Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10110.1 – Stanovení obsahu probiotických bakterií rodu Enterococcus
Strana
1
Vydání
2
Revize
0
STANOVENÍ OBSAHU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ RODU ENTEROCOCCUS 1
Rozsah a účel
Postup slouží ke stanovení počtu probiotických bakterií v doplňkových látkách, premixech a krmivech. Postup stanovení nelze použít pro minerální krmiva, tj. krmiva doplňková, která jsou složena převážně z minerálních látek (s obsahem minimálně 40 % hrubého popela). Poznámky 1
2
2
Používá se technika zalitím agarem se žlučí, eskulinem a azidem nebo roztěr na tento agar. Tato metoda není selektivní pro probiotické bakterie rodu Enterococcus, ale může být použita pro stanovení jejich počtu v aditivech, premixech a krmivech za předpokladu, že probiotické enterokoky (E. faecium) jsou přítomné v mnohem vyšších počtech, než jakékoli jiné enterokoky. Kategorie vzorků krmiv: Doplňkové látky - obsahují okolo 1010 CFU/g. Premixy - obsahují okolo 108 CFU/g. Krmné směsi, mouky a pelety - obsahují okolo 106 CFU/g. Princip
Vzorek se homogenizuje, připraví se výchozí suspenze, ředicí řada a plotny (Petriho misky) se inokulují roztěrem inokula na povrch ploten. Plotny se inkubují v aerobních podmínkách po dobu (24 ± 2) h při teplotě (37 ± 1) °C. Narostlé kolonie se spočítají a vyjádří se jako kolonie tvořící jednotky (CFU) v g nebo kg krmiva. Poznámky 3
Norma ČSN EN 15788 uvádí pouze roztěr inokula na povrch plotny. Vzhledem k tomu, že jsou bakterie rodu Enterococcus (E. faecium) fakultativně anaerobní, dochází k vyššímu nárůstu kolonií při inokulaci ploten zalitím. Proto jsou uvedeny obě možnosti inokulace.
3
Chemikálie
Používají se chemikálie čistoty p. a. 1
Chlorid sodný, NaCl.
2
Chlorid draselný, KCl.
3
Hydrogenfosforečnan sodný, Na2HPO4. Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 17.4. 2013
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10110.1 – Stanovení obsahu probiotických bakterií rodu Enterococcus
Strana
2
Vydání
2
Revize
0
4
Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4.
5
Bakteriologický pepton.
6
Peptone 1 – casein peptone
7
Pepton 2 – meat peptone typ P.
8
Kvasniční extrakt.
9
Sušená hovězí žluč.
10
Eskulin.
11
Citronan železitoamonný.
12
Azid sodný.
13
Agar.
14
Voda (deionizovaná, demineralizovaná nebo destilovaná) odpovídající stupni 1 dle EN ISO 3696.
15
Základní ředicí roztok. Příprava: 8 g chloridu sodného (1), 0,2 g chloridu draselného (2), 1,15 g hydrogenfosforečnanu sodného (3) a 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného (4) se rozpustí ve vodě (14), upraví se pH hydroxidem sodným (20) na hodnotu 7,3 ± 0,2 a doplní se do objemu 1000 ml. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) °C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu.
16
Peptonová voda (pepton). Příprava: 1 g bakteriologického peptonu (5) a 8,5 g chloridu sodného (1) se rozpustí v asi 200 ml vody (14). pH se upraví hydroxidem sodným (20) na hodnotu 7,0 ± 0,2 a doplní se v 1000ml odměrné baňce po značku vodou (14). Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) °C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu.
17
Kultivační médium (agar se žlučí, azidem sodným a eskulinem). Příprava: 17 g casein peptonu (6), 3 g meat peptonu (7), 5 g kvasničního extraktu (8), 10 g žluče (9), 5 g chloridu sodného (1), 1 g eskulinu (10), 0,5 g citronanu železitoamonného (11), 25 g azidu sodného (12) a 13,5 g agaru (13) se rozpustí ve vodě (14), upraví se pH hydroxidem sodným (20) na hodnotu 7,1 ± 0,2 a doplní se do objemu 1000 ml. Takto připravený agar se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) °C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se agar vytemperuje na laboratorní teplotu, nalije na Petriho misky přibližně po (15 – 20) ml a nechá se přes noc ztuhnout. Misky se mohou skladovat v lednici 2 týdny při teplotě 4 °C. Před použitím se musejí vytemperovat na laboratorní teplotu.
18
Denaturovaný 70% etanol. Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 17.4. 2013
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10110.1 – Stanovení obsahu probiotických bakterií rodu Enterococcus
19
Kyselina iminodioctová.
20
Hydroxid sodný, NaOH, 1 mol/l
Strana
3
Vydání
2
Revize
0
Příprava: 10 g hydroxidu sodného se rozpustí ve vodě (14) a doplní se vodou do 250 ml. Poznámky 4
Pro stanovení probiotických bakterií rodu Enterococcus lze použít komerčně dodávaný agar se žlučí, eskulinem a azidem, který se připravuje podle návodu výrobce.
4 Přístroje a pomůcky 1
Analytické váhy.
2
Váhy s přesností 0,01 g.
