Johan Robbens, ILVO 1

Johan Robbens, ILVO

1

Deze eindverhandeling was een examen. De tijdens de verdediging geformuleerde opmerkingen werden niet gecorrigeerd.

2

Woord vooraf In dit woord vooraf wil ik iedereen bedanken die mij gesteund en geholpen heeft tijdens het verloop van mijn stage en het schrijven van dit eindwerk. Allereerst wil ik mijn stagebedrijf zelf bedanken. Dit was het ILVO, het Instituut voor Landbouw- en Visserijonderzoek eenheid dier, visserij, te Oostende. Zij hebben mij de mogelijkheid gegeven om daar stage te lopen en het praktisch deel van dit eindwerk uit te werken. Het was een leerrijke ervaring om deel uit te maken van het onderzoek in verband met biogene amines. Ik wil het volledige personeel van het ILVO bedanken. In het bijzonder wil ik nog een dankwoord richten tot mijn externe promotor mevrouw Daphné Deloof, voor alle hulp die ik heb gekregen en voor alle tijd die ze gestoken heeft in het begeleiden van mijn stage en mijn eindwerk. Ook wil ik de heren Bavo De Witte en Marc Vanryckeghem bedanken om mij op weg te helpen met het nieuwe HPLC-toestel. Ik wil ook zeker de heer Johan Robbens bedanken voor het ter beschikking stellen van de stageplaats en het project waarrond dit eindwerk draait. Op het einde van mijn opleiding als professioneel bachelor in de chemie, wil ik ook alle docenten van het KHBO bedanken die mij de voorbije drie jaar opgeleid hebben en het mogelijk gemaakt hebben dat ik met alle nodige vakkennis kon beginnen aan mijn stage. Van alle docenten wil ik zeker het opleidingshoofd, de heer Luc Scherpereel, bedanken voor het lezen, verbeteren en raadgeven tijdens het schrijven van dit eindwerk. Tenslotte wil ik nog mijn ouders bedanken, die mij gedurende mijn gehele opleiding mentaal en financieel gesteund hebben en voor het vele geduld die ze hebben moeten opbrengen tijdens de examenperiodes.

3

Samenvatting Er is de voorbije jaren een groeiend bewustzijn omtrent voedselveiligheid zowel bij de consument als bij de overheid. Verschillende componenten die aanwezig zijn in onze voeding waarvan vroeger werd gedacht dat ze onschadelijk waren, blijken nu toch schadelijke gevolgen te hebben op onze gezondheid. Dit groeiend bewustzijn is ook deels het gevolg van het feit dat analyses alsmaar nauwkeuriger en uitgebreider worden. Er zijn dan ook nog maar weinig geschikte analysemethoden voor handen om deze componenten op te sporen. Een voorbeeld hiervan zijn de biogene amines die aanwezig zijn in onder andere vis, wijn en kaas. Het best bekende biogeen amine is histamine. Het is ook het enige biogeen amine waarvoor er al normen opgesteld zijn in de wetgeving. Maar naast histamine blijken andere biogene amines zoals putrescine, cadaverine en tyramine ook zeer goede indicatoren te zijn. Bovendien zijn de schadelijke gevolgen op de gezondheid van deze biogene amines nog niet goed gekend. Bij het ILVO is er reeds een methode opgesteld om deze biogene amines op te sporen in een aantal vissoorten. Van deze vissoorten kan er een onderscheid gemaakt worden tussen scombroïde en niet-scombroïde soorten. De scombroïde vissen zijn deze die na het overlijden een hoog gehalte aan histamine bevatten. Tijdens het onderzoek voor dit proefschrift werd gewerkt met niet-scombroïde vissoorten omdat er nood was aan een aminevrije matrix. Het doel van dit onderzoek was om de invloed van het matrixeffect in kaart te brengen tijdens de detectie van biogene amines. De matrix blijkt een effect te hebben op de helling van de ijklijn (Duflos et al. (1999)). Deze stelling werd nader onderzocht. Er werd gekeken naar de invloed van de vissoort, maar ook naar de invloed van het bederf. Hieruit bleek dat de matrix niet op alle onderzochte amines een even groot effect heeft. De draaiing van de ijklijn hangt zelfs af van vissoort tot vissoort. Ook werd bewezen dat er bij het bepalen van onbekende stalen zoveel mogelijk rekening moet worden gehouden met de matrix (met name de vissoort en de versheid).

4

Abstract For the past few years, there has been a growing awareness regarding food safety by both the consumer and the government. Various components that are present in our food, which were previously thought to be harmless, now seem to have harmful effects on our health anyway. Because of this growing awareness, it seems there are few suitable analytical methods at hand to detect these components. Examples of these components are biogenic amines present in foods such as fish, wine and cheese. The most best known biogenic amine is histamine. It is also the only biogenic amine for which there already established standards in the legislation. But in addition to histamine, there are also other biogenic amines (putrescine, cadaverine and putrescine) which seem to be good indicators of food safety as well. At ILVO, a method for detecting these biogenic amines in certain fish species has already been developed. There are two types of fish species: the scombroid-fish and the nonscombroid-fish. The scombroid-fish are fish that contain a lot of histamine. During the research for this thesis, non-scombroid-fish were used since there was a need to work with an amine free matrix. The purpose of this study was to determine the influence of the matrixeffect on the detection of biogenic amines. The matrix appears to have an effect on the slope of the calibration curve (Duflos et al. (1999)). The influence of the species was researched, as well as the influence of the decay of the matrix. This research revealed that the matrix does not have the same effect on each amine. The rotation of the calibration curve depends on the species. The decay of the matrix has also been proved to have an influence on the calibration curve.

5

Inhoudstafel 1.

Situering van het project .......................................................................................................... 13 1.1.

1.1.1.

Versheid ................................................................................................................... 13

1.1.2.

Oorzaken van bederf ................................................................................................ 13

1.1.3.

Factoren die de kwaliteit beïnvloeden ...................................................................... 14

1.2.

2.

Zintuiglijke methode ................................................................................................ 15

1.2.2.

Fysische methode ..................................................................................................... 16

1.2.3.

Chemische methode ................................................................................................. 16

1.2.4.

Microbiologische methode ....................................................................................... 17

Biogene amines ........................................................................................................................ 18 2.1.

Definitie............................................................................................................................ 18

2.2.

Effecten van biogene amines............................................................................................ 18

2.3.

Vorming van biogene amines ........................................................................................... 19

2.4.

Onderzochte biogene amines ........................................................................................... 21

2.4.1.

Putrescine (1,4-butaandiamine) ................................................................................ 21

2.4.2.

Cadaverine (1,5-pentaandiamine) ............................................................................ 21

2.4.3.

Histamine (2-(3H-imidazol-4-yl)ethaanamine) ........................................................ 22

2.4.4.

Tyramine (4-(2-aminoethyl)fenol) ........................................................................... 22

2.4.5.

Spermidine (N-(3-aminopropyl)butaan-1,4-diamine) .............................................. 23

2.4.6.

Spermine (N-N‟-bis(3-aminopropyl)butaan-1,4-diamine) ....................................... 23

2.4.7.

Tryptamine (2-(1H-indool-3-yl)ethaanamine) ......................................................... 24

2.4.8.

2-Fenylethylamine .................................................................................................... 24

Biogene amines in voeding .............................................................................................. 25

2.5.1.

Biogene amines in vis .............................................................................................. 25

2.5.2.

Histamine intoxicatie/Scombroïde intoxicatie ......................................................... 26

2.6.

4.

Het bepalen van de viskwaliteit ....................................................................................... 15

1.2.1.

2.5.

3.

Viskwaliteit ...................................................................................................................... 13

Wetgeving ........................................................................................................................ 27

2.6.1.

België ....................................................................................................................... 27

2.6.2.

De VS en de FDA..................................................................................................... 27

Theoretische achtergrond van de HPLC methode .................................................................... 29 3.1.

Principe van de opwerking ............................................................................................... 29

3.2.

Scheiding op de kolom ..................................................................................................... 31

3.3.

Detectie ............................................................................................................................ 32

Materiaal en methoden ............................................................................................................. 34

6

4.1.

4.1.1.

Monstername ............................................................................................................ 34

4.1.2.

Monstertransport ...................................................................................................... 34

4.1.3.

Monsterbewaring...................................................................................................... 35

4.1.4.

Monstervoorbereiding .............................................................................................. 36

4.2.

Apparatuur................................................................................................................ 38

4.2.2.

Klein materiaal en glaswerk ..................................................................................... 39

4.2.3.

Reagentia .................................................................................................................. 40

4.2.4.

Referentiematerialen ................................................................................................ 40

4.2.5.

Oplossingen .............................................................................................................. 41

Uitvoering HPLC-bepaling .............................................................................................. 42

4.3.1.

Wetenschappelijke publicatie ................................................................................... 42

4.3.2.

Opwerking ................................................................................................................ 43

4.3.3.

Instellingen voor de HPLC/UHPLC......................................................................... 46

Resultaten ................................................................................................................................. 48 5.1.

Bepalen van de retentietijden ........................................................................................... 48

5.1.1.

Beschrijving ............................................................................................................. 48

5.1.2.

Bespreking................................................................................................................ 49

5.2.

Ijklijn zonder matrix ......................................................................................................... 50

5.2.1.

Beschrijving ............................................................................................................. 50

5.2.2.

Bespreking................................................................................................................ 51

5.3.

Ijklijn met matrix.............................................................................................................. 52

5.3.1.

Opzet experimenten.................................................................................................. 52

5.3.2.

Experiment 1: Bewaarproef met schol ..................................................................... 53

5.3.3.

Experiment 2: bewaarproef met wijting ................................................................... 59

5.4.

CRM-bepalingen .............................................................................................................. 62

5.4.1.

Beschrijving ............................................................................................................. 62

5.4.2.

Bespreking................................................................................................................ 63

5.5. 6.

Materialen en reagentia .................................................................................................... 38

4.2.1.

4.3.

5.

