HIM. Účel. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5

HIM PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO.

Objednací údaje

HIM COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5

COBAS® AMPLICOR® Wash Buffer

WB

48 Tests P/N: 21118390 123 ART: 11 1839 0 US: 83369 500 Tests P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314

Účel COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 (v1.5) je test založený na amplifikaci nukleové kyseliny in vitro pro stanovení RNA viru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1) v lidské plazmě na přístroji COBAS® AMPLICOR® Analyzer. Testem je možno HIV-1 RNA stanovit v rozmezí 50-750 000 kopií/ml použitím kombinace dvou postupů přípravy vzorku: postupu Standard a UltraSensitive.

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 není určen plošnému vyšetřování krve či krevních derivátů na přítomnost HIV-1, ani jako diagnostický test k potvrzení infekce virem HIV-1.

4/2008, Revision 7.0


1/52

P/N: 04497813 190

Test se používá ve spojení s klinickými údaji a dalšími laboratorními markery postupu nemoci k určování klinické terapie pacientů infikovaných virem HIV-1. Pomocí testu lze posuzovat pacientovu prognózu stanovením výchozí hladiny HIV-1 RNA nebo sledovat účinky antiretrovirové terapie stanovením změn koncentrací HIV-1 RNA v plazmě v průběhu terapie. Hladina HIV-1 RNA stanovená pomocí polymerázové řetězové reakce (Polymerase Chain Reaction, PCR) sloužila jako jeden z výchozích markerů při zrychleném procesu schvalování FDA v případě léčiv s inhibitory proteázy INVIRASE (saquinavir mesylát), CRIXIVAN® (indinavir sulfát), NORVIR® (ritonavir) a FORTOVASE (saquinavir); léčiv s inhibitory nenukleozidové reverzní transkriptázy VIRAMUNE® (nevirapine), SUSTIVA® (efavirenz) a ZIAGEN® (abacavir) a léčiva s inhibitorem reverzní transkriptázy EPIVIR® (lamivudin).

Souhrn a výklad testu Virus lidské imunodeficience (HIV) je etiologickým agens syndromu získané imunodeficience (AIDS)1-3. Infekce virem HIV se může přenést pohlavním stykem, stykem s infikovanou krví či krevními deriváty nebo z infikované matky na plod4. Do tří až šesti týdnů od expozice viru HIV se u infikované osoby obvykle objevují symptomy podobné chřipce, které jsou spojeny s vysokou hladinou viremie v periferní krvi5-8. U nejvíce infikovaných osob následuje obvykle v době čtyř až šesti týdnů od prvních symptomů imunitní reakce specifická pro HIV a pokles viremie v plazmě9,10. Po serokonverzi se u infikovaných osob obvykle dostavuje klinicky stabilní asymptomatická fáze, která může trvat i léta11-13. Pro asymptomatické období je charakteristická přetrvávající nízká viremie v plazmě14 a postupné spotřebovávání lymfocytů CD4+ T, což vede k závažné imunodeficienci, četným oportunním infekcím, malignancím a úmrtí15. Koncentrace virů v periferní krvi je sice během asymptomatické fáze infekce nízká, ovšem replikace a clearance viru jsou dynamické procesy, kde je vysoká hodnota produkce viru a infekce buněk CD4+ vyvážena stejně vysokými hodnotami virové clearance, odumírání infikovaných buněk a doplňování buněk CD4+, což vede k poměrně stálým hladinám jak plazmatické viremie, tak buněk CD4+16-18. Kvantitativními měřeními viremie HIV bylo zjištěno, že je možno korelovat zvýšené hladiny viru se zvýšeným rizikem klinického postupu onemocnění virem HIV a že pokles hladiny viru v plazmě může být spojen se sníženým rizikem klinického postupu19-21. Hladinu viru v periferní krvi je možno stanovit měřením HIV antigenu p24 v séru, kvantitativní kultivací HIV z plazmy nebo přímým měřením virové RNA plazmě použitím metod amplifikace nukleové kyseliny nebo amplifikace signálu22-26. Antigen p24is je hlavní protein jádra HIV a v séru se vyskytuje buď volný, nebo vázaný na protilátku proti p24. Volný antigen p24 je možno měřit komerční soupravou pro enzymovou imunoanalýzu (EIA), ovšem jako marker virové zátěže má antigen p24 jen omezený význam, protože je zjistitelný jen u 20% asymptomatických pacientů a u 40-50% symptomatických pacientů. Citlivost testů na antigen p24 sice zvyšují postupy disociace komplexu antigen-protilátka, ale i tak zůstává tento virový protein u většiny asymptomatických pacientů nezjistitelný22. Infekční HIV v plazmě se dá vypěstovat naočkováním do mononukleárních buněk aktivované krve (PBMC) od normálních dárců. Stanovuje se očkováním PBMC se sériovým ředěním vzorku plazmy. Pro sledování hladin viru u infikovaných osob má kvantitativní kultivace pouze omezený význam, protože jen malý podíl virových části je infekčních in vitro. U asymptomatických osob je infekční virus často nedetekovatelný22. HIV RNA v plazmě je možno stanovit metodami amplifikace nukleové kyseliny, například využitím polymerázové řetězové reakce (PCR)27-29. V testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 se PCR metody využívá k dosažení maximální citlivosti a dynamického rozmezí kvantitativní detekce HIV-1 RNA v plazmě s EDTA nebo ACD jako antikoagulačními činidly24.

2/52



HIV-1 MONITOR

Princip metody COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 zahrnuje pět základních procesů: přípravu vzorku, reverzní transkripci terčové RNA za tvorby komplementární DNA (cDNA)30, PCR amplifikaci30 terčové cDNA za použití HIV-1-specifických komplementárních primerů, hybridizaci amplifikovaných produktů na oligonukleotidové sondy specifické pro daný terč/terče a detekci amplifikovaných produktů navázaných na sondu kolorimetrickým stanovením. COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 umožňuje současnou reverzní transkripci a PCR amplifikaci RNA HIV-1 a kvantifikačního standardu (QS) HIV-1. Činidlo Master Mix obsahuje primerový pár specifický jak pro HIV-1 RNA, tak pro kvantifikační standard HIV-1 RNA; bylo vyvinuto tak, aby umožňovalo ekvivalentní stanovení subtypů HIV-1 skupiny M. Se vzorky skupiny O funkční charakteristiky testu zjišťovány nebyly. Stanovení virové HIV-1 RNA se provádí pomocí kvantifikačního standardu HIV-1, což je neinfekční RNA transkript, který obsahuje stejná místa pro vazbu primeru jako terčová HIV-1 RNA a jedinečnou oblast pro vázání sondy, díky které se dá amplikon tohoto standardu odlišit od amplikonu HIV-1. Kvantifikační standard HIV-1 se zabudovává do každého jednotlivého vzorku ve známém počtu kopií a prochází společně s terčovým HIV-1 všemi stupni postupu od přípravy vzorku přes reverzní transkripci, PCR amplifikaci, hybridizaci až po detekci a je společně s ním amplifikován. COBAS® AMPLICOR® Analyzer vypočítává koncentraci HIV-1 RNA v testovaných vzorcích tak, že u každého vzorku porovnává signál HIV-1 se signálem kvantifikačního standardu. Kvantifikačním standardem se kompenzují inhibiční efekty a kontroluje se amplifikační proces tak, aby bylo možno v každém vzorku přesně stanovit HIV-1 RNA. Příprava vzorku


Pro COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 se používá jeden ze dvou postupů přípravy vzorku: Standard nebo UltraSensitive. Při postupu Standard se HIV-1 RNA izoluje přímo z plazmy lýzou virových částic pomocí chaotropního činidla s následným vysrážením RNA alkoholem. Při postupu UltraSensitive se virové částice HIV-1 v plazmě nejprve koncentrují vysokorychlostní centrifugací, po které teprve následuje lýza virových částic pomocí chaotropního činidla a vysrážení HIV-1 RNA alkoholem. Do každého vzorku se společně s činidlem pro lýzu zavádí známý počet molekul RNA kvantifikačního standardu. Kvantifikační standard HIV-1 prochází stadii přípravy vzorku, reverzní transkripce, amplifikace a detekce a slouží ke stanovení HIV-1 RNA ve zkušebním vzorku.


3/52

Reverzní transkripce a PCR amplifikace

Volba terče Volba terčové RNA sekvence pro HIV-1 je dána identifikací oblastí v genomu HIV-1, kde se sekvence v maximální míře zachovává. V této souvislosti má pro schopnost detekovat genotyp HIV-1 zásadní význam vhodná volba primerů a sondy. V soupravě COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 se používají primery SK145 a SKCC1B, kterými se definuje sekvence 155 nukleotidů ve vysoce konzervované oblasti HIV-1 gag genu31. Oblast gag kóduje skupinově specifické antigeny nebo jádrové strukturní proteiny virionu. Gag geny HIV-1 mají obvykle délku 1 500 nukleotidů a v genomu HIV se nacházejí přibližně v polohách 789-2 290. Nukleotidová sekvence primerů je optimalizována tak, aby poskytovala ekvivalentní amplifikaci subtypů HIV-1 skupiny M. Reverzní transkripce Reverzní transkripce a PCR amplifikace se provádí pomocí DNA polymerázy tepelně stálého rekombinantního enzymu Thermus thermophilus (rTth pol). Za přítomnosti manganu a za vhodných pufrovacích podmínek vykazuje rTth pol aktivitu jak reverzní transkriptázy, tak DNA polymerázy30. Díky tomu může reverzní transkripce a PCR amplifikace probíhat v téže reakční směsi. Zpracované vzorky se přidávají do amplifikační směsi v amplifikačních zkumavkách (A-zkumavkách), kde probíhá jak reverzní transkripce, tak PCR amplifikace. Downstream čili antisense primer (SKCC1B) i upstream neboli sense primer (SK145) jsou na 5'-koncích biotynylovány. Reakční směs se zahřívá, aby se downstream primer napojil na terčovou RNA HIV-1 a na kvantifikační standard RNA HIV-1. Za přítomnosti Mn2+ a nadbytku deoxynukleosid-trifosfátů (dNTPs), včetně trifosfátu deoxyadenosinu, deoxyguanosinu, deoxycytidinu, deoxyuridinu a deoxythymidinu, prodlužuje rTth pol napojený primer a vytváří řetězec DNA (cDNA) komplementární k terčové RNA. Amplifikace terče Po reverzní transkripci terčové RNA HIV-1 a RNA kvantifikačního standardu RNA HIV-1 se reakční směs zahřívá, aby se RNA:cDNA hybrid denaturoval a odhalily se terčové sekvence primeru. Během ochlazování směsi se upstream primer (SK145) napojuje specificky na řetězec cDNA, rTth pol primer prodlužuje a syntetizuje se druhý řetězec DNA. Tím se uzavírá první cyklus PCR, poskytující dvouřetězcovou DNA kopii terčové oblasti RNA HIV-1 a kvantifikačního standardu RNA HIV-1. Reakční směs se opět zahřeje k oddělení výsledné dvouřetězcové DNA a exponování sekvencí primerového terče. Během chlazení směsi se primery SK145 a SKCC1B napojují na terčovou DNA. rTth pol za přítomnosti Mn2+ a nadbytku dNTPs prodlužuje napojené primery podél terčových templátů a vytváří dvouřetězcovou molekulu DNA se 155 páry bází, která se nazývá amplikon. COBAS® AMPLICOR® Analyzer tento postup automaticky opakuje ve stanoveném počtu cyklů, přičemž v každém cyklu se množství amplikonové DNA efektivně zdvojnásobuje. Amplifikace probíhá pouze v oblasti genomu HIV-1 mezi primery; celý genom HIV-1 amplifikován není.

4/52



HIV-1 MONITOR

Selektivní amplifikace Selektivní amplifikace terčové nukleové kyseliny z klinického vzorku se u soupravy COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 dosahuje použitím enzymu AmpErase (uracil-N-glykosylázy) a deoxyuridin-trifosfátu (dUTP). Enzym AmpErase rozezná vlákna DNA obsahující deoxyuridin32, a katalyzuje jejich destrukci, ale nepozná DNA, pokud obsahuje deoxythymidin. Deoxyuridin se v přirozené DNA nevyskytuje, je však vždy přítomen v amplikonu díky použití deoxyuridintrifosfátu jako jednoho z dNTPs v činidle Master Mix, takže deoxyuridin obsahuje pouze amplikon. V důsledku přítomnosti deoxyuridinu je kontaminující amplikon citlivý vůči destrukci enzymem AmpErase před amplifikací cílové DNA. Enzym AmpErase, který je obsažen ve směsi činidla Master Mix, katalyzuje štěpení DNA obsahující deoxyuridin v místě deoxyuridinového zbytku rozevřením deoxyribozového řetězce v pozici C1. Během zahřívání v prvním tepelném cyklu při alkalickém pH činidla Master Mix se DNA řetězec amplikonu štěpí v poloze deoxyuridinu, čímž se tato DNA stává neamplifikovatelnou. Při teplotách nad 55°C, tedy během tepelného cyklování, je enzym AmpErase inaktivní, a proto terčový amplikon nerozkládá. Po amplifikaci se případný zbytkový enzym denaturuje přídavkem denaturačního roztoku, čímž se předchází degradaci terčového amplikonu. Bylo zjištěno, že enzym AmpErase v soupravě COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 inaktivuje minimálně 103 kopií deoxyuridin-obsahujícího HIV-1 amplikonu na jednu PCR. Hybridizační reakce

Po PCR amplifikaci přidává COBAS® AMPLICOR® Analyzer automaticky do A-zkumavek denaturační roztok k chemické denaturaci amplikonu HIV-1 a kvantifikačního standardu HIV-1 a k tvorbě jednořetězcové DNA. K dosažení kvantitativních výsledků v širokém dynamickém rozmezí ředí COBAS® AMPLICOR® Analyzer denaturovaný amplikon sériově v detekčních kelímcích (D- kelímcích). Ke každému ze čtyř zředěných roztoků amplikonu HIV-1 resp. ze dvou zředěných roztoků kvantifikačního standardu HIV-1 se přidá suspenze magnetických částic potažených oligonukleotidovou sondou specifickou pro daný amplikon, tj. SK102 pro amplikon HIV-1 nebo CP35 pro kvantifikační standard HIV-1. Biotinem značený amplikon je hybridizován k terčově specifické oligonukleotidové sondě vázané na magnetické částice. Pro každé kvantitativní stanovení je zapotřebí čtyř nezávislých měření absorbance činidla za použití suspenze sondy HIV-1 a dvou měření absorbance za použití suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1.

Detekční reakce

Po hybridizační reakci opláchne COBAS® AMPLICOR® Analyzer v D-kelímku magnetické částice, aby z nich odstranil nenavázanou látku, a přidá konjugát Avidinu s křenovou peroxidázou. Tento konjugát se naváže na biotinem značený amplikon hybridizovaný k terčově specifickým oligonukleotidovým sondám navázaným na magnetické částice. Opláchnutím magnetických částic odstraní přístroj COBAS® AMPLICOR® Analyzer nenavázaný konjugát, načež přidá do všech D-kelímků roztok substrátu obsahující peroxid vodíku a 3,3',5,5' tetramethylbenzidin (TMB). Za přítomnost peroxidu vodíku katalyzuje navázaná křenová peroxidáza oxidaci TMB na barevný komplex, jehož absorbanci přístroj COBAS® AMPLICOR® Analyzer proměřuje při 660 nm.



