II. Chromatografické separace 9. Jednotlivé chromatografické metody
Adsorpční, gelová, iontově výměnná, afinitní chromatografie, chromatografie na reverzní a normální fázi
10. Teoretické základy chromatografických metod
Princip separace, separační účinnost, počet teoretických pater, selektivita, rozlišení, kapacita nosiče, stacionární a mobilní fáze, faktory ovlivňující separaci
11. Nosiče (sorbenty)
Materiál, složení, porozita, ligandy, zesítění, fyzikální vlastnosti
12. Uspořádání chromatografického procesu
Kolony, režim provozu, eluční činidla, typy eluce (isokratická, gradientová), detektory, průmyslové kolony, vsádková chromatografie, kontinuální chromatografie (Fixed bed, Moving bed, Simulated moving bed)
13. Aplikace
Potravinářský průmysl, biotechnologie Preparativní chromatografie
II. Chromatografické separace 10. Úvod do chromatografických metod Chromatografie = technika, jež rozděluje látky (molekuly) mezi dvěma fázemi (navzájem nemísitelnými): • Mobilní fáze (eluent) – plyn, kapalina, kapalina v superkritickém stavu • Stacionární fáze (sorbent, matrice) Terminologie: analyt, eluce, mobilita, chromatogram Princip separace: Vzorek je rozpuštěn v mobilní fázi, ta prochází přes sorbent, kde dochází k vratné interakci složek mezi oběma fázemi Jednotlivé složky mají odlišnou rozpustnost v obou fázích odlišnou mobilitu, retenci Čím více je analyt rozpustný ve stacionární fázi – tím déle se zdržuje v systému
Základní dělení chromatografických metod Podle mobilní fáze Kapalinová (LC) Plynová (GC)
Podle druhu interakce molekul analytu se sorbentem Adsorpční Gelová (permeační; GPC) Iontově výměnná (ionexová; IEC) Afinitní chromatografie Podle měřítka a použití: Analytická Preparativní Průmyslová
Opět trochu historie… 1903 M.S. Tswett; Separoval barviva ze zelených listů na koloně tvořené sloupcem křídy
Uspořádání chromatografického procesu Základní uspořádání přibližně stejné u všech typů separací: Sorbent (malé částice, kulovité) tvoří náplň v úzké trubici koloně, kterou prochází mobilní fáze umístěna v zásobníku - čerpadlo (nebo jen rozdílný hydrostatický tlak) Vzorek se vpraví do mobilní fáze na počátku kolony a prochází kolonou (eluce), Průměrná rychlost, kterou se analyt pohybuje kolonou – dána časem, který stráví v mobilní fázi. Mobilní fáze: Jednotné složení po celou dobu eluce – složky směsi vzorku procházejí kolonou různou rychlostí (dáno mobilitou) = isokratická eluce Některé složky se silně váží na sorbent – aby se vytěsnily – mění se složení mobilní fáze: kontinuálně = gradientová eluce v určitých krocích (stupních) = postupná eluce Za kolonou umístěn detektor
Retenční mechanismus Chromatografická separace = dynamický adsorpční proces Molekuly analytu se váží na sorbent na základě různých interakcí: Hydrofobní (nespecifické) –chromatografie na reverzní fázi Polární (dipól – dipól) – chromatografie na normální fázi Iontové (náboj) – iontově výměnná chromatografie Biospecifické – afinitní chromatografi Velikost molekul – gelová filtrace Všechny jsou kompetitivní (molekuly analytu vs. mobilní fáze): Čím silnější interakce analytu na sorbent A čím slabší interakce elučního činidla na adsorpční míst tím déle analyt zadržen tím větší retenční čas
