Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10120.1 – Stanovení obsahu kvasinek rodu Saccharomyces
Strana
1
Vydání
2
Revize
1
STANOVENÍ OBSAHU KVASINEK RODU SACCHAROMYCES 1
Rozsah a účel
Metodika slouží ke stanovení počtu probiotických kvasinek v doplňkových látkách, premixech a krmivech. Postup stanovení není použitelný pro minerální krmiva, tj. krmiva doplňková složená převážně z minerálních látek a obsahující minimálně 40 % hrubého popela. Poznámky 1
2
3
2
Jedná se o metodu, ve které je použita technika inokulace zalitím agarem s kvasničním extraktem, glukózou a chloramfenikolem. Tato metoda není selektivní pro probiotické kvasinky, ale může být použita pro stanovení jejich počtu v krmivech za předpokladu, že probiotické kvasinky jsou přítomny v mnohem vyšších počtech, než jakékoli jiné kvasinky. Kromě uvedené techniky lze použít techniku očkování roztěrem na povrch chromogenního agaru (např. CHROMagar® Candida from CHROMagar), který umožňuje selektivní stanovení počtu druhů probiotických kvasinek, např. Saccharomyces cerevisiae. Kategorie vzorků krmiv: Doplňkové látky - obsahují okolo (109 – 1010) CFU/g. Premixy - obsahují okolo 108 CFU/g. Krmiva, mouky a pelety - obsahují okolo 106 CFU/g. Princip
Základem této metody je homogenizace vzorku, příprava výchozí suspenze, ředicí řady a inokulace ploten (Petriho misek) zalitím inokula médiem nebo roztěrem inokula na povrch ploten. Plotny inokulované roztěrem se inkubují v aerobních podmínkách 3 dny při teplotě (30 ± 1) °C. Plotny inokulované zalitím se inkubují v aerobních podmínkách 2 dny při teplotě (35 ± 1) °C. Narostlé kolonie se spočítají, ověří podle mikroskopické morfologie a vyjádří se jako kolonie tvořící jednotky (CFU) v g nebo kg krmiva. 3
Chemikálie a roztoky
Používají se chemikálie čistoty p. a., pokud není uvedeno jinak. 1
Chlorid sodný, NaCl.
2
Chlorid draselný, KCl.
3
Hydrogenfosforečnan sodný, Na2HPO4.
4
Dihydrogenfosforečnan draselný, KH2PO4. Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 10. 12. 2015
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10120.1 – Stanovení obsahu kvasinek rodu Saccharomyces 5
Bakteriologický pepton.
6
Kvasniční extrakt.
7
Glukóza.
8
Chloramfenikol.
9
Agar.
10
(re)destilovaná voda.
11
Základní ředicí roztok.
Strana
2
Vydání
2
Revize
1
Příprava: 8 g chloridu sodného (1), 0,2 g chloridu draselného (2), 1,15 g hydrogenfosforečnanu sodného (3) a 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného (4) se rozpustí v asi 200 ml vody (10). pH se upraví hydroxidem sodným (16) na hodnotu 7,3 ± 0,2 a doplní se v 1000ml odměrné baňce po značce. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) °C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu. 12
Peptonová voda (pepton). Příprava: 1 g bakteriologického peptonu (5) a 8,5 g chloridu sodného (1) se rozpustí v asi 200 ml vody (10). pH se upraví hydroxidem sodným (16) na hodnotu 7,0 ± 0,2 a doplní se v 1000ml odměrné baňce po značku. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) °C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu.
13
Kultivační médium (agar s kvasničním extraktem, glukózou a chloramfenikolem). Příprava: 5 g kvasničního extraktu (6), 20 g glukózy (7), 0,1 g chloramfenikolu (8) a (12 – 15) g agaru (9) se rozpustí v asi 200 ml vody (10) za varu. pH se upraví hydroxidem sodným (16) na hodnotu 6,6 ± 0,4 a doplní se v 1000ml odměrné baňce po značku. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) °C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím k zalévání inokula se médium uchovává při teplotě (48 ± 1) °C.
14
Fyziologický roztok. Příprava: 0,85 g chloridu sodného (1) se rozpustí v asi 50 ml vody (10). pH se upraví hydroxidem sodným (16) na hodnotu 7,4 ± 0,2 a doplní se ve 100ml odměrné baňce po značku. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) °C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu.
15
Denaturovaný etanol, 70%.
16
Hydroxid sodný, NaOH, c = 1 mol/l. Příprava: 10 g hydroxidu sodného se rozpustí asi ve 100 ml vody (10) a doplní se v 250ml odměrné baňce po značku.
17
Imerzní olej. Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 10. 12. 2015
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10120.1 – Stanovení obsahu kvasinek rodu Saccharomyces
Strana
3
Vydání
2
Revize
1
Poznámky 4
Pro stanovení kvasinek rodu Saccharomyces lze použít komerčně dodávaný chromogenní agar, který se připravuje podle návodu výrobce.
4
Přístroje a pomůcky
1
Analytické váhy.
2
Váhy s přesností 0,01 g.
3
pH metr.
4
Magnetické míchadlo.
5
Přístroj ke sterilizaci teplem - autokláv, sušárna nebo tlakový hrnec.
6
Termostat s teplotou udržovanou na (30 – 35) ± 1 °C.
7
Vodní lázeň.
8
Vortex.
9
Mikroskop s imerzním objektivem (zvětšení 100 ×).
10
Sterilní laboratorní sklo – lahve s uzávěrem, odměrná baňka Erlenmeyerovy baňky, zkumavky, Petriho misky.
11
Automatické pipety s nastavitelnými objemy (100 – 1000) µl a špičky bez filtru.
12
Jednorázové plastové nebo sterilní skleněné hokejky.
