UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta
Katedra analytické chemie
JATERNÍ STEATÓZA A MITOCHONDRIÁLNÍ DYSFUNKCE
Diplomová práce studijního programu Klinická a toxikologická analýza
Praha 2010
Eliška Páleníčková
Prohlášení Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně, pod vedením školitelky RNDr. Moniky Cahové, PhD. a pana doc. RNDr. Františka Nováka, CSc. a že jsem všechny použité prameny řádně citovala. Jsem si vědoma toho, že případné využití výsledků získaných v této práci, mimo Univerzitu Karlovu v Praze, je možné pouze po písemném souhlasu této univerzity.
V Praze dne 1. května 2010.
2
Abstrakt Cíle: Stanovit vliv dietně navozené steatózy na rozvoj mitochondriální dysfunkce v játrech a odolnost jater vůči parciální ischémii. Metody: Potkani kmene Wistar (samci; 361 ± 8,8 g) byli krmeni standardní (SD), nebo vysokotukovou dietou (VTD). Parciální ischémie byla navozena krátkodobým teplým zaškrcením portální žíly (20 min) dva dny před ukončením pokusu. Výsledky: Desetitýdenní dieta vedla ke zhoršení glukózové tolerance a zvýšení NEMK v séru. Prokázali jsme inhibiční účinek VTD na dýchací kapacitu mitochondrií in vitro. Ketogeneze byla vlivem VTD zvýšená. VTD negativně ovlivňuje aktivitu antioxidačních systémů, stimuluje tvorbu
lipoperoxidů
a
zhoršuje
odolnost
jater
k oxidativnímu
poškození
během
ischémie/reperfúze. Závěr: Podávání VTD vede k rozvoji jaterní steatózy, která dosud není provázená biochemicky vyjádřeným poškozením jater. Prokázali jsme poškození oxidační kapacity mitochondrií, známky strukturního poškození mitochondrií a zvýšenou citlivost jater k oxidačnímu poškození. Předmětová hesla: biochemie, fyziologie, Klíčová slova: mitochondrie, VTD, ischémie, dýchací řetězec, antioxidační systém, ROS
Aim: To determine the effect of diet-induced steatosis in the development of mitochondrial dysfunction in the liver and hepatic sensitivity to the partial ischemia. Methods: Male Wistar rats (361 ± 8.8 g) were fed standard (SD) or high-fat diet (VTD). Partial ischemia was induced by short-term clamp (20 min) of vein porta two days before the end of the experiment. Results: Ten-week HFD administration lead due to increased ketogenesis the altered glucose tolerance elevated serum NEFA. We demonstrated the inhibitory effect of HFD on the respiratory capacity of mitochondria in vitro. HFD negatively affected the activity of antioxidant systems and stimulated the formation of lipoperoxides. Partial ischemia had no efect on the mitochondrial oxidative capacity but significantly elevated the oxidative stress. Conclusion: HFD administration lead to the development of fatty liver that was still not accompanied by biochemical markers of liver injury. Nevertheless, we proved the impairment of to mitochondrial respiratory capacity, signs of structural damage of mitochondria and the increased sensitivity to oxidative damage of the liver. Subject words: biochemistry, physiology Keywords: mitochondria, HFD, ischemia, respiratory chain, antioxidant systém, ROS
3
Obsah
Obsah…………………………………………………………………………………….4 Seznam zkratek ………………………………………………………………………….5
I
II
ÚVOD ...................................................................................................................... 8 I.1
Steatóza............................................................................................................. 8
I.2
Mitochondrie .................................................................................................... 9
I.3
Cíl výzkumu a pracovní hypotézy.................................................................. 12
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................... 13 II.1
Metody............................................................................................................ 13
II.1.1
Experimentální zvířata a diety................................................................ 13
II.1.2
Biochemické metody .............................................................................. 14
II.1.2.1
Stanovení glykémie ........................................................................ 14
II.1.2.2
Orální glukózový toleranční test..................................................... 15
II.1.2.3
Inzulinémie ..................................................................................... 15
II.1.2.4
Obsah triacylglycerolu v séru ......................................................... 16
II.1.2.5
Stanovení množství proteinů pomocí metody BCA ....................... 17
II.1.2.6
Obsah mastných kyselin v séru ...................................................... 17
II.1.2.7
Stanovení
aktivity
alaninaminotransferázy
a
aspartát-
aminotransferázy ........................................................................... 18
II.2
II.3
II.1.2.8
Ketolátky v séru.............................................................................. 19
II.1.2.9
Stanovení obsahu triacylglycerolu v játrech................................... 20
II.1.2.10
Stanovení obsahu glykogenu v játrech ........................................... 20
Dýchání mitochondrií ..................................................................................... 21 II.2.1.1
Příprava jaterního homogenátu....................................................... 21
II.2.1.2
Oxidační kapacita mitochondrií...................................................... 21
II.2.1.3
Aktivita enzymu NADH: cytochrom c oxidoreduktázy................. 22
II.2.1.4
Imunostanovení obsahu cytosolického cytochromu c .................... 23
Stanovení aktivity antioxidačních enzymů.................................................... 24 II.3.1.1
Příprava jaterního homogenátu....................................................... 24
4
II.3.1.2
Superoxiddismutáza ....................................................................... 24
II.3.1.3
Glutationperoxidáza........................................................................ 25
II.3.1.4
Glutation ......................................................................................... 26
II.3.1.5
Kataláza .......................................................................................... 26
II.3.1.6
Látky reagující s kyselinou tiobarbiturovou................................... 27
III VÝSLEDKY A DISKUZE ................................................................................... 28 III.1
Vliv diety a ischémie na některé základní parametry..................................... 29
III.2
Vliv diety a parciální ischémie na dýchací kapacitu mitochondrií................. 31
III.2.1
Dýchání mitochondrií in vitro ................................................................ 32
III.2.2
Aktivita složek respiračního řetězce in vitro .......................................... 32
III.2.3
Integrita vnější mitochondriální membrány ........................................... 34
III.3
Vliv diety na míru poškození oxidačním stresem .......................................... 36
III.3.1
Tvorba lipoperoxidačních produktů ....................................................... 36
III.3.2
Aktivita antioxidačních systémů ............................................................ 37
IV ZÁVĚRY ............................................................................................................... 40
V
POUŽITÁ LITERATURA .................................................................................. 41
5
Seznam zkratek
ACO
acyl-CoA-oxidáza
ACS
acyl-CoA-syntetáza
ALT
alaninaminotransferáza
AST
aspartátaminotransferáza
BCA
bicinchoninová kyselina
BSA FFA free
hovězí sérový albumin bez NEMK
CAT
kataláza
EDTA
ethylendiamintetraoctová kyselina
ELISA
enzym linked immunosorbent assay, enzymová imunoanalýza na imunosorbentu
ETT
epididymální tuková tkáň
FADH2
redukovaný flavinadenindinukleotid
GK
glycerolkináza
GOD
glukózoxidáza
GPO
glycerol-3-fosfátoxidáza
GSH
redukovaná forma glutationu
GSH-Px
glutationperoxidáza
β-HBDH
β -hydroxybutyrátdehydrogenáza
HEPES
4‑(2‑hydroxyetyl)-1-piperazinetansulfonová kyselina
isch
skupina s parciální ischémii (= isch - VTD; isch – SD)
kon
kontrolní skupina (= kon – VTD; kon – SD)
MEHA
3-metyl-N-etyl-N-(β-hydroxyetyl)-anilin
MK
mastné kyseliny
mtDNA
mitochondriální deoxyribonukleová kyselina
NADH2
redukovaný nikotinamidadenindinukleotid
NAFLD
nonalcoholic fatty liver dinase, nealkoholická jaterní steatóza