Monsterbehandeling ......................................................................................................... 34

Experiment 3: UHPLC ..................................................................................................... 65

Besluit ...................................................................................................................................... 67

Bijlagen ............................................................................................................................................ 68 Bijlage 1: CRM laag bereik.......................................................................................................... 68 Bijlage 2: CRM hoog bereik ........................................................................................................ 69

7

Lijst met illustraties Figuur 1: Algemene structuur amine ............................................................................................... 18 Figuur 2 Vorming van biogene amines ............................................................................................. 20 Figuur 3: Putrescine.......................................................................................................................... 21 Figuur 4: Cadaverine ........................................................................................................................ 21 Figuur 5: Histamine .......................................................................................................................... 22 Figuur 6: Tyramine ........................................................................................................................... 22 Figuur 7: Spermidine ........................................................................................................................ 23 Figuur 8: Spermine ........................................................................................................................... 23 Figuur 9: Tryptamine ........................................................................................................................ 24 Figuur 10: Fenylethylamine .............................................................................................................. 24 Figuur 11 Basisprincipe dansylering ................................................................................................. 29 Figuur 12 Volledig reactiemechanisme dansylering ........................................................................ 30 Figuur 13 Dansylderivaten van de biogene amines ......................................................................... 31 Figuur 14 HPLC toestel (Shimadzu) .................................................................................................. 38 Figuur 15 Matrixeffect bij histamine volgens Duflos et al. (1999) ................................................... 42 Figuur 16 Gradiëntprogramma HPLC ............................................................................................... 46 Figuur 17 Gradiëntprogramma UHPLC............................................................................................. 46 Figuur 18 Chromatogram retentietijden .......................................................................................... 48 Figuur 19 Chromatogram matrixvrije ijklijn ..................................................................................... 50 Figuur 20 Chromatogram uitgebreide ijklijn .................................................................................... 51 Figuur 21 Matrixeffect putrescine dag 0 .......................................................................................... 53 Figuur 22 Matrixeffect histamine dag 0 ........................................................................................... 54 Figuur 23 Matrixeffect spermidine dag 0 ......................................................................................... 54 Figuur 24 Matrixeffect putrescine dag 3 mengstalen ...................................................................... 55 Figuur 25 Matrixeffect putrescine dag 3 individuele stalen ............................................................ 56 Figuur 26 Matrixeffect putrescine dag 7 .......................................................................................... 57 Figuur 27 Matrixeffect cadaverine dag 7 ......................................................................................... 57 Figuur 28 Matrixeffect histamine dag 7 ........................................................................................... 58 Figuur 29 Matrixeffect voor 2-fenylethylamine schol-wijting ......................................................... 59 Figuur 30 Matrixeffect voor histamine schol-wijting ....................................................................... 60 Figuur 31 Matrixeffect wijting voor putrescine dag 3 ...................................................................... 61 Figuur 32 Matrixeffect wijting voor putrescine dag 7 ...................................................................... 62 Figuur 33 Chromatogram BA 100 ppm UHPLC ................................................................................. 66

8

Lijst met tabellen Tabel 1 Factoren die de bederfsnelheid beïnvloeden...................................................................... 14 Tabel 2 Stockoplossingen ................................................................................................................. 41 Tabel 3 Standaardreeks zonder matrix ............................................................................................ 44 Tabel 4 Standaardreeks met matrix ................................................................................................. 45 Tabel 5 Parameters HPLC/UHPLC..................................................................................................... 47 Tabel 6 Retentietijden biogene amines ........................................................................................... 49 Tabel 7 Bewaarproeven ................................................................................................................... 52 Tabel 8 Toegekende waarden CRM's ............................................................................................... 62 Tabel 9 CRM bepaling schol dag 0.................................................................................................... 63 Tabel 10 CRM bepaling wijting dag 0 ............................................................................................... 63 Tabel 11 CRM bepaling schol dag 3.................................................................................................. 64 Tabel 12 CRM bepaling wijting dag 3 ............................................................................................... 64 Tabel 13 CRM bepaling schol dag 7.................................................................................................. 65 Tabel 14 CRM bepaling wijting dag 7 ............................................................................................... 65 Tabel 15 Vergelijking retentietijden HPLC/UHPLC ........................................................................... 66

9

Alfabetische lijst van gebruikte symbolen en afkortingen CAD:

cadaverine

CRM:

Certified Reference Material

DAD/PDA:

diode-array detector/photodiode array

DNS:

dansyl

DNS-Cl:

dansylchloride

FEN:

2-fenylethylamine

HIS:

histamine

MAO-B:

monoamine-oxidase-B

ppm:

parts per million

PUT:

putrescine

S:

individueel staal schol

SM:

mengstaal schol

SPD:

spermidine

SPER:

spermine

TRYP:

tryptamine

TYR:

tyramine

uv:

ultraviolet

WM:

mengstaal wijting

10

Inleiding Vis eten is gezond. Vis is rijk aan eiwitten, vitamine B12 en D en bevat daarenboven ook de vitamines B3 en B6, kalium, fosfor, selenium en jodium. Eén tot twee porties vis per week kan het risico op hart- en vaatziekten bij een gezonde persoon aanzienlijk verlagen. Het is dus heel belangrijk om regelmatig vis te eten. Maar deze vis moet dan ook vers en goed bewaard zijn. Als de vis niet goed bewaard wordt, dan kunnen er zich uit de proteïnen biogene amines vormen ten gevolge van het metabolisme van aanwezige micro-organismen. Een te hoge concentratie van deze biogene amines kan schadelijke effecten hebben op de gezondheid. Tijdens het onderzoek werden de biogene amines eerst kwalitatief bepaald om de retentietijden te weten. Daarna werden er bewaarproeven uitgevoerd met schol en wijting. De invloed van de vissoort en van het bederf op de extractie van de biogene amines werd op deze manier onderzocht. Er werden ook telkens CRM‟s bepaald om de juistheid van de resultaten te controleren. Naar het einde toe werd ook gewerkt met een UHPLC-methode, met als doel de analyses vlugger te doen verlopen en minder solventen te verbuiken.

11

DEEL 1: THEORETISCHE ACHTERGROND

12

1. Situering van het project 1.1.

Viskwaliteit

Bron: (3)

De term “viskwaliteit” is een ruim begrip en omvat verschillende aspecten. De voornaamste hiervan zijn de versheid, hygiënische kwaliteit, biologische conditie, diëtische kwaliteit, commerciële kwaliteit en authenticiteit. De versheid en hygiënische kwaliteit worden vooral bepaald door uitwendige invloeden zoals de visvangst zelf en de manier van behandelen achteraf.

1.1.1. Versheid In dit hoofdstuk zal vooral gekeken worden naar de belangrijkste kwaliteitsparameter, namelijk de versheid. Vis bederft snel en dit kan problemen opleveren tijdens de verwerking en distributie. Het is daarom heel belangrijk om een goede kennis te hebben van de factoren die het bederf veroorzaken. Op die manier kan het bederfproces vertraagd worden en blijft de vis dus langer vers. Met bederf wordt bedoeld het uiteenvallen of degraderen van dood organisch materiaal. Na het afsterven van het organisme begint, onder invloed van bacteriële, enzymatische en oxidatieve werking, de afbraak van eiwitten, extraheerbare stikstofverbindingen, vetten en nucleïnezuurderivaten. De oorzaken van bederf zijn voornamelijk chemisch, biochemisch, fysisch of microbiologisch van aard.

1.1.2. Oorzaken van bederf Bij de chemische oorzaken van bederf hoort onder andere het ranzig worden van vetten. De vetten worden geoxideerd onder invloed van zuurstof en licht. De veranderingen gebeuren dus op moleculair niveau. De biochemische veranderingen tijdens het bederfproces komen tot stand onder invloed van enzymen. Na de dood van de vis krijgen deze enzymen vrij spel en gaan ze ongecontroleerd veranderingen veroorzaken in het weefsel van de vis. Deze vorm van bederf speelt een belangrijke rol bij vis. De spijsverteringsenzymen in de ingewanden

13

tasten het vlees aan en dit vormt op zijn beurt een voedingsbodem voor allerlei bacteriën. Deze bacteriën hoeven zelfs niet van buiten de vis komen, er bevinden zich ook microorganismen in het spijsverteringsstelsel of in de slijmlaag op de huid van de vis. Bacteriën of schimmels zijn ook veroorzakers van bederf. Hier kan het bederf op verschillende manieren gebeuren. De micro-organismen kunnen giftige stoffen afscheiden maar ze kunnen ook gewoon gisting of rotting veroorzaken, afhankelijk van het soort micro-organisme. Rotting bestaat uit het afbreken van eiwitten met de vorming van schadelijke of storende afbraakproducten. Gisting is het proces waarbij grote moleculen worden afgebroken tot kleinere verbindingen in afwezigheid van zuurstof. Bij de fysische oorzaken gebeuren er geen veranderingen op moleculair niveau. Bij deze oorzaken horen voornamelijk uitwendige acties of behandelingen die het weefsel kunnen beschadigen.

1.1.3. Factoren die de kwaliteit beïnvloeden

Er zijn vele factoren die de kwaliteit van de vis kunnen beïnvloeden en waarmee rekening moet worden gehouden indien de vis zo lang mogelijk vers gehouden moet worden. Een eerste factor is de samenstelling en de grootte van de vis en/of vissoort. Dit is natuurlijk een factor die niet kan beïnvloed worden. De invloed van de grootte en samenstelling wordt weergegeven in tabel 1. Tabel 1 Factoren die de bederfsnelheid beïnvloeden

Factoren die de bederfsnelheid beïnvloeden

Relatieve bederfsnelheid Snel

Traag

Grootte

Kleine vis

Grote vis

Zuurtegraad (pH) na de vangst

Hoge

pH Lage pH (zuur)

(basisch) Vetgehalte

Vette vissoorten

Magere vissoorten

Huidkenmerken

Dunne huid

Dikke huid

Vissoort

Kraakbeenvis

Beenvis

14

De temperatuur van het water waarin de vis gevangen wordt speelt ook een rol bij de bederfsnelheid. Als de vis bewaard wordt op ijs zullen koudwatervissen veel sneller bederven dan vissen uit tropische wateren. Dit komt natuurlijk vooral door de bacteriën die op deze vissen leven. De bacteriën op de tropische vissen kunnen wel groeien bij een lage temperatuur (zoals deze van ijs) maar ze moeten zich eerst aanpassen, dit vertraagt het bederfproces. Veruit de belangrijkste factor die de kwaliteit van de vis beïnvloedt, is de bewaartemperatuur. Een te hoge bewaartemperatuur zal ervoor zorgen dat de eiwitten worden afgebroken met de vorming van vluchtige basen die zullen zorgen voor de typische bederfgeur. De ideale bewaartemperatuur is dan ook bij 0 °C (temperatuur op smeltend ijs). Tijdens het koelen wordt er ook gezorgd voor een hoge vochtigheidsgraad en luchtcirculatie. De vis moet op ijs worden gelegd omdat ze anders zou kunnen uitdrogen. Naast de bewaartemperatuur speelt tijd ook een grote rol, met name de tijd tussen het vangen en het koelen. De temperatuur van de vis kan te hoog oplopen en dit kan zorgen voor beschadiging van het weefsel. Ook de invriestijd en dus de invriessnelheid is van belang. Als het invriezen te traag gebeurt dan zullen zich grote ijskristallen vormen tussen de cellen. De cellen worden kapotgeprikt en het weefsel wordt beschadigd. De kapotgeprikte cellen zullen water verliezen bij het ontdooien waardoor de vis uitgedroogd zal zijn.

1.2. Het bepalen van de viskwaliteit

Bron: (3)

Voor het bepalen van de viskwaliteit zijn er veel verschillende methoden voorhanden. 1.2.1. Zintuiglijke methode

De sensorische beoordeling van de viskwaliteit gebeurt door middel van de KwaliteitsIndexMethode (KIM). Een aantal uitwendige kenmerken (huid, ogen, slijm, kieuwen, insnijding, textuur en smaak) van de vis worden beoordeeld om de versheid te beoordelen. De KIM-score stijgt lineair met de toenemende bewaarduur op ijs.

