HEMOREOLÓGIAI PARAMÉTEREK PROGNOSZTIKAI JELENTŐSÉGE ÉS MÉRÉSÜK MÓDSZERTANA
Ph.D. értekezés
Szerző: Dr. Kenyeres Péter
Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Kísérletes Kardiológia program
Programvezető: Prof. Dr. Tóth Kálmán Témavezetők: Prof. Dr. Tóth Kálmán Prof. Dr. Bogár Lajos Dr. Késmárky Gábor
Pécsi Tudományegyetem I. sz. Belgyógyászati Klinika Pécs
2010.
TARTALOMJEGYZÉK
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ......................................................................................... 4 I. A HEMATOKRIT-VÉRVISZKOZITÁS ARÁNY PROGNOSZTIKAI JELENTŐSÉGE ÉS FELHASZNÁLÁSA AZ OPTIMÁLIS HEMATOKRIT MEGÍTÉLÉSÉBEN 1. Bevezetés............................................................................................................ 5 2. Célkitűzések ....................................................................................................... 6 3. Az alacsony hematokrit-vérviszkozitás arány, mint rizikótényező a koszorúérbetegek halálozásában ......................................................................... 7 3.1. Betegek és módszerek ............................................................................... 7 3.2. Eredmények............................................................................................... 8 3.3. Diszkusszió................................................................................................ 11 4. Új módszer a hematokrit-vérviszkozitás arány és a virtuális optimális hematokrit meghatározására................................................................................ 13 4.1. Betegek...................................................................................................... 13 4.2. Módszerek és minták................................................................................. 14 4.3. Eredmények............................................................................................... 15 4.4. Diszkusszió................................................................................................ 17 4.5. Összefoglalás............................................................................................. 19 5. A virtuális és a globális optimális hematokrit kapcsolata akut koronária szindrómán átesett betegek esetén....................................................................... 20 5.1. Bevezetés................................................................................................... 20 5.2. Betegek és módszerek ............................................................................... 21 5.3. Eredmények és diszkusszió....................................................................... 21 5.4. Összefoglalás............................................................................................. 26 6. Összefoglalás...................................................................................................... 27
1
II. MÓDSZERTANI MEGFONTOLÁSOK A HEMOREOLÓGIAI PARAMÉTEREK MÉRÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE KAPCSÁN 7. A minta előkészítés hatása a hemoreológiai paraméterekre............................... 28 7.1. Bevezetés................................................................................................... 28 7.2. Módszerek és minták................................................................................. 29 7.2.1. Viszkozitás mérése........................................................................... 29 7.2.2. Vörösvérsejt deformabilitás mérése ................................................. 29 7.2.3. Vörösvérsejt aggregáció mérése....................................................... 30 7.2.4. Statisztikai analízis........................................................................... 31 7.3. Eredmények............................................................................................... 31 7.3.1. A teljes vér és plazmaviszkozitás változásai.................................... 31 7.3.2. A vörösvérsejt deformabilitás változásai ......................................... 32 7.3.3. A vörösvérsejt aggregáció változásai............................................... 34 7.4 Diszkusszió................................................................................................. 36 7.4.1. A vörösvérsejt deformabilitás változásai ......................................... 36 7.4.2. A vörösvérsejt aggregáció változásai............................................... 38 7.4.3. A teljes vér és plazmaviszkozitás változásai.................................... 39 7.5 Összefoglalás.............................................................................................. 40 8. Módszertani megfontolások ektacytometria kapcsán: Adatredukció.................... 42 8.1. Bevezetés................................................................................................... 42 8.2. Módszerek ................................................................................................. 43 8.3. Eredmények és diszkusszió....................................................................... 43 8.3.1. A Lineweaver-Burke illesztés .......................................................... 43 8.3.2. A Streekstra-Bronkhorst illesztés..................................................... 46 8.2.3. Általános megjegyzések................................................................... 49 8.3. Összefoglalás............................................................................................. 50 9. Módszertani megfontolások ektacytometria kapcsán: A közegviszkozitás szerepe.................................................................................................................... 51 9.1. Bevezetés................................................................................................... 51 9.2. Minták és módszerek................................................................................. 51 9.3.. Eredmények és diszkusszió...................................................................... 52
2
9.4. Összefoglalás............................................................................................. 56 10. Új eredmények .................................................................................................... 57 11. Köszönetnyilvánítás ............................................................................................ 58 12. Irodalomjegyzék.................................................................................................. 59 13. A szerző közleményei ......................................................................................... 66 13.1. Teljes közlemények................................................................................. 66 13.2. Előadáskivonatok .................................................................................... 68
3
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
PV
Plazmaviszkozitás
VV
Teljes vér viszkozitás
Htk
Hematokrit
Htkopt,v
Virtuális optimális hematokrit
Htk/VV
Hematokrit-vérviszkozitás arány
BMI
Testtömeg index
EI
Elongációs index
SS
Nyírófeszültség
PVP
Polivinilpirrolidon
AI
Aggregációs index
ηCasson
Casson-viszkozitás
τküszöb
Küszöbfeszültség
γ
Sebességgrádiens
4
I. A HEMATOKRIT-VÉRVISZKOZITÁS ARÁNY PROGNOSZTIKAI JELENTŐSÉGE ÉS FELHASZNÁLÁSA AZ OPTIMÁLIS HEMATOKRIT MEGÍTÉLÉSÉBEN
1. BEVEZETÉS
A fejlett országokban a szív- érrendszeri kórképek és szövődményeikből eredő megbetegedések vezetik a morbiditási és mortalitási statisztikákat. Ezen megbetegedések „klasszikus” rizikófaktorai, mint a cukorbetegség, a magasvérnyomás, a diszlipidémiák, a dohányzás vagy az elhízás, régóta ismertek. További vizsgálatok más tényezők szerepét is felvetették a betegségek kialakulásában. A hemoreológiai faktorok jelentőségére elsősorban az utóbbi két évtized kutatásai hívták fel a figyelmet. A hemoreológiai paraméterek a vér áramlási viszonyait, a vér elemeinek fizikai tulajdonságait jellemzik. Ezen tényezők romlása a mikrokeringés, a szövetek vérellátásának károsodásához, valamint a szívre háruló munka fokozódásához vezethetnek [1,2]. Számos tanulmány igazolta a hemoreológiai viszonyok romlását a „klasszikus” rizikófaktorok fennállása esetén is [1,3-5]. Az említett paramétereknek azonban nem csak közvetítő szerepe van, hanem multicentrikus tanulmányok szerint
ezen
túlmutatóan
független
rizikófaktorok
a
kardiovaszkuláris
betegségek
kialakulásában [6,7]. A legtöbb információ a hematokrit, a plazma- és a teljes vér viszkozitás, valamint a fibrinogén szerepével kapcsolatban áll rendelkezésre, a klinikumban is elsősorban ezen paraméterek használatosak. Anémia, azaz alacsony hematokrit esetén a vér nem tud megfelelő mennyiségű oxigént felvenni és szállítani, a hematokrit csökkenésével a szív eredetű halálozás nő [8]. A hematokrit emelkedésével az oxigénkötő kapacitás lineárisan, míg a vér viszkozitása exponenciálisan nő, és bár a vér oxigénben gazdagabb lesz, a megnövekedett áramlási ellenállás, a véráramlás lelassulása miatt az eredő oxigénellátás romlik [9]. A hemoreológia egyik sokat kutatott területe, hogy mely hematokrit tekinthető optimálisnak [10,11].
5
A vér oxigénszállító intenzitása a véráramlás intenzitásától és az oxigénszállító hemoglobin koncentrációjától függ. Előbbi a Hagen-Poiseuilles törvény alapján írható le, utóbbit praktikus okokból a hematokrit értékkel közelíthetjük. Amennyiben az áramlást jelemző geometriai paraméterek és az áramlást létrehozó nyomásgrádiens rögzítettek, az oxigénszállítás intenzitása a hematokrit-vérviszkozitás aránnyal (Htk/VV) jellemezhető [12].
