01/2014:0828
HEPARINA MASSAE MOLECULARIS MINORIS Kis molekulatömegű heparinok DEFINÍCIÓ A kis molekulatömegű heparinok olyan, 8000-nél kisebb átlagos relatív molekulatömegű szulfatált glükózaminoglikánok sói, amelyekre jellemző, hogy az anyag teljes tömegének legalább 60 százaléka 8000-nél kisebb relatív molekulatömegű molekulákból áll. A poliszacharid láncok redukáló, illetve nem redukáló végén eltérő kémiai szerkezetű csoportok találhatók. A szárított anyagra vonatkoztatott anti-Xa-faktor aktivitás legalább 70 NE/mg. Az anti-Xa-faktor aktivitás/anti-IIa-faktor aktivitás arány, a „Hatóérték-meghatározás” pontban leírtak szerint meghatározva, legalább 1,5. ELŐÁLLÍTÁS Indokolt és engedélyezett esetek kivételével, a kis molekulatömegű heparinokat olyan természetes eredetű heparin frakcionálásával vagy depolimerizációjával állítják elő, amely megfelel a Heparinnátrium (0333), illetve a Heparin-kalcium (0332) cikkelyben meghatározott követelményeknek. Minden kis molekulatömegű heparin típus esetén biztosítani kell, hogy az anyag gyártási tételről gyártási tételre azonos minőségű, pl. annak bizonyításával, hogy az átlagos relatív molekulatömeg, valamint a meghatározott, 8000-nél kisebb relatív molekulatömeg-tartományokba eső frakciók tömegaránya az adott típus specifikációjában meghatározott érték 75–125%-a százaléka között van. Ugyanezen követelmény érvényes az anti-Xa-faktor aktivitás/anti-IIa-faktor aktivitás arányra is. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, nedvszívó por Oldékonyság: vízben bőségesen oldódik. AZONOSÍTÁS A. Mágneses magrezonancia spektrometria (2.2.33). Mintakészítés. 0,200 g vizsgálandó anyagot 0,2 ml R deutérium-oxid és 0,8 ml R víz elegyében oldunk. Összehasonlítás. 0,200 g, a mintának megfelelő, referencia standard kis molekulatömegű heparint 0,2 ml R deutérium-oxid és 0,8 ml R víz elegyében oldunk. Működési körülmények: a 13C-vizsgálathoz 75 MHz frekvenciájú, impulzusüzemű (Fouriertranszformációs) spektrométert használunk A spektrumokat 40 °C-on, 5 mm átmérőjű mintatartó csövekben vesszük fel. Belső referenciaanyagként R deuterometanolt használunk, amely δ=50,0 ppm-en ad jelet. Értékelés. A vizsgálati oldat spektruma egyezzék meg a megfelelő kis molekulatömegű heparint tartalmazó referenciastandard spektrumával. B. Az anti-Xa-faktor aktivitás/anti-IIa-faktor aktivitás arány a „Hatóérték-meghatározás” pontban leírtak szerint meghatározva, legalább 1,5. C. Méretkizárásos kromatográfia (2.2.30).
Vizsgálati oldat. 20 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázis 2 ml-ében oldunk. Összehasonlító oldat. 20 mg CRS kalibrációs célra szánt kis molekulatömegű heparint a mozgófázis 2 ml-ében oldunk. Oszlop: – méretei: l = 0,30 m, ∅ = 7,5 mm, – állófázis: kb. 15 000–100 000 relatív molekulatömeg-tartományba eső fehérjék elválasztására alkalmas porózus szilikagélgyöngyök (5 µm); – elméleti tányérszám: legalább 20 000/méter. Mozgófázis: R vízmentes nátrium-szulfát 28,4 g/l töménységű oldata, melynek pH-ját R hígított kénsavval 5,0-re állítottuk be. Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc. Detektálás: differenciál-refraktométerrel. Injektálás: 25 µl. A rendszer kalibrálása. Detektáláshoz differenciál-refraktométert (RI) és vele sorba kötött, 234 nm hullámhosszon detektáló ultraibolya spektrofotométert (UV) használunk úgy, hogy az UV detektor az oszlop kivezetőnyílásához, a differenciál refraktométer pedig az UV detektor kimenetéhez csatlakozik. Fontos a két detektor közötti áthaladási idő pontos meghatározása, mert a két kromatogramot csak így tudjuk helyesen összeilleszteni. A kalibrációnál használt retenciós időket az RI detektor alapján határozzuk meg. A normalizációs faktort, amelyet a relatív molekulatömeg RI/UV arány alapján történő meghatározására használunk, a következő módon nyerjük: numerikus integrálással meghatározzuk az UV234 (ΣUV234) és az RI (ΣRI) görbék alatti területet az általunk vizsgált szakaszon (azaz a sónak és az oldószernek megfelelő csúcsokat, melyek a kromatogram végén jelentkeznek, figyelmen kívül hagyjuk). A következő kifejezés alapján kiszámítjuk az r arányt:
A következő kifejezés alapján kiszámítjuk az f tényezőt:
ahol Mna = a CRS kalibrációs célra szánt kis molekulatömegű heparinhoz mellékelt CRS kísérőiratban feltüntetett átlagos relatív molekulatömeg (számtani átlag). Amennyiben az UV234 és az RI görbék illesztése helyes, az M relatív molekulatömeg minden ponton kiszámítható a következő kifejezésből: . Az így kapott, retenciós időket és relatív molekulatömegeket tartalmazó táblázat alapján, az adatokhoz megfelelő matematikai függvényt illesztve, kalibrálhatjuk a kromatográfiás rendszert.