5/52

Stanovení HIV-1 RNA COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 stanovuje RNA viru HIV-1 pomocí druhé terčové sekvence (kvantifikační standard HIV-1), který je do testovaného vzorku přidán ve známé koncentraci. Kvantifikační standard HIV-1 je neinfekční molekula RNA transkribovaná 233 nukleotidy in vitro s oblastmi vazby primeru stejnými jako v terčové sekvenci HIV-1. Kvantifikační standard HIV-1 obsahuje vazebná místa pro primer SK145 a SKCC1B a vytváří amplifikační produkt téže délky (155 bází) a složení bází jako v terčové RNA HIV-1. Oblast vázající sondu v amplikonu kvantifikačního standardu HIV-1 je modifikována tak, aby se tento amplikon HIV-1 odlišil od terčového amplikonu HIV-1. V lineární oblasti testu je absorbance u 660 nm (A660) D-kelímku úměrná množství amplikonu HIV-1 resp. amplikonu kvantifikačního standardu HIV-1 v něm. Přístroj COBAS® AMPLICOR® Analyzer nejprve vypočítá absorbanci celkového HIV-1 a kvantifikačního standardu HIV-1 vynásobením absorbance D-kelímku faktorem zředění amplikonu v daném D-kelímku a potom vybere D-kelímek o nejvyšší celkové absorbanci. Vypočtená celková absorbance je úměrná množství RNA HIV-1 nebo RNA kvantifikačního standardu HIV-1 v dané reakci reverzní transkripce/PCR amplifikace. Množství HIV-1 RNA ve vzorku se pak vypočte z poměru celkové absorbance HIV-1 k celkové absorbanci kvantifikačního standardu HIV-1 a vstupního počtu molekul RNA kvantifikačního standardu HIV-1 podle rovnice: A HIV-1 [Celková ] Celková A QS Kde:

6/52

AF

x Vstupních HIV-1 QS kopií/PCR x faktor objemu vzorku = HIV-1 RNA kopií/ml

Celková A HIV-1 = vypočtená celková absorbance amplikonu HIV-1 Celková A QS = vypočtená celková absorbance amplikonu kvantifikačního standardu Vstupních kopií QS HIV-1/PCR = počet kopií kvantifikačního standardu v každé reakci; toto číslo je specifické pro danou šarži Objemový faktor vzorku = přepočítávací faktor pro převod z kopí/PCR na kopií/ml AF = adjustační faktor pro standardizaci výsledků testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR v1.5 na výsledky testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR v1.5 (adjustační faktor = 1,11). Objemový faktor vzorku = 40 pro postup přípravy vzorku Standard Objemový faktor vzorku = 4 pro postup přípravy vzorku UltraSensitive



HIV-1 MONITOR

Činidla COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 Příprava vzorků činidla

HIM

48 testů P/N: 21118390 123 ART: 11 1839 0 US: 83369

HIM PREP

HIV-1 LYS (Činidlo pro lýzu HIV-1 MONITOR) Pufr Tris-HCl 68% Guanidinthiokanát 3% Dithiothreitol < 1% Glykogen 68% hm. guanidinthiokyanát

+

Xn

4 x 9,0 ml

Zdraví škodlivý HIV-1 QS, v1.5 (Kvantifikační standard HIV-1 MONITOR, verze 1.5) < 0,001% neinfekční RNA transkribovaná in vitro (mikrobiální) obsahující sekvence vázající HIV-1 primer a jedinečnou oblast vázající sondu < 0,005% poly rA RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný

4 x 0,1 ml

HIV-1 DIL (Redidlo na vzorky HIV-1 MONITOR) Pufr Tris-HCl < 0,005% poly rA RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný

4 x 4,8 ml

Kontrolní činidla

HIM CTL

NHP 4 x 1,6 ml [Negativní plazma (lidská)] Lidská plazma, nereaktivní v US FDA-licencovaných testech na protilátky proti HCV, protilátky proti HIV-1/2, antigen HIV p24 a HBsAg; metodou PCR nebyla ve spojených dárcovských jednotkách zjištěna žádná HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA a testem licencovaným FDA. 0,1% konzervační činidlo ProClin® 300 HIV-1 (–) C [Kontrola HIV-1 (–)] < 0,005% poly rA RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný



4 x 0,05 ml

7/52

HIV-1 L(+)C [Nízká (+) kontrola HIV-1 MONITOR] < 0,001% neinfekční RNA transkribovaná in vitro (mikrobiální) obsahující sekvence HIV-1 < 0,005% poly rA RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný

4 x 0,05 ml

HIV-1 H(+)C [Vysoká (+) kontrola HIV-1 MONITOR] < 0,001% neinfekční RNA transkribovaná in vitro (mikrobiální) obsahující sekvence HIV-1 < 0,005% poly rA RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný

4 x 0,05 ml

Amplifikační činidla

HIM AMP

HIV-1 MMX, v1.5 4 x 0,7 ml (Master Mix HIV-1 MONITOR, verze 1.5) Bicinový pufr Glycerol < 0,01% rTth DNA polymeráza (rTth pol, mikrobiální) Octan draselný < 0,07% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP < 0,001% primery SKCC1B a SK145, biotinylované < 0,01% enzym AmpErase uracil-N-glykosyláza (mikrobiální) 0,05% azid sodný 4 x 0,1 ml

HIV-1 Mn2+, v1.5 (Manganatý roztok HIV-1 MONITOR, verze 1.5) < 2% Mangan Kyselina octová Amarantové barvivo 0,05% azid sodný Specifická detekční činidla

HIM DK

AD3 (Cinidlo pro ředění amplikonu) EDTA 0,8% hydroxid sodný 0,8% hm. hydroxid sodný

+

Xi

2 x 75 testů

Dráždivý IM PS1, v1.5 (Suspenze sondy HIV-1 MONITOR 1, verze 1.5) MES pufr < 0,01% suspenze částic Dynabeads® (paramagnetické částice) potažených HIV-1-specifickou oligonukleotidovou záchytovou sondou SK102 0,09% azid sodný

8/52


2 x 100 testů


HIV-1 MONITOR

IM4, v1.5 (Suspenze sondy HIV-1 MONITOR 2, verze 1.5) Pufr s fosforečnanem sodným < 0,2% detergent 24,9% thiokyanát sodný

2 x 100 testů

IQ PS1, v1.5 1 x 100 testů (Suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1 MONITOR č. 1, verze 1.5) MES pufr < 0,01% suspenze Dynabeads (paramagnetické částice) potažených oligonukleotidovou záchytovou sondou CP35 specifickou pro kvantifikační standard HIV-1 0,09% azid sodný IQ4, v1.5 (Suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1 MONITOR č. 2, verze 1.5) Pufr s fosforečnanem sodným < 0,2% detergent 24,9% thiokyanát sodný Generická detekční činidla

DK

DN4 (Denaturační roztok) 1,6% hydroxid sodný EDTA Thymolová modř

1 x 100 testů

1,6% hm. hydroxid sodný

+

Xi

1 x 100 testů

Dráždivý CN4 (Konjugát avidinu s křenovou peroxidázou) Pufr Tris-HCl < 0,001% konjugát avidinu s křenovou peroxidázou Bovinní serumalbumin (savčí) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% konzervační činidlo ProClin® 150


3 x 100 testů

SB3 (Substrát A) Citrátový roztok 0,01% peroxid vodíku 0,1% konzervační činidlo ProClin® 150

5 x 75 testů


9/52

SB (Substrát B) 0,1% 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) 40% dimethylformamid (DMF) T

5 x 5 ml

40% hm. dimethylformamid (DMF)

Toxický R: 61-20/21-36

Může poškodit plod v těle matky. Zdraví škodlivý při vdechování a při styku s kůží. Dráždí oči.

S: 53-45

Zamezte expozici - před použitím si obstarejte speciální instrukce. V případě nehody, nebo necítíte-li se dobře, okamžitě vyhledejte lékařskou pomoc (je-li možno, ukažte toto označení).

COBAS® AMPLICOR® WB Wash Buffer Promývací pufr COBAS® AMPLICOR®

500 testů P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314

WB (10X-promývací koncentrát) < 2% fosfátový pufr < 9% chlorid sodný EDTA < 2% detergent 0,5% konzervační činidlo ProClin® 300

2 x 250 testů

Upozornění a bezpečnostní pokyny Pro diagnostické použití in vitro. Tento test se používá pouze s lidskou plazmou odebranou v antikoagulantech EDTA nebo ACD. Heparin inhibuje PCR a při tomto postupu je jeho použití zakázáno. Nepipetovat ústy. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a nekuřte. Při manipulaci se vzorky a reagenciemi ze soupravy noste ochranné rukavice na jedno použití, laboratorní plášť a prostředek ochrany očí. Po práci se vzorky a zkušebními činidly si důkladně umyjte ruce. Při odebírání alikvotních podílů z lahviček s činidly dbejte, aby nedošlo k mikrobiální nebo ribonukleázové kontaminaci. Doporučuje se používat sterilní pipety na jedno použití a špičky na pipety prosté RNázy. Nesměšujte dohromady činidlo z různých šarží, ani z různých lahviček téže šarže. Nespotřebovaná činidla a odpad likvidujte v souladu s celostátními a místními předpisy.

10/52



HIV-1 MONITOR

Po vypršení lhůty použitelnosti již soupravu nepoužívejte. Materiálové bezpečnostní listy si lze vyžádat u místního zastoupení firmy Roche. Pracovní tok musí v laboratoři probíhat jednosměrně, od předamplifikačního prostoru směrem k poamplifikačnímu prostoru (amplifikace/detekce). Předamplifikační činnosti začínají přípravou činidel a postupují k přípravě vzorků. Látky a vybavení se musí přiřadit jednotlivým předamplifikačním činnostem a nesmějí se používat k jiným činnostem, ani přenášet mezi jednotlivými vyhrazenými prostory. Ve všech prostorech je třeba nosit rukavice, které se před opuštěním prostoru vymění. Vybavení a materiály pro přípravu činidla se nesmějí používat k přípravě vzorků, ani pro pipetování nebo zpracování amplifikované DNA či jiných zdrojů terčové DNA. Poamplifikační materiály a vybavení musí vždy zůstat v poamplifikačním prostoru. Se vzorky je třeba zacházet jako s infekčními a používat odpovídající laboratorní postupy, například jak jsou uvedeny v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories33 nebo v dokumentu CLSI M29-A334. Všechny plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným 0,5% roztokem chlornanu sodného v deionizované nebo destilované vodě. Poznámka

Běžné bělicí prostředky pro domácnost obvykle obsahují chlornan sodný v koncentraci 5,25%. Roztok o koncentraci 0,5% tak dostanete zředěním bělidla pro domácnost v poměru 1:10. POZOR: Souprava obsahuje složku (NHP) odvozenou z lidské krve. Zdrojový materiál byl analyzován pomocí testů schválených US FDA a byl shledán nereaktivním vůči protilátkám proti HCV, protilátkám proti HIV-1/2, antigenu HIV p24 a povrchovému antigenu hepatitidy B (HBsAg). Mimoto byly testovány spojené dárcovské jednotky; metodou PCR nebyla zjištěna žádná HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA a testem licencovaným FDA nebyla zjištěna žádná HBV core protilátka. Ovšem žádná známá testovací metoda nepředstavuje dokonalou záruku, že se s deriváty z lidské krve nepřenesou nějaké infekční látky. Proto je třeba považovat všechen materiál lidského původu za potenciálně infekční. S NHP je třeba zacházet jako s infekčním a při práci s ním je nutno uplatňovat bezpečné laboratorní postupy, například ty, které jsou uvedeny v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories33 nebo v dokumentu CLSI M29-A334. Všechny plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným 0,5% roztokem chlornanu sodného v deionizované nebo destilované vodě. HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn2+, v1.5; HIV-1 (–) C; HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 a IQ PS1, v1.5 obsahují azid sodný. Ten může reagovat s kovovým olovem nebo mědí instalačních trubek za tvorby vysoce výbušných kovových azidů. Budete-li tedy vylévat roztoky obsahující azid do laboratorní výlevky, spláchněte je velkým objemem vody, aby se azid nemohl nikde usadit. Při práci s HIV-1 LYS, HIV-1 MMX v1.5, DN4, AD3, IM4 v1.5, IQ4 v1.5, CN4, SB3, SB a pracovním substrátem (směs činidel SB3 a SB) noste prostředek ochrany očí, pracovní plášť a rukavice na jedno použití. Dbejte, aby se tyto materiály nedostaly do styku s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud byste tuto péči zanedbali, mohly by se vyvinout popáleniny. Jestliže se některé činidlo rozlije nebo rozsype, před vytřením dosucha je zřeďte vodou. Dbejte, aby se SB ani pracovní substrát nedostal do styku s pokožkou nebo sliznicemi. Pokud se některá z těchto látek do styku s pokožkou dostane, omyjte ji okamžitě velkým množstvím vody.



11/52

SB a pracovní substrát obsahují dimethylformamid, který je ve vysokých orálních dávkách toxický a může poškodit plod. Je třeba dbát, aby nedošlo k jejich styku s pokožkou, vdechování výparů ani požití. Pokud ke styku s pokožkou dojde, omyjte ji důkladně vodou a mýdlem a vyhledejte okamžitě lékařskou pomoc. Dbejte, aby se HIV-1 LYS, který obsahuje guanidinthiokyanát, ani IM4 v1.5 nebo IQ4 v1.5, které obsahují thiokyanát sodný, nemohly dostat do styku s roztokem chlornanu sodného (bělidlo). Ze směsi by se mohl uvolňovat vysoce toxický plyn. Vzorek i kontrolní preparát se musí uchovávat ve zkumavkách se šroubovacím uzávěrem, aby nemohl vystříknout a aby nemohlo dojít ke vzájemné (křížové) kontaminaci vzorků. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte.

Požadavky na skladování a manipulaci Reagencie nezmrazujte. HIV-1 LYS, HIV-1 QS v1.5 a HIV-1 DIL uchovávejte při teplotě 2-8°C. Dokud jsou neotevřená, jsou tato činidla stálá do vyznačeného data použitelnosti. Po otevření je třeba nespotřebovanou část zlikvidovat. V HIV-1 LYS se během skladování při teplotě 2-8°C tvoří sraženina. Tu před použitím rozpusťte zahřátím HIV-1 LYS na teplotu 25-37°C. Ohřívejte HIV-1 LYS nejdéle 30 minut a potom kapalinou důkladně míchejte, dokud se krystalky nerozpustí. Před použitím si každou lahvičkou HIV-1 LYS prohlédněte proti bílému podkladu a sledujte, jestli nezpozorujete žluté zabarvení nebo známky netěsnosti. Pokud žlutou barvu nebo známky netěsnosti zjistíte, lahvičku k testování nepoužijte a vyžádejte si od místního zastoupení firmy Roche náhradu. Po otevření je třeba nespotřebovanou část zlikvidovat. Pracovní činidlo pro lýzu, připravené tak, že se k HIV-1 LYS přidal HIV-1 QS, v1.5, se uchovává za pokojové teploty a musí se spotřebovat do 4 hodin od přípravy. HIV-1 MMX, v1.5 a HIV-1 Mn2+, v1.5 se uchovává za teplot 2-8°C. Činidla jsou stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po otevření je třeba nespotřebovanou část zlikvidovat. Pracovní Master Mix, připravený tak, že se k HIV-1 MMX, v1.5 přidal HIV-1 Mn2+, v1.5, se uchovává za teploty 2-8°C, kdy je stálý po dobu 4 hodin. NHP, HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C uchovávejte při teplotě 2-8°C. Činidla jsou stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po otevření je třeba nespotřebovanou část zlikvidovat. AD3 uchovávejte za teplot 2-25°C. Po vložení do přístroje COBAS® AMPLICOR® Analyzer je AD3 při teplotě 2-8°C stálý 30 dní nebo do vypršení doby použitelnosti, podle toho, která doba je kratší. AD3 se dá použít maximálně na čtyři 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2-8°C. IM PS1, v1.5 a IM4, v1.5 uchovávejte při teplotě 2-8°C. Činidla jsou stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po smísení IM PS1, v1.5 s IM4, v1.5 je pracovní činidlo při teplotě 2-8°C stálé 14 dní. Dá se použít nanejvýš na dva 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2-8°C. IQ PS1, v1.5 a IQ4, v1.5 uchovávejte při teplotě 2-8°C. Činidla jsou stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po smísení IQ PS1, v1.5 s IQ4, v1.5 je pracovní činidlo při teplotě 2-8°C stálé 30 dní. Dá se použít nanejvýš na čtyři 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2-8°C.

12/52



HIV-1 MONITOR

DN4 uchovávejte za teplot 2-25°C. DN4 je stálé do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po otevření je DN4 při teplotě 2-8°C stálé 30 dní nebo do vypršení doby použitelnosti, podle toho, která doba je kratší. DN4 se dá použít maximálně na čtyři 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2-8°C. CN4 uchovávejte při teplotě 2-8°C. CN4 je stálé do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po otevření je CN4 při teplotě 2-8°C stálé 30 dní nebo do vypršení doby použitelnosti, podle toho, která doba je kratší. CN4 se dá použít maximálně na čtyři 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2-8°C. SB3 a SB uchovávejte při teplotě 2-8°C. Neotevřená jsou tato činidla stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Pracovní substrát se připravuje smísením SB3 s SB denně. Pracovní substrát je v přístroji COBAS® AMPLICOR® Analyzer stálý 16 hodin. SB3, SB ani pracovní substrát nesmí přijít do styku s kovy ani s oxidačními činidly a nesmí se vystavovat přímému světlu. WB uchovávejte za teplot 2-30°C. WB je stálé do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Před zředěním WB prohlédněte a zpozorujete-li sraženinu, kapalinu zahřejte na 30-37°C, aby se sraženina rozpustila. Pracovní promývací pufr (1X), připravený zředěním činidla WB destilovanou nebo deionizovanou vodou v poměru 1:10, se v rezervoáru promývacího pufru přístroje COBAS® AMPLICOR® uchovává za teplot 2-25°C, kdy je stálý 2 týdny ode dne přípravy. Částečně spotřebovaná detekční činidla uchovávejte mezi jednotlivými měřeními při teplotě 2-8°C. Před vložením do přístroje COBAS® AMPLICOR® Analyzer zkontrolujte, zda otevřeným nebo pracovním činidlům neuplynula doba použitelnosti.