Logikusnak tűnik, hogy ha a kardiovaszkuláris betegségek elsősorban a perfúzió károsodásával hozhatók összefüggésbe, akkor a Htk/VV egy erősebb prediktor lehet, mint a korábban vizsgált paraméterek. Mindazonáltal az irodalomban kevés tanulmány foglalkozik ezen paraméterrel. Munkám során a hematokrit-vérviszkozitás arány klinikai használhatóságát vizsgáltam.
2. CÉLKITŰZÉSEK
Tanulmányozni kívántuk, hogy a hematokrit-vérviszkozitás arány milyen összefüggést mutat a kardiovaszkuláris morbiditással és mortalitással. A hematokrit-vérviszkozitás görbe felvétele sok mérést igényel, a minta és az időigénye nagy. Egy olyan módszert kerestünk, mely révén az összefüggést a klinikum számára is használható módon, gyorsan, egyszerűen mérni lehet. Ezen belül a hematokrit-vérviszkozitás görbe maximumához tartozó virtuális optimális hematokrit érték meghatározását is célul tűztük ki. Tanulmányozni kívántuk, hogy az elméleti módon számított virtuális optimális hematokrit a klinikai betegek empirikus adataival milyen viszonyban áll.
6
3. AZ ALACSONY HEMATOKRIT-VÉRVISZKOZITÁS ARÁNY, MINT RIZIKÓTÉNYEZŐ A KOSZORÚÉRBETEGEK HALÁLOZÁSÁBAN
3.1. Betegek és módszerek: 1996.
októbere
és
1997.
novembere
között
109,
egyetemünkön
elektív
koronarográfiára utalt koszorúér-beteget vizsgáltunk. Az invazív vizsgálatot indikáló iránydiagnózist a klinikai panaszok, járószalagos terheléses teszt, 24 órás Holter EKG monitorozás, echokardiográfia és terheléses szívizomperfúziós scintigráfia eredményei alapján állították fel. Az eredeti tanulmány protokollját a Regionális Kutatásetikai Bizottság jóváhagyta, a betegek hozzájárultak a vizsgálathoz. Harmincegy beteg esetén (28%) a jelen tanulmány szempontjából elsődleges fontosságú paraméterek nem álltak rendelkezésre, ezért őket kihagytuk a 2006. februárjában végzett retrospektív utánkövetéses vizsgálatból. A koronarográfia elvégzésekor a következő kardiovaszkuláris rizikófaktorokat vizsgáltuk: dohányzónak tekintettük a beteget, ha az elmúlt 15 évben dohányzott; magasvérnyomást a beteg korábbi dokumentációja alapján vélelmeztünk; cukorbetegségről beszéltünk, ha a beteg orális antidiabetikus vagy inzulin terápiában részesült; korábbi szívinfarktus vélelmeztünk, ha a dokumentációban említették, vagy egyértelmű EKG jelei látszottak. Feljegyeztük a nemet, kort, testmagasságot, testtömeget és a testtömeg indexet (BMI). A vérmintákat a koronarográfiát megelőző héten könyökvénából vettük. A hematokritot és fibrinogént kapilláris centrifugával illetve nefelometriás eljárással határoztuk meg. A plazma (PV) és teljes vér viszkozitás (VV) mérése Hevimet 40 kapilláris viszkoziméterrel (Hemorex Kft, Budapest) történt 37,0±0,1 °C hőmérsékleten és 90 1/s nyírási sebességgrádiens mellett a vérvételtől számított 3 órán belül. A bal kamrai ejekciós frakciót és cardiac indexet echo- illetve impedancia-kardiográfiával (ASK Kft, Budapest) mértük. A koronarográfia femorális artériás behatolásból, standard Judkins módszer szerint történt, és nem történt sem tágítás, sem stent-beültetés. A fő ágak szűkületének súlyosságát 0tól 4-ig terjedő skálával jellemeztük, ezek összege képezte a koronarográfiás szkórt (maximum 12 pont) [31]. 2006. februárjában a helyi önkormányzati nyilvántartástól
7
megtudtuk az időközben elhunyt betegek nevét. Az életben maradt betegeket levélben megkérdeztük a szívproblémák miatti kórházi bennfekvések számáról. Az elhunytak halálokáról a betegek kezelőorvosától szereztünk információt. Az utánkövetés során szívbetegségben elhunyt betegeket (n=10) „C”, a nem szívbetegség miatt elhunytakat (n=2) és a túlélőket (n=66) együttesen „NC” csoportként jelöltük. A dichotom jellemzőknél Pearson khi-négyzet próbát, illetve szükség szerint Fischer egzakt tesztet, míg a folytonos változók analízisénél Student t-próbát használtunk. A paraméterek kardiális mortalitásra vonatkozó jóslóerejének megítéléséhez kiszámoltuk az egyes ROC-görbék (receiver operating characteristic) alatti területet (AUC). Valamennyi paraméternél alsó és felső félcsoportokba soroltuk a betegeket, és az egyes paraméterek túlélésre gyakorolt hatását Kaplan-Meier túlélésvizsgálattal elemeztük. A nem szív eredetű halálozást cenzoráltnak tekintettük. Lineáris kétváltozós korrelációvizsgálattal demonstráltuk az összefüggés szorosságát a paraméterek értéke és a koszorúér-betegség súlyossága között; ez utóbbit a szívproblémák miatti kórházi felvételek számával jellemeztük. A statisztikai elemzést az SPSS 11.0 programcsomaggal végeztük (SPSS®, Chicago, Ill., USA).
3.2. Eredmények: Az alcsoportok jellemzői és összehasonlításuk az 3.1. táblázatban láthatók. A „C” csoportba tartozó betegek átlagos életkora szignifikánsan magasabb, a triglicerid szintje és Htk/VV aránya alacsonyabb volt, mint az „NC” csoporté. A ROC görbék szerint a hagyományos paraméterek nem tudták előre jelezni a kardiális halálozást (3.1. táblázat), a Htk/VV arány viszont alkalmas volt erre. (AUC: 0,716, p=0,028, 3.1/a ábra) Legjobb határpontnak a 88,8 Pa-11/s Htk/VV arány tűnt (specificitás 70%, szenzitivitás 70%). A Kaplan-Meier analízis a felső és alsó félcsoport között csak a fibrinogén (p=0,03) és a Htk/VV arány (p=0,009) esetén talált szignifikáns különbséget (3.1/b ábra). Harmincnégy beteg válaszolt a hospitalizációt érintő kérdőívre. A vizsgált paraméterek (kor, BMI, triglicerid, Htk, PV, VV, Htk/VV arány, cardiac index, bal kamrai ejekciós frakció) közül egyik sem korrelált szignifikáns mértékben a kórházi bennfekvések számával, de a Htk/VV arány esetén egy nyilvánvalóan távol eső pont kizárása után ez elérte a szignifikancia határát (Pearson r: -0,377, p=0,03, 3.1/c ábra).
8
Teljes csoport „C” csoport „NC” csoport (n = 78)
(n = 10)
(n = 68)
Férfiak (%)
62
80
59
Életkor (év)
54.4 ± 8,7
62.3 ± 10,1
53.3 ± 8,9 *
Dohányzók (%)
51
30
54
Magasvérnyomás (%)
69
90
67
Diabetes (%)
29
40
27
Korábbi szívinfarktus (%)
61
80
58
Testtömeg index (kg m-2)
27,6 ± 3,6
27,7 ± 4,3
27,6 ± 3,5
Triglicerid (mmol l-1)
2,5 ± 1,6
1,8 ± 0,5
2,6 ± 1,6 *
Összkoleszterin (mmol l-1)
5,8 ± 1,3
5,8 ± 1,9
5,9 ± 1,2
HDL per LDL arány
0,31 ± 0,13
0,28 ± 0,08
0,32 ± 0,14
Hematokrit (%)
40,4 ± 4,0
40,6 ± 4,7
40,4 ± 3,9
Fibrinogén (g l-1)
3,2 ± 0,6
3,2 ± 0,4
3,2 ± 0,6
Vérviszkozitás (mPa s, 90 1/s-nél)
4,4 ± 0,7
4,7 ± 0,7
4,4 ± 0,6
Plazmaviszkozitás (mPa s)
1,3 ± 0,1
1,3 ± 0,1
1,3 ± 0,1
92 ± 9
87 ± 5
93 ± 9 *
Cardiac index (l min-1m-2)
2,6 ± 0,5
2,4 ± 0,4
2,6 ± 0,5
Bal kamrai ejekciós frakció (%)
50,9 ± 9,3
48,0 ± 10,6
51,5 ± 9,0
Hematokrit per vérviszkozitás arány (Pa-11/s)
3.1. táblázat: A 78 koszorúér-beteg klinikai jellemzői. Az adatokat átlag ± szórás formában adtuk meg; * = p < 0,05 a „C” (szívbetegség miatti halálozás) és „NC” (nem szív eredetű halálozás, vagy túlélő).
