FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN
Academiejaar 2009 - 2010
Identificatie en screening van kandidaatgenen voor aorta aneurysma’s
Alexander SCHAUWVLIEGHE
Promotor: Prof. Dr. B. Loeys
Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot
MASTER IN DE GENEESKUNDE
Inhoudstafel __________________________________________________________________________________
Inhoudstafel Inhoudstafel _______________________________________________________________ I Voorwoord _______________________________________________________________ III Abstract ___________________________________________________________________ 1 1.
Inleiding ______________________________________________________________ 3 1.1.: Wat zijn aorta aneurysma’s? _________________________________________________ 3 1.2.: Epidemiologie _____________________________________________________________ 3 1.3: Etiologie___________________________________________________________________ 3 1.3.1: Opbouw bloedvat __________________________________________________________________ 3 1.3.2: Opbouw gladde spiercel _____________________________________________________________ 4 1.3.3: Wat zijn de oorzaken van een aorta aneurysma? __________________________________________ 4
1.4: Pathogenese________________________________________________________________ 6 1.5: Classificatie ________________________________________________________________ 7 1.6: Kliniek ____________________________________________________________________ 8 1.7: Diagnose __________________________________________________________________ 8 1.8: Evolutie ___________________________________________________________________ 9 1.9: Behandeling _______________________________________________________________ 9 1.9.1: Behandeling van risicofactoren _______________________________________________________ 9 1.9.2: Medische behandeling _____________________________________________________________ 10 1.9.2: Chirurgische behandeling ___________________________________________________________ 10 1.9.2.1: Methode_____________________________________________________________________ 10 1.9.2.1.1: Aorta ascendens aneurysma’s: _______________________________________________ 10 1.9.2.1.2: Booganeurysma’s _________________________________________________________ 10 1.9.2.1.3: Endovasculaire stenting_____________________________________________________ 11 1.9.2.2: Wanneer opereren? ____________________________________________________________ 11 1.9.2.1: Asymptomatische patiënten ___________________________________________________ 11 1.9.2.2: Symptomatische patiënten ____________________________________________________ 11 1.9.3: Seriële beeldvorming ______________________________________________________________ 11
1.10: Embryologie _____________________________________________________________ 12
2.
Marterialen en Methoden ________________________________________________ 14 2.1: Literatuuronderzoek _______________________________________________________ 14 2.2: Werkwijze ________________________________________________________________ 14 2.3: Gebruikte labotechnieken ___________________________________________________ 14 2.3.1: Polymerase Chain Reaction (PCR) ___________________________________________________ 14 2.3.1.1: Principe _____________________________________________________________________ 14 2.3.1.2: Touch-Down PCR _____________________________________________________________ 15 2.3.1.3: Elementen mastermix __________________________________________________________ 15 2.3.1.4: PCR-toestel __________________________________________________________________ 17
I
Inhoudstafel __________________________________________________________________________________ 2.3.2: Agarosegelelektroforese ____________________________________________________________ 17 2.3.2.1: Principe _____________________________________________________________________ 17 2.3.2.2: Protocol _____________________________________________________________________ 17 2.3.3: Sequencing ______________________________________________________________________ 18 2.3.3.1: Principe _____________________________________________________________________ 18 2.3.3.2: Analyse _____________________________________________________________________ 19 2.3.4: Koppelingsonderzoek ______________________________________________________________ 20 2.3.4.1: Wat is koppelingsonderzoek? ____________________________________________________ 20 2.3.4.2: Lod-score____________________________________________________________________ 20 2.3.4.3: Mastermix ___________________________________________________________________ 21 2.3.4.4: Protocol _____________________________________________________________________ 22 2.3.4.5: Analyse _____________________________________________________________________ 23
2.4: Doelstelling_______________________________________________________________ 23
3. Resultaten ______________________________________________________________ 24 3.1: Resultaten literatuuronderzoek ______________________________________________ 24 3.1.1.: Genetische syndromen die voorbeschikken tot type A aorta dissecties _______________________ 24 3.1.1.1: Marfan Syndroom _____________________________________________________________ 24 3.1.1.2: Loeys-Dietz syndroom (LDS) ___________________________________________________ 27 3.1.1.3: Ehlers-Danlos syndroom _______________________________________________________ 28 3.1.1.4: Cutis laxa ____________________________________________________________________ 29 3.1.1.5: Arterieel tortuositas syndroom (ATS) _____________________________________________ 31 3.1.1.6: Turner syndroom ______________________________________________________________ 31 3.1.1.7: Noonan syndroom _____________________________________________________________ 33 3.1.1.8: Filamine A mutaties ___________________________________________________________ 33 3.1.2.: Niet-syndromale familiale thoracale aorta aneurysma’s en dissecties ________________________ 34 3.1.2.1: Patente ductus arteriosus met thoracale aorta aneurysma’s (MYH11 mutaties) _____________ 34 3.1.2.2: Mutaties in het gladde spiercel α-actine en thoracale aorta aneurysma’s __________________ 35 3.1.2.3: TGF-β receptor mutaties leidend tot familiale niet-syndromale aorta aneurysma’s __________ 35 3.1.2.4 : Bicuspide aortaklep in associatie met thoracale aorta aneurysma’s ______________________ 35 3.1.2.5: Andere loci geassocieerd aan familiale niet-syndromale aorta aneurysma’s _______________ 36
3.2: Koppelingsonderzoek_______________________________________________________ 38 3.3: Calponine ________________________________________________________________ 40 3.3.1: Werking gladde spiercel ____________________________________________________________ 40 3.3.2: Structuur calponine________________________________________________________________ 42 3.3.3: Functie calponine _________________________________________________________________ 43 3.3.4: resultaten calponine _______________________________________________________________ 46 3.3.4.1: Optimalisatie primers __________________________________________________________ 46 Exon 1,2,4,5,6,7___________________________________________________________________ 46 Exon 3 __________________________________________________________________________ 46 3.3.4.2: Resultaten analyse _____________________________________________________________ 47
4. Discussie _______________________________________________________________ 50 5. Referentielijst ___________________________________________________________ 55 6. Bijlage _________________________________________________________________ 62
II
Voorwoord __________________________________________________________________________________
Voorwoord Graag zou ik mijn promotor Prof. dr. B. Loeys willen bedanken voor zijn permanente beschikbaarheid ondanks zijn drukke agenda. Machteld Baetens en Hendrik Van de Voorde die steeds bereid waren me met hun expertise verder te helpen wanneer er ergens vragen rezen. Karen Wettinck, Petra Van Acker, Charlotte Opsomer, Lynn Demuynck, Delfien Syx en Joris S’Heeren en vele anderen, werkzaam in het MRB, die me hielpen als er zich technische moeilijkheden stelden. Ook zou ik papa, mama, mijn zus Ann-Sofie en mijn broer Pieter-Paul en zijn vrouw Leen willen bedanken voor hun steun. Sofie Gossé en Elisabeth De Mont voor de gezellige momenten en gesprekken tijdens de julimaand. Mijn vrienden en mijn vriendin, lotgenoten, wil ik bedanken omdat we elkaar zo goed begrepen in ons gemeenschappelijk gezaag. Bovendien zou ik ook prof. Paul Coucke willen danken, supervisor van het labo medische genetica.
III
Abstract __________________________________________________________________________________
Abstract •
Inleiding: Aorta aneurysma’s zijn verantwoordelijk voor één à twee percent van de mortaliteit in de Westerse wereld. Ze worden onderverdeeld in abdominale en thoracale aorta aneurysma’s. Daar waar abdominale aneurysma’s vaak het gevolg zijn van levensstijlgebonden factoren (hypertensie, atherosclerose), kennen thoracale aneurysma’s vaak een genetische etiologie. Thoracale aorta aneurysma’s worden verder onderverdeeld in syndromale en niet-syndromale thoracale aorta aneurysma’s. Ongeveer één op vijf van de patiënten met een niet-syndromaal aorta aneurysma heeft een eerstegraadsverwant met een aorta aneurysma. Onderzoek naar gendysfuncties binnen deze niet-syndromale context bevindt zich, in tegenstelling tot het domein van de syndromale aorta aneurysma’s, nog in zijn kinderschoenen.
•
Doel: Verrichten van literatuuronderzoek om inzicht te verwerven in de verschillende genetische syndromen met hun specifieke genmutatie. Het bestuderen van zeldzame genetische ziektes waarbij een bepaalde predispositie bestaat voor de ontwikkeling van aorta aneurysma’s laat toe om tot een beter begrip te komen van de pathogenese van aorta aneurysma’s. Een familie met familiaal voorkomende aorta aneurysma’s wordt gescreend naar koppeling met bekende loci waarvoor koppeling reeds werd aangetoond. Screenen van een cohorte van zesendertig patiënten voor een mutatie in het gen coderend voor calponine.
•
Materialen en methoden: Aan de hand van de zoekrobot Pubmed werden relevante artikels gevonden om het nodige inzicht te verwerven in die syndromen, die gekenmerkt zijn door aorta aneurysma’s. Met behulp van de aanwezige expertise op het medisch genetisch labo werden relevante moleculair genetische vaardigheden aangeleerd waardoor de nodige onderzoekshandelingen zelfstandig konden worden uitgevoerd.
•
Resultaten: Uit de literatuurstudie is gebleken dat er een belangrijke rol is weggelegd voor TGF-β signaalcascade in de pathogenese van genetische syndromen die voorbeschikken tot thoracale aorta aneurysma’s. Het onderkennen van pathogenetische mechanismen biedt de mogelijkheid voor een meer gerichte medische therapie. Veelbelovende resultaten worden bekomen voor de behandeling met losartan. Naast het blokkeren van angiotensine II receptoren zou losartan ook het TGF-β signaalpad blokkeren. Langetermijnresultaten moeten echter nog afgewacht worden. Bij patiënten met niet-syndromaal familiale aorta aneurysma’s werd koppeling aangetoond voor loci op chromosoom vijf en elf. Een familie werd bestudeerd voor koppeling met deze loci en het resultaat hiervan was negatief. Daarnaast werden in de laatste jaren bij patiënten met familiale thoracale aorta aneurysma’s mutaties beschreven in genen die coderen voor eiwitten van het contractiel apparaat van gladde spiercellen. Twee gendysfuncties zijn reeds gevonden in de niet-syndromale context. In families met de associatie van aorta aneurysma’s en patente ductus arteriosus werden mutaties gevonden in het
________________________________________________________________________________ 1
Abstract __________________________________________________________________________________ MYH-11 gen (myosine heavy chain 11). In families met geïsoleerde aorta aneurysma’s werden mutaties geïdentificeerd in het gen coderende voor ACTA-2 (alpha-2 of smooth muscle actin gen). Calponine is een eiwit welke het actomyosine ATP’ase blokkeert en een actieve rol zou spelen in het PKC signaalpad. Wat de exacte rol is in dit signaalpad is tot op heden onduidelijk. Bij zesendertig patiënten die negatief waren voor screening naar FBN1, ACTA2 en TGFBR1/2 mutaties, werden onderzocht of ze drager zijn van een mutatie in het gen coderende voor calponine. Bij drie patiënten werd één bekend polymorfisme gevonden.
________________________________________________________________________________ 2
Inleiding __________________________________________________________________________________
1. Inleiding 1.1.: Wat zijn aorta aneurysma’s? Aorta aneurysma’s worden gedefinieerd als een verbreding van de aorta met twee standaard deviaties boven het gemiddelde in functie van het lichaamsoppervlak en de leeftijd (Loeys et al., 2008). Een andere definitie stelt dat een aorta aneurysma een permanente dilatatie is met een diameter die minstens vijftig procent groter is dan de verwachte normale diameter (Hiratzka et al., 2010). Bij een acute dissectie loopt, via een scheur in de tunica intima (zie 1.3.1: opbouw bloedvat), bloed uit het lumen in de wand van de aorta, wat leidt tot het ontstaan van een vals lumen. 1.2.: Epidemiologie Aorta aneurysma’s en dissecties zijn één van de belangrijkste doodsoorzaken in de geïndustrialiseerde wereld (Milewicz et al., 2008), en zijn zelfs verantwoordelijk voor 1-2% van de totale mortaliteit/morbiditeit (Loeys et al., 2008). Het voorkomen van aorta aneurysma’s wordt geschat op 5,9 gevallen per honderdduizend persoonsjaren. De gemiddelde leeftijd van de diagnose ligt tussen de negenenvijftig en negenenzestig jaar en het komt ook twee tot viermaal meer bij mannen voor (Coady et al., 1999). De prevalentie lijkt toe te nemen, enerzijds dankzij de verbeterde beeldvormingstechnieken en anderzijds dankzij de kennis over de ernst van de pathologie. Acute aorta dissecties komen voor bij vijf tot dertig mensen op een totaal van een miljoen per jaar. Bij een acute aorta dissectie zal minder dan de helft van de patiënten het ziekenhuis levend bereiken. Tijdens de eerste vierentwintig tot achtenveertig uur sterft per uur één à twee percent van de patiënten (Wung and Aouitzerat, 2004). 1.3: Etiologie 1.3.1: Opbouw bloedvat De aorta is opgebouwd uit drie lagen. De binnenste laag en buitenste laag zijn dun en worden respectievelijk de tunica intima en de tunica adventitia genoemd. De tunica intima is opgebouwd uit een laag van endotheelcellen die rusten op subendotheliaal weefsel, dat onder andere bestaat uit collageen, elastine vezels en fibroblasten. De lamina elastica interna (binnenste laag van de tunica intima) scheidt de intima van de media. Deze laag is gefenestreerd waardoor nutriënten kunnen diffunderen van het lumen naar de cellen in de wand (Wung and Aouitzerat, 2004). De dikke middenste laag, de tunica media, is betrokken in de pathogenese (zie verder) van aorta aneurysma’s (Loeys et al., 2008). Deze laag is opgebouwd uit gladde spiercellen en elastine vezels. De gladde spiercellen zijn longitudinaal diffuus verdeeld rond de circulair georiënteerde elastine vezels. Door de concentrische elastische vezels en gladde spiercellen is de tunica media verantwoordelijk voor de elasticiteit en de spankracht van de aorta. De gladde spiercellen contraheren in respons op de pulsatiele bloeddruk om zo de polsdruk en debiet constant te houden (Milewicz et al., 2008). Rond de tunica ________________________________________________________________________________ 3
Inleiding __________________________________________________________________________________ media ligt de tunica adventitia. Deze bestaat voornamelijk uit collageen en bevat ook vasa vasorum en zenuwen (Hiratzka et al., 2010). Collageen en elastine zijn de belangrijkste structurele proteïnen van de aorta, een elastische arterie. Collageen is belangrijk voor behoud van de structuur terwijl elastine instaat voor de elastische veerkracht (Wung en Aouitzerat, 2004). 1.3.2: Opbouw gladde spiercel
Figuur 1: Moleculaire opbouw cytoskelet/contractiel apparaat (Milewicz et al., 2008)
Het structureel skelet van de gladde spiercel bestaat uit het contractiel apparaat enerzijds en het cytoskelet anderzijds. Het cytoskelet bestaat uit niet-musculair actine (β en γ) en intermediaire filamenten. De contractiele eenheid bestaat uit dunne en dikke filamenten. De dunne filamenten bestaan uit α-actine en de dikke filamenten uit β-myosine zware keten. Filamine A is verantwoordelijk voor het verbinden van het cytoskelet met het celoppervlak. Integrine receptoren zijn transmembranaire eiwitten en dienen als belangrijke receptoren voor de extracellulaire matrix (ECM). Deze integrine receptoren dienen als link tussen de ECM, het actine cytoskelet en de contractiele eenheden en wordt daarom ook wel het mechanotransductiecomplex geheten. Deze integrine receptoren zijn samengesteld uit α- en β-subeenheden. Een specifieke αβ-combinatie verleent de receptor een specifieke ligandspecificiteit. Het belangrijkste bestanddeel van de extracellulaire matrix zijn microfibrillen. Het belangrijkste eiwit bestanddeel van deze laatste is fibrilline-1. Er wordt gesuggereerd dat fibrilline-1 bevattende microfibrillen deel uitmaken van het mechanotransductiecomplex doordat fibrilline een herkenningsite heeft voor integrine (Milewicz et al., 2008). 1.3.3: Wat zijn de oorzaken van een aorta aneurysma? Genetische invloeden, fysiologische factoren en omgevingsfactoren zijn belangrijke oorzaken van aorta aneurysma’s (Wung and Aouitzerat, 2004). Bij aorta aneurysma’s en dissecties is er in de wand van de aorta fragmentatie en verlies van elastine vezels en opstapeling van proteoglycanen in de tunica ________________________________________________________________________________ 4
Inleiding __________________________________________________________________________________ media (Milewicz et al., 2008). Aneurysma’s zijn dan ook het gevolg van cystische degeneratie van de tunica media, welke zich histologisch uit als gladdespiercelverlies en elastinevezeldegeneratie (Isselbacher et al., 2005). In associatie met deze degeneratie worden soms inflammatoire cellen teruggevonden, maar de rol hiervan is onduidelijk (Loeys et al., 2008). Bij aorta aneurysma’s worden mutaties gevonden in genen die betrokken zijn bij de structuur van het contractiel apparaat van de gladde spiercel. Dit suggereert dat gladdespiercelcontractie een belangrijke rol speelt in het onderhouden van de normale structuur van de aorta en ook een afremmende functie vervult in de ontwikkeling van aorta aneurysma’s (Milewicz et al., 2008). Genetische aanleg is een belangrijk etiologische factor. Genetisch bepaalde aorta aneurysma’s kunnen passen binnen een syndromale context (bespreking van syndromen: zie later). Bij niet-syndromale aorta aneurysma’s spelen familiale factoren een belangrijke rol. Negentien percent van de geïsoleerde gevallen met aorta aneurysma’s hebben een eerstegraadsverwant met een thoracaal aorta aneurysma (Milewicz et al., 2008; Isselbacher et al., 2005). Hypertensie geeft een verhoogd risico op aorta dissectie. Als een hypertensieve episode (meestal emotioneel of inspanningsgewijs) een hoge druk genereert en de limiet overschrijdt welke de aorta kan verdragen geeft dit een aorta dissectie (Elefteriades, 2008). Andere mogelijke voorbeschikkende factoren voor thoracale aorta aneurysma’s zijn syfilis, infectieuze aortitis, reuscelarteritis, aorta trauma en dissectie. Atherosclerose is geen frequente oorzaak van thoracale aorta aneurysma’s (Guo et al., 2006). Deze is net als hypertensie wel vaak geassocieerd met abdominale aneurysma’s (Isselbacher et al., 2005). Deze laatste vallen buiten het opzet van deze thesis.
