben a gyógyszerkutatás gyakorlatában előtérbe került a nagy áteresztőképességű módszerek (high-throughput screening, HTS) alkalmazása. A felgyorsult eredeti gyógyszerkutatásnak köszönhetően az elsődleges HTS biológiai szűrésből nagyszámú gyógyszerjelölt vegyület került kiválasztásra.1 A gyógyszerkutatás során egy potenciális gyógyszerjelölt molekulából csekély valószínűséggel lehet gyógyszert kifejleszteni, ha a molekula gyenge felszívódási tulajdonsággal rendelkezik. Ezen gyógyszerjelöltek általában gyenge savak és/vagy bázisok, magas lipofilitás értékkel, tehát viszonylag gyenge ADME (felszívódás, eloszlás, metabolizmus, kiválasztás) tulajdonság hordozói. Per os adagolás során emiatt a felszívódásuk jellemzően igen csekély. A gyenge abszorpció egyik lehetséges oka a molekula csekély vízben való oldhatósága. Ennél fogva nagy szükség van a vegyületek vízoldhatóságának ismeretére, mivel ez lehetővé teszi a vegyület farmakokinetikai paramétereinek előrejelzését. A szervezetben végbemenő folyamatok
vizes
közegben
játszódnak
le,
így
a
gyógyszermolekulának
hidrofil
tulajdonságokkal kell rendelkeznie. A membránokon való átjutáshoz pedig, melyek foszfolipid-kettősrétegek, lipofil karakterre van szükség. Az ideális gyógyszermolekulának tehát lipofil és hidrofil karakterrel is kell rendelkeznie, ezek más néven az amfifil vegyületek. A gyógyszerek felszívódásának előrejelzésére általánosan a transzportfolyamatokat leíró fizikai-kémiai sajátságokat, mint a proton-disszociációt (pKa), a lipofilitást (logP, logD), illetve a permeabilitást (Pe, effektív permeabilitás) használják.2 Költséghatékonysági aspektusból is különösen nagy jelentőséggel bír a gyógyszerjelölt vegyületek korai fázisú fizikai-kémiai profiljának meghatározása in silico és in vitro módszerekkel.3 A kutatómunka során, melybe lehetőségem volt bekapcsolódni, azt vizsgáltuk, hogy a már forgalomban lévő kismolekulás gyógyszerhatóanyagok milyen kölcsönhatásba lépnek a különböző természetes forrásból származó segédanyagokkal, mutatnak-e komplexálódási hajlamot, valamint ezen kialakult komplexek hatására változnak-e azon fizikai-kémiai paraméterek, melyek a felszívódás minőségét leginkább jellemzik. .
5
Merkei Viktória
2014
2. Irodalmi rész Vegyületek fizikai-kémiai paramétereinek módosítása Egy gyógyszerjelölt vegyület fizikai-kémiai paraméterinek optimalizálása nem csak szerkezetének módosításával lehetséges. Rosszul oldódó, rossz abszorpciós ablakkal rendelkező, habár már forgalomban lévő kismolekulás hatóanyagok ADME tulajdonságai javíthatók különböző segédanyagokkal. A vegyületek komplexálódási lehetősége ciklodextrinekkel (továbbiakban CD) már régóta ismert és kutatott terület.4 Ezen folyamatok hatására javítható az egyes vegyületek oldhatósága, illetve egyéb fizikai-kémiai paramétereik, melyek alkalmasak annak jelzésére, hogy várhatóan javul-e a felszívódásuk a szervezetben.5
1. ábra Vegyületek komplexálódása CD-vel6 A CD-k glükopiranóz egységekből felépülő, jól definiált, kvázi merev, csonka kúp alakú, üreges szerkezettel rendelkeznek. A glükózegységek konformációjának köszönhetően sajátos szerkezet alakul ki: egy hidrofil külső oldallal rendelkező molekula relatív jó vízoldhatósággal és hidrofób üreggel, mely képes befogadni vendégmolekulákat.7 A CD-k adta e különleges lehetőségeket számos módon igyekszik a gyógyszeripar hasznosítani, mint sóképző, komplexáló, és kioldódás-kinetikát módosító segédanyagok.8 A képződő komplex, más néven zárványkomplex kialakulásának feltétele a megfelelő sztérikus illeszkedés, azaz, hogy a vendégmolekula bizonyos részlete, esetleg egésze képes legyen bezáródni a ciklodextrin üregébe. Ezen folyamatok következményeként megnőhet az eredetileg rosszul oldódó hatóanyagok vízoldhatósága, megváltozhat a vendégmolekula spektrális tulajdonsága valamint reakcióképessége is.9 A legtöbb stabilitási állandó meghatározására szolgáló módszer azon alapul, hogy a vendégmolekula
valamely
tulajdonsága 6
a
komplexképződés
következtében
Merkei Viktória
2014
megváltozik.1011A változás mértékének nyomon követése a koncentrációviszonyok függvényében információt ad a bezáródás mértékéről, illetve a kialakult komplex sztöchiometriai viszonyáról. A leggyakrabban alkalmazott vizsgálati módszerek a spektroszkópia
(pl.
UV-VIS,
NMR),
pH–potenciometria,
oldhatósági,
valamint
a
permeabilitás és membrán transzport vizsgálatok. Egy komplex-képződési folyamat során különböző sztöchiometriájú komplexek jöhetnek létre, CD-k esetében a legkedvezőbb az 1:1 arány.
2. ábra Oldhatóság izoterma típusok, AL felel meg az 1:1 arányú komplexnek12 Ha ábrázoljuk a ligandum, azaz a CD koncentráció függvényében a mért változó sajátságot, például szubsztrát (hatóanyag) oldhatóságát, matematikai transzformációk után a komplex stabilitási állandó számolható az egyenes meredekségéből.13 Abszorbancia-változás alapú módszer esetén ezen érték reciprokát ábrázolva a ligandum koncentrációjának
függvényében,
linearizáló
formulák
segítségével
a
következő
összefüggésekhez jutunk.14 AD = εDDt + εCDCDt + Dε11[D:CD]
(1)
Alkalmazva a Benesi-Hildebrandt- féle linearizálási függvényt:
1 1 1 A Dt K11 CD Dt 11
(2)
Melyből a komplex stabilitási állandó meghatározható:
7
Merkei Viktória
K11
2014
y tengelymet szet meredekség
(3)
ahol K11 az 1:1 arányú komplex stabilitási állandója, ΔA az abszorbancia-változás, CD a CD koncentráció, CD:D a létrejövő komplex koncentrációja, Dt a t időpontbeli szubsztrát koncentráció, CDt a t időpontbeli CD koncentráció, εD a szubsztrát moláris abszorpciós együtthatója, εCD a CD moláris abszorpciós együtthatója, εCD1:1 a létrejövő komplex moláris abszorpciós együtthatója, Δε a moláris abszorpciós együtthatók különbsége. A CD-k komplexálási folyamatainak felderítésére kutatások az osztályon is folynak.
A szakirodalom és a sokrétű felhasználás tükrében felmerült a lehetőség, hogy megvizsgáljuk a glükózaminoglikánok, továbbiakban GAG-ok, mint endogénen is jelenlévő molekulák komplexálódási viszonyait is. A GAG-ok egyik jellegzetes képviselőjét, a hialuronsavat sokféle módon hasznosítja a gyógyszeripar, melynek vonatkozásai sok hasonlóságot mutatnak a CD-ekhez.15 Így vizsgálatainkat a klasszikus CD vizsgálatokhoz hasonló módon kívántuk megvalósítani,
hatásaikat
feltérképezni.
E
vizsgálatmenet
fontos
paramétereit
a
következőkben szeretném részletesebben áttekinteni. A téma újdonságértékét és aktualitását jelzi, hogy kevesebb, mint egy hónapja publikálták az első olyan cikket, mely a hialuronsav és doxorubicin komplexálódását írja le.16
Glükózaminoglikánok A mukopoliszacharidok, más néven glükózaminoglikánok, bonyolult összetételű makromolekulák, amelyek aminocukor és uronsav típusú komponenseket tartalmaznak. Az
aminocukrok
olyan
cukorszármazékok,
amelyekben
egy
alkoholos
hidroxilcsoportot aminocsoport helyettesít, a molekulán belül általában acetil- aminocsoport található. Az uronsavak olyan karbonsavak, amelyek aldózokból az oxocsoport átmeneti megvédése mellett oxidációval vezethetők le. Összességében elmondható, hogy a glükózaminoglikánok aminocukor és uronsav egységből álló, diszacharidegységek alkotta makromolekulák. A karboxil és más savas jellegű csoportok jelenléte adja a poliszacharidok savas jellegét. A negatív töltéseket hordozó molekulák az élő szervezetben különböző kationokkal képzett asszociátumok formájában fordulnak elő. 8
Merkei Viktória
2014
A GAG-ok két külön csoportját különböztethetjük meg. A heparin és kondroitin-szulfát, mint szulfatált glükózaminoglikán, valamint a hialuronsav, továbbiakban HA, mint nem szulfatált GAG.
A HA szerkezete, előfordulása17 Karl Meyer jellemezte először 1934-ben azt a poliszacharidot, amit a szem csarnokvizéből sikerült izolálnia. Az izolált polimer termék savas jellegű volt, az uronsav tartalma miatt. Meyer nevezte el ezt a poliszacharidot hialuronsavnak, a hyalos (=üvegszerű, üveges) és az uronsav alapján. A hialuronsav (vagy hyaluronan, ami a vegyület intra- és intermolekuláris speciális komplexálódási sajátságára utal) ismétlődő N-acetil-glükózamin– glükuronsav diszacharid egységekből felépülő homopolimer. (3. ábra)
3. ábra A HA diszacharid egysége17 A HA monoszacharid egységei (13) kötéssel, a diszacharid egységek (14) kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. Fiziológiás körülmények között a hyaluronan leggyakrabban Na+nal képzett só formájában fordul elő, de számos egyéb pozitív töltésű ionnal vagy molekulával alkothat vegyületet. A továbbiakban a HA rövidítés a hialuronsav valamilyen kationnal képzett formáját fogja jelezni. Gyakran nagyon nehéz pontosan meghatározni az elleniont, főleg a szövetekben. Rendkívüli vízmegkötő sajátsága révén még viszonylag híg vizes oldata (0,5%) is magas viszkozitású. Így ezen homopolimer két legfontosabb fizikai jellemzője a viszkozitása és a molekulatömege. A HA molekulatömege 10-20 kDa-tól több ezer kDa-ig terjedhet. A HA szerkezetében található csoportok számos H-hidas kötés kialakítására adnak lehetőséget. Az intramolekuláris H-hidas, illetve a biológiai rendszerekben jelenlévő intermolekuláris
H-hidas
kölcsönhatásoknak
köszönhetően,
meglehetősen
bonyolult
háromdimenziós szerkezetet mutat. A hialuronsav egy lineáris polimer, az oldatban kialakuló 9
Merkei Viktória
2014
szerkezetét kezdetben szabálytalannak, úgynevezett random coil-nak tekintették. Az újabb vizsgálatok azonban kimutatták, hogy az oldatban kialakuló szerkezete egyáltalán nem véletlenszerű. A HA molekulák fiziológiás körülmények között rendezett szerkezetet vesznek fel, ahol a hidrofil és hidrofób részek szabályos irányba rendeződnek, tehát a lánc egy csavarodott szerkezetet alkot. A kialakuló specifikus szerkezet pontosabb magyarázatot ad egyes fehérjékkel, receptorokkal kialakított kölcsönhatására, valamint az így kialakuló harmadlagos szerkezet és ezáltal a töltések rendezett eloszlása teheti lehetővé, hogy különböző komplexet alakítsunk ki velük.