9
AUC
p érték
Testtömeg index
0,512
NS
Triglicerid
0,320
NS
Összkoleszterin
0,419
NS
HDL per LDL arány
0,566
NS
Hematokrit
0,502
NS
Fibrinogén
0,566
NS
Vérviszkozitás
0,621
NS
Plazmaviszkozitás
0,652
NS
Hematokrit per vérviszkozitás arány
0,716
0.028
Cardiac index
0,631
NS
Bal kamrai ejekciós frakció
0,615
NS
3.2. táblázat: ROC görbék alatti terület, a szíveredetű halálozás jóslásának megítélésére. AUC = az ROC görbe alatti terület
3.1. ábra: (a) A hematokrit per vérviszkozitás (Htk/VV) kardiális halálozást jósló erejének ábrázolása ROC görbén (AUC: 0,716, p = 0,028). (b) Kaplan-Meier túlélési görbék a Htk/VV arány szerint alsó és felső félcsoportba sorolt betegek esetén (p = 0,009). (c) Pontdiagram a Htk/VV arány és az utánkövetés során szívproblémák miatti kórházi felvételek száma közötti összefüggés ábrázolására (Pearson r: -0,377, p = 0,03).
10
3.3. Diszkusszió: A fibrinogén szint a plazmaviszkozitás legfontosabb meghatározója. Ezen paraméterek a hematokrit értékkel együtt alakítják a vérviszkozitást. Bizonyított, hogy a fibrinogén, a PV és a Htk független rizikófaktorai a koszorúér-betegek halálozásának, ellenben a belőlük származtatható VV-t nem sikerült azzal összefüggésbe hozni [13]. Ez magyarázható azzal is, hogy a széleskörű epidemiológiai tanulmányokban általában a PV-t és nem a VV-t vizsgálják, mivel a VV mérése nehézkesebb (a teljes vér nem fagyasztható károsodás nélkül, így szűk időablak áll rendelkezésre a mintavételtől a mérés elvégzéséig, amely a központi laboratóriumot használó multicentrikus vizsgálatoknál logisztikai problémát jelent), és a mérés
körülményei
a
teljes
vér
nem
Newtoni
viselkedése
miatt
nehezebben
standardizálhatóak. Tudomásunk szerint a VV-t is figyelembe vevő hosszú távú utánkövetéses vizsgálat eddig nem is készült. A Htk/VV arány szerepével foglalkozó publikációt sem találtunk. Korábbi tanulmányunkban kimutattuk, hogy minél nagyobb a Htk/VV arány, annál nagyobb a vér reológiai oxigénszállító kapacitása. A Htk/VV arányt a Htk függvényében ábrázolva egészséges, Raynaud szindrómás és hiperlipidémiás járóbetegeknél is konkáv görbe adódott [13]. Hasonló összefüggést kimutattak más érbeteg csoportoknál is [10,12,15]. A fibrinogén szerepével kapcsolatban hasonló eredményre jutottunk, mint Woodward és mtsai. Ők 1238, a North Glasgow MONICA tanulmányban és a Scottish Heart Health Studyban résztvevő beteg adatait vizsgálták, és 1,78-szorosnak ítélték meg a fibrinogén szempontjából felső tercilisbe tartozók összhalálozási kockázatát az alsó terciliséhez képest [16].
Tanulmányunkban
mindazonáltal
nem
sikerült
igazolni
számos
klasszikus
kardiovaszkuláris rizikófaktor jósló értékét. Ennek egyik oka az lehet, hogy egy viszonylag súlyosan érintett betegcsoportot vizsgáltunk. Feltételezésünk szerint ezen atherogenesisben fontos rizikótényezők jobbára már az utánkövetés kezdete előtt kifejtették hatásukat, és a definitív coronaria stenosis létrehozása után későbbi befolyásuk már kevésbé volt jelentős. Ezenfelül a vizsgált paraméterek csak az adott pillanatot tükrözték, és nem volt tudomásunk sem
korábbi
abnormalitásokról,
melyeket
az
időközben
beállított
kezelés
már
maszkírozhatott, sem a paraméterek későbbi alakulásáról. Megjegyzendő, hogy a „C” és „NC” csoport értékei közötti különbségek a legtöbb rizikótényező esetén a várt tendenciát mutatták, és feltehetően a viszonylag kis mintaméret miatt nem érték el a szignifikancia határát. Hasonlóképp, a rizikótényezők és a hospitalizációk száma közötti összefüggés is a
11
várakozásoknak megfelelően alakult. Példaképp eredményeinkből is látszott a tendencia (külön nem ábrázolva), miszerint mind a magas (44% feletti) mind az alacsony (36% alatti) Htk-tal rendelkező betegeknél gyakrabban fordul elő kórházi felvétel, mint a köztes értékekkel rendelkezőknél [9]. Többváltozós lineáris regressziós analízissel egyik vizsgált paraméter sem bizonyult független rizikótényezőnek a hospitalizáció kérdésében. Ezen eredményt azonban fenntartásokkal kell kezelni. Egyrészt a minta elemszáma ehhez kicsi, ami hiányzó értékek miatt a statisztika szempontjából még tovább csökkent. Másrészt a paraméterek közt jelentős interferencia volt. Ilyen interferencia jól ismert például a BMI és a lipid paraméterek [17,18], a fibrinogén és a PV, a Htk és a VV, vagy a kor és a cardiac index között [19]. Egyéb, a vizsgálat értékét korlátozó tényezőkre is fel kell hívnunk a figyelmet. Több mint egy évtizede a koronarográfia hazánkban és régiónkban sokkal kevésbé hozzáférhető vizsgálat volt, mint manapság, így általában csak a legsúlyosabb eseteknél került elvégzésre. A vizsgált betegek több mint fele súlyos háromérbetegségben szenvedett (koronarográfiás szkór 11-12). Az eloszlás ennyire torz volta miatt nem is készítettünk olyan statisztikát, melyben a koronarográfiás szkór direkt változóként szerepelne. Amikor a túlélést vizsgáltuk, csak a szívbetegség miatti halálozást, mint kemény végpontot vettük figyelembe, és figyelmen kívül hagytunk olyan információkat, mint későbbi koronarográfia és stent-beültetés vagy revaszkularizációs műtét, jóllehet ezek valószínűleg szintén befolyásolták a túlélést. Végezetül annyi újdonságot állíthatunk, hogy a kedvezőtlen Htk/VV arány koszorúérbetegeknél magasabb kardiális halálozási kockázatot jelent. A Htk egy gyakran, a VV egy ritkán vizsgált paraméter ezen betegeknél. A kockázat megítélésénél célszerű lenne a kettő hányadosát is figyelembe venni. Az elgondolás igazolásához a jövőben nagyobb elemszámú és prospektív utánkövetéses vizsgálatokra lesz szükség.