11. Teoretické základy chromatografických metod Distribuce analytu Analyt je v rovnováze mezi dvěma fázemi: Amobilní = Astacionární Rovnovážná konstanta tohoto děje = rozdělovací koeficient K K = c A(stac)/ c A(mob) c = molární koncentrace analytu v dané fázi Retenční čas (tR ) = čas mezi nástřikem vzorku a okamžikem jeho detekce (max.) Mrtvý čas (tM) = čas, za který projde kolonou mobilní fáze Dobré rozdělení – rozdílné retenční časy analytů
Retenční parametry Retenční (kapacitní) faktor k' popisuje rychlost pohybu analytu kolonou - nezávislý na geometrii systému, ale vyjadřuje termodynamický charakter systému sorbent – analyt – eluent. Pro analyt A je definován: k'A = t R - tM / tM t R a tM – snadno získatelné z chromatogramu Nabývá hodnoty k' < 1 k' > 20 1< k' > 5 Retenční čas t R – nepřímo úměrný průtoku eluentu Retenční objem VR vyjadřuje objem eluentu, který prošel kolonou během eluce dané složky, nezávisí na průtoku, ale na geometrii kolony Retenční objem složky se může dělit na: 1. Redukovaný retenční objem – objem eluentu, který prošel kolonou, zatímco analyt byl vázán na povrch sorbentu 2. Mrtvý objem V0 – objem eluentu, který prošel kolonou, zatímco se analyt pohyboval s mobilní fázi; je roven objemu kapalné fáze v koloně a je tudíž stejný pro jakoukoliv složku (pro danou kolonu) Poměr retenčního objemu a mrtvého objemu k – universální a základní retenční parametr k = VR/Vo
Retenční objem VR
Separační účinnost, selektivita a rozlišení Účinnost separace závisí na dvou vlastnostech: 1. Selektivita – vyjádřena poměrem kapacitních faktorů VR1 V 0 dvou píků (a = faktor selektivity) a – charakterizuje separační schopnosti VR 2 V 0 sorbentu pro danou směs složek – nezávisí na účinnosti kolony – nevyjadřuje šířku píků, ale pouze vzdálenosti maxim píků – závisí na charakteru komponentů, druhu a složení eluentu a charakteru vazebných interakcí se sorbentem 2. Šířka píků Rozlišení Vyjadřuje separační sílu celého chromatogafického systému vztaženou na danou složku Je dáno jako poměr vzdáleností mezi maximy dvou píků ke střední hodnotě šířky píku u základní linie Pokud předpokládáme, že píky jsou symetrické R<1 Nerozlišené píky R=1 Rozlišené píky R>1 Rozlišené píky
R
k 1 k 2
VR 2 VR1
1 w1 w2 2
Model počtu teoretických pater a účinnost kolony Optimální separace – ostré, symetrické chromatografické píky Rozšiřování píků způsobené difúzí – nevyhnutelné, ALE snaha co nejmenší Proto je někdy vhodné stanovit účinnost kolony
Model počtu teoretických pater Předpoklad – chromatografická kolona rozdělena do velkého počtu oddělných vrstev = teoretická patra Každé patro – rovnováha analytu mezi mobilní a stacionární fází Analyt prochází kolonou díky přenosu mobilní fáze v rovnovážném stavu z jednoho patra do druhého L délka kolony N počet teoretických pater (čím víc – tím líp) HETP výška ekvivalentní teoretickému patru (čím menší – tím lepší)
Vztah mezi délkou kolony a počtem teoretických pater HETP = L / N Teoretická patra neexistují pomáhají pouze pochopení problému slouží ke stanovení účinnosti kolony; počet teoretických pater skutečné kolony se dá určit z charakteru chromatografického píku po eluci, kde w1/2 je šíře píku v polovině výšky:
5.55 tR N w1 / 2 2
2
Stejná kolona může mít pro každý analyt ve směsi jiný počet teoretických pater
Selektivita,rozlišení a počet pater Rozlišení pak můžeme vyjádřit pomocí počtu teoretických pater N faktoru selektivity a R retenčních faktorů k’:
N 4
a 1 1 k B a k B