= hidrofób folt
karboxilátcsoport acetaminocsoport
4. ábra A hialuronsav harmadlagos szetkezete: A-hialuron lánc; B-projekció a síkba; C- a duplex oldalnézete18 A HA az extracelluláris mátrix egyik fő alkotóelemeként a szervezet minden pontján jelen van. Egyes szervek, illetve szövetek (kötőszövet, bőr, ízületi folyadék, szem csarnokvize, érfal) fokozott mennyiségben tartalmaznak HA-at. Az állati eredetű szövetek közül kiemelkedően nagy mennyiségben található a kakastaréjban. Ipari méretű előállítása is elsősorban kakastaréjból való izolálással történik.
10
Merkei Viktória
2014
A HA biológiai szerepe A HA biológiai szerepét sokáig fizikai-kémiai tulajdonságaiban látták. Például reológiai tulajdonsága révén képes mechanikai védelmet nyújtani a sejteknek és az ízületeknek, az ízületek esetében például a felületeken csúszás elősegítésével. Rendkívüli vízmegkötő képességének köszönhetően szabályozni tudja a vízháztartási egyensúlyt, de fontos szerepet játszik a sejtek közötti tér kitöltésében és a sejtek különböző fizikai behatások ellen nyújtott védelmében. Az utóbbi évek kutatásai rávilágítottak arra, hogy számos élettani folyamat összefüggésbe hozható
a
HA
és
a
szervezetben
előforduló
makromolekulák
között
kialakuló
kölcsönhatással.19 Ilyenek például az extracelluláris mátrixban található proteoglikánok, amelyek fő feladata a sejtek közötti tér kitöltése és az anyagtranszport. A HA-val kölcsönható makromolekulák ugyanakkor lehetnek intracelluláris transzmembrán receptor-fehérjék is, amelyeknek fontos szerepe van számos sejt szintű szabályozási folyamatban. Az embrionális fejlődés stádiumában például a végtagok és az idegrendszer kialakulásában játszik fontos szerepet. Összefoglalva a HA szerepet játszik immunfolyamatok szabályozásában, sejtregenerálódási
folyamatokban,
tumor
sejtek
inváziójában
és
angiogenikus
folyamatokban20, a helyi mikrocirkuláció javításával, valamint szerepet tölt be az anyagtranszporthoz szükséges terek, „csatornák” kialakításában.21 Ezen okok következtében már számos terápiában alkalmazzák sikeresen, sebgyógyítás, krónikus gyulladások, szemészeti műtétek esetében.22 A
hialuronsav
a
sérült
területeken
elősegíti
a
sebgyógyulás
folyamatát.
Szövetregenerálódás során a HA lokális koncentrációja emelkedik, és optimális feltételeket teremt a szövetek megújulásában résztvevő sejtek aktiválásához, vándorlásához és a szaporodásához. Patológiás folyamatok során a szövetek hialuronsav koncentrációja az egyensúly felborulása miatt lecsökken, és a gyógyulási folyamat, a sejtosztódás lelassul. A HA lokális alkalmazásával ez a folyamat visszafordítható, és megindulhat a természetes sebgyógyulás. A HA terápiás alkalmazása kiterjeszthető, illetve egyes esetekben hatása fokozható a glükuronsav rész karboxil csoportja és különböző fémionok (Na+, Zn2+, Co2+ stb.) között létrejövő asszociátumok létrehozásával. Jó példa erre, a Richter Gedeon
Nyrt.
sebgyógyításban egyedülállóan hatékony, originális hatóanyaga a cink-hyaluronát, amit Curiosin néven hoznak forgalomba.23 A fenti általános szerep mellett, fontos szerepet tölt be 11
Merkei Viktória
2014
a bőr felső rétegében lezajló sejtes folyamatok szabályozásában, elsősorban a keratinocyták képződésének, fejlődésének, élettartamának befolyásolása révén.
A szulfatált GAG-ok HA-tól eltérő jellemzői Az általunk vizsgált szulfatált GAG-ok szerkezetükben és így kémiai, fizikai-kémiai tulajdonságaikban is igen hasonlók a fent bemutatott hialuronsavhoz, így ebben a pontban, a struktúrájukban és biológiai szerepükben mutatkozó különbségekről szeretnék pár szót szólni. A
kondroitin-szulfát
ismétlődő
N-acetil-galaktózamin–glükuronsav
diszacharid
egységekből felépülő homopolimer, amely a glükuronsav gyűrűn 6-os vagy 4-es pozíciójában lévő hirdoxil-csoportja szulfatált. Így megkülönböztetünk kondroitin-szulfát A-t és C-t, melyek az ízületi folyadék és porcok fő alkotó eleme és biztosítja azok mechanikai ellenálló képességét. Az egyik legelterjedtebb porcerősítő, táplálék kiegészítő glükózaminnal kombinálva.
5. ábra A kondroitin-szulfát építőegysége A heparin több, ismétlődő diszacharid egységekből épül fel, melyek közül a fő komponense a glükuronsav 2-es pozícióban lévő hidroxil-csoportján szulfatált glükuronsav (14) kötéssel kapcsolódva a 6-os helyzetben és nitrogénen is szulfatált glükózaminhoz, valamint a diszacharid egységek is (14) kötéssel kapcsolódnak egymáshoz.24
12
Merkei Viktória
2014
. 6. ábra a heparin szerkezeti eleme A heparin endogén antikoaguláns, amelyet széles körben alkalmaznak véralvadásgátlóként. A heparin erős anionos töltéssűrűsége miatt a kationos proteinekkel komplexet alkot, és így azok biológiai tulajdonságait megváltoztatja. A heparinnak katalitikus funkciója a véralvadásgátlásban az antitrombin III (AT III) nevű alfa-2-globulinnal képezett komplexén keresztül valósul meg.25 Az AT III gátolja a szerinproteázok az alvadási folyamatban részt vevő enzimekhez való kötődését. Ezáltal nemcsak trombint, hanem több véralvadásban részt vevő faktort is inaktivál. Az inaktiválás a dózistól függ, a trombin különösen érzékeny a heparin-AT III komplexre.
3. A felszívódást leíró fizikai-kémiai paraméterek Sav-bázis tulajdonság, proton-disszociációs állandó (pKa) A gyenge savak és bázisok a pH-tól függően különböző ionizált formában és arányban vannak jelen vizes oldatokban. Ez nagymértékben befolyásolja, hogy egy vegyület kölcsönhatásba tud-e lépni biológiai rendszerekkel, átjuthat-e a membránon. Az ismert gyógyszerkincs mintegy 80%-a tartalmaz legalább egy ionizálható funkciós csoportot. Ezen funkciós csoportok száma alapján megkülönböztetünk mono-, di-, és poliprotikus vegyületeket. A vizes közegű kémhatástól függő töltöttségi állapotot jellemző termodinamikai paraméter az ionizációs vagy proton-disszociációs állandó, pKa.26 A pKa megegyezik azzal a pH értékkel, ahol a disszociált és disszociálatlan forma egyenlő arányban van jelen. Így a pKa értéknél két egységgel nagyobb pH-kon savas karakterű vegyületek esetében a vegyület teljesen ionizált, két egységgel kisebb pH-kon pedig teljesen semleges állapotban van jelen. 13
Merkei Viktória
2014
A pKa definícióját képszerűen egy egyszerű ikerionos vegyület, a glicin segítségével mutatom be. A glicin makroállapotai a 7. ábrán láthatóak, mely makroállapotot a különböző mikroállapotok eredőjeként definiálunk. Mikroállapot alatt pedig a különböző formákat, tautomereket értjük. O
+ H3N
K1 H3N
O
+
H2N
O
OH
O
K2
O
7. ábra A glicin makroállapotai A következő 8. ábra a glicin különböző formáinak megoszlását ábrázolja.
100 90 80 70
a
60 50 40 30 20 10 0 0
pKa 2 1 2,31
4
6 pH
8 pKa210 9,24
12
14
8. ábra A glicin makroállapotainak megoszlása A pKa érték meghatározására leggyakrabban a potenciometrikus és spektrofotometriás, úgynevezett UV-pH titrálást alkalmaznak. A napjainkban gyógyszeripari standardnak tekinthető indirekt potenciometriás titrálás alapja, hogy az erős savat erős bázissal titrálják, majd a mérést elvégzik a mérendő vegyület jelenlétében is. A két titrálási görbe különbségéből függvénytranszformációk után meghatározható a vegyület pKa értéke.27 UV-pH titrálás akkor alkalmazható, ha a vegyület ionizálható csoportja a kromofór csoport közelében található és az ionizálható csoportok állapotváltozása pH változás hatására spektrumváltozást okoz. Az UV-pH titrálást elsősorban olyan vegyültek disszociációs 14
Merkei Viktória
2014
állandóinak meghatározására használjuk, melyek alacsony oldhatósága nem teszi lehetővé a potenciometriás titrálás alkalmazását. További előnye, hogy az egymáshoz közel eső pKa értékű csoportok is detektálhatók és jóval több, akár különböző sav/bázis karakterű csoport is meghatározható egyidejűleg. Ezen előnyök a mérés anyagigényét is csökkentik. Az UV-pHmetrikus vizsgálat során azonos anyagkoncentrációjú és azonos ionerősségű, viszont különböző pH-jú oldatsorozatot kell készíteni, és minden egyes oldatnak regisztrálni kell a spektrumát. Automatizált UV-pH titrálásnál a titráló berendezéshez spektrofotométer van csatlakoztatva és a minta spektrumai minden egyes mérőoldat adagolás után (azaz a pH függvényében) rögzítésre kerülnek. Példaként szeretném bemutatni a benzokain UV-pH titrálását.
9. ábra A benzokain UV-pH titrálási görbéi
Permeabilitás, mint a felszívódás jellemző értéke28 A felszívódást leíró egyik legfontosabb fizikai-kémiai paraméter a permeabilitás, mely a hatóanyag membránon történő átjutás mértékét jelzi. A mérésére általánosan elfogadott in vitro módszer a PAMPA (Paralell Artificial Membrane Permeability Assay) technika, mely a passzív diffúzióval történő felszívódás modellezésére szolgál. Ezzel a vizsgálati módszerrel jó közelítéssel előre jelezhető a gyógyszervegyületek szervezetben végbemenő transzportja.29
Passzív transzport A biológiai membrán építőkövei a foszfolipidek. Töltéssel rendelkező poláris fejrészük és apoláris zsírsavláncaik orientálódásával a vizes közegben lipid-kettősréteget alkotnak.30
15
Merkei Viktória
2014
10. ábra A foszfatidil-kolin és a lipid-kettősréteg31 A lipid kettősréteg felépítésében másik fontos szerepet játszó alkotóelem a koleszterin, ami másodlagos kötésekkel kapcsolódik a lipidekhez és hozzájárul a membrán mechanikai stabilitásának kialakításához. A membránban jelenlévő fehérjék nemcsak a szerkezet stabilizálásában, de a sejteken keresztül történő transzportfolyamataiban is részt vesznek. Elmondhatjuk tehát, hogy a sejtmembránon keresztül végbemenő transzport több tulajdonság együttes hatásának következménye. Ezek közül egyik igen fontos a sejtmembrán lipid-fehérje és lipid-koleszterin aránya, mely arány változtatásával a különböző szövetek modellezhetők. Passzív transzport szempontjából a vegyületek egyik legfontosabb fizikai-kémiai jellemzője a lipofilitása, mivel a gyógyszertranszport során a zsírsavlánccal kialakuló lipofil-lipofil kölcsönhatás nagyon erős. Figyelembe kell venni az anyagok sav-bázis jellegét is, mely az ionos kölcsönhatás kialakulása miatt lényeges. A fentiek mellett a molekula mérete, formája, konfigurációja és benne elhelyezkedő heteroatomok pozíciója is befolyásolja a permeabilitást. A pH-megoszlás hipotézis értelmében a molekulák semleges formája könnyen, az ionos formája nehezebben hatol át a membránon, hiszen a molekula lipofilitása semleges formában a maximális.