________________________________________________________________________________ 5
Inleiding __________________________________________________________________________________ 1.4: Pathogenese Figuur 2: Schematische weergave pathogenese (Milewicz et al., 2008)
Toegenomen druk op de bloedvatwand
Gen Mutaties
Hypertensie of isometrische activiteit
Onderbreking van de gladdespiercelfunctie door verstoring van een component in het mechanotransductiecomplex (ACTA2, MYH11, FLNA, FBN1)
Gladde spiercel dysfunctie/overbevraging
Activatie van compensatiemechanismen van de gladde spiercel. Dit leidt tot expressie van mitotische en trofische factoren zoals IGF-1, TGF-β1
Activatie van compensatiemechanismen van de gladde spiercel. Dit leidt tot toegenomen hoeveelheid metalloproteïnasen en proteoglycanen
Afbraak van elastinevezels Opstapeling van proteoglycanen
Bij thoracale aneurysma’s is de gladdespiercelfunctie verstoord. Enerzijds kan dit het gevolg zijn van mutaties in genen betrokken in het mechanotransductiecomplex van de gladde spiercel (ACTA2, MYH11 en FBN1: zie verder). Anderzijds kan de gladdespiercelfunctie overmatig belast worden door een toegenomen druk op de bloedvatwand. Dit laatste kan het gevolg zijn van chronisch aanwezige ________________________________________________________________________________ 6
Inleiding __________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ an met een verhoogde bloeddruk hypertensie maar ook van isometrische activiteiten die gepaard gaan (zoals gewichtheffen). De gladde spiercel reageert hierop, niet alleen door middel van expressie van mitotischee en trofische factoren, factoren maar ook door een verhoging van matrixmetalloproteïnasen en proteoglycanen. Dit alles leidt tot degradatie van elastinevezels en toename van proteoglycanen in de extracellulaire matrix (Milewicz et al., 2008). De extracellulaire ulaire matrix (ECM) dient ook als opslagplaats van an groeifactoren en groeifactorbindende groeifactor proteïnen en kan dienen als ligand van celadhesiereceptoren. Stoornissen in de opbouw van de elementen, die de extracellulaire matrix opbouwen, opbouwen leidt tot een verstoorde matrixconfiguratie en functie. De structuur en functie van de wand van de aorta hangt in sterke mate af van de integriteit van de ECM. Een bepaald gegeven (roken, hypertensie) hypertensie en genetische predispositie (Marfan, Ehler-Danlos, Ehler bicuspide aortaklep,…) kan fungeren ungeren als oorspronkelijke stimulus om de structuur van de ECM te verstoren. Hierop wordt gereageerd door inductie en activatie van proteolytische enzymen. Dit leidt tot verdere destructie van de ECM. Hierop ontstaat een dilatatie en neemt de druk op de wand w nog extra toe. Matrixmetalloproteïnasen (MMPs) zijn in dit proces betrokken, gezien hun capaciteit om alle componenten van de ECM af te breken (Barbour et al., 2007). De activiteit van MMP wordt door verschillende mechanismen gereguleerd. Deze regulatie gebeurt op het niveau van de transcriptie en de vrijstelling van MMPs maar ook door posttranslationele modificaties en endogene weefselinhibitoren (TIMPs). In een normale normale fysiologische situatie is er een goede balans tussen de activiteit van de MMPs en TIMPs zodat de opbouw van de matrix in evenwicht is met de afbouw. In het geval van een aneurysma is dit evenwicht verstoord door een overproductie van de MMPs en een verlaagde ver activiteit van de TIMPs. Dit resulteert in een verhoogde proteolyse en degeneratie van de ECM (Jones et al., 2009). 1.5: Classificatie Type A
Type B
Figuur 3: Type A en type B dissectie (Milewicz et al., 2008). 2008) ________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ 7
Inleiding __________________________________________________________________________________ Thoracale aneurysma’s kunnen ingedeeld worden op basis van het deel van de aorta dat wordt getroffen en het aneurysma kan verschillende segmenten betreffen. Zo kunnen de aortawortel, aorta ascendens, aortaboog of aorta descendens worden getroffen door een aneurysma. 60% van de aneurysma’s worden gelokaliseerd ter hoogte van de aortawortel en/of aorta ascendens, 40% in de aorta descendens en 10% in de aortaboog (Isselbacher et al., 2005). Aorta rupturen worden onderverdeeld in twee types. Type A zijn rupturen die optreden in het stijgende deel van de aorta (distaal van de aortaklep). Type B scheuren zijn scheuren die typisch optreden in het dalende deel juist distaal van de oorsprong van de linker arteria subclavia. Beide types nemen 95 % van thoracale aneurysma’s voor hun rekening (Loeys et al., 2008). 1.6: Kliniek Aorta aneurysma’s blijven in vijfennegentig procent asymptomatisch. Bij vijf procent geeft het aanleiding tot symptomen. Een patiënt met een aneurysma in de aorta ascendens kan klagen over retrosternale pijn, terwijl aneurysma’s in de aorta descendens aanleiding kunnen geven tot interscapulaire pijn (Elefteriades, 2008). Patiënten zijn dus meestal asymptomatisch op het moment van de diagnose. Deze aneurysma’s komen dan tot uiting door middel van beeldvorming (röntgenologisch, CT of echocardiografie), aangevraagd in het kader van een andere indicatie. Bij een aortawortelaneurysma wordt, bij een routinematig uitgevoerde auscultatie, soms regurgitatie vastgesteld. Vormt het aneurysma een uitgesproken massa, dan kan het door de massawerking nabijgelegen structuren obstrueren. Hoest, wheezing, dyspnoe of recidiverende pneumonie kan aldus ten gevolge van compressie van de trachea of de hoofdbronchus optreden. Compressie van de oesofagus kan leiden tot dysfagie en druk op de nervus laryngeus recurrens kan leiden tot heesheid (Isselbacher et al., 2005). 1.7: Diagnose De meest geschikte beeldvormingstechnieken om aorta aneurysma’s in het licht te stellen zijn transoesofagale echocardiografie, CT en MR angiografie.
De aorta met zijn zijtakken kan worden gevisualiseerd aan de hand van echocardiografie. Door het gebruik van verschillende beeldvormingsincidenties kan men de aorta ascendens, de aortaboog en aortawortel visualiseren. Transoesofagale echocardiografie is beter dan transthoracale echocardiografie. Vergeleken met andere beeldvormingsmodaliteiten is echocardiografie geen geschikte beeldvormingstechniek voor de visualisatie van de aorta descendens (Hiratzka et al., 2010). Andere methodes om aorta aneurysma’s in beeld te brengen zijn CT of MR angiografie. De lokalisatie van het aneurysma kan soms indicatief zijn voor welke beeldvorming gekozen dient te worden. Aortawortel wordt het best met MR gevisualiseerd terwijl axiale beeldvorming voor een tortueuze aorta minder geschikt is. Een tortuositas aortae wordt het best gevisualiseerd met hetzij een 3D-CT hetzij een MR angiografie (Isselbacher et al., 2005). Een röntgenologische opname (Rx) van de thorax kan meestal ________________________________________________________________________________ 8
Inleiding __________________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________________ visualiseren maar een normale Rx sluit de aanwezigheid ervan niet uit. uit een aorta aneurysma visualiseren, Uiteindelijke selectie van de meest geschikte beeldvorming hangt af van de beschikbaarheid van de apparatuur en de toestand van de patiënt (Hiratzka et al., 2010). 1.8: Evolutie Veel kennis omtrent de natuurlijke evolutie van aorta aneurysma’s is niet voorhanden. Dit komt doordat de huidige behandelingsvormen van vroegtijdige interventie niet toelaten een verregaande evolutie te volgen.. Elefeteriades et al. poneert dat een aneurysma per jaar gemiddeld met 0,12 cm in diameter toeneemt.. De initiële diameter van het aneurysma is een belangrijke predictieve factor voor de snelheid van de groei van aneurysma’s (Isselbacher et al.,, 2005). Twee procent van de aneurysma’s met een diameter van minder dan vijf centimeter, drie procent procen van de aneurysma’’s met een doormeter tussen de 5 en 5.9 cm en zeven procent van de aneurysma’s met een diameter ≥ 6cm evolueren per jaar naar een aorta dissectie (Davies et al., al. 2002). Figuur 4: Weergave van de impact van de diameter van het aorta aneurysma op het risico voor het ontwikkelen van een ruptuur. Y-as as geeft de mogelijkheid tot complicatie weer. De x-as as geeft de diameter van het aorta aneurysma weer. (Coady et al., 1997)
1.9: Behandeling Ruptuur of dissectie van een aneurysma is geassocieerd met een hoge morbiditeit en mortaliteit ondanks de verbeterde chirurgische technieken. Daartegenover staat dat profylactisch herstel van een aorta ascendens cendens aneurysma voor ruptuur en dissectie dissectie geassocieerd is met zeer lage morbiditeit en mortaliteit (Milewicz et al.,, 2008). Wanneer een aorta aneurysma wordt gediagnosticeerd, dan moet worden nagekeken of dit aneurysma een manifestatie is van een syndroom. Voor deze screening is doorverwijzing naar een geneticus aan te raden (Loeys et al., 2008). 1.9.1: Behandeling van risicofactoren Risicofactoren voor de ontwikkeling van thoracale aorta aneurysma’s (TAA) zijn hypertensie, roken en chronisch obstructieve longziekten. Hypertensie moet medisch behandeld worden bij patiënten met thoracale aorta aneurysma’s (zie 1.9.2) maar levensstijlaanpassingen, gewichtsreductie en matige alcoholinname zijn standaard antihypertensiemaatregelen antihypertensie die ook voor patiënten met TAA kunnen worden geïmplementeerd. Bovendien wordt de rokende patiënt aangeraden het tabakgebruik te staken. ________________________________________________________________________________ ____________________________________ ____________________________________________ 9
Inleiding __________________________________________________________________________________ Er zijn geen gerandomiseerde of prospectieve studies voorhanden die het effect van roken op TAA bestuderen, maar de aorta aneurysma’s van patiënten die roken, hebben een verdubbelde expansiesnelheid. Ook wordt aangeraden om bij patiënten met TAA het lipidenprofiel te optmaliseren, maar er zijn geen studies die aantonen dat statines de expansie van een aorta aneurysma vertragen (Hiratzka et al., 2010). 1.9.2: Medische behandeling Hypertensie is vaak geassocieerd aan aneurysma’s zowel bij patiënten met genetische predispositie als bij geïsoleerde gevallen met aorta aneurysma’s. Daarom is medicamenteuze behandeling van hypertensie bij patiënten met aneurysma’s aangewezen (Wung and Aouitzerat, 2004). Het doel moet zijn om de bloeddruk onder 140/90 mm Hg te krijgen voor patiënten zonder diabetes of onder de 130/80 mm Hg voor diabetici (Hiratzka et al., 2010). Medische behandeling beperkt zich nu tot het voorschrijven van β-blokkers. Behandelde patiënten vertonen minder cardiovasculaire complicaties zoals aorta regurgitatie, aorta dissectie en vertonen toegenomen overleving. β-blokkers zijn effectief omdat ze enerzijds negatief chronotroop werken en anderzijds negatief inotroop werken, wat resulteert in een verminderd debiet en bloeddruk in de aorta ascendens. Op basis van de beschreven pathogenese, moeten medicamenten, die de bloeddruk verlagen, ook de compensatoire activiteiten van de gladde spiercel lam leggen en dus ook de klinische manifestaties van de ziekte (Milewicz et al., 2008). Als β-blokkers gecontraindiceerd zijn, kan men opteren voor Ca-blokkers en ACE-remmers, alhoewel geen Randomized Controlled Trials (RCT’s) bestaan (Loeys et al., 2008). 1.9.2: Chirurgische behandeling 1.9.2.1: Methode 1.9.2.1.1: Aorta ascendens aneurysma’s: Hierbij wordt een cardiopulmonaire bypass aangelegd. Vervolgens wordt het aneurysma in zijn geheel verwijderd en vervangen door een Dacron tube greffe. Is de aortawortel betrokken, dan wordt een prothese gebruikt voorzien van een klepsysteem. Na implantatie worden dan de arteriae coronariae geïmplanteerd. De mortaliteit van chirurgie ligt tussen de 3% en de 5% (Isselbacher et al., 2005). Is de functie van de aortaklep nog gespaard, dan kan gekozen worden voor een chirurgische interventie waarbij de klep ongemoeid wordt gelaten, zodat de patiënt niet wordt gedwongen tot een levenslange inname van anticoagulantia (Loeys et al., 2008).
1.9.2.1.2: Booganeurysma’s: Hierbij worden eerst de brachiocefale zijtakken afgeklemd. Daarna wordt het betrokken segment verwijderd en vervangen door een prothese waarop de verschillende brachiocefale zijtakken worden geïmplanteerd. Dit alles gebeurt onder hypotherme cardioplegie. De hypotherme episode wordt in ________________________________________________________________________________ 10
Inleiding __________________________________________________________________________________ duur gereduceerd wanneer men gebruik maakt van een prothese met verschillende zijtakken waarop de brachiocefale zijtakken één voor één worden geïmplanteerd. De belangrijkste complicaties bij een dergelijke interventie zijn neurologische consequenties als gevolg van langdurige cerebrale ischemie of embolisatie door atherosclerotische plaques.
1.9.2.1.3: Endovasculaire stenting Een recente evolutie is het endovasculair herstel van aneurysmata. Dit gaat gepaard met minder mortaliteit en morbiditeit, maar langetermijnresultaten moeten nog afgewacht worden (Mustafa et al., 2010). Het aanbrengen van een stent, stopt in sommige gevallen de vergroting van het aneurysma niet. Verdere ziekte-evolutie kan leiden tot het falen van de stent. Het is dan ook belangrijk de patiënt nauwkeurig op te volgen (Jones et al., 2009).
1.9.2.2: Wanneer opereren? Voor een schematische weergave wordt verwezen naar bijlage 2. 1.9.2.1: Asymptomatische patiënten Asymptomatische patiënten met thoracala aorta aneurysma’s (TAA’s) worden best geopereerd als de diameter van het aneurysma gelijk is aan of groter dan 5,5 cm. Voor patiënten met een syndromaal aorta aneurysma worden strengere afkapwaarden gebruikt om te beslissen tot chirurgische interventie (tussen vier en vijf centimeter afhankelijk van het syndroom). TAA’s, die jaarlijks een toename in diameter hebben van een halve centimeter of meer, komen ook in aanmerking voor een chirurgische profylactische interventie (onafhankelijk van de doormeter van het aneurysma). Als patiënten een klepherstel ondergaan, worden dilataties van de aortawortel of de aorta ascendens die in diameter groter zijn dan 4,5 centimeter, concomitant meegecorrigeerd (Hiratzka et al., 2010). 1.9.2.2: Symptomatische patiënten Bij patiënten met symptomen, suggestief voor een uitbreiding van een thoracaal aorta anuerysma, wordt geopteerd voor een snelle chirurgische interventie, tenzij de patiënt door andere aandoeningen een verkorte levensverwachting of een verminderde levenskwaliteit heeft. 1.9.3: Seriële beeldvorming Seriële beeldvorming van patiënten met een gediagnosticeerd aneurysma vormt een belangrijk onderdeel in de langdurige opvolging van dergelijke patiënten. Op basis van de initiële beeldvorming, uitgevoerd bij de diagnosestelling, is het onmogelijk een inschatting te maken van de snelheid waarmee het aneurysma toeneemt. Na zes maanden moet de beeldvorming opnieuw plaatsvinden. Is het aneurysma dan niet toegenomen in grootte, dan is een jaarlijkse beeldvorming voldoende. Is er echter een toename in doormeter, dan dient dit om de drie tot zes maanden worden opgevolgd met een CT of MR (Isselbacher et al., 2005). Seriële beeldvorming is niet enkel belangrijk om de evolutie te ________________________________________________________________________________ 11
Inleiding __________________________________________________________________________________ bepalen want ook andere aneurysma’s kunnen zich ontwikkelen. Een patiënt met een aneurysma heeft namelijk een verhoogde kans er nog één te ontwikkelen (Wung and Aouitzerat, 2004). Daarom moet na een operatie een patiënt blijvend opgevolgd worden met beeldvorming voor de tijdige detectie van aneurysma’s in het chirurgisch hersteld aorta gedeelte en van aneurysma’s meer distaal in het lichaam (Loeys et al., 2008). 1.10: Embryologie Neurale lijstcellen zijn pluripotente cellen die aanleiding kunnen geven tot verschillende celtypes, weefsels en organen. Deze cellen zijn nodig voor de differentiatieprocessen, optredend in de verschillende ontwikkelingsstadia van verschillende orgaansystemen zoals het perifeer zenuwstelsel, het aangezichtsskelet, melanocyten en cardiaal outflow tract septum. Inductie van de neurale lijstcellen gebeurt aan de dorsale zijde van het zich ontwikkelend ruggenmerg (aanvankelijk vormt zich de neurale buis). Door de interactie tussen het oppervlakkig gelegen ectoderm en de neurale plaat ondergaan ze epitheliaal-mesenchymale transformatie en gaan dan migreren en verder differentiëren. Een subpopulatie van de neurale lijstcellen vormen de cardiale neurale lijstcellen (CNC: cardiac neural crest cells (En)). Deze zijn afkomstig van de neurale lijst gelegen tussen de otische placode en de vierde somiet. Deze CNC ondergaan een epitheliale-mesenchymale transformatie en migreren dan via de derde, vierde en zesde faryngeale bogen naar het hart (Snider et al., 2007). Cardiac neural lijst cellen spelen een rol in het ontwikkelen van het proximaal deel van het septum en het voorzien van myocard in het septum (Snider et al., 2007). Naast het vormen van het aorticopulmonaal septum, speelt het ook een rol in het ontwikkelen van de tunica media van de aortaboog en de grote zijtakken (Epstein and Stoller, 2005). Figuur 5: weergave van een normale remodellering (Epstein and Stoller, 2005)
Een normale cardiovasculaire ontwikkeling begint met één enkel bloedvat, dat zich verdeelt ter hoogte van de aortazak in bilateraal symmetrische bloedvaten: de derde, vierde of zesde aortaboogarteriën. Deze arteriën zijn tijdelijk en gaan aanleiding geven tot de volwassen aorta, welke linksdraaiend is. Dit is het resultaat van een asymmetrisch geprogrammeerde regressie of blijvende aanwezigheid van de specifieke boogarteriën. De arteriën van de derde farynxboog geven aanleiding tot de arteria carotis ________________________________________________________________________________ 12
Inleiding __________________________________________________________________________________ communis, de vierde farynxboog arteriën geven aanleiding tot het vormen van het distale deel van de aortaboog, de arteria brachiocefalica (welke gemeenschappelijke basis is van de arteria carotis communis dextra en de arteria subclavia dextra). De zesde farynxboogarteriën geven aanleiding tot het ontstaan van de ductus arteriosus (of de ductus van Botal) en de proximale delen van de arteriae pulmonales. De definitieve structuur is het resultaat van de interactie tussen het mesenchym, de endotheelcellen van de faryngeale arteriën, de neurale lijstcellen, welke de oorsprong zijn van de gladde spiercellen en het endoderm. Abnormale remodellering leidt tot allerlei congenitale cardiovasculaire afwijkingen. (Snider et al., 2007). De aard van de congenitale afwijkingen ten gevolge van CNC dysfunctie suggereert een continuüm van afwijkingen relatief aan de ernst van CNC dysfunctie (Stoller and Epstein, 2005). Remodelleren gaat uit van differentiatie, proliferatie, migreren over grote afstanden en een goed gereguleerde apoptose. Apoptose speelt ook een belangrijke rol in de vroege ontwikkeling van het cardiovasculair systeem. De zoektocht naar een mogelijke consequentie van het dysfuntioneren van dit proces biedt heel wat mogelijkheden met betrekking tot toekomstige onderzoekingen (Fisher et al., 2002). Het belang van cardiale neurale lijstcellen voor de cardiovasculaire ontwikkeling is zeer groot. Getuigen hiervan zijn de ernstige congenitale afwijkingen welke het gevolg zijn van het verwijderen of genetische manipulatie van cardiale neurale lijstcellen. Er zijn al een aantal signaalwegen blootgelegd die een rol spelen in de vorming en migratie van de CNC. Het gemeenschappelijk mechanisme en de relatie tussen de onderliggende signaalwegen moet echter nog opgehelderd worden (Snider et al., 2007). NOTCH, TGF-β en Semaphorin spelen hierbij een rol. De meeste gendysfuncties die blootgelegd zijn, zijn gebaseerd op diermodellen. Ook op basis van diermodellen is gebleken dat de cardiovasculaire ontwikkeling ook het resultaat is van interacties tussen lokale weefsels zoals endotheel, faryngeaal endoderm, ectoderm en cardiaal mesenchym en myocard. Verder onderzoek moet uitmaken welke interacties en signaalpaden een belangrijke rol spelen bij de mens (Epstein and Stoller, 2005). Aorta aneurysma’s kunnen binnen bepaalde families geassocieerd zijn met een bicuspide aortaklep, cerebrale aneurysmata of een coarctatio aortae. De aortakleppen en de tunica media van de aorta ascendens en de zijtakken zijn afkomstig van cardale neurale lijstcellen. Een dysfunctie op het niveau van deze cellen kan de oorzaak zijn van cardiovasculaire ziekte binnen deze families (Pannu et al., 2006).
________________________________________________________________________________ 13
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________
2. Marterialen en Methoden 2.1: Literatuuronderzoek Met behulp van de zoekrobot Pubmed werden artikels gezocht om inzicht te verwerven in thoracale aneurysma’s en hun genetische basis. Hierbij werd gebruik gemaakt van de kernwoorden thoracic aortic aneurysms. Op basis van de gevonden artikels werden ook nieuwe artikels gevonden die werden geciteerd. De artikels die gebruikt werden, werden opgenomen in de referentielijst.
2.2: Werkwijze Eerst werden een aantal artikels gezocht om inzicht te verwerven in de pathologie. Het eerste thesisjaar werd besteed aan het labowerk, waar het verwerven van een aantal vaardigheden werd gevolgd door het uitvoeren van praktisch werk. Eerst werd een koppelingsonderzoek uitgevoerd en dan werd een kandidaatgen gescreend op mutaties in een populatie van 36 patiënten geselecteerd uit een lijst van patiënten verzameld door prof. dr. B. Loeys. 2.3: Gebruikte labotechnieken 2.3.1: Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.3.1.1: Principe Met behulp van de polymerase chain reaction (PCR) kan een specifiek DNA-fragment, uitgaand van een geringe hoeveelheid DNA, in veelvoud worden vermenigvuldigd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een cyclus die vele malen wordt herhaald. Een dergelijke cyclus bestaat uit drie stappen: denaturatie, hybridisatie en elongatie. Het DNA-fragment, dat dient verveelvoudigd te worden (het template DNA), wordt bepaald door het gebruik van een primer. Een primer is een oligonucleotide dat ontworpen wordt om specifiek te binden op een specifieke plaats in het genoom. Voor een PCR- reactie zijn er twee primers nodig: een forward en een reverse primer. Een forward primer bindt op 5’-3’ streng (de sense-DNA streng) terwijl de reverse primer op de 3’-5’ streng (anti-sense streng) bindt. De forward en reverse primer moeten elk aan één kant van de template binden om deze dan specifiek te vermenigvuldigen. Een meer precieze bespreking van primers volgt in 2.3.1.3. De PCR cyclus bestaat dus uit drie stappen. Een woordje uitleg: I.
Denaturatie: De twee strengen van het dubbelstrengig DNA worden bijeengehouden door waterstofbruggen. Het doel van het “denatureren” van het dubbelstrengig DNA is het verbreken van die waterstofbruggen teneinde het dubbelstrengig DNA om te zetten naar het enkelstrengig DNA. Door de oplossing met het dubbelstrengig DNA op te warmen tot gewoonlijk 92 tot 97°C
________________________________________________________________________________ 14
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________ worden de waterstofbruggen tussen de basen gebroken en wordt enkelstrengig DNA (ssDNA) bekomen, welke dan dient als template voor de aanmaak van nieuwe strengen. II.