Dodané materiály COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, version 1.5

HIM

Příprava vzorků činidla

HIM PREP

P/N: 21118390 123 ART: 11 1839 0 US: 83369

HIV-1 LYS (Činidlo pro lýzu HIV-1 MONITOR) HIV-1 QS, v1.5 (Kvantifikační standard HIV-1 MONITOR, verze 1.5) HIV-1 DIL (Redidlo na vzorky HIV-1 MONITOR) Kontrolní činidla

HIM CTL

NHP [Negativní plazma (lidská)] HIV-1 (–) C [Kontrola HIV-1 (–)] HIV-1 L(+)C [Nízká (+) kontrola HIV-1 MONITOR] HIV-1 H(+)C [Vysoká (+) kontrola HIV-1 MONITOR] 4/2008, Revision 7.0


13/52

Amplifikační činidla

HIM AMP

HIV-1 MMX, v1.5 (Master Mix HIV-1 MONITOR, verze 1.5) HIV-1 Mn2+, v1.5 (Manganatý roztok HIV-1 MONITOR, verze 1.5) Specifická detekční činidla

HIM DK

AD3 (Cinidlo pro ředění amplikonu) IM PS1, v1.5 (Suspenze sondy HIV-1 1, verze 1.5) IM4, v1.5 (Suspenze sondy HIV-1 2, verze 1.5) IQ PS1, v1.5 (Suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1 č. 1, verze 1.5) IQ4, v1.5 (Suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1 č. 2, verze 1.5) Generická detekční činidla

DK

DN4 (Denaturační roztok) CN4 (Konjugát avidinu s křenovou peroxidázou) SB3 (Substrát A) SB (Substrát B) COBAS® AMPLICOR® Wash Buffer COBAS® AMPLICOR® Promývací pufr

WB

P/N: 20759899 123 ART: 07 5989 9 US: 83314

WB (10X-promývací koncentrát)

Potřebné materiály, jež nejsou součástí dodávky Předamplifikace – prostor pro přípravu činidel – COBAS® AMPLICOR® A-ring fitted with 12 A-tubes – COBAS® AMPLICOR® A-ring holder – Pipeta Eppendorf Multipette® se dvanácti zásobníky Eppendorf Combitip® Reservoir 1,25 ml (sterilní, jednotlivě balené) – Pipetory (objem 50 µl a 100 µl)* s aerosolovou bariérou nebo RNázy prostými špičkami s pozitivním posuvem – Rukavice na jedno použití bez prášku

14/52



HIV-1 MONITOR

Předamplifikace – prostor pro přípravu vzorku a kontroly – Zkumavky 2,0 ml se šroubovacím uzávěrem, sterilní (Sarstedt 72.694.006 nebo ekvivalentní)** – Zkumavky 1,5 ml se šroubovacím uzávěrem, sterilní (Sarstedt 72.692.105 nebo ekvivalentní)** – Stojany na zkumavky (Sarstedt 93.1428 nebo ekvivalentní) – 95% ethanol pro mikrobiologii nebo histologii (čerstvě zředěný na 70% destilovanou nebo deionizovanou vodou) – Izopropylalkohol čistoty p.a. – Sterilní transferové pipety s jemnou špičkou prosté RNázy – Sterilní polystyrenové serologické pipety na jedno použití (5 ml, 10 ml a 25 ml) – Pipetory (objem 12,5 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 800 µl a 1 000 µl)* s aerosolovou bariérou nebo špičkami s pozitivním posuvem prostými RNázy – Mikrocentrifuga (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g) Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M nebo ekvivalentní – Mražená ultracentrifuga s rotorem s pevným úhlem (45°, kapacita minimálně 24 zkumavek po 1,5 ml) o RCF 23 600 x g (Heraeus 17RS s rotorem HFA 22.1, Biofuge 28RS nebo ekvivalentní) – Vířivý mixér – Rukavice na jedno použití bez prášku Poamplifikace – prostor pro amplifikaci/detekci – COBAS® AMPLICOR® Analyzer a tiskárna – Příručka „Operator’s Manual“ k přístroji COBAS® AMPLICOR® Analyzer • Volitelné: Software AMPLILINK včetně: – Datová stanice pro software AMPLILINK s tiskárnou – Příručka uživatele k softwaru AMPLILINK verze 2.4 pro analyzátor COBAS® AMPLICOR® (pro použití se softwarem AMPLILINK verze 2.41) nebo Aplikační manuál k softwaru AMPLILINK verze 3.2 pro zařízení COBAS® AmpliPrep, analyzátor COBAS® TaqMan®, analyzátor COBAS® TaqMan® 48 a analyzátor COBAS® AMPLICOR® (pro použití se softwarem AMPLILINK verze 3.2) – Racks of D-cups – Destilovaná nebo deionizovaná voda – Serologické pipety 5 ml – Vířivý mixér – Rukavice na jedno použití bez prášku * Pipetory musejí být přesné na 3% jmenovitého objemu. Kde je tak uvedeno, musí být použita aerosolová bariéra nebo špičky s pozitivním posuvem prosté RNázy, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci vzorku a amplikonu. ** Na vzorek a kontrolní preparát se používají zkumavky se šroubovacím uzávěrem, aby se předešlo možné vzájemné kontaminaci vzorků a kontrol. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte.



15/52

Odběr, přeprava a skladování vzorků Poznámka

Se všemi vzorky je třeba zacházet jako s infekčními.

Odběr vzorků

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 je určen pouze pro práci se vzorky plazmy. Krev se odebírá do sterilních zkumavek za použití EDTA (vršek levandulové barvy) nebo ACD (vršek žluté barvy) jako antikoagulantu. Vzorky antikoagulované heparinem jsou pro tento test nevhodné. Celou krev uchovávejte při teplotě 2-25°C maximálně 6 hodin. Při použití vzorků s ACD jako antikoagulantem jsou výsledky testu zhruba o 15% nižší než při použití EDTA jako antikoagulantu; to je důsledkem zředění krve při odběru objemem 1,5 ml ACD. Vliv antikoagulantů ACD a EDTA na výsledky stanovení HIV-1 RNA ve vzorcích plazmy ukazuje Obr. 1.

Vzorky s ACD Průměrný výsledek testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (HIV RNA kopií/ml plazmy, n = 2)

Obr. 1 Porovnání antikoagulantů ACD a EDTA* AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Výsledky u vzorků s EDTA a ACD 10 5

y = 1,4381 * x^(0,93286) R= 0,90097 EDTA = ACD

10 4

10 3

10 3

10 4 10 5 Vzorky s EDTA Pruměrný výsledek testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (HIV RNA kopií/ml plazmy, n = 2)

* Hodnoty v Obr. 1 byly testem AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test získány při použití postupu přípravy vzorku Standard. Sérum nebo plazmu z krve separujte do 6 hodin od odběru, a to odstřeďováním za pokojové teploty po dobu 20 minut při 800-1 600 x g. Plazmu převeďte do sterilní polypropylenové zkumavky. Přeprava vzorků

Při přepravě celé krve, séra nebo plazmy je třeba dodržovat celostátní resp. místní předpisy o dopravě etiologických látek35. Celá krev se přepravuje za teplot 2-25°C a musí se zpracovat do 6 hodin od odběru. Plazma se může přepravovat při teplotě 2-8°C nebo ve zmrazeném stavu při teplotách –20°C až –80°C.

Skladování vzorků

Vzorky plazmy je možno uchovávat při pokojové teplotě 1 den, při teplotě 2-8°C do 5 dnů nebo ve zmrazeném stavu při teplotách –20°C až –80°C. Doporučuje se uchovávat vzorky v alikvotních podílech po 600-700 µl ve sterilních polypropylenových zkumavkách o objemu 2,0 ml se šroubovacím uzávěrem (Sarstedt 72.694.006). Vzorky plazmy je možno zmrazit a rozmrazit maximálně třikrát. Údaje ze studií zabývajících se cykly zmrazení-rozmrazení ukazuje Obr. 2.

16/52



HIV-1 MONITOR

Obr. 2 Průměrné výsledky pro HIV-1 ze tří spojených vzorků HIV-1-pozitivní plazmy po 2, 3 a 4 cyklech zmrazení-rozmrazení*

HIV-1 RNA kopií/ml Normalizováno na 1. rozmrazení

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0 1

2

3

4

Počet rozmrazení

* Hodnoty v Obr. 2 byly testem AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test získány při použití postupu přípravy vzorku Standard.

Návod k použití Poznámka

Podrobné pokyny pro práci, tisk výsledků a vysvětlení značek a poznámek najedete v (1) Příručce uživatele k analyzátoru COBAS® AMPLICOR® a (2) jestliže používáte software AMPLILINK verze 2.41, přečtěte si Příručku uživatele k softwaru AMPLILINK verze 2.4 pro analyzátor COBAS® AMPLICOR®, nebo jestliže používáte software AMPLILINK verze 3.2, přečtěte si Aplikační manuál k softwaru AMPLILINK verze 3.2 pro zařízení COBAS® AmpliPrep, analyzátor COBAS® TaqMan®, analyzátor COBAS® TaqMan® 48 a analyzátor COBAS® AMPLICOR®.

Poznámka

Všechna činidla musejí mít před použitím teplotu okolí. Před započetím testu se vizuálně přesvědčte, že je objem činidel dostatečný.

Poznámka

Vzorky plazmy musejí mít před použitím teplotu okolí. Kde je tak uvedeno, používejte pipetory s aerosolovou bariérou nebo se špičkami s pozitivním posuvem. Dávejte obzvláštní pozor, abyste zajistili selektivní amplifikaci.

Poznámka

Vzorek i kontrolní preparát se musí uchovávat ve zkumavkách se šroubovacím uzávěrem, aby nemohl vystříknout a aby nemohlo dojít ke vzájemné (křížové) kontaminaci vzorků. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte.

Poznámka

Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 by se měl spouštět pouze v základním režimu.

Množství pro jedno měření Každá souprava obsahuje dostatečné množství činidla na čtyři 12-testová měření, která mohou probíhat zvlášť nebo dvě 24-testová měření. Maximální počet vzorků na jedno testové měření je 24 (21 vzorků + 3 kontroly). Každé měření musí zahrnovat minimálně po jednom replikátu AMPLICOR® HIV-1 (–) Control, AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Low (+) Control a AMPLICOR® HIV-1 MONITOR High (+) Control (viz část „Kontrola jakosti“). Činidla pro přípravu vzorku a amplifikaci jsou balena v 12-testových lahvičkách na jedno použití. Pro co nejefektivnější využití je vhodné zpracovávat činidla, vzorky i kontroly v dávkách, jež jsou násobky 12.



17/52

Poznámka


Pracovní tok

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 se dá provést během jednoho nebo dvou dnů. Pokud se má test provést během jednoho pracovního dne, postupuje se podle pokynů v částech Příprava činidel a kontrol a Reverzní transkripce, amplifikace a detekce v tomto pořadí. Test lze také provést v průběhu 2 dnů. V takovém případě se první den provede Příprava vzorků a kontrol a příští den se pokračuje postupy Příprava činidel, Reverzní transkripce a Amplifikace a detekce. Chceme-li první den provést přípravu vzorků a kontrol a druhý den reverzní transkripci, amplifikaci a detekci, provedeme buď Přípravu vzorků a kontrol postupem Standard (kroky A.1 až A.14) nebo Přípravu vzorků a kontrol postupem UltraSensitive (kroky B.1 až B.19) a zpracované vzorky uskladníme podle bodu A.14 resp. B.19. Druhého dne začneme Přípravou činidel, potom zpracované vzorky a kontroly rozmrazíme na pokojovou teplotu a pokračujeme postupy Příprava vzorků a kontrol postupem Standard, krok A.15, resp. Příprava vzorků a kontrol postupem UltraSensitive, krok B.20, a dále Reverzní transkripce, Amplifikace a Detekce.

Příprava činidel

Provádí se: Předamplifikce – prostor pro přípravu činidel 1.

Stanovte potřebný počet A-kruhů pro testování pacientova vzorku a kontroly. Uložte A-kruh(y) do držáku(ů).

2.

Připravte pracovní Master Mix odměřením 100 µl HIV-1 Mn2+, v1.5 do jedné lékovky HIV-1 MMX, v1.5. Objem Master Mix není třeba měřit. Odměřte 100 µl HIV-1 Mn2+, v1.5 do celé lékovky HIV-1 MMX, v1.5. Zkumavku opět uzavřete a dobře promíchejte tak, že ji 10-15-krát obrátíte dnem vzhůru. Víření k promísení pracovního Master Mix nepoužívejte. Růžové barvivo v HIV-1 Mn2+, v1.5 slouží k vizuálnímu ověření, že byl HIV-1 Mn2+, v1.5 k Master Mix skutečně přidán. Zbývající HIV-1 Mn2+, v1.5 zlikvidujte Pracovní Master Mix se uchovává při teplotě 2-8°C a musí se spotřebovat do 4 hodin od přípravy.

3.

Do každé A-zkumavky odměřte 50 µl pracovního Master Mix za použití opakovacího pipetoru nebo pipetoru s aerosolovou bariérou nebo se špičkou s pozitivním posuvem. Tentokrát čepičky A-zkumavek nezavírejte. Nespotřebovaný pracovní Master Mix zlikvidujte.

4.

A-kruh(y) s pracovním Master Mix vložte do těsně uzavíratelného plastového vaku a vak bezpečně těsně uzavřete. Přemístěte A-kruh(y) do prostoru Předamplifikace – příprava vzorku a kontroly. Uložte A-kruh(y) obsahující pracovní Master Mix do prostoru Předamplifikace – příprava vzorku a kontroly – při teplotě 2-8°C do doby, než bude příprava vzorku a kontroly hotova. Pracovní Master Mix v A-zkumavkách zatavených v plastovém vaku je při teplotě 2-8°C stálý 4 hodiny.

Vzorek a kontrola Příprava

Provádí se v: Předamplifikace – prostor pro přípravu vzorku a kontroly

Poznámka

K amplifikaci zpracovaných vzorků a kontrol proveďte nejprve kroky uvedené v části „Příprava činidel“. Zpracované vzorky a kontroly rozmrazte na pokojovou teplotu a pokračujte „Přípravou vzorků a kontrol postupem Standard“, krok A.15, resp. „Přípravou vzorků a kontrol postupem UltraSensitive“, krok B.20.

18/52



HIV-1 MONITOR

Poznámka

V HIV-1 LYS se během uchovávání při teplotě 2-8°C vytváří sraženina. Před použitím kapalinu zahřejte na teplotu 25-37°C a důkladně promíchávejte, aby se veškerý vysrážený materiál rozpustil.

Poznámka

Před použitím si každou lahvičkou HIV-1 LYS prohlédněte proti bílému podkladu a sledujte, jestli nezpozorujete žluté zabarvení nebo známky netěsnosti. Pokud žlutou barvu nebo známky netěsnosti zjistíte, lahvičku k testování nepoužijte a vyžádejte si od místního zastoupení firmy Roche náhradu.

Příprava vzorků a kontrol postupem Standard A.1. Připravte si 70% ethanol. Na 12 testů smíchejte 11,0 ml 95% ethanolu se 4,0 ml deionizované nebo destilované vody. A.2. Označte po jedné 2,0 ml zkumavce se šroubovacím uzávěrem pro každý vzorek od pacienta a další tři zkumavky označte „HIV-1 (–)C“, „HIV-1 L(+)C“ a „HIV-1 H(+)C“. A.3. Připravte standardní pracovní Lysis Reagent. Před použitím HIV-1 QS, v1.5 vířením minimálně 10 sekund promíchávejte. Na každou dávku až 12 vzorků a kontrol odměřte do jedné lahvičky HIV-1 LYS objem 100 µl HIV-1 QS, v1.5. Objem HIV-1 LYS není třeba odměřit. Růžové barvivo v HIV-1 QS, v1.5 slouží k vizuální kontrole, že byl HIV-1 QS, v1.5 k HIV-1 LYS přidán Nespotřebovaný HIV-1 QS, v1.5 zlikvidujte. Standardní pracovní Lysis Reagent je při pokojové teplotě stálý 4 hodiny. Poznámka

Používáte-li vzorky zmrazené, rozmrazte je při pokojové teplotě a vířením po dobu 3-5 sekund je promíchejte. Zkumavkou se vzorkem zakružte, abyste sebrali vzorek i ze dna zkumavky. Dejte pozor, abyste si při manipulaci se vzorky nezkontaminovali rukavice. A.4. Do každé označené zkumavky odměřte 600 µl pracovního Lysis Reagent a zkumavky uzavřete. Přesvědčte se, že je pracovní Lysis Reagent růžový, tedy že HIV-1 QS, v1.5 byl k HIV-1 LYS přidán. A.5. Kontroly si připravte tímto způsobem: –

NHP, HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C vířením po dobu 3-5 sekund promíchejte.

–

Do každé ze tří kontrolních zkumavek odměřte po 200 µl NHP. Zkumavky uzavřete a nechte 3-5 sekund vířit.

–

Do zkumavky označené „HIV-1 (–) C“, obsahující standardní pracovní Lysis Reagent a NHP, odměřte 50 µl HIV-1 (–) C. Zkumavku uzavřete a nechte 3-5 sekund vířit.

–

Do zkumavky označené „HIV-1 L(+)C“, obsahující standardní pracovní Lysis Reagent a NHP, odměřte 50 µl HIV-1 L(+)C. Zkumavku uzavřete a nechte 3-5 sekund vířit.

–

Do zkumavky označené „HIV-1 H(+)C“, obsahující standardní pracovní Lysis Reagent a NHP, odměřte 50 µl HIV-1 H(+)C. Zkumavku uzavřete a nechte 3–5 sekund vířit.

A.6. Do patřičně označených zkumavek obsahujících standardní pracovní Lysis Reagent přidejte po 200 µl jednotlivých vzorků od pacientů. Zkumavky uzavřete a nechte 3-5 sekund vířit. A.7. Zkumavky se vzorky a kontrolami inkubujte při pokojové teplotě po dobu 10 minut.