A permeabilitás A sejtes modelleknél, melyek a passzív transzport mellett az aktív transzport modellezésére is alkalmasak, jóval robusztusabb és olcsóbb a PAMPA rendszer, ahol
16
Merkei Viktória
szendvics-szerű
2014
mérőtálcákkal
96-cellás
(plate-ekkel)
modellezik
a
gyógyszerek
felszívódását. fedél
96 cellás donor
mérőtálca 96 cellás fogadó mérőtálca
11. ábra A PAMPA felépítése32
A PAMPA rendszerben a kiválasztott lipidrendszert feloldjuk valamilyen inert szerves oldószerben (pl. n-dodekánban), majd ezt az oldatot egy rétegben felvisszük a donor oldali plate membránjára. A mérendő vegyületet DMSO-törzsoldat segítségével adjuk a rendszerhez, és a modellezni kívánt apikális és bazolaterális oldalnak megfelelő pH-jú pufferált közeget helyezünk rendre a donor és a fogadó oldalakra. A két plate-et egymásba illesztjük, majd a rendszert inkubáljuk. Az inkubálás során a hatóanyag a koncentrációgradiens hatására passzív diffúzióval átjut a donor mérőtálcából a fogadó oldalra. Például vékonybélen keresztüli felszívódás modellezéséhez pH 6,5 donor - pH 7,4 akceptor összeállítást, ún. pH-gradiens rendszert használunk. Tehát az alkalmazáskor változtatható paraméterek: az inkubálás hőmérséklete és ideje, a donor-akceptor közegének pH-ja és a lipid minősége.3334 A donor és fogadó oldalon kialakult koncentrációkat különböző analitikai módszerrel (UV-spektrofotométer, HPLC) mérhetjük és értékelhetjük, majd ezek alapján jellemezni lehet a vizsgált vegyület penetrációs képessége, sebessége az effektív permeabilitási értékkel (mértékegysége Pe*10-6 cm/s). Tapasztalatok alapján kijelenthetjük, hogy a PAMPA rendszereken végzett mérések jól reprodukálhatóak, megbízhatóak, viszonylag alacsony költségűek és nagy kapacitásúak, azaz robusztusak.
17
Merkei Viktória
2014
A PAMPA kinetikai leírása3536 A vegyületek szempontjából a membránon való áthaladást alapvetően három lépesre oszthatjuk (12. ábra). A Fick I. törvény értelmében a koncentráció gradiensnek megfelelően a donor fázis főtömegéből (kevert fázis) kiindulva a hatóanyag-koncentráció lecsökken a nemkevert fázis határrétegében. Majd a membránban az anyag feldúsul és diffúzióval a fogadó fázis nem-kevert határrétegén keresztül a fogadó oldal kevert fázisába jut. A sebességmeghatározó lépés a harmadik, utolsó lépés, mely során a hatóanyagnak a fogadó fázis kevert rétegébe kell jutnia.
Kevert K/N Nem-kevert N/M Membrán M/N
Konc.
Nem-kevert N/K Kevert
12. ábra A membrán és határrétegei35 A
folyamat
alapján
egy
vegyület
effektív
permeabilitása
(Pe)
a
harmadik,
sebességmeghatározó lépéssel írható le, mely tovább bontható két külön részre, a membrán (Pm) és nem-kevert határréteg (Pn) permeabilitására.
(4)
A laboratóriumban használt, Millipore cég PAMPA rendszerére (11. ábra) vonatkozó effektív permeabilitási egyenlet megadása Faller és munkatársainak nevéhez fűződik.
, ahol
18
(5)
Merkei Viktória
2014
A egyenletben szereplő állandók rendre: VA a fogadó, VD a donor oldal térfogata, A a membrán „effektív” területe (0,24 cm2-a gyártó által megadott érték). Az egyenlet változói a hatóanyag fogadó oldali, illetve egyensúlyi koncentrációja (egyensúlyi koncentráció alatt a teljes megoszlásnak megfeleltethető koncentrációt értjük).
Oldhatóság Egy anyag oldhatóságát oldatának koncentrációjával jellemezzük adott hőmérsékleten, nyomáson az adott oldószerben és az alábbi oldhatósági fogalmakat különböztetjük meg. Termodinamikai (egyensúlyi) oldhatóság, S, logS A termodinamikai oldhatóság megmutatja a termodinamikailag egyensúlyban lévő heterogén, kétkomponensű rendszer (oldat és szilárd anyag), telített oldatfázisban lévő hatóanyag koncentrációját. Értéke adott nyomáson és hőmérsékleten, az adott szilárd anyag formára vonatkozatva állandó. Ionizálható molekulák esetében az oldhatóság pH-függést mutat, így a neutrális formára az ún. valódi, vagy belső oldhatóságot S0, míg az ionos formára a logS-pH összefüggést is megadják. Kinetikai oldhatóság, SAPP A kinetikai oldhatóság megadásánál a vizsgált heterogén rendszerekben a pillanatnyi oldhatóságot mérik, mivel a mérési eljárás során nem hagyunk elég időt az egyensúly beállására. A kinetikai oldhatóság a telített oldat koncentrációja adott időpillanatban nézve. Általánosságban elmondható, hogy a vegyületek kinetikai oldhatósága a legtöbb esetben magasabb, mint az egyensúlyi oldhatósága, amely a definícióból is egyértelműen következik. Kinetikai oldhatóság során a hatóanyagot tömény, DMSO-os oldat formájában viszik be a rendszerbe, így nem kell számolni a szilárd forma, vagy a formulálás különbségeiből adódó különböző rácsenergiák leküzdésével. Ugyanis a szilárd struktúrának gátló hatása lehet az oldhatóságra. 37
Az ionizálható vegyületek oldhatósága gyenge savak esetében Ahhoz, hogy kiszámolhassuk egy vegyület pH-függő oldhatóságát a HendersonHasselbalch (HH) egyenletből, szükségünk van a vegyület belső oldhatóságára (S0), és a molekula pKa értékeire. 19
Merkei Viktória
2014
és a hozzá tartozó egyensúlyi állandó:
(6)
és a hozzá tartózó egyensúlyi oldhatóság: (7) Az oldhatóság (S) egy adott pH-n megadható a vizes oldatban jelenlévő részecskék koncentrációjával a tömeghatás törvénye alapján. Az alábbi összefüggést érdemes átalakítani olyan formába, hogy csak a hidrogén-ion koncentráció legyen az egyetlen változó paraméter.
(8) (9)
(10) (11) Analóg módon levezetve gyenge bázisokra és amfoterekre rendre a következő egyenletet kapjuk: (12) (13) Az oldhatóság meghatározására számos módszer ismert. Ennek ellenére nincs egységesen elfogadott, általánosan alkalmazható módszer. Különbséget tehetünk, hogy kinetikai vagy termodinamikai oldhatóság meghatározásról van-e szó. A kapott eredményekből az oldhatóság-változásokat akarjuk tanulmányozni. Így az általunk választott mérési összeállítás egy kvázi-termodinamikai oldhatóság mérés volt.
Kvázi-termodinamikai oldhatóság mérés38 Ebben az eljárásban ismert mennyiségű mintát viszünk be ismert pH-jú és térfogatú oldószeres rendszerbe. A mintát tömény DMSO törzsoldat segítségével adjuk a rendszerhez, figyelve, hogy a DMSO térfogatszázalékban megadott koncentrációja 1% alatt legyen. Az alkalmazott mintának elegendő mennyiségűnek kell lennie ahhoz, hogy a telítődés elérése esetén csapadékkiválást figyelhessünk meg. Megfelelő ideig rázatjuk a mintát, hogy az 20
Merkei Viktória
oldatunk
elérjen
2014
egy
kívánt
telítettségi
állapotot.
Ezután
a
szilárd
fázist
szűréssel/centrifugálással eltávolítjuk, és a visszamaradt tiszta oldat/felülúszóból vett minta spektrumát felvesszük UV-vis spektrofotométerrel. A referencia oldat esetében is adott mennyiségű mintát oldunk fel ismert pH-jú és térfogatú oldószerben, de a minta mennyisége kevesebb, mint az előző esetben, hogy elkerüljük a csapadékkiválást. Tehát, hogy ismert koncentrációjú (cR) mintaoldat spektrumát regisztráljuk. Mindkét spektrum esetében a görbe alatti területet (AUCS, AUCR) használjuk a kiértékelés alapjául. (14) A módszer előnye, hogy egy plate-en egyszerre 96 beállítást mérhetünk.39 Oldhatóság mérés során több tényezőt is fegyelembe kell venni. Szennyezők jelenléte, segédanyagok, aggregátum képződés mind változtathatja az oldhatóságot.40
4. Célkitűzés Munkám során célul tűztem ki, hogy a ciklodextrin-hatóanyagok komplexálódási folyamatait leíró jellemző paraméterein végighaladva egyes gyógyszerek mutatnak-e hasonló komplexálódási hajlamot glükózaminoglikánokkal, valamint ezen kialakult komplexek hatására változnak-e azon fizikai-kémiai paraméterek, melyek a felszívódás minőségét leginkább jellemzik. Feladatunk ennek megfelelően annak feltérképezése volt, hogy a glükózaminoglikánok milyen interakcióba lépnek a kismolekulás hatóanyagokkal és e folyamatok során létrejönneke olyan komplexek, melyek kedvezőbb felszívódási körülményeket biztosítanak a kiválasztott hatóanyagokra, mint amit a gyógyszerek eredeti szabad formái. Munkám célja egyes fizikai-kémiai paraméter változások követése alapján a glükózaminoglikánok komplexáló ágensként való viselkedésének igazolása néhány előzetesen kiválasztott hatóanyag példáján.
21
Merkei Viktória
2014
5. Kísérleti rész A kismolekulás hatóanyagok Munkám során 5 gyógyszervegyületet vizsgáltam, melyeket sav-bázis és lipofil tulajdonságuk alapján, vagyis UV-pH spektrofotometriásan mérhető és magas lipofilitás értékkel rendelkező vegyületeket választottunk ki. A vegyületek szerkezeti képletét a 13. ábra, fizikai-kémiai tulajdonságaikat a 1. táblázat mutatja be. Az Asztemizol hisztamin H1-receptor antagonista, a Dietilsztilbesztrol egy szintetikus ösztrogén, a Telmizartán egy angiotenzin II receptor blokkoló, melyet magas vérnyomás kezelésére adnak. A Nifedipin egy L-típusú kalcium-ion csatornablokkoló, többek között magas vérnyomás kezelésére a Glibenklamid pedig egy diabétesz ellenes hatóanyag.
Nifedipin
Dietilsztilbesztrol
Asztemizol
Telmizartán
Glibenklamid 13. ábra Hatóanyagok szerkezeti képlete
22
Merkei Viktória
2014
1. táblázat Hatóanyagok tulajdonságai Név
1. 2. 3. 4. 5.