Harmadfokú polinom használata ajánlott. Nyomatékosítanunk kell, hogy ilyen kalibráció esetén nem lehet nagyobb molekulatömegre extrapolálni. 25 µl vizsgálati oldatot injektálunk az oszlopra, és a kromatográfiás vizsgálatot a minta- és az oldószercsúcsok teljes eluálódásáig végezzük. Az átlagos molekulatömeget (tömeg szerinti átlag) a következő kifejezés alapján számítjuk:
ahol RIi = az i-dik frakcióban eluálódott anyag tömege, Mi = az i-dik frakcióhoz tartózó molekulatömeg. Bármely egyedi cikkellyel rendelkező kis molekulatömegű heparinnak meg kell felelnie a megfelelő cikkely „Azonosítás” részének C pontjában előírt követelményeknek. Amennyiben nincs a vizsgálandó kis molekulatömegű heparinra vonatkozó cikkely, az átlagos relatív molekulatömeg legfeljebb 8000 lehet, és a teljes tömeg legalább 60 százaléka 8000-nél kisebb relatív molekulatömegű molekulákból kell álljon. Továbbá, egy adott anyag molekulatömeg adatainak (átlagos molekulatömeg és megadott intervallumba eső lánctömegszázalék) meg kell felelniük a gyártó referenciaanyagának adatainak. D. A nátriumion a) pont szerinti azonossági reakcióját, illetve adott esetben a kalciumion azonossági reakcióját (2.3.1) elvégezve, az előírt változás észlelhető. VIZSGÁLATOK pH (2.2.3): 5,5–8,0. A vizsgálathoz 0,1 g anyagot R szén-dioxid mentes vízzel 10 ml-re oldunk. Nitrogén (2.5.9): 1,5–2,5% (szárított anyagra). Kalcium (2.5.11): 9,5–11,5% (szárított anyagra), amennyiben az anyag a Heparin-kalcium (0332) cikkelyben előírt követelményeknek megfelelő heparinból készült. 0,200 g anyagot vizsgálunk. Nátrium: 10,5–13,5% (szárított anyagra), amennyiben az anyag a Heparin-nátrium (0333) cikkelyben előírt követelményeknek megfelelő heparinból készült. Atomabszorpciós spektrometriás vizsgálatot végzünk (2.2.23, I .módszer). Vizsgálati oldat. 50 mg vizsgálandó anyagot R cézium-kloridot 1,27 mg/ml töménységben tartalmazó 0,1 M sósavval 100,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldatok. 25 ppm, 50 ppm és 75 ppm Na-ot tartalmazó összehasonlító oldatokat készítünk, úgy, hogy R nátrium–mértékoldatot (200 ppm Na) R cézium-kloridot 1,27 mg/ml töménységben tartalmazó 0,1 M sósavval megfelelő mértékben hígítunk. Fényforrás: nátrium vájtkatód lámpa. Hullámhossz: 330,3 nm. Atomizáló egység: megfelelő összetételű láng (pl. 11 liter levegő és 2 liter acetilén/perc). A szulfát és karboxilát ionok mólaránya (2.2.38): legalább 1,8. A titrálás során használt heparin-mintának ionos szennnyezőktől, különösen sóktól, mentesnek kell lennie.