NASH
non-alcoholic steatohepatitis, nealkoholická steatohepatitida
6
NEMK
neesterifikované mastné kyseliny
PMSF
fenylmetylsulfonylflourid
PO
peroxidáza
PVDF
polyvinylidendifluorid
RNS
reactive nitrogen species, reaktivní formy dusíku
ROS
reactive oxygen species, reaktivní formy kyslíku
SD
standardní dieta
SOD
superoxiddismutáza
TAG
triacylglyceroly
TBA
tiobarbiturová kyselina
TBS
kyselý trisový pufr
TBARS
thiobarbituric acids reactive substance, látky reagující s kyselinou tiobarbiturovou
TCA
trichloroctová kyselina
Tris
2-amino-2-hydroxymetyl-propan-1,3-diol
XO
xantinoxidáza
VLDL
very low density lipoprotein,lipoproteiny s velmi nízkou hustotou
VTD
vysokotuková dieta
7
I
Úvod
I.1 Steatóza
Nealkoholická jaterní steatóza (NAFLD- nonalcoholic fatty liver disease) je celosvětově rozšířené chronické onemocnění jater zasahující jak dospělé, tak děti. Prostá steatóza je stav, kdy obsah tuku v játrech převyšuje 5 % hmotnosti jater. NAFLD je již provázená mírným zvýšením jaterních testů, zejména zvýšením aktivity alaninaminotransferázy (ALT) a aspartátaminotransferázy (AST). 1, 2 Ke vzniku steatózy může docházet z exogenních nebo endogenních příčin. Základní intrahepatické děje přispívající ke vzniku steatózy jsou zvýšená syntéza mastných kyselin (MK) de novo, zhoršená oxidace neesterifikovaných mastných kyselin (NEMK) a snížená sekrece lipoproteinů s velmi nízkou hustotou (VLDLs - very low density lipoproteins) z jater. Hlavní extrahepatickou příčinou steatózy je zvýšený obsah NEMK v séru. Při poruše správného ukládání triacylglycerolů (TAG) do tukové tkáně se zvyšuje obsah cirkulujících NEMK a dochází k jejich zvýšenému vychytávání v játrech a esterifikaci do TAG. 3 Ačkoliv je steatóza reverzibilní děj, může přecházet v závažnější stavy steatohepatitidy, fibrózy, a cirhózy. 4, 5 Příčina přechodu steatózy na steatohepatitidu není plně objasněna. Nejvíce uznávanou hypotézou je hypotéza „dvou zásahů“ (two-hits). Podle ní je první nezbytnou podmínkou akumulace TAG v játrech, tedy steatóza. Steatózní játra jsou pak zvýšeně citlivá k dalším zátěžovým faktorům („druhý zásah“), jako je například oxidační stres. Podle zmíněné hypotézy může porucha činnosti mitochondrií hrát kritickou roli v rozvoji steatózy a jejím přechodu na steatohepatitidu. Tato dysfunkce může být způsobena
různými
druhy
biochemických
a
molekulárních
změn
v mitochondriích. Tyto poruchy zahrnují strukturální poškození mitochondrií,
8
ztrátu mtDNA (mitochondriální DNA), snížení aktivity komplexů dýchacího řetězce a ATP syntézy, nebo poškození β- oxidace. 2, 6
I.2 Mitochondrie
Mitochondrie je semiautonomní organela, která slouží v eukaryotním organizmu jako kompartment pro syntézu ATP (adenosintrifosfát), nebo pro tvorbu tepla v buňce pomocí substrátu přeměněného z lipidů nebo z glukózy. Mitochondrie hrají důležitou roli v jaterním metabolizmu. Primárně jsou místem β-oxidace MK a oxidativní fosforylace. Přes vnější mitochondriální membrána látky přecházejí pomocí pasivní difúze nebo aktivního transportu. Vnitřní mitochondriální membrána obsahuje proteiny dýchacího řetězce, ve kterém dochází k přenosu elektronů ze substrátu na kyslík za vzniku ATP.7 Elektrony přenáší do dýchacího řetězce buď NADH + H+ (nikotinamidadenindinukleotid) přes komplex I, který prostupuje celou vnitřní membránu, nebo jsou elektrony dopraveny do respiračního řetězce z FADH2 (flavinadenindinukleotid) komplexem II, který je zakotvený do matrixové strany vnitřní membrány. Elektronový tok dále prochází přes ubichinon a cytochrom c až na terminální cytochrom aa3 komplexu IV. Z cytochromu aa3 elektrony jsou předány na molekulu kyslíku za vzniku vody. Průchod elektronů dýchacím řetězcem je úzce svázán s oxidativní fosforylací. Uvolněná energie vzniklá transportem elektronů je využita při tvorbě ATP. Abnormality a poruchy činnosti mitochondrií jsou spojeny s patogenezí steatózy. Patří mezi ně strukturní poškození mitochondrií, snížená aktivita komplexů dýchacího řetězce a ATP syntázy, poškození mitochondriální β-oxidace. 2
Situace, kdy dochází k radikálovému poškození biomolekul, např. DNA, proteinů, nebo lipidů, se nazývá oxidační stres. Tento biologický děj vzniká v důsledku významného zvýšení koncentrace reaktivních forem kyslíku (ROS - reactive oxygen species) a reaktivních forem dusíku (RNS - reactive nitrogen species). 6
9
Za normálních podmínek je tvorba ROS kompenzována aktivitou antioxidačních systémů. ROS zahrnuje široké spektrum radikálových sloučenin kyslíku: oxid (O-2), superoxid (O2•-), hydroxylový radikál (•OH), hydroperoxid (HOO•-), uhličitanový radikál (CO3•-), peroxyl (RO2•), alkoxyl (RO•) a řadí se k nim i některé neradikálové sloučeniny: peroxid (H2O2), kyselina chlorná (HClO), volné hydroperoxidové kyseliny (FAOOH), reaktivní aldehydy (RCHO) a singletový kyslík. Hlavním zdrojem ROS ve většině tkání jsou mitochondrie. Aktuální produkce ROS je závislá na řadě faktorů. Mitochondrie ve stavu „fosforylace“ netvoří větší množství radikálů. Jejich tvorba významně vzrůstá, je-li mitochondrie v podmínkách bez fosforylace, nebo dojde-li v důsledku hypoxie k obrácenému toku elektronů. Další rizikový faktor představuje reperfúze po ischémii.8, 9 Přenos elektronů respiračním řetězcem je nevyhnutelně doprovázen tvorbu radikálů kyslíku. Podle pokusů in vitro se odhaduje, že 1-2 % celkově spotřebovaného kyslíku je přeměněno na O2•-. Tato prvotní forma radikálových sloučenin kyslíku vzniká na dvou místech mitochondriálního respiračního řetězce: v komplexu I a komplexu III. 10, 11 Superoxidový radikál (O2•-) je s vysokou účinností přeměňován na peroxid již v místě svého vzniku, v mitochondriích. Samotný peroxid je relativně stabilní sloučenina, nicméně umožňuje vznik dalších mimořádně reaktivních produktů, např. •OH, HO2•- a CO3•-. Tyto sloučeniny mohou na dalších místech v buňce napadat proteiny, DNA a vyvolávat neenzymatickou lipoperoxidaci. 12, 13 Tvorba lipoperoxidů sice na jedné straně slouží jako detoxikační mechanismus, ale zároveň díky svému autokatalytickému charakteru ji lze považovat i za nový zdroj radikálů. Tyto radikálové anionty vznikají z počáteční oxidace kyslíkových radikálů. Vlna lipoperoxidace se šíří z místa vzniku na membráně. Původní rozsah poškození je mnohokrát znásoben. Buňka disponuje několika antioxidačními systémy, které ji chrání před negativním působením radikálů. Superoxidový radikál je rozkládán superoxiddismutázami (SOD), které jsou lokalizovány přímo v mitochondriálním matrixu (MnSOD), intermembránovém prostoru (Cu/ZnSOD) i v cytosolu (Cu/ZnSOD).
10
Glutationový systém je hlavním antioxidačním systémem v cytosolu. H2O2 a další ROS jsou přeměňovány pomocí několika glutationperoxidáz (GSH-Px) na vodu a kyslík. Volné radikály mastných kyselin jsou jejich působením transformovány na odpovídající hydroxykyseliny. Glutathion je nezbytný kofaktor těchto enzymů a jeho redukovaná forma (GSH) je indikátorem redoxního stavu buňky. Redoxní stav buňky je důležitý faktor, který určuje, zda buňka přežije, nebo zda budou aktivovány dráhy, vedoucí ke spuštění buněčné smrti, apoptózy. 14, 15 Významným antioxidačním enzymem je kataláza (CAT), která rozkládá peroxid. Její aktivita je ve většině tkání soustředěna výlučně do peroxisomů. 16
11
I.3 Cíl výzkumu a pracovní hypotézy
Dlouhodobě zvýšený příjem tuků v potravě vede v játrech ke steatóze. Cílem předkládané práce je přispět k objasnění vlivu steatózy na energetický metabolizmus jaterní buňky a na odolnost jater k dalšímu zátěžovému faktoru, tj. krátkodobé parciální ischémii. Na zvířecím modelu jaterní steatózy navozené desetitýdenním podáváním vysokotukové diety budou sledovány tyto vlivy:
a) Vliv vysokotukové diety a parciální ischémie na funkci mitochondrií a stav energetických zásob jaterní buňky
V jaterním homogenátu bude stanovena oxidační kapacita mitochondrií vzhledem k různým substrátům. Měření na intaktních mitochondriích bude dále doplněno stanovením aktivity složek mitochondriálního respiračního řetězce in vitro. Míra strukturního poškození mitochondrií bude posuzována podle rozsahu uvolňování cytochromu c z mitochondrií do cytosolu.
b) Vliv vysokotukové diety a parciální ischémie na míru oxidačního stresu v játrech
Poškození buněčných struktur v důsledku tvorby ROS bude hodnoceno podle tvorby
lipoperoxidačních
produktů.