Nifedipin Dietilsztilbesztrol Telmizartán Asztemizol Glibenklamid5
Móltömeg (g/mol) 346,33 268,35 514,62 458,57 493,14
Összegképlet
C17H18N2O6 C18H20O2 C33H32N4O2 C28H31FN4O C23H28ClN3O5S
clogP1
1,82 5,19 7,83 5,39 3,79
log D7,42
Sav/Bázis karakter3
pKa1
pKa2
pKa3
3,17 5,07 5,95 2,96 -
B 2B BAB 2A A
2,33 9,60 3,50 5,81 5,38
10,32 4,01 8,51 -
-
A GAG-ok és CD-k A kísérletek során felhasznált különböző glükózaminoglikánok a Richter Gedeon Nyrt. Technológiai Fejlesztési Labor II. részlegétől származtak. A CD-k a CycloLab Kft-től kerültek beszerzésre. A GAG-ok és CD-ek dolgozatomban használt jelölései: Nagy mólsúlyú hialuronát: HMW-HA (a viszkozitás értékeket használják ezek jellemzésére, esetünkben η=27,13 Pas). Kis mólsúlyú hialuronátok: 10E HA (átlagos molekulaméret: ~10 kDa-os), 100E HA (átlagos molekulaméret: ~100 kDa-os). Ezen értékek méretkizárásos kromatográfia segítségével lettek meghatározva. Heparin. Kondroitin-szulfát: kondroitin. α-CD: αCD β-CD: βCD γ-CD: γCD Randommetil-β-CD: RaMeβCD 2-hidroxipropil-β-CD: OHPrβCD 2-hidroxipropil-γ- CD: OHPrγCD és szulfobutil-β-CD: SBuβCD
1
MarvinSketch (ChemAxon Kft.) program által kalkulált érték Avdeef, A.: Absorption and Drug Development Solubility, Permeability and Charge State 2012. pION, Inc. John Wiley & Sons 3 A a savi karakter, B bázikus karakter jelölése, az előtte álló szám pedig a karaktert hordozó funkciós csoportok számát jelöli. 4 Az feltüntetett pKa értékeket mérések segítségével határoztuk meg. 5 Csak koszolvens jelenlétében sikerült a psKa értéket meghatározni, pKa értékét extrapoláció útján nyertük ki. 2
23
4
5,93 -
Merkei Viktória
2014
A glükózaminoglikánok esetében nem beszélhetünk konkrét molekulatömegről, csupán átlagos móltömegről és annak tartományairól, ezért a koncentrációk meghatározása nehézkes. Esetünkben, hogy a méréseket összehasonlíthassuk a CD mérések értékeivel a GAG-ok diszacharid egységeire vonatkozó móltömegeket használtam a koncentrációk kiszámítására (minden esetben a nátrium-só formák móltömegét vettem alapul).
2. táblázat GAG-ok diszacharid egységeinek móltömegei Átlagos móltömeg
Diszacharid egység móltömege
(Da)
(g/mol)
10E HA
10.000
402
100E HA
100.000
402
HMW-HA
milliós nagyságrend, nem definiálják
402
kondroitin
16.000-25.000
503
heparin
12.000-15.000
675
Név
A pKa mérés során felhasznált anyagok, eszközök A mérések során különböző reagenseket és puffer oldatokat használtunk. Reagensek: 0,5 M HCl, 0,5 M KOH oldatok, ISA-víz oldat (0,15 M KCl oldat). Puffer oldatok: Neutral Linear Buffer a gyors UV mérésekhez és mid-range puffer a kétküvettás mérésekhez. A puffer oldatokat a következő receptek alapján készítettük el: Mid-range puffer: 2,5 mg/ml-es K2HPO4 ISA-vízzel készített oldat. Neutral Linear Buffer: a Sirius Analytical Ltd. speciális puffere a teljes tartományon végzett UV-pH titrálásokhoz. Összetételét a forgalmazó cég nem adja meg, védett információként kezeli. A méréseket a Sirius Analytical Ltd. által forgalmazott T3 Sirius készülékkel végeztük.
24
Merkei Viktória
2014
A permeabilitás mérések során felhasznált anyagok és eszközök A n-dodekán és a dimetil-szulfoxid (DMSO) oldószerek a Merck Kft.-től származtak. Az összes többi vegyszer, illetve a referencia gyógyszerhatóanyagok a Sigma-Aldrich Kft-től kerültek beszerzésre. A használt puffer oldatok elkészítési receptjei: pH 6,5-ös puffer: 45 ml 0,01 M-os Na2HPO4 oldat + 55 ml 0,01 M-os NaH2PO4 oldat. pH 7,4-es puffer: 1 l ioncserélt víz + 1 tasak izotóniásan kiegyensúlyozott foszfát puffer (PBS) só keverék (0,01 M Phosphate Buffered Saline, 0,138 M NaCl; 0,0027 M KCl, pH 7,4, 25 C-on; Sigma Aldrich Kft., 028K8214). A vizsgálatokhoz 96-cellás polipropilén mérőtálcákat (Agilent Technologies, Denmark), 96cellás polikarbonát alapú, szűrő donor-tálcákat (MultiscreenTM-IP, MAIPNTR10, pórusméret 0,45µm; Merck-Millipore) és 96-cellás teflon fogadó tálcát (Multiscreen Acceptor Plate, MSSACCEPTOR; Merck-Millipore) használtunk. A méréseket mérőtálca-rázó inkubátorban (Heidolph Titramax 1000) végeztük 300 rpm fordulatszámon. Az oldatok bemérésére Eppendorf többcsatornás automata pipettákat, pipettahegyeket használtunk.
Az oldhatóság mérés során alkalmazott anyagok és eszközök Alacsony viszkozitású anyagok vizsgálataihoz 96-cellás polipropilén mérőtálcákat (Agilent Technologies, Denmark), 96-cellás polikarbonát alapú, szűrő tálcákat (MultiscreenTM-HTS, MSSLBPC10, Merck-Millipore) és az oldatok bemérésére Eppendorf többcsatornás automata pipettákat, pipettahegyeket használtunk. A méréseket mérőtálca-rázó inkubátorban (Heidolph Titramax 1000) végeztük 600 rpm fordulatszámon. A magas viszkozitású HMW-HA oldatok vizsgálataihoz 1,5 ml térfogatú Eppendorf-csöveket használtunk. A méréseket mérőtálca-rázó inkubátorban (Heidolph Titramax 1000) végeztük 600 rpm fordulatszámon. Szűrés kiváltására pedig centrifugát (Eppendorf Centrifuge 5804 R, szobahőmérsékleten 15 percen át 14000 rpm fordulatszámon alkalmaztuk), az oldatok bemérésére Eppendorf többcsatornás automata pipettákat, pipettahegyeket használtunk.
25
Merkei Viktória
2014
Az abszorbncai-változások detektálásához használt eszközök A permeabilitás és oldhatóság mérés abszorbancia-változások detektáláshoz 96 lyukú UVáteresztő UV-STAR mikroplate (65580M Greiner Bio-One cég által gyártott) mérőtálcát használtuk
és
Multiskan
Sectrum
Microplate
(Thermo)
UV-spektrofotométerrel
(továbbiakban UV-mérőtálca olvasó) követtük az abszorbancia-változásokat.
A pKa mérés összeállítása A készülék mérőtálcáján elkészítettem a minta-összeállításokat, mely a különböző GAG-ok különböző koncentrációjú és térfogatú oldatából és a hatóanyagok 10 mM os DMSO törzsoldatból vett 5 l, illetve Telmizartán esetén a fokozott UV abszorbancia miatt 3 µl térfogatú oldatából állt. Minden háttérhez külön referenciamérést programoztunk be, oly módon, hogy az adott referencia üvegcsébe az adott hátteret (GAG-ot) és a következőkben bemérendő hatóanyag-oldat térfogatoknak megfelelő DMSO oldatot pipettáztam be. A mérőberendezéshez tartozó szoftver segítségével beprogramoztam a kívánt paramétereket. A kiértékeléshez szintén a Sirius Analytical Ltd. által fejlesztett RefinementProTM szoftvert használtam.
A PAMPA rendszer összeállítása A permeabilitási méréseket minden esetben 3 párhuzamossal végeztem 96 lyukú plate rendszeren. Első lépésként polipropilén plate-en összemértem a vizsgálandó GAG és hatóanyag-törzsoldatokat különböző összeállításban, melyek a PAMPA rendszer donor oldali összeállításának feleltek meg (15 µl DMSO-törzsoldat és 285 µl háttér, összesen 300 µl). A bemérés után anyagkiválást figyelhettünk meg, azaz túltelített oldatot készítettünk a hatóanyagra nézve, majd ezt 1 órás rázatás követett szobahőmérsékleten. Ezt követően bemértem a megfelelő 300 µl-nyi fogadó és az előzetesen rázatott összeállításból 150 µl-nyi donor mintákat. A plate donor és fogadó oldalát mesterséges, polikarbonát membrán választja el, melyre foszfatidilkolin és koleszterin 2:1 arányú n-dodekános oldatát vittem fel, amit előzetesen homogenizáltunk hidegen, ultrahangos fürdő segítségével. Ennek megfelelően a membrán elkészítéséhez 16 mg foszfatidilkolint és 8 mg koleszterint oldottam 600 µl ndodekánban, mely oldatból 5 µl-t vittem fel a polikarbonát membrán felületére. Ez a lipidösszetétel a vékonybél felszínén történő felszívódás modellezéséhez a megfelelő, ami ebből a szempontból a legjelentősebb része a gasztrointesztinális traktusnak. A párolgási veszteségek elkerülése érdekében nedves szűrőpapírral lefedtük. 4 órás 370C-on történő 26
Merkei Viktória
2014
inkubálás után UV-mérőtálca olvasóval detektáltuk a hatóanyag koncentrációváltozását a donor és a fogadó oldalon. A 370C megfelel szervezetünk maghőmérsékletének. A kiértékeléshez az irodalmi részben bevezetett Faller-egyenletet (5) használtuk. Az így nyert permeabilitási adatokat a tiszta, GAG-mentes, pufferes oldatok permeabilitásához viszonyítva információt kapunk a vizsgált vegyület passzív diffúzión alapuló transzportjának megváltozásáról. Különböző összeállítások mellett határoztuk meg a permeabilitásokat. Az 5 féle GAGoldatot (10E HA,100E HA, HMW- HA, heparin, kondroitin) 3 különböző (1, 2,5, 5 mg/ml-es oldatok,
melyekből
a
diszacharid
egységek
móltömegét
felhasználva
számoltam
koncentrációt) koncentrációban használtam. Ezeket egyik esetben, mint donor oldali, másik esetben, mint fogadó oldali közegként alkalmaztuk. A hatóanyagok permeabilitását regisztráltuk azon esetekben is, amikor mindkét oldalon csupán tisztán pufferes közeg található. Az így kapott permeabilitási értékeket viszonyítottuk a GAG-oldatok jelenlétében kapott értékekkel, vagyis a GAG-ok hatására bekövetkező változásokat ennek megfelelően azonosítottuk.
Az oldhatóság mérés összeállítása Az oldhatóság méréseket minden esetben 6 párhuzamos mérés mellett végeztem. Összemértem a hatóanyag DMSO törzsoldatából adott térfogatot és maximális térfogatra kiegészítettem a különböző, adott koncentrációjú és pH-jú GAG-oldatokkal. Az összeállítást 4 órán keresztül szobahőmérsékleten rázattam, majd szűrtem/centrifugáltam és 100 µl-nyi szűrletben/felülúszóban a kialakult hatóanyag-koncentrációt UV-áteresztő plate-en UVmérőtálca olvasó segítségével (230-400 nm között) mértem. A kiértékeléshez az irodalmi részben ismertetett (14)-es összefüggést használtam fel.