19/52

A.8. Z každé zkumavky se vzorkem resp. kontrolou sejměte uzávěr, přidejte 800 µl 100% izopropylalkoholu (o pokojové teplotě), zkumavku opět uzavřete a intenzivním vířením 3-5 sekund míchejte. Najednou mějte otevřenu jenom jednu zkumavku. A.9. Na zkumavkách si udělejte orientační značky a vložte zkumavky do mikrocentrifugy orientační značkou ven, takže se pelety podle nich srovnají. Vzorky a kontroly odstřeďujte při pokojové teplotě po dobu 15 minut maximální rychlostí (12 500-16 000 x g). A.10. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant; při tom dávejte pozor, abyste neporušili peletu (nemusí být vidět!). Odstraňte tolik kapaliny, kolik je bez porušení pelety možné. Supernatant odebírejte pomalu, tak aby mohla kapalina ze stěn zkumavky kompletně stéci. Vakuové odsávání nepoužívejte. A.11. Do každé zkumavky odměřte 1,0 ml 70% ethanolu (o pokojové teplotě), zkumavky opět uzavřete a vířením po dobu 3-5 sekund promíchejte. A.12. Vložte zkumavky do mikrocentrifugy orientačními značkami ven a centrifugujte při pokojové teplotě po dobu 5 minut maximální rychlostí (12 500 -16 000 x g). A.13. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant, aniž byste přitom porušili peletu; ta by měla být v tomto kroku dobře vidět. Supernatantu odstraňte co nejvíce. Zbytkový ethanol může amplifikaci inhibovat. A.14. Do každé zkumavky odměřte 400 µl HIV-1 DIL a zkumavku opět uzavřete. Intenzivním vířením po dobu 10 sekund důkladně promíchejte, aby se extrahovaná RNA resuspendovala. Může zbýt určité množství nerozpustné hmoty. Zpracované vzorky a kontroly amplifikujte do 2 hodin od přípravy. Pokud s amplifikací nelze do 2 hodin od přípravy začít, je možno vzorky uložit ve zmrazeném stavu při teplotě –20°C nebo nižší na dobu až jednoho týdne, přičemž zmrazit a rozmrazit se smějí jenom jednou. Kdyby se zmrazil a rozmrazil víckrát, mělo by to za následek úbytek počtu kopií. Poznámka

Pokud byly zpracované vzorky a kontroly uchovávány před amplifikací ve zmrazeném stavu, rozmrazte je za pokojové teploty a před postoupením k bodu 15 je dejte na dobu 5 sekund vířit. A.15. Z každého zpracovaného vzorku od pacienta a kontroly odměřte 50 µl do příslušné A-zkumavky obsahující pracovní Master Mix; použijte k tomu pipetor s aerosolovou bariérou nebo se špičkou s pozitivním posuvem. Pro každý vzorek a kontrolu použijte novou špičku. Dejte pozor, abyste nepřenesli žádnou vysráženou látku, která se nemusela nepřevést zpět do roztoku. A-zkumavky uzavřete. A.16. Zaznamenejte pozice kontrol a vzorků v A-kruhu (kruzích). S amplifikací je třeba začít do 45 minut okamžiku, kdy byly zpracované vzorky a kontroly odměřeny do A-zkumavek obsahujících pracovní Master Mix. Připravené vzorky a kontroly v A-kruzích přemístěte do prostoru Amplifikace/detekce. Nespotřebovaný zpracovaný vzorek je možno na dobu jednoho týdne uložit ve zmrazeném stavu při teplotě –20°C nebo nižší, přičemž zmrazit a rozmrazit se smí jenom jednou. Kdyby se zmrazil a rozmrazil víckrát, mělo by to za následek úbytek počtu kopií.

Příprava vzorků a kontrol postupem UltraSensitive B1.

20/52

Ultracentrifugu a rotor předem podle návodu k ultracentrifuze ochlaďte na teplotu 2-8°C.



HIV-1 MONITOR

Poznámka

B2.

Připravte si 70% ethanol. Na 12 testů smíchejte 11,0 ml 95% ethanolu se 4,0 ml deionizované nebo destilované vody.

B3.

Označte po jedné 1,5 ml zkumavce se šroubovacím uzávěrem pro každý vzorek od pacienta a další tři zkumavky označte „HIV-1 (–) C“, „HIV-1 L(+)C“ a „HIV-1 H(+)C“.

B4.

Připravte pracovní UltraSensitive Lysis Reagent. Před použitím HIV-1 QS, v1.5 vířením minimálně 10 sekund promíchávejte. Na každou dávku až 12 vzorků a kontrol odměřte do jedné lahvičky HIV-1 LYS objem 25 µl HIV-1 QS, v1.5. Objem HIV-1 LYS není třeba odměřit. Růžové barvivo v HIV-1 QS, v1.5 slouží k vizuální kontrole, že byl HIV-1 QS, v1.5 k HIV-1 LYS přidán Nespotřebovaný HIV-1 QS, v1.5 zlikvidujte. Pracovní UltraSensitive Lysis Reagent je při pokojové teplotě stálý 4 hodiny.

Používáte-li vzorky zmrazené, rozmrazte je při pokojové teplotě a vířením po dobu 3-5 sekund je promíchejte. Zkumavkou se vzorkem zakružte, abyste sebrali vzorek i ze dna zkumavky. Dejte pozor, abyste si při manipulaci se vzorky nezkontaminovali rukavice. B5.

Do patřičně označených zkumavek přidejte po 500 µl jednotlivých vzorků od pacientů.

B6.

Do jednotlivých patřičně označených zkumavek odměřte po 500 µl NHP.

B7.

Na zkumavkách si udělejte orientační značky a vložte zkumavky do ultracentrifugy orientační značkou ven, takže se pelety podle nich srovnají. Vzorky a kontroly odstřeďujte při teplotě 2-8°C po dobu 60 minut rychlostí 23 600 x g.

B.8. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant; přitom dávejte pozor, abyste neporušili peletu (nemusí být vidět!). Odstraňte tolik kapaliny, kolik je bez porušení pelety možné. Supernatant odebírejte pomalu, tak aby mohla kapalina ze stěn zkumavky kompletně stéci. Vakuové odsávání nepoužívejte. Poznámka

Virové pelety získané v rámci kroku B.8 přípravy vzorku postupem UltraSensitive jsou při pokojové teplotě stálé 6 hodin a při teplotě –20°C nebo nižší minimálně 14 dnů. B9.

Do každé označené zkumavky odměřte 600 µl pracovního Lysis Reagent a zkumavky uzavřete. Přesvědčte se, že je pracovní Lysis Reagent růžový, tedy že HIV-1 QS, v1.5 byl k HIV-1 LYS přidán. Zkumavku vířením po dobu 3-5 sekund promíchejte, aby se peleta resuspendovala.

B10. Připravte si ultracitlivé kontroly tímto způsobem: –

HIV-1 (–) C, HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C vířením po dobu 3-5 sekund promíchejte.

–

Do zkumavky označené „HIV-1 (–) C“, obsahující pracovní UltraSensitive Lysis Reagent, odměřte 12,5 µl HIV-1 (–) C. Zkumavku uzavřete a nechte 3-5 sekund vířit.

–

Do zkumavky označené „HIV-1 L(+)C“, obsahující pracovní UltraSensitive Lysis Reagent odměřte 12,5 µl HIV-1 L(+)C. Zkumavku uzavřete a nechte 3-5 sekund vířit.

–

Do zkumavky označené „HIV-1 H(+)C“, obsahující pracovní UltraSensitive Lysis Reagent odměřte 12,5 µl HIV-1 H(+)C. Zkumavku uzavřete a nechte 3-5 sekund vířit.

B11. Zkumavky se vzorky a kontrolami nechte při pokojové teplotě po dobu 10 minut inkubovat.



21/52

B12. Ze zkumavek se vzorky a kontrolami sejměte uzávěr, přidejte po 600 µl 100% izopropylalkoholu (o pokojové teplotě), zkumavky opět uzavřete a intenzivním vířením po dobu 3-5 sekund důkladně promíchejte. Najednou mějte otevřenu jenom jednu zkumavku. B13. Na zkumavkách si udělejte orientační značky a vložte zkumavky do mikrocentrifugy orientační značkou ven, takže se pelety podle nich srovnají. Vzorky a kontroly odstřeďujte při pokojové teplotě po dobu 15 minut maximální rychlostí (12 500-16 000 x g). B14. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant; přitom dávejte pozor, abyste neporušili peletu (nemusí být vidět!). Odstraňte tolik kapaliny, kolik je bez porušení pelety možné. Supernatant odebírejte pomalu, tak aby mohla kapalina ze stěn zkumavky kompletně stéci. Vakuové odsávání nepoužívejte. B15. Do každé zkumavky odměřte 1,0 ml 70% ethanolu (o pokojové teplotě), zkumavky opět uzavřete a vířením po dobu 3-5 sekund promíchejte. B16. Vložte zkumavky do mikrocentrifugy orientačními značkami ven a odstřeďujte při pokojové teplotě po dobu 5 minut maximální rychlostí (12 500-16 000 x g). B17. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant, aniž byste přitom porušili peletu; ta by měla být v tomto kroku dobře vidět. Supernatantu odstraňte co nejvíce. Zbytkový ethanol může amplifikaci inhibovat. B18. Krok B.17 opakujte, abyste odstranili co nejvíce zbylého supernatantu. Zbytkový ethanol může amplifikaci inhibovat. B19. Do každé zkumavky odměřte 100 µl HIV-1 DIL a zkumavku opět uzavřete. Intenzivním vířením po dobu 10 sekund důkladně promíchejte, aby se extrahovaná RNA resuspendovala. Může zbýt určité množství nerozpustné hmoty. Zpracované vzorky a kontroly amplifikujte do 2 hodin od přípravy. Pokud s amplifikací nelze do 2 hodin od přípravy začít, je možno vzorky uložit ve zmrazeném stavu při teplotě –20°C nebo nižší na dobu až jednoho týdne, přičemž zmrazit a rozmrazit se smějí jenom jednou. Kdyby se zmrazil a rozmrazil víckrát, mělo by to za následek úbytek počtu kopií. Poznámka

Pokud byly zpracované vzorky a kontroly uchovávány před amplifikací ve zmrazeném stavu, rozmrazte je za pokojové teploty a před postoupením k bodu B.20 je dejte na dobu 5 sekund vířit. B20. Z každého zpracovaného vzorku od pacienta a kontroly odměřte 50 µl do příslušné A-zkumavky obsahující pracovní Master Mix; použijte k tomu pipetor s aerosolovou bariérou nebo se špičkou s pozitivním posuvem. Pro každý vzorek a kontrolu použijte novou špičku. Dejte pozor, abyste nepřenesli žádnou vysráženou látku, která se nemusela nepřevést zpět do roztoku. A-zkumavky uzavřete. B21. Zaznamenejte pozice kontrol a vzorků v A-kruhu (kruzích). S amplifikací je třeba začít do 45 minut okamžiku, kdy byly zpracované vzorky a kontroly odměřeny do A-zkumavek obsahujících pracovní Master Mix. Připravené vzorky a kontroly v A-kruzích přemístěte do prostoru Amplifikace/detekce. Nespotřebovaný zpracovaný vzorek je možno na dobu jednoho týdne uložit ve zmrazeném stavu při teplotě –20°C nebo nižší, přičemž zmrazit a rozmrazit se smí jenom jednou. Kdyby se zmrazil a rozmrazil víckrát, mělo by to za následek úbytek počtu kopií.

22/52



HIV-1 MONITOR

Reverzní transkripce, amplifikace a detekce

Provádí se v: Poamplifikace – prostor amplifikace/detekce Provádějte denní údržbu zařízení, včetně: – – – –

– – – –

Otřete inicializační podstavec vlhkým hadříkem nepouštějícím vlas a osušte Otřete špičku zařízení pro manipulaci s D-kelímky vlhkým hadříkem nepouštějícím vlas a osušte Zkontrolujte rezervoár s promývacím kufrem a v případě potřeby doplňte Pracovní promývací pufr (1X) připravíte následujícím postupem. Před zředěním WB prohlédněte a zpozorujete-li sraženinu, kapalinu zahřejte na 30-37°C, aby se sraženina rozpustila. Přidejte 1 objem WB k 9 objemům destilované nebo deionizované vody. Dobře promíchejte. V rezervoáru promývacího pufru (1X) by měly být pufru vždy minimálně 3-4 litry. Vyprázdněte odpadní nádobu Analyzátor COBAS® AMPLICOR® naprimujte Během primingu zkontrolujte stříkačky a trubičky Během primingu zkontrolujte transferové špičky

Před každým měřením: – – – –

Zkontrolujte odpadní nádobu a případně ji vyprázdněte Zkontrolujte rezervoár na promývací pufr a případně pufr doplňte Vyměňte stojany s použitými D-kelímky Analyzátor COBAS® AMPLICOR® naprimujte

Plnění a provoz analyzátoru COBAS® AMPLICOR®


1.

Zkontrolujte v přístroji COBAS® AMPLICOR® Analyzer množství činidel. Připravte si dostatek kazet, abyste s nimi vystačili.

2.

IM PS1, v1.5 vířením důkladně promíchejte. Do jedné kazety s IM4, v1.5 odměřte 2,5 ml IM PS1, v1.5. a kazetu uložte do příslušného stojanu, specifického pro daný test. Použitou lékovku od IM PS1, v1.5 zlikvidujte. Na kazetě s IM4, v1.5 vyznačte datum přípravy činidla.

3.

IQ PS1, v1.5 vířením důkladně promíchejte. Do jedné kazety s IQ4, v1.5 odměřte 2,5 ml IQ PS1, v1.5. Kazetu uložte do příslušného stojanu, specifického pro daný test. Použitou lékovku od IQ PS1, v1.5 zlikvidujte. Na kazetě s IQ4, v1.5 vyznačte datum přípravy činidla.

4.

Připravte pracovní substrát tak, že do jedné kazety s SB3 odpipetujete 5 ml SB. K promísení pipetujte nahoru a dolů. Prázdnou lékovku od SB zlikvidujte. Na kazetě s SB3 vyznačte datum přípravy.

5.

Pracovní substrát uložte do příslušného (generického) stojanu.

6.

Kazetu s AD3 uložte do příslušného stojanu. Na kazetě s AD3 vyznačte datum přípravy.

7.

Kazety s DN4 a CN4 uložte do příslušných (generických) stojanů. Na kazetách vyznačte datum, kdy byly otevřeny.

8.

Identifikujte stojany s činidly jako obecné nebo testové pomocí tlačítek, skeneru čárových kódů nebo pomocí software AMPLILINK.

9.

Nakonfigurujte stojany s činidly tak, že pomocí tlačítek, skeneru čárových kódů nebo pomocí software AMPLILINK vložíte pozice činidel a čísla šarží do analyzátoru COBAS® AMPLICOR®.


23/52

10. Vložte stojany s činidly do analyzátoru COBAS® AMPLICOR® pomocí tlačítek, skeneru čárových kódů nebo pomocí software AMPLILINK. Dbejte, aby byla každá kazeta s činidlem ve své přiřazené pozici a aby ve stojanu těsně seděla. 11. Stojan na D-kelímky uložte na plošinu pro D-kelímky. Pro každý vzorek a kontrolu je zapotřebí šest D-kelímků, dalších dvou D-kelímků je třeba pro jednotlivé kazety pracovního substrátu k provedení slepého pokusu za použití analyzátoru COBAS® AMPLICOR®. 12. A-kruh(y) uložte do segmentu(ů) tepelného cyklizátoru přístroje COBAS® AMPLICOR® Analyzer. 13. Vložte A-kruhy do analyzátoru COBAS® AMPLICOR® pomocí tlačítek, skeneru čárových kódů nebo pomocí software AMPLILINK. 14. Vytvořte pracovní seznam A-kruhu. Poznámka

Nyní vložte do přístroje COBAS® AMPLICOR® Analyzer počet kopií kvantifikačního standardu, který je specifický pro danou šarži, a rozmezí Low (+) a High (+) Control uvedená na „Data Cards“ k soupravě COBAS® AMPLICOR® HIV-1 Test, v1.5. Příslušná rozmezí kontroly vložte podle toho, který postup přípravy vzorku jste použili, zda Standard nebo UltraSensitive. Tato rozmezí se do přístroje COBAS® AMPLICOR® Analyzer vkládají pomocí klávesnice, snímače čárových kódů nebo software AMPLILINK během nastavení pracovního seznamu A-kruhů. 15. Kryt segmentu(ů) tepelného cyklizátoru těsně uzavřete. 16. Spusťte analyzátor COBAS® AMPLICOR®. 17. Vyčkejte, dokud analyzátor COBAS® AMPLICOR® neohlásí, že kontrola vložení proběhla úspěšně.

Poznámka

V každé A-zkumavce umožňuje přístroj COBAS® AMPLICOR® Analyzer provést 2 samostatná kvantitativní stanovení. COBAS® AMPLICOR® Analyzer si sám vypočítá potřebná množství jednotlivých činidel a na počátku každého měření zkontroluje, jestli jich má pro požadovaný test dostatek. 18. Reverzní transkripci, amplifikaci a detekci provádí přístroj COBAS® AMPLICOR® Analyzer automaticky. Výsledky jsou udány v počtu HIV-1 RNA kopií/ml.

Poznámka

24/52




HIV-1 MONITOR

Výsledky Výpočet výsledku

Poznámka

U každého vzorku a kontroly COBAS® AMPLICOR® Analyzer provede automaticky tyto činnosti: •

Vybere všechna zředění amplikonu HIV-1 a kvantifikačního standardu, jejichž absorbance spadají do lineárního rozmezí pro daný test (A660 = 0,15-2,0). Má-li být výsledek počítán, musí do tohoto lineárního rozmezí spadat minimálně jedno zředění HIV-1 a jedno zředění amplikonu kvantifikačního standardu.

•

U všech vybraných hodnot absorbance provede korekci na pozadí.

•

Zkontroluje, jestli je hodnota A660 HIV-1 QS přijatelná, tedy jestli zpracování vzorku, reverzní transkripce, amplifikace a detekce proběhly správně.

•

Zkontroluje, že všechna zředění HIV-1 (–)C poskytují hodnoty A660 ≤ 0,099.

•

U všech vybraných zředění stanoví A660 celkového HIV-1 a kvantifikačního standardu a pomocí maximální celkové hodnoty A660 vypočítá počet kopií HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C a jednotlivých vzorků.

•

Zkontroluje, zda vypočtený počet kopií HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C spadá do vymezeného rozmezí.

•

Vygeneruje tisk hodnot A660 pro všechna zředění HIV-1 a kvantifikačního standardu a vypočtených hodnot počtu kopií (kopií HIV-1 RNA/ml) pro všechny vzorky i kontroly. Počet kopií je na tisku výsledků vyznačen pod identifikací vzorku ve vědecké notaci.

Podle uživatelovy volby mohou být výsledky testu manuálně přepočteny z hodnot počtu kopií/ml na mezinárodní jednotky (International Units, tedy naIU/ml). Z jedné kolaborativní studie vyplynul přepočítávací faktor pro 1. mezinárodní jednotku a HIV-1RNA ve výši 0,51 kopií HIV-1 RNA na jednu mezinárodní jednotku (IU).36

Validace měření


Projděte si, co přístroj vytiskl, a na příznacích a poznámkách si ověřte, že je měření platné. Měření platné není, pokud se u HIV-1 MONITOR Controls objeví některý z následujících příznaků (flags) nebo poznámek.