15

1.2.2. Fysische methode

1.2.2.1.

pH-metingen

De viskwaliteit kan ook bepaald worden door het meten van de zuurtegraad. Naarmate de vis meer bederft, zullen er basen (vb. ammoniak) gevormd worden. Hierdoor zal de pH van de vis stijgen. Bij het begin van de lijkstijfheid zal de pH, afhankelijk van vis tot vis, 5,6 – 6,9 bedragen.

1.2.2.2.

Meting ‘vrije watergehalte’

Tijdens het bewaren van vis op ijs gaan de eiwitten in het spierweefsel denatureren. Dit zorgt ervoor dat de eiwitten hun eigenschap om water vast te houden verliezen. Door middel van diëlektrische spectroscopie kan het vrije watergehalte gemeten worden in het weefsel en kan dus de versheid van de vis bepaald worden. 1.2.3. Chemische methode

Eén van de meest gebruikte chemische parameters voor het bepalen van de viskwaliteit is de TVB (Totale Vluchtige Basen). Bij deze methode worden TMA (trimethylamine), DMA (dimethylamine) en ammoniak bepaald. De meest gebruikte methode is stoomdestillatie van de vluchtige amines. Ammoniak wordt gevormd bij de bacteriële degradatie van proteïnen, peptiden en aminozuren. Het wordt ook gevormd bij de autolytische afbraak van adenosine monofosfaat (AMP). TMA is een vluchtig amine dat vaak wordt geassocieerd met de typische visgeur van bedorven vis. Het wordt gevormd door bacteriële reductie van trimethylamine oxide (TMAO). De grootste veroorzaker van deze reductie is Photobacterium phosphoreum en in mindere mate Shewanella putrefaciens.

16

In aanwezigheid van TMAO dimethylase splitst TMAO in gelijke hoeveelheden DMA en formaldehyde. DMA wordt gevormd tijdens het bewaren in de diepvries. 1.2.4. Microbiologische methode

Al naargelang de omstandigheden (temperatuur, atmosfeer, zoutgehaltes, bewaarmiddelen) waarin de vis wordt bewaard kunnen sommige bacteriën sneller groeien dan andere. Deze bacteriën produceren de stoffen die verantwoordelijk zijn voor het bederf. Door een combinatie te maken van het aantal aanwezige bacteriën en de concentratie van hun afbraakproducten kan er op een objectieve manier bepaald worden wanneer de vis niet meer geschikt is voor consumptie. Het aantal aanwezige bacteriën kan bepaald worden door middel van de plaattechniek, directe microscopische telling of door het bepalen van de chemische activiteit van de bacteriën. Er bestaat echter geen consensus omtrent het gebruiken van microbiologie voor het bepalen van de viskwaliteit. De overheersende bacteriën zijn niet altijd dezelfde, ze zijn namelijk

afhankelijk

van

vele

verschillende

factoren

(vissoort,

samenstelling,

bewaartemperatuur, deel van de vis,...). Daarom wordt er meer en meer gekeken naar de biogene amines in het weefsel. De biogene amines worden gevormd ten gevolge van bacteriële activiteit en zijn betrouwbaarder dan het bepalen van de bacteriën. De reden hiervoor is het feit dat biogene amines afbraakproducten zijn van proteïnen aanwezig in het weefsel, het zal dus steeds over dezelfde biogene amines gaan, onafhankelijk van de soort overheersende bacteriën.

17

2. Biogene amines 2.1. Definitie Bron (14) (26) (13) Biogene amines zijn basische, stikstofbevattende verbindingen die hoofdzakelijk gevormd worden door decarboxylatie van aminozuren of door aminering en transaminering van aldehyden en ketonen. Biogene amines worden gevormd in het metabolisme van bacteriën, planten en dieren. De chemische structuur kan alifatisch (putrescine, cadaverine,

Figuur 1: Algemene structuur amine

spermine, spermidine), aromatisch (tyramine, 2-fenylethylamine) of heterocyclisch (histamine, tryptamine) zijn. Dit onderzoek focust zich vooral op de biogene amines die voorkomen in vis, maar ze zijn ook terug te vinden in vlees, wijn, kaas en gefermenteerde voeding. De aanwezigheid van deze amines zijn een indicator voor bederf. De toxiciteit en effecten van biogene amines wordt verder besproken. (Zie 2.4. Onderzochte biogene amines, 2.5. Biogene amines in voeding)

2.2. Effecten van biogene amines Bron: (13) Biogene amines zijn bronnen van stikstof en precursors voor de synthese van onder andere hormonen, nucleïnezuren en proteïnen. Ze kunnen ook invloed hebben op het regelen van de lichaamstemperatuur, de inname van voedsel en het stijgen of dalen van de bloeddruk. Polyamines (organische componenten met twee of meer aminogroepen) zijn belangrijk bij de groei, vernieuwing en het metabolisme van elk orgaan in het lichaam. Door deze verschillende functies is er dus een grote behoefte aan polyamines in snelgroeiend weefsel. Behalve deze nuttige functies, zijn biogene amines verantwoordelijk voor een aantal schadelijke effecten. Zo is het belang van putrescine, spermidine en spermine goed gekend bij het ontwikkelen van een tumor. Biogene amines zijn potentiële precursors voor de vorming van de carcinogene N-nitroso verbindingen. Secundaire amines (zoals spermidine en spermine) kunnen nitrosamines vormen door reactie met nitriet. Tertiaire amines vormen dan weer een gamma aan N-nitroso producten. In vet voedsel wordt, bij hoge

18

temperatuur en in aanwezigheid van water, het carcinogene N-nitrosopyrrolidine gevormd uit putrescine en spermidine. In planten zijn putrescine, spermidine en spermine betrokken bij celdeling, bloei, vruchtvorming, respons op stress en veroudering.

2.3. Vorming van biogene amines Bron: (13) Bepaalde soorten bacteriën zoals Pseudomonas, Photobacterium en melkzuurbacteriën zoals Streptococcus, zijn in staat om één of meerdere aminozuren te decarboxyleren. Het decarboxylatieproces kan enkel doorgaan onder volgende omstandigheden: -

Er moet een vrij aminozuur ter beschikking zijn.

-

Er moeten decarboxylase-positieve micro-organismen aanwezig zijn.

-

Dit moet gebeuren onder omstandigheden die microbiële groei, decarboxylase synthese en decarboxylase activiteit toelaten.

Vrije aminozuren komen ofwel voor in de voeding of kunnen gevormd worden door middel van proteolyse (afbraak van eiwitten door middel van enzymes). Verwijderen van de α-carboxylgroep van aminozuren leidt tot het overeenkomstig biogene amine. De namen van de meeste biogene amines komen dan ook heel goed overeen met deze van het aminozuur. Zo wordt histamine bijvoorbeeld gevormd uit het aminozuur histidine, tyramine uit tyrosine en tryptamine uit tryptofaan. In planten en sommige microorganismen kan putrescine gevormd worden uit arginine via agmatine. Lysine wordt gedecarboxyleerd, met behulp van lysine decarboxylase, tot cadaverine. De aminozuur decarboxylasen zijn het meest actief in een zuur milieu, met een pH optimum tussen 4,0 en 5,5. Bacteriën vormen ook meer enzymes in zuur milieu om zichzelf in stand te kunnen houden. De aanwezigheid van koolhydraten zoals D-glucose stimuleert zowel de groei als de activiteit van de aminozuur decarboxylases in bacteriën. De optimale hoeveelheid D-glucose ligt tussen de 0,5-2,0 %. Bij hoeveelheden groter dan 3,0 % wordt de vorming van enzymes geremd.

19

Vervolgens lijkt zuurstof ook een invloed te hebben op de synthese van biogene amines. Omstandigheden die zorgen voor een verminderde redoxpotentiaal stimuleren histamine productie en de werking van histidine decarboxylase lijkt te worden stopgezet bij aanwezigheid van zuurstof. Aanwezigheid van NaCl activeert tyrosine decarboxylase en remt de werking van histidine decarboxylase. NaNO2 activeert eveneens tyrosine decarboxylase.

Figuur 2 Vorming van biogene amines

20

2.4. Onderzochte biogene amines Bron (4) 2.4.1. Putrescine (1,4-butaandiamine) Bron: (22)

Figuur 3: Putrescine

Putrescine komt, net als cadaverine, voor in rottend dierlijk weefsel. Het heeft een sterke, indringende geur en draagt dus bij tot de geur van rotte vis. Putrescine ontstaat door decarboxylatie van ornithine, maar kan ook gevormd worden uit arginine via agmatine.

2.4.2. Cadaverine (1,5-pentaandiamine)

Figuur 4: Cadaverine

Cadaverine lijkt qua structuur en eigenschappen op putrescine. De keten bevat één CH2groep meer. Deze stof ontstaat door de decarboxylatie van lysine.

21

2.4.3. Histamine (2-(3H-imidazol-4-yl)ethaanamine) Bron: (1) (8) (20)

Figuur 5: Histamine

Histamine

is

waarschijnlijk

het

best

gekende

biogene

amine.

Zoals te zien is op de figuur, is histamine een heterocyclisch primair amine. Het wordt gevormd uit het aminozuur histidine met behulp van het enzyme histidine decarboxylase. De ziekte ten gevolge van inname van te hoge hoeveelheid histamine uit vis staat gekend als Scombroïdintoxicatie. Typische scombroïde vissoorten zijn: tonijn, makreel, sardienen. De EU-norm voor histamine in vis is 100 ppm in rauwe vis en 200 ppm in gezouten vis. 1 % van de bevolking leidt aan histamine intolerantie, bij deze mensen is 5 mg reeds genoeg om symptomen te veroorzaken.

2.4.4. Tyramine (4-(2-aminoethyl)fenol) Bron: (17)

Figuur 6: Tyramine

Tyramine is een biogeen amine dat veel voorkomt in gefermenteerde voeding zoals kaas, wijn en vis. Het ontstaat uit het aminozuur tyrosine, dat meestal van nature aanwezig is. Tyramine kan verschillende effecten hebben op het menselijk lichaam. Zo kan het bij sommige mensen, die overgevoelig zijn voor deze stof, een stekende hoofdpijn veroorzaken. Dit staat ook wel bekend als het „Kaas-syndroom‟.

22

Verder zou tyramine ook een invloed hebben op depressie, hoewel nog niet gekend is of het een depressie zou tegengaan of juist stimuleren. Tyramine zorgt er verder ook nog voor dat adrenaline en noradrenaline vrijkomen in de zenuwuiteinden van het zenuwstelsel.

2.4.5. Spermidine (N-(3-aminopropyl)butaan-1,4-diamine) Bron: (16)

Figuur 7: Spermidine

Spermidine wordt gevormd uit putrescine en dient ook als precursor voor de vorming van spermine. Onderzoek heeft uitgewezen dat een verhoogde inname van spermidine veroudering tegengaat of kan tegengaan.