Hybridisatie: De temperatuur wordt verlaagd tot een temperatuur tussen de 40°C en 60°C. Zo worden de primers, aanwezig in de mastermix, toegelaten om het DNA op een specifieke plaats te binden. Hoe lager de temperatuur, hoe meer de primer de kans heeft om het ssDNA te binden. Hierdoor is er een hogere kans dat de primer zich op een verkeerde plaats op het DNA bindt. Omgekeerd betekent dat bij hogere temperatuur de primer minder kans heeft om het ssDNA te binden en dit enkel kan op de plaatsen waar het meest waterstofbruggen kan gevormd worden. Dus bij hogere temperatuur worden er minder bindingen gevormd maar zijn ze wel specifieker. Bij lagere temperatuur worden er meer bindingen gevormd maar is de kans hoger dat er meer aspecifieke binding wordt gevormd waardoor er meer ongewenste DNA-amplicons kunnen worden gevormd. De temperatuur waarop dit alles gebeurt wordt bepaald door de karakteristieken van de primer, met name lengte en samenstelling (GC/AT verhouding).
III.
Elongatie: Deze stap gebeurt op 72°C. Op deze temperatuur heeft het thermostabiele (warmtebestendige) Taq DNA-polymerase de meest optimale werking. Dit enzyme zorgt ervoor dat primers gebonden op het template DNA worden verlengd aan het 3’ uiteinde met verbruik van de juiste vrije mononucleotiden die ook aanwezig zijn in de mastermix. Bij deze laatste stap wordt een nieuwe streng gevormd.
Deze cyclus wordt een aantal maal doorlopen, waarbij het nieuw gevormd DNA telkens als template dienst doet. Het DNA wordt zo exponentieel verveelvoudigd, waarbij na elke cyclus het product werd verdubbeld. Wordt de cyclus twintig maal doorlopen, dan zijn er van elke DNA-streng 220 kopieën. De hoeveelheid DNA dat niet de sequentie bevat, is verwaarloosbaar in vergelijking met de hoeveelheid dat wel die sequentie bevat. 2.3.1.2: Touch-Down PCR Bij een touch-down PCR worden bij elke cyclus, net zoals bij een standaard PCR denaturatie, hybridisatie en elongatie doorlopen maar met dit verschil dat bij de eerste cyclus de temperatuur van de hybridisatie hoog wordt gehouden en dat bij het doorlopen van een aantal cycli deze temperatuur wordt verlaagd. Door van bij het begin de temperatuur hoog te houden, wordt er een grotere specificiteit bekomen. De verlaagde temperatuur na een aantal cycli zorgt dan weer voor een grotere opbrengst. 2.3.1.3: Elementen mastermix In de oplossing, welke voorwerp is van een PCR, zitten een aantal elementen die elk hun nut hebben:
________________________________________________________________________________ 15
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________ •
Dubbelstrengig DNA of template DNA: is het DNA waarvan een fragment dient verveelvoudigd te worden.
•
Taq polymerase: Deze DNA-polymerase is thermostabiel en is afkomstig van de bacterie thermus aquaticus. Het verlengt de DNA-streng met gebruik van de monomeren (zie hieronder).
•
dNTP’s (deoxyribonucleotidetrifosfaten) zijn monomeren welke de bouwstenen zijn van het DNA. Deze monomeren worden door het Taq polymerase gebruikt om nieuwe strengen te vormen. Deze worden gebruikt wanneer de juiste base op de template ligt. Er zijn vier soorten die elk uit drie componenten bestaan. Alle vier beschikken ze over een desoxyribose en een trifosfaatgroep. Wat hen onderscheidt is de derde component: een base. De vier basen zijn adenosine, guanosine, cytosine en thymidine. De vier monomeren, elk bestaande uit de drie componenten (een base, desoxyribose en trifosfaatgroep), zijn deoxycytidine trifosfaat (dCTP), deoxyguanosine trifosfaat (dGTP), deoxyandenosine trifosfaat (dATP), deoxyguanosine trifosfaat (dGTP).
•
Buffer: houdt het mengsel op de juiste pH zodat de reactie optimaal verloopt
•
MgCl2: werkt als co-factor voor het warmtebestendige Taq-polymerase en stabiliseert het dubbelstrengig DNA, wat zijn implicaties heeft op de smelttemperatuur en specificiteit.
•
Primers: een oligonucleotide die een bepaalde sequentie bevat die overeenkomt met een segment van het genoom, dat het deel dat moet worden gepcr’d flankeert. Zo is kennis over de sequentie naast het deel waarin men geïnteresseerd is, zeker noodzakelijk. Hiervoor zijn er verschillende databanken op het web beschikbaar waaronder Ensembl en NCBI. Primers moeten aan bepaalde eisen voldoen: Smelttemperatuur: Deze wordt in belangrijke mate bepaald door het GCgehalte van de primer. Tussen adenine enerzijds en thymine anderzijds zijn er twee waterstofbruggen betrokken. Tussen guanine en cytosine daarentegen zijn het er drie. Om ervoor te zorgen dat de smelttemperatuur optimaal zou blijven, moet het GC-gehalte van de primer tussen 40 en 60 % liggen. Secundaire structuren: Tussen de primers mogen geen secundaire structuren worden gevormd, wat optreedt als er een complementair deel zou zijn dat groter zou zijn als drie basen. Specificiteit: alle primers moeten op een specifiek deel van het genoom binden. Dit kan nagekeken door de primer te “blasten”. Dit betekent het hele genoom na te gaan naar homologie tussen de primersequentie enerzijds en het hele genoom anderzijds. Blast (Basic Local Alignment Search Tool), beschikbaar via de NCBI website, is een zoekmachine die naar de sequenties zoekt met de
________________________________________________________________________________ 16
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________ grootste homologie en als resultaat een lijst weergeeft met homologe regio’s. Deze worden gerangschikt naar afnemende homologie. 2.3.1.4: PCR-toestel Het gebruikte PCR-toestel is de thermal cycler, versie 2.08 van het merk Applied Biosystems. 2.3.2: Agarosegelelektroforese 2.3.2.1: Principe Agarosegelelektroforese laat toe om DNA-fragmenten te scheiden op basis van grootte. Deze scheiding gebeurt door de DNA-fragmenten te laten bewegen volgens een elektrisch veld in een gel, gelegen in een basisch bufferbad. De DNA-fragmenten migreren in de richting van de positieve pool omdat fosfaatgroepen, component van de DNA-molecule, in basisch milieu negatief geladen zijn. De scheiding van de fragmenten wordt bepaald door de migratiesnelheid. In de gel migreren kleinere DNA-fragmenten sneller dan grotere fragmenten. Het verschil in snelheid wordt bepaald door de hoeveelheid agarose (%) die in de gel verwerkt is. Deze agarose vormt namelijk een ingewikkeld netwerk van fibrillen waarin kleinere DNA-fragmenten vlotter migreren ten opzichte van de grotere fragmenten. Als men fragmenten moet scheiden die niet veel in lengte verschillen, moet men een hogere concentratie agarose hanteren. In de gel wordt ook ethidiumbromide verwerkt. Deze stof intercaleert in de DNA-helix en zorgt ervoor dat het DNA onder een UV-lamp fluorescent wordt. De grootte van een PCR-product kan nagegaan worden door te vergelijken met een referentie DNA-ladder. Dit is een mengsel van DNA-fragmenten met gekende grootte. Agarosegelektroferese wordt gehanteerd als middel om het PCR-product te beoordelen naar zijn kwaliteit. Zijn er bijvoorbeeld meerdere bandjes, dan is het PCR-product aspecifiek. DNA-fragmenten van dezelfde lengte worden niet van elkaar gescheiden en wanneer we een mooi bandje bekomen, dan is het PCR-product geschikt voor sequencing. Worden er geen bandjes gevonden of zeer zwakke bandjes dan wijst dit op onvoldoende amplificatie. 2.3.2.2: Protocol i. Bereiding agarosegel: Door 5 g agarose in 250 ml TBE buffer te mengen wordt 2% agarosegel bekomen. De agarose wordt opgelost door de oplossing aan de kook te brengen en te mengen. Vervolgens worden 3 tot 5 druppels ethidiumbromide toegevoegd. Vervolgens wordt het mengsel in een mal gegoten voorzien van kammetjes. Dit geheel moet dan rusten zodat het afkoelt en opstijft. Na afkoeling wordt een homogene gel bekomen met een rij slotjes die dan later met DNA-product kunnen worden geladen. ii.
PCR-productbewerking en gel laden
________________________________________________________________________________ 17
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________ Van het PCR-product wordt 3µl genomen. Dit wordt met 10 µl orange vermengd. Van de ladder wordt een 1,5µl genomen en dit wordt tevens vermengd met 10 µl orange. Dit mengsel kan in zijn geheel worden gepipetteerd (geladen) in de slots. Doordat het soortelijk gewicht van het mengsel groter is dan de buffer, blijft het product op de bodem zitten. iii.
Elektoforese Over de gel met geladen slots wordt dan een spanningsveld aangelegd van 140 volt. Het negatief geladen DNA begint dan te migreren. Het elektrisch veld moet tussen een half uur tot drie kwartier in stand worden gehouden. Dit geldt voor fragmenten die kleiner zijn dan duizend baseparen. Voor grotere baseparen moet anderhalf uur voorzien worden omdat grotere fragmenten minder snel migreren. Deze tijdspanne moet voldoende zijn om DNAfragmenten te laten migreren en hun lengte in te schatten aan de hand van een ladder.
iv.
Uitlezen: Na het afzetten van het elektrisch veld, wordt de gel met UV-stralen belicht waardoor het DNA-fragment kan worden gevisualiseerd.
2.3.3: Sequencing 2.3.3.1: Principe Na controle van het welslagen van het PCR-product door agarosegelelektroforese uit te voeren, kan het PCR-product worden gesequeneerd. Sequeneren betekent het bepalen van de nucleotidevolgorde van het PCR-product. Dit gebeurt volgens de Sanger-methode die praktisch in een aantal stappen kan worden ingedeeld: het DNA opzuiveren, het uitvoeren van de eigenlijke sequencingreactie, het opzuiveren van het sequencingproduct en het aflezen van het resultaat door het uitvoeren van capillaire gelelektoforese. Dit alles kan hetzij gerobotiseerd hetzij handmatig (of manuele sequencing) met elk zijn voor- en nadelen. I.
DNA opzuiveren Deze stap bestaat uit het toevoegen van exoSAP aan het PCR-product. ExoSap is een samenstelling van twee enzymen respectievelijk exonuclease en alkalisch fosfatase. Dit enzym zorgt ervoor dat het PCR-product wordt gezuiverd van primers en van overblijvende deoxyribonucleotidetrifosfaten of dNTP’s. Het alkalisch fosfatase gaat hierbij dNTP’s vernietigen door het verwijderen van een fosfaatgroep. Exonuclease gaat alle primers verwijderen door het enkelstrengig DNA (ssDNA) in dNTP’s om te zetten. Bovendien gaan ze ook aspecifieke DNA-strengen, gevormd in de PCR-reactie, vernietigen.
II.
Eigenlijke sequeneringsreactie Na het opzuiveren van het DNA wordt het opgezuiverd DNA aan een reactiemengsel toegevoegd, welke primers (forward en reverse), dNTP’s, een buffer, DNA-polymerase en een
________________________________________________________________________________ 18
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________ kleine hoeveelheid dideoxynucleoside triphosphaat (ddNTP’s) bevat. De sequeneringsreactie steunt op de sequeneringsmethode volgens Sanger. Hierbij worden de ddNTP’s op een willekeurige wijze ingebouwd. De ddNTP’s verschillen van de dNTP’s doordat de 3’hydroxylgroep bij de dideoxynucleotide ontbreekt. Een 2’-3’ ddNTP bevat een waterstof op de 2’ en 3’ plaats van de ribosering. Zo ontstaan er DNA fragmenten van wisselende lengte want na inbouw van een ddNTP kan verdere verlenging van de DNA-streng door het DNApolymerase niet meer gebeuren omdat een fosfodiësterbinding dan onmogelijk wordt. ddNTP’s worden daarom wel eens chain terminators genoemd. Door de inbouw van ddNTP’s wordt wel eens bij elke nucleotide de elongatie van de DNA-streng door de Taq-polymerase gestopt. De vier soorten ddNTP’s zijn ddGTP, ddTTP, ddATP en ddCTP. Elk van hen zijn voorzien van een fluorescente label (ook wel fluorochrome merker genaamd). III.
Opzuiveren van het sequencingproduct Aan het sequentieproduct wordt ethanol toegevoegd. Tevens worden magnetische beads toegevoegd die zich hechten aan het DNA. Na aanbrengen van een magnetisch veld rond de wand van het epje waarin het sequentieproduct zit, wordt het DNA met de magnetische beads naar de wand van het epje aangetrokken. De resten van de sequentiereactie blijven in de oplossing en kunnen na spoeling met ethanol worden verwijderd. Daarna kan een elutiebuffer worden toegevoegd waardoor het DNA vrijkomt van de magnetische beads. De magnetische beads blijven vastgehecht aan de magneet. De vloeistof met DNA kan dan worden geïsoleerd en in een nieuw epje geplaatst.
IV.
Capillaire gelelektoforese Het opgezuiverd sequencingproduct wordt in capillairen gebracht die gevuld zijn met polymeren. Er wordt dan een elektrisch veld aangelegd waardoor de DNA-fragmenten naar grootte worden ingedeeld door middel van elektroforese. Fragmenten van gelijke lengte komen dan op dezelfde plaats te liggen. Door middel van een laser wordt dan het aanwezige ddNTP tot fluorescentie gebracht. De uitgezonden fluorescentie wordt dan opgevangen door een CCD-camera. De resultaten worden weergegeven via een elektoferogram. Dit is een grafiek waar de x-as de afgelegde lengte weergeeft (of de lengte van het DNA-fragment) en de y-as de intensiteit van de uitgezonden fluorescentie weergeeft, waarbij elke van de vier soorten ddNTP’s een eigen kleur heeft. Dit aflezen gebeurt automatisch via een ABI 3130 XL Genetic Analyser of ABI 3730 XL DNA analyser (Applied Biosystems).
2.3.3.2: Analyse De analyse gebeurt door het programma SeqScape. Het resultaat wordt dan als volgt weergegeven (zie figuur).
________________________________________________________________________________ 19
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________
Figuur 6: Sequencingresultaat. Voorbeeld van een elektroferogram. 2.3.4: Koppelingsonderzoek 2.3.4.1: Wat is koppelingsonderzoek? Koppeling of linkage wil zeggen dat bepaalde loci of allelen samen worden overgeërfd omdat tijdens de meiose geen recombinatie optreedt. Gekoppelde loci komen significant samen meer voor dan op basis van de individuele allelfrequenties voorspeld kan worden. Koppelingsonderzoek is lange tijd een veel uitgevoerd onderzoek geweest om uit te zoeken of een patiënt al dan niet aan een dominant erfelijke aandoening lijdt.
Koppelingsonderzoek werd vroeger veelvuldig gebruikt om ziekte-loci binnen een familie met een pathologische belasting te identificeren. In een familie wordt dan gekeken hoe de overerving van de ziekte-loci gebeurt en wordt er onderzocht of er een verband kan worden gelegd met de manier waarop de ziekte tot expressie komt. Tussen gekoppelde merkers vindt, zoals reeds gezegd, geen recombinatie plaats. Deze merkers definiëren een DNA-fragment dat ongewijzigd wordt overgeërfd. Als een merker steeds aanwezig is bij bepaalde familieleden met een pathologie en afwezig is bij familieleden zonder de pathologie, kan worden gesteld dat de kans groot is dat de causale genetische afwijking zich in dat gebied bevindt. 2.3.4.2: Lod-score
Figuur 7: Illustratie bij de onderstaande tekst
________________________________________________________________________________ 20
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________ Stel dat er twee merkers zijn met als allelen A, a en B, b. In de bovenstaande figuur wordt een gezin weergegeven waarbij de vader als haplotypes AB en ab heeft. De mogelijke gameten zijn dan: AA, AB, aB en Ab. De laatste twee haplotypes zijn het resultaat van recombinatie tijdens de meiose zoals is opgetreden bij de dochter. Wanneer deze twee merkers onafhankelijk van elkaar worden overgeërfd, dan komen de gameten alle vier even frequent voor. Soms erven merkers niet onafhankelijk van elkaar over en zullen er meer niet-recombinante haplotypes voorkomen dan recombinante haplotypes. Wanneer dat gebeurt, is er sprake van genetische koppeling tussen de merkers. De recombinatiefractie (θ) wordt gedefinieerd als de verhouding recombinanten/niet-recombinanten. Als overerving tussen twee merkers onafhankelijk gebeurt, dan is deze recombinatiefractie gelijk aan 1/2. Is er echter volledige koppeling, dan is de recombinatiefractie gelijk aan nul. Een recombinatiefractie kan worden berekend wanneer overerving van merkers wordt bestudeerd binnen een familie. In de situatie zoals voorgesteld in figuur zeven is de recombinatiefractie 1/3. Het kan echter zijn dat de berekende recombinatiefractie afwijkend is van de recombinatiefractie zoals die optreedt in de populatie. De Lod-score (logarithm of odds) is echter een statistische methode om te bepalen hoe waarschijnlijk de berekende recombinatiefractie de werkelijkheid benadert. De Lod-score wordt berekend aan de hand van de volgende formule: Lod(θ) = log(L(θ)/L(0,5)) L(θ) is de kans dat de berekende recombinatiefractie gelijk zou zijn aan de werkelijke recombinatiefractie. L(0,5) is de kans dat de berekende recombinatiefractie zou bekomen worden als resultaat in een experiment als de overerving onafhankelijk zou zijn. L(θ) wordt berekend met de formule: L(θ)= (1-θ)a x θb met a= het aantal recombinante haplotypes en b= niet-recombinante haplotypes Een lod-score groter dan drie wordt aanvaard als koppeling. Een lod-score kleiner dan twee sluit koppeling uit. En een lod-score tussen deze grenzen is niet conclusief. 2.3.4.3: Mastermix Tabel 1: Overzicht mastermix voor koppelingsonderzoek Component
µl per reactie
Buffer (10X)
1,5
dNTP’s(1mM)
3
H2O
6,2
10% DMSO
0,7
MgCl2(50mM)
0.3
Forward primer(30µM)
0.2
________________________________________________________________________________ 21
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________ Reverse primer(30µM)
1
Platinum Taq polymerase
0.1
(5U/µl) Labelled M13 primer
1
gDNA (100 ng/µl)
1
TOTAAL
15
2.3.4.4: Protocol Bij koppelingsanalyse wordt een PCR-reactie gedaan zoals eerder beschreven maar met dit verschil dat er ook labeled M13 primer wordt gebruikt. Dit is een fluorescente label dat aan de primers wordt gehecht en belangrijk is bij de analyse van het PCR-product door de ABI 3100 Genetic Analyser. Deze voert een capillaire electoforese uit, gebaseerd op het reeds beschreven principe van de agarosegelelektroforese. Om het eenvoudig voor te stellen kan de werking van de ABI 3100 Genetic Analyser in een aantal stappen beschreven worden: I.
Labelen: De DNA-fragmenten worden tijdens de PCR-reactie gelabeld met een fluorescente M13 label.
II.
Elektroforese: De verschillende DNA-fragmenten worden in een capillair geïnjecteerd die een polymeer bevatten. De ABI 3100 bevat 16 capillairen die tegelijkertijd kunnen worden geladen. Na het laden wordt er een elektrisch veld aangelegd en beginnen de fragmenten te migreren naar de positieve pool toe. Naar analogie van de agarosegelelektroforese migreren de kleinste fragmenten het snelst en de grootste fragmenten het traagst.
III.
Detectie: De fragmenten gaan voorbij een detectiecel waar ze worden onderworpen aan een lasterstraal. Hierdoor wordt elke label geëxciteerd waardoor dit fluoresceert. Dit fluoresceren wordt gecapteerd door een CCD-camera. CCD staat voor charged coupled device. Deze CCD-camera zet de fluorescentie om in digitale informatie. Het is aan software om deze bekomen digitale informatie om te zetten in te interpreteren data.
IV.
Elektroferogram: De bekomen informatie wordt weergegeven door het programma Genemapper v3.7 in een elektroferogram. Hierbij wordt de graad van fluorescentie uitgezet op de y-as in functie van de tijd op de x-as.
V.
Voorbeeld: (zie figuur)
Figuur 8: voorbeeld van het elektroferogram bij een koppelingsonderzoek
________________________________________________________________________________ 22
Materialen en methoden __________________________________________________________________________________ 2.3.4.5: Analyse De verschillende lengte van de markers werden geanalyseerd en ingebracht in het programma progeny 6. 2.4: Doelstelling De doelstelling van deze thesis is het ontrafelen van de genetische basis van aorta aneurysma’s. De specifieke doelstellingen zijn: I.
Verrichten van literatuuronderzoek om inzicht te verwerven in de verschillende genetische syndromen met hun specifieke genmutatie. Het bestuderen van zeldzame genetische ziektes waarbij een predispostie bestaat voor de ontwikkeling van aorta aneurysma’s laat toe om tot een beter begrip te komen rond de pathogenese van aorta aneurysma’s. Het zoeken naar kandidaatgenen welke later dan zouden dienen om een cohorte patiënten te screenen die negatief getest hebben op FBN 1, TGFBR 1 en 2, ACTA 2.
II.
Het uitvoeren van een koppelingsonderzoek voor acht merkers binnen een familie welke negatief testte op FBN1, TGFBR1/2 en ACTA 2.
III.
Het screenen van een cohorte van zesendertig patiënten met aorta aneurysma’s voor mutaties op een kandidaatgen calponine.