25/52

Příznak _Q_ _N_ _H_ _L_

Poznámka QS_INVALID NC_INVALID HPC_INVALID LPC_INVALID OD_SEQUENCE

QS_SEQUENCE

TARGETOD_HI

TARGETOD_LO

TARG_RANGE

•

Kontrola dat

Interpretace Hodnota A660 HIV-1 QS u všech kontroly nad nebo pod přijatelným rozmezím. Hodnota A660 HIV-1 (–) C nad přijatelným rozmezím (> 0,099). Počet kopií HIV-1 H(+)C nad nebo pod přiřazeným rozmezím. Počet kopií HIV-1 L(+)C nad nebo pod přiřazeným rozmezím. Indikuje hodnotu A660 terče mimo sekvenci. Výsledky nebudou vypočítávány. Celý test opakujte, včetně přípravy vzorku a kontroly, amplifikace a detekce. Indikuje hodnotu A660 kvantifikačního standardu mimo sekvenci. Výsledky nebudou vypočítávány. Celý test opakujte, včetně přípravy vzorku a kontroly, amplifikace a detekce. Všechny cílové OD se nacházejí nad nejvyšší hodnotou stanoveného pásma. Pokud se tento příznak objeví i v případě nízce anebo vysoce pozitivního kontrolního vzorku, analyzátor COBAS® AMPLICOR® nevypočítá titr. V případě absence vypočítaného titru je výsledek příslušného kontrolního vzorku a celý testovací cyklus neplatný. Všechny cílové OD se nacházejí pod nejvyšší hodnotou stanoveného pásma. Pokud se tento příznak objeví i v případě nízce anebo vysoce pozitivního kontrolního vzorku, analyzátor COBAS® AMPLICOR® nevypočítá titr. V případě absence vypočítaného titru je výsledek příslušného kontrolního vzorku a celý testovací cyklus neplatný. Nejméně jedna cílová OD se nachází pod a jedna OD nad stanovenou hodnotou hraničního rozsahu, avšak ani jedna se nenachází v rámci stanoveného rozsahu. Pokud se tento příznak objeví i v případě nízce anebo vysoce pozitivního kontrolního vzorku, analyzátor COBAS® AMPLICOR® nevypočítá titr. V případě absence vypočítaného titru je výsledek příslušného kontrolního vzorku a celý testovací cyklus neplatný. Pokud je měření neplatné, je třeba celý test, tj. včetně přípravy vzorků a kontrol, reverzní transkripce, amplifikace a detekce, zopakovat.

Přístroj COBAS® AMPLICOR® Analyzer tiskne hodnoty A660 a počet kopií pro každý vzorek a kontrolu. Hodnoty A660 při sériovém ředění terčového amplikonu a amplikonu kvantifikačního standardu mají s rostoucím faktorem zředění vykazovat klesající trend hodnot A660, s výjimkou zředění, kde hodnoty A660 překračují lineární rozmezí testu (vzorky o vysokém titru) nebo se naopak blíží A660 pozadí (vzorky o nízkém titru). Zředění amplikonu HIV-1 U HIV-1 představují zředění č. 1, 2, 3 a 4 po řadě neředěný amplikon a amplikon HIV-1 zředěný v poměru 1:9, 1:81 a 1:729. Absorbance mají v této řadě klesat s tím, že nejvyšší hodnotu A660 vykazuje u každého vzorku nebo kontroly první zředění (zředění č. 1) a nejnižší hodnotu A660 vykazuje zředění poslední (zředění č. 4). Pokud hodnoty A660 pro HIV-1 toto pořadí nesledují, zobrazí se u daného vzorku nebo kontroly chybové hlášení OD_SEQUENCE. Zředění amplikonu kvantifikačního standardu HIV-1 U kvantifikačního standardu HIV-1 představuje zředění č. 1 čistý amplikon a zředění č. 2 amplikon zředěný v poměru 1:9. Pokud je hodnota A660 při zředění č. 2 vyšší než při zředění č. 1, došlo k chybě a zobrazí se chybové hlášení QS_SEQUENCE. Výsledek pro daný vzorek nebo kontrolu je neplatný a celý test pro daný vzorek či kontrolu, tj. včetně zpracování vzorku, amplifikace a detekce, je třeba zopakovat.

26/52



HIV-1 MONITOR

Interpretace výsledků ležících mimo řadu hodnot A660 •

Hodnoty A660 pro sérii zředění amplikonu HIV-1 mají s rostoucím faktorem zředění vykazovat klesající trend hodnot A660, s výjimkou zředění nasycených a zředění blížících se pozadí hodnot A660.

•

V reakcích s vysokým počtem kopií HIV-1 RNA v jednom ml mohou být zředění č. 1, 2 a 3 nasycená, což vede ke sníženým hodnotám A660 (viz Tab. 1, příklad č. 1). Tyto výsledky jsou platné i tehdy, nevykazují-li hodnoty A660 v řadě zředění HIV-1 od č. 1 do č. 4 klesající trend.

•

V reakcích s nízkým počtem kopií HIV-1 RNA v jednom ml mohou zředění č. 2, č. 3 a č. 4 vést k hodnotám A660 blížícím se pozadí (viz Tab. 1, příklad č. 2). Tyto výsledky jsou platné i tehdy, nevykazují-li hodnoty A660 v řadě zředění HIV-1 od č. 1 do č. 4 klesající trend.

•

Klesající trend s rostoucím zředěním v řadě od č. 1 do č. 4 se musí projevovat u hodnot A660 ležící v rozmezí 0,15-2,0. Pokud hodnoty A660 ležící v rozmezí 0,15-2,0 klesající trend s rostoucím zředěním v řadě od č. 1 do č. 4 nevykazují, pak došlo k chybě (viz Tab. 1, příklady č. 3, 4 a 5). Výsledky pro daný vzorek nebo kontrolu jsou neplatné a celý test pro daný vzorek či kontrolu, tj. včetně zpracování vzorku, amplifikace a detekce, je třeba zopakovat.

Tabulka 1 Příklady výsledků, kde se hodnoty A660 vymykají sérii

*

Příklad č. 1

1:1 2,578

Terčové A660 (Faktor zředění) 1:9 1:81 3,603 3,201

QS A660 (Faktor zředění) 1:1 1:9 2,618 *0,397

1:729 *0,700

Příklad č. 2

*0,216

0,004

0,016

0,007

3,236

*0,743

PLATNÉ: Vzorek o nízkém titru A660 na úrovni detekce nebo poblíž.

Příklad č. 3

0,002

0,007

0,004

0,339

4,218

*0,883

NEPLATNÉ: Zobrazí se hlášení OD_SEQUENCE.

Příklad č. 4

3,052

1,597

3,384

2,887

1,357

*0,158


Příklad č. 5

0,016

0,267

0,007

0,004

3,612

*0,793


Interpretace výsledků PLATNÉ: Vzorek o vysokém titru A660 nad lineárním rozmezím absorbací.

Označí hodnotu A660 vybranou přístrojem COBAS® AMPLICOR® Analyzer pro výpočet výsledku, jak je ukázáno na tisku. U vzorků, kde hodnoty A660 nedodržují trend, výsledky vypočítávány nejsou.

Interpretace výsledků

V případně platného měření zkontrolujte, zda v tisku výsledků nejsou u některého vzorku uvedeny nějaké příznaky nebo poznámky. Výsledky se interpretují takto:

Poznámka

Přístroj COBAS® AMPLICOR® Analyzer je naprogramován tak, aby nejběžnější chyby a nesoulady výsledků označil příznaky. Nicméně doporučujeme, abyste v rámci běžného laboratorního hodnocení dat hodnoty A660 kontrolovali a zajistili tak maximální integritu výsledků.



27/52

28/52

•

V případě vzorků, u kterých žádné příznaky ani poznámky nejsou, nahlaste výsledky tak, jak jsou přístrojem vytištěny.

•

Platné měření může zahrnovat platné i neplatné výsledky vzorků podle toho, zda se u jednotlivých vzorků objeví příznaky resp. poznámky nebo ne.

•

Vzorky s příznaky resp. poznámkami se interpretují takto:

Příznak

Poznámka

Interpretace

_Q_

QS_INVALID

Bez ředění QS s hodnotou A660 ležící uvnitř lineárního rozmezí pro daný test. Výsledek pro tento vzorek je neplatný. Vzorky s neplatnými výsledky je třeba otestovat znovu zopakováním přípravy vzorku a kontroly, reverzní transkripce, amplifikace a detekce.

TARGETOD_LO

Hodnoty A660 pro všechna ředění HIV-1 pod lineárním rozmezím pro daný test. Výsledky nahlaste jako „HIV-1 RNA nedetekována (méně než 400 HIV-1 RNA kopií/ml)“ nebo „HIV-1 RNA nedetekována (méně že 50 kopií/ml)“ podle toho, zda se použilo postupu přípravy vzorku Standard nebo UltraSensitive.

TARGETOD_HI

Hodnoty A660 pro všechna ředění HIV-1 pod lineárním rozmezím pro daný test. Výsledek nahlaste jako „Nestanoveno“. Pokud byl použit postup přípravy vzorku Standard, původní vzorek zřeďte HIV-negativní lidskou plazmou a test zopakujte za použití postupu přípravy vzorku Standard. Zjištěný výsledek vynásobte faktorem zředění. Pokud byl použit postup přípravy vzorku UltraSensitive, zopakujte test s původním vzorkem za použití postupu přípravy vzorku zopakujte za použití postupu přípravy vzorku Standard.

RESULT_LO

Vypočtená hodnota kopií/ml leží nad lineárním rozmezím testu. V případě postupu přípravy vzorku Standard nahlaste výsledky jako „HIV-1 RNA detekována, méně než 400 HIV-1 RNA kopií/ml”. Jsou-li požadovány kvantitativní výsledky, je třeba původní vzorek plazmy otestovat znovu za použití postupu přípravy vzorku Standard. V případě postupu přípravy vzorku UltraSensitive nahlaste výsledky jako „HIV-1 RNA detekována, méně než 50 HIV-1 RNA kopií/ml“.

RESULT_HI

Vypočtená hodnota kopií/ml leží nad lineárním rozmezím testu. V případě postupu přípravy vzorku Standard nahlaste výsledky jako „více než 7,5 x 105 HIV-1 RNA kopií/ml.“ Jsou-li požadovány kvantitativní výsledky, je třeba původní vzorek zředit HIV-1- negativní lidskou plazmou a test zopakovat. Nahlášený výsledek vynásobte faktorem zředění. V případě postupu přípravy vzorku UltraSensitive nahlaste výsledky jako „více než 1,0 x 105 HIV-1 RNA kopií/ml“. Pokud jsou požadovány kvantitativní výsledky, je možno test s původním vzorkem zopakovat za použití postupu přípravy vzorku Standard.

TARG_RANGE

Všechny hodnoty A660 terče leží mimo lineární rozmezí daného testu. Výsledek nahlaste jako „Nestanoveno“. Test s původním vzorkem zopakujte včetně přípravy vzorku, reverzní transkripce, amplifikace a detekce.

OD_SEQUENCE

Indikuje hodnotu A660 terče mimo sekvenci. Výsledky nebudou vypočítávány. Celý test zopakujte, včetně přípravy vzorku a kontroly, amplifikace a detekce.

QS_SEQUENCE

Indikuje hodnotu A660 kvantifikačního standardu imo sekvenci. Výsledky nebudou vypočítávány. Celý test zopakujte, včetně přípravy vzorku a kontroly, amplifikace a detekce.



HIV-1 MONITOR

Kontrola kvality Při každém měření musí být minimálně po jednom replikátu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (–) Control, AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Low (+) Control a AMPLICOR® HIV-1 MONITOR High (+) Control. Jak je tomu při každém novém laboratorním postupu, noví pracovníci obsluhy by měli zvážit, jestli by nebylo dobře při každém testování použít ještě další kontroly až doby, než dokáží test provádět s vysokou jistotou správně. Na pozice kontrol v A-kruhu/kruzích nejsou kladeny žádné požadavky. Projděte si, co přístroj vytiskl, a na příznacích a poznámkách si ověřte, že je měření platné. Negativní kontrola

HIV-1 (–) Control má poskytnout výsledek „HIV-1 RNA Not Detected“, což znamená, že všechny hodnoty HIV-1 A660 ≤ 0,099. Jestliže HIV-1 (–) Control toto kritérium nesplňuje, je celé měření neplatné; je pak třeba celý postup, tj. přípravu vzorků a kontrol, reverzní transkripci, amplifikaci a detekci, zopakovat. Jestliže je takto absorbance HIV-1 (–) Control soustavně vyšší než 0,099, spojte se s místním zastoupením firmy Roche a vyžádejte si technickou pomoc.

Pozitivní kontrola

Přiřazené rozmezí pro AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Low (+) a High (+) Controls je specifické pro danou šarži kontroly podle toho, zda byla použita metoda přípravy vzorku Standard nebo UltraSensitive, a je uvedeno na COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Data Card dodané v rámci soupravy. Tato rozmezí se do přístroje COBAS® AMPLICOR® Analyzer vkládají pomocí klávesnice, snímače čárových kódů nebo software AMPLILINK během sestavování pracovního seznamu pro A-kruh(y). Počet kopií HIV-1 RNA v jednom mililitru by měl jak pro HIV-1 MONITOR Low (+) Control, tak pro HIV-1 MONITOR High (+) Control ležet v rozmezí uvedeném na COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Data Card. Pokud tomu tak u některé z HIV-1 MONITOR (+) Controls není, je celé měření neplatné a je třeba celý postup, tj. včetně přípravy vzorků a kontrol, reverzní transkripce, amplifikace a detekce, zopakovat. Jestliže leží počet kopií HIV-1 RNA v jednom ml u jedné nebo obou HIV-1 MONITOR (+) Controls mimo přiřazené rozmezí soustavně, obraťte se o technickou pomoc na místní zastoupení firmy Roche.

Nač je třeba při postupu dbát Pracovní tok musí v laboratoři probíhat jednosměrně, od předamplifikačního prostoru směrem k poamplifikačnímu prostoru (amplifikace/detekce). Předamplifikační činnosti začínají přípravou činidel a postupují k přípravě vzorků. Látky a vybavení se musí přiřadit jednotlivým předamplifikačním činnostem a nesmějí se používat k jiným činnostem, ani přenášet mezi jednotlivými vyhrazenými prostory. Ve všech prostorech je třeba nosit rukavice, které se před opuštěním prostoru vymění. Vybavení a materiály pro přípravu činidla se nesmějí používat k přípravě vzorků, ani pro pipetování nebo zpracování amplifikované DNA či jiných zdrojů terčové DNA. Poamplifikační materiály a vybavení musí vždy zůstat v poamplifikačním prostoru. Jak je tomu při každém testovacím postupu, je pro správné fungování tohoto testu věcí zásadním požadavkem dodržovat principy správné laboratorní praxe. Vzhledem k vysoké analytické citlivosti testu je třeba věnovat mimořádnou péči tomu, aby se zachovala čistota reagencií soupravy a amplifikačních směsí. U všech činidel je třeba čistotu bedlivě sledovat. Jakmile je podezření na znečištění, je třeba činidlo zlikvidovat.



29/52

Omezení Tento test se používá pouze s lidskou plazmou odebranou v antikoagulantech ACD nebo EDTA. Pokud by byly testovány jiné typů vzorků, mohly by být výsledky falešně negativní nebo falešně pozitivní. Heparin inhibuje PCR, a proto se vzorky s heparinem jako antikoagulantem při testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 používat nesmějí. COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 je optimalizován pro HIV1 skupiny M, subtypy A-H. Jak by se COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 choval v případě HIV-1 skupiny O a HIV-2, není známo; proto se test ke klinickému hodnocení pacientů infikovaných virem HIV-2 nebo HIV-1 skupiny O používat nesmí. K tomu, aby byly výsledky spolehlivé, musejí být dodržovány správné postupy odběru vzorků, jejich přepravy, skladování a zpracování. Přítomností AmpErase v AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Master Mix, v1.5 se snižuje nebezpečí kontaminace amplikonu. Kontaminaci od HIV-1-pozitivních kontrol a klinických vzorků lze ovšem zabránit pouze důsledným uplatňováním zásad správné klinické praxe a pečlivým dodržováním postupů uvedených v této metodické příručce. S produktem by měli pracovat pouze pracovníci znalí technik PCR. Produkt se dá používat pouze ve spojení s přístrojem COBAS® AMPLICOR® Analyzer. Test COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 by se měl spouštět pouze v základním režimu. Detekce HIV-1 RNA závisí na tom, kolik virových částic je ve vzorku přítomno, na což mají vliv metody odběru vzorku a status pacienta (např. věk, přítomnost symptomů a/ nebo stádium infekce). I když vzácně, mutace ve vysoce konzervovaných oblastech virového genomu pokryté primery testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 a/nebo sondou mohou vést k podhodnocení množství nebo selhání detekce viru. Doporučuje se, aby uživatelé opět stanovili výchozí hladinu virové nálože pro podtypy non-B. Díky podstatným rozdílům mezi technologiemi se doporučuje, aby uživatelé před změnou technologie na jinou provedli korelační metodické studie ve vlastní laboratoři a kvantifikovali rozdíly mezi technologiemi.

Pokyny k postupům Rozhodnutí, zda použít postup přípravy vzorků Standard nebo UltraSensitive, závisí na konkrétní populaci pacientů. Doporučuje se, aby si laboratoř vyhodnotila charakteristiky populace pacientů a podle toho zvolila nejvhodnější laboratorní postup pro první testování a rozhodnutí, kdy použít alternativního postupu zpracování vzorku. Jestliže například v populaci nejsou žádní terapeuticky naivní pacienti nebo se ví, že všichni pacienti procházejí antiretrovirovou terapií, zvolí laboratoř nejspíše jako rutinní postup přípravy vzorku přístup UltraSensitive a postup Standard použije jenom tehdy, jsou-li výsledky virové zátěže vyšší než 100 000 kopií/ml. Jestliže je pacientská populace neznámá, pokud jde o terapii

30/52



HIV-1 MONITOR

nebo výchozí výsledky virové zátěže, zvolí laboratoř spíše postup přípravy vzorku Standard a postup UltraSensitive použije teprve tehdy, když postup Standard poskytne hodnoty virové zátěže pod 400 kopií/ml.