3
pH metr.
4
Magnetické míchadlo.
5
Přístroj pro sterilizaci teplem – autokláv nebo tlakový hrnec.
6
Horkovzdušná sušárna.
7
Termostat s teplotou udržovanou na (37 ± 1) °C.
8
Vodní lázeň.
9
Vortex.
10
Sterilní laboratorní sklo – lahve s uzávěrem, odměrné baňky, Erlenmeyerovy baňky, zkumavky, Petriho misky.
11
Automatické pipety s nastavitelnými objemy (100 – 1000) µl a špičky bez filtru.
12
Jednorázové plastové nebo sterilní skleněné hokejky.
13
Latexové rukavice bezpudrové, obalový materiál, stojánky na zkumavky, odpadní nádoby.
Poznámky 5
Sterilizace a dekontaminace se provádí dle charakteru materiálu buď tepelně (1 h v sušárně při 115 °C až 120 °C; 15 min v autoklávu při 121 °C ± 1 °C) nebo chemicky (např. 70% etanolem, Savem apod.).
Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 17.4. 2013
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10110.1 – Stanovení obsahu probiotických bakterií rodu Enterococcus
5
Postup
5.1
Příprava výchozího ředění
Strana
4
Vydání
2
Revize
0
Vzorky se připravují ve třech opakováních. Podle tabulky č. 1 se do Erlenmeyerových baněk navažuje vzorek a přidává se základní ředicí roztok (15). Takto připravené vzorky se míchají 5 min na míchadle nastaveném na vysokou rychlost. Poté se nechají 30 min stát a nakonec se opět míchají 2 min na míchadle nastaveném na vysokou rychlost. Tímto postupem se získá základní ředění 10-1. Tabulka č. 1. Navážky vzorku a objemy základního ředicího roztoku (15). Navážka (g) 20 ± 0,1
Objem základního ředícího roztoku (ml) 180 ± 0,1
Doplňková látka ve formě mikrogranulí
2 ± 0,1
198 ± 0,1
Kompletní krmná směs
50 ± 0,5
450 ± 1
Druh krmiva Doplňková látka, premix
Poznámky 6
U vzorků s obsahem mědi nad 200 mg/kg je třeba použít chelatinizační činidla, např. kyselinu iminodioctovou (19).
5.2
Příprava ředicí řady
Ředicí řada se přizpůsobuje předpokládanému obsahu bakterií rodu Enterococcus ve vzorku. Připraví se ředicí řada zkumavek s 9 ml peptonu (16). Z připraveného základního ředění se pipetuje 1 ml do první zkumavky (získá se ředění 10-2). Dobře se promíchá na vortexu. Tento postup se opakuje pro další zkumavky ředicí řady. Na každé ředění se použije nová sterilní špička. 5.3
Inokulace a inkubace
Pro inokulaci se vybírají dvě po sobě jdoucí ředění, a to od každého ředění dvě plotny. Agar se žlučí, eskulinem a azidem (17) – inokulace roztěrem Na zaschlý povrch Petriho misky se pipetuje 0,1 ml naředěné suspenze zvoleného ředění a sterilní hokejkou se suspenze rovnoměrně rozetře po celém povrchu. Plotny se nechají zaschnout. Plotny se inkubují 24 h v převrácené poloze v aerobních podmínkách v termostatu při (37 ± 1) °C. Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 17.4. 2013
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10110.1 – Stanovení obsahu probiotických bakterií rodu Enterococcus
Strana
5
Vydání
2
Revize
0
Poznámka 7
Agar se žlučí, eskulinem a azidem (17) – inokulace zalitím Do každé Petriho misky se pipetou přenese 1 ml vzorku vhodného ředění. Toto inokulum se zalije asi 15 ml agaru (13), který byl zchlazen na (48 ± 1) °C. Promíchá se krouživým pohybem pětkrát doprava a pětkrát doleva a nechá se zatuhnout.
6 Počítání kolonií a vyjádření výsledku Pro výpočet se použijí misky obsahující ne více než 15 a méně než 150 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Kolonie jsou lesklé, bílé, okrouhlé, neprůsvitné, vypouklého profilu a okrouhlého tvaru o velikosti (1 – 2) mm v průměru, hydrolyzující eskulin, tzn., že vykazují tmavě hnědé až černé zbarvení agaru v okolí kolonií. Celkový počet mikroorganismů
na g vzorku se vypočte podle vztahu
součet všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách, objem inokula aplikovaného na misku v ml, počet ploten použitých pro výpočet z prvního ředění, počet ploten použitých pro výpočet z druhého ředění, faktor prvního pro výpočet použitého ředění. Výsledek se vyjádří jako celkový počet mikroorganismů na g nebo kg vzorku jako číslo (1,0 – 9,9) násobené 10x, kde x je příslušná mocnina 10.
7 Literatura 1 2
prEN 15788, Animal feeding stuffs – Isolation and enumeration of Enterococcus (E. faecium) spp., CEN, 2008 ČSN EN 15788, Krmiva – Izolace a stanovení počtu bakterií rodu Enterococcus (E. faecium), Úřad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, 2010.
Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 17.4. 2013