2.4.6. Spermine (N-N’-bis(3-aminopropyl)butaan-1,4-diamine) Bron: (9)

Figuur 8: Spermine

Spermine wordt gevormd uit het hoger besproken spermidine. Het wordt teruggevonden in vele organismen en weefsels. Spermine zou ook de helix-structuur van nucleïnezuren stabiliseren.

23

2.4.7. Tryptamine (2-(1H-indool-3-yl)ethaanamine) Bron: (15) (20) Tryptamine is het decarboxylatieproduct van het aminozuur tryptofaan. Het komt voor in planten en bepaalde voedingsmiddelen zoals kaas en vis. Tryptamine werkt in op de serotoninereceptoren. Deze stof veroorzaakt hierbij verschillende symptomen zoals verhoogde hartslag, Figuur 9: Tryptamine

versnelde

ademhaling,

pupilverwijding

en

zelfs

hallucinaties.

2.4.8. 2-Fenylethylamine Bron: (24) (25)

Figuur 10: Fenylethylamine

2-Fenylethylamine is een decarboxylatieproduct van het aminozuur fenylalanine. Het is een biogeen amine dat wordt teruggevonden in chocolade, kaas en rode wijn.

24

2.5. Biogene amines in voeding Bron: (12) Biogene amines komen in veel voedingsmiddelen voor. Ze ontstaan tijdens de verwerking, de rijping (gisting, fermentatie) en de opslag. Vooral in eiwitrijk voedsel, zoals vis, kunnen veel biogene amines gevormd worden. In normale omstandigheden vormen biogene amines in voeding geen groot gevaar. Het lichaam kan namelijk zelf biogene amines aanmaken en afbreken. Op die manier wordt opname van biogene amines van buitenaf gecompenseerd. Bij te grote hoeveelheden of bij overgevoeligheid wordt dit mechanisme echter verstoord en ontstaan er diverse klachten. Dergelijke klachten worden in de medische wereld pseudo-allergische reacties (PAR‟s) genoemd. Op die manier wordt een onderscheid gemaakt met de echte allergische reacties. Het verschil tussen de twee ligt in het feit dat bij echte allergische reacties steeds het immuunsysteem betrokken is. Bij de PAR‟s is er sprake van een overgevoeligheidsreactie. Als een persoon bijvoorbeeld overgevoelig is voor histamine, dan raakt het lichaam bij opname van histamine uit balans. 2.5.1. Biogene amines in vis Bron: (21) Biogene amines worden in zeer lage concentraties teruggevonden in verse vis. Welke amines en in welke concentratie ze voorkomen hangt af van soort tot soort. Zo bevatten bijvoorbeeld de makreelachtigen (Scombridae) hogere concentraties aan histamine dan andere vissoorten. De vorming van biogene amines wordt veroorzaakt door bepaalde bacteriën die zich meteen na de dood, door het wegvallen van het afweersysteem, in de vis gaan ontwikkelen. De bacteriën in de vis veroorzaken een afbraak van het spierweefsel. Dit gebeurt vooral wanneer vissen die behoren tot de familie van de Scombridae niet goed bewaard worden. In de loop van de jaren zijn er veel onderzoeken geweest om deze componenten te kunnen gebruiken als indicator voor bederf. Zo werd cadaverine al door verschillende onderzoekers voorgesteld als dergelijke indicator. Een ander voorstel kwam van Mietz en Karmas (1978). Zij gebruikten de verhouding tussen de som van histamine, putrescine en cadaverine enerzijds en de som van spermine en spermidine anderzijds.

25

Een derde manier uit 1997 is de hoeveelheid histamine, tyramine, cadaverine en putrescine als bederfindicator voor tonijn in blik. Het blijkt ook zeer moeilijk te zijn om een exacte toxiciteitsdrempel van biogene amines in de mens vast te leggen. Dit hangt namelijk af van persoon tot persoon. Histamine is het enige biogene amine waarvoor een wettelijke maximumgrens is vastgelegd in vis. Dit wordt verder besproken.

2.5.2. Histamine intoxicatie/Scombroïde intoxicatie Bron: (1) (11) Histamine intoxicatie wordt veroorzaakt door voedsel, meestal bepaalde soorten vis en kaas, die een hoog gehalte aan histamine bevatten. Bedorven vis uit de familie van de makreelachtigen (Scombridae) en de makreelgepen (Scomberesocidae) zijn meestal de oorzaak bij gevallen van histamine-intoxicatie. De eerste symptomen manifesteren zich meestal binnen het uur. De meest voorkomende symptomen zijn: bloedstuwing naar het hoofd en een gevoel van extreme hitte in het hoofd en de nek. Andere symptomen zijn: hoofdpijn, gevoelloosheid in handen en voeten, duizeligheid, hartkloppingen, heftige uitbarsting van kriebel, brandend gevoel in de mond en slikproblemen. De boosdoener bij histamine-intoxicatie blijkt echter niet enkel histamine te zijn. Dit werd opgemerkt nadat mensen die zuivere histamine in grotere hoeveelheden innamen praktisch geen ziektebeeld vertoonden. Er zitten dus nog andere stoffen in het visweefsel die bijdragen tot deze ziekte. De werkelijke oorzaak ligt dus in de combinatie van verschillende biogene amines samen. De amines in kwestie zijn waarschijnlijk: spermine, spermidine, tryptamine, 2-fenylethylamine, cadaverine, putrescine en tyramine. Uit sommige artikels blijkt dat vooral putrescine en cadaverine hiervoor medeverantwoordelijk zijn, maar andere artikels vermelden dan weer spermidine en spermine. Er is dus nog geen eenduidig antwoord gevonden op de vraag wat nu juist deze histamine intoxicatie veroorzaakt.

26

2.6. Wetgeving Bron: (6) (2) Van alle biogene amines zijn er enkel wettelijke bepalingen vastgelegd voor het histaminegehalte in vis. Hieronder wordt de regelgeving voor België en de Verenigde Staten besproken.

2.6.1. België

Uit het ministrieel besluit betreffende de chemische controles wat histamine in vis betreft (24 mei 2000) blijkt: -Artikel 1: Voor de controle van het gehalte aan histamine in vis worden per partij negen monsters genomen

-Artikel 2: Voor vis behorende tot de families Scombridae, Clupeidae, Engraulidae en Coryphaenidea, gelden de volgende grenswaarden:  Het gemiddelde gehalte mag niet hoger zijn dan 100 ppm;  Bij ten hoogste twee monsters mag het gehalte meer dan 100 ppm, doch niet meer dan 200 ppm bedragen;  Bij geen enkel monster mag het gehalte meer dan 200 ppm bedragen.

2.6.2. De VS en de FDA

In september 1982 zette de US Food and Drug Administration (FDA) de bovengrens voor histamine in vis op 200 ppm. In 1995 werd deze grens verlaagd naar 50 ppm. De reden voor deze verlaging was dat de concentratie aan histamine sterk kan verschillen in verschillende delen van de vis. Als een staal 50 ppm histamine bevat, kan het evengoed zijn dat een ander staal genoeg bevatte om ziekte te veroorzaken. Ook in 1995, voerde de FDA nieuwe veiligheidsregulaties in gebaseerd op de Hazard Analysis Critical Control Points (HACCP)-aanpak.

27

HACCP is gebaseerd op 7 principes. Deze principes moeten het risico op schade aan de gezondheid controleren door bovengrenzen op te leggen voor de verschillende schadelijke stoffen. De dosissen worden opgevolgd en geregistreerd. Bij vissoorten die vatbaar zijn voor histaminevorming stelt de FDA 3 belangrijke punten voor waar de controles moeten worden uitgevoerd. Deze punten zijn: 1. Ontvangst bij de primaire verwerking (inclusief de eerste ontvanger); 2. Ontvangst bij de secundaire verwerking; 3. Tijdens het verwerken (inclusief opslag) De limieten voorgesteld bij de primaire verwerking zijn afhankelijk van de temperatuur van het water bij vangst, de grootte van de vis en de vissoort. Dit punt werd reeds besproken onder het deel viskwaliteit. Bij de aankomst bij de secundaire verwerker, moet ofwel een bewijs kunnen voorgelegd worden dat de vis werd bewaard bij een temperatuur lager dan 4,4 °C tijdens transport, ofwel moet er aangetoond worden dat er voldoende koeling aanwezig is op het moment van de levering. De regels voor verwerking zijn afhankelijk van het feit of de vis al dan niet ingevroren is geweest. Als de vis nog nooit werd ingevroren, mag deze niet langer dan 8 uur blootgesteld worden aan temperaturen hoger dan 4,4 °C. Als op gelijk welk punt in de verwerking, de vis werd blootgesteld aan temperaturen hoger dan 21 °C zakt deze tijd naar 4 uur. Als de vis werd ingevroren, mag deze maximum 24 uur worden blootgesteld aan temperaturen hoger dan 4,4 °C. Deze tijd daalt dan weer onmiddellijk naar 12 uur als er temperaturen waren hoger dan 21 °C.

28

3. Theoretische achtergrond van de HPLC methode

Om biogene amines te kunnen bepalen moeten deze eerst een zeker proces doorlopen. Ze moeten gedansyleerd worden, anders kunnen ze niet gedetecteerd worden met de uvdetector. In dit deel worden de verschillende stappen van de dansylering nader toegelicht. Daarna wordt een verklaring gezocht voor de elutievolgorde van de biogene amines. En tenslotte wordt de detectie zelf nog kort uitgelegd.

3.1. Principe van de opwerking

Tijdens de opwerking van zowel de standaarden als de stalen doorlopen de te bepalen amines verschillende stappen. Er wordt eerst perchloorzuur (HClO4) toegevoegd aan het staal. Dit perchloorzuur zorgt voor de extractie van de vrije amines naar de vloeibare fase. Na centrifugatie bevinden de amines zich dan in het supernatans. De volgende stap is de dansylering. Dit zorgt ervoor dat de biogene amines kunnen gedetecteerd worden met uv-detectie. De dansylering is gebaseerd op de Schotten-Baumann-reactie.

Figuur 11 Basisprincipe dansylering

Dansylering wordt meestal niet toegepast in combinatie met uv-detectie, maar in combinatie met een fluorescentie-detectie.

29

Er wordt ook vaak gekozen voor derivatisering op basis van benzoylchloride, dit zou zorgen voor een snellere elutie van de amines, maar het garandeert wel geen betere scheiding. Tijdens dit praktisch deel wordt er dus dansylchloride toegevoegd aan het staal. De dansylering gebeurt in het donker in een warmwaterbad bij 60 °C gedurende 5 minuten. De dansylering moet gebeuren in alkalisch milieu. Daarom wordt er Na2CO3 toegevoegd aan het staal. Het volledig dansyleringsmechanisme ziet er als volgt uit:

Figuur 12 Volledig reactiemechanisme dansylering

Via een nucleofiele substitutie tussen dansylchloride en de eindstandige aminogroep van het

amine

ontstaat

er

een

sulfonamide

met

afgifte

van

één

proton.