________________________________________________________________________________ 23
Resultaten __________________________________________________________________________________
3. Resultaten 3.1: Resultaten literatuuronderzoek 3.1.1.: Genetische syndromen die voorbeschikken tot type A aorta dissecties Een aantal genetische syndromen hebben een verhoogde kans op het ontwikkelen van thoracale aorta aneurysma’s. Het meest bekende is het Marfan syndroom. Andere genetische syndromen die tot thoracale aorta aneurysma’s leiden zijn het Loeys-Dietz syndroom, Ehlers-Danlos syndroom (vasculaire vorm) en filamine A mutaties. De meeste patiënten met een aneurysma hebben geen genetisch syndroom maar velen hebben wel een familiale aanleg (zie 3.1.2). 3.1.1.1: Marfan Syndroom Het Marfan syndroom (MFS) is een autosomaal dominante aandoening gekenmerkt door pleiotrope manifestaties, hoge penetrantie en inter- en intrafamiliale variabiliteit. Het heeft een wereldwijde prevalentie van één op vijfduizend en wordt veroorzaakt door een mutatie in het fibrilline-1 gen (FBN1). Wat de kliniek betreft, treden vooral skeletale, oculaire en cardiovasculaire afwijkingen op.
Skeletale afwijkingen zijn pectus deformaties, kyfoscoliose, dolichostenomelia (lange en smalle ledematen), arachnodactyly, elleboogcontracturen, columna vertebralis fracturen en pes planus te weerhouden. Wat de oculaire aantasting betreft, zijn ectopia lentis (lensdislocaties), myopie (bijziendheid), retina loslating, cataract en glaucoom te noteren. Dit alles kan leiden tot ernstig zichtverlies en zelfs blindheid. De cardiovasculaire afwijkingen vormen de belangrijkste reden waarom een MFS patiënt vroegtijdig het leven laat. Binnen de cardiovasculaire kenmerken is een onderscheid te maken tussen majeure en mineure manifestaties. Mineure manifestaties zijn arteria pulmonalis dilatatie, myxomateuse degeneratie van de mitralisklep en abdominale aorta dilatatie. De majeure manifestaties (aorta aneurysma’s en dissecties) zijn echter belangrijker omdat zij de belangrijkste oorzaak van mortaliteit en morbiditeit bij MFS vertegenwoordigen (Loeys et al., 2008). Deze majeure manifestaties zijn het gevolg van pathologische veranderingen welke optreden in de tunica media en de extracellulaire matrix (ECM). Op basis van muisproeven kan men concluderen dat de elastinevezels normaal zijn bij de geboorte. De eerst waarneembare afwijking is het verlies van de door microfibrillen verzorgde verbinding tussen de elastinevezels en de gladde spiercellen. Het verlies van deze verbindingen leidt tot de verhoogde vrijstelling van extracellulaire matrix proteïnes en matrix-degenerende enzymes zoals matrixmetalloproteïnasen 2 en 9. Later treedt er dan een toegenomen afbraak van elastinevezels op en rekrutering van inflammatoire cellen, leidend tot aorta dilatatie en dissectie (Matt et al., 2008). Een dissectie doet zich gemiddeld voor rond de leeftijd van tweeëndertig jaar (Kirchner et al., 2008). Adequate opvolging en behandeling drijft de gemiddelde levensduur echter op tot ongeveer tweeënzeventig jaar (Silverman et al., 1995). ________________________________________________________________________________ 24
Resultaten __________________________________________________________________________________ Bij MFS worden nog andere orgaansystemen getroffen. Faciaal vertoont een patiënt met MFS een antimongoloïde oogstand, enofthalmie en retrognathie. Pulmonale manifestaties zijn onder andere pneumothorax en emfyseem. In de huid kan een MFS patiënt striae distentiae vertonen. Ook hernia inguinalis komt meer bij Marfan voor. Bovendien worden MFS patiënten ook gekarakteriseerd door spierhypotonie.
Klinische diagnose kan gesteld worden op basis van de Ghent nosology (zie bijlage 1). Hierbij worden de klinische gegevens apart gewogen en een diagnostische beslissing wordt op basis hiervan genomen (Kirchner et al., 2008). Er is een algemene consensus dat genetische testen aangewezen zijn wanneer de klinische diagnose onzeker is (Boileau et al., 2005). De diagnose wordt in het algemeen gesteld door de kliniek, beeldvorming, familiale anamnese en genetische screening (Kirchner et al., 2008).
MFS wordt veroorzaakt door een mutatie in het fibrilline-1 gen (FBN1) op chromosoom 15. Fibrilline, een glycinerijk glycoproteïne, vormt een belangrijk bestanddeel van de microfibrillen van de extracellulaire matrix (ECM) en wordt teruggevonden in de periferie van elastinevezels (Milewicz et al., 2008). Microfibrillen zorgen voor structurele versterking en kunnen associëren met elastine vezels welke elasticiteit geven aan de weefsels. Deze microfibrillen kunnen ook dienen als opslagplaats van transforming growth factor beta (TGF-β) (Loeys et al., 2008). Reeds meer dan duizend vijfhonderd mutaties zijn geïdentificeerd. De meeste mutaties zijn missense mutaties (Milewicz et al., 2008). Screening naar een mutatie in dit gen laat moleculaire diagnose toe in negentig percent van de gevallen (Loeys et al., 2008).
Naast dysfunctie van fibrilline zijn er ook stoornissen in de regulatie van de TGF-β signaaltransductie. Deze laatste blijken een belangrijke rol te spelen in de pathogenese van aorta aneurysma’s, emfyseem en spierhypotonie in de ziekte van Marfan. Het is belangrijk naast de primaire structurele oorzaak de secundaire oorzaak (cytokine signalisatie) niet uit het oog te verliezen (Loeys et al., 2008).
TGF-β wordt gesynthetiseerd als een prepropolypeptide welke verder wordt gemodificeerd in een post-Golgi compartiment om zo de mature vorm van TGF-β en een peptide met de naam latencyassociated peptide (LAP) te genereren. Homodimeren van TGF-β en LAP vormen het small latent complex (SLC). SLC bindt zich op een covalente manier door middel van disulfidebruggen op een eiwit met de naam LTBP (latency-associated TGF-β binding protein). Dit complex verlaat de cel waarbij het LTBP als functie heeft de binding van het complex met de ECM te richten. Het complex bindt met fibrilline bevattende microfibrillen, waarvan aangewezen is dat ze LTBP’s rechtstreeks binden. TGF-β kan worden vrijgesteld door deze mature groeifactor los te koppelen van LAP. Dysfunctie van fibrilline zou dus leiden tot een verstoorde opslagfunctie van TGF-β door de ________________________________________________________________________________ 25
Resultaten __________________________________________________________________________________ extracellulaire matrix. Hierdoor is er een verhoogde beschikbaarheid van TGF-β voor activatie. Dit alles zou leiden tot een verhoogde signaalfunctie van TGF-β (Jones et al., 2009). De verhoogde TGF-β signalisatie wordt gesuggereerd uit een onderzoek waarbij muizen met FBN1 mutatie longafwijkingen vertoonden ten gevolge van een verhoogde TGF-β signalisatie. Perinatale administratie van TGF-β antilichamen kon de verdere evolutie naar pulmonale dysfunctie een halt toeroepen (Neptune et al., 2003).
Tien percent van de patiënten waarbij MFS als diagnose gesteld wordt, vertonen geen mutatie in het fibrilline-1 gen. Voor deze patiënten werd koppeling gevonden met een locus op chromosoom 3. De vondst van deze koppeling leidde tot het ontstaan van het Marfan syndroom type 2 (MFS type 2). Uit verdere analyse blijkt dat het onderliggend defect een mutatie in de TGF-β type 2 receptor (TGFBR2) is (Jones et al., 2009). Dit is een missense mutatie die de splicing verhindert in het kinase domein van de receptor (Milewicz et al., 2008). Klinisch is het erg gelijkend op het klassieke MFS behalve dat ectopia lentis nog nooit is beschreven bij patiënten met MFS type 2 maar dit klinisch gegeven kan niet gebruikt worden voor de diffirentiaal diagnose met MFS type 1 omdat ectopia lentis niet altijd aanwezig is in MFS type 1. Dit alles heeft ertoe geleid dat de definitie van MFS evolueerde van een bindweefselziekte naar een stoornis in de ontwikkeling met brede en complexe gevolgen op de vorming van verschillende orgaansystemen (Loeys et al., 2008).
Losartan zou een gunstig effect hebben want naast de blokkade van de angiotensine-1 receptor blokkeert het ook de TGF-β signaaltransductie (Milewicz et al., 2008). De resultaten op muizen zijn veel belovend. Het is echter niet uit te sluiten of deze medicatie ook niet werkt via onbekende feedback en andere signaalcascademechanismen. Verder onderzoek is hier nog noodzakelijk (Matt et al., 2008). Een gerandomiseerde studie wordt nu uitgevoerd of de behandeling met losartan effectief positieve effecten heeft in vergelijking met de standaard behandeling met β-blokkers. Niet alleen losartan maar in de literatuur wordt ook doxycycline als mogelijke behandeling voorgesteld want dit zou een niet-specifieke metalloproteïnase inhibitor zijn van MMP-2 en MMP-9 (Milewicz et al., 2008). Dit geneesmiddel zou goede effecten hebben op aorta aneurysma’s door verminderen van elastinevezel degeneratie, het verbeteren van de vasomotorische functie en leiden tot vermindering van TGF-β activatie. Langdurige behandeling met doxycycline zou zelfs beter zijn dan langdurige behandeling met β-blokkers (Ada et al., 2008). Al deze therapieën zouden de mogelijkheid hebben om verschillende compensatoire mechanismen, die van de gladde spiercel uitgaan, te blokkeren (Milewicz et al., 2008).
________________________________________________________________________________ 26
Resultaten __________________________________________________________________________________ 3.1.1.2: Loeys-Dietz syndroom (LDS) Deze ziekte wordt veroorzaakt door een heterozygote mutatie in het transforming growth factor-β receptor type 1 (TGFBR1) gen ofwel in het transforming growth factor-β receptor type 2 (TGFBR2) gen (Milewicz et al., 2008), respectievelijk optredend in een derde en twee derde van de patiënten (Williams et al., 2007). Dit syndroom wordt autosomaal dominant overgeërfd en kent een variabele klinische weergave (Loeys et al., 2005). LDS wordt gekarakteriseerd door een triade van symptomen zijnde hypertelorisme, een gespleten uvula/verhemelte en arteriële tortuositas welke kan verder evolueren naar het ontwikkelen van aorta aneurysma’s en dissecties (Loeys et al., 2008).
Sommige patiënten lijdend aan het Loeys-Dietz syndroom (LDS) vertonen een zekere overlap met het Marfan syndroom (MFS) maar deze patiënten voldoen niet aan de diagnostische criteria van MFS. Uitgesproken beengroei en lensdislocatie zijn symptomen die wel kunnen voorkomen bij Marfan patiënten maar niet bij het LDS. Daartegenover staat dat andere symptomen karakteristiek zijn voor het Loeys-Dietz syndroom maar dan weer niet voor Marfan. Voorbeelden hiervan zijn craniosynostose, patente ductus arteriosus en aneurysma’s voorkomend in elke arteriële tak. Deze symptomen zijn allemaal typische manifestaties van LDS type 1. Daartegenover staat het Loeys-Dietz syndroom type 2 welke gekarakteriseerd wordt door minder craniofaciale afwijkingen maar meer prominente huid- en gewrichtsdysfuncties (Loeys et al., 2008). Een gevoelige en doorschijnende huid, snelle ecchymosevorming, brede atrofe littekens, uterus ruptuur, ernstige bloedingen peripartum en aneurysma’s die in elke arterie kunnen voorkomen zijn typische klinische tekens voor Loeys-Dietz syndroom type 2 (Loeys et al., 2008).
De mutaties zijn vaak missense mutaties in het intracellulair kinase van TGF-β receptor type 1 of 2. Men zou verwachten dat dit gepaard gaat met een verlaagde TGF-β signaal functie maar paradoxaal wordt een verhoogde TGF-β signalisatie teruggevonden in de tunica media van de aorta. Dit werd geconcludeerd uit de waarneming van verhoogde expressie van zowel collageen als CTGF (connective tissue growth factor). Bepaalde types collageen worden gestimuleerd door TGF-β en CTGF is een groeifactor welke ook door TGF-β wordt gestimuleerd. Ook werd een verhoogd gehalte van fosfosmad2 in de celkern teruggevonden. Fosfo-smad2 is een essentieel onderdeel van de TGF-β signaaltransductie. Al deze waarnemingen pleiten voor een verhoogde TGF-β activiteit (Loeys et al., 2005). Er geldt nu de hypothese dat, ondanks de aanwezigheid van de disfunctionele TGF-β receptoren, een wild-type receptor zijn gevoeligheid voor TGF-β behoudt en zelfs een verhoogde activiteit vertoont. Dus ook hier geldt de veronderstelling dat een verhoogde TGF-β signaaltransductie de drijfveer is achter de aorta dilatatie en aneurysma vorming (Jones et al., 2009). Dit zou ook hier perspectieven kunnen openen voor de behandeling door het TGF-β inhiberende losartan (Loeys et al., 2008). ________________________________________________________________________________ 27
Resultaten __________________________________________________________________________________ Het klinisch verloop is bij dit syndroom zeer agressief. De gemiddelde levensduur is niet langer dan zesentwintig jaar (Loeys et al., 2008). Ruptuur van de aorta gebeurt dus op jonge leeftijd en vaak wanneer de aorta nog niet breder is dan vijf centimeter welke als arbitraire grens geldt om tot chirurgische interventie over te gaan (Milewicz et al., 2008). Voor LDS is de diameter, welke de beslissing richt om tot profylactisch chirurgisch herstel over te gaan, gelijk aan vier cm. Frequente echocardiografische evaluaties van de aortawortel in combinatie met een jaarlijkse CT of MR angiografie worden tevens aangeraden. Vroege herkenning van het LDS, vroegtijdige interventie en nauwgezette opvolging van de distale aorta en diens zijtakken zijn noodzakelijk om een goede behandeling te garanderen (Williams et al., 2007). 3.1.1.3: Ehlers-Danlos syndroom Het Ehlers-Danlos syndroom (EDS) is een heterogene groep van bindweefselziekten, welke wordt gekarakteriseerd door gewrichtshypermobiliteit en huidafwijkingen zoals huidhyperlaxiteit, striae, atrofische littekens en snelle ecchymosevorming. Er zijn zes types beschreven die verschillen op basis van de manifesterende symptomen, het oorzakelijk gen en het overervingpatroon (Watanabe et al., 2008). De belangrijkste types zijn de klassieke, de hypermobiele en vasculaire EDS types.
De klassieke en hypermobiele EDS types worden gekenmerkt door mutaties in het COL5A1 en COL5A2 gen en (minder frequent voorkomende) mutaties in genen die coderen voor collageen type I (COL1A1 en COL1A2). Bij deze EDS types wordt wel een dilatatie van de aorta beschreven, maar noch de progressie van deze dilatatie noch het voorkomen van een fataal event zoals een aorta dissectie is beschreven. Dit staat in schril contrast met het vasculaire type (Loeys et al., 2008). Het vasculaire type wordt qua kliniek als meest ernstige EDS type beschouwd (Watanabe et al., 2008).
Het vasculair EDS-type (vroegere naam: EDS type IV) is het resultaat van een autosomaal dominante heterozygote mutatie in het type III procollageen (COL3A1). Patiënten hebben een verhoogde kans op aneurysma’s of dissecties. Deze kunnen optreden bij middelgrote thoracale arteriën en abdominale arteriën. EDS type IV patiënten kunnen ook slachtoffer zijn van aorta aneurysma’s en dissecties. Wat de verhouding is van aantasting van de aorta ten opzichte van andere arteriën is nog niet goed beschreven (Milewicz et al., 2008). Het is echter onduidelijk of aneurysmavorming steeds dissectie voorafgaat (Loeys et al., 2008). Patiënten worden gemiddeld maar achtenveertig jaar (Milewicz et al., 2008).
Een vierde van de patiënten met EDS type IV ondervinden al
gezondheidsproblemen voor de leeftijd van twintig jaar en meer dan tachtig percent van de patiënten ondervinden al problemen op veertigjarige leeftijd (Sharma et al., 2009). Pogingen om arteriën te reconstrueren zijn vaak erg ingewikkeld omwille van de aanwezigheid van zeer broos weefsel. Doordat de ziekte zich op verschillende plaatsen manifesteert, is de behandeling van de ziekte niet eenvoudig en vaak niet succesvol (Loeys et al., 2008). ________________________________________________________________________________ 28
Resultaten __________________________________________________________________________________ Het belangrijkste kenmerk van EDS type IV patiënten zijn arteriële scheuren, maar een kwart van alle belangrijke complicaties zijn milt-, uterus- en darmscheuren welke colostomie noodzaken (Loeys et al., 2008). Bovendien hebben deze patiënten een doorschijnende huid, slecht genezende wonden en atrofe littekens (Milewicz et al., 2008). Ook wordt een verhoogd voorkomen van pneumothorax genoteerd. EDS vasculaire vorm wordt dus herkend op basis van vier klinische kenmerken: scheuren van bloedvaten of collageen 3 bevattende organen (darmen); de aanwezigheid van karakteristieke gelaatsvormen (dunne lippen, kleine kin, smalle neus en grote ogen); snelle ecchymosevorming; en een doorzichtige huid met duidelijk zichtbare venen (Watanabe et al., 2008). In tegenstelling tot andere EDS types komen atrofe littekens en hyperlaxiteit van de gewrichten niet voor (Sharma et al., 2009). De diagnose van dit type EDS wordt gesteld op basis van een verminderd gehalte aan type III collageen of op basis van een mutatie. De mutaties kunnen een mutatie zijn leidend tot een gewijzigde aminozuur in het eiwit of een mutatie zijn in een splice-site (Watanabe et al., 2008).
De mutatie heeft een dominant negatief effect in de vorming van collageen type 3. Bij een heterozygote mutatie valt de oorspronkelijke hoeveelheid normaal collageen tot een achtste terug (Watanabe et al., 2008). De contractiliteit van gladde spiercellen kan worden verstoord door de mutatie in het gen COL3A1. Collageen 1 en 3 maken een belangrijk onderdeel uit van de aortawand. Bij EDS type IV kan de gladdespiercelcontractiliteit gestoord zijn doordat de gladde spiercel wordt gebonden aan het collageen (Milewicz et al., 2008).
Een specifiek EDS type dat ook gepaard gaat met aorta fragiliteit is het EDS kyfoscoliotisch type. Dit type wordt gekenmerkt door het voorkomen van kyfoscoliose, gewrichtslaxiteit en spierhypotonie. Deze autosomaal recessieve aandoening wordt gekenmerkt door een mutatie in het PLOD gen wat een enzymatische dysfunctie veroorzaakt van lysyl hydroxylase (Loeys et al., 2008). 3.1.1.4: Cutis laxa Cutis Laxa vormt een heterogene groep van extreem zeldzame bindweefselziekten, gekarakteriseerd door een toegenomen aantal niet elastische huidplooien. Klinische classificatie is gebaseerd op de wijze waarop de ziekte wordt overgeërfd en de aanwezigheid van systemische manifestaties. Histologisch wordt de ziekte gekenmerkt door gefragmenteerde en dunne elastinevezels. Cutis laxa is één van de bindweefselziekten die worden gekarakteriseerd door een gewijzigde synthese, afbraak en verminderde stabiliteit van de elastinevezels (Rodriguez-Revenga et al., 2004). Twee klinische vormen zijn van belang in het kader van aorta aneurysma’s zijnde autsomaal dominante (ADCL) en type 1 autosomaal recessieve (ARCL) cutis laxa (Loeys et al., 2008). Daarnaast bestaat er ook een Xgebonden recessieve vorm met een mutatie in het ATP7A gen. Deze vorm behoort tot de koper deficiëntie syndromen. ATP7A gen codeert voor het eiwit ATP7A Cu2+-transporter. Cu2+ is een belangrijke cofactor van het lysyl oxidase, een belangrijke enzymfamilie noodzakelijk voor het cross________________________________________________________________________________ 29
Resultaten __________________________________________________________________________________ linken van collageen en elastine (Moller et al., 2000). Bij de geboorte hebben deze patiënten een karakteristieke klinische presentatie. Naast gegeneraliseerde cutis laxa hebben ze een smal gezicht, een hoekige neus, groot voorhoofd en grote fontanel. Systemisch worden ze gekenmerkt door een vertraagde ontwikkeling door chronische diarree, malabsorptie, congenitale hydronefrose, urethrale en blaasdiverticulae. Maar diagnostisch is het voorkomen van occipitaal voorkomende exostose (Morava et al., 2009). ADCL werd aanvankelijk omschreven als een louter dermatologische aandoening met veralgemeende huidplooien maar later is gebleken dat deze ziekte ook gepaard gaat met emfyseem en verbreding van de aorta met ruptuur bij de jonge volwassene. Mutaties in het elastine en het fibuline 5 gen worden geassocieerd met deze vorm van cutis laxa (Loeys et al., 2008). De pathologie van de aorta is niet te onderscheiden van wat gezien wordt bij het Marfan syndroom. Bij Marfan is er een verstoring in de microfibrilconstellatie waardoor er een verstoorde verankering van de gladde spiercel aan het elastine optreedt, wat de integriteit van de aortawand compromitteert. Laesies in de microfibril-elastine interacties, optredend in het kader van cutis laxa, doet een gemeenschappelijk pathologisch mechanisme met MFS vermoeden. Een hypothese zou kunnen zijn dat een mutatie in het elastine gen een toename geeft van aberrant tropo-elastine. Tropo-elastine is het genproduct van het elastinegen en polymeriseert tot het eiwit elastine. Een verscheidenheid aan normaal en gewijzigd elastine zou dit gevoeliger maken voor proteolyse leidend tot de afbraak van molecules betrokken in de microfibrilelastine interactie. Een mutatie zou ook dominant negatief kunnen werken (Szabo et al., 2006). Verschillende autosomaal recessieve vormen van cutis laxa zijn bekend, maar de meeste worden onderverdeeld onder een type 1 en 2. Het klinische spectrum is zeer heterogeen zowel wat de organen die in de pathologie worden betrokken als de ernst van de ziekte betreft (Morave et al., 2009). Type 1 autosomaal recessieve cutis laxa (ARCL) is een perinataal voorkomende levensbedreigende aandoening en wordt gekarakteriseerd door algemene cutis laxa, ernstig longemfyseem en genitourinaire/gastro-intestinale divertikels. Arteriële tortuositas en aneurysmavorming met ernstige fragmentatie van de elastine vezels worden bij zowel mensen als muizen genoteerd. Tot dusver werden genetische defecten in patiënten met ARCL type 1 geïndentificeerd in het fibuline 4 en 5 gen (FBLN 4 en FBLN 5) (Loeys et al., 2008). Fibuline-5 is een eiwit dat noodzakelijk is voor de vorming van elastinevezels. Recessieve cutis laxa mutaties leiden tot verkeerde vouwen, verminderde synthese en verminderde secretie van fibuline-5 en een verminderde interactie tussen elastine en fibrilline-1. Dit alles leidt tot een gestoorde elastinevezelvorming. Fibuline-5 zou noodzakelijk zijn voor elastinevezelvorming door het vergemakkelijken van het afgeven van elastine op het uit microfibrillen bestaande skelet via directe moleculaire interacties (Hu et al., 2006).
