IDENTIFIKASI DAN PENETAPAN KADAR EPIGALOKATEKIN GALAT DARI FRAKSI ASAM FENOLIK LIMBAH TEH Yohanes Martono Program Studi Kimia, Fakultas Sains dan Matematika Universitas Kristen Satya Wacana Jl. Diponegoro 52-60 Salatiga e-mail:
[email protected]
ABSTRAK Limbah teh ternyata masih mengandung senyawa fenolik yang dapat bermanfaat bagi kesehatan. Senyawa fenolik limbah teh tersebut dapat dipisahkan menjadi fraksi-fraksi asam fenolik yaitu: asam fenolik bebas, asam fenolik teresterifikasi, dan asam fenolik glikosida. Salah satu senyawa fenolik yang banyak terdapat dalam teh adalah epigalokatekin galat (EGCG). Identifikasi dan penetapan kadar EGCG dari fraksi asam fenolik limbah teh dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Kondisi operasional KCKT adalah kolom Eurosphere RP C-18 (250 х 4,6 mm i.d., 5 μm) dengan fase gerak berupa campuran asam orto-fosfat 0,1%, metanol, asetonitril, air (14 : 1 : 3 : 7 v/v/v/v) pada pH = 4,00 dan kecepatan alir 1,2 mL/menit serta dideteksi pada panjang gelombang 280 nm. Hasil penelitian ini menunjukkan Senyawa EGCG berada dalam bentuk asam fenolik bebas dan fenolik teresterifikasi dengan kadar 8,66 dan 5,33 mg/g ekstrak, secara berurutan. Kata kunci: EGCG, asam fenolik, limbah teh
Pendahuluan Teh merupakan bahan minuman penyegar yang sudah lama dikenal oleh masyarakat. Teh yang disajikan dalam bentuk minuman dikonsumsi sangat luas di seluruh dunia. Beberapa kandungan senyawa kimia dalam teh dapat memberi kesan warna, rasa, dan aroma yang memuaskan peminumnya. Berbekal kenyataan lama bahwa teh dipakai sebagai obat dan sarana meditasi dalam upacara ritual keagamaan, penelitian dalam dasawarsa terakhir abad 20 ini menunjukkan bukti bahwa teh dapat menjaga kesehatan tubuh manusia. Berbagai efek menyehatkan dari teh tersebut disebabkan karena kandungan fitokimia dari teh. Senyawa fitokimia yang banyak terkandung di dalam teh adalah katekin. Katekin merupakan golongan senyawa polifenolik yang mempunyai gugus hidroksi yang banyak atau sering disebut sebagai polihidroksi. Senyawa turunan katekin yang terdapat pada teh adalah: (-)-epikatekin (EC), (-)-epigalokatekin (EGC),(-)-epikatekin galat (ECG) dan (-)-epigalokatekin galat (EGCG). EGCG merupakan senyawa fitokimia yang terbesar yang terkandung dalam teh, yaitu 60 – 70% dari total katekin (Svobodova dkk., 2003). Berbagai studi telah menunjukkan bahwa katekin dan polifenol teh merupakan senyawa yang efektif meredam radikal bebas seperti oksigen reaktif
termasuk superoksida, radikal peroksi, oksigen singlet, dan radikal nitrogen seperti peroksinitrit, dan juga asam hipoklorit (Frei dan Higdon, 2003). Indonesia termasuk dalam 5 negara terbesar pengekspor teh selain India, China, Sri Lanka, dan Kenya. Produksi ekspor teh di Indonesia mencapai 6% dari total ekspor teh dunia. Selain itu, saat ini juga banyak sekali diproduksi minuman teh botol. Bahkan, minuman teh botol ini telah menjadi minuman idola bagi masyarakat Indonesia. Berbagai proses produksi tadi pastilah menghasilkan limbah teh yang cukup besar. Limbah teh tersebut selama ini belum dimanfaatkan secara khusus dan hanya dibuang begitu saja. Sebuah studi di Iran menunjukkan bahwa limbah teh ternyata masih memiliki antioksidan yang tinggi (Daniells, 2005). Hal ini menunjukkan bahwa sebagian senyawa katekin khususnya EGCG dimungkinkan masih terkandung dalam limbah teh. Jika limbah teh ini diekstraksi dengan metoda yang tepat untuk mengekstraksi senyawa EGCG dalam teh dan selanjutnya melakukan purifikasinya, maka peluang untuk dihasilkan produk yang bermanfaat untuk kesehatan dan bernilai ekonomis tinggi sangat terbuka lebar. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memisahkan fraksi asam fenolik limbah teh, kemudian mengidentifikasi dan menetapkan kadar EGCG fraksi asam fenolik limbah teh menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).