6. Eredmények A továbbiakban hatóanyagonkénti bontásban szeretném bemutatni a különböző GAG-ok hatásait. Az eredményekhez tartozó szórásértékek a Mellékletek fejezetben vannak feltüntetve. Habár a heparint és a kondroitint móltömeg alapján a kis mólsúlyú hialuronátoknak lehet megfeleltetni, az ezekben a vegyületekben jelenlévő szulfonát-csoport(ok) jelentősen megváltoztatják a tulajdonságaikat. Így a móltömeg alapján való összehasonlítás esetünkben 27
Merkei Viktória
2014
megtévesztő lenne, ezért külön kezeltem mindegyik általunk alkalmazott GAG-ot. Ez alapján minden hatóanyag esetében a GAG-ok hatására bekövetkező változások alapján trendszerű viselkedési formákat figyelhettünk meg. A CD mérések esetében, melyek kölcsönhatás szempontjából egyszerűbb vegyületeknek tekinthetők, így legtöbb esetben változásaik lineáris trendet követnek, hozzárendelhetők egy adott kölcsönhatási formához. Feltételezésünk ez alapján az volt, hogy a GAG-ok esetében, ha azonosíthatók is a trendek, nem lesznek egyszerűen, a CD-ekkel azonos módon hozzárendelhetőek egy-egy jól körülírt kölcsönhatás típushoz, hiszen összetett, változó harmadlagos szerkezettel rendelkező, több funkcióscsoporttal ellátott természetes polimerekről beszélünk.
pKa mérés eredményei, előzetes CD mérések A pKa mérések az esetben adnak információt egy adott rendszeren belül a vegyületek között kialakuló kölcsönhatásokról, ha a sav-bázis karaktert hordozó részlet érintett annak kialakításában. Így nem jelenthetjük ki egyértelműen azt, hogy amennyiben nincs változás, úgy kölcsönhatás sincsen. Viszont amennyiben detektálhatunk változást, az nagy valószínűséggel a kialakuló kölcsönhatást jelzi számunkra. Mivel munkánk kiindulópontja a CD-ek hatására bekövetkező proton-disszociációs viszonyok változásai, így meghatároztuk a kiválasztott vegyületek CD-kel mutatott pKa eltéréseit is. Ehhez először megmértük a hatóanyagok α-,β-,γ-, RaMeβ-, OHPrβ-, OHPrγ- és SBuβCD mellett a pKa értékek változását (1. melléklet). Minden esetben kiválasztottam, azt a CD-t, ami mellett a legnagyobb változást figyelhettük meg, és ezzel a komplexáló segédanyaggal különböző koncentrációk mellett is megmértük a pKa változást. A Nifedipin egyik CD hatására sem mutatott eltérést. Telmizartán esetében a γ-CD, míg a többi hatóanyag esetében a RaMeβ-CD volt a választott referencia ligandum. Glibenklamid esetében csak koszolvens jelenlétében sikerült a mérést végrehajtani, ekkor ugyanazon koszolvens (19,9 V/V% MeOH) tartalom mellett hasonlítottuk össze a psKa értékekben bekövetkező változásokat. A 14. ábrán bemutatott diagramon minden esetben, azzal a CD-vel mért értéket tüntettem fel, amellyel a legnagyobb változást figyelhettük meg. Így különböző hatóanyagoknál a fent felsorolt CD típusokhoz tartozó értékeket láthatjuk. Jelentős és értékelhető változásnak a legalább 0,1 pKa egységet meghaladó változást tekintjük.
28
Merkei Viktória
2014
14. ábra CD hatására bekövetkező pKa változások A diagramon látható, hogy jellemzően lépcsős mintázatot követve, a csökkenő CD koncentráció hatására csökken a ΔpKa érték is. Megfigyelhető továbbá az is, hogy a savas karakterek esetében a pKa nő, bázisok esetében csökken. Tehát a savak CD hatására gyengébb savas karakterűek, a bázisok gyengébb bázikus karakterűek lesznek. Ez a jelenség egyúttal azt is mutatja, hogy a ligandum (jelen esetben a CD) a komplexálódás során leárnyékolja az adott vegyület érintett savas, illetve bázikus karakterű funkciós csoportját. Másfelől megfelel annak az általános leírásnak miszerint a CD-ek jellemzően a vegyületek semleges formáját preferálják, hidrofób üregükbe ezt a formát zárják, komplexálják.41
29
Merkei Viktória
2014
pKa mérés eredményei - a GAG és hatóanyag együttesei
A CD-ek esetében kapott eredménnyel ellentétes trend figyelhető meg GAG-ok, mint ligandumok alkalmazása esetében. Méréseink alapján a savas karakterű csoportok esetében legtöbbször csökkentik, bázikus karakterű vegyületek esetében növelik a hatóanyagok pKa értékeit az oldatban jelenlévő GAG-ok. Ez a megfigyelés egyúttal azt is megmutatja, hogy a GAG-ok jelenlétében a hatóanyagok ionos formában stabilizálódnak, a kialakuló szubsztrátligadum rendszerek elsősorban elektrosztatikus kölcsönhatásokkal jellemezhetőek. A kölcsönhatás pontosabb definiálására, hogy pontosan milyen arányban vesz részt a komplex kialakításában az ionos, vagy a van der Waals típusú hatások, a pKa mérés keretein belül sajnos nincs lehetőség. A pKa változások esetében a CD-eknél tapasztaltakkal szemben még egy eltérő tulajdonság figyelhető meg. A CD-knél tapasztalt folyamatos és egyirányú pKa változásokkal szemben, GAG-ok esetében legtöbbször burkológörbe írja le a protondisszociációra vonatkozó paraméter változását. Így ennek megfelelően, illetve a jelenség pontosabb azonosíthatósága érdekében a következőkben az előzőtől eltérő diagramtípust alkalmaztam az eredmények bemutatására.
Asztemizol(2B) 0,6 pKa 110E 10E HA HA pka1
0,5
pKa 1100E 100E HA HA pka1
0,4 pKa változás
pKa 1HA HMW-HA pka1
0,3
pKa 1heparin heparin pka1 pKa 1kondroitin kondroitin pka1
0,2
pKa 210E 10E HA HA pka2
0,1
pKa 2100E 100E HA HA pka2
0 0
2
4
6
8
-0,1 -0,2
pKa 2HA HMW-HA pka2 pKa22 heparin heparin pka pKa 2kondroitin kondroitin pka2
GAG koncentáció (mM)
15. ábra Az Asztemizol pKa változásai GAG-ok jelenlétében. Az ábra jelölései: 10E HA= 10 kDa hialuronsav, 100E HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát. 30
Merkei Viktória
2014
Dietilsztilbesztrol (2A)
0,8 0,6
pKa 1 10E HA
pka 1 10E HA
pKa 1 100E HA
pka1 100E HA
0,4
pKa 1 HMW-HA
pKa változás
pka1 HA
pKa 1 heparin
0,2
pka1 heparin
pKa 1 kondroitin
pka1 kondroitin pKa 2 10E HA
0 0
2
4
6
8
pka2 10E HA
pKa 2 100E HA
pka2 100 E HA
pKa 2 HMW-HA
-0,2
pka2 ha
pKa 2 heparin
pka2 heparin
-0,4
pKa 2 kondroitin
pka2 kondroitin -0,6
GAG koncentráció (mM)
16. ábra A Dietilsztilbesztrol pKa változásai GAG-ok jelenlétében. Az ábra jelölései: 10E HA= 10 kDa hialuronsav, 100E HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát.
31
Merkei Viktória
2014
Glibenklamid (A) 0,3 0,2 0,1
pKa változás
0 -0,1 0
2
4
6
8
pka1 HA pKa 1 10E 10E HA
-0,2
pka1 HA pKa 1 100E 100E HA
-0,3
pka1 pKa 1 HA HMW-HA
-0,4
pka1 pKa 1 heparin heparin
-0,5
pka1 pKa 1 kondroitin kondroitin
-0,6 -0,7 -0,8
GAG koncentráció (mM)
17. ábra A Glibenklamid pKa változásai GAG-ok jelenlétében. Az ábra jelölései: 10E HA= 10 kDa hialuronsav, 100E HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát.
Nifedipin (B) 1,2 1
pKa változás
0,8 pka1 pKa 110E 10E HA HA 0,6
pka1 HA pKa 1100E 100E HA pKa 1HA HMW-HA pka1
0,4
pKa 1heparin heparin pka1
0,2
pKa 1kondroitin kondroitin pka1
0 0 -0,2
2
4
6
8
GAG koncentráció (mM)
18. ábra A Nifedipin pKa változásai GAG-ok jelenlétében. Az ábra jelölései: 10E HA= 10 kDa hialuronsav, 100E HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát. 32
Merkei Viktória
2014
Telmizartán (BAB) 0,6 pka1 pKa 110E 10EHA HA pka1 E HA HA pKa 1100 100E
0,4
pka pKa11Ha HMW-HA pka1 pKa 1heparin heparin
pKa változás
0,2
pka1 pKa 1kondroitin kondroitin pKa 210E 10EHA HA pka2
0 0
2
4
6
8
pKa 2100E 100EHA HA pka2 pKa 2HA HMW-HA pka2
-0,2
pKa 2heparin heparin pka2 pKa 2kondroitin kondroitin pka2
-0,4
pKa32HA HMW-HA pka pKa 2heparin heparin pka3
-0,6
GAG koncentráció (mM)
pKa 2kondroitin kondroitin pka3 pKa 2 10E HA pKa 2 100E HA
19. ábra A Telmizartán pKa változásai GAG-ok jelenlétében. Az ábra jelölései: 10E HA= 10 kDa hialuronsav, 100E HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát.
Asztemizol esetében a felső, piperidin-gyűrű bázikus nitrogénjéhez köthető pKa érték az, ami érzékeny a változó GAG koncentrációra. A gyengébb bázikus karakterrel rendelkező benzimidazol-gyűrű bázikus nitrogénje esetében, ha mutatkozik is változás a pKa értékben, nem mutat a koncentráció-függést, ami a CD-ektől eltérő összetett, több tényezős kölcsönhatás kialakulását jelzi. Megfigyelhető, hogy máshogy viselkedik a 10E HA és HMWHA is, ami rávilágít, hogy van különbség az éltérő átlagos molekulatömegű hialuronátok között is. A Dietilsztilbesztrolnak két, egymáshoz meglehetősen közel eső pKa értéke van, ami a két hirodxil-csoportjához köthető, melyek változásai jó egyezést adnak a különböző GAGok hatására és értékük (a 100E HA kivételével) a GAG-koncentráció változtatását trendszerűen követik. A Nifedipin és Glibenklamid esetében a kondroitin kivételével hasonló bár ellentétes irányú görbelefutásokat kaptunk, összhangban azzal, hogy itt egy báziskus és egy savas karakterű vegyületről beszélhetünk. 10E HA, 100E HA alkalmazásakor nem tapasztaltunk trendszerű 33
Merkei Viktória
változást,
csupán
2014
a
pKa
érték
ugrásszerű
változását.
HMW-HA
esetében
koncentrációnöveléssel nem-lineáris csökkenő tendenciát kaptunk, heparin esetében pedig kvázi-lineárisan növekvő tendencia volt tapasztalható. Itt is megfigyelhető a különbség a különböző méretű HA-k között. Érdemes megjegyezni, hogy GAG-ok jelenlétében a Glibenklamid titrálható volt már oldószermentes, tisztán vizes közegben, míg GAG-ok nélkül csak koszolvens (19,9 V/V% MeOH) segítségével volt a mérés kivitelezhető. A Telmizartán esetében csak a benzimidazol-gyűrű nitrogénjéhez köthető bázikus rész pKa értéke változott, a többi értékugrása valószínűleg ezen karakter megváltozásából adódik, ami hatással van a molekula többi részletére is. A szulfatált-GAG-ok jelenlétében a pKa változása lineáris, míg a HA jelenlétében ismét nem-lineáris trendet követ. Ezek alapján levonhatjuk azt a következtetés, hogy a kialakuló kölcsönhatás a GAG-ok és a hatóanyagok között szerkezet-specifikus jelenség lehet, hiszen mindegyik vegyület jelenlétében másképp alakultak az egyes görbék lefutásai. Ezen felül a Nifedipin esetén a CDek alkalmazásakor tapasztaltakkal szemben az egyes GAG-ok hatására karakterisztikus pKa változást sikerült azonosítanunk.