Vervolgens reageert dit vrije proton met een nog niet gereageerd amine. Dit amine kan hierdoor niet meer reageren met dansylchloride. Als de amines niet kwantitatief reageren met het dansylchloride, kan er bijgevolg ook geen betrouwbare meting worden uitgevoerd. Om dit probleem op te lossen, wordt een verzadigde Na2CO3-oplossing aan het mengsel toegevoegd. Dit Na2CO3 doet dan dienst als acceptor voor de vrijgekomen protonen. Het reactiemengsel bestaat uit twee fasen, een waterige en een organische fase. De gevormde derivaten bevinden zich uiteraard in de organische fase. Het gevormde zuur (reactie Na2CO3 met proton) wordt geneutraliseerd in de waterige fase. Na vijf minuten reactie in het donker, wordt er 100 µL L-proline toegevoegd en wordt het reactiemengel 15 minuten in het donker geplaatst op kamertemperatuur. De functie van het L-proline is de overmaat dansylchloride te laten weg reageren.

30

Het tolueen wordt aan het mengsel toegevoegd om de scheiding tussen organische en waterige laag te verbeteren. Alle gedansyleerde amines bevinden zich nu in de organische laag en alle aminozuren in de waterige laag. De organische laag wordt daarna afgenomen en uitgedampt met behulp van stikstofgas. Tenslotte wordt het gedroogde product opgelost in acetonitril.

3.2. Scheiding op de kolom Bron: (19) De scheiding op de kolom gebeurt op basis van de polariteit van de gedansyleerde biogene amines. Aangezien alle derivaten een dansylgroep bevatten, zal de elutievolgorde vooral bepaald worden door de ketens afkomstig van de biogene amines. In onderstaande tabel wordt nogmaals een overzicht getoond van alle onderzochte biogene amines:

Figuur 13 Dansylderivaten van de biogene amines

31

Uit de acht verschillende structuren kunnen de twee uiterste gedansyleerde biogene amines qua polariteit er meteen uitgehaald worden. De meest apolaire is spermine, met de lange Cketen. De meest polaire structuur is tryptamine of tyramine. In het praktisch deel wordt er gewerkt met een Reversed-Phase HPLC (RP-HPLC) C18-kolom, dat wil zeggen dat het meest polaire amine waarschijnlijk als eerste zal elueren. Op het uiteindelijke chromatogram is het tryptamine die het eerst verschijnt. Tyramine elueert op het einde voor spermidine en spermine. Spermine elueert zoals verwacht als laatste en spermidine verlaat de kolom als voorlaatste.

3.3. Detectie Bron: (19) Voor de detectie van de dansylderivaten wordt gebruik gemaakt van een PDA-detector, een photodiode array-detector. Een PDA-detector registreert continu spectra over het complete bereik van de detector. De gebruikte lichtbron is een deuterium-lamp en zorgt voor een hoge gevoeligheid bij het opmeten van een chromatogram. Daarnaast worden ook absorptiespectra geregistreerd van elke piek tussen 190 nm en 700 nm. Zoals eerder al werd vermeld, is een uv-detector en zelfs een PDA niet erg gevoelig voor het detecteren van biogene amines. Daarom werden de biogene amines gederivatiseerd met dansylchloride. De aromatische structuren in de dansylderivaten zorgen voor een gevoelige absorptie in het uv-gebied.

32

DEEL 2: PRAKTIJK

33

4. Materiaal en methoden

4.1. Monsterbehandeling 4.1.1. Monstername

De vismonsters werden genomen aan boord van 2 verschillende schepen. Een eerste batch wijting- en scholstalen werd tijdens de Belgicacampagne genomen. De Belgica is een Belgisch onderzoeksschip. De batch scholstalen afkomstig van de Belgica was niet zo groot. Deze vissen konden dus enkel worden gebruikt om pretesten uit te voeren. De tweede batch scholstalen werd genomen aan boord van het commercieel kustvissersvaartuig N.95 uit Nieuwpoort. De vis werd gevangen met de staande nettenmethode.

4.1.2. Monstertransport

De Belgica maakte een zeereis van 5 dagen. De vismonsters werden gegut (de ingewanden verwijderd) en bewaard in de diepvries. De vismonsters van het commercieel schip N.95 werden getransporteerd op smeltend ijs (bij 0°C). Deze monsters waren bij aankomst nog in rigor (lijkstijf). Deze lijkstijfheid treedt op enkele uren na de dood van de vis en kan enkele dagen duren (afhankelijk van soort, temperatuur, sterfwijze, ...).

34

4.1.3. Monsterbewaring

Een deel van de vismonsters van het commercieel schip N.95 werd meteen gefileerd, gemixt en daarna verdeeld in falcontubes per exact 5 g. De falcontubes werden in de diepvries bewaard om verder bederf te voorkomen. Deze tubes dienden dan als aminevrije matrix om later ijklijnen in op te werken. De monsters van de Belgica werden na het vangen meteen ingevroren. Bij ontvangst werden ze meteen in de diepvries geplaatst, op deze manier werd de koude keten niet verbroken.

35

4.1.4. Monstervoorbereiding Allereerst wordt de vis gefileerd omdat de filet uiteindelijk datgene is wat gebruikt wordt voor consumptie. 4.1.4.1.

Schol

Schol is een platvis en wordt als volgt gefileerd:

1.

Er wordt een insnijding gemaakt langs de

2.

middengraat.

3.

Het visweefsel wordt zo dicht mogelijk tegen de graten weggesneden.

Het visweefsel wordt van het vel

4.

De filet is volledig verwijderd.

6.

De filets worden gemixt met de ultra-turrax.

losgesneden.

5.

De 4 filets worden vervolgens verzameld in een beker.

Na het homogeniseren wordt het visweefsel per exact 5 g verdeeld in falcontubes.

36

4.1.4.2.

Wijting

Wijting is een rondvis en wordt dus bijgevolg ook op een andere manier gefileerd.

1. Plaats het mes tegen de graat 2. Snij het visweefsel langs de graat weg

3. Snij tot aan de staart

4. Snij het vel weg eenmaal de filet van de rest van de vis is gesneden

De twee filets worden vervolgens in een beker geplaatst en vervolgens gemixt.

37

4.2. Materialen en reagentia

4.2.1. Apparatuur Het toestel dat gebruikt werd, was een UHPLC-toestel van Shimadzu. Het toestel werd gebruikt als klassieke HPLC. Voor de verwerking van de resultaten werd de software LabSolutions (Shimadzu) gebruikt. Solventreservoirs (water en acetonitril) LC-30AD

Controller: CBM-20A Ontgasser: DGU-20A uv-detector (Diode Array): SPD-M30A Pomp

Kolomoven: CTO-20AC

Autosampler: SIL-30AC Figuur 14 HPLC toestel (Shimadzu)

38

4.2.2. Klein materiaal en glaswerk



Maatcilinder 250 mL, 50 mL, 100 mL, 10 mL



Duranfles 1 L



Duranfles 50 mL



Duranfles 250 mL



Duranfles 25 mL



Analytische balans, Sartorius



Bovenweger, Mettler Toledo PB3002 Delta Range



PP-maatkolven 50 mL



Micropipetten 1 mL, 100 µL, 10 mL, Rainin



Micropipettips 1 mL, 100 µL, 10 mL



Reacti-Vap Evaporator (9-port) met Replacement Tube Kit (naalden en plugs), ref. 18780, Pierce, Perbio



Steriele naalden, ref. B4933A, Fisher Scientific



Plastieken spuiten, ref. B1644C, Fisher Scientific



Minisart RC4 0.20 µm filters, ref. 17821Q, Sartorius



Cultuurbuisjes met schroefdop, ref. K251.1, Fiers



PP vials, transparent conical insert, ref. 548-0440, VWR



Vial deksels, PP blue, Silicone white/PTFE red, ref. 548-0085, VWR



Kromasil 100-5C18 (250x4,6 mm) Serial No. E79319



UHPLC Kolom: XBridge™ BEH CHP 2,5µm (2,1x150 mm)



Prekolom, A0470MG, Varian



Centrifuge 3-18K, Sigma



Falcontubes 50 mL, ref. AN 76-1, Roth



Vortex, Retsch, MIX TM01



Warmwaterbad

39

4.2.3. Reagentia



Putrescine dihydrochloride, ref. P7505-25G (Sigma)



Cadaverine dihydrochloride, ref. C8561-5G (Sigma)



Histamine dihydrochloride, ref. H7250-5G (Sigma)



Tyramine hydrochloride, ref. T2879-5G (Sigma)



Spermidine trihydrochloride, ref. 85578-5G (Sigma)



Spermine tetrahydrochloride, ref. 85607-5G (Sigma)



Tryptamine hydrochloride, ref. 93650 (Sigma)



2-fenylethylamine, ref. P7513-25G (Sigma)



1,7-diaminoheptaan dihydrochloride, ref. D17408-5G (Sigma)



Perchloorzuur standaardoplossing 1.0 M, ref. 34288-1L-R (Sigma)



Tolueen, ref. 244511 (Sigma)



Aceton, ref. 01032602 (Biosolve)



Natriumcarbonaat, ref. S7795-500G (Sigma)



Acetonitril, ref. 01204102 (Biosolve)



Dansylchloride, ref. 39220-5G (Sigma)



L-proline, ref. 81709 (Sigma)



HPLC water, ref 23214125 (Biosolve)

4.2.4. Referentiematerialen

Er werden twee gecertificeerde referentiematerialen (CRM) gebruikt met een gekende hoeveelheid aan histamine. Deze referentiematerialen werden aangekocht bij Fapas. Fapas staat voor Food Analysis Performance Assessment Scheme en houdt zich bezig met het organiseren van ringtesten en verdelen van de daaruit ontstane referentiematerialen. Aan een ringtest nemen verschillende labo‟s deel. De stalen worden bij Fapas gehomogeniseerd en verdeeld, waarna deze worden opgestuurd naar de deelnemende labo‟s. Elk labo voert de analyses uit volgens hun eigen methode en uit de resultaten wordt dan een toegekende waarde en afwijking opgesteld.

40

Het referentiemateriaal met laag bereik heeft een concentratie van (26,7 ± 5,2) mg/kg. Het referentiemateriaal met hoog bereik heeft een concentratie van (192,6 ± 28) mg/kg. (zie bijlagen 1 en 2) 4.2.5. Oplossingen



Stockoplossingen biogene amines 10 000 ppm Bereid de stockoplossingen voor in PP-maatkolven van 50 mL en breng ze daarna over in een falcontube. Bewaar de oplossingen bij -18 °C.

Tabel 2 Stockoplossingen

Theoretische massa voor 10 000 ppm (mg)



Putrescine.2HCl

913,6

Cadaverine.2HCl

856,8

Histamine.2HCl

828,0

Tyramine.HCl

632,9

Spermidine.3HCl

876,5

Spermine.4HCl

860,4

Tryptamine.HCl

613,8

2-fenylethylamine

930,4

HClO4 0.2 mol/L Neem met een maatcilinder van 250 mL, 200 mL HClO4 1 mol/L en breng over in een Duranfles van 1 L, voeg 800 mL HPLC water toe.