Pro vysoké rozlišení – všechny tři členy maximální: N – prodloužení kolony (ALE tím se může zvýšit šířka píků); měnit tento parametr - málo efektivní HETP – zmenšením velikosti částic sorbentu Kapacitní faktor k’ – změnou teploty (GC) složením mobilní fáze (LC); tento člen - nejmenší vliv na rozlišení Faktor selektivity a – změnou složení mobilní fáze, teploty kolony, složení stacionární fáze; změna parametru nejúčinnější
Šířka píků chromatogramu Van Deemterova rovnice Reálné chování uvnitř chromatografické kolony: Dochází k ustanovení rovnováhy mezi stacionární a mobilní fází ALE: rychlost ekvilibrace je pomalejší než-li uvažuje model počtu teoretických pater (ekvilibrace je nekonečně rychlá) Výsledný tvar píků chromatogramu ovlivněn: rychlostí eluce způsobem jakým se molekuly opakovaně pohybují mezi stacionární a mobilní fází difúzí přenosem hmoty mezi fázemi Výsledkem je Van Deemterova rovnice - popisuje závislost výšky ekvivalentní teoretickému patru na rychlosti průtoku mobilní fáze a zahrnuje vliv zmíněných parametrů, kde u je průměrná rychlost toku mobilní fáze, A, B a C jsou faktory způsobující rozšiřování píků :
HETP A B u C u použití: stanovení optimálního průtoku mobilní fáze
Van Deemterova rovnice Jednotlivé členy rovnice představují: A - Eddyho difúze Molekuly rozpouštědla procházejí nahodile (různým způsobem) přes sorbent - každá cesta je jinak dlouhá - rozmývání píků
http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/
Kde dp je průměr částic a l je konstanta závisející na A = 2ldp distribuci velikostí částic (čím užší distribuce, tím menší l (avšak oba parametry zvyšují tlak na koloně) - zmírňuje se použitím sorbentu o jednotné a malé velikosti částic, homogenním plněním kolony - aby nevznikal mrtvý objem B - Difúze podél kolony Koncentrace analytu uvnitř pásu větší než na jeho okrajích - analyt difunduje ze středu na kraj pásu - rozšíření píku. Kde Dm je difúzní koeficient analytu v mobilní fázi, g B = 2gDm vyjadřuje zmírnění difúze způsobem plnění kolony
- vyšší rychlost m. f. - zkrácení doby zdržení analytu v koloně - zmírnění podélné difúze (u kapalin molekulární difúze o 5 řádů nižší než u plynů u LC zanedbat
Šířka píků chromatogramu C - Přenos hmoty Analyt přechází z mobilní fáze do stacionární - určitou dobu trvá, než se ustanoví rovnováha Při vysoké rychlosti toku mobilní fáze a silné afinitě analytu k sorbentu – analyt v mob. fázi se bude pohybovat před analytem ve stacionární fázi – rozšíření píku. Nejvíce sporný parametr; u moderních sorbentů kombinuje dva efekty: Adsorpční kinetiku – téměř zanedbatelná v porovnání s difúzí Přenos hmoty mezi částicemi (vlivem difúze) Kde dp je průměr částice, Dm je difúzní koeficient analytu v mobilní fázi, je koeficient daný 2 C = d P / Dm distribucí velikostí pórů, tvarem a distribucí velikostí částic
Různé složky mají různou závislost HETP na rychlosti toku mobilní fáze tou samou kolonou - Pro všechny členy můžeme nalézt optimální rychlost toku mobilní fáze
HETP A B u C u
C A B
12. Jednotlivé chromatografické metody Gelová permeační chromatografie (GPC) Speciální případ z chromatografických separací dělení v závislosti na velikosti molekul (čím větší molekula, tím menší retence v systému – nepronikne do pórů stacionární fáze) interakce analytu na sorbent nežádoucí Patří obecně do tzv. Size Exclusion Chromatography (SEC) Sorbent: nerozpustné, hydrofilní, porézní částice (gel) Uspořádání procesu: isokratické (separace podle odlišné rychlosti pohybu molekul kolonou) Použití: Separace molekul, které se výrazně liší ve velikosti při volbě vhodného gelu mohou být velké molekuly zcela vymyty ze systému, malé molekuly zůstanou v gelu a mohou být vyloučeny později Příklad – odstranění solí nebo ethanolu z proteinů Frakcionace – separace molekul s podobným rozsahem velikostí – nutnost pečlivého výběru gelu a podmínek separace