PAMPA mérés eredményei A permeabilitási vizsgálatokat 5 féle GAG esetében (10E HA,100E HA, HMW-HA, heparin, kondroitin) 3 különböző (1, 2,5, 5 mg/ml-es) koncentrációban végeztük két beállítása mellett. Egyik esetben csak a donor oldalhoz, a másik esetben csak fogadó oldalhoz adtunk GAG oldatokat az előzőekben megadott végkoncentrációk beállítása mellett. PAMPA mérések esetében csak 4 hatóanyagot tudtam vizsgálni, mivel az UV-mérőtálca olvasó érzékenységéből adódóan nem volt alkalmas a Dietilszilbesztrol azonosítására. A CD-vel kivitelezett, az osztályon folytatott PAMPA kísérletek eredményeit alapul véve, a donor oldali esetben permeabilitás csökkenést, míg a fogadó oldali összeállítás esetében permeabilitás növekedést vártunk, amit mind a két esetben a segédanyag oldhatóság segítő hatásával magyaráztunk.
34
Merkei Viktória
2014
Asztemizol-donor oldali GAG -4,20 0
5
10
Asztemizol- fogadó oldali GAG -4,20 15
0
-5,20
-5,20
logPe
-4,70
logPe
-4,70
-5,70 -6,20 -6,70 -7,20
10E HA 10E 100E HA 100E HMW-HA HA heparin heparin kondroitin kondroitin
5
10
15
-5,70 -6,20 -6,70 -7,20
GAG koncentráció (mM)
GAG koncentráció (mM)
20. ábra Asztemizol logPe - GAGkoncentráció diagramja. Az ábra jelölései: 10E HA= 10 kDa hialuronsav, 100E HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát. Az Asztemizol, ami egy dibázikus vegyület, pKa értékeiből adódóan (5,81 és 8,51) részlegesen ionos formában van jelen a PAMPA modell pH rendszereiben (donor pH 6,5, fogadó pH 7,4). Az eredmények alapján jól látható, hogy a két modellrendszer esetében kapott logPe - GAGkoncentráció görbék lefutásai minden egyes GAG esetén kvázi egymásnak tükörképi vonulatait követik le, ami megfelel az ellentétes összeállítás miatt várható ellentétes hatásnak. A kisebb átlagos móltömegű hialuronátok esetében a 100E-HA közel a HMW-HAnak görbéjének lefutását követi le, viszont a 10E-HA egyértelműen elkülönül előbbi kettő görbe-lefutásától.
35
Merkei Viktória
2014
Telmizartán-donor oldali GAG -4,35 0
5
10
Telmizartán- fogadó oldali GAG 15
-4,35 0
-4,55
5
10
15
-4,75 -4,95
10E HA 10E 100E HA 100E
-5,15
HMW-HA HA heparin heparin
logPe
logPe
-4,55 -4,75 -4,95 -5,15
kondroitin kondroitin -5,35
-5,35
GAG koncentráció (mM)
GAG koncentráció (mM)
21. ábra Telmizartán logPe – GAGkoncentráció diagramja. Az ábra jelölései: 10E-HA= 10 kDa hialuronsav, 100E-HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát. Telmizartán esetében, ami ikerionos vegyület két bázikus és egy savas funkciós csoporttal, mely makroállapotait nézve minden pH értéken, így a pH 6,5-es értéken is ionos formában van jelen. Igaz az is elmondható, hogy döntő részben az ikerionos és az egyszeresen negatív töltéssel rendelkező forma dominál. A kapott eredmények közül kiemelendő a heparin fokozott gátló hatása a donor oldalon történő alkalmazása esetén.
36
Merkei Viktória
2014
Nifedipin- fogadó oldali -3,40 GAG
Nifedipin-donor oldali GAG -3,40 -3,80
logPe
-4,00 -4,20 -4,40
0
5
10
15
-3,60
10E 10E HA 100E 100E HA
-3,80
heparin heparin kondroitin kondroitin
5
10
15
-4,20 -4,40
-4,60
-4,60
-4,80
-4,80
-5,00
-5,00
-5,20
0
-4,00
HA HMW-HA
logPe
-3,60
-5,20
GAG koncentráció (mM)
GAG koncentráció (mM)
22. ábra Nifedipin logPe - GAGkoncentráció diagramja. Az ábra jelölései: 10E-HA= 10 kDa hialuronsav, 100E-HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát. A nifedipin, ami egyértékű bázis, a PAMPA modell puffer-rendszerében teljesen semleges formában van jelen (pKa = 2,33). Fontos kiemelni, hogy heparin esetében a fogadó oldali összeállításnál kiugró permeabilitás növekedést tapasztaltunk, ami nagy valószínűséggel nem a szulfonsav-csoport jelenlétével magyarázható, hiszen a kondroitin alkalmazásakor nem azonosítható ilyen jellegű változás. Hasonlóan a Telmizatánnál tapasztaltakhoz, igaz itt a fogadó oldali GAG alkalmazás mellett, itt is a heparin esetén tapasztaltunk kiugró permeabilitás változást. A többi összeállításban felvitt hialuronátok és kondroitin mellett trendszerű csökkenés mutatkozik minden esetben.
37
Merkei Viktória
2014
Glibenklamid- donor oldali GAG
-3,40 -3,60 0
5
10
Glibenklamid- fogadó oldali GAG -3,40 15
-3,60
10E 10E HA
-3,80
-4,60
logPe
logPe
heparin heparin kondroitin kondroitin
-4,40
-4,20 -4,40 -4,60
-4,80
-4,80
-5,00
-5,00
-5,20 -5,40
10
-4,00
HMW-HA HA
-4,20
5
-3,80
100E 100E HA
-4,00
0
-5,20 -5,40
GAG koncentráció (mM)
GAG koncentráció (mM)
23. ábra Glibenklamid logP -GAGkoncentráció diagramja. Az ábra jelölései: 10E-HA= 10 kDa hialuronsav, 100E-HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát. A Glibenklamid, ami egyértékű sav, döntően ionos formában van jelen a PAMPA modellkörülményei között. Mindkét esetben a szulfatált-GAG-ok alkalmazásakor értünk el Pe növekedést. 100E-HA ismét leköveti a HMW-HA permeabilitás lefutásait, míg a 10E-HA ebben az esetben is más görbelefutást követ. A magasabb HA koncentrációknál tapasztalt visszaeső Pe értékeket a viszkozitást emelkedés miatt bekövetkező eloszlásviszonyok megváltozásnak tudjuk be. Összességében elmondható, hogy a heparin és a kondroitin-szulfát alkalmazása esetén tapasztalt kiugró eseteket leszámítva a két szulfatált-GAG hasonló módon befolyásolják a vizsgált hatóanyagok permeabilitási viszonyait, ami feltehetően a szulfonsav-csoportukkal magyarázható. A kapott eredményekből kitűnik, hogy a kis mólsúlyú, 10E HA alkalmazásakor a hatóanyagok permeabilitás lefutása eltér a HMW-HA esetében kapott trendtől. Ugyanakkor a HMW-HA esetében a magasabb hialuronát koncentrációk mellett tapasztalat csökkenő hatóanyagra vonatkoztatott permeabilitás feltehetően a viszkozitás növekedésével magyarázható. A HMW-HA igen viszkózus anyag, ami a közeg pH-jának savas irányba való eltolódásának hatásra tovább növekedik. Az általunk használt HMW-HA maximális oldatkoncentrációja, ami még kezelhető, 7,5 mg/ml volt, míg a többi GAG
38
15
Merkei Viktória
2014
esetében könnyen készíthetünk normál viszkozitású (könnyen folyó) oldatokat nagyobb koncentráció értékeken is. Az eredmények alapján megállapítható az is, hogy az előzőekben bemutatott permeabilitási trendek függetlenek a vegyületek sav-bázis karakterétől. Első megközelítésben elmondhatjuk, hogy a kialakuló kölcsönhatás szerkezet-specifikus jelenség. Az eredmények alapján elmondható, hogy a vizsgálatainkban alkalmazott GAG-ok nem csak a klasszikus pHmegoszlás hipotézissel harmonizáló semleges formában, hanem az ionos formáikban jelenlévő hatóanyagok permeabilitását is emelték.
Oldhatóság mérés A fenti eredmények, a pKa és a permeabilitás mérés során tapasztalt változások alapján egy kiválasztott vegyület, az Asztemizol oldhatóságának változását vizsgáltuk részletesen a GAGok emelkedő oldatkoncentrációjának a függvényében. A választásunk azért esett erre a hatóanyagra, mert a pKa változása egyetlen esetben sem lineáris lefutású, tehát ez különbözik leginkább a CD-k esetében tapasztalható trendektől.
Asztemizol oldhatóság Asztemizol pH ph6,5 6,5 oldhatóság 600 500 400
S
10E HA 300
100E HA HMW-HA
200
heparin
100
kondroitin
0 0
5
10
15
GAG koncentráció (mM)
24. ábra Asztemizol oldhatóság-GAG koncentráció összefüggése 6,5-ös pH-n. Az ábra jelölései: 10E-HA= 10 kDa hialuronsav, 100E-HA= 100 kDa hialuronsav, HMW-HA: nagy mólsúlyú hialuronsav, kondroitin=kondroitin-szulfát.
39
Merkei Viktória
2014
A korábbi vizsgálatainkkal összevetve igen érdekes következtetéseket vonhatunk le az 24. ábra alapján látható oldhatóság – GAGkoncentráció lefutásokat követve. A GAG-ok hatására bekövetkező oldhatóság javulás és/vagy romlás nem magyarázható közvetlenül a permeabilitási értékben bekövetkező változásokkal sem a donor, sem a fogadó oldali PAMPA modell esetében. Ha azt feltételeznénk, hogy a javuló oldhatóság miatt emelkedik a magasabb koncentráció miatt a passzív transzporttal átjutó molekulák száma, akkor egyértelmű növekedéseket kellene látnunk a donor oldali összeállítások esetében is, ahol oldhatóság növekedést tapasztaltunk, például 100E HA vagy a HMW-HA egy pontjában. Ezzel szemben permeabilitás csökkenéseket láthatunk. Ezen összeállításban csak a kondroitin esetében függhet össze az oldhatóság-javulás és a permeabilitás, mivel csak itt tapasztaltuk együttesen a két paraméter értékének emelkedését. Összességében levonhatjuk azt a következtetést, hogy a permeabilitás esetén kapott fordított trendek egy a CD-kel ellentétes effektusnak tudhatók be. Vagyis az első esetben, donor oldali összeállítás esetén a Pe emelkedés azt sugallja, hogy a GAG-al alkotott ionos kölcsönhatáson alapuló komplex segíti a membránon való átjutást azáltal, hogy lefedi a hatóanyagok töltéssel rendelkező részleteit, de a szabad hatóanyag koncentrációt nem, vagy csak igen kis mértékben csökkenti. A többi hatóanyag oldhatóság összefüggéseit részletesebben a jövőben kívánjuk vizsgálni.