OH OH HO
O
OH O
OH
OH O OH OH
Gambar 1. Struktur kimia EGCG
Metodologi Bahan Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel limbah teh berasal dari industri minuman di Jawa Tengah. EGCG (derajat HPLC, minimal 80%), asetonitril, metanol absolut dengan derajat Liquid Chromatography serta asam orto-fosfat 85% (derajat pro-analisis) (Merck), etanol (PA Merck) dan akuabides (Ikhapharmindo Putramas).
Ekstraksi dan Fraksinasi Asam Fenolik Limbah Teh (Zadernoskwi dkk., 2002) Sampel yang telah didefatisasi ditimbang sebanyak 50 g. Sampel dimaserasi menggunakan pelarut etanol 50% (v/v) dan diekstrak sebanyak 6 kali masing-masing selama 1
jam sambil digoyang dengan mesin shaker. Campuran disaring dan filtrat dikumpulkan kemudian dipekatkan dengan rotaryevaporator. Ekstrak siap difraksinasi. Ekstrak sampel diasamkan dengan HCl 6 M sampai pH 2, kemudian disari 5 kali menggunakan pelarut eter (2:1, v /v) pada suhu kamar. Ekstrak eter dikumpulkan dan dikeringkan dengan rotaryevaporator pada suhu 40о C. Residu disebut sebagai fraksi asam fenolik bebas (AFB). Fase air diatur pHnya sampai pH 7 dengan NaOH 2 M dan dipekatkan dengan rotaryevaporator. Residu ditambah 20 ml NaOH 4 M dan dialiri gas N2 selama 4 jam pada suhu ruang. Larutan diasamkan dengan HCl 6 M sampai pH 2 dan disari dengan eter seperti prosedur sebelumnya. Ekstrak eter dikumpulkan dan dikeringkan dengan rotaryevaporator pada suhu 40о C. Residu disebut sebagai fraksi asam fenolik teresterifikasi (AFE). Fase air diatur pHnya sampai pH 7 dengan NaOH 2 M dan dipekatkan dengan rotaryevaporator. Residu ditambah HCl 2 M sebanyak 50 ml dan dipanaskan 95о C selama 30 menit. Setelah dingin, filtrat disari dengan eter seperti prosedur sebelumnya. Ekstrak eter dikumpulkan dan dikeringkan dengan rotaryevaporator pada suhu 40о C. Residu disebut sebagai fraksi asam fenolik glikosida (AFG). Masing-masing fraksi yang diperoleh dilarutkan ke dalam 50 ml NaHCO 3 5 % (pH = 8) dan disari 5 kali dengan eter sebanyak 5 kali guna menghilangkan sisa lemak yang tertinggal pada fraksi, dan sari eter dibuang. Fase air diasamkan dengan HCl 6 M sampai pH 2 dan disari 5 kali dengan eter seperti prosedur sebelumnya. Masing-masing residu dilarutkan dengan etanol dan siap dianalisa menggunakan KCKT. Instrumentasi dan Kondisi Operasional KCKT Sistem KCKT terdiri dari HPLC Knauer GmBH-Jerman Model Smart Line Series dengan detektor UV (Smart Line UV Detektor 2500 A 5140), pompa ganda Smart Line Pump 1000 V 7603, sampel injektor dengan volume 20 μL Rheodyne Loop model A135. Kolom yang digunakan adalah Eurosphere C-18 (250 × 4,6 mm i.d., 5μm). KCKT fase terbalik yang digunakan menggunakan sistem elusi fase gerak isokratik yaitu campuran asam orto-fosfat 0,1%, air, asetonitril, metanol (14 : 7 : 3 : 1 v/v/v/v) pada pH = 4,00 dengan kecepatan alir 1,2 mL/min serta dideteksi pada panjang gelombang 280 nm.