A vizsgálandó anyagból 0,100 g-ot mérünk be, a higroszkóposságból adódó problémák elkerüléséhez szükséges szabályokat megtartva. A vizsgálandó anyagot kb. 20 ml, üvegkészüléken kétszer desztillált R vízben oldjuk. A 4 °C-ra hűtött oldat 2,0 ml-ét előhűtött (kb. 10×1 cm-es), R kationcserélő gyantával töltött oszlopra visszük. Az oszlopot kb. 10–15 ml, üvegkészüléken kétszer desztillált R vízzel a titráló lombikba mossuk (a titráló lombik pontosan akkora legyen, hogy elférjenek az elektródok, egy kis keverőrúd és egy 2 ml-es büretta kivezetőcsöve). Az oldatot mágneses keverővel kevertetjük. Az állandósult vezetőképesség értéket feljegyezzük, és az oldatot 0,05 M nátrium-hidroxid–mérőoldattal titráljuk; a mérőoldatot kb. 50 µl-enként adagoljuk. A bürettaállást és a vezetőképességet a végpont eléréséig minden mérőoldatrészlet hozzáadása után néhány másodperccel feljegyezzük. Minden mért értékhez kiszámítjuk a hozzáadott nátrium-hidroxid milliekvivalenseinek számát a mérőoldat térfogatából és az ismert nátrium-hidroxid koncentrációból. A kapott értékeket grafikonon úgy ábrázoljuk, hogy a vezetőképességet az y-tengelyen, a nátrium-hidroxid milliekvivalenseinek számát az x-tengelyen vesszük fel. A grafikonnak három, hozzávetőlegesen lineáris szakasza lesz: egy kezdeti, meredeken csökkenő, egy középső, lassan emelkedő, és egy utolsó, gyorsan emelkedő rész. Megbecsüljük az egyes szakaszokra legjobban illeszkedő egyeneseket. Az első és a második egyenes, illetve a második és a harmadik egyenes metszéspontjában merőlegest bocsátunk az x-tengelyre, és megbecsüljük a minta által felvett, milliekvivalensben kifejezett nátrium-hidroxid mennyiséget ezekben a pontokban. Az első és a második egyenes metszéspontja mutatja meg a szulfátcsoportok által felvett nátrium-hidroxid mennyiséget, míg a második és a harmadik egyenes metszéspontja jelzi a szulfát- és a karboxilát-csoportok által együttesen felvett nátrium-hidroxid mennyiségét. A kettő különbsége adja meg tehát a karboxilát-csoportok által felvett nátrium-hidroxid mennyiségét, milliekvivalensben kifejezve. Nehézfémek (2.4.8/C): legfeljebb 30 ppm. 0,5 g anyagot vizsgálunk. Az összehasonlító oldatot 3,0 ml R ólom–mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 10,0%. 1,000 ganyagot R foszfor(V)-oxid jelenlétében 60 °C-on, 670 Pa-t meg nem haladó nyomáson, 3 órán át szárítunk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 0,01 NE/ NE anti-Xa-aktivitás. A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag – abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására alkalmas eljárást – feleljen meg e vizsgálat követelményének is. Annak érdekében, hogy a készítmény megfeleljen a validációs kritériumoknak, kétértékű kationok hozzáadására lehet szükség. HATÓÉRTÉK-MEGHATÁROZÁS A kis molekulatömegű heparin véralvadásgátló aktivitását két in vitro eljárással határozzuk meg, ahol az antitrombin III Xa-faktorgátló, illetve trombin(IIa-faktor)-gátló hatásának gyorsítását mérjük (antiXa, illetve anti-IIa eljárás). Az anti-Xa-, illetve az anti-IIa-aktivitás Nemzetközi Egysége a kis molekulatömegű heparin Nemzetközi Standard meghatározott mennyiségének aktivitása. Összehasonlító készítményként BRP hatóérték-meghatározás céljára szánt kis molekulatömegű heparin készítményt használunk, amelynek Nemzetközi Egységben mért aktivitását a Nemzetközi Standarddal történő összehasonlítás alapján, az alábbi két módszerrel határozzuk meg. ANTI-XA-FAKTOR AKTIVITÁS Összehasonlító és vizsgálati oldatok A vizsgálandó anyagból és az összehasonlító kis molekulatömegű heparin készítményből négy független, egyenként négy tagból álló hígítási sort készítünk és az összehasonlító kis molekulatömegű heparin készítményből négy különálló, négy tagú hígítási sort készítünk R trometamol–nátrium-