7. Összefoglalás A kutatómunkám során azt vizsgáltuk, hogy a már forgalomban lévő kismolekulás gyógyszerhatóanyagok
(Asztemizol,
Glibenklamid,
Nifedipin,
Dietilsztilbesztrol
és
Telmizartán) milyen kölcsönhatásba lépnek a különböző természetes forrásból származó glükózaminoglikánokkal. Mutatnak-e komplexálódási hajlamot, valamint ezen kialakult komplexek hatására változnak-e azon fizikai-kémiai paraméterek, melyek a felszívódás minőségét leginkább jellemzik. Az általunk vizsgált fizikai-kémiai paraméterek a protondisszociációs állandó (pKa), effektív permeabilitás (logPe) és oldhatóság voltak. Minden paraméter esetében a megfigyelhető GAG-ok hatására bekövetkező változások, melyek e szempontból az irodalomban leginkább vizsgált segédanyagokkal (lásd CD-k) összevetve, nem, vagy csak részben egyező trendeket mutatnak. Ugyanakkor a hatóanyagokat egymáshoz viszonyítva sem lehetett egyértelmű összefüggéseket megállapítani, tehát nagy 40
Merkei Viktória
2014
valószínűséggel szerkezet-specifikus tulajdonságról beszélhetünk. A paraméterek egyeztetése során meg kellett állapítanunk, hogy nem csupán egy paraméter megváltozása befolyásolja a többi fizikai-kémiai paramétert. A proton-disszociációs állandók változásaiban a következő összefüggéseket
tapasztaltuk.
Amennyiben
változik
értékük
a
GAG
koncentráció
változtatására, a savas karakterek esetében csökkennek, bázikus karakterek esetében nőnek az értékek,
ami
az
ionos
kölcsönhatások
dominanciájára
utal
a
komplexképződési
folyamatokban. Permeabilitás esetében a donor oldalon alkalmazva a GAG-okat a legtöbb esetben csökken a Pe, míg fogadó oldalon alkalmazva a GAG-okat, nem tudunk egyértelmű következtetéseket levonni. Ezek a változások nem köthetők egyértelműen a vegyületek egy adott paraméteréhez. Az oldhatóság-javulás pedig az Asztemizol esetében közvetlenül nem magyarázza a tapasztalt Pe változásokat. Meg kell említenünk továbbá, hogy a vizsgálatok jóságát rontja a HMW-HA magas viszkozitásából adódó mérési nehézségek. Összességében, a három paramétert tekintve elmondható, hogy vizsgálataink alátámasztják a hatóanyagok – GAG-ok között kialakuló komplex kölcsönhatások kialakulását, ami alapvetően ionos jellegű. Igaz az egyes fizikai-paraméterek között megfigyelhető eltérő trendek miatt nem zárhatók ki egyéb
kölcsönhatások
létrejöttei
sem,
melyeket
NMR-vizsgálatokkal
kívánunk
a
továbbiakban azonosítani. Ezen megállapítások azt az információt is hordozzák magukban, hogy a jelenleg ismert és használt in vitro kísérletek és azok kinetikai leírása milyen korlátokat rejt magában az általunk választott és vizsgált GAG-ok körében. Így az ilyen, bár láthatóan egyszerű diszacharid egységekből álló, de bonyolult harmadlagos szerkezetű molekulák és egyes hatóanyagok közötti kölcsönhatások esetében azonosíthatjuk a változásokat, de összefüggéseiket már nem látjuk egyértelműen. Így további terveink között szerepel a komplexeket NMR-spektroszkópia segítségével vizsgálni, hogy pontosabb szerkezeti információt nyerjünk, valamint a fent tárgyalt in vitro előrejelzések alapján tervezzük összetettebb sejtes, in vivo farmakokinetikai vagy akár állatkísérletekben megvizsgálni a hatások változását. Elképzelésünk szerint ezen kölcsönhatások javíthatják a kismolekulás hatóanyagok biohasznosulását ADME tulajdonságaik befolyásolásával, melyeket a fent említett módokon, elsősorban in vivo farkmakokinetikai kísérletekkel kívánunk a jövőben azonosítani.
41
Merkei Viktória
2014
8. Mellékletek
1. melléklet hatóanyagok pKa változásai különböző CD-k esetében (mérések száma 1)
Asztemizol pKa 1 aq pKa
5,8
Telmizartán
pKa 2
pKa1
pKa 2
pKa 3
pKa 1
pKa 2
8,51
3,5
4,01
5,93±
9,6
10,3
9,86
10,88
10,34
11,67
5,98
αCD
5,82
-
3,17
4,4
βCD
5,72
8,1
3,27
4,21
5,95
3,01
4,35
6,01
γCD
Dietilsztilbesztrol
rosszul oldódik
nem oldódik
nem oldódik
RaMeβCD
5,56
7,88
OHPrβCD
5,67
7,83
2,08
4,13
5,86
nem oldódik
OHPrγCD
5,78
7,95
3,24
4,43
5,89
nem oldódik
SBuβCD
5,89
8,32
nem oldódik
10,25
11,57
nem oldódik
42
Glibenklamid
psKa (MeOH) 19.9 V/V%n-ál psKa (MeOH)
Nifedipin pKa 1
pKa 1
5,22
2,33
5,31
19.4 V/V%n-ál psKa (MeOH) 19.2 V/V%n-ál psKa (MeOH) 19.1 V/V%n-ál psKa (MeOH) 19.96V/V%n-ál psKa (MeOH) 19.5 V/V%n-ál psKa (MeOH) 19.9 V/V%n-ál psKa (MeOH) 19.5 V/V%n-ál
2,36
5,2
2,33
5,31
2,35
5,55
2,30
5,37
rosszul oldódik
5,29
2,39
5,54
2,38
Merkei Viktória
2014
2. melléklet hatóanyagok pKa változásai a kiválasztott CD-k esetében (érték±szórás alakban)
Név
Asztemizol
CD koncentráció (mM)
aq pKa
6,22
3,11
1,55
Dietilsztilbesztrol
Telmizartán
Glibenklamid
Nifedi pin
pKa 1
pKa 2
pKa 1
pKa 2
pKa 3
pKa 1
pKa 2
pKa 1
pKa 1
5,81
8,51
3,5
4,01
5,93
9,6
10,32
5,38
2,33
5,48±
7,8±
3,15±
4,3±
5,89±
10,07±
10,95±
5,65±
0,027
0,012
0,031
0,005
0,005
0,021
0,09
0,093
5,62±
8,03±
3,07±
4,29±
5,96±
9,9±
10,8±
5,62±
0,037
0,069
0,096
0,021
0,028
0,033
0,131
0,053
5,66±
8,11±
3,05±
4,3±
5,99±
9,87±
0,021
0,05
0,051
0,003
0,005
0,044
10,88± 0,063
rosszul oldódik
-
-
-
3. melléklet hatóanyagok pKa változásai különböző GAG-ok jelenlétében (érték±szórás alakban) Asztemizol
Név GAG koncentráció (mM) 6,22
aq pKa HMW-HA
3,11
1,55
6,22
3,11 1,55
heparin
Dietilsztilbesztrol
Telmizartán
Glibenklamid
Nifedipin
pKa 1
pKa 2
pKa 1
pKa 2
pKa 3
pKa 1
pKa 2
pKa 1
pKa 1
5,81
8,51
3,5
4,01
5,93
9,6
10,32
5,38
2,33
5,81±
8,72±
3,11±
4,33±
6,01±
9,60±
10,17±
4,93±
3,07±
0,083
0,102
0,096
0,07
0,011
0,101
0,023
0,109
0,096
5,76±
8,72±
3,01±
4,33±
5,94±
9,47±
10,08±
5,08±
3,15±
0,032
0,051
0,052
0,07
0,012
0,057
0,027
0,027
0,107
5,86±
8,84±
3,12±
4,33±
6,01±
9,65±
10,37±
5,06±
3,24±
0,056
0,096
0,07
0,01
0,014
0,181
0,191
0,03
0,091
5,93±
8,92±
3,32±
4,36±
6,01±
9,88±
10,93±
5,40±
3,30±
0,015
0,094
0,015
0,041
0,01
0,075
0,041
0,002
0,031
5,94±
8,99±
3,19±
4,33±
6,02±
9,66±
10,36±
5,25±
3,15±
0,001
0,125
0,004
0,003
0,027
0,003
0,021
0,005
0,08
5,89±
8,94±
3,12±
4,35±
6,01±
9,76±
10,55±
5,17±
3,07±
43
Merkei Viktória
6,22
kondroitin
3,11
1,55
6,22
10E HA
3,11
1,55
6,22
100 E HA
3,11
1,55
2014
0,033
0,16
0,027
0,007
0,007
0,024
0,070
0,071
0,151
5,96±
8,98±
3,13±
4,32±
6,05±
10,50±
5,56±
2,32±
0,022
0,112
0,015
0,03
0,022
9,96± 0,027
0,087
0,021
0,027
5,95±
9,00±
3,11±
4,34±
6,02±
9,80±
10,40±
5,41±
2,34±
0,016
0,092
0,019
0,011
0,004
0,019
0,053
0,035
0,027
5,92±
9,04±
3,09±
4,35±
6,01±
9,70±
10,39±
5,37±
2,38±
0,011
0,091
0,023
0,03
0,02
0,000
0,001
0,01
0,07
5,75±
8,41±
3,07±
4,31±
5,96±
9,21±
9,97±
4,78±
3,41±
0,061
0,036
0,026
0,013
0,005
0,061
0,033
0,141
0,011
5,80±
8,46±
3,00±
4,32±
5,99±
9,56±
10,20±
4,79±
3,46±
0,047
0,048
0,039
0,008
0,002
0,024
0,069
0,15
0,042
5,78±
8,56±
3,10±
4,33±
6,00±
9,56±
10,19±
4,72±
3,44±
0,092
0,072
0,076
0,008
0,017
0,018
0,051
0,136
0,058
5,77±
8,51±
3,05±
4,31±
5,96±
9,44±
10,06±
4,92±
3,35±
0,022
0,052
0,042
0,03
0,01
0,022
0,01
0,127
0,092
5,75±
8,58±
3,04±
4,34±
5,95±
9,44±
10,07±
4,87±
3,36±
0,017
0,065
0,04
0,014
0,005
0,019
0,034
0,148
0,096
5,74±
8,66±
3,00±
4,31±
5,95±
9,43±
10,05±
4,86±
3,36±
0,023
0,043
0,097
0,023
0,008
0,024
0,015
0,148
0,098
4. melléklet hatóanyagok logPe értékei pufferes közegben (donor oldal ph 6,5-fogadó oldal ph7,4) logPe
érték
szórás
Glibenklamid
-4,82
0,054936
Nifedipin
-4,60
0,013744
Telmizartán
-4,46
0,073516
Asztemizol
-5,03
0,051103
5. melléklet hatóanyagok logPe értékei donor oldali GAG összeállítás esetén (első oszlopban a donor oldali összeállítással feltüntetve) 44
Merkei Viktória
2014
Glibenklamid
Nifedipin
Telmizartán
Asztemizol
logPe
érték
szórás
érték
szórás
érték
szórás
érték
szórás
10E HA 1 mg/ml
-5,26
0,099737
-4,70
0,016594
-4,60
0,051775
-5,05
0,108546
10E HA 2,5 mg/ml
-4,70
0,016594
-4,60
0,051775
-5,05
0,108546
-5,27
0,089649
10E HA 5 mg/ml
-4,60
0,051775
-5,05
0,108546
-5,27
0,089649
-4,75
0,005635
100E HA 1 mg/ml
-5,05
0,108546
-5,27
0,089649
-4,75
0,005635
-4,62
0,044164
100E HA 2,5 mg/ml
-5,27
0,089649
-4,75
0,005635
-4,62
0,044164
-4,97
0,094999
100E HA 5 mg/ml
-4,75
0,005635
-4,62
0,044164
-4,97
0,094999
-5,07
0,086014
HMW-HA 1 mg/ml
-4,93
0,012359
-4,70
0,047269
-4,61
0,024476
-5,33
0,080812
HMW-HA 2,5 mg/ml
-4,70
0,047269
-4,61
0,024476