Vliv
sledovaných
parametrů
na antioxidační systémy bude sledován na základě měření aktivity vybraných antioxidačních enzymů (SOD, GSH-Px, CAT) a obsahu GSH.
12
II Experimentální část
II.1 Metody
II.1.1 Experimentální zvířata a diety
K prováděným pokusům byli použiti potkani kmene AVN z Fyziologického ústavu Akademie věd ČR. Kmen je odvozen od potkanů kmene Wistar inbredním křížením. Zvířata byla chována v chovných nádobách po pěti až šesti jedincích v místnosti se standardními podmínkami při konstantní teplotě (25
o
C) a
v konstantním světelném režimu (12 hodin světlo, 12 hodin tma), měla volný přístup k pitné vodě a byla krmena ad libitum standardní peletovanou dietou nebo experimentální dietou. V pokusech byli používáni výhradně samci.
Na základě krmných diet byla zvířata rozdělena do několika skupin. Experimentální skupina byla krmena vysokotukovou dietou (VTD) a skupina kontrolních potkanů měla standardní peletovanou dietu (SD). Obě diety byly podávány po dobu 10 týdnů (Tab. 1). SD (hm. %)
VTD (hm. %)
kasein
8,0
8,0
sušené mléko
10
12
vojtěška
4,0
5,0
vitamínová směs
1,5
1,0
minerální směs
2,0
1,0
tuk
1,0
41
sušené droždí
4,0
12
šrot
2,5
-
škrob, pšenice
66
20
Tabulka 1 Složení diet 17
13
V pokusech, ve kterých byl sledován vliv ischémie, byla dva dny před ukončením pokusu navozena parciální ischémie (isch). U zvířat byla provedena anestezie zoletilem
(Virbac,
Francie).
Otevřeli
jsme
dutinu
břišní
a
pomocí
mikrochirurgické svorky jsme zaškrtili portální žílu po dobu 20 minut. Poté byl opět obnoven krevní oběh a uzavřeli jsme břišní dutinu. U kontrolní skupiny (kon) byla v anestezii provedena pouze laparotomie.
II.1.2 Biochemické metody
II.1.2.1 Stanovení glykémie
Glukóza je důležitý zdroj energie, její hodnoty v séru se považují za základní fyziologický parametr. Principem metody je měření úbytku kyslíku, který se redukuje na peroxid, v důsledku přeměny D-glukózy na kyselinu glukonovou. Tato reakce je katalyzována enzymem glukózoxidázou (GOD) obsahující kofaktor flavinadenindinukleotid (FAD) a měřena pomocí biosenzoru. D-glukóza + O2 GOD kyselina glukonová + H2O2
Pomocí amperometrického převodníku (kyslíková elektroda) biosenzoru je zaznamenáván pokles kyslíku, který je přímo úměrný koncentraci glukózy ve vzorku. Jako signál je použit přímo měřený proud. Měření bylo stanoveno pomocí glukometru Accu Check GO Gs.
14
II.1.2.2 Orální glukózový toleranční test
Metodou orálního glukózového tolerančního testu je zjištěna rychlost úbytku glukózy v krvi. Zvířata jsou vystavena nočnímu lačnění. Glukóza je aplikována sondou per os do žaludku v dávce 3 g/kg tělesné hmotnosti. Po aplikaci je měřena hladina glukózy v krvi z ocásku v intervalech 0, 30, 60, 120 a 180 minut. Ke změření byl použit glukometr Accu Check GO Gs.
II.1.2.3 Inzulinémie
Hlavním regulátorem obsahu glukózy v krvi je inzulin, který se stanovuje metodou ELISA (enzyme linked immunosorbent assai; enzymová imunoanalýza na imunosorbentu). Tato metoda je založena na přímé „sendvičové“ technice se dvěma monoklonálními protilátkami, které rozpoznávají dvě různé antigenní determinanty na molekule inzulinu. Na mikrodestičce je navázána primární protilátka (1.Ab), k ní je přidán vzorek s inzulinem. Množství vychytaného inzulinu je kvantifikováno pomocí sekundární protilátky (2. Ab) značené peroxidázou (PO). Nenavázaná sekundární protilátka je odstraněna promýváním. PO v této reakci indikuje barevnou přeměnu substrátu (3,3´,5,5´-tetrametylbenzidinu). Při promývání dojde k odstranění nenavázané sekundární protilátky. Po zastavení reakce je vazba inzulin-sekundární protilátka měřena kolorimetricky na spektrofotometru Leader Labsystems 35100 při 450 nm. Množství inzulinu je vypočteno podle kalibrační křivky. Na toto stanovení byl použit kit Mercodia Rat Inzulin ELISA.
15
II.1.2.4 Obsah triacylglycerolu v séru
Triacylglyceroly jsou součástí transportních lipoproteinových částic, které přenášejí TAG, cholesterol, ale i proteiny. Stanovení TAG v séru probíhá podle reakce: TAG
lipáza
glycerol + volné MK
Glycerol + ATP
GK
Glycerol-3-fosfát + ADP GPO
Glycerol-3-fosfát + O2
Dihydroxyacetonfosfát + H2O2
PO
2 H2O2 + barvivo
barvivo + 4 H2O
Triacylglycerol byl rozštěpen lipoproteinovou lipasou na glycerol. Ten byl převeden pomocí glycerolkinázy (GK) a glycerol-3-fosfátoxidázy (GPO) na dihydroxyacetonfosfát a peroxid. Množství TAG je tedy přímo úměrné množství peroxidu. Obsah peroxidu byl změřen fotometricky na UV/VIS spektrometru Perkin Elmer Lambda 40 při vlnové délce 546 nm. Koncentrace TAG byla vypočtena podle vzorce:
cvz =
Avz ∗ cst (1 mmol / l ) Ast
c (mmol/l) koncentrace vzorku; A při 546 nm absorbance Na stanovení byl použit kit Triacylglycerol liquid 250 S (Pliva-Lachema Diagnostika).
16
II.1.2.5 Stanovení množství proteinů pomocí metody BCA
Stanovení celkového množství proteinů ve vzorku jaterního homogenátu je důležitým parametrem pro výpočet aktivity enzymů. Princip metody je založen na redukci mocenství mědi (z II na I) nacházející se v komplexu s proteiny (díky peptidovým vazbám a aminokyselinám: cysteinu, cystinu, tryptofanu a tyrosinu). Tento přechod mocenství je přímo úměrný jejich kvantitativnímu množství. Měď spolu s kyselinou bicinchoninovou (BCA) vytvoří komplex, který má absorpční maximum při 562 nm. Analýza proběhla na destičkovém readeru Synergy 2 BioTek. Množství proteinů ve vzorku bylo odečteno z kalibrační křivky. Pro tuto analýzu byl použit kit Pierce BCA protein assay.
II.1.2.6 Obsah mastných kyselin v séru
Mastné kyseliny jsou důležitým zdrojem energie v periferních tkáních. Zvýšené hodnoty NEMK v séru představují zátěž pro organizmus. Stanovení probíhá podle těchto reakcí: ACS
RCOOH + ATP+ CoA Acyl-CoA + O2
ACO
Acyl-CoA+ AMP+ Ppi 2,3-trans-enoyl-CoA + H2O2 PO
2 H2O2 + 4-aminoantipyrin + MEHA
(barvivo)-OH- + 3 H2O
V prvním kroku dojde k přeměně NEMK na acyl-CoA za přítomnosti acylCoA-syntetázy (ACS). V druhém kroku vznikne 2,3-trans-enoyl-CoA a H2O2 za účasti acyl-CoA-oxidázy (ACO). Množství H2O2 je úměrné množství NEMK. Měření proběhlo pomocí barviva ( 3-methyl-N-ethyl-N-(ß-hydroxyetyl)-anilin (MEHA) při vlnové délce 546 nm a 660 nm na automatickém analyzátoru Hitachi
17
902.