________________________________________________________________________________ 30
Resultaten __________________________________________________________________________________ 3.1.1.5: Arterieel tortuositas syndroom (ATS) ATS is een zeldzaam autosomaal recessieve bindweefselziekte, voornamelijk gekarakteriseerd door ernstige tortuositas, stenose en aneurysma’s ter hoogte van middelgrote en grote arteriën, waaronder de aorta, ten gevolge van stoornis van de elastinevezels (fragmentatie) in de tunica media van de aortawand. Dit resulteert vaak in vroegtijdig overlijden van de patiënt. Bovendien vertonen patiënten met dit syndroom vaak typische gezichtsafwijkingen en bindweefselaantastingen (gewrichtslaxiteit bijvoorbeeld) (Coucke et al., 2006). Dit fenotype wordt voornamelijk veroorzaakt door een loss of function mutatie in het SLC2A10 gen. Dit gen codeert voor een glucose transporter (Glut10). Het lijkt eigenaardig dat een mutatie in een glucose transporter een dergelijk ziektebeeld kan veroorzaken maar een mutatie in het gen coderend voor de glucose transporter zorgt ervoor dat er een opregulatie is van de TGF-β signaaltransductieweg net zoals gezien wordt bij het Loeys-Dietz syndroom en het Marfan syndroom (Loeys et al., 2008). Decorin is een proteoglycan inhibitor van TGF-β in de extracellulaire matrix en inhibeert de mogelijkheid van TGF- β te interageren met de TGF-β receptoren. Decorin wordt ten dele gereguleerd door een glucosegevoelig element in diens promotor. Gladde spiercellen van de aortawand van patiënten lijdend aan het ATS blijken een ernstig verminderde expressie van decorin te vertonen in vergelijking met controlecellen (Jones et al., 2009). Er zijn een aantal argumenten aan te brengen om dit mechanisme niet reeds als correct pathogenetisch mechanisme te aanvaarden. Ten eerste geldt GLUT 10 niet enkel als een glucosetransporter maar kan het verschillende substraten binden. Ten tweede is decorin niet het enige gen dat wordt gecontroleerd door glucose. Zo worden genen coderend voor in de ECM voorkomende eiwitten, thrombospondine (activator van TGF-β) en TGF-β zelf gereguleerd door glucose. Tot slot, TGF-β1 vervult een belangrijke rol in weefselhomeostase en is vaak verhoogd onder pathologische omstandigheden. Het is dan ook niet uit te sluiten of TGF-β1 verhoogd is ten gevolge van het pathologisch proces of juist de pathologie veroorzaakt (Akhurst, 2006). 3.1.1.6: Turner syndroom Turner syndroom wordt gekarakteriseerd door de complete of partiële afwezigheid van een X chromosoom, welke aanleiding geeft tot spontane abortus, primair hypogonadisme, kleine gestalte en andere fenotypische abnormaliteiten. Eén tot twee percent van de embryo’s heeft Turner waarvan zevenennegentig percent spontaan aborteert. Tien percent van alle spontane vroegtijdige zwangerschapsonderbrekingen zijn het gevolg van het optreden van Turner syndroom. Desalniettemin lijdt één meisje op tweeduizendvijfhonderd aan de ziekte. De helft van de gevallen heeft slechts één X-chromosoom (45, X0 karyotype). Andere patiënten met Turner hebben aberrante X-chromosomen of X-chromosomen deleties die alle of slechts een deel van de lichaamscellen treft (mosaïcisme, XX/X0). ________________________________________________________________________________ 31
Resultaten __________________________________________________________________________________ Manifestaties van het Turner syndroom zijn variabel en kunnen subtiel zijn bij meisjes lijdend aan mosaïcisme. Bij een mosaïcisme hangt het fenotype dan ook af van de anatomische distributie van 45,X celpopulaties. De meest voorkomende fenotypische manifestaties bij Turner patiënten zijn de kleine gestalte ondanks normaal groeihormoon gehalte en uitblijvende menses of prematuur ovarieel falen. Mits vroegtijdige diagnose en adequate behandeling vertonen Turner patiënten volledige feminisatie en bereiken ze een gemiddelde lengte (Fitzgerald, 2010). Turner patiënten hebben een verhoogd risico op coarctatio aortae (11%) en bicuspide aortakleppen (16%). Deze abnormaliteiten komen meer voor bij patiënten met een webbed nek (Fitzgerald, 2010). Bicuspide aortakleppen zijn geassocieerd met een verhoogd risico voor aorta ascendens aneurysma’s en dissecties. Het is daarom aangewezen om patiënten hiervoor zorgvuldig op te volgen. Elke Turner patiënt zou een echo en/of een MRI van thorax en abdomen moeten ondergaan om tijdig cardiale, aorta en renale (o.a. hydronefrose) afwijkingen te onderkennen. Het Turner syndroom is geassocieerd met een honderdmaal verhoogd risico op aorta dissectie. Patiënten met een gedilateerde aorta worden behandeld met β-blokkers en gevolgd met seriële beeldvorming. De incidentie voor aorta dissecties is significant gestegen bij elke leeftijd maar het risico is vooral verhoogd gedurende de jonge volwassenheid en tijdens zwangerschap. Kinderen met dissecties hebben vaak gekende cardiovasculaire afwijkingen (bicuspide aortaklep, coarctatio aortae) maar een gedilateerde aorta bij volwassenen kan vaak pas worden ontdekt via screeningsbeeldvorming. Gezien de typische kleine gestalte van Turner patiënten, dient de dilatatie in relatie worden gesteld met hun lichaamslengte. De beste methode voor het bepalen van aortadilatatie is het normaliseren van de aortadiameter aan het lichaamsoppervlak (Bondy, 2008). Zwangere vrouwen wordt aangeraden om te bevallen met een keizersnede omdat aorta aneurysma’s kunnen scheuren tijdens een vaginale partus (Fitzgerald, 2010). Turner patiënten die een verhoogd risico lopen voor de ontwikkeling van een aortadissectie, zijn dus patiënten met een bicuspide aortaklep of coarctatio aortae. De jonge gemiddelde leeftijd waarbij aorta dissecties optreden, de hoge incidentie tijdens zwangerschap en degeneratieve aortawandafwijkingen suggereren dat Turner syndroom ook een bindweefselcomponent heeft ondanks de afwezigheid van gewrichtslaxiteit en lensdislocaties in de kliniek. Specifieke moleculaire studies naar de functie van elastine en het aantal en de survival van de gladde spiercellen moeten nog uitgevoerd worden. Deze studies kunnen eventueel een methode aanreiken voor het vinden van vroegtijdige detectiemethoden om patiënten die risico lopen in het licht te stellen. Verder onderzoek moet duidelijk maken of het risico voor de ontwikkeling van een dissectie meer geassocieerd is met de aortopathie dan wel het vaak samengaand voorkomen van bicuspide kleppen of coarctatio. Zo zal duidelijk worden of ook Turner patiënten voordeel putten uit profylactische chirurgische interventies en medicamenteuze interventies ingrijpend op het TGF-β mechanisme (Bondy, 2008).
________________________________________________________________________________ 32
Resultaten __________________________________________________________________________________ 3.1.1.7: Noonan syndroom Het Noonan syndroom omvat mannelijke patiënten met heel wat fysieke kenmerken karakteristiek voor patiënten lijdend aan het Turner syndroom. Vandaar dat dit syndroom ook soms het Male Turner’s Syndrome wordt genoemd. Het treft tussen de één op duizend tot één op tweeduizend vijfhonderd levendgeborenen. Het kan familiaal voorkomen en op een autosomaal dominante manier worden overgeërfd met een variabele penetrantie. Ongeveer de helft van de patiënten hebben een mutatie in het PTPN11 gen gelegen op chromosoom twaalf. Het codeert voor een fosfatase (SHP-2), een signaalmolecule welke instaat voor cellulaire proliferatie, differentiatie en migratie. Maar vele patiënten vertonen de ziekte als gevolg van een de novo mutatie (Braustein, 2007). Een ander gen waarin mutaties worden gevonden is het KRAS-gen. Net als het PTPN11 gen speelt dit een rol in de Ras-signaaltransductieweg waarbij het zowel de rol van oncogen vervult als een gen betrokken in de ontwikkeling (Jorge et al., 2009). De meest prominente klinische manifestaties zijn een kleine gestalte, een webbed nek, hypertelorisme, cubitus valgus, een verhoogde bloedingsneiging en een verminderde cognitieve functie. Er worden ook andere lichamelijke afwijkingen genoteerd maar deze zijn variabel. Zo worden congenitale hartafwijkingen gevonden bij vijftig tot tachtig procent van de patiënten. Cryptorchidie komt ook voor bij patiënten lijdend aan dit syndroom. Het karyotype van deze patiënten is normaal (46,XY) zodat het onderscheid met XY/XO mosaïcisme kan gemaakt worden (Braustein, 2007). De meest frequente congenitale hartafwijkingen zijn een pulmonaalstenose en hypertrofe cardiomyopathie. Het Noonan syndroom moet ook overwogen worden bij een patiënt met een aortadilatatie want er werd bij een aantal patiënten met het Noonan syndroom een aortadilatatie vastgesteld. Het is echter niet steeds voorkomend in het klinisch spectrum van het Noonan syndroom (Power et al., 2005). 3.1.1.8: Filamine A mutaties Filamine A is een X-gebonden aandoening die een hersenaandoening, met name periventriculaire heterotopie, veroorzaakt. Mannelijke foetussen met een mutatie bevattend X-chromosoom zouden niet levensvatbaar zijn. Getroffen vrouwen hebben een toegenomen aantal abortussen. Filamine A-gen codeert voor een niet-spiergebonden actinebindend proteïne welke een belangrijke rol speelt in het cross-linken van corticale actine filamenten in een dynamische driedimensionele structuur. Filamine A is een component van de intermediaire filamenten in de gladde spiercel. Ook al maken deze intermediaire filamenten geen deel uit van het mechanotransductie complex, toch geldt de hypothese dat deze mutaties ook leiden tot het verbreken van de verbinding tussen de contractiele elementen enerzijds en de integrine receptoren anderzijds (Milewicz et al., 2008).
________________________________________________________________________________ 33
Resultaten __________________________________________________________________________________ 3.1.2.: Niet-syndromale familiale thoracale aorta aneurysma’s en dissecties Pas in het laatste decennium is het duidelijk geworden dat gendysfuncties bijdragen tot het voorkomen van familiaal niet-syndromale aorta aneurysma’s. Zo heeft ongeveer één patiënt op vijf een nietsyndromaal aorta aneurysma een eerstegraadsverwant met een thoracaal aorta aneurysma (TAA). In de meeste families wordt de stoornis op een autosomaal dominante manier overgeërfd met een verminderde penetrantie en variabele expressie. Dat er een familiale aanleg is, kan vaak pas ontdekt worden door beeldvorming van de familieleden. In deze families neemt de prevalentie van TAA toe met de leeftijd. Genetische screening van deze families wordt bemoeilijkt door de variabele leeftijd waarop het aneurysma zich manifesteert en door de variabele penetrantie, vooral bij vrouwelijke draagsters. De plaats van het aneurysma is bovendien ook variabel. De meest frequente locatie is de aorta ascendens.
De zoektocht naar kandidaat-genen is pas recentelijk gestart in niet-syndromale aorta aneurysma’s. Zo is uit onderzoek gebleken dat gendysfuncties (MYH11 en ACTA2: zie hieronder), leidend tot eiwitstoornissen in het contractiel apparaat van de gladde spiercel, een mogelijke rol spelen in de pathogenese van aorta aneurysma’s. Deze gendysfuncties wijzen op het belang van de gladdespiercelcontractie in het onderhouden van de structurele integriteit van de aorta ascendens. Tachtig percent van de familiale niet-syndromale aorta aneurysma’s dient nog qua genetische etiologie opgehelderd te worden. 3.1.2.1: Patente ductus arteriosus met thoracale aorta aneurysma’s (MYH11 mutaties) Een patente ductus arteriosus (PDA) is een van de meest voorkomende aangeboren cardiovasculaire malformaties (één op tweeduizend levendgeborenen). Bij patiënten waarbij een PDA tegelijkertijd optreedt met thoracala aorta aneurysma’s werden mutaties teruggevonden in het MYH11 (myosine heavy protein 11) gen, gelegen op de korte arm van chromosoom zestien. Deze codeert voor een specifiek contractiel proteïne in gladde spiercellen. Meer bepaald zorgt het voor een verstoring van Cterminale coiled-coil structuur van de myosine zware keten en verstoort het de binding met andere eiwitten waardoor de vorming van de myosine dikke filamenten niet lukt.
Alle patiënten (ook
asymptomatische) met een heterozygote mutatie vertoonden een verhoogde stijfheid van de aorta (mindere compliantie). De mutatie zorgt voor een dominant negatief effect daar het door de mutatie getroffen eiwit het wild-type eiwit in zijn werking verstoort. Deze mutatie was het eerste voorbeeld van een mutatie in een gladdespiercelproteïne leidend tot overerfbare vaatziekte (Zhu et al., 2006). Pannu et al. screenden drieënnegentig families met het voorkomen van aorta aneuysma’s zonder PDA naar MYH11 mutaties. Geen enkele MYH11 mutatie werd gevonden. Drie families met PDA en thoracale aorta aneurysma’s werden gescreend en bij twee families werd een MYH11 mutaties gevonden. Histopathologisch werd bij de MYH11 mutanten een focale hyperplasie van gladde spiercellen gevonden. Er werd echter geen verhoogde TGF-β activiteit genoteerd. Daarentegen was ________________________________________________________________________________ 34
Resultaten __________________________________________________________________________________ insulin-like growth factor-1 (IGF-1) en agiotensin-converting enzyme (ACE) verhoogd. Deze gegevens suggereren dat MYH11 mutaties uniek zijn voor het concomitant voorkomen van PDA met thoracale aorta aneurysma’s (Pannu et al., 2007). 3.1.2.2: Mutaties in het gladde spiercel α-actine en thoracale aorta aneurysma’s Dergelijke mutaties zijn de meest frequente oorzaak (14%) van niet-syndromale familiale aorta aneurysma’s. Contractie van de gladde spiercel is essentieel voor het onderhouden van bloeddruk. Deze contractie wordt tot stand gebracht door de cyclische interactie tussen het α-actine en β-myosine zware keten. Deze worden respectievelijk gecodeerd door het ACTA2 gen en MYH11 gen (3.1.2.1). ACTA2 mutaties interfereren met de aanmaak van actine filamenten en zouden zo leiden tot een verminderde gladdespiercelcontractiliteit. Bovendien zou ook ACTA 2 mutaties dominant negatief zijn (Guo et al., 2007).
ACTA2 mutaties zouden niet alleen aanleiding geven tot aorta aneurysma’s maar ACTA2 mutanten zouden ook een verhoogde kans hebben tot vroegtijdig cardiovasculair lijden zoals coronair lijden en CVA. De mutatie is slechts zeer zelden de oorzaak van cardiovasculaire insulten in de algemene populatie zonder aorta aneurysma’s. Patiënten met een ACTA2 mutatie moeten dus niet enkel gescreend worden op aorta aneurysma’s maar ook op andere cardiovasculaire occlusieve ziekten. ACTA2 mutatie als mogelijke oorzaak van aneurysma’s, coronair lijden en CVA’s suggereert dat een monogenische mutatie een spectrum aan cardiovasculaire ziekten kan veroorzaken (Guo et al., 2009). Een dergelijke mutatie ondersteunt bovendien het concept dat remodelleren van het cytoskelet een belangrijke regulator kan zijn voor de gladdespiercelcontractiliteit. Hoe het cytoskelet zijn regulerende functie uitoefent, moet nog opgehelderd worden (Kim et al., 2008). 3.1.2.3: TGF-β receptor mutaties leidend tot familiale niet-syndromale aorta aneurysma’s Mutatie in de genen coderend voor de TGF-β receptor is reeds voorgesteld als oorzaak van een kleine groep Marfanachtige patiënten en van het Loeys-Dietz syndroom. Mutaties in het TGFBR2 gen wordt ook als oorzaak van familiaal niet-syndromale aorta aneurysma’s voorgesteld. Tachtig families met niet-syndromaal voorkomende aorta aneurysma’s werden gescreend op mutaties in dit gen maar slechts vier families vertoonden een mutatie (5%). De klinische manifestaties van het Loeys-Dietz syndroom zijn afwezig. De meeste familieleden vertonen naast thoracale aorta aneurysma’s ook aneurysma’s van andere arteriën (de cerebrale, de carotiden) (Pannu et al., 2005). Ook mutaties in het TGFBR1 gen wordt zeer zelden als oorzaak van familiale niet-syndromaal voorkomende aorta aneurysma’s gezien (Milewicz et al., 2008). 3.1.2.4 : Bicuspide aortaklep in associatie met thoracale aorta aneurysma’s Eén tot twee percent van de populatie vertoont een bicuspide aortaklep (BAV). Het is de meest frequente congenitale cardiale afwijking. Bij acht procent van alle aorta rupturen wordt post-mortem een BAV teruggevonden. De helft van de patiënten met een bicuspide aortaklep hebben een aorta ________________________________________________________________________________ 35
Resultaten __________________________________________________________________________________ dilatatie. In de literatuur wordt gesuggereerd dat zowel aberrante klepformatie als aortaworteldilatatie het gevolg zijn van dezelfde mutatie. Thans zijn een aantal mutaties blootgelegd zoals, het NOTCH1 en KCNJ2 gen, in een minderheid van de patiënten met bijkomende cardiale malformaties (Loeys et al., 2008). Zo is NOTCH1 mutatie bijvoorbeeld ook een mogelijke oorzaak van het hypoplastisch linker kamer syndroom (Garg et al., 2005) en is KCNJ2 genmutatie een mogelijke oorzaak van pulmonaalstenose en concomitant voorkomen van bicuspide aortaklep en coarctatio aortae (Andelfinger et al., 2002). Koppelingsonderzoek heeft genetische heterogeniteit aangetoond op de lange armen van chromosoom achttien, vijf en dertien (Loeys et al., 2008). Het overervingspatroon is autosomaal dominant met verminderde penetrantie (Milewicz et al., 2008). Het is daarom essentieel om routinematig de doormeter van de aortawortel na te gaan met echocardiografie. Indien dit niet kan gevisualiseerd worden, dan dient men een CT of een MRI te overwegen (Loeys et al., 2008). NOTCH1 codeert voor een transmembranair eiwit. Dit eiwit activeert een signaalcascade welke een actieve rol vervult in de embryonale vorming van het hart (de pulmonale en aortakleppen incluis) en de ontwikkeling van de aorta en andere grote bloedvaten (McKellar et al., 2007). Een aantal moleculaire waarnemingen suggereren dat er interactie is tussen de NOTCH en TGF-β signaalcascade (Klüppel and Wrana, 2005). Een hypothese is dat patiënten met BAV gevoeliger zijn aan een aberrante extracellulaire matrix regulatie door TGF-β (McKellar et al., 2007). Histopathologisch ziet men dezelfde afwijkingen zoals bij Marfan: fragmentatie van elastinevezels, verlies aan gladde spiercellen en toegenomen basofiele grondstof bestaande uit proteoglycanen. Een stoornis van de gladde spiercel wordt voorgesteld als oorzaak van de histopathologie. De gladde spiercel staat in voor het vormen van de eiwitten die normaal in de extracellulaire matrix worden teruggevonden. Een gestoord eiwittransport van de gladde spiercel kan ten dele de structurele afwijkingen verklaren. Door accumulatie van proteïnen intracellulair zouden de gladde spiercellen afsterven. In de aortawand van patiënten wordt bovendien een verhoogde activiteit en expressie van de proteolytische matrixmetalloproteïnasen (MMC) genoteerd. Wat ook een belangrijke rol speelt in de pathogenese van aortapathologie bij BAV, is een toegenomen schuif- en trekspanning op de aortawand. Een toegenomen wandspanning wordt over de gehele wandstructuur overgedragen. De toegenomen schuifkracht (gevolg van de viscositeit en verplaatsingsnelheid van het bloed) geeft spanning op de endotheelcellen die reageren door middel van signaalcascades die aanleiding geven tot een verhoogde expressie van de MMC en groeifactoren die leiden tot matrixdegeneratie en apoptose van de gladde spiercellen (Tadros et al., 2009). 3.1.2.5: Andere loci geassocieerd aan familiale niet-syndromale aorta aneurysma’s Een locus waarvoor koppeling werd genoteerd is 5q13-14. Deze locus wordt ook wel TAAD1 genoemd. Deze locus staat in voor het voorkomen van thoracale aorta aneurysma’s bij familieleden op een autosomaal dominante manier en een verminderde penetrantie (Guo et al., 2001). Deze locus zou ________________________________________________________________________________ 36
Resultaten __________________________________________________________________________________ verantwoordelijk zijn voor tien tot dertig percent van de niet-syndromale aorta aneurysma’s (Milewicz et al., 2008). Een andere locus is FAA1, welke wordt gevonden op chromosoom elf, meer bepaald 11q23-24. Deze ziekte wordt gekenmerkt door aneurysma’s, niet alleen voorkomend in de thoracale aorta maar ook in de abdominale aorta, alsook in andere arteriën. Koppeling werd gevonden bij slechts één familie. Daarom moet dit beschouwd worden als een zeer zeldzame oorzaak van familiale nietsyndromale aorta aneurysma’s met autosomaal dominante overerving en in tegenstelling, tot andere familiale niet-syndromale vormen van aorta aneurysma’s, als zeer penetrant (Vaughan et al., 2001). Gekoppelde loci vereisen nog verder onderzoek naar de oorzakelijke gendysfunctie.