Rušivé látky Heparin inhibuje PCR, proto vzorky odebrané s heparinem nepoužívejte. Je prokázáno, že zvýšené hladiny lipidů, bilirubinu a hemoglobinu ve vzorcích stanovení HIV-1 RNA tímto testem neruší. Stanovení HIV-1 RNA testem AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 neruší tato léčiva: Inhibitory HIV proteázy • Indinavir • Ritonavir • Nelfinavir • Saquinavir

Inhibitory nenukleozidové reverzní transkriptázy • HBY 097 • Nevirapine • Delavirdine

Inhibitory HIV nukleozidové reverzní transkriptázy • Zidovudine • Didanosine • Zalcitabine • Stavudine • Lamivudine Složky léčby CMV • Ganciclovir • Ganciclovir valinát

Hodnocení neklinických funkčních parametrů Charakteristika studie

Mez detekce, přesnost a lineární úsek testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 byly stanoveny analýzou série zředění dobře charakterizovaných zásobních vzorků vypěstovaného viru HIV-1 v HIV-negativní lidské plazmě. Virus byl získán z laboratoře VQA (Virology Quality Assurance) skupiny ACTG (AIDS Clinical Trials Group) při Divizi pro AIDS Národních zdravotnických ústavů (National Institutes of Health) v Bethesdě v USA. Koncentrace virové RNA v těchto zásobních vzorcích byla odhadnuta pomocí elektronové mikroskopie, koncentrace antigenu p24 testem AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test a analýzou DNA s rozvětveným řetězcem. Všechny metody poskytly srovnatelné výsledky36. Příprava vzorků a analýza soupravou COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 byla provedena na místě. Panel sériově zředěných vzorků byl analyzován denně po dobu dvanácti dnů s přípravou vzorků postupy Standard i UltraSensitive a za použití dvou šarží COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5.

Mez detekce

Výše uvedené studie prokázaly, že při použití postupu přípravy vzorku UltraSensitive dokáže COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 detekovat virionovou HIV-1 RNA v plazmě při koncentraci pouhých 50 RNA kopií/ml s podílem pozitivity vyšším než 95%; při použití postupu Standard stačí pro podíl pozitivity převyšující 95% koncentrace pouhých 400 RNA kopií/ml (Tab. 2), pokud absorbance vybraného D-kelímku leží ve specifikovaném rozmezí (0,15-2,00).



31/52

Tabulka 2 Mez detekce testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Příprava vzorku Standard

Postup přípravy vzorků UltraSensitive

Nominální Nominální Vstup No. No. Pozitivita Vstup No. No. (HIV-1 RNA Replikátů Pozitivní Podíl (HIV-1 RNA Replikátů Pozitivní kopií/ml) kopií/ml)

Přesnost

Pozitivita Podíl

850 000

36

36

100%

100 000

36

36

100%

750 000

36

36

100%

75 000

36

36

100%

650 000

36

36

100%

50 000

36

36

100%

500 000

36

36

100%

35 000

36

36

100%

350 000

36

36

100%

25 000

35

35

100%

100 000

36

36

100%

5 000

35

35

100%

35 000

36

36

100%

1 000

36

36

100%

7 000

36

36

100%

400

32

32

100%

2 000

36

36

100%

100

36

36

100%

600

36

36

100%

80

36

36

100%

500

48

46

96%

60

36

35

97%

400

36

36

100%

50

36

35

97%

250

36

29

81%

40

36

32

89%

175

36

27

75%

25

36

29

81%

Přesnost v rámci jednoho měření („within-run“) a celková přesnost byla vyhodnocena pomocí metod uvedených ve směrnici CLSI Guideline EP5-T2, „Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices“. Tímto postupem je možno stanovit přesnost v rámci jednoho měření a celkovou přesnost provedením jediné studie zahrnující více dní a více pracovníků obsluhy. Denně po dobu 12 dnů bylo prováděno měření zahrnující 3 identicky opakované analýzy (replikáty) každého vzorku. Každý vzorek prošel kompletní procedurou pro COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5, tedy včetně přípravy vzorku, reverzní transkripce, amplifikace a detekce. Zde uváděná přesnost tedy zahrnuje všechny aspekty zkušebního postupu. Výsledky této studie přesnosti jsou uvedeny v Tab. 3 a 4. Tabulka 3 Přesnost testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 při použití postupu přípravy vzorku Standard Vzorek

Vzorek č. 1 Vzorek č. 2 Vzorek č. 3

Vzorek č. 4

Celk. počet Replikátů

36

36

36

36

Průměrný titr HIV-1 RNA (kopií/ml)

705

10 056

162 119

535 083

Směrod. odchylka

341

3082

44 188

148 708

Variační koef.

48%

31%

27%

28%

Směrod. odchylka

340

2916

53 556

190 702

Variační koef.

48%

29%

33%

36%

V rámci testu

Celkem

32/52



HIV-1 MONITOR

Tabulka 4 Přesnost testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 při použití postupu přípravy vzorku UltraSensitive Vzorek

Vzorek č. 1 Vzorek č. 2 Vzorek č. 3

Vzorek č. 4

Celk. počet Replikátů

36

36

35*

36

Průměrný titr HIV-1 RNA (kopií/ml)

84

1045

5578

39 825

44

331

823

12 451

52%

32%

15%

31%

39

382

1350

12 074

47%

37%

24%

30%

V rámci testu Směrod. odchylka Variační koef. Celkem Směrod. odchylka Variační koef.

* Se vzorkem č. 3 byl získán jeden QS-neplatný výsledek a nebyl do výpočtu přesnosti zahrnut. Lineární rozmezí

Jak ukazuje Obr. 3, je odezva testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 při použití postupu přípravy vzorku UltraSensitive lineární od 50 (log10 = 1,70) HIV-1 RNA kopií/ml minimálně po 100 000 (log10 = 5,00) HIV-1 RNA kopií/ml a při použití postupu přípravy vzorku Standard od 400 (log10 = 2,60) HIV-1 RNA kopií/ml minimálně po 750 000 (log10 = 5,87) HIV-1 RNA kopií/ml. Mimoto byla ve společném lineárním rozmezí testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5, tj. 400-100 000 kopií/ml, zjištěna mezi postupy přípravy vzorku Standard a UltraSensitive úzká korelace.

7,0 Postup přípravy vzorků Standard y = -0,16731 + 1,06x R=0,99912 Postup přípravy vzorků UltraSensitive y = -0,18823 + 1,0465x R=0,99946

6,0

5,0

4,0

3,0

10

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 výsledek Log (HIV-1 RNA kopií/ml)

Obr. 3 Linearita testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 při použití postupu přípravy vzorku Standard a UltraSensitive

2,0

1,0 Chybové úsečky – 1 směrodatná odchylka N = 27 až 36 0,0

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

Nominální koncentrace Log (HIV-1 RNA kopií/ml) 10



33/52

Inkluzivita (Funkčnost u subtypů skupiny M)

Izoláty HIV-1 získané po celém světě vykazují značnou genetickou diverzitu a dají se roztřídit do fylogeneticky spřízněných skupin podle nukleotidové sekvence38,39. Drtivá většina izolátů HIV-1 spadá do skupiny M („Major“), zatímco malý počet izolátů, zejména z Kamerunu a Gabunu, tvoří skupinu O („Outliers“). Skupinu M lze dále rozčlenit minimálně na 9 subtypů (anglicky též „clades“) označených jako A až I. Funkčnost testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 u jednotlivých subtypů skupiny M byla hodnocena analýzou 30 dobře charakterizovaných vypěstovaných izolátů HIV-1 reprezentujících subtypy A až G (viz Tab. 5). Každý izolát byl kultivován in vitro. Koncentrace viru v zásobních vzorcích byla odhadnuta počítáním částic pod elektronovým mikroskopem metodou Laynea a spol.40 Každý zásobní vzorek viru byl v negativní lidské plazmě zředěn na koncentraci přibližně 12 500 a 1 250 virových částic/ml. Každý takto zředěný vzorek byl analyzován na místě trojmo za použití metody přípravy vzorku Standard i UltraSensitive. Jelikož jedna virová částice obsahuje dva virové genomy, činila očekávaná koncentrace HIV RNA přibližně 25 000 resp. 2 500 kopií/ml. COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 poskytl u všech 30 izolátů ekvivalentní výsledky; počty kopií u jednotlivých testovaných subtypů byly v dobrém vzájemném souladu i v souladu s očekávanou hodnotou počtu virových částic (viz Obr. 4). U vzorků se 25 000 kopií/ml činil průměrný výsledek při použití postupu přípravy Standard 43 906 kopií/ml se 4,5-násobným rozmezím (od 18 567 do 82 917 kopií/ml) a při použití postupu přípravy vzorku UltraSensitive 29 019 kopií/ml se 6,3-násobným rozmezím (od 12 233 do 77 250 kopií/ml). U vzorků se 2 500 kopií/ml činil průměrný výsledek při použití postupu přípravy Standard 4 045 kopií/ml se 6,4-násobným rozmezím (od 1 379 do 8 807 kopií/ml) a při použití postupu přípravy vzorku UltraSensitive 3 710 kopií/ml s 5,7-násobným rozmezím (od 1 390 do 7 977 kopií/ml). Tyto výsledky dokladují úzkou korelaci mezi postupy přípravy vzorku Standard a UltraSensitive. Izoláty skupiny O testovány nebyly. Jak by COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 fungoval u izolátů skupiny O, není známo.

34/52



HIV-1 MONITOR

Tabulka 5 COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 – testování inkluzivity subtypů – testované izoláty HIV-1


Izolát

Země izolace

UG273 DJ258 DJ263 US1 US2 US3 US4 CM237 BK132 BZ167 ZAM18 UG268 ETH2220 SE364 SM145 SE365 UG270 UG274 CM235 CM238 CM240 CM243 POC30506 ID12 ID17 NP1465 BZ126 BZ162 BZ163 HH8793

Uganda Džibuti Džibuti USA USA USA USA Thajsko Thajsko Brazílie Zambie Uganda Ethiopie Senegal Somálsko Senegal Uganda Uganda Thajsko Thajsko Thajsko Thajsko Thajsko Indonésie Indonésie Thajsko Brazílie Brazílie Brazílie Keňa

Subtyp

Reference

GenBank Přístupové číslo

A A A B B B B B B B C C C C C D D D E E E E E E E E F F F G

43 41, 43 43, 47 44 44 44 44 44 45 41, 42 43, 46, 50 41, 43, 46 46, 52 43 41, 43 41, 43 41 41, 43, 46 45 41, 44 41, 44, 48 45 46, 49 46, 51 46, 51 46 42 41, 42 42 46, 47

L22957 L11763, L22939 AF063223, L22941 L14573 L14574 L14575 L14576 L14570 L03696, L03697 L11752, L22087 L03705, L22945 L11799, L22948 U46016 L22944 L11803, L22946 L11797, L22945 L11800 L11801, L22950 L03698 L11760, L14571 U54771, L11761, L14572 L03702, L03703 U48272 U68193 U68191 není v GenBank L22083, L22082 L11751, L22084 L22086, L22085 AF061640


35/52

BZ163 / F

HH8793 / G

BZ162 / F

BZ126 / F

ID17 / E

NP1465 / E

ID12 / E

CM243 / E

POC30506 / E

CM240 / E

CM238 / E

UG274 / D

CM235 / E

SE365 / D

UG270 / D

SE364 / C

1

SM145 / C

10

UG268 / C

2

ETH2220 / C

10

BZ167 / B

3

ZAM18 / C

10

BK132 / B

4

US4 / B

10

CM237 / B

5

US3 / B

10

US2 / B

6

US1 / B

10

UltraSensitive – 2 500 c/ml UltraSensitive – 25 000 c/ml Standard – 2 500 c/ml Standard – 25 000 c/ml

DJ263 / A

7

DJ258 / A

10

UG273 / A

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 výsledek (HIV-1 RNA kopií/ml)

Obr. 4 Fungování COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 u HIV-1 subtypů A až G

Izolát a subtyp

Klinická specifičnost testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 byla zjišťována analýzou vzorků od anti-HIV-1-negativních dárců krve. Celkem bylo při uplatnění postupu přípravy vzorku Standard testováno 507 vzorků antikoagulovaných buď EDTA (267) nebo ACD (240); v případě postupu přípravy vzorku UltraSensitive činil počet vzorků 504, z toho 307 antikoagulovaných EDTA a 197 antikoagulovaných ACD. V rámci této studie byly použity tři šarže COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5. Při použití postupu Standard byly všechny vzorky HIV-1 RNA negativní, při použití postupu UltraSensitive bylo negativních 503 vzorků. Jediný vzorek, který byl při použití postupu UltraSensitive na HIV-1 RNA pozitivní, měl hodnotu HIV A660 v neředěném D-kelímku 0,156 (viz Tab. 6). Když byl tento vzorek testován opakovaně identickým postupem (za použití metody UltraSensitive), poskytly oba opakované vzorky výsledky negativní (HIV A660 v D-kelímku s neředěným vzorkem = 0,002 a 0,002). Předpokládáme-li, že je prevalence infekce virem HIV-1 u seronegativních dárců krve nulová, pak je klinická specifičnost testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 v případě postupu přípravy vzorku Standard 100% a při postupu UltraSensitive 99,8%.

Klinická specifičnost

Tabulka 6 Klinická specifičnost testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 u anti-HIV-1-negativních dárců krve

Příprava vzorku Standard UltraSensitive

36/52

N

HIV-1 RNA Kopií/ml

507 504

Nedetekováno Pozitivní 507 0 503 1

HIV-1 A660 (v D-kel. neředěné) Minimum 0,000 0,000

Průměr 0,004 0,005

Maximum Směrod. odch. 0,082 0,006 0,156 0,010



HIV-1 MONITOR

Analytická specifičnost

Analytická specifičnost testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 byla hodnocena tak, že do HIV-negativní lidské plazmy byly přidány vypěstované buňky, vypěstovaný virus nebo přečištěná nukleová kyselina z organismů a virů uvedených v Tab. 7 (po kroku A.6. „Návodu k použití“). Všechny vzorky byly testem COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 analyzovány za použití postupu přípravy vzorku Standard. Žádný z non-HIV organismů, virů ani přečištěných nukleových kyselin nevykázal pozitivitu na HIV-1 RNA. Dva ze čtyř testovaných izolátů HIV-2 (7824A a 60415K) sice pozitivní výsledky měly, ovšem o schopnosti tohoto testu amplifikovat izoláty HIV-2 se nic určitého netvrdí. Tabulka 7 Analytická specifičnost Adenovirus typ 2 Adenovirus typ 3 Adenovirus typ 7 Cytomegalovirus AD-169 Cytomegalovirus Davis Cytomegalovirus Towne Virus Epsteinův-Barrové P-3 (Buňky Burkittova lymfomu) Virus Epsteinův-Barrové HR1 (Buňky Burkittova lymfomu) Virus Epsteinův-Barrové (Buňky Burkittova lymfomu RAJI) Varicella-Zoster Ellen Varicella Oka Virus hepatitidy B Virus hepatitidy C Genotyp 1a Virus hepatitidy C Genotyp 1b Virus hepatitidy C Genotyp 2b Virus hepatitidy C Genotyp 3a Virus hepatitidy C Genotyp 4c HIV-2 BEN HIV-2 subtyp A/B (izolát 7312A) HIV-2 subtyp A/B (izolát 7824A)

HIV-2 subtyp A/B (izolát 60415K) Lidský herpes virus 6 Lidský herpes virus 7 Herpes simplex typ 1,F Herpes simplex typ 1, HF Herpes simplex typ 1, MacIntyre Herpes simplex typ 2, G Herpes simplex typ 2, MS Lidský papilloma virus 6B Lidský papilloma virus 11 Lidský papilloma virus 16 Lidský papilloma virus 18 Buňky HTLV-1 MT-2 Buňky HTLV-1 MoT Mycobacterium avium Pneumocystis carinii Propionibacterium acnes Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

Výsledky v porovnání se soupravou AMPLICOR® HIV-1MONITOR Test, v1.5 Testy COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v,1,5 a AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 byly vzájemně porovnány analyzováním vzorků plazmy od osob infikovaných virem HIV-1. Tyto vzorky byly získány od firmy Bioclinical Partners, Inc. (Franklin, MA). Nebyly k nim k dispozici žádné předchozí výsledky testu soupravou AMPLICOR® HIV-1 MONITOR test a předpokládalo se, že patří k subtypu B. Porovnáno bylo celkem 289 vzorků připravených postupem Standard a 332 vzorky připravených postupem UltraSensitive. Korelace byla hodnocena za použití vzorků, u nichž byly získány kvantitativní výsledky oběma testy, jak COBAS® AMPLICOR®, tak AMPLICOR® HIV-1 MONITOR (225 vzorků připravených postupem Standard a vzorek 259 vzorků připravených postupem UltraSensitive). Lineární regresní analýza byla provedena o těch vzorků, které poskytly výsledky ležící v lineárním úseku, tedy 400-750 000 kopií/ml při postupu přípravy vzorků Standard (Obr. 5), resp. 50-100 000 kopií/ml při postupu přípravy vzorků UltraSensitive (Obr. 6). Výsledky získané soupravou COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 a soupravou AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 u obou postupů přípravy vzorku vysoce korelovaly.