-5,33
0,080812
-4,87
0,024906
HMW-HA 5 mg/ml
-4,61
0,024476
-5,33
0,080812
-4,87
0,024906
-4,70
0,024913
heparin 1 mg/ml
-5,33
0,080812
-4,87
0,024906
-4,70
0,024913
-4,64
0,04482
heparin 2,5 mg/ml
-4,87
0,024906
-4,70
0,024913
-4,64
0,04482
-5,36
0,06672
heparin 5 mg/ml
-4,70
0,024913
-4,64
0,04482
-5,36
0,06672
-4,82
0,025778
kondroitin 1 mg/ml
-4,65
0,036701
-4,50
0,049029
-4,50
0,058522
-5,05
0,063464
kondroitin 2,5 mg/ml
-4,50
0,049029
-4,50
0,058522
-5,05
0,063464
-4,68
0,054748
kondroitin 5 mg/ml
-4,50
0,058522
-5,05
0,063464
-4,68
0,054748
-4,41
0,099935
45
Merkei Viktória
2014
6. melléklet hatóanyagok logPe értékei fogadó oldali GAG összeállítás esetén (első oszlopban a fogadó oldali összeállítás feltüntetve) Glibenklamid
Asztemizol
Telmizartán
Nifedipin
logPe
érték
szórás
érték
szórás
érték
szórás
érték
szórás
10E HA 1 mg/ml
-4,81
0,034072
-4,62
0,016346
-4,53
0,025718
-5,08
0,086762
10E HA 2,5 mg/ml
-4,71
0,001399
-4,66
0,021478
-4,60
0,056099
-5,33
0,053911
10E HA 5 mg/ml
-5,09
0,077874
-4,80
0,048961
-4,70
0,075241
-7,00
0,108546
100E HA 1 mg/ml
-4,59
0,158879
-4,87
0,055247
-4,77
0,032364
-4,94
0,064018
100E HA 2,5 mg/ml
-5,14
0,022494
-4,87
0,036375
-4,73
0,049388
-5,29
0,079584
100E HA 5 mg/ml
-5,12
0,057252
-4,85
0,016841
-4,74
0,0579
-5,23
0,071817
HMW-HA 1 mg/ml
-4,12
0,206843
-4,56
0,022859
-4,43
0,028815
-4,70
0,251302
HMW-HA 2,5 mg/ml
-4,52
0,039769
-4,71
0,067944
-4,77
0,139269
-4,83
0,167458
HMW-HA 5 mg/ml
-4,78
0,02482
-5,03
0,438583
-4,83
0,055321
-4,97
0,261256
heparin 1 mg/ml
-4,57
0,129937
-4,58
0,055275
-4,51
0,101198
-4,71
0,247772
heparin 2,5 mg/ml
-4,36
0,221166
-4,44
0,086786
-4,59
0,034769
-4,63
0,10349
heparin 5 mg/ml
-3,506
-
-3,506
-
-4,37
0,107668
-4,36
0,142498
kondroitin 1 mg/ml
-4,60
0,007356
-4,41
0,082278
-4,31
0,030385
-5,24
0,04648
kondroitin 2,5 mg/ml
-4,38
0,065626
-4,61
0,089503
-4,57
0,056475
-5,37
0,097297
kondroitin 5 mg/ml
-4,72
0,010496
-4,53
0,062777
-4,41
0,05128
-5,52
0,065783
7. melléklet Asztemizol oldhatósága különböző GAG-ok jelenlétében (érték± szórás alakban) GAG koncentráció (mg/ml)
0
1
2,5
5
101,47±12,59 117,09±5,45 121,22±12,38 113,44±11,66 136,25±12,36 176,19±16,24
10E HA 100E HA
heparin
92,37±9,42
145,09±15,52 106,98±10,89 98,11±9,86 86,73±9,12
kondroitin
352,08±6,37
415,31±6,94 485,05±34,66
HMW-HA
122,74±14,66
90,99±8,96
6
A rendszer elérte az egyensúlyi állapotát, ehhez rendeltük a -3,5-ös Pe értéket. Mivel ez egy hozzárendelt érték szórást ez esetben nem definiálhatunk.
46
Merkei Viktória
2014
9. Irodalomjegyzék 1 C. A. Lipinski, Journal of Pharmacological and Toxicological Methods 2000. 44, 235-249. 2 B. Testa, Pharmacokinetic Optimization in Drug Research: Biological, Physicochemical, and Computational Strategies, 2001. Wiley-VCH, Zürich p155-333. 3 E. H. Kerns, L. Di,: Drug-like Properties: Concepts, Structure Design and Methods: from ADME to Toxicity Optimization 2008. Elsevier Inc. p. 6-16. 4 L. Liu, QX, Guo: The driving forces in the inclusion complexation of cyclodextrins 2002 J. Incl. Phenom., 42, p1-14. 5 E.D. Gamsiz, L. Miller, A. G. Thombre, I. Ahmed, R. L. Carrier: Modeling the Influence of Cyclodextrins on Oral Absoprtion of Low-Solubility Drugs 2010 Biotechnology and Bioengineering Vol. 105 No. 2 6 http://unam.bilkent.edu.tr/~uyar/Research.html 7 S. V. Kurkov, T. Loftsson: Cyclodextrins 2013 Int. J. Pharm. 453 p.167-180 8 A. M.ChordiyaK.Senthilkumaran Cyclodextrin In Drug Delivery: A Review 2012 Research Rev. J. Pharm. Pharmac. Sci. Vol. 1.1
9 T. Lotsson, S. B. Vogensen, M. E. Brewster: Effects of Cyclodextrins on Drug Delivery Through Biological Membranes 2007 J. Pharm. Sci. Vol 96. No. 10. 10 K. Hirose: A Practical Guide for the Determination of Biding Constants 2001 J. Inc. Phe. Macro.Chem. 39, 193-209 11 S. Petralito, I. Zanardi, A. Memoli, M. C. Annesini, V. Travelgi: Solubility, spectroscopic properties and photostability of Rhein/cyclodextrin inclusion complex 2009 Spect. Chem. Acta 74 1254-1259 12 Szejtli J.: Ciklodextrinek és zárványkomplexeik a biotechnológiában és a vegyiparban 1990 Magyar Kémikusok Lapja, 45. évfolyam, 35.szám 13 C. Kahle, U.Holzgrabe: Determination of Binding Constants of Cyclodextrin Inclusion Complexes With Amino Acids and Dipeptides by Potentiometric Titration 2004. Chirality 16 509-515 14 Kenneth A. Connors, Binding Constants: The measurement of molecular complex stability. ISBN 0 471-83083-6 1987 Wiley-Interscience; 1th edition pp. 141-161 15 Patent of Vozymes Biopharma DK WO 2013/030348 A1
47
Merkei Viktória
2014
16 F. D. Battistini, J. Flores-Martin, M.E. Olivera, S. Genti-Raimondi, R.H. Manzo: Hyaluronan as drug carrier. The in vitro efficacy and selectivity of Hyaluronan-Doxorubicin complexes to affect the viability of overexpressing CD44 receptor cells 2014 Eur. J. Pharm. 65 p. 122-129 17 http://glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA01/HA01.pdf 18 Nagy A.: Természetes eredetű hialuronátok rheológiai és anilitikai vizsgálata 2012 Szakdolgozat 19 J. E. Scott: Secondary and Tertiary Structures of Hyaluronan in Aqueous Solution. Some Biological Consequences. 1998 Glycoforum /Science of Hyaluronan, 20 M. Slevin, J. Krupinski, S. Kumar, J. Gaffney: Angiogenic oligosaccharides of hyaluronan induce protein tyrosine kinase activity in endothelial cells and activate a cytoplasmic signal transduction pathway resulting in proliferation. 1998 Lab Invest 78 (8) p.987-1003. 21 J. E. Scott: Secondary structures in hyaluronan solution: chemical and biological implications 1989 The biology of hyaluronan. Wiley, Chichester (Ciba Found. Symp. 143.), p.6-20 22 Dr. Balogh György Tibor: Biológiai oxidációk biomimetikus modellezése 2003 Ph. D. értekezés 23 http://www.curiosin.com/Curiosin/What_is_Curiosin/ 24 European Pharmacopoeia 6.0 p. 1525-1526 25 http://www.heparinscience.com 26 Avdeef, A.: Absorption and Drug Development Solubility, Permeability and Charge State 2012 pION, Inc. John Wiley & Sons, p.22-41. 27 Völgyi Gergely: Módszerek fejlesztése vízben rosszul oldódó vegyületek fizikai-kémiai paramétereinek (pKa, logP) meghatározására a gyógyszerkutatás korai fázisában 2007 Ph.D. értekezés 28 A. Avdeef: Absorption and Drug Development Solubility, Permeability and Charge State 2012 pION, Inc. John Wiley & Sons, p.116-246. 29 Müller Judit: Ionos állapotú gyógyszerek transzportfolyamatainak vizsgálata 2010 Tudományos diákköri dolgozat 30 Novák Béla: Sejtbiológia, BME e-jegyzet http://oktatas.ch.bme.hu/oktatas/konyvek/mezgaz/sejtbiol/membran.pdf 48
Merkei Viktória
2014
31 B. Alberts: Essential Cell Biology. 2010 3rd ed., Garland Science, New York - Abingdon 32 D. Schmidt, J. Lynch: MultiScreenTM Permeability Plates, Millipore application note 33M. Kansy, A. Avdeef, H. Fischer: Advances in screening for membrane permeability: high-resolution PAMPA for medicinal chemists 2004 Drug Discovery Today: Technologies, Vol. I. No. 4, 349-355 34 S. Bendels, O. Tsinman, B. Wagner, D. Lipp, I. Parrilla, M. Kansy, and A. Avdeef: PAMPA-Excipient classification Gradient Map 2006 Pharm. Re. Vol. 23 No.11 p2525-2535 35 Faller, B.; Grimm, H. P.; Loeuillet-Ritzler, F.; Arnold, S.; Briand, X.: High-throughput lipofilicity measurment with immobilized artificial membranes 2005 J. Med. Chem., 48, 25712576 36 Wohnsland,F.; Faller, B., High-throughput permability pH profile and high-throughput alkane/water logP with artificial membranes 2001 J. Med. Chem.,44, 923-930 37 Baka Edit: Gyógyszerek oldhatóságának meghatározására alkalmas módszerek vizsgálata és fejlesztése 2010 Ph.D. értekezés 38 A. Avdeef, S. Bendels, O. Tsinman, K. Tsinman, M. Kansy: Solubility-Excipient Classification Gradient Map 2007 Pharm. Res. Vol. 24 No.3. p 532 39 A. Avdeef: Absorption and Drug Development Solubility, Permeability and Charge State 2012 pION, Inc. John Wiley & Sons, p.91-111. 40 A. Avdeef, S. Bendels, O. Tsinman, K. Tsinman, M. Kansy: Solubility-Excipient Classification Gradient Map 2007 Pharm. Res. Vol. 24 No.3. p530-545 41 S. V. Kurkov, T. Loftsson: Cyclodextrins 2013 Int. J. Pharm. 453 p.167-180
49