________________________________________________________________________________ 37
Resultaten __________________________________________________________________________________
3.2: Koppelingsonderzoek Een familie, welke gekarakteriseerd met een familiaal voorkomen van thoracale aorta- aneurysma’s, werd reeds negatief gescreend voor mutaties in de genen FBN1, TGFBR1/2 en ACTA 2. Deze familie is daarom onderworpen aan een koppelingsonderzoek voor acht merkers. Vier van deze merkers bevinden zich op chromosoom vijf en vier op chromosoom elf. Voor chromosoom vijf gaat het over de merkers D5S1464, D5S253, D5S626 en D5S2029. Voor chromosoom elf worden de merkers D11S1341, D11S924, D11S994 en D11S4195 gebruikt. Merkers zijn hoog polymorfe loci (i.e. specifieke regio in een DNA-sequentie) waar korte DNA-sequenties herhaald worden in tandem herhalingen. De herhaalde DNA-sequenties betreffen meestal di-, tri- of tetranucleotiden. Bij D11S994 is dat CA bijvoorbeeld. Een andere naam voor een merker is een microsatelliet. Een microsatelliet is een specifieke DNA-sequentie in het genoom welke vaak varieert tussen individuen in populaties. Deze variabiliteit hangt af van de mutatiefrequentie in deze specifieke DNA-sequentie. Een merker wordt gekarakteriseerd door verschillende allelen. Deze allelen onderscheiden zich van elkaar door een verschillend aantal herhalingen. Er werd nagegaan of bepaalde allelen konden worden gekoppeld aan het voorkomen van aorta aneurysma’s. Figuur 9: overzicht voor de merkers van chromosoom 5. De rood gekleurde patiënten zijn aangetast. De asterix (*) geeft aan van wie er DNA ter beschikking was. Chromosoom 5 merkers:
D5S1464 D5S253 D5S626 D5S2029 I.1 * 1 1 1 1
3 1 2 1
I.2
I.3
*
II.2
II.3
II.1
4 3 1 5
1 3 3 4
* 1 1 1 1
II.5
II.4 III.1
III.2
* 4 3 1 5
II.7
II.6 *
1 3 3 4
1 3 3 4
5 2 3 3
III.3
1 3 3 4
II.8
* 1 3 3 4
5 2 3 3
II.9
*
*
III.5
III.6
III.7
III.8
III.4
III.9
III.10
1 3 3 4
4 1 1 1
4 3 1 5
2 2 4 2
III.11 III.12
Geen enkel allel komt enkel voor bij de familieleden met een aorta aneurysma. Zo is het rode haplotype zowel bij een aangetast persoon (II.1) als een niet aangetast persoon (II.6) aanwezig. Er kan voor de merkers op chromosoom vijf geen koppeling worden aangetoond.
________________________________________________________________________________ 38
Resultaten __________________________________________________________________________________ Figuur 10: overzicht voor de merkers van chromosoom 5. De rood gekleurde patiënten zijn aangetast. De asterix (*) geeft aan van wie er DNA ter beschikking was. Overzicht chromosoom 11: D11S1341 D11S924 D11S994 D11S4195
Ook voor de merkers van chromosoom elf komt geen enkel allel enkel voor bij patiënten met aortaaneurysma’s. Zo komt het rood gekleurd haplotype zowel bij zieke (II.1) als bij niet zieke patiënten (II.8) voor. Uit het onderzoek is dus gebleken dat het cardiovasculair ziektepatroon niet kan gekoppeld worden aan een eventueel gen gelegen op deze merkers.
________________________________________________________________________________ 39
Resultaten __________________________________________________________________________________
3.3: Calponine 3.3.1: Werking gladde spiercel
Figuur 11: signaalweg tot gladdespiercelcontractie; uitleg: zie tekst; . αβγ, heterotrimeer G proteine; PLC, phospholipase C; DAG, diacylglycerol; PIP2, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate; IP3, inositol trifosfaat; Ca2+, calcium; ATP, adenosine trifosfaat; P, fosfaat; CaM, calmoduline; MLCK, myosine light chain kinase; MLC, myosine light chain; GEF, guanine nucleotide exchange factor; PP1M, myosine fosfatase; MLCP, myosine light chain fosforylatie; CD, caldesmon; ERK 1/2, extracellular signal regulated kinase
Onder impuls van vasoconstrictorische signalen, verhoogt de intracellulaire concentratie aan calcium waardoor Ca2+-ionen binden op het eiwit calmoduline. Vier Ca2+-ionen vormen een complex met dit eiwit. Dit complex bindt dan op een inactief myosine light- chain kinase (MLCK) om zo een actief holoenzymatisch complex te vormen dat de transfer van een fosfaatgroep katalyseert van het adenosinetrifosfaat (ATP) –Mg2+ naar een serine residu gelegen op positie negentien van een myosine regulatory light chain (MLC). De fosforylatie van dit MLC leidt tot de activatie van het myosine adenosine trifosfatase door actine, welke leidt tot toegenomen ATP-hydrolyse.
De contractie wordt tot stand gebracht door interactie tussen actine enerzijds en de motoreenheid van myosine anderzijds. De energie voor dit proces wordt bekomen door middel van ATP hydrolyse. Gladdespiercelmyosine bestaat uit twee zware ketens en vier lichte ketens. De lange C-terminus ketens van de zware ketens van myosine dimeriseren en vormen een α-helicale coiled-coil structuur. De Nterminus bevat het motordomein en dit bevat zowel ATP- als actine bindingssites. Deze bindingsites ________________________________________________________________________________ 40
Resultaten __________________________________________________________________________________ vormen samen met twee lichte ketens twee cross-bridges bestaande uit twee globulaire hoofden. Myosine brengt actine tot beweging doordat het staartdeel van de N-terminus als hefboom dient welke leidt tot conformationele wijzigingen in het motordomein. Deze conformationele wijzigingen leiden tot het verplaatsen van actine door myosine. Een essentiële verbinding tussen het motordomein en het staartgedeelte dat als hefboom dient, is de SH-1 α-helix. Deze α-helix speelt een belangrijke rol in het ontwikkelen van kracht want deze verandert van vorm tijdens de ATP-hydrolyse. De Ca2+-afhankelijke activatie van het MLCK en de fosforylatie van MLC wordt algemeen gezien als de eerste mechanismen welke leiden tot de contractie van een gladde spiercel en dus tot ontwikkeling van kracht. Wanneer de intracellulaire concentratie van Ca2+ daalt onder 100nM, dan komt Ca2+ los van calmoduline waardoor het complex loskomt van MLCK waardoor deze laatste inactief wordt. MLC fosfatase wordt dominant waardoor myosine wordt gedefosforyleerd en de crossbridging activiteit wordt stopgezet (Griendling et al., 2009). Dit fosfatase werd aanvankelijk gedacht constitutief te werken maar ook dit blijkt onderhevig te zijn aan talrijke regulatiemechanismen. Een voorbeeld van een eiwit welke de activiteit van het myosine fosfastase meebepaalt is MYPT1. Dit werkt als een eiwit, welke zijn substraat helpt de beste conformatie aan te nemen zodat de werking van zijn substraat optimaal is, en is tevens zelf een substraat van andere kinasen die dit eiwit kunnen fosforyleren waardoor het wordt geïnactiveerd (Kim et al., 2008).
Recente studies hebben echter gesuggereerd dat er nog andere mechanismen bestaan die kunnen instaan voor de regulatie van de fosforylatiegraad van het myosin light chain. Dit kan zowel door het moduleren van het defosforylatieproces als door de activatie van een tweede Ca2+-Calmoduline dependent kinase, CaMKII. Deze laatste zou eerder werken door het activeren van ERK gemedieerde fosforylatie van het MLCK dan door rechtstreekse activatie (Kim et al., 2008).
Recent is gebleken dat het laagmoleculairgewicht guanosine trifosfatase (GTPase) Rho, welke oorspronkelijk werd gezien als een modulator van het actine cytoskelet, een belangrijke rol speelt in de gladdespiercelcontractie. In zijn actieve vorm, waarbij het aan GTP gebonden is, activeert Rho het Rho kinase, welke het myosine fosfatase type 1 inhibeert (PP1M). Deze inhibitie zorgt er dan weer voor dat het MLC-fosforylatie persisteert en maakt het contractiel apparaat voor calcium gevoeliger. Rho kinase is een doelwit geworden voor therapeutische interventies. De activiteit van het Rho kinase zou verhoogd zijn bij hypertensie en inhibitoren van het Rho kinase zoals fasudil hebben bewezen de vasculaire weerstand te verlagen bij hypertensie (Griendling et al., 2009).
________________________________________________________________________________ 41
Resultaten __________________________________________________________________________________ 3.3.2: Structuur calponine
Figuur 12: De structuur van een calponine molecule. Uit Rozenblum and Gimona, 2008. Er zijn drie menselijke calponine eiwitten (zuur, neutraal en basisch) afkomstig van drie verschillende genen. Het basische calponine komt vooral in het glad spierweefsel voor, het zure calponine vooral in zenuwweefsel en het neutrale calponine (welke een grote homologie vertoont qua sequentie met het basische calponine) vooral in het hartspierweefsel. Deze eiwitten hebben gelijkaardige modulaire structuur (Rozenblum and Gimona, 2008). Aan het NH2-uiteinde van het eiwit wordt een Ca2+Calmoduline bindend peptide gevolgd door het CH(Calponin homology)-domein, bestaande uit honderd aminozuren. Dit domein is niet uniek voor calponine maar wordt teruggevonden zowel in actinebindende eiwitten als signaaleiwitten. De functie is wat onduidelijk maar hun aanwezigheid in zowel cytoskeletale als signaaleiwitten in combinatie met hun modulaire structuur doet vermoeden dat deze domeinen een rol zouden kunnen spelen in het localiseren van signaalmoleculen in de buurt van het actine cytoskelet (Morgan and Gangopadhyay, 2001). Dit wordt opgevolgd door een zone welke het actomyosine ATPase inhiberend peptide en een actinebindend deel (ABS1) omvat. De meeste actinebindende delen zijn echter terug te vinden in de CLIK (Calponin like) repeats. Het aantal van deze repeats staat in verband met sterkte van de actinebinding. Het COOH-uiteinde is uniek in lengte en samenstelling wanneer de drie verschillende calponine genen worden vergeleken (Rozenblum and Gimona, 2008).
In het kader van deze thesis, wordt enkel het basische calponine beschouwd. Deze wordt gecodeerd door het CNN1 gen. Het CNN1 gen bestaat uit zeven exonen. Het wordt teruggevonden op chromosoom 19, meer bepaald 19p13.
Figuur 13: positie CNN1 op chromosoom 19 aangegeven met rood kader. Bron: www.ensembl.org
________________________________________________________________________________ 42
Resultaten __________________________________________________________________________________ 3.3.3: Functie calponine De gladdespiercelcontractie gebeurt door veranderingen in de interacties van actine en myosine. Er kunnen drie verschillende mechanismen worden onderscheiden die instaan voor de controle van de gladdespiercontractiliteit. Ten eerste zijn er mechanismen die de door actine geactiveerde actomyosine ATPase moduleren door het wijzigen van de fosforylatiestatus van het myosin light chain. Als tweede regulatiemechanisme zijn er de actinebindende proteïnen die zo de beschikbaarheid van actine voor interactie met myosine moduleren. Het derde voorgesteld mechanisme is het remodelleren van het cytoskelet welke het onderhouden of doorgeven van kracht uitgaande van de actomyosine interacties kan bepalen (Kim et al., 2008).
Een verhoogde gevoeligheid voor een intracellulaire stijging van de calciumconcentratie gebeurt ook in afwezigheid van wijzigingen in de fosforylatiestatus van het MLC. Hiervoor kunnen dan de actinebindende eiwitten, die de beschikbaarheid van actine voor interactie met myosine bepalen, als mogelijk regulatiemechanisme worden aangeduid. Voorbeelden van dergelijke actinebindende eiwitten zijn caldesmon en calponine.
Zo inhibeert caldesmon op een tonische wijze contractie door inhibitie van de interactie tussen myosine en actine. Agonisten zoals phenylephrine stimuleren extracellulair gereguleerd kinase (ERK) 1/2-gemedieerde fosforylatie van caldesmon en verhoogt de binding van calcium/calmoduline aan caldesmon. Dit zou leiden tot het verminderen van het inhiberend effect van caldesmon op de actinemyosineinteractie en zo tot een toegenomen gladdespiercelcontractiliteit (Griendling et al., 2009). ERK 1/2 wordt zelf geactiveerd door PKC (Kim et al., 2008). Wat de tonische inhibitie van de gladdespiercelcontractiliteit door caldesmon vermindert, is nog niet duidelijk. Ofwel kan de verminderde inhiberende werking van caldesmon het gevolg zijn van de binding van calmoduline aan caldesmon. Caldesmon zou hierdoor een verminderde actinebinding vertonen welke een conformationele verandering geeft die de inhiberende werking van caldesmon doet wegvallen. Ofwel is het een gevolg van de fosforylatie. Voor de volledige inhibitie van het actomyosine ATPase door caldesmon is de aanwezigheid van tropomyosine vereist maar de exacte functie van dit actinebindend eiwit moet nader bepaald worden (Morgan and Gangopadhyay, 2001). Dus is caldesmon een belangrijke actor in de contractiliteitsregulatie van de gladde spiercel, zelf geregeld door een PKC/ERK signaalpad naast andere mechanismen (Kim et al., 2008).
Calponine heeft een andere werking. Het zou direct de actomyosine ATP’ase activiteit reduceren (zie figuur 11) en zou fungeren als een signaalmolecule dat de agonist-gestimuleerde activatie van proteïne kinase C vergemakkelijkt (Griendling et al., 2009). Calponine zou gebonden zijn aan actine waardoor deze niet in staat is om het actomyosine ATP’ase van myosine te activeren (El-Mezgueldi, 1996). De inhiberende werking van calponine op actomyosine ATP’ase zou stopgezet worden wanneer het Ca2+________________________________________________________________________________ 43
Resultaten __________________________________________________________________________________ calmodulinecomplex (gevormd bij intracellulair gestegen calciumconcentraties) het calponine loskoppelt van het actine. Een andere hypothese zou zijn dat calponine wordt gefosforyleerd. Om beter te begrijpen hoe calponine precies werkt moet verder uitgemaakt worden hoe het interageert met actine en het actomyosine ATP’ase en hoe de functie wordt gereguleerd wanneer de intracellulaire calcium concentraties stijgen (El-Mezgueldi, 1996). Bij muizen waar calponine niet meer actief is, is de gladdespiercelcontractiliteit en calciumgevoeligheid zeer gering gestoord wat suggereert dat de rol van calponine in de Ca2+-afhankelijke signalen verwaarloosbaar is (Rozenblum and Gimona, 2008).
Zoals reeds aangehaald speelt calponine ook een rol in de signaaltransductie van PKC. Het zou dienen als een scaffold proteïne. Dit is een eiwit die andere eiwitten in een geschikte conformatie brengt waardoor interactie wordt geoptimaliseerd. Het feit dat calponine een rol speelt in de PKC signaalcascade wordt geconcludeerd uit de vaststelling dat basisch calponine direct interageert als adaptorproteïne met de signaaleiwitten PKC en ERK 1/2, dat calponine zich verplaatst naar de celcortex samen met PKC en ERK1/2 wanneer ze worden gestimuleerd en dat het de PKC activatie blijkt te bevorderen (Kim et al., 2008). Bovendien blijkt calponine PKC te binden in diens regulatoir domein. Stimulatie van dit domein blijkt de activatie van PKC te vergemakkelijken (Morgan and Gangopadhyay, 2001).
Figuur 14: voorgesteld mechanisme voor de werking van basisch calponine in de gladde spiercel: zie tekst. De in de tekst vermelde cijfers verwijzen naar de cijfers in de figuur. (Kim et al., 2008) Een mogelijk model voor de regulerende functie van het basisch calponine in de gladde spiercel wordt mooi weergeven in de bovenstaande figuur. In dit model is het basisch calponine een vouweiwit welke de signaalcascades van ERK 1/2 en PKC verbindt die een rol spelen in de contractiliteitsregulatie van de gladde spiercel. De initiële stap (1) is de activatie van PKC α/ε. Dit wordt vereenvoudigd door het ________________________________________________________________________________ 44
Resultaten __________________________________________________________________________________ basisch calponine. Wat de stimulus is tot de activatie van PKC α/ε is nog onduidelijk. Deze activatie zou dan basisch calponine (bCaP) fosforyleren en deze fosforylatie zou leiden tot een verminderde bindingsaffiniteit van het bCaP voor actine. Hierop volgend is er dan een verplaatsing (2) van het bCaP-ERK1/2- PKC α/ε complex naar de celcortex waar het in contact komt met smooth muscle Archvillin protein (SmAV). SmAV is een vouwproteïne voor Raf en MEK. PKC α/ε wordt aan het celoppervlak geactiveerd door diacylglycerol (DAG) welke zelf geproduceerd wordt door geactiveerd fosfolipase C. Deze activatie van PKC α/ε leidt tot fosforylatie van Raf, welke leidt tot de activatie van MEK. MEK activeert dan ERK1/2. Het gefosforyleerd ERK1/2 verplaatst zich terug naar het cytoskelet waar het actinegebonden caldesmon fosforyleert. PKC α/ε, bCaP en SmAV blijven echter achter aan de celcortex (3). Caldesmon ondergaat een verandering in zijn structuur waardoor actine/myosine interactie mogelijk wordt en dus ook contractie (4).
Calponine is niet alleen terug te vinden in het contractiel apparaat maar is ook aanwezig in het cytoskelet. De stabiliteit van het cytoskelet, waarvan actine een belangrijk bestanddeel is, wordt ten dele geregeld door calponine. Hierdoor speelt calponine als signaalmolecule een belangrijke rol in op actine gebaseerde cellulaire processen (Rozenblum and Gimona, 2008). Calponine zou ook een rol spelen in het aanmaken van intermediaire filamenten bestaande uit desmine. Intermediaire filamenten zijn een belangrijk onderdeel van het cytoskelet en hebben een diameter van tien nanometer. Deze intermediaire filamenten verlenen de cel een grotere weerstand tegen mechanische stress. Het maken van desmine bundels en het verbinden van de intermediaire filamenten met andere cytoskeletale componenten zou beter gebeuren onder calponine. Calponine zou zo een grotere mechanische integriteit aan de gladde spiercel verlenen (Fujii et al., 2000).
Verlies van basisch calponine leidt ook tot toegenomen ectopische botvorming in CNN1 knockout muizen. Dit suggereert dat basisch calponine botvorming zou onderdrukken (Rozenblum and Gimona, 2008). In gladde spiercellen wordt de graad waarmee CNN1 tot expressie wordt gebracht geregeld door groeifactoren. Hierdoor is de mate van voorkomen van basisch calponine een betrouwbare maat voor de differentiatiegraad van de gladde spiercel (Rozenblum and Gimona, 2008). Bovendien is er een hypothese dat slecht gereguleerd basisch calponine zou gepaard gaan met kanker. Een verstoorde calponine vorming zou tot instabiele actine filamenten leiden, waardoor de verbinding van de cel met de ECM en de naburige cellen wordt gecrompromitteerd. Bovendien zou herstel van de expressie van basisch calponine in getransformeerde cellen leiden tot een verminderde proliferatie (Kim et al., 2008).