37/52

Obr. 5 Korelace výsledků testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 a testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 v případě vzorků plazmy od pacientů infikovaných virem HIV-1 za použití postupu přípravy vzorků Standard

y = 0,33206 + 0,95588x R=0,93668 6,0

5,0

4,0

10

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Log HIV-1 RNA kopií/ml

7,0

3,0

2,0

1,0 1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

AMPLICOR®

HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Log HIV-1 RNA kopií/ml 10

Obr. 6 Korelace výsledků testu COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 a testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 v případě vzorků plazmy od pacientů infikovaných virem HIV-1 za použití postupu přípravy vzorků UltraSensitive

y = 0,27412 + 0,93427x R=0,91887 6,0

5,0

4,0

3,0

10

COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Log HIV-1 RNA kopií/ml

7,0

2,0

1,0

0,0 0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Log 10 HIV-1 RNA kopií/ml

38/52



HIV-1 MONITOR

Klinické výsledky Analýza virové zátěže byla v rámci studií uvedených níže provedena pomocí soupravy AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test. Při těchto studiích, které proběhly ve Spojených státech, se předpokládalo, že všichni zařazení pacienti jsou infikováni virem HIV-1 subtypu B. Z těchto studií lze posoudit i klinické uplatnění soupravy COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test, v1.5, protože bylo prokázáno, že se soupravy AMPLICOR® HIV-1 MONITOR a COBAS® AMPLICOR® HIV-1 MONITOR, v1.5 chovají stejně (s výjimkou non-B subtypů HIV-1) a u vzorků subtypu B poskytují ekvivalentní výsledky (data jsou evidována). Prognóza pacientů

Použitelnost soupravy AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test k prognózování rizika progrese choroby u HIV-infikovaných osob byla hodnocena v rámci studií ACTG č. 116A a 116B/117. Údaje z těchto studií byly analyzovány Coxovým modelem proporcionálních rizik k vyhodnocení četnosti postupu choroby na základě hladiny HIV-1 RNA. Studie ACTG č. 116A byla dvojitá slepá studie, kterou se porovnávala klinická účinnost zidovudinu (ZDV) v kombinaci se dvěma dávkami 2',3'-dideoxyinosinu (ddI) u pacientů s pokročilou chorobou HIV, kteří byli předtím po dobu nepřekračující 16 týdnů léčeni zidovudinem. Studie ACTG č. 116B/117 byla studie účinnosti, kdy se porovnávala léčba 2',3'-dideoxyinosinem (ddI) a zidovudinem u pacientů infikovaných virem HIV, kteří byli předtím léčeni zidovudinem po dobu delší než 16 týdnů. Populace pacientů v těchto studiích zahrnovala pacienty s diagnózou AIDS, s ARC i pacienty asymptomatické při zahájení studie. Progresi choroby představovaly postup AIDS, nová AIDS-definující příhoda (AIDS Defining Event, ADE) nebo úmrtí. Do podstudie HIV-1 RNA ACTG č. 116A bylo zařazeno 186 pacientů z klinické studie, jimž byly při vstupu do studie odebrány vzorky plazmy a PBMC, které byly řádně skladovány a byly pro testování k dispozici. Do podstudie HIV-1 RNA ACTG č. 116B/117 bylo zařazeno 99 náhodně vybraných pacientů ze studie léčiva, jimž byly při vstupu do studie odebrány vzorky plazmy, které byly řádně skladovány a byly pro testování k dispozici. Neupravené a upravené hodnoty relativního rizika postupu choroby na základě výchozí hladiny HIV-1 RNA, změny hladiny HIV-1 RNA během 8 týdnů a počtu buněk CD4+ byly vyhodnoceny pomocí Coxova modelu proporcionálních rizik. Neupravená hodnota relativního rizika je riziko, jak je představuje proměnná samotná, kdežto upravená hodnota je riziko, jak je představuje táž proměnná po kontrole ostatními proměnnými zahrnutými v modelu. Tyto modely poskytují vztah mezi případně zvýšeným rizikem postupu choroby a proměnnými, jež jsou do modelu zařazeny. Tyto analýzy byly provedeny posouzením relativních rizik 5-násobného rozdílu příslušné proměnné. Výsledky analýz jsou uvedeny v Tabulkách 8-11. Údaje ukazují, že v populaci pacientů s pokročilou chorobou HIV podrobujících se speciální terapii proti reverzní transkriptáze je 5-násobně vyšší výchozí hladina HIV-1 RNA spojena se zvýšeným rizikem postupu choroby. U pacientů, kteří se předtím podrobovali terapii ZDV po dobu delší než 16 týdnů (pacienti ze studie ACTG č. 116B/117), neměla 5-násobně vyšší výchozí hladina HIV-1 RNA staticky významnou prognostickou hodnotu. U pacientů, kteří předtím neabsolvovali žádnou terapii ZDV nebo u nichž terapie ZDV nepřekračovala dobu 16 týdnů, 5-násobná změna mezi výchozí hladinou RNA a touž hladinou v 8. týdnu statisticky významnou prognostickou hodnotu měla. U pacientů, kteří předtím absolvovali terapii ZDV po dobu přesahující 16 týdnů, se prognostická hodnota 5-násobné změny mezi výchozí hladinou RNA a touž hladinou v 8. týdnu neprokázala.



39/52

Také četnost postupu choroby byla v jednotlivých studiích analyzována, a to rozdělením příslušné studované populace na decily podle výchozí HIV-1 RNA. Četnost postupu choroby byla hodnocena u těchto decilů. Ve všech studiích byla u všech pacientů, u nichž výchozí hladina HIV-1 RNA převyšovala 250 000 kopií/ml, zjištěna 60% četnost postupu choroby. Ve studii 116A byla u pacientů v prvních čtyřech decilech (< 11 912, < 34 661, < 72 438 a < 103 806 HIV-1 RNA kopií/ml) zjištěna zhruba 35% četnost postupu choroby. V dalších třech decilech (< 15 695, < 194 312 a < 247 229) se četnost postupu choroby pohybovala v rozmezí 40-50%. V posledních třech decilech, kde byla hladina HIV-1 RNA > 250 000 HIV-1 RNA kopií/ml, přesahovala četnost postupu choroby 60%. Ve studii č. 116B/117 byla četnost postupu choroby proměnlivější, nicméně i zde byl obecný trend zvýšené četnosti při vyšších hladinách HIV-1 RNA. U prvních šesti decilů této studie (< 11 571, < 31 292, < 49 743, < 62 132, < 97 781 a < 150 866) představoval podíl postupu choroby v průměru 30% (rozmezí 10-60%). V následujících dvou decilech (< 251 627 a < 403 146) vzrostla četnost postupu choroby na 50 a 60% a u posledních dvou decilů (< 794 027 a < 1 456 302), kde byla hladina HIV-1 RNA vyšší než 403 000, přesáhla četnost postupu choroby 80%. Souhrnné tabulky a sloupcové grafy těchto analýz uvádí Obr. 7 a 8. Měření reakce na antiretrovirovou terapii

Použitelnost testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test k měření účinků antiretrovirové terapie byla posuzována v rámci jedné klinické studie antiretrovirových sloučenin, kam spadal inhibitor reverzní transkriptázy zalcitabin (ddC, obchodní název HIVID), léčivo obsahující inhibitor proteázy saquinavir (SAQ, obchodní název INVIRASE) a jejich kombinace. Jednalo se o dvojitou slepou randomizovanou studii fáze III (studie NV14256), jejímž primárním cílem bylo posoudit bezpečnost, tolerovanost a účinnost zmíněných tří způsobů léčby (ddC, SAQ, a jejich vzájemná kombinace) na základě klinických údajů od pacientů, kteří vysadili (nebo nemohli nasadit) terapii zidovudinem (ZDV) a porovnat míru přežití u těchto tří terapeutických skupin (včetně úmrtí po příhodě definující AIDS [ADE] a toxicity omezující dávkování). Ve studii NV14256 představovala předchozí léčba ZDV kritérium pro zařazení, přičemž u většiny pacientů trvala léčba ZDV déle než jeden rok. Do studie NV14256 bylo na 49 klinických pracovištích zařazeno celkem 970 pacientů. Pacienti spadali do tří skupin podle předchozí terapie: ddC (325), Saquinavir (327) a Saquinavir + ddC (318). Z hlediska demografie a charakteristiky výchozí choroby představovali pacienti ve studii NV14256 rozmanitou populaci pacientů s pokročilou infekcí virem HIV-1 a širokým rozmezím režimů předchozí antiretrovirové terapie. Použitelnost testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test k měření účinků léčiv v čase byla hodnocena analýzou změny mediánu hladiny HIV-1 RNA od výchozího stavu do DAVGt (Difference Averaged over Time - průměrná změna oproti výchozímu stavu během t týdnů). K posouzení schopnosti testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test detekovat změny hladiny HIV-1 RNA, k nimž dochází v důsledku léčby, byly u každé pacientské skupiny analyzovány časové změny mediánu oproti výchozímu stavu. Tyto změny mediánu během 48týdenního období jsou pro jednotlivé pacientské skupiny studie NV14256 znázorněny na Obr. 9; vidíme, že AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test ukazuje měřitelný a trvalý pokles hladiny HIV-1 RNA s časem. Tato změna mediánu hladiny HIV-1 RNA je nejvyšší a v jednotlivých časových bodech nejkonzistentnější u pacientů podrobujících se kombinované léčbě (SAQ+ddC).

40/52



HIV-1 MONITOR

Použitelnost sériových měření HIV-1 RNA k posouzení virové odezvy na antiretrovirovou terapii byla také hodnocena pomocí Coxova modelu proporcionálních rizik. Při této analýze byly všechny tři skupiny pacientů sloučeny a byl fitován Coxův model stratifikovaný na terapeutické skupiny, přičemž jako lineární členy byly použity tyto kovariáty: log10(výchozí HIV-1 RNA), log10(poslední HIV-1 RNA), výchozí CD4 a poslední CD4. Rizikový poměr byl v tomto modelu definován jako 10-násobný nárůst HIV-1 RNA nebo pokles 100 v počtu buněk CD4. Jak ukazuje Tab. 12, je koeficient členu log10(poslední HIV-1 RNA) v tomto modelu statisticky významný a do 40. týdne pozitivní. To znamená, že hodnoty poměru rizik HIV-1 RNA do 40. týdne ukazují, že hladina HIV-1 RNA má v každém časovém bodě statisticky významnou a kontinuální prognostickou hodnotu. V rámci jedné příbuzné analýzy dat byla posuzována spojitost mezi hladinou HIV-1 RNA a dobou přežití. Zde byla doba přežití definována jako doba v rámci studie, po kterou pacient přežíval bez příhody definující AIDS (ADE) nebo smrti. Analýza byla provedena vynesením Kaplanových-Meierových křivek přežití pro jednotlivé terapeutické skupiny pacientů tak, že byla pacientská populace v dané skupině rozdělena podle hladiny HIV-1 RNA na třetiny: na nízkou, střední a vysokou. Křivky přežití byly vyneseny v závislosti na procentu přežití bez ADE pro jednotlivé skupiny, tj. pro skupinu nízkou, střední a vysokou, jako počet týdnů po 8. týdnu. Kaplanovy-Meierovy odhadové analýzy přežití ukazují, že u pacientů s nízkou hladinou HIV-1 RNA (nízká třetina) je vyšší pravděpodobnost, že přežijí bez ADE déle, než pacienti s vysokou hladinou HIV-1 RNA. Kaplanovy-Meierovy křivky přežití jsou pro jednotlivé terapeutické skupiny pacientů znázorněny na Obr. 10, 11 a 12. V rámci samostatné analýzy dat ze studie NV14256 bylo pacientské riziko ADE nebo úmrtí posuzováno v závislosti na časově poslední hladině HIV-1 RNA v jednotlivých týdnech studie. Speciálně byla posuzována souvislost mezi posledním měřením HIV-1 RNA a rizikem vzniku první ADE nebo úmrtí (na základě klinických událostí zjištěných v rámci studie později). Analýza byla provedena za použití Coxova modelu pro analýzu přežití s kovariáty log10(výchozí HIV-1 RNA), log10(poslední HIV-1 RNA), výchozí CD4 a poslední CD4. Model byl lineární funkcí kovariátů predikujících log rizika (poměrného) vzniku ADE. Tato lineární funkce pak byla použita ke stanovení indexu rizika pro všechny pacienty zařazené do studie. Pacienti, kteří přežili 4. týden studie bez ADE, byli rozčleněni podle svého indexu rizika společně s prvními 25% pacientů tvořících „nízkorizikovou“ skupinu a zbývající pacienti byli podle svého indexu rizika rovnoměrně rozděleni na šest oddělených skupin. Každá z těchto šesti skupin pak byla porovnána s nízkorizikovou skupinou za použití modelu přežití a průměrná hladina HIV-1 RNA každé skupiny byla vynesena proti poměrnému riziku ADE vypočtenému za použití exponenciálního modelu po částech. Poměrné riziko pro dobu do první ADE je vyneseno proti hodnotě log10(poslední HIV-1 RNA) pro pacienty, kteří přežili bez ADE do 4. týdne, v Obr. 13 a pro pacienty, kteří přežili bez ADE až do 16. týdne (včetně), v Obr. 14. Tyto údaje ukazují, že pravděpodobnost vzniku ADE nebo úmrtí je ve 4. týdnu studie u pacienta s HIV-1 RNA na hladině 100 000 kopií/ml (log10 = 5,0) 6-násobná oproti pacientovi s HIV-1 RNA hladinou 8000 kopií/ml. V 16. týdnu je u pacienta s HIV-1 RNA hladinou 1 000 000 (log10 = 6,0) pravděpodobnost vzniku ADE nebo úmrtí oproti pacientovi s HIV-1 RNA hladinou 8 000 kopií/ml 20-násobná.



41/52

Zde prezentované údaje týkající se klinické využitelnosti a použití testu AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test ke sledování účinků antiretrovirové terapie jsou odvozeny pouze z jedné klinické studie, která se zabývala porovnáním dvou léčiv a tří léčebných režimů u jisté specifické skupiny pacientů. Jelikož jenom jedna klinická studie nemusí dostatečně prokazovat klinickou využitelnost kvantitativního testování na HIV RNA v celé pacientské populaci, ve všech klinických situacích či při všech druzích antiretrovirové terapie, je třeba k rozšíření interpretace údajů ze studie na každý jednotlivý případ nemocného přistupovat obezřetně. Jako je tomu u každého diagnostického testu, je třeba výsledky z AMPLICOR® HIV-1 MONITOR Test interpretovat s uvážením všech klinických zjištění a laboratorních nálezů. Tabulka 8 Studie ACTG 116A: spojitost mezi proměnnými studie ve výchozím stavu a postupem choroby (N = 153 pacientů, 73 událostí progrese) Neupravené relativní riziko (95% Cl)

Upravené relativní riziko (95% Cl) hodnota p2

Proměnná Log počtu HIV-1 RNA kopií1 Log počtu buněk CD4+1 Dx AIDS ve výchoz. stavu Terapie ddl

1,58 (1,20-2,09)

1,44 (1,07-1,93)

0,02

0,39 (0,28-0,54) 2,00 (1,22-3,27) 0,95 (0,59-1,53)

0,45 (0,31-0,64) 1,39 (0,82-2,37) 1,12 (0,68-1,84)

0,0001 0,22 0,66

1 - Relativní riziko je poměrné riziko spojené s 5-násobným nárůstem HIV-1-RNA nebo poklesem počtu buněk CD4+ 2 - p značí upravenou hodnotu relativního rizika

Tabulka 9 Studie ACTG 116A: spojitost mezi změnou hladiny HIV-1 RNA od výchozího stavu do 8. týdne a postupem choroby (N = 114 pacientů, 62 událostí progrese) Neupravené relativní riziko (95% Cl)


Proměnná Log počtu HIV-1 RNA kopií1 Log změny HIV-1 RNA od výchoz. stavu do 8. týdne1 Log počtu buněk CD4+1 Dx AIDS ve výchoz. stavu Terapie ddl

1,46 (1,11-1,93)

1,63 (1,16-2,28)

0,0005

1,18 (0,93-1,48)

1,54 (1,09-2,16)

0,013

0,43 (0,30-0,62) 1,83 (1,09-3,09) 0,76 (0,45-1,27)

0,50 (0,34-0,73) 1,28 (0,74-2,21) 0.87 (0,51-1,.49)

0,0004 0,38 0,61


Tabulka 10 Studie ACTG 116B/117: spojitost mezi proměnnými studie ve výchozím stavu a postupem choroby (N = 86 pacientů, 39 událostí progrese) Neupravené relativní riziko (95% Cl)


Proměnná Log počtu HIV-1 RNA kopií1 Log počtu buněk CD4+ 1 Dx AIDS ve výchoz. stavu Terapie ddl

1,90 (1,28-2,82)

1,25 (0,81-1,94)

0,32

0,28 (0,16-0,48) 3,13 (1,66-5,92) 0,89 (0,47-1,69)

0,33 (0,18-0,62) 2,38 (1,24-4,58) 0,88 (0,46-1,71)

0,0006 0,01 0,71


42/52



HIV-1 MONITOR

Tabulka 11 Studie ACTG 116B/117: spojitost mezi změnou hladiny HIV-1 RNA od výchozího stavu do 8. týdne a postupem choroby (N = 65 pacientů, 29 událostí progrese) Neupravené relativní riziko (95% Cl)


Proměnná Log počtu HIV-1 RNA kopií1 Log změny HIV-1 RNA od výchoz. stavu do 8. týdne1 Log počtu buněk CD4+1 Dx AIDS ve výchoz. stavu Terapie ddl

2,10 (1,32-3,34)

1,58 (0,93-2,69)

0,09

1,41 (0,71-2,79)

1,58 (0,68-3,68)

0,29

0,25 (0,13-0,46) 2,43 (1,17-5,05) 1,07 (0,51-2,27)

0,29 (0,14-0,60) 1,87 (0,88-3,97) 0,98 (0,39-2,48)

0,001 0,10 0,96


Obr. 7 Studie 116A: četnost postupu choroby dle výchozí hladiny HIV-1 RNA Postup choroby vs. výchozí hladina HIV-1 RNA

Postup choroby (%)

80 70 60 50 40 30 20 10

Výchozí hladina HIV-1 RNA (kopií/ml)


<2 162 193

<775 841

<417 316

<247 229

<194 312

<150 695

<103 806

<72 438

<34 661

<11 912

0

Záznam č.