Koncentrace
byla
za předpokladu
rovnosti
molárních
absorpčních
koeficientů ε546 nm a ε660 nm vypočtena pomocí vzorce:
cvz (mmol / l ) =
(A
546
− A660 ) + 0,043 1,013
c (mmol/l) koncentrace vzorku; A absorbance
Ke stanovení byl použit kit Wako NEFA-HR.
II.1.2.7 Stanovení
aktivity
alaninaminotransferázy
a
aspartát-
aminotransferázy
ALT (alaninaminotransferáza) a AST (aspartátaminotransferáza) jsou základní ukazatele poškození jater.
ALT měření probíhá na základě těchto reakcí: 2-oxoglutarát + L-alanin pyruvát + NADH + H+
ALT LDH
L-glutamát + pyruvát L-laktát + NAD+
NADH je oxidován na NAD+. Rychlost úbytku NADH, která je stanovena fotometricky, je přímo úměrná rychlosti tvorby pyruvátu, tedy ALT aktivitě (µkat/l). Absorpční maximum NAD+ při vlnové délce 366 nm bylo změřeno na automatickém analyzátoru Hitachi 902.
18
AST aktivita byla stavena podle rovnic: 2-oxoglutarát + L-aspartát AST L-glutamát + oxalacetát oxalacetát + NADH + H+
MDH L-malát + NAD+
NADH je oxidován na NAD+. Rychlost úbytku NADH, která je stanovena fotometricky, je přímo úměrná rychlosti tvorby oxalacetátu , tedy AST aktivitě (µkat/l). Absorpční maximum NAD+ při vlnové délce 366 nm bylo změřeno na automatickém analyzátoru Hitachi 902.
Na stanovení ALT i AST byly použity kity Roche/Hitachi 912 10851132 a Roche/Hitachi 10851124.
II.1.2.8 Ketolátky v séru
Ketolátky jsou tvořeny z MK v játrech a vylučovány do krevního řečiště, kterým jsou dopraveny k dalším orgánům . Měření je založeno na reakci: β -HBDH +
β-hydroxybutyrát + NAD
Acetoacetát + NADH + H+
NAD+ je redukován na NADH. Rychlost přírůstku NADH, která je stanovena fotometricky,
je
přímo
úměrná
množství
β-hydroxybutyrátu.
Množství
uvolněného NADH ve vzorku, které bylo měřeno při vlnové délce 366 nm na UV/VIS spektrometru Perkin Elmer Lambda 40, bylo porovnáno s přírůstkem známého množstvím standardy. Množství ketolátek v séru se vypočte podle vzorce:
cvz =
Avz ∗ cst (1 mmol / l ) Ast
c (mmol/l) koncentrace vzorku; A při 366 nm absorbance Obsah ketolátek v séru byl změřen kitem Ranbut Randox.
19
II.1.2.9 Stanovení obsahu triacylglycerolu v játrech
Obsah TAG v jaterní tkáni byl stanoven po extrakci do směsi chloroform : methanolu podle Folche (1957). 18 1 ml 20 % jaterního homogenátu se extrahuje do 15 ml směsi chloroform: methanolu v poměru (2:1). Vodná a chloroformová frakce se separují pomocí KH2PO4, svrchní frakce i se zbytky tkáně jsou odstraněny. 1 ml alikvot spodní chloroformové frakce je odpařen pod proudem dusíku a resuspendován v 100 µl směsi propan-2-ol : 10 % Triton X-100. (Triton X-100 je přidán kvůli emulgaci tukového substrátu). Obsah TAG je stanoven pomocí kitu Triacylglycerol liquid 250 S (Pliva-Lachema Diagnostika) (více kapitola III.1.2.4) na UV/VIS spektrometru Perkin Elmer Lambda 40 při vlnové délce 546 nm. Množství TAG ve tkáni bylo vypočítáno jako:
A c(µmol / g ) = vz ∗ absolutní mn.TAG v 10 µl ∗ f ředění ÷ mtkáně Ast c (µmol/g) koncentrace vzorku; A při 546 nm absorbance; m tkáně (g) hmotnost jaterní tkáně; f faktor ředění
TAG v játrech byly vztaženy na váhu tkáně. Výsledná koncentrace tedy vyšla v µmol/mg.
II.1.2.10 Stanovení obsahu glykogenu v játrech
Glykogen slouží jako zásobní polysacharid. Čerstvá játra jsou rozvařena v 30 % KOH. Proteiny jsou odstraněny opakovanou alkoholovou precipitací. Následuje kyselá hydrolýza glykogenu provedená pomocí 96 % kyseliny sírové. Uvolněná glukóza je pak stanovena na základě reakce s antronem (barvivo) při 600 nm na UV/VIS spektrometru Perkin Elmer Lambda 40. Množství glykogenu se vypočte podle vzorce:
20
A cvz (µmol / g ) = vz ∗ cst (1 µmol / ml ) ∗ f ředění ÷ mtkáně Ast c (µmol/g) koncentrace vzorku; A
při 600 nm
absorbance; f faktor ředění; m
tkáně
(g)
hmotnost jaterní tkáně
Množství glykogenu v játrech bylo vztaženo na navážku vzorku. Výsledné množství vychází v µmol/g.
II.2 Dýchání mitochondrií
II.2.1.1 Příprava jaterního homogenátu
Respirační
kapacita
mitochondrií
byla
měřena
v jaterním
homogenátu.
10 % homogenát byl připraven homogenizací jaterní tkáně v roztoku 0,25 M sacharóza; 0,001 M EDTA (pH= 7,4); 0,05 % BSA FFA free (hovězí sérový albumin bez NEMK) a homogenizuje v homogenizátoru Glas-Col s teflonovým pístem. Fragmenty tkáně a buněčná jádra byly odstraněny centrifugací při 830 g po dobu 4 minut a při teplotě 4 °C. Alikvoty homogenátu byly odebrány a dále zpracovány.
II.2.1.2 Oxidační kapacita mitochondrií
Oxidační kapacita mitochondrií ukazuje schopnost zužitkovat různé substráty pro vznik protonového gradientu a následné syntézy ATP. Koncentrace kyslíku byla změřena pomocí iontově selektivní elektrody (Clarkovy elektrody). Proud, který prochází roztokem, je přímo úměrný koncentraci kyslíku v měřící komůrce.
21
Základním měřeným parametrem je spotřeba kyslíku po přidání testovaného substrátu. Do základního roztoku (100 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 4 mM H3PO4, 1 mM EDTA (pH= 7,2)) byl přidán homogenát, 10 % BSA FFA free a 4 mM cytochrom c. Při měření byly postupně přidávány tyto substráty: 3,5 mM malát, 10 mM glutamát, 1,5 mM ADP, 10 mM sukcinát a 1,25 µM palmitoylcarnitin. Měření bylo provedeno na respirometru Oroboros Oxygraph-2k a programu DatLab4.
II.2.1.3 Aktivita enzymu NADH: cytochrom c oxidoreduktasa
Principem metody je přenos elektronů enzymovým komplexem z exogenního donoru NADH na akceptor cytochrom c. Protože jak donor, tak akceptor jsou v nadbytku, množství redukované formy cytochromu c je přímo úměrné aktivitě sledovaných komplexů. Přidáním KCN bylo zabráněno předání elektronů až na terminální cytochrom aa3. Mitochondriální a cytoplazmatický NADH se rozliší pomocí citlivosti k rotenonu. Pro měření byl použit 10 % jaterní homogenát. Aktivita mitochondriálního enzymu se vypočte jako změna kinetiky reakce probíhající v přítomnosti a nepřítomnosti rotenonu při T = 37 °C podle vzorce:
∆A c = 550 ∗ 10 −3 ÷ mg ( proteinu ) l ∗ ε 550
c (mmol/min/mg) koncentrace vzorku; A -1
při
550
nm
absorbance; ε
550 nm
-1
(mM *cm ) molární absorpční koeficient; l délka optické dráhy = 1 cm
Měřilo se na UV/VIS spektrometru Perkin Elmer Lambda 40.
22
II.2.1.4 Imunostanovení obsahu cytosolického cytochromu c
Zamražený vzorek jaterní tkáně byl homogenizován v homogenizačním pufru (0,25 M sacharóza; 0,001 M EDTA (pH = 7,4); heparin 7 UI/ml, 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylflourid), leupeptin 10 µg/ml, aprotinin 10 µg/ml) na teflonovém pístovém homogenizátoru Glas-Col.