________________________________________________________________________________ 45
Resultaten __________________________________________________________________________________ Exon 5
3.3.4: resultaten calponine Exon 1
Exon 2
Exon 3
Exon 4
Exon 6
Figuur 15: Weergave van de genstructuur voor CNN1. De rode zones geven de positie van de exonen weer. Het bestaat uit 1586 baseparen en het eiwit uit 297 aminozuren. Bron: www.ensembl.org 3.3.4.1: Optimalisatie primers Exon 1,2,4,5,6,7 Tabel 2: Overzicht exon 1,2,4,5,6,7
Exon 1 Exon 2 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7
Primer 1F 1R 2F 2R 4F 4R 5F 5R 6F 6R 7F 7R
Sequentie GAGGAGGGAAGAGTGTGCAG GATAGGCAGGAGGGGGTTC GGCTCTAGGAAGTTCAGAGACAGG GTTGTTTTGGGGGTTGAGG GGTGAGCCCAGACACAATCT AAGTGGCCACACCTGCAT AGTGTCCAAGGGGACTGTG CCCAAAAGCCTTCAGACATC CTCTCCTCTCCCATCAGCTA GAAGGGTGGTGTGGTCAGG ATGGGCACCAACAAAGGA TGAGTTCTACAGGGGCTGGA
Lengte fragment 247 292 359 311 347 499
Tabel 3: Overzicht mastermix exon 1,2,4,5,6 en 7 Component
µl per reactie
DMSO 2 Kapa buffer A (5x) 4 dNTP’s (1mM) 2,4 H2O 6,7 MgCl2 (25mM) 0,8 Forward primer (10µM) 1,5 Reverse primer (10µM) 1,5 Taq polymerase (5U/µl) 0,1 gDNA (75ng/µl) 1 TOTAAL MASTERMIX 20 Voor exonen 2, 3, 4, 5, 6 en 7 wordt een touch-down PCR 62°C-50°C uitgevoerd. Voor optimale amplificatie van exon 1 is een touch-down PCR 63°C-51°C vereist. Exon 3 Optimalisatie van de PCR-amplificaties van exon 3 verliep heel moeilijk. Tot driemaal moesten nieuwe primers besteld worden maar telkens waren de sequentieresultaten onbruikbaar. Als een ________________________________________________________________________________ 46
Exon 7
Resultaten __________________________________________________________________________________ oligonucleotide met een sequentievolgorde zoals voorkomend in de zone voor exon 3 wordt geblast (zie figuur 16), dan worden er heel wat regio’s in het genoom gevonden die een hoge graad van overeenkomst vertonen met dit oligonucleotide, waardoor het specifieke onderdeel van het genoom, welke ons interesseert, niet wordt geamplificeerd. Uiteindelijk werd geprobeerd om een PCR-reactie uit te voeren waarbij de 3F primer werd gecombineerd met de 4R primer. Hiervoor werden wel mooie sequentieresultaten bekomen met de mastermix zoals ook gebruikt voor de andere exonen. Voor optimale amplificatie van exon 3 is een touchdown PCR 62°C-51°C vereist.
Figuur 16: Het BLAST-resultaat van 25 nucleotiden (TGCTGGGATTACAGGCGTGAGCCAC) in de regio voor exon 3. Het hoge aantal overeenkomsten van deze sequentie met andere sequenties van het genoom illustreert de moeilijkheid om exon 3 te amplificeren. Sequenties met een hoge graad van overeenkomst worden teruggevonden op chromosomen 1, 4, 5, 6, 16 en 17. Bron: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. BLAST staat voor The Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). Het vindt regio’s in het genoom die qua sequentie overeenkomen. Het programma vergelijkt nucleotide of proteïne sequenties met sequentiedatabanken en berekent de statische significantie van overeenkomsten. 3.3.4.2: Resultaten analyse Een puntmutatie is de wijziging van een nucleotide in een ander nucleotide. Komt een dergelijke puntmutatie frequent voor, dan wordt dit een single nucleotide polymorphism (SNP) genoemd. Wanneer een polymorfisme een hoge frequentie heeft, dan krijgt dit polymorfisme een rs-nummer. ________________________________________________________________________________ 47
Resultaten __________________________________________________________________________________ Een pyrimidine kan door een ander pyrimidine worden vervangen (C↔T) en een purine kan worden uitgewisseld voor een andere purine(A↔G). Dit wordt dan een transitie geheten. Het vervangen van een pyrimidine door een purine of omgekeerd is een transversie.
Na analyse van een cohorte van zesendertig patiënten kon een polymorfisme teruggevonden worden bij drie patiënten. Deze was reeds bekend in ensembl. Het is een SNP met het rs-nummer 8109708. Het is een transitie (TG) en is éénenvijftig basen gelegen voor het eerste exon. Tot dusver is voor dit polymorfisme nog geen klinische relevantie aangetoond. De vermelde frequentie van dit polymorfisme op de NCBI site voor de kaukasische bevolking is 0,069 wat vergelijkbaar is met de bekomen resultaten (0.088 of 3/34 patiënten).
Figuur 17: de variatie van het polymorfisme rs8109708. EU staat voor Europese populatie, Am voor Amerikaans, Jap voor Japanees, Ch voor Chinees en Afrika voor Afrikaans. Bron: site van NCBI Url: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_re f.cgi?rs=8109708.
________________________________________________________________________________ 48
Resultaten __________________________________________________________________________________ Tabel 4: Resultaat na screening van 36 patiënten. P1 staat voor het polymorfimsme c. 1-51 t>g. ? zijn stalen die niet geanalyseerd konden worden.
Patiënt 1 Patiënt 2 Patiënt 3 Patiënt 4 Patiënt 5 Patiënt 6 Patiënt 7 Patiënt 8 Patiënt 9 Patiënt 10 Patiënt 11 Patiënt 12 Patiënt 13 Patiënt 14 Patiënt 15 Patiënt 16 Patiënt 17 Patiënt 18 Patiënt 19 Patiënt 20 Patiënt 21 Patiënt 22 Patiënt 23 Patiënt 24 Patiënt 25 Patiënt 26 Patiënt 27 Patiënt 28 Patiënt 29 Patiënt 30 Patiënt 31 Patiënt 32 Patiënt 33 Patiënt 34 Patiënt 35 Patiënt 36
exon1 ok ok ? ok P1 ok ok ? ok ok ok ok ok ok ok P1 P1 ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok
exon2 ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok
exon3 ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ? ok ok ok ok ?
exon4 ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ? ok ok
exon5 ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok
exon6 ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ? ok ok ok ok ok
exon7 ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok ok
Standaard sequentie Figuur 18 Illustratie: polymorfisme rs8109708 van patiënt 5 vergeleken met normale sequentie Polymorfisme c.1-51 T>G ________________________________________________________________________________ 49
Discussie __________________________________________________________________________________
4. Discussie Aorta aneurysma’s zijn één van de belangrijkste doodsoorzaken in de geïndustrialiseerde wereld en zijn zelfs verantwoordelijk voor één à twee percent van de totale mortaliteit. Vijfennegentig procent van de aorta aneurysma’s blijven asymptomatisch. Het aneurysma komt dan ook vaak pas tot uiting wanneer het scheurt en aanleiding geeft tot een aorta dissectie. Bij een acute aorta dissectie zal minder dan de helft van de patiënten het ziekenhuis levend bereiken en in de eerste vierentwintig tot achtenveertig uur sterft één à twee procent van de patiënten per uur dat verstrijkt.
Aorta aneurysma’s worden verder opgedeeld in thoracale en abdominale aneurysma’s. Abdominale aneurysma’s worden voornamelijk veroorzaakt door levensstijlgebonden factoren zoals hypertensie en atherosclerose. Thoracale aneurysma’s hebben veeleer een genetische etiologie. Thoracale aneurysma’s kunnen zowel voorkomen in een syndromale als een niet-syndromale context. Bij deze niet-syndromale aorta aneurysma’s spelen familiale factoren tevens een belangrijke rol. Negentien percent van de patiënten met geïsoleerde gevallen van aorta aneurysma’s hebben een eerstegraadsverwant met een thoracaal aneurysma.
Bij thoracale aneurysma’s is de gladdespiercelfunctie verstoord. Dit kan enerzijds het gevolg zijn van mutaties in genen, betrokken in het mechanotransductiecomplex van de gladde spiercel (ACTA2,MYH11 en FBN1). Anderzijds kan de gladdespiercelfunctie overmatig worden belast door een toegenomen druk op de bloedvatwand. Dit laatste kan het gevolg zijn van chronisch aanwezige hypertensie maar ook van isometrische activiteiten die gepaard gaan met een verhoogde bloeddruk (gewichtheffen). De gladde spiercel reageert hier niet alleen op door middel van expressie van mitotische en trofische factoren, maar ook door een verhoging van matrixmetalloproteïnasen en proteoglycanen. Dit alles leidt tot degradatie van elastinevezels en toename van proteoglycanen.
Bij syndromale vormen van aorta aneurysma’s is gebleken dat het TGF-β (Transforming growth factor-bèta) signaalpad vaak verstoord is. Voorbeelden van syndromen met een verstoord TGF-β signaalpad zijn het Marfan sydroom, het Loeys-Dietz syndroom en het arteriële tortuositas syndroom (ATS). Het Marfan syndroom gaat gepaard met een mutatie in het fibrilline-1 gen (FBN1). Fibrilline, een glycinerijk glycoproteïne, vormt een belangrijk bestanddeel van de microfibrillen van de extracellulaire matrix (ECM) en wordt teruggevonden in de periferie van elastinevezels. Microfibrillen zorgen niet alleen voor structurele versterking van de ECM maar zijn ook belangrijke opslagplaatsen voor TGF-β. De fibrilline bevattende microfibrillen binden namelijk het LTBPs (latency-associated TGF-β binding protein). Dus het disfunctioneren van het fibrilline-1 gen leidt niet alleen tot stoornis in de structurele integriteit van de ECM maar ook tot een verhoogde TGF-β activiteit gezien de gecompromitteerde extracellulaire opslagcapaciteit. ________________________________________________________________________________ 50
Discussie __________________________________________________________________________________ Ook het arterieel tortuositas syndroom (ATS) gaat gepaard met een verhoogde TGF-β signalisatie. Het ATS syndroom gaat gepaard met een loss of function mutatie in het SLC2A10 gen. Dit gen codeert voor een glucose transporter (Glut10). Decorin is een proteoglycan inhibitor van TGF-β in de extracellulaire matrix en inhibeert de mogelijkheid van TGF-β te interageren met de TGF-β receptoren. Decorin wordt ten dele gereguleerd door een glucosegevoelig element (Glut 10) in diens promotor. Gladde spiercellen van de aortawand van patiënten, lijdend aan het ATS, blijken een ernstig verminderde expressie van decorin te vertonen in vergelijking met controlecellen. Er zijn een aantal argumenten aan te brengen om dit mechanisme niet reeds als correct pathogenetisch mechanisme te aanvaarden. Ten eerste geldt GLUT 10 niet enkel als een glucosetransporter maar kan het verschillende substraten binden. Ten tweede is decorin niet het enige gen dat wordt gecontroleerd door glucose. Zo worden genen coderend voor in de ECM voorkomende eiwitten, thrombospondine (activator van TGF-β) en TGF-β zelf gereguleerd door glucose. Tot slot, TGF-β vervult een belangrijke rol in weefselhomeostase en is vaak verhoogd onder pathologische omstandigheden. Het is dan ook niet uit te sluiten dat TGF-β verhoogd is ten gevolge van het pathologisch proces of juist de pathologie veroorzaakt. Het Loeys-Dietz syndroom (LDS) wordt veroorzaakt door een heterozygote mutatie in het transforming growth factor-β receptor type 1 (TGFBR1) gen ofwel in het transforming growth factor-β receptor type 2 (TGFBR2) gen. Men zou verwachten dat dit gepaard gaat met een verlaagde TGF-β signaalfunctie maar paradoxaal wordt een verhoogde TGF-β signalisatie teruggevonden in de tunica media van de aorta. Er geldt nu een hypothese dat, ondanks de aanwezigheid van de disfunctionele TGF-β receptoren, een wild-type receptor zijn gevoeligheid voor TGF-β behoudt en zelfs een verhoogde activiteit vertoont. Een goede verklaring moet echter nog gevonden worden. Het onderkennen van de rol van TGF-β in de pathogenese biedt perspectieven om medicatie te vinden welke ingrijpt op het pathogenetisch proces. Losartan, een angiotensine II receptor blokker, blijkt ook een inhiberende werking te hebben op het TGF-β signaalpad. Administratie van losartan biedt alvast veelbelovende perspectieven voor de behandeling van patiënten met aorta aneurysma’s. Langetermijnresultaten moeten echter nog afgewacht worden. Voor andere syndromale vormen zoals Noonan syndroom, Turner syndroom, Ehlers-Danlos vasculair type, Cutis laxa moet de rol van TGF-β signaalcascade nader onderzocht worden. Negentien percent van de patiënten met een niet-syndromaal thoracaal aorta aneurysma hebben een eerstegraadsverwant met een thoracaal aorta aneurysma. Dat genmutaties een rol kunnen spelen bij familiaal niet-syndromale aorta aneurysma’s is pas duidelijk geworden in het laatste decennium. Onderzoek naar gendysfuncties is dan ook een jong onderzoeksdomein.
________________________________________________________________________________ 51
Discussie __________________________________________________________________________________ In de meeste families wordt de stoornis op een autosomaal dominante manier overgeërfd met een verminderde penetrantie en variabele expressie. Onderzoek heeft tot dusver twee gendysfuncties blootgelegd. Beide gendysfuncties leiden tot eiwitstoornissen in het contractiel apparaat van de gladde spiercel. Dit onderstreept het belang van de gladdespiercelcontractie in het onderhouden van de structurele integriteit van de aorta ascendens. Contractie in de gladde spiercel wordt tot stand gebracht door de cyclische interactie tussen de αactine en β-myosine zware keten. Deze worden respectievelijk gecodeerd door het ACTA2 gen en MYH11 gen. Mutaties werden gevonden in beide genen. MYH11 genmutaties zorgen voor een dysfunctie van myosine dikke filamenten. Deze mutaties komen steeds in associatie voor met een patente ductus arteriosus, één van de meest voorkomende aangeboren cardiovasculaire malformaties. Deze mutaties zijn maar heel zelden (< 2%) verantwoordelijk voor familiaal niet-syndromale aorta aneurysma’s. ACTA2 gendysfuncties zijn in veertien procent van de gevallen als oorzaak van nietsyndromale familiale aorta aneurysma’s aan te duiden. Mutaties leiden tot interferentie met de aanmaak van actine filamenten en zouden zo leiden tot een verminderde gladdespiercelcontractiliteit. Actine is ook betrokken in het cytoskelet van de gladde spiercel. Remodelleren van het cytoskelet zou mogelijk een rol spelen in de gladdespiercelcontractiliteit maar hierover zijn nog maar weinig gegevens bekend en is een mogelijke toekomstige onderzoekspiste. Een dysfunctie van het gen coderende voor het myosin light chain kinase zou ook als mogelijke etiologie zijn blootgelegd, maar publicaties hieromtrent moeten nog verschijnen.
Naast deze gendysfuncties, als mogelijke oorzaak van familiale niet-syndromale aorta aneurysma’s, is er ook koppeling gevonden met loci op chromosoom vijf en elf. De locus op chromosoom vijf (5q1314) wordt op een autosomaal dominante manier overgeërfd. Deze koppeling komt frequenter voor dan koppeling met de locus op chromosoom elf (11q23-24). Deze koppeling werd nog maar genoteerd bij één familie.
Een familie met familiaal voorkomende aorta aneurysma’s welke negatief testte op FBN1, TGFBR1/2 en ACTA 2 werd onderworpen aan een koppelingsonderzoek voor deze gekende loci op chromosoom vijf en elf. Er werd geen koppeling gevonden.
Bicuspide aortakleppen (BAV) zijn de meest frequente congenitale cardiale afwijking. Er blijkt een associatie te bestaan tussen deze congenitale afwijking en aorta aneurysma’s. Als mogelijke oorzaak werd een NOTCH1 mutatie gesuggereerd. Het NOTCH1 gen codeert voor een transmembranair eiwit, dat een rol speelt in de embryonale vorming van de aorta en grote bloedvaten. Een aantal moleculaire waarnemingen suggereren dat er interactie is tussen de NOTCH en TGF-β signaalcascade. Een
________________________________________________________________________________ 52
Discussie __________________________________________________________________________________ hypothese is dat patiënten met BAV gevoeliger zijn aan een aberrante extracellulaire matrixregulatie door TGF-β. Ook hier is verder onderzoek vereist. Op basis van de gegevens in de literatuur werd in een populatie, welke negatief testte op FBN1, TGFBR1/2 en ACTA 2, onderzocht of er een verband bestaat tussen een gendysfunctie in het eiwit calponine en de gladde spiercel. Calponine is een gen op chromosoom negentien bestaande uit zeven exonen. Als de intracellulaire concentratie van calcium stijgt onder impuls van vasoconstrictorische signalen, dan gaan vier calciumionen met het eiwit calmoduline een complex vormen. Dit complex bindt dan het myosine light chain kinase om zo een actief holo-enzymatisch complex te vormen. Dit leidt tot de activatie van het myosine regulatory light chain (MLC). De fosforylatie van dit MLC leidt tot de activatie van het actomyosine adenosine trifosfatase door actine. Calponine zou direct de actomyosine ATP’ase activiteit reduceren. Het bindt actine waardoor deze het actomyosine ATP’ase niet meer kan activeren. Bovendien speelt calponine ook een rol in het activeren van het PKC signaalpad. Wat de rol hiervan is, is echter nog niet volledig duidelijk. In het onderzoek, beschreven in deze thesis, waarin zesendertig patiënten werden gescreend naar een eventuele mutatie werd slechts één bekend polymorfisme (rs8109708) gevonden. Verder werd er niets onregelmatig in de sequenties gevonden. Een populatie van zesendertig personen is echter te klein om een definitieve uitspraak te doen en een groter aantal patiënten zou nog gescreend moeten worden. Vanuit de literatuur is het mogelijk een aantal genen aan te rijken waarvan disfunctioneren een mogelijke pathogenetische rol zou kunnen hebben in het voorkomen van aorta aneurysma’s. Reeds twee disfuncties van genen (ACTA2 en MYH11), coderend voor eiwitten die een belangrijke rol spelen in de gladdespiercelcontracilitieit, zijn aangetoond als oorzaak van familiaal voorkomende aorta aneurysma’s. De contractiliteit van de gladde spiercel zou ten dele kunnen worden gereguleerd door het remodelleren van het cytoskelet. Wat de exacte rol is van het cytoskelet in de contractiliteitsregulatie van de gladde spiercel is echter onduidelijk. Een belangrijk bestanddeel van dit cytoskelet is actine. Actine komt in de cel voor onder zes verschillende vormen, elk gecodeerd door een verschillend gen. Het wordt onderverdeeld in musculair actine (actine welke een rol speelt in het contractiel apparaat) en niet-musculair actine (actine deel uitmakend van het cytoskelet). Elk gen coderend voor actine zou kunnen onderzocht worden of eventuele disfunctie een rol speelt in de pathogenese van aorta aneurysma’s gezien de mogelijke rol van dit eiwit in de gladdespiercelcontractiliteit. SM22 is een gladde spiercel specifiek eiwit waarvan de functie onbekend is. In SM22 deficiënte muizen echter wordt er een wijziging gezien in de distributie van actine in de cel (Morgan and Gangopadhyay, 2001). Dit suggereert een mogelijke rol van SM22 in de organisatie van het cytoskelet. Mogelijks speelt SM22 een rol in de pathogenese van aorta aneurysma’s en ook dit kan ________________________________________________________________________________ 53
Discussie __________________________________________________________________________________ onderzocht worden. Caldesmon is een eiwit dat een belangrijke rol speelt in het reguleren van de gladdespiercelcontractiliteit door het binden van actine waardoor deze niet kan interageren met myosine. Vanuit de wetenschap dat een gestoorde gladdespiercelcontractiliteit een belangrijk etiologische factor is in het onstaan van aorta aneurysma’s, kan ook dit gen nader onderzocht worden. Aorta aneurysma’s hebben een belangrijke genetische etiologische grondslag zowel in syndromale als in niet-syndromale context. Het genetisch onderzoek naar aorta aneurysma’s is een zeer breed domein waarvan de pathogenetische inzichten razendsnel evolueren. Nieuwe inzichten bieden verschillende nieuwe behandelingsperspectieven zoals het onderkennen van het belang van de TGF-β cascade in de pathogenese van syndromale aorta aneurysma’s en de behandeling met losartan. Er is echter ruimte voor nog heel wat verder onderzoek. Zo kan het belang van de TGF-β cascade in de pathogenese van andere syndromen, waarin aorta aneurysma’s voorkomen, verder onderzocht worden. De zoektocht naar gendysfuncties die leiden tot eiwitstoornissen in de gladdespiercelcontractiliteit bevindt zich nog in zijn kinderschoenen. Bovendien kan onderzocht worden of cytoskeletale dysfunctie ook een rol speelt in de ontwikkeling van aorta aneurysma’s. Wat de rol is van het remodelleren van het cytoskelet voor de gladdespiercelcontractiliteit is een nog te ontginnen onderzoeksdomein. Voor ongeveer twintig percent van de familiale niet-syndromale aorta aneurysma’s is de genetische oorzaak reeds bekend maar tachtig percent moet nog nagegaan worden. Dit zijn toch een aantal aanrijkingen voor verdere onderzoekingen in dit boeiend domein.