13
Latexové rukavice bezpudrové, obalový materiál, stojánky na zkumavky, odpadní nádoby.
Poznámky 5
Sterilizace a dekontaminace se provádí dle charakteru materiálu buď tepelně, tj. 1 h v sušárně při (115 – 120) °C nebo 15 min v autoklávu při (121 ± 1) °C nebo chemicky (např. 70% etanol, Savo, apod.).
5
Postup
5.1
Příprava výchozího ředění
Vzorky se připravují ve třech opakováních. Do Erlenmeyerových baněk se navažuje množství vzorku a přidává základní ředicí roztok (11) podle tabulky 1. Vzorek se základním ředicím roztokem (11) se promíchá a upraví se pH na hodnotu 7,3 – 8,1. Takto připravené vzorky se míchají 5 min na míchadle nastaveném na vysokou rychlost. Poté se nechají 30 min stát a nakonec se opět míchají 2 min na míchadle nastaveném na vysokou rychlost. Tímto postupem se získá základní ředění 10-1. Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 10. 12. 2015
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10120.1 – Stanovení obsahu kvasinek rodu Saccharomyces
Strana
4
Vydání
2
Revize
1
Tabulka 1. Navážky vzorku a objemy základního ředicího roztoku (11). Navážka (g) 20 ± 0,1
Objem základního ředicího roztoku (ml) 180 ± 0,1
Doplňková látka ve formě mikrogranulí
2 ± 0,1
198 ± 0,1
Kompletní krmná směs
50 ± 0,5
450 ± 1
Druh krmiva Doplňková látka, premix
Poznámky 6
Suspenze obsahující probiotika mají tendenci po homogenizaci rychle sedimentovat. Tomu se zabrání rychlým pipetováním z řádně zhomogenizovaných vzorků.
5.2
Příprava ředicí řady
Ředicí řada se přizpůsobuje předpokládanému obsahu kvasinek Saccharomyces cerevisiae ve vzorku. Připraví se ředicí řada zkumavek s 9 ml peptonu (12). Z připraveného základního ředění se napipetuje 1 ml do první zkumavky (získá se ředění 10 -2). Dobře se promíchá na vortexu. Tento postup se opakuje pro další zkumavky ředicí řady. Na každé ředění se použije nová sterilní špička. 5.3
Inokulace a inkubace
Pro inokulaci se vybírají dvě po sobě jdoucí ředění, a to od každého ředění dvě plotny. Do každé Petriho misky se pipetou přenese 1 ml vhodného ředění. Toto inokulum se zalije asi 15 ml agaru (13), který byl zchlazen na (48 ± 1) °C. Promíchá se krouživým pohybem pětkrát doprava a pětkrát doleva a nechá se zatuhnout. Plotny se inkubují v převrácené poloze v aerobních podmínkách v termostatu 2 – 3 dny při teplotě (35 ± 1) °C. Poznámky 7
8
Pokud se použije komerčně dodaný chromogenní agar, postupuje se takto: Na zaschlý povrch Petriho misky se napipetuje 0,1 ml naředěné suspenze zvoleného ředění a sterilní hokejkou se suspenze rovnoměrně rozetře po celém povrchu. Plotny se nechají zaschnout. Plotny se inkubují v převrácené poloze v aerobních podmínkách v termostatu 3 – 5 dnů při teplotě (30 ± 1) °C. Doba mezi ukončením přípravy výchozí suspenze a zalitím inokula v Petriho miskách nesmí překročit 15 min.
Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 10. 12. 2015
Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský Národní referenční laboratoř
Jednotné pracovní postupy – zkoušení krmiv 10120.1 – Stanovení obsahu kvasinek rodu Saccharomyces
6
Strana
5
Vydání
2
Revize
1
Počítání kolonií a vyjádření výsledku
Pro výpočet se použijí misky, které obsahují nejvýše 300 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. U vybraných kolonií se provádí fenotypová charakteristika. Jedná se o kontrolu mikroskopické morfologie. Z části kolonie se připraví suspenze ve sterilním fyziologickém roztoku s obsahem 0,85 % chloridu sodného (14), překryje se krycím sklíčkem a použije se vhodné zvětšení za použití olejové imerze (17). Kvasinky jsou tvořeny velkými buňkami různého vzhledu a velikosti, mnohdy s projevy pučení. Kolonie jsou smetanově zbarvené a neprůhledné, mají nepravidelný tvar a jejich velikost kolísá od 1 mm do 6 mm. Ve spodní vrstvě agaru mohou narůst i kolonie Saccharomyces cerevisie ze spodního kvašení, které jsou smetanově zbarvené, neprůsvitné a mají nepravidelný tvar i okraje. Poznámky 7
V případě použití komerčně dodaného chromogenního agaru jsou kolonie okrouhlé, konvexní nebo kuželovité, celokrajné, světle až sytě fialově zbarvené. Mají matný nebo lesklý povrch, jsou neprůhledné a jejich velikost kolísá od 1 mm do 3 mm.
Celkový počet mikroorganismů
na g vzorku se vypočte podle vztahu
součet všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách, objem inokula aplikovaného na misku v ml, počet ploten použitých pro výpočet z prvního ředění, počet ploten použitých pro výpočet z druhého ředění, faktor prvního pro výpočet použitého ředění. Výsledek se vyjádří jako celkový počet mikroorganismů na g nebo kg vzorku jako číslo 1,0 až 9,9 násobené 10x, kde x je příslušná mocnina 10. 7
Literatura
1
ČSN EN 15789, Krmiva – Izolace a stanovení počtu probiotických kvasinek, Úřad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, 2010. Schválil: RNDr. Jiří Zbíral, PhD., ředitel NRL Platné od: 10. 12. 2015