Celý proces izolace byl
důsledně prováděn na ledu nebo při 4 °C. Zbytky tkáně byly z homogenátu odstraněny centrifugací při 850 g po dobu 5 min. Frakce intaktních mitochondrií byla oddělena centrifugací při 10 000 g 20 min 4 °C. Supernatant byl dále centrifugován 1 hod při 100 000 g, v peletě sedimentovaly membránové struktury, supernatant reprezentuje cytosolickou frakci.
Tato frakce byla rozdělena do
alikvotů a zamražena. Množství proteinů v jednotlivých frakcích homogenátu bylo stanoveno pomocí metody BCA (více kapitola III.1.2.5). Proteiny byly rozděleny pomocí elektroforetické separace za denaturujících podmínek a elektroforeticky přeneseny na PVDF (polyvinylidendifluoridové) membrány. Množství cytochromu c bylo kvantifikováno imunodetekcí pomocí králičí polyklonální protilátky Ab53056 (Abcam, Camebridge), ředění 1: 750 do 1 % BSA + TBS + 0,05 % Tween. Velikost nanášky byla ověřena po stripping a reblotování původní membrány s protilátkou proti beta aktinu Ab8227 (Abcam, Camebridge, UK), ředění 1: 5000 do 1 % BSA + TBS + 0,05 % Tween. Vazba protilátky byla detekována pomocí sekundární protilátky proti králičímu IgG značené křenovou peroxidasou Ab7040 (Cell signaling, Boston), ředění 1: 5000 do 5 % mléka + TBS + 0,05 % Tween. Vazba byla vizualizována chemiluminiscenčně.
Intentenzita
chemiluminiscence
byla
kvantifikována
na FUJI LAS-3000 imager (FUJI FILM, Japan) s využitím Quantity One software (Biorad, Hercules, CA).
23
II.3
Stanovení aktivity antioxidačních enzymů
II.3.1.1 Příprava jaterního homogenátu
Aktivita jednotlivých enzymů byla měřena v jaterním homogenátu. Jaterní tkáň byla okamžitě zamražena do tekutého dusíku. Těsně před analýzou byl ze zamražené tkáně připraven 10 % jaterní homogenát, který byl homogenizován na nožovém homogenizátoru Ultra Turrax T18 v HEPES sacharóza,
0,22 M
manitol,
2 mM
HEPES
pufru (70 mM
(4-(2-hydroxyetyl)-1-
piperazinetansulfonová kyselina), 0,05 % BSA FFA free). Zbytky tkáně byly odstraněny centrifugací při 830 g po dobu 4 minut při teplotě 4 °C. Alikvoty homogenátu byly odebrány a dále zpracovány.
II.3.1.2 Superoxiddismutáza
SOD
je
nejvýznamnější
superoxiddismutázy
(SOD)
intracelulární je
antioxidační
důležitý indikátor
enzym.
poruch
Aktivita
v metabolismu
kyslíkových radikálů v organismu. Pomocí xantinoxidázy (XO) jsou vytvořeny kyslíkové radikály z hypoxantinu. Část těchto radikálů je přeměněna SOD zpátky na kyslík a peroxid. Množství nerozložených radikálů je změřeno pomocí tetrazoliové soli (barvivo). XO
Hypoxantin + O2 3O2·- + 2H+
SOD
2H2O2 + O2
2O2·- + kyselina močová 2O2·- + barvivo
2O2
Aktivita SOD byla stanovena na základě kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla vypočtena jako podíl absorbance vzorku bez SOD (A0) ku absorbancím se
24
vzrůstajícím množstvím SOD (Ax).
cSOD
A0 − 0,905 A ∗ f (U / ml ) = x ředění 7,796
c (U/ml) koncentrace vzorku; A při 440 nm absorbance; f faktor ředění Koncentrace SOD byla vztažena na množství proteinů v jaterním homogenátu. Výsledná koncentrace je tedy uvedena v U/mg. Koncentrace proteinů ve vzorcích byla analyzována pomocí metody BCA (více kapitola III.1.2.5). Analýza byla provedena na spektrofotometru Leader Labsystems 35100 při vlnové délce 440 nm kitem Superoxide dismutase Assay Cayman.
II.3.1.3 Glutationperoxidáza
Glutationperoxidáza (GSH-Px) je klíčový enzym v ochraně membrány, která je vystavena oxidačnímu stresu. Bylo stanoveno množství H2O2 ve vzorku (vz0), který byl okamžitě zastaven kyselinou trichloroctovou (TCA), a ve vzorku (vz10), který byl inkubován 10 minut při pokojové teplotě, a pak zastaven pomocí TCA. 2 GSH + H2O2
GSH-Px GSSG + 2H2O
Pokles obsahu H2O2 je úměrný aktivitě GSH-Px. V tomto stanovení obsahuje standarda i vzorek stejné množství 10 % jaterního homogenátu, 4,8 mM GSH (redukovaná forma glutationu) a tetrabutylhydroperoxidu. Koncentrace samotné GSH-Px je vypočítána podle vzorce:
cvz ( µmol GSH / ml ) =
c (µmol GSH/ml) koncentrace vzorku; A
A0 − A10 ∗f ε 412 ∗ l ∗ t ředění při 412 nm
absorbance; ε (mM-1*cm-1)
molární absorpční koeficient; t čas = 10 min; l délka dráhy 1 cm; f faktor ředění
25
Koncentrace GSH-Px byla vztažená na množství proteinů v jaterním homogenátu. Výsledná koncentrace je uvedena v µmol/mg. Množství proteinů ve vzorcích bylo analyzováno pomocí metody BCA (více kapitola III.1.2.5). Analýza byla stanovena na UV/VIS Spektrometru Perkin Elmer Lambda 40 při vlnové délce 412 nm.
II.3.1.4 Glutation
Glutation je kofaktor enzymu glutathionperoxidasy. Je významnou součástí antioxidačního systému. Stanovení je založeno na reakci SH-skupin glutationu s DTNB (5,5´ditiobis-2-nitrobenzoová kyselina) za vzniku 5-tionitrobenzoátu. Množství GSH bylo vypočítáno podle vzorce:
cvz (µmol / ml ) =
Avz ∗ cst (48 µmol / ml ) ∗ f ředění Ast
c (µmol/ml) koncentrace vzorku; A při 412 nm absorbance; f faktor ředění Absorbance při vlnové délce 412 nm 5-tionitrobenzoátu byla měřena fotometricky na UV/VIS Spektrometru Perkin Elmer Lambda 40. Koncentrace GSH byla vztažena na množství proteinů v jaterním homogenátu, výsledná koncentrace je uvedena v U/mg. Koncentrace proteinů ve vzorcích byla analyzována pomocí metody BCA (více kapitola III.1.2.5).
II.3.1.5 Kataláza
Kataláza (CAT) patří do skupiny antioxidačních enzymů. V analýze dochází k reakci peroxidu a (NH4)2MoO4 s 10 % jaterním homogenátem (obsahuje
26
katalázu). Množství CAT je měřeno jako rozdíl absorbance peroxidu ve standardě bez katalázy a absorbancí peroxidu v homogenátu, tedy jako úbytek peroxidu za dobu 2 min, podle vzorce:
cvz (mmol H 2 O2 / min/ ml ) =
( Ast − Avz ) ∗ f ředění ε 410 ∗ l ∗ t (2 min )
c (mmol H2O2/ml/min) koncentrace vzorku; A při 410 nm absorbance; ε (mM-1*cm-1) molární absorpční koeficient; t čas = 2 min; l délka dráhy = 1 cm; f faktor ředění
Absorbance při vlnové délce 410 nm byla měřena na UV/VIS Spektrometru Perkin Elmer Lambda 40. Koncentrace CAT byla vztažena na množství proteinů v jaterním homogenátu. Výsledná koncentrace je uvedena v U/mg. Koncentrace proteinů ve vzorcích byla analyzována pomocí metody BCA (více kapitola III.1.2.5).
II.3.1.6 Látky reagující s kyselinou tiobarbiturovou
Látky reagující s kyselinou tiobarbiturovou
(TBARS -thiobarbituric acids
reactive substances) jsou oxidované formy lipidů, které slouží jako ukazatel tvorby ROS. 10 % jaterní homogenát byl deproteinován použitím TCA v poměru 1:1. Denaturované proteiny byly odstraněny centrifugací při 3000 g po dobu 10 min. Oxidované lipidy v supernatantu byly stanoveny pomocí thiobarbiturové kyseliny (TBA). Kvantifikace byla provedena porovnáním se standardním roztokem. Množství TBARS bylo vypočteno podle vzorce:
cvz (nmol / ml ) =
(
)
Avz ∗ c st 1 ∗ 10 3 nmol / ml ∗ f ředění Ast
c (nmol/ml) koncentrace vzorku; A při 535 nm absorbance; f faktor ředění
Analýza byla provedena na UV/VIS spektrofotometru Perkin Elmer Lambda 40 při vlnové délce535 nm.