Hasil dan Pembahasan Ekstraksi dan Purifikasi EGCG Hasil yang diperoleh dalam % yield proses fraksinasi asam fenolik ekstrak limbah teh ditunjukkan pada Tabel 1. dibawah ini : Tabel 1.
Data % yield proses fraksinasi asam fenolik ekstrak limbah teh Fraksi asam fenolik AFB AFE AFG
% yield (b/b) 9,92 0, 14 0,4
Dari hasil yang diperoleh, % yield terbesar asam fenolik ekstrak limbah teh adalah asam fenolik bebas (AFB) diikuti dengan fraksi asam fenolik glikosida (AFG) dan fraksi asam fenolik teresterifikasi (AFE). Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa polifenol dalam ekstrak limbah teh
sebagian besar berada dalam bentuk fenolik bebasnya. Untuk memastikan kandungan EGCG dalam fraksi dilakukan identifikasi dan penetapan kadar EGCG mengguakan KCKT. Senyawa fenolik dapat diperoleh dengan cara dirubah menjadi asam fenolik dan diekstrak dengan dietil eter (Shahidi dan Nazck, 2004; Zadernoskwi dkk., 2002). Asam-asam fenolik tersebut terdapat dalam bentuk asam fenolik bebas, asam fenolik ester terikat, dan asam fenolik glikosida terikat (Zadernoskwi dkk., 2002). Faktor lain yang mempengaruhi efisiensi dari ekstraksi pelarut adalah pH. pH dari medium ekstraksi akan menentukan tingkat kelarutan dari senyawa terlarut. Fraksinasi ekstraks pada pH yang bervariasi telah digunakan untuk memisahkan asam-asam fenolik bebas, teresterifikasi, dan senyawa terikat yang tidak larut seperti glikosida. Penyesuaian pH hingga pH 2 dengan HCl yang diikuti dengan ekstraksi menggunakan pelarut dietil eter telah digunakan untuk memisahkan asam galat,(+)-katekin,(-)epikatekin, p-asam kumarat, asam ferulat, myrisetin, kuersetin, dan kaempferol (EstribanosBailon dan Santos-Buelga, 1998). Berdasar hasil analisa KCKT dapat diidentifikasi kandungan EGCG pada masing-masing fraksi asam fenolik. Apabila dibandingkan dengan profil kromatogram ekstrak limbah teh dengan fraksi asam fenolik (lihat Gambar 2, 3, 4, dan 5), maka dapat dikatakan bahwa proses fraksinasi dapat memisahkan senyawa EGCG dengan senyawa lain. Hal ini terlihat dari jumlah kromatogram fraksi asam fenolik lebih sedikit dibanding ekstrak limbah teh.
Gambar 2. Profil kromatogram ekstrak limbah teh. Kromatogram EGCG adalah kromatogram 5 (tR = 15,633). Parameter KCKT: Fase diam : Eurosphere RP C-18 (250 × 4,6 mm, 5μm), Knauer GmBH-Jerman Fase gerak : Campuran asam orto-fosfat 0,1% : air : asetonitril : metanol dengan perbandingan (14 : 7: 3 : 1 v/v/v/v) pH = 4,00 Kecepatan alir : 1,2 mL/min. Volume injeksi (loop) : 20μL. Detektor : UV 280 nm
Gambar 3.
Profil kromatogram AFB. Kromatogram EGCG adalah kromatogram 2 (tR = 14, 317). Kondisi operasional HPLC sama dengan Gambar 2.
Gambar 4. Profil kromatogram AFE. Kromatogram EGCG adalah kromatogram 4 (tR = 14, 650). Kondisi operasional HPLC sama dengan Gambar 2.
Gambar 7. Profil kromatogram AFE. Kromatogram EGCG (2) tidak terkuantitasi. Kondisi operasional HPLC sama dengan Gambar 2.