Dansylchloride-oplossing 7.5 mg/mL Weeg 187.5 mg dansylchloride af. Breng over in Duranfles van 50 mL en voeg met maatcilinder van 50 mL, 25 mL aceton toe. Bewaar de oplossing in het donker.

41



Verzadigde Na2CO3 oplossing (220 g/L bij 20°C) Weeg met de bovenweger 22 g Na2CO3 af. Voeg met een maatcilinder van 100 mL, 100 mL HPLC water toe aan Duranfles van 250 mL en laat roeren op magnetische roerder.



L-proline oplossing 10 mV % Weeg met de bovenweger 2 g L-proline af en los dit op in 20 mL HPLC water.



1,7-diaminoheptaan dihydrochloride 6,4 mg/mL Weeg met de analytische balans 320 mg 1,7-diaminoheptaan dihydrochloride af en los dit op in een PP-maatkolf van 50 mL en leng aan tot aan de maatstreep met HPLC water. Bewaar de oplossing in de koelkast.

4.3.

Uitvoering HPLC-bepaling

4.3.1. Wetenschappelijke publicatie Bron: (5) (19) Volgens Duflos et al. (1999) is het belangrijk om rekening te houden met het matrixeffect wanneer er ijklijnen worden opgemaakt. De helling van een ijklijn opgewerkt in een vismatrix is anders dan de helling van een ijklijn opgewerkt zonder vismatrix. De matrix oefent dus een invloed uit op de helling van de ijklijn. De matrix verwijst in dit geval naar het geheel van

Figuur 15 Matrixeffect bij histamine volgens Duflos et al. (1999)

spierweefsel en andere stoffen die zich in het vismonster bevinden naast de te bepalen biogene amines. Deze stoffen nemen niet noodzakelijk deel aan het vormen van de biogene amines, maar ze kunnen wel een effect hebben op de extractie van de amines. Het matrixeffect is het effect waarbij de meetwaarde verandert door de aanwezigheid van andere stoffen dan de te bepalen biogene amines in het vismonster. Het matrixeffect

42

verschilt van vissoort tot vissoort maar kan ook veranderen in de loop van de tijd. Naarmate de vis langer bewaard wordt, zullen er dus veranderingen optreden in het weefsel waardoor de matrix een andere samenstelling krijgt. Op figuur 15 zijn twee ijklijnen te zien van een histamine analyse. De volle lijn stelt de ijklijn voor van een histaminestandaardreeks zonder matrix. De streepjeslijn is de ijklijn voor een histaminestandaardreeks waarbij een wijtingmatrix werd gebruikt. Het is dus noodzakelijk om de standaardadditiemethode te gebruiken om stalen te kwantificeren. Deze benadering ligt het dichtst bij de realiteit. Tijdens dit proefschrift werd de methode van Duflos et al. (1999) grotendeels overgenomen. Er wordt nu wel gewerkt met de interne standaard 1,7-diaminoheptaan in plaats van 1,3-diaminopropaan, omdat er ondertussen in het labo op het ILVO ontdekt werd dat de 1,3-diaminopropaanpiek overlapte met de piek van het biogeen amine fenylethylamine.

4.3.2. Opwerking

4.3.2.1.

Opwerking zonder matrix

a) Blanco 

Voeg 5 mL HPLC water toe in een falcontube



Voeg 10 mL HClO4 0,2 mol/L toe



Voeg 100 µL 1,7-diaminoheptaan dihydrochloride 6,4 mg/mL



Mix met de ultraturrax



Centrifugeer 5 minuten lang aan 8500 tpm en bij 4 °C



Neem 100 µL af van het supernatans en doe het in een glazen cultuurbuisje



Voeg 300 µL van de verzadigde Na2CO3-oplossing toe



Voeg 400 µL dansylchloride 7,5 mg/mL toe



Draai de dop op het cultuurbuisje en vortex het mengsel



Steek het cultuurbuisje in het donker in een warmwaterbad bij 60 °C voor 5 minuten



Haal het cultuurbuisje uit het warmwaterbad na 5 minuten en koel het onder stromend water

43



Voeg 100 µL L-proline 10 mV% toe



Vortex het staal 10 seconden en plaats het daarna voor 15 minuten in het donker bij kamertemperatuur



Voeg 500 µL tolueen toe



Plaats het staal opnieuw voor 10 seconden op de vortex



Neem met behulp van een pipet de bovenstaande organische laag af en breng dit over in een nieuw cultuurbuisje



Damp de vloeistof uit onder een stikstofstroom met behulp van de Reacti-Vap™



Voeg na het uitdampen 200 µL acetonitril toe



Vortex het staal zachtjes



Breng het staal over in een vial van 200 µL met behulp van een spuit, naald en spuitfilter

b) Standaardreeks 

Voeg aan een reeks van 7 falcontubes volgende volumes uit de stockoplossing van 10 000 ppm van elk amine toe:

Tabel 3 Standaardreeks zonder matrix

5 ppm

10 ppm

25 ppm

50 ppm

100 ppm

250 ppm

400 ppm

500 µL

1250 µL

2000 µL

PUT CAD HIS TYR

25 µL

50 µL

125 µL

250 µL

SPD SPER FEN TRYP



Giet de volumes over in een PP-maatkolf van 50 mL en leng aan tot aan de ijkstreep



Breng met een pipet 5 mL over in een falcontube



De rest van de opwerking is analoog met deze van de blanco.

44

4.3.2.2.

Opwerking met matrix

a) Blanco Weeg 5 g aminevrij staal af en volg de opwerking onder 4.3.2.1.a. b) Standaardreeks Neem 7 falcontubes die elk exact 5 g aminevrij staal bevatten en voeg hier vervolgens x mL toe van elk amine uit de stockoplossingen van 10 000 ppm, voeg ook y mL HClO4 toe. (zie tabel 4) Tabel 4 Standaardreeks met matrix

5 ppm

10 ppm

25 ppm

50 ppm

100 ppm

250 ppm

400 ppm

25 µL

50 µL

125 µL

200 µL

PUT CAD HIS TYR

2,5 µL

5,0 µL

12,5 µL

HClO4

9,98 mL

9,96 mL

9,90 mL

9,80 mL

9,60 mL

9,00 mL

8,60 mL

IS(7) 6,4

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

SPD SPER FEN TRYP

mg/mL

Opmerking bij tabel 4 : dit zijn theoretische volumes gebaseerd op de theoretische massa‟s uit tabel 2. Bij de werkelijke massa‟s werden deze volumes omgerekend om opnieuw de gewenste concentraties te bekomen. De rest van de opwerking is analoog met deze uit 4.3.2.1.a. c) Staal Weeg exact 5 g af van onbekende het staal en werk op zoals beschreven in 4.3.2.1.a.

45

4.3.3. Instellingen voor de HPLC/UHPLC 4.3.3.1.

Gradiëntprogramma

Als programma wordt volgende gradiënt gebruikt:

Figuur 16 Gradiëntprogramma HPLC

Figuur 17 Gradiëntprogramma UHPLC

46

4.3.3.2.

Andere parameters

Tabel 5 Parameters HPLC/UHPLC

HPLC

UHPLC

Injectievolume

20 µL

1 µL

Injectietemperatuur

5 °C

5 °C

Oventemperatuur

25 °C

60 °C

Flow

1 mL/min

0,6 mL/min

UV-detector

254 nm

254 nm

47

5. Resultaten Het doel van het onderzoek was de invloed van het matrixeffect bij de bepaling van biogene amines in vis vastleggen. Het onderzoek bestond uit twee delen, een kwalitatief deel en een kwantitatief deel. Bij het kwalitatief deel werden de retentietijden bepaald van de onderzochte biogene amines. Bij het kwantitatief deel werden standaardreeksen opgewerkt zonder matrix, met scholmatrix en met scholmatrix. Het doel hiervan was vaststellen wanneer er sprake is van een matrixeffect en indien nodig, hoe groot dit effect is. Er werd gekeken naar het verschil tussen de twee onderzochte vissoorten. Tenslotte werd er ook nog gekeken naar de evolutie van het matrixeffect binnen dezelfde vissoort tijdens het bederven.

5.1. Bepalen van de retentietijden 5.1.1. Beschrijving

Tijdens de eerste stap van het onderzoek werden de retentietijden van elk biogeen amine bepaald. Om deze retentietijden te bepalen werd van elk amine een aparte oplossing van 100 ppm gemaakt. Bij deze oplossingen werd ook telkens interne standaard toegevoegd.

Pieken: 1. Dansylchloride 2. Tryptamine 3. 2-fenylethylamine 4. Putrescine 5. Cadaverine

9 6. Histamine 7. 1,7-diaminoheptaan (interne standaard) 8. Tyramine 9. Spermidine 10. Spermine 7

1

5 3

6

10

4

2

8

Figuur 18 Chromatogram retentietijden

48

5.1.2. Bespreking

De eerste piek die te zien is op het chromatogram is deze van dansylchloride. Tijdens de opwerking reageert de overmaat dansylchloride met L-proline. Wat dus nog overblijft op het chromatogram is het deel dat niet is weggereageerd. Vervolgens komen de pieken van de amines tryptamine, 2-fenylethylamine, putrescine, cadaverine en histamine. Piek 7 is deze van de interne standaard. Na de interne standaard zijn er tenslotte nog de pieken van tyramine, spermidine en spermine. Het klein piekje dat te zien is na putrescine wordt een stoorpiek genoemd en is op elk chromatogram te zien. De interne standaardpiek is hier niet overal even hoog omdat het tijdens de opwerking zeer belangrijk is om telkens gelijke volumes over te brengen. Om dit te doen werd er gewerkt met een positive displacement pipet. Als er niet wordt opgelet, dan kan één druppeltje meer of minder het verschil al maken. Er werd even overgeschakeld naar het gebruik van een Hamilton-naald. Het was echter enorm tijdrovend om hiermee te werken, want de naald moet tussendoor telkens worden uitgespoeld. Daarom werd er toch verder gewerkt met de positive displacement pipet, maar dan met extra aandacht of er wel telkens een gelijk volume wordt overgebracht. In onderstaande tabel zijn de retentietijden weergegeven voor elk biogeen amine. Tabel 6 Retentietijden biogene amines

Amine

Retentietijd (min)

Tryptamine

15,58

2-fenylethylamine

18,25

Putrescine

19,59

Cadaverine

21,07

Histamine

21,62

IS7

25,12

Tyramine

27,83

Spermidine

28,67

Spermine

31,91

49

Nu de retentietijden bepaald zijn en alle pieken dus geïdentificeerd, kan overgegaan worden naar het kwantitatieve deel van het onderzoek. De logische volgende stap is dus het opwerken van standaardreeksen om daarna de pieken te kwantificeren en een ijklijn op te stellen.

5.2.

Ijklijn zonder matrix

5.2.1. Beschrijving

Na het bepalen van de retentietijden konden ijklijnen van alle biogene amines bepaald worden. De opwerking gebeurde zonder matrix. Op deze manier zullen enkel resten van de opwerking te zien zijn op het chromatogram. De achtergrond is minimaal. De ijklijnen werden opgesteld met 4 standaarden, namelijk: 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm en 250 ppm.