12
4. ÚJ MÓDSZER A HEMATOKRIT-VÉRVISZKOZITÁS ARÁNY, ÉS A VIRTUÁLIS OPTIMÁLIS HEMATOKRIT MEGHATÁROZÁSÁRA
Az előző tanulmányban kimutattuk, hogy a hematokrit-vérviszkozitás arány alkalmas lehet a kardiális mortalitás és morbiditás előrejelzésére, e tekintetben a „minél magasabb, annál jobb” üzenet fogalmazható meg [20]. Nem tisztázott azonban, hogy ez a „minél magasabb” mekkora értéket jelent, és miként érhető el. 4.1. Bevezetés: A hematokrit és a vérviszkozitás között Mátrai szerint exponenciális kapcsolat áll fenn [21], így a hematokrit és a hematokrit-vérviszkozitás arány közötti összefüggés egy x/ex típusú függvénnyel jellemezhető. Az említett függvény x>0 tartományban konkáv módon nő, elér egy maximumot, majd konkáv módon csökken. Később egy inflexiós pontot követően konvex módon 0-hoz konvergál. Ezzel analóg módon alacsony hematokritnál az oxigénszállítás intenzitását jelző Htk/VV alacsony, a hematokrit emelésével nő, egy határon túl emelve azonban ismét csökkenni kezd. A lokális maximum értéke mutatja az elérhető maximális oxigénszállítási intenzitást, melyet az optimális hematokrit révén érhetünk el. Mint azt a későbbiekben részletezzük, ez az érték nem azonos a klinikai szempontból optimális hematokrittal, ezért a különbözőséget hangsúlyozandó, a továbbiakban virtuális optimális hematokritnak (Htkopt,v) nevezzük. A vér alakos elemek plazmában való szuszpenziója, így viszkozitását a szuszpendáló közeg viszkozitása is alapvetően befolyásolja. A vér nem Newtoni folyadék, így viszkozitása függ a sebességgrádienstől. Alacsony sebességgrádiensnél a viszkozitás meredeken nő, ennek hátterében elsősorban vörösvérsejt aggregátumok képződése áll. Magas sebességgrádiensek felé a viszkozitásgörbe egy határértékhez tart, melynek fontos meghatározója a vörösvérsejtek deformálhatósága [22]. Munkacsoportunk a klinikai rutinban a 90 1/s sebességgrádiensnél mért viszkozitásértéket alkalmazza, ahol az említett faktorok hatása kiegyensúlyozottnak tekinthető; a korábbi tanulmányban is ezen értéket használtuk. A Htk/VV görbék lefutása és a
13
Htkopt,v-k értelemszerűen szintén függenek az alkalmazott sebességgrádienstől. A különböző sebességgrádiensen felvett görbéket nevezzük Htk/VV profilnak. Célunk a Htk/VV profil felvételére, a Htkopt,v meghatározására alkalmas mérési módszer kidolgozása volt. 4.2. Módszerek és minták: Méréseinkhez 7 egészséges önkéntes 30 ml heparinnal antikoagulált teljes vérét használtunk. A hematokritot kapilláris centrifugával határoztuk meg. A plazma és teljes vér viszkozitás méréséhez Hevimet 40 (Hemorex Kft, Budapest) kapilláris viszkozimétert használtunk [32]. A berendezésben egy vízszintes kapilláris spirál csatlakozik egy függőleges mérőcsőhöz. A rendszer feltöltése után a mintát a hidrosztatikai nyomáskülönbség hajtja át a kapillárison. A folyadékszint süllyedésével a hidrosztatikai nyomás, így az áramlás sebessége is folyamatosan csökken. A mérőcsőben lefolyó folyadék pozíciója optoelektronikusan detektálható. A sebesség és a kapilláris geometriai adatainak ismeretében a folyadékra ható nyíróerők és a sebességgrádiens, valamint a látszólagos viszkozitás számítható. A felvett sebességgrádiens-viszkozitás pontokra a Casson-formula segítségében görbe illeszthető, és a viszkozitás tetszőleges sebességgrádiensen kiszámítható. A mérések relatív hibáját az eszköz gyártója 3%-nak adja meg. A mérések 37 °C-on történtek a mintavételtől számított 2 órán belül. A vérmintából félretettünk egy 3 ml-es kontroll frakciót, majd a többit 2500 g-n 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó plazma kb. ¾ részét leszívtuk és félretettük. A maradékot összekevertük és hematokritot határoztunk meg, mely így 75-85%-nak adódott. A magas hematokritú törzsszuszpenzióból és a plazmából az alábbi keverés szerint 3 ml-es 10, 25, 40, 55 és 70% hematokritra beállított frakciókat hoztunk létre: Törzsszuszpenzió:
3 ml x (Htkkívánt/Htktörzs)
Plazma:
3 ml x (1 - Htkkívánt/Htktörzs)
A kontroll és a beállított frakciók, valamint a plazma viszkozitását a fent részletezett metódussal megmértük. A hematokritot minden esetben ellenőriztük.
14
A
kontroll
frakció
paramétereiből
a
Mátrai-összefüggés
felhasználásával
származtattuk a 10, 25, 40, 55 és 70% hematokritnál várt viszkozitást. A kontroll frakció viszkozitása tetszőleges sebességgrádiensen a Casson formulával számítható. Ezen értékből az alábbi képlet szerint az aktuális sebességgrádiensen tetszőleges hematokritnál kalkulálható.
4.3. Eredmények: Az 4.1/a ábrán a különböző sebességgrádiensek melletti teljes vér viszkozitást tüntettük fel a hematokrit függvényében. A folytonos vonal a beállított frakciók megmért viszkozitásait, a szaggatott vonal a kontroll frakcióból számított viszkozitásokat jelöli. Az ábra
egy reprezentatív minta
eredményeit
mutatja.
A
4.1/b ábrán a
kalkulált
viszkozitásértékek mért értékektől való relatív eltérését és ennek 95%-os konfidencia intervallumát tüntettük fel különböző sebességgrádienseken. Ha a konfidencia intervallum nem tartalmazza a 0 értéket, akkor p<0,05 szignifikancia szint mellett a különbség szignifikáns. A 4.2/a és a 4.2/b ábrán a fentiekkel analóg módon a Htk/VV és Htk közötti összefüggéseket tüntettük fel. A 70% hematokritú frakciónál a kalkulált viszkozitás szignifikánsan alatta marad a mértnek 50 1/s vagy ennél nagyobb sebességgrádienseken. A tendencia már 30 1/s-nál is megfigyelhető. A 10 1/s-on mért és számított viszkozitásértékek közötti eltérés ugyan nem szignifikáns, de a szórása bármely hematokrit esetén nagyon magas. Ez a jelenség enyhébb mértékben a 30 1/s-hoz tartozó értékeknél is megfigyelhető. Más sebességgrádienseken és hematokritok mellett a két módszer által adott értékek nem térnek el egymástól szignifikánsan, és a relatív eltérés 95%-os konfidencia intervalluma is ±10%-on belül marad. A Htk/VV esetén ugyanezen eredmények érvényesek ellentétes előjellel.
15
(a)
(b)
4.1.ábra: (a) A teljes vér viszkozitás alakulása a hematokrit függvényében különböző sebességgrádiensek mellett. A folytonos vonal a mért, a szaggatott vonal a Mátrai formulával számított értékeket jelöli. (b) A számított viszkozitásértékek relatív eltérése a mértektől.
(a)
(b)
4.2.ábra: (a) A Htk/VV alakulása a hematokrit függvényében különböző sebességgrádiensek mellett. A folytonos vonal a mért, a szaggatott vonal a Mátrai formula alapján számított értékeket jelöli. (b) A számított HtK/VV értékek relatív eltérése a mértektől.
16
4.4. Diszkusszió: A kapilláris viszkoziméterben a folyadék áramlását a hidrosztatikai nyomáskülönbség biztosítja, mely bármely minta esetén hasonló tartományban mozog. Magasabb viszkozitású folyadékot ugyanezen erő lassabb áramlásra bír, azaz a mért sebességgrádiens tartomány alacsonyabb lesz, mint egy alacsony viszkozitású, gyorsabban mozgó mintánál. A Casson egyenlet következtében „alacsony” sebességgrádienseknél a sebességgrádiens csökkenésével párhuzamosan a viszkozitás meredeken nő, míg „magasabb” sebességgrádienseken a Casson viszkozitáshoz való aszimptotikus konvergencia figyelhető meg. Az „alacsony” és „magasabb” kifejezések számszerű értéke erősen függ a mintát jellemző küszöbfeszültség értéktől. Általánosságban az volt látható, hogy a 70% hematokritú mintáknál a tényleges mérési tartomány 10-100 1/s környékére esett, amely a Casson görbe meredek szárát jelentette. Az itt elhelyezkedő pontok sztochasztikus hibával terheltek, a Casson görbe csak valamekkora
bizonytalansággal
illeszthető
rájuk.