27
III Výsledky a diskuze
Obezita je stav, kdy dochází k poruše rovnováhy mezi energetickým příjmem a energetickou spotřebou.19, 20 Játra hrají rozhodující roli v metabolizmu sacharidů, proteinů a lipidů. Udržují také hladinu glukózy v krvi a regulují energetickou homeostázu u savců. Proto jsou důležitým cílovým orgánem při obezitě. 2, 21
Studium NAFDL a z ní vyplývajících komplikací je podmíněno vhodným zvířecím modelem. V současné době se využívají 3 hlavní modely:
a) ob/ob zvířecí model Deficit leptinu u tohoto modelu vyvolává hyperfagii a obezitu. Dochází ke zvýšení chuti k jídlu a sníženému výdeji energie. Zvířata s ob/ob genem (obézní recesivní mutace) jsou obézní a je u nich pravděpodobný vznik steatózy. Ob/ob mutace u myší je provázena také hyperinzulinémií, hyperglykémií a hypotermií.5 V tomto modelu nedochází k dalšímu přechodu steatózy do závažnějších stádií, pokud nedochází k působení dalšího podnětu, např. endotoxinů, nebo metioninové deficience (extremní metioninový nedostatek v potravě). Mitochondrie jsou u tohoto
modelu
za
normálních
podmínek
plně
funkční.
Za určitých
experimentálních podmínek dochází k funkčnímu poškození mitochondrií.
b) cholin deficientní dieta Cholin deficientní dieta je dobře známý experimentální model způsobující steatózu. Absence cholinu zasahuje do syntézy a/ nebo sekrece VLDLs, blokuje tak přenos TAG ven z jaterní buňky. Dochází k hromadění lipidových kapének v buňce. Biochemické parametry tohoto modelu jsou podobné lidské steatóze. Nevýhodou tohoto modelu je vysoká specifičnost vyvolávajícího mechanismu. 22, 23
28
c) NAFLD indukovaná dietou s vysokým obsahem tuku (VTD) VTD je rovněž spjata se sníženou sekrecí VLDL. 24 Při dlouhodobém podávání se mohou vyskytovat mitochondriální poruchy spojené se sníženou oxidativní fosforylací. Z hlediska studia NAFLD je tento model nejvhodnější, protože se nejvíce blíží patogenezi této poruchy u lidí.
III.1 Vliv diety a ischémie na některé základní parametry Základní parametry jsou shrnuty v Tab. 2. Na konci pokusu měli experimentální potkani, kteří byli krmeni VTD, větší podíl tělesného tuku (p.< 0,05). U skupiny na VTD jsme prokázali zvýšení lačné glykémie (p.< 0,05). Inzulinémie je u této skupiny v sytém stavu snížena. Tento výsledek lze interpretovat jako poruchu sekrece inzulinu. Na poruchu sacharidového metabolizmu poukazuje i orální glukózový toleranční test (Obr. 1). Podávání diety se neprojevilo změnou obsahu TAG v séru. Hodnota NEMK v séru byla významně zvýšena pouze ve skupině krmené VTD a vystavené krátkodobé ischémii. Množství ketolátek v séru (stanoveno jako β-hydroxybutyrát) se díky VTD významně zvýšilo. Nebyl prokázán vliv parciální ischémie. Vlivem VTD došlo ke snížení hodnot ALT (p.< 0,05). Nebyly prokázány změny v obsahu ALT a AST v důsledku parciální ischémie.
29
SD
VTD
kon
isch
kon
isch
419 ± 9,3
413 ± 12
395 ± 11
399 ± 5,3
0,84 ± 0,06
0,73 ± 0,06
0,73 ± 0,05
0,77 ± 0,05
Adiposita (g)
1,3 ± 0,1
1,1 ± 0,1
2,1 ± 0,2∆
2,0 ± 0,1#
Glykémie-lačná (mmol/l)
4,5 ± 0,2
4,2 ± 0,1
5,2 ± 0,4
5,3 ± 0,3#
Inzulinémie-sytá (pmol/l)
157 ± 27
-
104 ± 21
-
NEMK (mmol/l)
0,33 ± 0,04
0,32 ± 0,02
0,40 ± 0,04
0,49 ± 0,04#
ALT (µkat/l)
1,11 ± 0,12
0,98 ± 0,13
0,78 ± 0,03∆
0,87 ± 0,08
AST (µkat /l)
3,80 ± 0,53
3,17 ± 0,36
3,33 ± 0,22
3,22 ± 0,42
β-hydroxybutyrát (mmol/l)
0,17 ± 0,02
0,19 ± 0,02
0,86 ± 0,22∆
0,68 ± 0,17#
Tělesná hmotnost (g) Triglyceridémie (mmol/l)
Tabulka 2 Charakteristiky všech pozorovaných skupin
Adiposita byla vypočtena jako poměr váhy ETT (epididymální tukové tkáně) na 100 g tělesné hmotnosti. Data představují průměr měření ± stand. chyba průměru, n= 7; kon-VTD vs kon-SD p.<0,05;
#
isch-VTD vs isch-SD p.<0,05.
Orální glukózový toleranční test
7,0
6,0
mmol glukózy/l
∆
5,0
4,0
3,0
2,0
0
30
60
t (min)
120
180
Obrázek 1
Data představují průměr měření ± stand. chyba průměru, n= 7;
= SD; x = VTD
30
SD
VTD
kon
isch
kon
isch
TAG (µmol/g)
12,5 ± 2,3
12,1± 2,2
45,5 ± 9,0∆
43,5 ± 4,4#
glykogen (µmol glukózy/g)
280 ± 13
265 ± 11
193 ± 18∆
226 ± 12#
Tabulka 3 Vliv diety a parciální ischémie na obsah TAG a glykogen v játrech.
Data představují průměr měření ± stand. chyba průměru, n= 7; kon-SD p.<0,05;
#
∆
kon-VTD vs
isch-VTD vs isch-SD p.<0,05.
Podávání VTD vedlo ke významnému zvýšení obsahu TAG v játrech (p.< 0,05) a dále ke snížení obsahu glykogenu (p.< 0,05). (Tab. 3) Vliv parciální ischémie se stejně jako u předchozích parametrů neprojevil.
III.2 Vliv diety a parciální ischémie na dýchací kapacitu mitochondrií Prostá steatóza a NAFLD jsou samy o sobě považovány za malé zatížení organismu. Ovšem ukazuje se, že steatóza per se zvyšuje citlivost jater vůči dalšímu poškození (ischémie, léčiva). Podmínkou přechodu NAFLD na NASH může
být
právě
mitochondriální
dysfunkce.
Mitochondriální
dysfunkce
(podmíněná přítomností steatózy) může představovat rizikový faktor snižující odolnost jater po transplantacích, nebo parciální hepatektomii. 5, 25, 26 Specifickým problémem steatózy je hypoxie. Hypoxie vzniká v organismu v důsledku nedostatečného zásobením buněk kyslíkem. Za toho stavu jsou centrální hepatocyty prokysličovány lépe, než periferní jaterní buňky. Právě hypoxie, jako jeden z přispívajících faktorů, ve spojení s VTD by mohla hrát kritickou
roli
v
přechodu
steatózy
k závaznějším
formám
jaterního
onemocnění. 4, 27 Důsledek VTD je zvětšený objemu jater, který snížuje hepatickou mikrocirkulaci krve.4, 28
31
III.2.1 Dýchání mitochondrií in vitro
Vysokotuková dieta významně snižuje schopnost mitochondrií oxidovat všechny testované substráty (malát, glutamát, palmitoylcarnitin a sukcinát) (Obr.2 ). Na standardní dietě parciální ischémie dýchací kapacitu mitochondrií buď neovlivnila (palmitoylcarnitin s malátem a ADP), nebo zhoršila (malát s glutamátem; malát, glutamát a ADP; sukcinát). Na vysokotukové dietě parciální ischémie způsobila nevýznamné zvýšení oxidační kapacity mitochondrií (Obr. 2).
III.2.2 Aktivita složek respiračního řetězce in vitro Aktivita komplexu I a komplexu III měřená in vitro byla významně snížená u VTD ve srovnání se standardní dietou. Vliv parciální ischémie se neprojevil ani u jedné skupiny. (Obr. 3) Tento komplex je místem vstupu většiny substrátů, proto významně reguluje celkovou respirační aktivitu, dále je jedním ze dvou předpokládaných míst vzniku ROS.