Ionexová chromatografie (IEC) Jiný název: iontově-výměnná Separace na základě náboje Nízká energetická náročnost Univerzální použití Molekuly jsou vázány na základě iontových sil k opačně nabitým skupinám imobilizovaným v matrici
Iontové sorbenty (iontoměniče, ionexy) – hydrofilní matrice (styren, DVB, celulosa, agarosa, dextran, zeolit, SiO2) s kovalentně vázanými funkčními skupinami nesoucími náboj a nevázáné ionty opačného znaménka: Anex – výměna aniontů (+ náboj) =N+=, =NH2, -NH3 Katex – výměna kationtů (- náboj) -SO32-, -CH2SO3-, -COOVliv pH na náboj molekul (isoelektrický bod) Přídavek solí – desorpce
Uspořádání: isokraticky x gradient (průmyslové aplikace) Separace iont – neelektrolyt, iont –iont,
Chromatografie s hydrofobní interakcí (HIC) Matrice bez náboje, slabě hydrofilní (gel na bázi polysacharidů, např. Agarosa) navázány hydrofobní skupiny (alkylové řetězce, fenylové kruhy) vysoká mechanická stabilita a rigidita slabé interakce: – polární – Van der Waalsovy síly Použití Proteiny – na povrchu hydrofobní skupiny různá síla interakce hydrofobních skupin se sorbentem zvýšení hydrofobní interakce – zvýšením iontové síly roztoku (např. přídavkem neutrální soli) Adsorpce vzorku na matrici při vysoké iontové síle roztoku Selektivní postupná desorpce (kontrolované podmínky) analytu z matrice – například: snižováním iontové síly (voda nejsilnější) zvyšováním pH eluentu přidáním detergentu.. apod. Uspořádání: gradient (kontinuální x stupňovitý)
Chromatografie na reverzní fázi (chromatografie s obrácenými fázemi) Obdoba HIC – vyšší obsah hydrofobních skupin silnější interakce s analytem (u proteinů by došlo k denaturaci) Použití: malé molekuly peptidů Sorbent: nepolární (silikagel modifikován nepolární složkou, Al2O3, umělé polymery, aktivní uhlí) rigidní, vysoká pevnost částic, makroporézní Eluent: polární (organická rozpouštědla; CH3OH, alkoholy ve směsi s vodou - isopropanol, nitrily - acetonitril, ether, voda)
Chromatografie na normální fázi Sorbent: polární (silikagel modifikován polární složkou SiO2xH2O – silně kyselý povrch; pH = 3-5, Al2O3, Florisil - MgSiO3) Eluent: nepolární (hexan, cyklohexan) O
O
O
Si
Si
O
O
R
R
R=
O Si
Si O
–H – NH2 – CN – C18 –C –N–C – Si – C
pol. pol. pol. nepol. nepol. nepol. nepol.
Afinitní chromatografie Biospecifická vazba mezi molekulou a specifickou molekulou (ligandem) vázaným na povrchu matrice Interakce: Van der Waals hydrofobní sférická elektrostatická Matrice: Sepharosa, celulosa Ligand – látka s vysokou specifitou k separované látce (barvivo, protein, kofaktor: NAD, 5-AmP) Imobilizace ligandu na matrici: aktivace matrice (epichlorhydrin) spacer (raménko), kovalentní vazba Afinita matrice – analyt: matrice specifické k určitému konkrétnímu analytu (např. enzym – analog substrátu, inhibitor, či specifická protilátka) matrice specifické ke skupině analytů (skupina ligandů, např. kofaktory) Uspořádání: adsorpce – desorpce Desorpce: změnou elučních podmínek, např. přidáním specifického kofaktoru, změnou pH, iontové síly)