________________________________________________________________________________ 54
Referenties __________________________________________________________________________________
5. Referentielijst Ada W.Y., Chung H.H., Yang C., Radomski M.W., van Breemen C. Long-term doxycycline is more effective than atenolol to prevent thoracic aortic aneurysm in marfan syndrome through the inhibition of matrix metalloproteinase-2 en metalloproteinase-9. Circ.Res., 2008; 102 :73-85.
Akhurst R.J. A sweet link between TGFbeta and vascular disease? Nat Genet., 2006; 38(4):400-1.
Andelfinger G., Tapper A.R., Welch R.C., Vanoye C.G., George A.L.Jr., Benson D.W. KCNJ2 mutation results in Andersen syndrome with sex-specific cardiac and skeletal muscle phenotypes. Am J Hum Genet., 2002; 71(3): 663-8.
Aoyama T., Francke U., Dietz H.C., Furthmayr H. Quantitative differences in biosynthesis and extracellular deposition of fibrillin in cultured fibroblasts distinguish five groups of Marfan syndrome patients and suggest distinct pathogenetic mechanisms. J Clin Invest., 1994; 94(1):130-7.
Arslan-Kirchner M., von Kodolitsch Y., Schmidtke J. The importance of genetic testing in the clinical management of patients with marfan syndrome and related disorders. Dtsch Arztebl Int., 2008; 105(27):483-91.
Barbour J.R., Francis G.S., Ikonomidis J.S. Proteinase systems and thoracic aortic aneurysm progression. Journal of Surgical research, 2007; 139, 292-307.
Boileau C., Jondeau G., Mizuguchi T., Matsumoto N. Molecular genetics of Marfan syndrome. Curr Opin Cardiol. 2005; 20(3): 194-200.
Bondy A. Aortic dissection in Turner syndrome. Current opinion in Cardiology, 2008; 23: 519-526.
Braustein G.D. Chapter 13: Testes. In: Greenspan’s Basic and Clinical Endrocrinology, Eds. Gardner DG, Shoback D. New York: Mc. Graw-Hill, 2007.
Coady M.A., Rizzo J.A., Goldstein L.J., Elefteriades J.A. Natural history, pathogenesis, and etiology of thoracic aortic aneurysms and dissections. Cardiol Clin. 1999; 17: 615–35.
________________________________________________________________________________ 55
Referenties __________________________________________________________________________________ Coady M.A., Rizzo J.A., Hammond G.L., Mandapati D., Darr U., Kopf G.S., Elefteriades J.A. What is the appropriate size criterion for resection of thoracic aortic aneurysms? J Thorac Cardiovasc Surg., 1997; 113(3): 476-91.
Coucke P.J., Willaert A., Wessels M.W., Callewaert B., Zoppi N., De Backer J., Fox J.E., Mancini G.M., Kambouris M., Gardella R., Facchetti F., Willems P.J., Forsyth R., Dietz H.C., Barlati S., Colombi M., Loeys B., De Paepe A. Mutations in the facilitative glucose transporter GLUT10 alter angiogenesis and cause arterial tortuosity syndrome. Nat Genet., 2006; 38(4): 452-7.
Davies R.R., Goldstein L.J., Coady M.A., Tittle S.L., Rizzo J.A., Kopf G.S., Elefteriades J.A. Yearly rupture or dissection rates for thoracic aortic aneurysms: simple prediction based on size. Ann Thorac Surg. 2002; 73(1): 17-27.
Drera B., Ritelli M., Zoppi N., Wischmeijer A., Gnoli M., Fattori R., Calzavara-Pinton P.C., Barlati S., Colombi M. Loeys-Dietz syndrome type I en type II: clinical findings and novel mutations in two Italian patients. Orphanet J Rare Dis, 2009; 2; 4:24.
Elefteriades J.A.Thoracic Aortic Aneurysm: Reading the Enemy’s Playbook. Yale J. Biol. Med., 2008; 81(4): 175–186.
El-Mezgueldi M. Calponin. Int. J. Biochem. Cell Biol., 1996; 28, 1185-1189.
Fitzgerald P.A. Chapter 26. Endocrine Disorders. In: Current medical diagnosis and treatment: Lange 2010, Eds. McPhee J., Papadakis M.A. New York: Mc Graw Hill medical, 2010.
Fujii T., Takagi H., Arimoto M., Ootani H., Ueeda T. Bundle formation of smooth muscle desmin intermediate filaments by calponin and its binding site on the desmin molecule. J Biochem., 2000 ; 127(3): 457-65.
Garg V., Muth A.N., Ransom J.F., Schluterman M.K., Barnes R., King I.N., Grossfeld P.D., Srivastava D. Mutations in NOTCH1 cause aortic valve disease. Nature., 2005; 437(7056): 270-4.
Griendling K.K., Harrison D.G., Alexander R.W. Chapter 7. Biology of the Vessel Wall. In: Hurst’s The Heart Manual of Cardiology 12th edition, Eds. Fuster V., O'Rourke R.A., Walsh R.A., PooleWilson P. New York: McGraw Hill professional, 2009.
________________________________________________________________________________ 56
Referenties __________________________________________________________________________________ Guo D., Hasham S., Kuang S.Q., Vaughan C.J., Boerwinkle E., Chen H., Abuelo D., Dietz H.C., Basson C.T., Shete S.S., Milewicz D.M. Familial thoracic aortic aneurysms and dissections: genetic heterogeneity with a major locus mapping to 5q13-14. Circulation, 2001; 22; 103(20):2461-8.
Guo D.C., Pannu H., Tran-Fadulu V., Papke C.L., Yu R.K., Avidan N., Bourgeois S., Estrera A.L., Safi H.J., Sparks E., Amor D., Ades L., McConnell V., Willoughby C.E., Abuelo D., Willing M., Lewis R.A., Kim D.H., Scherer S., Tung P.P., Ahn C., Buja L.M., Raman C.S., Shete S.S., Milewicz D.M. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections. Nat Genet., 2007; 39(12): 1488-93
Guo D.C., Papke C.L., Tran-Fadulu V., Regalado E.S., Avidan N., Johnson R.J., Kim D.H., Pannu H., Willing M.C., Sparks E., Pyeritz R.E., Singh M.N., Dalman R.L., Grotta J.C., Marian A.J., Boerwinkle E.A., Frazier L.Q., LeMaire S.A., Coselli J.S., Estrera A.L., Safi H.J., Veeraraghavan S., Muzny D.M., Wheeler D.A., Willerson J.T., Yu R.K., Shete S.S., Scherer S.E., Raman C.S., Buja L.M,. Milewicz D.M. Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) cause coronary artery disease, stroke, and Moyamoya disease, along with thoracic aortic disease. Am J Hum Genet., 2009; 84(5): 617-27
Hiratzka L.F., Bakris G.L., Beckman J.A., Bersin R.M., Carr V.F., Casey D.E. Jr., Eagle K.A., Hermann L.K., Isselbacher E.M., Kazerooni E.A., Kouchoukos N.T., Lytle B.W., Milewicz D.M., Reich D.L., Sen S., Shinn J.A., Svensson L.G., Williams D.M.; ACCF/AHA Task Force, Jacobs A.K., Smith S.C. Jr., Anderson J.L., Adams C.D., Buller C.E., Creager M.A., Ettinger S.M., Guyton R.A., Halperin J.L., Hunt S.A., Krumholz H.M., Kushner F.G., Lytle B.W., Nishimura R., Page R.L., Riegel B., Stevenson W.G., Tarkington L.G., Yancy C.W., American College of Cardiology Foundation/American Heart Association; American Association for Thoracic Surgery; American College of Radiology; American Stroke Association; Society of Cardiovascular Anesthesiologists; Society for Cardiovascular Angiography and Interventions; Society of Interventional Radiology; Society
of
Thoracic
Surgeons;
Society
ACCF/AHA/AATS/ACR/ASA/SCA/SCAI/SIR/STS/SVM
for
Vascular
guidelines
for
Medicine. the
diagnosis
2010 and
management of patients with Thoracic Aortic Disease: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines, American Association for Thoracic Surgery, American College of Radiology, American Stroke Association, Society of Cardiovascular Anesthesiologists, Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, Society of Interventional Radiology, Society of Thoracic Surgeons, and Society for Vascular Medicine. Circulation.; 2010; 121(13): 266-369
________________________________________________________________________________ 57
Referenties __________________________________________________________________________________ Hu Q., Loeys B.L., Coucke P.J., De Paepe A., Mecham R.P., Choi J., Davis E.C., Urban Z. Fibulin-5 mutations: mechanisms of impaired elastic fiber formation in recessive cutis laxa. Hum Mol Genet., 2006; 15(23): 3379-86
Innis M.A., Myambo K.B. Gelfand D.H., Brow M.A.D. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988; 85:9436–9440.
Isselbacher E.M. Thoracic and abdominal aortic aneurysms. Circulation, 2005, 111: 816-828.
Jones J.A., Spinale F.G., Ikonomidis J.S. Transforming growth factor-beta signaling in thoracic aortic aneurysm development: a paradox in pathogenesis. 2009; J Vasc Res.; 46(2): 119-37.
Jorge A.A., Malaquais A.C., Arnhold I.J., Mendonca B.B. Noonan syndrome and related disorders: a review of clinical features and mutations in genes of the RAS/MAPK pathway. Horm. Res., 2009; 71: 185–193.
Kim H.R., Appel S., Vetterkind S., Ganghpadhyay S.S., Morgan K.G. Smooth muscle signaling pathways in health and disease. J Cell Mol Med., 2008; 12(6A): 2165-2180.
Klüppel M., Wrana J.L. Turning it up a Notch: cross-talk between TGF beta and Notch signaling. Bioessays., 2005; 27(2):115-8.
Lodish H., Berk A., Matsudaira P., Kaiser C.A., Krieger M. molecular cell biology. 2 ed. New York: elsevier; 2004.
Loeys B., De Paepe A. New insights in the pathogenesis of aortic aneurysms. 2008; Verh K Acad Geneeskd Belg., 70(2): 69-84.
Loeys B.L., Chen J., Neptune E.R., Judge D.P., Podowski M., Holm T., Meyers J., Leitch C.C., Katsanis N., Sharifi N., Xu F.L., Myers L.A., Spevak P.J., Cameron D.E., De Backer J., Hellemans J., Chen Y., Davis E.C., Webb C.L., Kress W., Coucke P., Rifkin D.B., De Paepe A.M., Dietz H.C. A syndrome of altered cardiovascular, craniofacial, neurocognitive and skeletal development caused by mutations in TGFBR1 or TGFBR2, Nat Genet., 2005; 37(3):275-81.
________________________________________________________________________________ 58
Referenties __________________________________________________________________________________ Maleszewski J.J., Miller D.V., Lu J., Dietz H.C., Halushka M.K. Histopathologic findings in ascending aortas from individuals with Loeys-Dietz syndrome (LDS). Am J Surg Pathol., 2009; 33(2): 194-201.
Matt P., Habashi J., Carrel T., Cameron D.E., Van Eyk J.E., Dietz H.C. Recent advances in understanding Marfan syndrome: should we now treat surgical patients with losartan? J Thorac Cardiovasc Surg., 2008: 135(2): 389-94.
McKellar S.H., Tester D.J., Yagubyan M., Majumdar R., Ackerman M.J., Sundt T.M. Novel NOTCH1 mutations in patients with bicuspid aortic valve disease and thoracic aortic aneurysms. J Thorac Cardiovasc Surg. 2007; 134(2):290-6.
Milewicz D.M., Guo D.C., Van Trna-Fadalu, Lafont A.L., Papke C.L., Inamoto S., Pannu H. Genetic Basis of Thoracic Aneurysms and Dissections: Focus on Smooth Muscle Cell Contractile Dysfunction. Annu. Rev. Genomics Hum.Genet., 2009; 283-302.
Morava E., Guillard M., Lefeber D.J., Wevers R.A. Autosomal recessive cutis laxa syndrome revisited. Eur J Hum Genet., 2009; 17(9): 1099-110
Morgan K.G., Gangopadhyay S.S. Signal Transduction in Smooth Muscle Invited Review : Crossbridge regulation by thin filament-associated proteins. J Appl Physiol, 2001; 91:953-962.
Mustafa S.T., Sadat U., Majeed M.U., Wong C.M., Michaels J, Thomas S.M. Endovascular repair of nonruptured thoracic aortic aneurysms: systematic review. Vascular, 2010; 18(1): 28-33.
Neptune E.R., Frischmeyer P.A., Arking D.E., Myers L., Bunton T.E., Gayraud B., Ramirez F., Sakai L.Y., Dietz H.C.: Dysregulation of TGF-beta activation contributes to pathogenesis in Marfan syndrome. Nat Genet, 2003; 33:407-411.
Nussbaum R.L. Chapter 8. Gene mapping and the Human Genome project. In: Thompson and Thompson genetics in medicine Sixth edition, Eds. Nussbaum R.L., McInnes R.R., Willard H.F. Philadelphia: Saunders, 2004.
Pannu H., Avdian N., Van Tran-Fadalu, Milewicz D.M. Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: Potential relevance to abdominal aortic aneurysms. Ann N Y Acad Sci., 2006; 1085:242-55. ________________________________________________________________________________ 59
Referenties __________________________________________________________________________________
Pannu H., Fadulu V.T., Chang J., Lafont A., Hasham S.N., Sparks E., Giampietro P.F., Zaleski C., Estrera A.L., Safi H.J., Shete S., Willing M.C., Raman C.S., Milewicz D.M. Mutations in transforming growth factor-beta receptor type II cause familial thoracic aortic aneurysms and dissections. Circulation., 2005; 112(4):513-20.
Pannu H., Tran-Fadulu V., Papke C.L., Scherer S., Liu Y., Presley C., Guo D., Estrera A.L., Safi H.J., Brasier A.R., Vick G.W., Marian A.J., Raman C.S., Buja L.M., Milewicz D.M. MYH11 mutations result in a distinct vascular pathology driven by insulin-like growth factor 1 and angiotensin II. Hum Mol Genet., 2007; 16(20):2453-62.
Power P.D., Lewin M.B., Hannibal M.C., Glass I.A. Aortic Root Dilatation is a Rare Complication of Noonan Syndrome. Pediatr Cardiol, 2006; 27:478-480.
Rodriguez-Revenga L., Iranzo P., Badenas C., Puig S., Carrió A., Milà M. A novel elastin gene mutation resulting in an autosomal dominant form of cutis laxa. Arch Dermatol., 2004; 140(9): 1135-9.
Rothenberg F., Hitomi M., Fisher S.A., Watanabe M. Initiation of apoptosis in the developing avian outflow tract myocardium. Dev. Dyn., 2002; 223, 469–482
Rozenblum G.T., Gimona M. Calponins: adaptable modular regulators of the actin cytoskeleton. Int J Biochem Cell Biol., 2008; 40(10):1990-5
Rychlik W., Spencer W.J., Rhoads R.E. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Res. 1990; 18:6409–6412.
Sharma N.L., Mahajan V.K., Gupta N., Ranjan N., Lath A. Ehlers-Danlos syndrome-vascular type (ecchymotic variant): cutaneous and dermatopathologic features. J Cutan Pathol, 2009; 36: 486-492.
Wung S.F., Aouizerat B.E. Newly mapped gene for thoracic aortic aneurysm and dissection. Journal of cardiovascular nursing, 2004; 19(6), 409-416.
Silverman D.I., Burton K.J., Gray J., Bosner M.S., Kouchoukos N.T., Roman M.J., Boxer M., Devereux R.B., Tsipouras P. Life expectancy in the Marfan syndrome. Am J Cardiol., 1995; 15; 75(2):157-60.
________________________________________________________________________________ 60
Referenties __________________________________________________________________________________ Snider P., Olaopa M., Firulli A.B., Conway SJ. Cardiovascular development and the colonizing cardiac neural crest lineage. ScientificWorldJournal, 2007; 7, 1090-1113.
Stoller J.Z., Epstein J.A. Cardiac neural crest. Semin.CellDev.Biol. 2005; 16, 704–715.
Szabo Z., Crepeau M.W., Mitchell A.L., Stephan M.J., Puntel R.A., Yin Loke K., Kirk R.C., Urban Z. Aotic aneurysmal disease and cutis laxa caused by defects in the elastin gene. J Med Genet, 2006; 43: 255-258.
Tadros T.M., Klein M.D., Shapira O.M. Ascending Aortic Dilatation Associated With Bicuspid Aortic Valve: Pathofysiology, Molecular Biology, and Clinical Implications. Circulation, 2009; 119; 880-890.
Vaughan C.J., Casey M., He J., Veugelers M., Henderson K., Guo D., Campagna R., Roman M.J., Milewicz D.M., Devereux R.B., Basson C.T. Identification of a chromosome 11q23.2-q24 locus for familial aortic aneurysm disease, a genetically heterogeneous disorder. Circulation., 2001; 103(20): 2469-75.
Watanabe A., Shimada T. Vascular type of Ehlers-Danlos syndrome. J Nippon Med Sch. 2008; 75(5): 254-61.
Williams J.A., Loeys B.L., Nwakanma L.U., Dietz H.C., Spevak P.J., Patel N.D., François K., DeBacker J., Gott V.L., Vricella L.A., Cameron D.E. Early surgical experience with Loeys-Dietz: a new syndrome of aggressive thoracic aortic aneurysm disease. Ann Thorac Surg, 2007; 83(2): S75763; discussion S785-90.
Zhu L., Vranckx R., Khau Van Kien P., Lalande A., Boisset N., Mathieu F., Wegman M., Glancy L., Gasc J.M., Brunotte F., Bruneval P., Wolf J.E., Michel J.B., Jeunemaitre X. Mutations in myosin heavy chain 11 cause a syndrome associating thoracic aortic aneurysm/aortic dissection and patent ductus arteriosus. Nat Genet., 2006; 38(3): 343-9.
________________________________________________________________________________ 61
6. Bijlage
Bijlage 1: Ghent nosology voor de klinische diagnose van Marfan. Overgenomen uit Kirchner et al., 2008.
Bijlage 2: Behandelingsschema voor patiënten met een aorta aneurysma met genetische etiologie (Hiratzka et al., 2010).* betekent hangt af van de genetische etiologie. CABG staat voor coronary arterial bypass graft surgery: CAD; Coronary artery disease; CT, computed tomographic imaging; and MR, magnetic resonance imaging.
Bijlage 3: Toestemming gebruik figuren Figuren: 1, 2 en 3 Dear Alexander, It is fine if you use these figures for your master paper. Good luck, Dianna _________ Dianna M. Milewicz, M.D. Ph.D. President George H.W. Bush Chair of Cardiovascular Medicine Professor and Director Division of Medical Genetics Department of Internal Medicine 6431 Fannin, MSB 6.100 University of Texas Medical School at Houston Houston, TX 77030 Phone: 713-500-6715 FAX: 713-500-0693
CONFIDENTIAL AND PRIVILEGED COMMUNICATION The information contained in this e-mail message may be privileged, confidential, and/or protected from disclosure. If you are not the intended recipient, or an authorized representative of the intended recipient, any further review, disclosure, use, dissemination, distribution, or copying of this message or any attachment (or the information contained therein) is strictly prohibited. If you think that you have received this e-mail in error, please notify the sender by return e-mail and delete all references to it and its content from your system. Thank you. Oorspronkelijk bericht: Dear professor, I am a student, studying medicine at the university of Ghent. I am writing my master paper about the genetic basis of thoracic aortic aneurysms and my promoter is prof. dr. B. Loeys. In order to explain the text I have written, I would like to use a few figures of an article of your hand. That is why I am asking your permission to include figures one, four and six in the article Genetic basis of thoracic aortic aneurysms and dissections: focus on smooth muscle cell contractile dysfunction. The master paper is for academic use only and not for publication. Yours sincerely, Alexander Schauwvlieghe Student second master medicine
Figuur 4: Toestemming You have my permission. I wish you the best success with your thesis. Please extend my regards to Prof. Loeys. John. Oorspronkelijk bericht: From: Alexander Schauwvlieghe [
[email protected]] Sent: Thursday, April 22, 2010 6:17 AM To: Elefteriades, John Subject: master paper Dear professor, I am a student, studying medicine at the university of Ghent. I am writing my master paper about the genetic basis of thoracic aortic aneurysms and my promoter is prof. dr. B. Loeys. In order to explain the text I have written, I would like to use a figure of an article of your hand. That is why I am asking your permission to include table 1 in the article Natural history, pathogenesis, and etiology of thoracic aortic aneurysms and dissections, published in the year 1999. The master paper is for academic use only and not for publication. Yours sincerely, Alexander Schauwvlieghe Student second master medicine Figuur 14: Toestemming Certainly, you can consider this e-mail to be my written permission to include figure 5, with reference to the original paper, in your master's paper. With best regards Kathleen Morgan Kathleen G. Morgan Ph.D. Professor and Chair Health Sciences Department Room 443B Boston University 635 Commonwealth Avenue Boston MA 02215 phone: 617-353-7464 fax: 617-353-7567 Oorspronkelijk bericht: Dear professor,
I am a student, studying medicine at the university of Ghent. I am writing my master paper about the genetic basis of thoracic aortic aneurysms and my promoter is prof. dr. B. Loeys. In order to explain the text I have written, I would like to use a figure of an article of your hand. That is why I am asking your permission to include figure 5 in the article Smooth muscle signalling pathways in health and disease, published in the year 2008. The master paper is for academic use only and not for publication. Yours sincerely, Alexander Schauwvlieghe Student second master medicine Voor de andere figuren werd een e-mail verstuurd, maar geen antwoord ontvangen.