400
Aktivita NADH:cytochrom c oxidoreduktasy
mmol/min/mg
350 300 250
∆
200
#
150 100 50 0
SD
VTD
Obrázek 3 Data představují průměr měření ± stand. chyba průměru, n= 7; kon-SD p.<0,05;
#
∆
kon-VTD vs
isch-VTD vs isch-SD p.<0,05; bílý sloupec = skupina kontrol,
tmavý sloupec = skupina parciální ischémie.
32
33
III.2.3 Integrita vnější mitochondriální membrány
Cytochrom c se v buňce vyskytuje vázáný na vnitřní mitochondriální membránu. Další část cytochromu c se vyskytuje v prostoru mezi vnitřní a vnější mitochondriální membránou. Mezi oběma kompartmenty se neustále tvoří dynamická rovnováha. Pokud dojde k poškození vnější mitochondriální membrány, cytochrom c uniká z mezimembránového prostoru do cytosolu. Nedostatek cytochromu c v mezimembránovém prostoru může mít za následek strukturní
poruchy
v mitochondriálním
respiračním
řetězci
a
zhoršení
elektronového transportu. Cytochrom c v cytosolu může také aktivovat vnitřní apoptickou dráhu a nastolit buněčnou smrt.
Míra poškození vnější mitochondriální membrány jaterních mitochondrií byla sledována podle uvolňování cytochromu c do cytosolu metodou western blot. (Obr. 4, 5) Byl prokázán významně vyšší obsah cytochrom c v cytosolu ve skupině VTD ve srovnání se skupinou SD.
SD
VTD
cytochrom c aktin Obrázek 4
Množství cytochromu c v cytosolu.
34
Intenzita chemiluminiscence cytochromu c 2,00
arbitrární jednotky
1,75 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00
SD
VTD
Obrázek 5 Intenzita signálu pro cytochrom c byla normalizována na signál pro aktin (hodnota navážky). Bílý sloupec = skupina kontrol
Chronické vystavení VTD může způsobit „hypermetabolický stav“ v důsledku trvale zvýšené dostupnosti intracelulárních NEMK. Zvýšené množství NEMK představuje zvýšené nároky na respirační kapacitu buňky. V předchozích pracích naší laboratoře jsme ukázali, že při dietně indukované NAFLD skutečně dochází ke zvýšení intracelulárního obratu TAG.29, 30 Je aktivována autofagickolysozomální dráha intracelulární TAG jsou ve zvýšené míře odbourávány zvyšuje se dostupnost NEMK v buňce. Nedostačující kapacitu mitochondriálního respiračního řetězce potvrzuje i zvýšená tvorba ketolátek ve skupině VTD. Ketogeneze může představovat alternativní metabolickou cestu utilizace acetyl-CoA, který byl vytvořen v procesu β-oxidace. Za podmínek našeho experimentálního modelu může zvýšená nabídka substrátu k oxidaci představovat jeden z mechanismů přispívajících k poškození mitochondrií.
35
III.3 Vliv diety na míru poškození oxidačním stresem Pojmem „oxidační stres“ označujeme stav, kdy tvorba ROS přesahuje kapacitu antioxidačních ochranných systémů buňky. Samotné radikálové sloučeniny kyslíku jsou v podmínkách běžné laboratoře neměřitelné vzhledem k jejich mimořádně krátkému poločasu života (O2•- 10-6 s; OH• 10–9 s). Na jejich existenci a frekvenci výskytu však lze soudit na základě přítomnosti oxidovaných forem biomolekul.
III.3.1 Tvorba lipoperoxidačních produktů
Často užívaným ukazatelem oxidačního stresu jsou oxidované formy lipidů označované jako TBARS. Kyselina 2-tiobarbiturová reaguje v největší míře s malonyldialdehydem. Tato reakce není specifická, s kyselinou 2-tiobarbiturovou mohou také reagovat 4-hydroxy-non-2-en-1-al, nebo 4-hydroxyalk-2-en. Naše výsledky ukazují, že oba sledované vlivy - VTD i parciální ischémie, nezávisle na sobě zvyšují tvorbu lipoperoxidů. Kombinace obou vlivů má aditivní účinek. (Obr. 6)
36
Obsah TBARS v jaterním homogenátu 1,80
#○
1,60
●
nmol/mg
1,40 1,20
∆
1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00
SD
VTD
Obrázek 6
Data představují průměr měření ± stand. chyba průměru, n= 7; kon-SD p.<0,05; ○
#
isch-VTD vs isch-SD p.<0,05;
●
∆
kon-VTD vs
isch-SD vs kon-SD p.<0,05;
isch-VTD vs kon-VTD p.<0,05; bílý sloupec = skupina kontrol, tmavý
sloupec = skupina parciální ischémie.
III.3.2 Aktivita antioxidačních systémů Dalším parametrem, který vypovídá o míře oxidačního stresu, je aktivita jednotlivých antioxidačních enzymů. V našem experimentálním uspřádání jsme ve skupině kon-VTD prokázali zvýšení aktivity katalasy a snížení aktivity SOD. Kataláza je výlučně cytosolickým enzymem, který rozkládá peroxid vodíku. Peroxid vodíku vzniká jak v mitochondriích činností SOD, tak v peroxizomech v důsledku extramitochondriální oxidace NEMK. Zvýšená aktivita katalázy je obecně popisována jako adaptivní odpověď při stavech spojených se zvýšenou produkcí ROS. SOD je při reakci s O2-. irreverzibilně poškozena a pokles aktivity SOD lze interpretovat jako výsledek zvýšené „spotřeby“ enzymu při neutralizaci vznikajících radikálů. (Tab. 4, Obr. 7)
37
SD
VTD
kon
isch
kon
isch
SOD (U/mg)
152 ± 7,8
101 ± 4,5●
118 ± 6,8∆
79,2 ± 4,2#○
CAT (umol H2O2/min/mg)
586 ± 42
489 ± 30
764 ± 30 ∆
324 ± 7,6#○
GSH (U/mg)
22,8 ± 0,6
16,5 ± 1,1
23,8 ± 0,7
14,0 ± 0,9#
GSH-Px (uM GSH/min/mg)
628 ± 30
478 ± 20●
456 ± 22 ∆
258 ± 18#○
Tabulka 4 Aktivita antioxidačních systémů
Data představují průměr měření ± stand. chyba průměru, n= 7; #
kon-SD p.<0,05; ○
isch-VTD vs isch-SD p.<0,05;
●
∆
kon-VTD vs
isch-SD vs kon-SD p.<0,05;
Isch-VTD vs kon-VTD p.<0,05;
Parciální ischémie a zejména následná reperfúze vždy představuje výrazné zvýšení rizika oxidačního stresu. V našem uspořádání jsme ve skupině VTD/ischémie
prokázali
významné
snížení
aktivity
všech
sledovaných
antioxidačních enzymů. Tento výsledek si vysvětlujeme jako důsledek masivně zvýšené produkce ROS, která vedla k vyčerpání ochranných možností buňky. Tuto představu podporuje i významné zvýšení obsahu lipoperoxidů v této skupině. (Tab. 4, Obr. 7)
A Vliv vysokotukové diety na antioxidační systém a tvorbu lipoperoxidů: skupina kon 180
∆
160
∆
%
140
120
100
80
∆ ∆
60
SOD
CAT
GSH
GSH-Px
TBARS
38
B Vliv vysokotukové diety na antioxidační systém a tvorbu lipoperoxidů: skupina isch 130
#
120 110
%
100 90 80 70
# #
60 50
#
SOD
CAT
GSH
GSH-Px
TBARS
Obrázek 7
100 % = hodnota SD; Data představují průměr měření ± stand. chyba průměru, n= 7;
∆
kon-VTD vs kon-SD p.<0,05;
SOD - superoxiddismutáza;
CAT
#
–
isch-VTD vs isch-SD p.<0,05; kataláza;
GSH - glutation;
GST-Px - glutathionperoxidasa; TBARS – sloučeniny reagující s kyselinou tiobarbiturovou; bílý sloupec (A)- skupina kontrol, tmavý sloupec (B)- skupina parciální ischémie.