A
magas
sebességgrádiensek
extrapolációjakor és az aszimptota számításakor ez a bizonytalanság halmozottan jelenik meg. Hasonlóképpen, ha a mért pontok döntően a lapos, aszimptotikus szárra esnek (pl. 40% Htk, kb. 40-240 1/s mérési tartomány), akkor az alacsony sebességgrádiensekhez tartozó meredek szár extrapolációja lesz hibákkal terhelt. A Casson egyenlet két konstanst (küszöbfeszültség és Casson-viszkozitás) tartalmaz. Bizonyított, hogy egyetlen konstans-párt használva a Casson egyenlet segítségével nem lehetséges a teljes sebességgrádiens tartományon jól leírni a teljes vér viszkozitást, azonban több szűkebb sebességgrádiens tartományhoz rendelt konstans-párokkal már jó illeszkedés biztosítható [23]. Viszkoziméterünk az említett korlátok miatt csak egyetlen, változó sebességgrádiens tartományban képes mérni, és egy konstans-párt ad meg, az extrapolációt ennek segítségével végzi. Az eredményekben ismertetett magas hematokrit mellett fellépő deviáció, illetve az alacsony sebességgrádienseknél megnövekedő pontatlanság részben magyarázható azzal, hogy a berendezés ezen szélsőséges viszonyok mellett jelentős extrapolációs hibával dolgozik. Rotációs viszkoziméter alkalmazásával, ahol az alkalmazott sebességgrádiens jobban kézben tartható, ezen hibák feltehetőleg alacsonyabbak lennének [60]. A
sebességgrádiens-vérviszkozitás
összefüggés
leírása
a
Quemada
egyenlet
segítségével is lehetséges [23], és a Casson egyenletnél sokkal szélesebb sebességgrádiens
17
tartományban alkalmazható. Az egyenlet konstansainak meghatározásához azonban a kísérleti beállítás és a mérőeszközünk alkalmatlan, ezért használatától eltekintettünk. A sebességgrádiens és vérviszkozitás kapcsolatát befolyásolja többek között a vérsejtek nyírással párhuzamosan változó aggregációja és alakfaktora, vagy a vérsejtek belső viszkozitásának és a szuszpendáló plazma viszkozitásának aránya [24,25]. Ezt a soktényezős összefüggést nem lehet egyetlen exponenciális függvénnyel pontosan leírni. A kalkulált és mért értékek két ponton (a kontroll frakció hematokritján, és a 0% hematokriton) megegyeznek, ezektől távolodva fokozódó mértékben eltérnek egymástól. Nem meglepő tehát, hogy a kontroll hematokrithoz (43,7±2,9%) legközelebb eső 40%-os hematokritú frakciók egyezése volt a legjobb, a legtávolabbi 70%-os hematokritúaké a legrosszabb. A 50 1/s vagy annál nagyobb sebességgrádienseken és 55% vagy kisebb hematokritokon a két módszer különbsége 95%-os valószínűséggel ±10%-on belül van. Ez statisztikailag nem szignifikáns. Ekkora pontatlanság valószínűleg biológiai értelemben sem számottevő. Bár az 55-70% között már nem vettünk föl több lépcsőt, az ábrák alapján a 60% hematokrit még valószínűleg belefér a „biztonságos” tartományba. 10%-nál kisebb vagy 60%-nál nagyobb hematokritú minták mérésére igen ritkán van szükség; ilyen esetekben pedig nemcsak a származtatás, de a fenti megfontolásból a hagyományos mérés sem tekinthető elegendően pontosnak. Hasonló mondható el az igen alacsony 10 1/s sebességgrádiensekre vonatkozó értékekről is. A klinikailag releváns hematokrit és sebességgrádiens tartományban a két módszer által adott eredmények kielégítő egyezést mutatnak. Méréssel csak a Htk/VV görbe előzetesen definiált hematokritokhoz tartozó pontjait tudjuk felvenni. Az optimális hematokritot ezzel a módszerrel nem lehet eltalálni, csak megbecsülni, melyik két előre definiált hematokrit között várható. A frakciók hematokritjának beállítása időigényes. A görbe finomítása a frakciók számának növelésével lehetséges, ez azonban a vér- és időigény arányos növekedésével jár. Ezzel szemben a kalkulációs módszerrel a teljes Htk/VV profil származtatható egyetlen mérésből. Nem igényel mintaelőkészítést, a hematokrit beállítását; a vér- és időigény lényegesen kisebb. A hematokrit, plazma- és teljes vér viszkozitás eredmények, amiket a rutin klinikai mérések során kaptunk, alkalmasak a Htk/VV profil felvázolására is. Ez lehetőséget teremt a korábbi adatok új szempont szerinti retrospektív feldolgozására. A kalkulációs módszer hátránya, hogy a Htk/VV görbe egyetlen mérés pontosságától függ. Míg a mért
18
Htk/VV görbénél a különböző frakciók viszonyítási alapul szolgálnak egymás helyességét illetően, a számított görbénél ez a belső kontroll hiányzik. A Htk/VV értéket tetszőleges Htk mellett zárt képlet segítségével számíthatjuk. Differenciálszámítás segítségével a görbe maximumpontja meghatározható:
maximális, ha az első derivált értéke nulla:
(Htk0, VV0: a kiinduló vérminta hematokrit- és viszkozitás-értéke)
A Htk/VV görbe és az ebből származtatott optimális hematokrit csak kontrollált Hagen-Poiseuille áramlási viszonyok és előre definiált sebességgrádiens mellett értelmezhető in vitro paraméterek. Nem szabad összekevernünk a holisztikus (vagy legalábbis szituatív) szemléletet tükröző, klinikailag releváns in vivo optimális hematokrittal. A különbséget hangsúlyozandó, a bemutatott paramétert virtuális optimális hematokritnak (Htkopt,v) nevezzük. 4.5. Összefoglalás: A fent vázolt kalkulációs módszer alkalmas a Htk/VV profil felvételére egyetlen minta mérését követően. A klinikailag legfontosabb hematokrit és sebességgrádiens tartományban jó egyezést mutat az empirikus módszerrel, ám vér és időigénye lényegesen kisebb. Ezenfelül lehetőséget ad retrospektív adatfeldolgozásra, és a virtulális optimális hematokrit kiszámítására.
19
5. A VIRTUÁLIS ÉS A GLOBÁLIS OPTIMÁLIS HEMATOKRIT KAPCSOLATA AKUT KORONÁRIA SZINDRÓMÁN ÁTESETT BETEGEK ESETÉN
5.1. Bevezetés: A hematokrit-vérviszkozitás arány (Htk/VV) az oxigénszállítás intenzitására utal, mely maximális értékét az optimális hematokrit mellett veszi fel. A fentiek csak kontrollált Hagen-Poiseuille áramlás mellett érvényesek, a görbe és az optimális hematokrit pedig függ az áramlást jellemző sebességgrádienstől. Az in vitro jelleget hangsúlyozandó, a továbbiakban virtuális optimális hematokritként (Htkopt,v) hivatkozunk a paraméterre. Klinikailag az optimális hematokritot (globális optimális hematokrit) nehezebb meghatározni. Jelentheti ez a minél alacsonyabb mortalitást, a legjobb életminőséget, utalhat a sportteljesítmény maximalizálására, vagy éppen előnyben részesíthetjük egy kritikus vérellátású terület minél jobb perfúzióját. Bármely megközelítést vesszük is alapul, a vér áramlását egy komplex in vivo rendszerben vizsgáljuk, ahol a Hagen-Poiseuille áramlás feltételei nem teljesülnek, és a sebességgrádiensek dinamikusan változnak. Ilyen körülmények között a Htk/VV modell érvényessége korlátozott, de valamilyen relevanciával mégis rendelkezik. Korábbi tanulmányunk szerint a hematokrit-vérviszkozitás arány hasznos lehet a kardiális mortalitás és morbiditás előrejelzésében is [20]. Az érpálya olyan elemi érszakaszok hálózatából áll, melyekre a Hagen-Poiseuille törvény jó közelítéssel alkalmazható, és a globális hemodinamikai viszonyokat ezen szakaszok áramlási viszonyainak eredője alakítja ki. Analóg módon feltételezhetjük, hogy a globális optimális hematokritot is az egyes érszakaszokat jellemző virtuális optimális hematokritok határozzák meg. Tanulmányunkban a globális és a virtuális optimális hematokritok közötti kapcsolatot vizsgáltuk.