13. Průmyslová chromatografie – scale-up Scale-up – založen na laboratorních testech Laboratorní podmínky – teoretický základ (účinnost) Průmyslové podmínky – další faktory: průtočná rychlost, velikost vzorku, doba cyklu…atd. Výhody použití chromatografických metod v průmyslu: Universální metoda Jednoduchý systém Mírné pracovní podmínky Získání až 100% čistoty produktů Možnost zvýšení měřítka bez ztráty v čistotě produktu a rozlišení
Princip zvětšení měřítka: Veškeré zpracovávané objemy (objem vrstvy, promývání, eluční objem) lze zvětšovat v poměru k objemu vzorku Délka kolony se udržuje konstantní (může se měnit průměr kolony, počet kolon) Lineární rychlost prodění se udržuje konstantní (celkové retenční časy zůstávají konstantní) Složení vzorku udržovat konstantní (nemění se pak kritické parametry koncentrace, viskozita, pH, iontová síla)
Volba stacionární fáze Úspěch separace dán selektivitou a rozlišením stacionární fáze Průměr částic (x tlak, průtok) Rigidita (pokles tlaku vlivem stlačení sorbentu – problém u velkých kolon) Distribuce velikostí částic (homogenita, malé částice – vyšší hustota plnění – kratší cesty toku – snížení průtokové rychlosti) Gely • Trojrozměrná struktura, zesítění – mechanická pevnost, elasticita • Bobtnání: před plněním – dokonale nabobtnalý gel • Inertní matrice Stlačitelné gely (Dextrany, celulosa, agarosa) – spodní část vrstvy – deformace částic – zvýšení odporu – pokles lineární rychlosti proudění Vyšší průměr vrstvy + silně stlačitelné matrice = nulový průtok Náhrada: série krátších kolon Použití: frakcionace velkých molekul Rigidní gely Matrice z rigidních částic – pokles tlaku přímo úměrný výšce vrstvy Použití: odsolování, možno velké průměry vrstvy (> 1 m), výška 50 cm
Nanášení vzorku Množství a koncentrace vzorku – kritické parametry Isokratické separace (GPC) – nepříznivý vliv na rozlišení Laboratorní techniky: V vzorku = 2 – 3 % V vrstvy Průmyslové aplikace: V vzorku = 5 – 15 % V vrstvy (ekonomické důvody, překryv píků – viz. obr.) Řešení – odebírání frakcí – střední část zóny (vysoká čistota), zbytek – znovu chromatografický proces Desorpční techniky (IEC, AC) Množství vzorku dáno kapacitou nosiče Hmotnost vzorku důležitější než objem – lze použít pro zkoncentrování Nutné laboratorní testy (známé množství produktu ve vzorku, objem nosiče)
Rychlost toku mobilní fáze Kritický parametr v průmyslových a poloprůmyslových aplikacích Vliv nosiče, kolony a dalšího zařízení Matrice: Rigidní – průtoková rychlost roste lineárně s tlakem Polo-rigidní – do určité výše tlaku se chovají rigidně, pak se průtok nezvyšuje (maximum) Stlačitelné – dosáhnou maximální průtok a pak s vyšším tlakem průtok klesne (kritický tlak!) GPC a frakcionační chromatografie: Maximální rozlišení při průtoku 1 – 3 ml/cm-2 h-1 optimální průtok Průmyslové aplikace - potřeba 10 – 20 ml/cm-2 h-1 Separace skupin: Rozlišení není limitující faktor Průtok běžně: 50 - 100 ml/cm-2 h-1 IEC a AC: 20 – 150 ml/cm-2 h-1
Chromatografické kolony Materiál: Nerezové (odolné, sterilizovatelné, chemicky odolné, neprůhledné, korozívní) Skleněné (organické solventy, autoklávování, průhledné, křehké) Plastové (vodné roztoky, cena, pružnost – odolnost, průhledné; akrylát, polypropylen) Frity, podložení vrstvy sorbentu, O-kroužky = těsnění, Délka kolony GPC (a jiné isokratické techniky) – kritický parametr (délka = rozlišení, problém u stlačitelných gelů) zapojení série kolon (celkový pokles tlaku v systému může být vysoký ALE tlak v jednotlivých kolonách nižší, snadné a homogenní plnění, při zacpání vrchní vrstvy – kolony snadné čištění) IEC, HIC a AC – délka není limitující (kapacita nosiče ano)