Decil

n=

Počet progresí

Počet progresí k AIDS/úmrtí

%

18 36 54 72 90 108 126 144 162 179

< 11912 < 34661 < 72438 < 103806 < 150695 < 194312 < 247229 < 417316 < 775841 < 2162193

18 18 18 18 18 18 18 18 18 17

15 14 17 14 16 16 14 16 17 14

5 5 6 5 7 8 6 10 12 9

33,33 35,71 35,29 35,71 43,75 50,00 42,86 62,50 70,59 64,29


43/52

Obr. 8 Studie 116B/117: četnost postupu choroby dle výchozí hladiny HIV-1 RNA Postup choroby vs. výchozí hladina HIV-1 RNA 90

Postup choroby (%)

80 70 60 50 40 30 20 10

<1 456 302

<794 027

<403 146

<251 627

<150 866

<97 781

<62 132

<49 743

<31 292

<11 571

0

Výchozí hladina HIV-1 RNA (kopií/ml)

Záznam č.

Decil

n=

Počet progresí

Počet progresí k AIDS/úmrtí

%

10 20 30 40 50 60 70 80 90 96

< 11571 < 31292 < 49743 < 62132 < 97781 < 150866 < 251627 < 403146 < 794027 < 1456302

10 10 10 10 10 10 10 10 10 6

10 10 10 10 10 10 10 10 10 6

4 2 3 6 1 3 5 6 9 5

40,00 20,00 30,00 60,00 10,00 30,00 50,00 60,00 90,00 83,33

Obr. 9 Studie NV14256: mediány změn hladiny HIV-1 RNA oproti výchozímu stavu v průběhu 48 týdnů Týden 4 n1=98 n2=91 n3=92

Týden 8 n1=90 n2=85 n3=91

Týden 12 n1=89 n2=88 n3=85

Týden 16 n1=93 n2=81 n3=86

Týden 24 n1=86 n2=83 n3=84

Týden 32 n1=71 n2=73 n3=79

Týden 40 n1=63 n2=71 n3=69

Týden 48 n1=52 n2=62 n3=56

0,4 0,2 0 -0,2 -0,4 -0,6 -0,8 Týden 4 Týden 12 Týden 16 Týden 8 ZDV+ddC

44/52

Týden 24

Týden 32

SAQ 600mg+ZDV

Týden 40

Týden 48

SAQ 600mg+ZDV+ddC



HIV-1 MONITOR

Tabulka 12 Studie NV 14256: závislost rizika ADE na hodnotě log10 (poslední RNA) a dalších kovariátech na základě doby od daného týdne studie u pacientů, kteří tento týden přežili; souhrn výsledků z Coxova modelu – model stratifikován podle terapeutických skupin Týden studie 4

8

16

24

32

40

48

56

64

Proměnná

Koef. Coxova modelu

Poměrné riziko*

Hodnota p

log10(výchozí RNA) log10(poslední RNA) Výchozí CD4 Poslední CD4 log10(výchozí RNA) log10(poslední RNA) Výchozí CD4 Poslední CD4 log10(výchozí RNA) log10(poslední RNA) Výchozí CD4 Poslední CD4 log10(výchozí RNA) log10(poslední RNA) Výchozí CD4 Poslední CD4 log10(výchozí RNA) log10(poslední RNA) Výchozí CD4 Poslední CD4 log10(výchozí RNA) log10(poslední RNA) Výchozí CD4 Poslední CD4 log10(výchozí RNA) log10(poslední RNA) Výchozí CD4 Poslední CD4 log10(výchozí RNA) log10(poslední RNA) Výchozí CD4 Poslední CD4 log10(výchozí RNA) log10(poslední RNA) Výchozí CD4 Poslední CD4

0,798 0,4197 –0,0009 –0,0040 0,8096 0,4186 –0,0019 –0,0049 0,8714 0,5385 –0,0015 –0,0049 0,6910 0,7135 –0,0003 –0,0064 0,5926 0,9000 –0,0040 –0,0023 0,8003 0,7086 –0,0030 –0,0031 0,5993 0,5631 –0,0011 –0,0079 1,0917 0,0835 –0,0022 –0,0072 1,2803 –0,2500 0,0006 –0,0085

2,22 1,52 0,91 0,67 2,25 1,52 0,83 0,62 2,39 1,71 0,87 0,62 2,00 2,04 0,97 0,53 1,81 2,46 0,67 0,79 2,23 2,03 0,74 0,73 1,82 1,76 0,89 0,45 2,98 1,09 0,80 0,49 3,60 0,78 1,07 0,43

0,0012 0,0219 0,5806 0,0084 0,0004 0,0138 0,2107 0,0006 0.005 0,0046 0,3510 0,0010 0,0136 0,0017 0,8667 0,0001 0,0492 0,0003 0,0252 0.1523 0,0159 0,0096 0,1282 0,0955 0,0978 0,0629 0,6168 0,0016 0,0127 0,8025 0,4560 0,0201 0,0135 0,4988 0,8531 0,0213

* Poměrné riziko vyvolané 10-násobným nárůstem HIV-1 RNA nebo poklesem počtu buněk CD4 o 100.

Obr. 10 Studie NV14256: Kaplanovy-Meierovy odhady přežití – terapeutická skupina: pacienti na SAQ 600 mg, kteří přežili 8. týden bez ADE Přežití ADE (%)

Poslední hladina RNA: 8. týden

Spodní třetina Prostřední třetina Horní třetina

Týdnů po 8. týdnu



45/52

Obr. 11 Studie NV14256: Kaplanovy-Meierovy odhady přežití – terapeutická skupina: pacienti na ddC, kteří přežili 8. týden bez ADE Přežití ADE (%)




Obr. 12 Studie NV14256: Kaplanovy-Meierovy odhady přežití – terapeutická skupina: pacienti na ddC + SAQ 600 mg, kteří přežili 8. týden bez ADE Přežití ADE (%)




46/52



HIV-1 MONITOR

Obr. 13 Studie NV14256: poměrné riziko pro dobu do první ADE – pacienti, kteří přežili 4. týden bez ADE Poměrné riziko 21

16

11

6

1 3,8

4,2

4,6

5,0

5,4

5,8

log10 (poslední RNA)

Obr. 14 Studie NV14256: poměrné riziko pro dobu do první ADE – pacienti, kteří přežili 16. týden bez ADE

Poměrné riziko 21

16

11

6

1 3,8

4,2

4,6

5,0

5,4

5,8

log10 (poslední RNA)



47/52

Literatura 1.

Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rey, F. 1983. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome. Science 220:868-871.

2.

Popovic, M., Sarngadharan, M.G., Read, E., et al. 1984. Detection, isolation and continuous production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. Science 224:497-500.

3.

Gallo, R.C., Salahuddin, S.Z., Popovic, M., et al. 1984. Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and at-risk for AIDS. Science 224:500-502.

4.

Curran, J.W., Jaffe, H.W., Hardy, A.M., et al. 1988. Epidemiology of HIV Infection and AIDS in the United States. Science 239:610-616.

5.

Gaines, H., von Sydow, M.A., von Stedingk, L.V. 1990. Immunological changes in primary HIV-1 infection. AIDS 4:995-999.

6.

Tindall, B., and Cooper, D.A. 1991. Primary HIV-1 infection: host responses and intervention strategies. AIDS 5:1-14.

7.

Daar, E.S., Moudgil, T, Meyer. R.D., et al. 1991. Transient high levels of viremia in patients with primary human immunodeficiency virus type 1 infection. New England Journal of Medicine 324:961-964.

8.

Clark, S.J., Saag, M.S., Decker, W.D. 1991. High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptomatic primary HIV-1 infection. New England Journal of Medicine 324:954-960.

9.

Albert, J., Abrahamsson, B., Nagy, K. 1990. Rapid development of isolatespecific neutralizing antibodies after primary HIV-1 infection and consequent emergence of virus variants which resist neutralization by autologous sera. AIDS 4:107-112.

10. Hornsburgh, C.R., Jason, J., Longini, I.M., et al. 1989. Duration of human immunodeficiency virus infection before detection of antibody. Lancet 26:637-640. 11. Schnittman, S.M., Psallidopoulos, M.C., Lane, H.C., et al. 1989. The reservoir for HIV-1 in human peripheral blood is a T cell that maintains expression of CD4. Science 245:305-308. 12. Schnittman, S.M., Greenhouse, J.J., Psallidopoulos, M.C. 1990. Increasing viral burden in CD4+ T cells from patients with human immunodeficiency virus (HIV) infection reflects rapidly progressive immunosuppression and clinical disease. Annals of Internal Medicine 113:438-443. 13. Pantaleo, G., Graziosi, C., Fauci, A.S. 1993. New concepts in the immunopathogenesis of human immunodeficiency virus (HIV) infection. New England Journal of Medicine 328:327-335.

48/52



HIV-1 MONITOR

14. Piatak, N., Saag, M.S., Yang, L.C., et al. 1993. High levels of HIV-1 in plasma during all stages of infection determined by competitive PCR. Science 259:1749-1754. 15. Fauci, A.S., Schnittman, S.M., Poli, G., et al. 1991. NIH conference: immunopathogenic mechanisms in human immunodeficiency virus (HIV) infection. Annals of Internal Medicine 114:678-693. 16. Coffin, J.M. 1995. HIV-1 population dynamics in vivo: Implications for genetic variation, pathogenesis, and therapy. Science 267:483-489. 17. Ho, D.D., Neumann, A.U., Perelson, A.S., et al. 1995. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection. Nature 373:123-126. 18. Wei, X., Ghosh, S.K., Taylor, M.E., et al. 1995. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection. Nature 373:117-122. 19. O’Brien, W.A., Hartigan, P.M., Martin, D. et al. 1996. Changes in plasma HIV-1 RNA and CD4 lymphocyte counts and the risk of progression to AIDS. New England Journal of Medicine 334:426-431 20. Welles, S.L., Jackson, J.B., Yen-Leiberman, B., et al. 1996. Prognostic value of plasma Human Immunodeficiency Virus Type I (HIV-1) RNA levels in patients with advanced HIV-1 disease and with little or no zidovudine therapy. Journal of Infectious Diseases 174:696-703. 21. Coombs, R.W., Welles, S.L., Hooper, C., et al. 1996. Association of plasma Human Immunodeficiency Virus Type I RNA level with risk of clinical progression in patients with advanced infection. Journal of Infectious Diseases 174:704-712. 22. Hammer, S., Crumpacker, C., D’Aquila, R., et al. 1993. Use of virologic assays for detection of human immunodeficiency virus in clinical trials: Recommendations of the AIDS Clinical Trials Group Virology Committee. Journal of Clinical Microbiology 31:2557-2564. 23. Schochetman, G., George, J.R., ed. AIDS testing: a comprehensive guide to technical, medical, social, legal and management issues. 2nd ed. New York: Springer-Verlag, 1994. 24. Mulder, J. McKinney, N., Christopherson, C., et al. 1994. Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: Application to acute retroviral infection. Journal of Clinical Microbiology 32:292-300. 25. Dewar, R.L., Highbarger, H.C., Sarmiento, M.B., et al. 1994. Application of branched DNA signal amplification to monitor human immunodeficiency virus type 1 burden in human plasma. Journal of Infectious Diseases 170:1172-1179. 26. van Gemen, B., Kievits, T., Schukkink, R., et al. 1993. Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA during HIV-1 primary infection. Journal Virological Methods 43:177-188.



49/52

27. Saiki, R.K. Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β−globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of Sickle Cell Anemia. Science 230:1350-1354. 28. Saiki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., et al. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-491. 29. Mullis, K.B., Faloona, F.A. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155:335-350. 30. Myers, T.W., and Gelfand, D.H. 1991. Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry 30:7661-7666. 31. Kwok, S., Sninsky, J.J. 1993. PCR detection of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA sequences. In: Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications. eds. Persing, D.H., Smith, T.F., Smith, F.C., et al. ASM, Washington, D.C. 32. Longo, M.C., Berninger, M.S., Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128. 33. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 34. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline–Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA: CLSI, 2005. 35. International Air Transport Association Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 36. Holmes, H., Davis, C., Heath, A., et al. 2001. An international collaborative study to establish the 1st international standard for HIV-1 RNA for use in nucleic acid-based techniques. Journal Virological Methods 92:141-150. 37. Yen-Lieberman, B., Brambilla, D., Jackson, B. et al. 1996. Evaluation of a quality assurance program for quantitation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA in plasma by the AIDS Clinical Trials Group Virology. Journal of Clinical Microbiology 34:2695-2701. 38. Dale, J., Dondero, T.J., Rayfield, M.A. et al. 1996. The emerging genetic diversity of HIV. JAMA 275:210-216. 39. Gao, F., Morrison, S.G., Robertson, D.L. et al. 1996. Molecular cloning and analysis of functional envelope genes from Human Immunodeficiency Virus Type 1 sequence subtypes A through G. Journal of Virology 70:1651-1667.

50/52



HIV-1 MONITOR

40. Layne, S.P., Merges, M.J., Dembo, M. et al. 1992. Factors underlying spontaneous inactivation and susceptibility to neutralization of Human Immunodeficiency Virus. Virology 189:695-714. 41. Louwagie, J.J., McCutchan, F., Brennan, T. et al. 1993. Phylogenetic analysis of gag genes from seventy international HIV-1 isolates provides evidence for multiple genotypes. AIDS 7:769-780. 42. Louwagie, J.J., Delwart, E.L., Mullins, J.I. et al. 1994. Genetic analysis of HIV-1 isolates from Brazil reveals presence of two distinct genetic subtypes. AIDS Research and Human Retroviruses 10:561-567. 43. Louwagie, J.J., Janssens, W., Mascola, J.J. et al. 1995. Genetic diversity of the envelope glycoprotein from Human Immunodeficiency Virus Type 1 isolates of African origin. Journal of Virology 69:263-271. 44. Mascola, J.J., Louwagie, J.J., McCutchan, F.E. et al. 1993. Two antigenically distinct subtypes of human immunodeficiency virus type 1: viral genotype predicts neutralization serotype. Journal of Infectious Diseases 169:48-54. 45. McCutchan, F.E., Hegerich, P.A., Brennan, T.P. et al. 1992. Genetic variants of HIV-1 in Thailand. AIDS Research and Human Retroviruses 8:1887-1895. 46. Michael, N. The Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C. Personal communication. 47. Carr, J.K., Salminen, M.O., Albert, J. et al. 1998. Full genome sequences of human immunodeficiency virus type 1 subtypes G and A/G intersubtype recombinants. Virology. 247:22-31. 48. Carr, J.K., Salminen, M.O., Koch, C. et al. 1996. Full-length sequence and mosaic structure of a human immunodeficiency virus type 1 isolate from Thailand. Journal of Virology 70:5935-5943. 49. McCutchan, F.E., Artenstein, A.W., Sanders-Buell, E. et al. 1996. Diversity of the envelope glycoprotein among human immunodeficiency virus type 1 isolates of clade E from Asia and Africa. Journal of Virology 70:3331-3338. 50. McCutchan, F.E., Ungar, B.L., Hegerich, P. et al. 1992. Genetic analysis of HIV-1 isolates from Zambia and an expanded phylogenetic tree for HIV-1. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome 5:441-449. 51. Porter, K.R., Mascola, J.R., Hupudio, H. et al. 1997. Genetic, antigenic and serologic characterization of human immunodeficiency virus type 1 from Indonesia. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome and Human Retrovirology 14:1-6. 52. Salminen, M.O., Johansson, B., Sonnerborg, A. et al. 1996. Full-length sequence of an ethiopian human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) isolate of genetic subtype C. AIDS Research and Human Retroviruses. 12:1329-1339.



51/52

" Distributed by

Roche Molecular Systems, Inc. Branchburg, NJ 08876 USA Člen Roche Group Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247)

Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433)

Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz

Roche Diagnostics F-38240 Meylan

Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany

Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano

Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona

Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora

ROCHE, COBAS, AMPLICOR, AMPLILINK, AMPERASE, AMPLIPREP, TAQMAN, AMPLICOR HIV-1 MONITOR, FORTOVASE, HIVID a INVIRASE jsou obchodní značky společnosti Roche. ROCHE RESPONSE CENTER je servisní značka společnosti Roche. CRIXIVAN® je registrovaná obchodní známka společnosti Merck & Co., Inc. Parmagnetické částice Dynabeads® jsou licencovány v rámci patentů ve vlastnictví společnosti Dynal Biotech ASA, Oslo, Norsko. Dynabeads® je registrovaná obchodní známka společnosti Dynal Biotech ASA, Oslo, Norsko, licencovaná subjektu Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana. Eppendorf Multipette® a Eppendorf Combitip® jsou registrované obchodní známky společnosti Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburk, Německo. EPIVIR® a ZIAGEN® jsou registrované obchodní známky společnosti GlaxoSmithKline. NORVIR® je registrovaná obchodní známka společnosti Abbott Laboratories. ProClin® je registrovaná obchodní známka společnosti Rohm and Haas Company. SUSTIVA® je registrovaná obchodní známka společnosti DuPont Pharmaceuticals Company. VIRAMUNE® je registrovaná obchodní známka společnosti Roxane Laboratories, Inc. Copyright 2008. Roche Molecular Systems, Inc. Všechna práva vyhrazena.

4/2008

(00058003436-06ENGL) 04497848001-04

52/52



HIM. Účel. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO

Recommend Documents