20
5.2. Betegek és módszerek: Retrospektív vizsgálatunkban 122 akut iszkémiás koronária szindrómán átesett beteg adatait használtuk fel (férfi 57%, átlag életkor: 50±12 év) [26]. A betegeknél hemoreológiai vizsgálatok történtek a kórházba kerülés napján, 2 és 6 nappal később, valamint a 6 és 12 hónapos kontroll vizsgálat kapcsán. Ennek során kapilláris centrifugával meghatároztuk a hematokritot, valamint Hevimet 40 kapilláris viszkoziméterrel a plazma és teljes vér viszkozitást. A mérések heparinnal antikoagulált vérmintából történtek a mintavételtől számított 2 órán belül. A viszkozitások mérése 37 °C-on történt. A virtuális optimális hematokrit számítása az alábbiak szerint történt.
ahol
Htk0
a
beteg
vérmintájának
hematokritja
(empirikus
hematokrit),
PV
a
plazmaviszkozitás, VV0 a teljes vér viszkozitás. A VV a Casson egyenlet segítségével határozható meg a kívánt γ sebességgrádiensen (ηCasson: Casson féle viszkozitás, τküszöb: küszöbfeszültség)
5.3. Eredmények és diszkusszió: Míg a virtuális optimális hematokrit jól definiálható fogalom, számítása viszonylag egyszerű és egzakt folyamat, a globális optimális hematokrit meghatározása lényegesen bonyolultabb. A bevezetésben taglaltak szerint már az is nézőpont kérdése, hogy mit tekintünk optimálisnak. Ezeknek objektív mérése hosszas utánkövetést és retrospektív elemzést, vagy speciális kísérleti beállítást és invazivitást igényelne. Tanulmányunkban erre nem volt lehetőség, ehelyett a következő feltételezést alkalmaztuk: A vérképzés legfontosabb regulátora az erythropoetin szint, melynek szintézisét a szöveti (elsősorban a renális) oxigén nyomás szabályozza [27]. A szabályozás célja, hogy a szervezet a legjobb oxigén-ellátást érje el. Ha a szabályozás ilyen tisztán, zavartalanul és tökéletesen működne, feltételezhetnénk, hogy a hematokrit az optimális szinten áll. A valóságban ezt a szabályozási kört számos külső és belső tényező befolyásolja, azonban továbbra is
21
feltételezhető, hogy az empirikus és a globális optimális hematokrit közt szoros kapcsolat áll fenn. Tanulmányunkban jobb lehetőség híján a globális optimális hematokritot az empirikus hematokritnak feleltettük meg. Az 5.1. táblázat a globális optimális hematokrit és a különböző sebességgrádienseken mért
virtuális
optimális
hematokritok
közötti
korrelációt
mutatja.
A
magas
sebességgrádiensekhez tartozó korrelációk erősebbek. A keringési rendszert számos különböző sebességgrádienssel jellemezhető érszakasz alkotja. Ezekben ugyanannak a vérnek kell folynia, habár a virtuális optimális hematokrituk eltérő lenne. A globális optimális hematokrit ezek kompromisszumaként jön létre. Feltehetőleg ebben azon érszakaszok súlya a nagyobb, melyek a hemodinamikailag is nagyobb jelentőséggel bírnak, azaz a legnagyobb rezisztenciát
jelentő
arterioláké
és
kapillárisoké.
Az
említett
érszakaszokon
a
sebességgrádiens a párszáz-párezer 1/s tartományba tehető. A legerősebb korrelációkat éppen itt találtuk. Sebességgradiens 10 1/s 20 1/s 30 1/s 40 1/s 50 1/s 60 1/s 70 1/s 80 1/s 90 1/s 100 1/s 120 1/s 140 1/s 160 1/s 180 1/s 200 1/s 250 1/s 300 1/s 350 1/s 400 1/s 450 1/s 500 1/s 600 1/s 700 1/s 800 1/s 900 1/s 1000 1/s 2000 1/s 3000 1/s végtelen
0.nap -0,122 -0,069 -0,038 0,006 0,037 0,075 0,097 0,125 0,152 0,171 0,208 0,230 0,254 0,272 0,291 0,331 0,355 0,371 0,382 0,393 0,398 0,408 0,412 0,414 0,416 0,416 0,429 0,431 0,451
Mintavétel ideje 2. nap 6. nap 6 hónap 0,183 -0,074 -0,387 0,196 -0,015 -0,345 0,221 0,033 -0,287 0,244 0,077 -0,230 0,261 0,122 -0,136 0,263 0,157 -0,067 0,272 0,179 -0,024 0,281 0,209 0,038 0,293 0,238 0,101 0,300 0,256 0,133 0,320 0,301 0,224 0,339 0,334 0,299 0,349 0,367 0,331 0,362 0,391 0,373 0,370 0,409 0,401 0,375 0,438 0,473 0,382 0,470 0,515 0,370 0,480 0,541 0,360 0,492 0,565 0,357 0,504 0,567 0,345 0,509 0,565 0,336 0,528 0,593 0,327 0,535 0,605 0,322 0,537 0,611 0,319 0,536 0,626 0,310 0,541 0,626 0,296 0,551 0,644 0,282 0,559 0,651 0,257 0,550 0,679
12 hónap -0,082 -0,001 0,086 0,173 0,228 0,297 0,310 0,325 0,371 0,373 0,394 0,436 0,441 0,432 0,451 0,435 0,442 0,466 0,475 0,488 0,503 0,504 0,510 0,510 0,511 0,508 0,526 0,526 0,561
5.1. táblázat: Különböző sebességgrádiensen vett virtuális optimális hematokritok korrelációja az empirikus hematokrittal. Spearman korrelációs együtthatók
N.S p<0,05 p<0,05, rs≤0,300 p<0,05, rs≤0,400 22
A hospitális időszakra vonatkozó korrelációk gyengébbnek tűnnek. Az akut iszkémiás koronária szindróma akut (0. napos) és szubakut (2. és 6. napos értékek) ellátása során a betegek infúziókat kaptak, mely hemodilúciót okoz. Az empirikus hematokrit és a homeosztázis által fenntartani kívánt globális optimális hematokrit közötti kapcsolat gyengül, így gyengülnek azon korrelációk is, melyek a két paraméter egyenlőségét használják ki. Az utánkövetéses időszakban (6 és 12 hónapos értékek) már nem történik zavaró külső behatás, a korrelációk erősebbek. Az 5.1. ábra az empirikus hematokrit és a virtuális optimális hematokritok alakulását mutatja az idő előrehaladtával. A magasabb sebességgrádiensekhez magasabb virtuális optimális hematokrit tartozik. Ennek oka a vér nem-Newtoni tulajdonságában keresendő. A vérviszkozitás a sebességgrádiens emelésével csökken, a Htkopt,v képlet nevezőjében szereplő ln(VV/PV) kifejezés értéke csökken, így a Htkopt,v nő. Megfigyelhető
a
terápia
hemodilúciós
hatása,
a
hospitális
időszak
alatti
hematokritcsökkenés. Érdekes módon a virtuális optimális hematokritok lényegében változatlanok maradnak. A virtuális optimális hematokritok változatlansága nem feltétlenül jelenti a globális optimális hematokrit változatlanságát. A hemodinamikai viszonyok, a sebességgrádiensek változása esetén a virtuális optimális hematokritok átsúlyozódnak, a kompromisszumos érték áthelyeződik. AICS-ben a perctérfogat csökkenése miatt keringési redisztribúció történik. A perifériák (izom, bőr) ellenállása fokozódik, hogy a vér nagyobb arányban az alacsonyabb ellenállású életfontosságú szervek irányába terelődjön, azok szükséges perfúzióját biztosítsa. Az „optimális” állapot eléréséhez a hemoreológiai viszonyok változásának is elsősorban nem az emelkedő sebességgrádiensű perifériák, hanem a centrális régiók perfúzióját kell szolgálnia. A betegek immobilizációja ugyancsak a perctérfogat csökkenéséhez vezet, emiatt csökken a vér áramlási sebessége és az átlagos sebességgrádiens is. A globális optimális hematokrit így valószínűleg inkább csökken. Az infúziók adásának elsődleges célja nem a hemoreológiai viszonyok javítása volt, hanem eszköz az intravénás gyógyszerek szervezetbe juttatására. A jobb kamrát is érintő infarktus esetén az intravaszkuláris volumen növelésével az előterhelés is nő, mely a perctérfogat fenntartását is segíti. Ez a perfúzió biztosításában nagyobb jelentőséggel bír, mint a hemoreológiai viszonyok optimalizálása.