14. Uspořádání chromatografického procesu
Chrom atografiekolonová Kontinuální
M B (m ovingbed)
Diskontinuální
SM B (sim ulatedM B)
Vsádková chromatografie (diskontinuální) + + + -
Velká flexibilita nástřik Standardní podmínky procesu Dělení více složek naráz Nízká účinnost (gradientová eluce – zvýšení efektivity) Produkty zředěné (elucí analytů) Nákladné (vysoká spotřeba sorbentu i eluentu)
desorbent
Tok mobilní fáze
Uspořádání: sorpce – desorpce kolona – opakovaný nástřik vzorku, střídavě s desorbentem
extrakt
rafinát
Kontinuální chromatografie Důvody pro skutečně kontinuální systém: Vsádkový systém – drahá technika Dlouhá perioda mezi nástřiky
Moving bed chromatography (MB) „Chromatografie s pohyblivým ložem“ Princip - pohybuje se: vrstva sorbentu i mobilní fáze - protiproudé uspořádání
Sorbent
Eluent Extrakt
Nástřik
Rafinát
Moving bed Skutečný pohyb sorbentu (true moving bed TMB) – technologicky náročné Teoretický případ Rafinát – méně zadržovaný analyt Extrakt – více zadržovaný analyt Nižší spotřeba stacionární fáze i eluentu
Vzorek
Desorbent – kontinuálně přidáván na jeden konce kolony, dělená směs dávkována doprostřed; dělené složky se pohybují v opačných směrech a kontinuálně dělí na obou koncích kolony
Tok kapalné fáze
Tok pevné fáze
Princip: Prstenec naplněný sorbentem
Moving bed (MB) Uvnitř cirkuluje eluent
Sorbent cirkuluje proti směru toku eluentu
Analyt se silnou afinitou k sorbentu – pohyb se sorbentem
Nástřik binární směsi
Nástřik
Extrakt
Nástřik
Eluent
eluent sorbent
Analyt s nízkou afinitou k sorbentu – pohyb s eluentem
Rafinát
Simulated moving bed (SMB) TMB - teoretický případ Při reálných aplikacích SMB
F
Ex
1
2
3
4
A
4
3
4
s
l
1
B
Raf
3
Elu
3
4
D
1
3
2
2 F
Raf
F
4
C
F
Raf
Tok eluentu
1
1 2
Raf
4
3
2
Elu
Ex
Elu
1 2
Ex
Ex
Elu
Vytvoření hypotetického toku pevné fáze posunem vstupních a výstupních míst
QEx
QE
Sekce I 3
4 Kapalná f.
2
QRe
Sekce II
Sekce IV
Pevná f.
1 8
QF
5
Sekce III
6 7
QRa
Simulated moving bed
Více adsorbující
Kapalná f.
Desorbent
Nástřik Pevná f.
Nástřik
Méně adsorbující
www.organo.co.jp
Průměr kolony 3.2 m, výška 15 m
www.organo.co.jp
15. Aplikace chromatografických procesů Potravinářský průmysl, biotechnologie, farmacie
Separace glukosy a fruktosy Purifikace sacharidů o vysoké čistotě (xylosa, arabinosa, trehalosa) Oddělení glukosy a xylosy z hydrolyzátů biomasy Separace dextranů Frakcionace řepné melasy na rafinosu, sacharosu, glukosu a betain Separace maltitolu o vysoké čistotě Separace vitamínů E (a, b, c, d tokoferol) Čištění proteinů (enzymů) Odsolování AK, čištění AK (směs Pro – Lys, výroba Phe) Produkce inositolu Separace kyselin mléčné a citrónové z fermentačního média Separace nasycených mastných kyselin od nenasycených Separace mono- a triglyceridů Oddělení alfa-pinenu od beta-pinenu Výroba Cyclosporinu (vysoká čistota)
Dělení optických izomerů Separace chirálních epoxidů Výroba čistých enatiomerů z racemických směsí
Chemický průmysl
Separace olefinů a parafinů
Výroba a purifikace methanolu
Čištění n-parafinů
Separace ethylbenzenu
Separace toluenu a isopropylbenzenu ze směsi
Odsolení glycerinu
Separace ethanolu z vodných roztoků
Čištění cukerných roztoků Zařízení: • Vnitřní průměr kolony: • Výška: • Kapacita sorbentu: • Adsorbent: • Separované látky:
Výsledky separace:
108 mm 1600 mm x 10 kolon 147 l Amberlite CG6000 Na+ DP2