39
IV Závěry
1. Vliv vysokotukové diety a parciální ischémie na funkci mitochondrií a energetické zásoby jaterní buňky
Prokázali jsme negativní vliv vysokotukové diety na oxidační kapacitu izolovaných mitochondrií in vitro, jak vzhledem k substrátům závislým na komplexu I (glutamát, malát, palmitoylcarnitin), tak i na komplexu II (sukcinát). Na molekulární úrovni jsme identifikovali sníženou kapacitu komplexu I. Zvýšené uvolňování cytochromu c do média poukazuje na strukturní poškození mitochondrií v důsledku podávání vysokotukové diety.
2. Vliv vysokotukové diety a parciální ischémie na oxidační stres v játrech
Vysokotuková dieta snižuje aktivitu antioxidačních systémů a potencuje ischémii/ reperfúzí navozené oxidační poškození lipidů.
40
V Použitá literatura
1. Li, Z.; Berk, M.; McIntyre, T. M.; Gores, G. J.; Feldstein, A. E., The lysosomalmitochondrial axis in free fatty acid-induced hepatic lipotoxicity. Hepatology 2008, 47, (5), 1495-503. 2. Wei, Y.; Rector, R. S.; Thyfault, J. P.; Ibdah, J. A., Nonalcoholic fatty liver disease and mitochondrial dysfunction. World J Gastroenterol 2008, 14, (2), 193-9. 3. den Boer, M.; Voshol, P. J.; Kuipers, F.; Havekes, L. M.; Romijn, J. A., Hepatic steatosis: a mediator of the metabolic syndrome. Lessons from animal models. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004, 24, (4), 644-9. 4. Mantena, S. K.; Vaughn, D. P.; Andringa, K. K.; Eccleston, H. B.; King, A. L.; Abrams, G. A.; Doeller, J. E.; Kraus, D. W.; Darley-Usmar, V. M.; Bailey, S. M., High fat diet induces dysregulation of hepatic oxygen gradients and mitochondrial function in vivo. Biochem J 2009, 417, (1), 183-93. 5. Mantena, S. K.; King, A. L.; Andringa, K. K.; Eccleston, H. B.; Bailey, S. M., Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the pathogenesis of alcohol- and obesity-induced fatty liver diseases. Free Radic Biol Med 2008, 44, (7), 1259-72. 6. Browning, J. D.; Horton, J. D., Molecular mediators of hepatic steatosis and liver injury. J Clin Invest 2004, 114, (2), 147-52. 7. Pessayre, D., Role of mitochondria in non-alcoholic fatty liver disease. J Gastroenterol Hepatol 2007, 22 Suppl 1, S20-7. 8. Jezek, P.; Hlavata, L., Mitochondria in homeostasis of reactive oxygen species in cell, tissues, and organism. Int J Biochem Cell Biol 2005, 37, (12), 2478-503. 9. Aiston, S.; Peak, M.; Agius, L., Impaired glycogen synthesis in hepatocytes from Zucker fatty fa/fa rats: the role of increased phosphorylase activity. Diabetologia 2000, 43, (5), 589-97. 10. Brand, M. D.; Affourtit, C.; Esteves, T. C.; Green, K.; Lambert, A. J.; Miwa, S.; Pakay, J. L.; Parker, N., Mitochondrial superoxide: production, biological effects, and activation of uncoupling proteins. Free Radic Biol Med 2004, 37, (6), 755-67. 11. Traverse, J. H.; Nesmelov, Y. E.; Crampton, M.; Lindstrom, P.; Thomas, D. D.; Bache, R. J., Measurement of myocardial free radical production during exercise using EPR spectroscopy. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2006, 290, (6), H2453-8. 12. Balazy, M.; Nigam, S., Aging, lipid modifications and phospholipases--new concepts. Ageing Res Rev 2003, 2, (2), 191-209. 13. Spiteller, G., Are changes of the cell membrane structure causally involved in the aging process? Ann N Y Acad Sci 2002, 959, 30-44. 14. Droge, W., Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev 2002, 82, (1), 47-95. 15. Fernandez-Checa, J. C., Redox regulation and signaling lipids in mitochondrial apoptosis. Biochem Biophys Res Commun 2003, 304, (3), 471-9. 16. Radi, R.; Turrens, J. F.; Chang, L. Y.; Bush, K. M.; Crapo, J. D.; Freeman, B. A., Detection of catalase in rat heart mitochondria. J Biol Chem 1991, 266, (32), 2202834. 17. Fabry, P., [Certain modifications of laboratory diets with various distributions of principal foods.]. Cesk Fysiol 1961, 10, 164-6.
41
18. Folch, J.; Lees, M.; Sloane Stanley, G. H., A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem 1957, 226, (1), 497-509. 19. Chavin, K. D.; Yang, S.; Lin, H. Z.; Chatham, J.; Chacko, V. P.; Hoek, J. B.; Walajtys-Rode, E.; Rashid, A.; Chen, C. H.; Huang, C. C.; Wu, T. C.; Lane, M. D.; Diehl, A. M., Obesity induces expression of uncoupling protein-2 in hepatocytes and promotes liver ATP depletion. J Biol Chem 1999, 274, (9), 5692-700. 20. Rosenbaum, M.; Leibel, R. L.; Hirsch, J., Obesity. N Engl J Med 1997, 337, (6), 396-407. 21. Wasserman, D. H.; Cherrington, A. D., Hepatic fuel metabolism during muscular work: role and regulation. Am J Physiol 1991, 260, (6 Pt 1), E811-24. 22. Vendemiale, G.; Grattagliano, I.; Caraceni, P.; Caraccio, G.; Domenicali, M.; Dall'Agata, M.; Trevisani, F.; Guerrieri, F.; Bernardi, M.; Altomare, E., Mitochondrial oxidative injury and energy metabolism alteration in rat fatty liver: effect of the nutritional status. Hepatology 2001, 33, (4), 808-15. 23. Ghoshal, A. K.; Farber, E., Choline deficiency, lipotrope deficiency and the development of liver disease including liver cancer: a new perspective. Lab Invest 1993, 68, (3), 255-60. 24. Francone, O. L.; Griffaton, G.; Kalopissis, A. D., Effect of a high-fat diet on the incorporation of stored triacylglycerol into hepatic VLDL. Am J Physiol 1992, 263, (4 Pt 1), E615-23. 25. Fromenty, B.; Robin, M. A.; Igoudjil, A.; Mansouri, A.; Pessayre, D., The ins and outs of mitochondrial dysfunction in NASH. Diabetes Metab 2004, 30, (2), 121-38. 26. Yamaguchi, K.; Yang, L.; McCall, S.; Huang, J.; Yu, X. X.; Pandey, S. K.; Bhanot, S.; Monia, B. P.; Li, Y. X.; Diehl, A. M., Inhibiting triglyceride synthesis improves hepatic steatosis but exacerbates liver damage and fibrosis in obese mice with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2007, 45, (6), 1366-74. 27. Savransky, V.; Bevans, S.; Nanayakkara, A.; Li, J.; Smith, P. L.; Torbenson, M. S.; Polotsky, V. Y., Chronic intermittent hypoxia causes hepatitis in a mouse model of diet-induced fatty liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2007, 293, (4), G8717. 28. Caraceni, P.; Domenicali, M.; Vendemiale, G.; Grattagliano, I.; Pertosa, A.; Nardo, B.; Morselli-Labate, A. M.; Trevisani, F.; Palasciano, G.; Altomare, E.; Bernardi, M., The reduced tolerance of rat fatty liver to ischemia reperfusion is associated with mitochondrial oxidative injury. J Surg Res 2005, 124, (2), 160-8. 29. Cahova, M.; Zdychova, J.; Dankova, H.; Kazdova L., Dysregulation of intracellular triacylglycerol breakdown in fatty liver contributes to the development of hepatic insulin resistance. Diabetologia 2009, 52 (supp. 1): S216-217. 30. Cahová, M.; Drahota, Z.; Daňková, H.; Oliyarnyk, O.; Páleníčková, E.; Papáčková, Z.; Kazdová, Z., Ovlivnění metabolismu triacylglycerolů v játrech krátkodobým a chronickým příjmem vysokotukové diety. Časopis lékařů českých 2009, 148 (11): 562.
42
PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala především své školitelce RNDr. Monice Cahové, PhD. za bezmeznou trpělivost, odborné vedení a nehynoucí optimismus při mých nelehkých začátcích i během psaní této diplomové práce. Dále děkuji garantovi mé diplomové práce doc. RNDr. Františku Novákovi, CSc. a panu RNDr. Zdeněku Drahotovi, DrSc za ochotu a mnoho cenných rad. Velký dík patří také kolegům z laboratoře za podporu a příjemné pracovní prostředí.
43