Pieken: 1. Dansylchloride 2. Tryptamine 3. 2fenylethylamine 4. Putrescine 5. Cadaverine 6. Histamine 7. 1,7diaminoheptaan (interne standaard) 8. Tyramine 9. Spermidine 10. Spermine 2

9

Legende: 25 ppm 50 ppm 100 ppm 250 ppm

10 8 4

6 3

5 7

1

Figuur 19 Chromatogram matrixvrije ijklijn

50

In bijlagen 1 en 2 staan de toegekende waarden en afwijking van het beschikbaar referentiemateriaal. Beide referentiematerialen vallen net binnen het bereik van de ijklijn. Daarom werd geopteerd om het bereik van de ijklijn uit te breiden. Deze nieuwe ijklijn bestaat uit de standaarden 5 ppm, 10 ppm, 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 250 ppm en 400 ppm. Pieken: 1. Tryptamine 2. 2fenylethylamine 3. Putrescine 4. Cadaverine 5. Histamine 6. 1,7diaminoheptaan (interne standaard) 7. Tyramine 2 8. Spermidine 9. Spermine

3

7

5

8

Legende: Blanco 5 ppm 10 ppm 25 ppm 50 ppm 100 ppm 250 ppm

9

4

6 1

Figuur 20 Chromatogram uitgebreide ijklijn

5.2.2. Bespreking

Na het bekomen van het chromatogram werd iedere piek handmatig aangeduid met de software. Daarna werden de oppervlaktes van iedere piek gecorrigeerd met de piek van de overeenkomstige interne standaard. Per amine werd vervolgens een ijklijn opgemaakt.

51

5.3. Ijklijn met matrix

5.3.1. Opzet experimenten

Het praktisch deel van dit onderzoek bestond voornamelijk uit het uitvoeren van bewaarproeven. De opzet wordt weergegeven in tabel 7. De vismonsters (schol en wijting) werden gedurende een bepaalde tijd bewaard op ijs in een koelcel. Zoals te zien in de tabel, werden stalen uitgehaald, gefileerd, gemixt, opgewerkt en geanalyseerd op dag 0, op dag 3 en op dag 7. Er werd gewerkt met zowel schol en wijting om eerst en vooral te kijken of de vissoort een invloed heeft op de helling van de ijklijn. Er werd staal genomen op verschillende dagen om te zien of de viskwaliteit (met andere woorden, de bewaarduur) een invloed heeft op de helling van de ijklijn. Tenslotte werden er bij de bewaarproef met schol ook verschillende individuele stalen genomen om te kijken of er een verschil is in de resultaten tussen verschillende individuen. Dit werd niet gedaan bij de bewaarproef met wijting omdat een individueel wijtingstaal te klein is om er een volledige standaardreeks te kunnen uit opwerken. Tabel 7 Bewaarproeven

Matrix

Bewaarduur op ijs (dagen) Stalen

Schol

0

Mengstaal 5 individuele stalen

3

Mengstaal 5 individuele stalen

7

Mengstaal 5 individuele stalen

Wijting

0

Mengstaal

3

Mengstaal

7

Mengstaal

52

5.3.2. Experiment 1: Bewaarproef met schol

Tijdens deze eerste bewaarproef werd gekeken wat de invloed is van het bederven van de matrix op de helling van de ijklijn. Zoals eerder beschreven werd daarvoor staal genomen op dag 0, dag 3 en dag 7. 5.3.2.1.

Dag 0

a) Beschrijving Op dag 0 wordt gekeken naar het matrixeffect voor het bederf begint. De resultaten van de standaardreeks met scholmatrix werden uitgezet ten opzichte van deze van de standaardreeksen zonder matrix. De concentraties toegekend aan elke standaard werden uitgezet in functie van de verhouding van de piekoppervlakte van het amine ten opzichte van de piekoppervlakte van IS7 (Area ratio). b) Bespreking

Legende: Zwarte lijn: zonder matrix Rode lijn: met matrix

Figuur 21 Matrixeffect putrescine dag 0

53

Legende: Zwarte lijn: zonder martrix Rode lijn: met matrix

Figuur 22 Matrixeffect histamine dag 0

Legende: Zwarte lijn: zonder martrix Rode lijn: met matrix

Figuur 23 Matrixeffect spermidine dag 0

Zoals te zien is op figuur 21 is er in het geval van putrescine geen sprake van een matrixeffect. De ijklijn met matrix valt samen met de ijklijnen zonder matrix. In het artikel van Duflos et al. (1999) wordt het matrixeffect geïllustreerd aan de hand van histamine. Bij dit experiment hier is bij histamine echter geen sprake van een matrixeffect.

54

Er is wel een matrixeffect bij tryptamine, tyramine, spermidine en spermine. De reden hiervoor is dat de pieken van de onderzochte amines kleiner geworden zijn, maar de piek van IS7 is even groot gebleven. De verhouding van deze twee oppervlaktes wordt kleiner, dit wordt weerspiegeld in de ijklijn. Ter illustratie worden de resultaten weergegeven voor spermidine van de standaardreeksen met en zonder matrix. (zie figuur 23)

5.3.2.2.

Dag 3

a) Beschrijving Na drie dagen op ijs bewaard te zijn, wordt opnieuw een deel van de batch scholstalen gefileerd, gemixt, opgewerkt en geanalyseerd. Zoals beschreven in de opzet van het experiment, werden 5 individuele vismonsters apart gefileerd om te kijken of er een verschil is tussen verschillende individuen. Er werd ook een mengstaal gemaakt van vijf vismonsters samen. b) Bespreking

Legende: Blauwe lijn: met martrix dag 0 Groene lijn: met matrix dag 3 Rode lijn: zonder matrix

Figuur 24 Matrixeffect putrescine dag 3 mengstalen

55

Legende: Blauwe lijn: met martrix dag 0 Groene lijn: met matrix dag 3 Rode lijn: zonder matrix

Figuur 25 Matrixeffect putrescine dag 3 individuele stalen

Op figuur 10 staan de resultaten van de mengstalen voor dag 0 en dag 3. Figuur 11 toont de individuele stalen van dag 0 en dag 3. Na dag 3 is er dus nog geen uitgesproken verschil in de helling. Er is visueel geen matrixeffect vast te stellen.

5.3.2.3.

Dag 7

a) Beschrijving Op dag 7 worden opnieuw tien scholstalen uit het ijs gehaald. Vijf van deze scholstalen werden apart gefileerd, gemixt, opgewerkt en geanalyseerd. Er werd ook een mengstaal gemaakt van de vijf overige scholstalen. b) Bespreking Na 7 dagen op ijs is bij elk onderzocht amine een duidelijke verandering te zien in de helling van de ijklijn. Hieronder worden enkele voorbeelden gegeven. De oranje lijnen zijn de resultaten voor de vismonsters van dag 7.

56

Rode lijn: zonder matrix Blauwe lijn: met matrix dag 0 Groene lijn: met matrix dag 3 Oranje lijn: met matrix dag 7

Figuur 26 Matrixeffect putrescine dag 7

Rode lijn: zonder matrix Blauwe lijn: met matrix dag 0 Groene lijn: met matrix dag 3 Oranje lijn: met matrix dag 7

Figuur 27 Matrixeffect cadaverine dag 7

57

Rode lijn: zonder matrix Blauwe lijn: met matrix dag 0 Groene lijn: met matrix dag 3 Oranje lijn: met matrix dag 7

Figuur 28 Matrixeffect histamine dag 7

Het matrixeffect is hier visueel vast te stellen. De ijklijnen van dag 7 vallen duidelijk onder een andere hoek dan de ijklijnen van de andere dagen. Bij putrescine en cadaverine is het matrixeffect zeer duidelijk te zien. Bij histamine is het minder zichtbaar, maar wel nog steeds zichtbaar.

58

5.3.3. Experiment 2: bewaarproef met wijting

Na de bewaarproef met schol werd er ook een bewaarproef uitgevoerd met wijting. Hier werden enkel mengstalen opgewerkt omdat er te weinig staal kan gehaald worden uit een individueel wijtingmonster om een volledige ijklijn uit op te werken. 5.3.3.1.

Dag 0

a) Beschrijving Eén van de onderzoeksvragen is of de vissoort een invloed heeft op de helling van de ijklijn. Daarom werden de resultaten van de ijklijnen van dag 0 van beide bewaarproeven (bewaarproef met wijting en bewaarproef met schol) met elkaar vergeleken. b) Bespreking

Rode lijn: scholmatrix dag 0 Blauwe lijn:wijtingmatrix dag 0

Figuur 29 Matrixeffect voor 2-fenylethylamine schol-wijting

59

Rode lijn: scholmatrix dag 0 Blauwe lijn: wijtingmatrix dag 0

Figuur 30 Matrixeffect voor histamine schol-wijting

Zowel bij 2-fenylethylamine en histamine, als bij alle andere onderzochte amines, is er visueel een verschil vast te stellen tussen de twee soorten stalen. 5.3.3.2.

Dag 3

a) Beschrijving Na 3 dagen op ijs te hebben gelegen worden de wijtingmonsters gefileerd, gemixt, opgewerkt en geanalyseerd.

60

b) Bespreking

Blauwe lijn: wijtingmatrix dag 0 Groene lijn: wijtingmatrix dag 3

Figuur 31 Matrixeffect wijting voor putrescine dag 3

Na 3 dagen zijn de ijklijnen steiler geworden, er kan echter puur visueel niet gezegd worden dat het verschil significant is. Om met zekerheid te kunnen zeggen of er sprake is van een matrixeffect, zou dit statistisch moeten bepaald worden. 5.3.3.3.

Dag 7

a) Beschrijving Op de laatste dag van deze bewaarproef worden de overige wijtingstalen gefileerd, gemixt, opgewerkt en geanalyseerd. De resultaten worden vervolgens vergeleken met de resultaten van dag 0 en dag 3.

61

b) Bespreking

Blauwe lijn: wijtingmatrix dag 0 Groene lijn: wijtingmatrix dag 3 Oranje lijn: wijtingmatrix dag 7

Figuur 32 Matrixeffect wijting voor putrescine dag 7

De hellingen van de ijklijnen van dag 7 vertonen bijna geen visueel verschil met de hellingen van de ijklijnen van dag 0 en dag 3. Er kan hier dus niet met zekerheid gesteld worden dat er een matrixeffect aanwezig is. Ook hier zou de aan- of afwezigheid van een matrixeffect statistisch aangetoond moeten worden.