23
5.1. ábra: Az empirikus hematokrit és
5.2. ábra: Az empirikus hematokrit és
különböző sebességgrádienseken vett
különböző sebességgrádienseken vett
virtuális optimális hematokritok alakulása a
virtuális optimális hematokritok
hospitális szakban és az utánkövetés során.
férfiakban és nőkben. (Átlag és 95% CI)
(Átlag és 95% CI)
Az 5.2. ábra a két nem empirikus és virtuális optimális hematokritjait hasonlítja össze. Régóta ismert, hogy a férfiak hematokritja magasabb, mint a nőké, melynek hátterében elsősorban a nők rendszeres, menstuáció kapcsán történő vérvesztését feltételezik. A virtuális optimális hematokritok tekintetében ezzel szemben nem találtunk szignifikáns különbséget. Elképzelhető, hogy a két nem között a globális optimális hematokrit tekintetében valóban nincs különbség, és az észlelt eltérés evolúciós maradvány. Filogenetikai megközelítés szerint a szervezet vértartalékot képez, felkészül az esetleges sérülések miatti vérveszteségek ellensúlyozására. Civilizált viszonyok közt, ahol ritka a vérvesztés, a tényleges hematokrit magasabb az optimálisnál. Az agresszívebb, és így sérülésre hajlamosabb hímeknél a fenti mechanizmus valószínűleg kifejezettebb. Másfelől lehet, hogy a férfiak globális optimális hematokritja azonos virtuális optimális hematokritok mellett is magasabb a nőkénél. Ha a férfiakban magasabb sebességgrádiensek dominálnak, akkor a globális opimális hematokrit is a magasabb sebességgrádienshez tartozó virtuális optimális hematokritok, azaz magasabb értékek felé tolódik.
24
Az 5.2. táblázat eredményei azt mutatják, hogy a betegek plazmaviszkozitása és a virtuális optimális hematokritok között szignifikáns pozitív korreláció áll fenn. A Htkopt,v=Htk/ln(VV/PV) képlet szerint ha PV nő, Htkopt,v csökken, így az említett korreláció szinte matematikai szükségszerűség, és nem jelenti, hogy az összefüggés biológiailag is helytálló. A Htkopt,v és az empirikus hematokrit közti pozitív korrelációra is tekinthetnénk hasonlóképp. Jelen kísérleti beállítás nem alkalmas az optimális hematokrit adekvát mérésére, és így a fenti korrelációk validálására.
Sebességgradiens 10 1/s 20 1/s 30 1/s 40 1/s 50 1/s 60 1/s 70 1/s 80 1/s 90 1/s 100 1/s 120 1/s 140 1/s 160 1/s 180 1/s 200 1/s 250 1/s 300 1/s 350 1/s 400 1/s 450 1/s 500 1/s 600 1/s 700 1/s 800 1/s 900 1/s 1000 1/s 2000 1/s 3000 1/s végtelen
0.nap 0,456 0,507 0,548 0,577 0,599 0,608 0,613 0,617 0,616 0,610 0,611 0,608 0,585 0,579 0,574 0,540 0,510 0,490 0,472 0,451 0,443 0,423 0,405 0,395 0,384 0,373 0,312 0,291 0,198
Mintavétel ideje 2. nap 6. nap 6 hónap 0,273 0,370 0,115 0,306 0,424 0,132 0,338 0,465 0,202 0,363 0,476 0,264 0,383 0,499 0,324 0,403 0,515 0,405 0,423 0,520 0,444 0,441 0,529 0,477 0,455 0,531 0,488 0,460 0,531 0,509 0,476 0,533 0,517 0,481 0,530 0,536 0,489 0,531 0,542 0,493 0,533 0,541 0,495 0,525 0,542 0,483 0,502 0,506 0,449 0,486 0,502 0,428 0,472 0,496 0,414 0,461 0,496 0,397 0,448 0,482 0,383 0,437 0,484 0,361 0,427 0,474 0,341 0,412 0,477 0,327 0,393 0,471 0,313 0,386 0,467 0,308 0,378 0,463 0,288 0,323 0,444 0,274 0,312 0,441 0,214 0,245 0,397
12 hónap 0,347 0,519 0,616 0,657 0,691 0,704 0,698 0,710 0,725 0,724 0,715 0,727 0,727 0,718 0,716 0,695 0,673 0,668 0,660 0,655 0,648 0,636 0,631 0,631 0,628 0,623 0,598 0,595 0,567
5.2. táblázat: Különböző sebességgrádiensen vett virtuális optimális hematokritok korrelációja a plazmaviszkozitással. Spearman korrelációs együtthatók
N.S p<0,05 p<0,05, rs≤0,450 p<0,05, rs≤0,600
25
Ha igaz az, hogy a magasabb plazmaviszkozitás mellett magasabb a virtuális optimális hematokrit, és a magasabb virtuális optimális hematokrit miatt magasabb lesz a globális optimális és az empirikus hematokrit, akkor azt várjuk, hogy magasabb plazmaviszkozitás magasabb empirikus hematokritot eredményez. Az 5.3. táblázat korrelációs eredményei ezt mutatják. A plazmaviszkozitás és empirikus hematokrit valódi mért, és nem származtatott paraméterek, a jelenség tőlünk függetlenül létezik. A vázolt teória magyarázatul szolgálhat erre, ám még így sem szükségszerűen helytálló. Lehet, hogy a plazmaviszkozitás és az empirikus hematokrit együttes változása mögött valamely közös ok (pl. dohányzás) áll, és a virtuális optimális hematokrit logikai kapcsoló szerepére nincs szükség. A teória megerősítéséhez vagy megcáfolásához újabb tanulmányokra van szükség.
Mintavétel ideje Spearman r
0.nap -0,002
2. nap 0,271 *
6. nap 0,267 *
6 hónap 0,172
12 hónap 0,398 *
5.3. táblázat: A plazmaviszkozitás korrelációja az empirikus hematokrittal (* p≤0,05)
5.4. Összefoglalás: A tanulmány eredményei szerint az egyszeri viszkozitás és hematokrit mérés segítségével számítható virtuális optimális hematokrit értékek összefüggést mutatnak a globális optimális hematokrittal. Az összefüggést a szervezet fizológiás vagy patológiás hemodinamikai viszonyai alapvetően meghatározzák, így az összefüggés alaposabb megismeréséhez ezen viszonyokat kell először felmérni.
26
6. ÖSSZEFOGLALÁS
A hematokrit-vérviszkozitás arány a vér oxigénszállító intenzitására utal, melynek romlása összefüggést mutat a kardiovaszkuláris betegségek kialakulásával. Tanulmányunkban megmutattuk, hogy a hematokrit-vérviszkozitás arány segítséget nyújthat a kardiális morbiditás és mortalitás előrejelzésében. Bemutattunk egy módszert, mellyel az egyénekben a fenti paraméter karakterisztikája egyszerűen és megbízhatón felrajzolható, és számítható a maximális oxigénszállító intenzitást adó virtuális optimális hematokrit. Bíztató eredményeket találtunk arra vonatkozóan, hogy a virtuális optimális hematokrit segítséget nyújthat a beteg globális optimális hematokritjának felmérésében, amennyiben lehetőség van a hemodinamikai viszonyok feltérképezésére.