klorid–tompítóoldattal (pH 7,4), úgy, hogy a koncentrációk a 0,025–0,2 NE anti-Xa-faktor/ml tartományba essenek, és a választott hígítások esetén a koncentrációk logaritmusa és a mért abszorbanciák között lineáris összefüggés legyen. Eljárás 16 csövet a következőképpen jelölünk meg: két-két csövet T1, T2, T3, T4 felirattal látunk el, a vizsgálati anyag hígításaihoz, két-két csövet pedig S1, S2, S3, S4 felirattal látunk el, az összehasonlító készítmény hígításaihoz. Minden csőbe 50 µl R1 antitrombin III–oldatot mérünk, és a vizsgálandó anyag, illetve az összehasonlító készítmény megfelelő hígításaiból 50–50 µl-t elegyítünk hozzá. Az oldatot rögtön az elegyítés után megkeverjük, ügyelve arra, hogy a buborékképződést elkerüljük. A csöveket S1, S2, S3, S4, T1, T2, T3, T4, T1, T2, T3, T4, S1, S2, S3, S4 sorrendben, a következő módon kezeljük: az oldatokat 1 percig 37 °C fokon melegítjük (vízfürdőben vagy száraz melegítő blokkban), majd mindegyikhez 100 µl R szarvasmarha Xa véralvadási faktor–oldatot adunk. Pontosan 1 perc inkubálást követően az egyes csövekbe 250 µl R1 kromofór szubsztrátumot mérünk. A reakciót pontosan 4 perc múlva, 375 µl R ecetsav hozzáadásával leállítjuk. Az elegyeket félmikroküvettába töltjük, és egy erre alkalmas készülékben megmérjük az abszorbanciát (2.2.25), 405 nm-en. A vak minta amidolitikus aktivitását a folyamat elején és végén is meghatározzuk, ehhez az összehasonlító, ill. a vizsgálati oldat helyett R trometamol–nátrium-klorid–tompítóoldatot (pH 7,4) használunk; a két üres mérés során kapott abszorbancia nem különbözhet szignifikáns mértékben egymástól. A log koncentráció–abszorbancia értékekből regressziót számolunk a vizsgálati anyag és az összehasonlító kis molekulatömegű heparin készítmény esetén, és a párhuzamos egyeneseknél használt szokásos statisztikai eljárásokkal kiszámítjuk a vizsgálandó anyag hatóértékét, anti-Xa-faktor Nemzetközi Egység/ml-ben. ANTI-IIA-FAKTOR AKTIVITÁS Összehasonlító és vizsgálati oldatok A vizsgálandó anyagból és az összehasonlító kis molekulatömegű heparin készítményből négy független, egyenként négy tagból álló hígítási sort készítünk és az összehasonlító kis molekulatömegű heparin készítményből négy különálló, négy tagú hígítási sort készítünk R trometamol–nátriumklorid–tompítóoldattal (pH 7,4), úgy, hogy a koncentrációk a 0,015–0,075 NE anti-IIa-faktor/ml tartományba essenek, és a választott hígítások esetén a koncentrációk logaritmusa és a mért abszorbanciák között lineáris összefüggés legyen. Eljárás 16 csövet a következőképpen jelölünk meg: két-két csövet T1, T2, T3, T4 felirattal látunk el, a vizsgálati anyag hígításaihoz, két-két csövet pedig S1, S2, S3, S4 felirattal látunk el, az összehasonlító készítmény hígításaihoz. Minden csőbe 50 µl R2 antitrombin III–oldatot mérünk, és a vizsgálandó anyag, illetve az összehasonlító készítmény egyes hígításaiból 50–50 µl-t elegyítünk hozzá. Elegyítés után az oldatokat megkeverjük, ügyelve arra, hogy a buborékképződést elkerüljük. A csöveket S1, S2, S3, S4, T1, T2, T3, T4, T1, T2, T3, T4, S1, S2, S3, S4 sorrendben, a következő módon kezeljük: az oldatokat 1 percig 37 °C fokon melegítjük (vízfürdőben vagy száraz melegítő blokkban), majd mindegyikhez 100 µl R humán trombin–oldatot adunk. Pontosan 1 perc inkubálást követően az egyes csövekbe 250 µl R2 kromofór szubsztrátumot mérünk. A reakciót pontosan 4 perc múlva, 375 µl R ecetsav hozzáadásával leállítjuk. Az elegyeket félmikroküvettába töltjük, és egy erre alkalmas készülékben megmérjük az abszorbanciát (2.2.25), 405 nm-en. A vak minta amidolitikus aktivitását a folyamat elején és végén is meghatározzuk; ehhez az összehasonlító, ill. a vizsgálati oldat helyett R trometamol–nátrium-klorid– tompítóoldatot (pH 7,4) használunk; a két üres mérés során kapott abszorbancia nem különbözhet szignifikáns mértékben egymástól. A log koncentráció–abszorbancia értékekből regressziót számolunk a vizsgálati anyag és az összehasonlító kis molekulatömegű heparin készítmény esetén, és a párhuzamos egyeneseknél használt szokásos statisztikai eljárásokkal kiszámítjuk a vizsgálandó anyag hatóértékét anti-IIa-faktor Nemzetközi Egység/ml-ben.
FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: −
– az anti-Xa-faktor aktivitás Nemzetközi Egység/milligrammban mért értékét,
−
– az anti-IIa-faktor aktivitás Nemzetközi Egység/milligrammban mért értékét,
−
– az átlagos molekulatömeget és az anyag meghatározott molekulatömeg tartományokba eső százalékos mennyiségét,
−
– adott esetben, hogy az anyag heparin-nátrium,
– adott esetben, hogy az anyag heparin-kalcium. ELTARTÁS Légmentesen záró, garanciazáras edényben. Ha a termék steril és bakteriális endotoxinoktól mentes, úgy steril, pirogénmentes edényben.