5.4. CRM-bepalingen 5.4.1. Beschrijving

Om te controleren hoe correct de methode is, werden beide CRM‟s (zie bijlage 1 en 2) ook telkens bepaald. Dit is tevens een extra controle op de lineariteit van de ijklijnen. Bij ontvangst van de CRM‟s, werden deze verdeeld per exact 5 g in falcontubes. Tijdens de bewaarproeven werden beide CRM‟s ook opgewerkt en geanalyseerd. Het bereik van beide CRM‟s wordt hier nog eens kort weergegeven: Tabel 8 Toegekende waarden CRM's

Minimum

Toegekende waarde

Maximum

T2764

21,5

26,7

31,9

T27105QC

164,7

192,6

220,6

62

5.4.2. Bespreking

a) Dag 0

Tabel 9 CRM bepaling schol dag 0

Concentratie Staalnummer Area Area IS7 Area ratio Dag 0 S1 Dag 0 SM1 T2764 614.279 2.838.951 0,21638 23,14 T27105QC 6.408.634 3.566.359 1,79697 194,19

22,61 196,5

Tabel 10 CRM bepaling wijting dag 0

Staalnummer Area Area IS7 Area ratio T2764 510.068 2.318.567 T27105QC 4.833.367 2.653.633

Concentratie Dag 0 WM1 Dag 0 WM2 0,21999 28,69 28,74 1,82142 238,69 248,0

Als de concentraties van de CRM‟s worden bepaald aan de hand van scholstandaarden, dan valt de concentratie telkens binnen het toegekende bereik. Bij bepaling aan de hand van wijtingstandaarden valt echter enkel T2764 binnen het toegelaten bereik. De T27105QC valt hier tweemaal hoger dan de maximum toegelaten waarde van 220,6 ppm.

63

b) Dag 3

Tabel 11 CRM bepaling schol dag 3

Staalnummer T2764 T27105QC

Concentratie Area Area Area IS7 ratio Dag 3 S5 Dag 3 SM1 629.886 3.035.378 0,20751 23,25 23,02 6.598.253 3.881.412 1,69996 177,92 183,9

Tabel 12 CRM bepaling wijting dag 3

Staalnummer T2764 T27105QC

Concentratie Area Area IS7 Area ratio Dag 3 WM1 Dag 3 WM2 523.761 2.451.765 0,21363 28,60 27,16 4.848.429 2.910.901 1,66561 225,03 227,8

Net zoals bij dag 0 vallen ook weer de bepalingen gedaan aan de hand van de scholstandaarden binnen het toegelaten bereik. De T27105QC komt bij de wijtingstandaarden nog steeds te hoog uit, hoewel deze waarde wel gezakt lijkt te zijn sinds dag 0.

64

c) Dag 7 Tabel 13 CRM bepaling schol dag 7

Concentratie Staalnummer T2764 T27105QC

Area Area Area IS7 ratio Dag 7 S5 Dag 7 SM1 549.729 2.459.090 0,22355 26,99 5.380.011 3.022.909 1,77975 211,37

28,58 226,6

Tabel 14 CRM bepaling wijting dag 7

Staalnummer T2764 T27105QC

Concentratie Area Area IS7 Area ratio Dag 7 WM1 Dag 7 WM2 501.307 2.213.878 0,22644 27,93 27,48 6.606.536 3.924.054 1,68360 212,29 235,1

De lage CRM (T2764) ligt bij alle vier de bepalingen binnen het toegelaten bereik. De hoge CRM valt de ene keer binnen de het bereik en de andere keer niet, er kan dus niet met zekerheid gezegd worden of deze juist zal bepaald worden op deze manier.

5.5. Experiment 3: UHPLC

Ter afsluiting van het onderzoek werd er een mix van alle onderzochte biogene amines met een concentratie van 100 ppm zonder matrix opgewerkt en geanalyseerd met behulp van de UHPLC-kolom. Er zijn verschillende voordelen aan deze methode. Om te beginnen is de analysetijd veel korter, 6 minuten in plaats van 45 minuten. De reden dat de analysetijd zoveel korter is, is dat er met de UHPLC-kolom kan gewerkt worden bij veel hogere drukken. Waar de druk bij klassieke HPLC tot 250 bar mag bedragen, is deze bij UHPLC maximum 1000 bar. Een ander voordeel is de flow die slecht 0,6 mL/min bedraagt in plaats van 1,0 mL/min. Deze twee voordelen zorgen ervoor dat de analyses ook veel goedkoper worden per staal, aangezien er tijd en solvent wordt uitgewonnen.

De elutievolgorde van de biogene amines was precies dezelfde als bij de gewone HPLCmethode. De retentietijden zijn wel veranderd. Het chromatogram ziet er als volgt uit:

65

170000

uV

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

6

160000 150000 140000

7

2 3

130000

8

120000 110000 100000

5

90000 80000

9

4

70000

Tryptamine 2-fenylethylamine Putrescine Cadaverine Histamine IS7 Spermidine Spermine

60000

1

50000 40000 30000 20000 10000 0 -10000 0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00

2,25

2,50

2,75

3,00

3,25

3,50

3,75

4,00

4,25

4,50

4,75

5,00

5,25

5,50

5,75

6,00

Figuur 33 Chromatogram BA 100 ppm UHPLC

Bij het verder zetten van dit onderzoek, zal er dus veel sneller en economischer kunnen gewerkt worden. Tabel 15 Vergelijking retentietijden HPLC/UHPLC

Retentietijd HPLC (min)

Retentietijd UHPLC (min)

TYR

15,58

2,68

2-FEN

18,25

2,87

PUT

19,59

2,96

CAD

21,07

3,08

HIS

21,62

3,16

IS7

25,12

3,37

TYR

27,83

3,69

SPD

28,67

3,82

SPER

31,91

4,31

66

6,25

min

6. Besluit Op het einde van dit onderzoek kan besloten worden dat er niet bij elk onderzocht biogeen amine sprake is van een matrixeffect. De biogene amines waarbij vooral een uitgesproken matrixeffect te zien was, waren tryptamine, tyramine, spermidine en spermine. Vooral bij de bepaling van tryptamine blijkt dit problematisch te zijn. De respons wordt zodanig klein dat dit kan zorgen voor minder betrouwbare resultaten. Ook werd er vastgesteld dat er ook een stijgend matrixeffect is tijdens het bederfproces bij alle onderzochte biogene amines. Deze conclusie werd getrokken uit de bewaarproef met schol. Bij de bewaarproef met wijting was dit niet het geval. De aanwezigheid van het matrixeffect is dus afhankelijk van de vissoort en de bewaarduur. Tijdens de bepaling moet hier dus rekening mee worden gehouden. Dit kan het best in rekening worden gebracht door gebruik te maken van standaardadditie. Met standaaradditie wordt meteen rekening gehouden met alle andere stoffen die aanwezig zijn in het visweefsel. Uit de resultaten van de CRM-bepalingen kan afgeleid worden dat de resultaten meestal wel aanvaardbaar zijn. De resultaten van de hoge CRM die werden berekend aan de hand van de wijtingstandaarden vallen meestal wel buiten het toegekende bereik. De reden hiervoor is dat de matrix van de CRM te veel verschilt van deze van de wijtingmonsters. Vooral naar hogere concentraties toe lijkt dit verschil een grotere rol te spelen. Dus zelfs bij het bepalen van een CRM zou eigenlijk de methode van de standaardadditie moeten worden gebruikt om een zo correct mogelijke bepaling te doen.

67

Bijlagen Bijlage 1: CRM laag bereik

68

Bijlage 2: CRM hoog bereik

69

Literatuurlijst 1. Histamine. (2008). Kennisbank Voedselveiligheid VWA, 1-4. 2. Allen, D. G. (2004). Regulatory control of histamine production in north carolina harvested mahi-mahi (coryphaena hippurus) and yellowfin tuna (thunnus albacares): A HACCP-Based Industry Survey. North Carolina: Raleigh, NC. 2. Bekaert, K., Deloof, D., & Robbens, J. (2012). Eindverslag project 'seaquid'. Oostende: ILVO. 3. Demeulemeester, E. (2008). Optimalisatie van HPLC detectie van biogene amines in vis. Oostende: KHBO. 4. Duflos, G., Dervin, C., Malle, P., & Bouquelet, S. (1999). Relevance of Matrix Effect in Determination of Biogenic Amines in Plaice (Pleuronectes platessa) and Whiting (Merlangus merlangus). Journal of AOAC International, 1097-1101. 5. ejustice. (sd). Opgehaald van ejustice.just.fgov.be: http://www.ejustice.just.fgov.be/doc/rech_n.htm 6. Hernandez-Borges, J. (2009). Analysis of biogenic amines in wine. Chromedia. 7. Histamine (Life Science format). (sd). Oxford. 8. HMDB. (sd). Opgehaald van HMDB California: http://www.hmdb.ca/metabolites/hmdb01256 9. Hwang, D.-F., Chang, S.-H., Shiua, C.-Y., & Chai, T.-j. (1997). High performance liquid chromatographic determination of biogenic amines in fish implicated in food poisoning. Journal of Chromatography B, 23-30. 10. Informahealthcare. (sd). Opgehaald van Informahealthcare.com: http://informahealthcare.com/doi/abs/10.3109/15563658908994420 11. Kamsteeg, J. (1988). Biogene Aminen in de voeding. ORTHOMoleculair, 7-13. 12. Karovicova, J., & Kohajdova, Z. (2005). Biogenic Amines in Food. Chem. Pap., 70-79. 13. Malle, P., & Vallé, M. (1996). Assay of Biogenic Amines Involved in Fish Decomposition. Journal of AOAC International, 43-49. 14. Medical dictionary. (sd). Opgehaald van Free dictionary: http://medicaldictionary.thefreedictionary.com/tryptamine 15. NCBI. (sd). Opgehaald van ncbi.nlm.nih.gov: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20110777 16. objectief. (sd). Opgehaald van objectief.be: http://objectief.be/Tyramine.html 17. Redmond, J. W., & Tseng, A. (1978). High-pressure liquid chromatographic determination of putrescine, cadaverine, spermidine and spermine. Journal of Chromatography, 479-481.

70

18. Richard, N., Pivarnik, L., Ellis, P. C., & Lee, C. (2008). Effect of matrix on recovery of biogenic amines in fish. Journal of AOAC International. 19. Robbens, J. (2012). Persoonlijke mededeling. Oostende. 20. Rossi, S., Lee, C., Ellis, P., & Pivarnik, L. (2002). Biogenic Amines Formation in Bigeye Tuna Steaks and Whole Skipjack Tuna. Food Chemistry and Toxicology, 2056-2060. 21. Sigma Aldrich. (sd). Opgehaald van Sigma Aldrich: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/DataSheetPage.do?brandKey=ALDRICH&symbol=D 13208 22. Slocum, R. D., Flores, H. E., Galston, A. W., & Weinstein, L. H. (1988). Improved Method for HPLC Analysis of Polyamines, Agmatine and Aromatic Monoamines in Plant Tissue. Plant Physiol., 512-517. 23. Smela, D., Pechova, P., Komprda, T., Klejdus, B., & Kuban, V. (2003). Liquid Chromatographic Determination of Biogenic Amines in a Meat Product during Fermentation and Long-term Storage. Czech J. Food Sci., 167-175. 24. Wetenschap info. (sd). Opgehaald van Wetenschap.infonu.nl: http://wetenschap.infonu.nl/onderzoek/81448-chocolade-samenstelling.html 25. Yen, G.-C., & Hsieh, C.-l. (1991). Simultaneous Analysis of Biogenic Amines in Canned Fish by HPLC. Journal of food science, 158-160.

71