Pada Gambar 3, 4, dan 5 menunjukkan bahwa senyawa EGCG sebagian besar berada dalam bentuk asam fenolik bebas (AFB) dan teresterifikasi (AFE), dan sejumlah kecil dalam bentuk asam fenolik glikosidanya (AFG). Secara kuantitatif, kadar EGCG (mg/g ekstrak) dalam bentuk asam fenolik bebas lebih besar dibandingkan dalam bentuk teresterifikasinya, yaitu 8,66 dan 5,33 secara berurutan. Kadar EGCG setelah difraksinasi dalam bentuk AFB juga lebih besar dari pada dalam ekstrak limbah teh. Hasil ini mendukung bahwa proses fraksinasi dapat digunakan untuk mengekstraksi dan mempurifikasi senyawa EGCG limbah teh industri.
Data kadar EGCG dan profil histogram ekstrak beserta masing-masing fraksi asam fenolik dapat dilihat pada Tabel 2. dan Gambar 6.
Tabel 2.
Kadar EGCG (mg/g ekstrak) ekstrak dan fraksi asam fenolik limbah teh Jenis sampel Kadar EGCG (mg/g ekstrak) Ekstrak limbah teh 3,57 AFB 8,66 AFE 5,33 AFG tidak terkuantitasi
Kadar EGCG (mg/g ekstrak)
Profil Kadar EGCG 10
5
0 Ekstrak
AFB
AFE
AFG
Jenis sampel
Gambar 6. Kadar EGCG (mg/g ekstrak) ekstrakdan fraksi asam fenolik limbah teh Kandungan senyawa polifenol teh yang sebagaian besar adalah EGCG sangat dipengaruhi oleh proses pengolahannya. Kontak udara dan proses pengolahan dengan panas dapat menyebabkan proses fermentasi oksidatif. Selain mengoksidasi senyawa polifenol, proses ini juga dapat menyebabkan pemutusan ikatan polimer senyawa polifenol menjadi monomermonomer senyawa fenolik bebasnya. Hal ini menyebabkan kadar EGCG dalam bentuk fenolik bebas menjadi meningkat. Dalam penelitian ini, selain dalam bentuk fenolik bebas, EGCG juga
ditemui sebagai fenolik yang teresterifikasi. Senyawa polifenol dalam teh sebagian besar teresterifikasi dengan senyawa asam galat (Zhen, 2002). Kesimpulan Senyawa EGCG fraksi asam fenoli limbah berada dalam bentuk fenolik bebas dan fenolik teresterifikasi dengan kadar 8,66 dan 5,33 mg/g ekstrak, secara berurutan. Ucapan Terimakasih Peneliti mengucapkan terimakasih kepada Kopertis wilayah VI Departemen Pendidikan Nasional yang telah memfasilitasi jalannya penelitian ini dan P.T. Coca-cola Indonesia yang telah menyediakan sampel. Daftar Pustaka Daniells, Stephen. 2005. Tea Waste Rich With Extractable Antioxidants. http://www.nutraingredients.com/news/ng.asp?id=64274-green-tea-antioxidants-blacktea Frei, Balz dan Higdon, Jane V. 2003. Antioxidant Activity of Tea Polyphenols In Vivo: Evidence from Animal Studies. Proceedings of the Third International Scientific Symposium on Tea and Human Health: Role of Flavonoids in the Diet. American Society for Nutritional Sciences: 3275S-3284S Svobodova, A., Psotova, J., and Walterova, D., 2003, Natural phenolics in prevention of UVInduced Skin Damage (A review), Biomed. Papers, 147(2), 137-145. Saito, S.T., Welzel, A., Suyenaga, E.S., dan Bueno, F. 2006. A Method for Fast Determination of Epigallocatechin gallate (EGCG), epicatechin (EC), catechin (C) and caffeine (CAF) in green tea using HPLC. Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 26(2): 394-400 Shahidi,F dan M. Naczk. 2004. Phenolics in Food and Neutraticals. CRC PRESS, Boca Raton, Florida. Zadernowski, R., Naczk, M., Nowak-Polakowska, H. 2002. Phenolic Acid of Borage (Borago officinalis L.) and Evening Primrose (Oenothera biennis L.). AOCS Press: Vol. 79.No.4, 335 – 338. Zhen, Y., 2002, Tea, Bioactivity and Therapeutic Potential. P 1, 57-65, Taylor and Francis, New York.