27
II. MÓDSZERTANI MEGFONTOLÁSOK A HEMOREOLÓGIAI PARAMÉTEREK MÉRÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE KAPCSÁN
7. A MINTA ELŐKÉSZÍTÉS HATÁSA A HEMOREOLÓGIAI PARAMÉTEREKRE
7.1. Bevezetés: Modelljeinkben a természeti folyamatokat kontrollált körülmények között utánozzuk, egyszerűsítéseket alkalmazunk. A kapott eredmény óhatatlanul különbözni fog a valóságban tapasztalhatótól. Ha a különbséget okozó zavaró tényezőket megértjük és kiküszöböljük, a valóságot egyre jobban tükröző modelleket hozhatunk létre. A vérvétel és a minták feldolgozása gyakran eltérő helyen történik. A szállítás és a limitált feldolgozó kapacitás miatt a tényleges mérésig hosszabb-rövidebb idő telik el, ami alatt a vért eredeti környezetéből kiszakítva tárolják. Az afiziológiás körülmények között az alkotóelemek tulajdonságai megváltozhatnak, az ezeket leíró paraméterek hamis képet mutatnak az eredeti állapotról [28-30]. Tanulmányunkban választ kerestünk arra, hogy milyen időtartamú tárolás esetén hagyható még figyelmen kívül ez a zavaró tényező a hemoreológiai mérések kapcsán. Bizonyos mérésekhez a mintákat afiziológiás előkészítésen visszük keresztül. Gyakran szükséges centrifugálni, mely során a sejtekre perceken keresztül akár több ezer g-nek megfelelő gyorsulás hat. Vörösvérsejt filterabilitás vagy aggregabilitás1 méréséhez a sejteket többszöri mosás után a plazmától jelentősen eltérő összetételű közegben szuszpendáljuk. Tanulmányunkban az említett előkészítések hatását is vizsgáltuk.
1
Aggregáció: a sejtek összecsapzódásának mértéke az aktuális mintában Aggregabilitás: a sejtek összecsapzódásának mértéke standardizált kísérleti elrendezésben (átmosott sejtek szuszpendálása standard összetételű közegben standard hematokritra)
28
7.2. Módszerek és minták:
7.2.1. Viszkozitás mérése A plazma és teljes vér viszkozitás méréséhez Hevimet 40 (Hemorex Kft, Budapest) kapilláris viszkozimétert használtunk [31,32]. A mérések 37 °C-on történtek. A berendezésben egy vízszintes kapilláris spirál csatlakozik egy függőleges mérőcsőhöz. A rendszer feltöltése után a mintát a hidrosztatikai nyomáskülönbség hajtja át a kapillárison. A folyadékszint süllyedésével a hidrosztatikai nyomás, így az áramlás sebessége is folyamatosan csökken. A mérőcsőben lefolyó folyadék nívója optoelektronikusan detektálható. A sebesség és a kapilláris geometriai adatainak ismeretében a folyadékra ható nyíróerők és a sebességgrádiens, valamint a látszólagos viszkozitás kiszámítható. A felvett sebességgrádiens-viszkozitás pontokra a Casson-formula segítségében görbe illeszthető, és a viszkozitás tetszőleges sebességgrádiensen kiszámítható.
A mérés során 15 egészséges önkéntes heparinnal antikoagulált vérét használtuk, ezeket frakciókra osztottuk. A kontroll frakciót a vérvételtől számított fél órán belül megmértük. Más frakciókat 2, 4 és 6 óráig tároltunk szobahőmérsékleten, valamint 24 és 48 óráig 4ºC-on. A frakciók hematokrit értékét kapilláris hematokrit centrifugával határoztuk meg (Hereaus Instruments, Németország).
7.2.2. Vörösvérsejt deformabilitás mérése A vörösvérsejtek deformabilitását LORCA berendezéssel mértük. (Laser-assisted Optical Rotational Cell Analyzer, Mechatronics BV, Hollandia). A mintát 27 mPas viszkozitású polivinilpirrolidon (PVP) oldatban szuszpendáltuk kb. 0,2%-os hematokritra. A mintákat Couette-áramlásban 0,30-30 Pa nyírófeszültségnek tettük ki. A deformációról lézerdiffrakció alkotott képet. A deformáció számszerűsítése a diffrakciós képre legjobban illeszkedő ellipszis tengelyeiből képzett elongációs index (EI=(A-B)/(A+B)) segítségével történt.
29
A méréshez 20 egészséges önkéntes heparinnal antikoagulált vérét használtuk. A kontroll frakciókat a vérvételtől számított 20 percen belül megmértük. Más frakciókat 1, 2, 3 és 6 óráig tároltunk szobahőmérsékleten, valamint 1, 2 illetve 7 napig 4ºC-on. A centrifugálás okozta mechanikus stressz hatásának vizsgálatához a frakciókat 10 percig 2500 g mellett centrifugáltuk, ezután ismét felkevertük őket. Egyszeri, kétszeri és háromszori centrifugálás hatását vizsgáltuk. Harmincöt heparinnal antikoagulált vérmintánál vizsgáltuk a pufferes mosás hatását. A mintákat 2500 g-n 10 percig centrifugáltuk, a felülúszót és a határréteget eltávolítottuk, majd a vérsejteket foszfát pufferben (PBS) reszuszpendáltuk. A mosást három alkalommal végeztük el.
7.2.3. Vörösvérsejt aggregáció mérése A méréseket két műszerrel végeztük párhuzamosan: A
LORCA
a
vérmintát
Couette-áramlásban
500
1/s
sebességgrádiensen
diszaggregálja, majd a nyírás hirtelen megszűnik. A mintára bocsátott és onnan visszaverődő vörös lézerfény intenzitását regisztráljuk, ez a vörösvérsejtek aggregációjával párhuzamosan csökken. A 2 perc alatt elért intenzitáscsökkenésre, mint maximálisan elérhetőre tekintünk. Az aggregációs index (AI) a görbe első 10 másodperce alatti terület és ezen maximálisan elérhető intenzitáscsökkenés aránya. Küszöbgrádiensnek azt a legkisebb sebességgrádienset nevezzük, amely képes a diszaggregáció fenntartására. A Myrenne MA-1 aggregométer (Myrenne GmBH, Németország) a vérmintát kónuszlemez rendszerrel 600 1/s sebességgrádiensen diszaggregálja. M üzemmódban a nyírás hirtelen megszűnik, M1 üzemmódban 3 1/s-os lassú nyírás marad fenn. A berendezés a mintán átbocsátott infravörös fény intenzitását méri. Az aggregációs indexek a görbe első 10 másodperce alatti területet korrekció nélkül mutatják. A méréshez 21 egészséges önkéntes heparinnal antikoagulált vérét használtuk. A mérés előtt a frakciókat tízszeres mennyiségű levegővel 15 perces keveréssel oxigenizáltuk. A LORCA AI és küszöbgrádiens, valamint a Myrenne M és M1 indexeket vizsgáltuk. A kontroll frakciókat a vérvételtől számított 30 percen belül megmértük. Más frakciókat 2, 4 és 6 óráig tároltunk szobahőmérsékleten, valamint 1, 2 illetve 7 napig 4ºC-on. Annak megítélésére, hogy a vérsejtek átmeneti ülepedése hatással van-e a későbbi aggregációra, a 2,
30
4 és 6 óráig szobahőmérsékleten állva tárolt frakciókkal párhuzamosan másokat folyamatos keverés mellett inkubáltunk.
7.2.4. Statisztikai analízis A kísérletekben a paraméterek változását hasonlóan vizsgáltuk. Minden minta esetében a kezelt frakció értékéből kivontuk a kontroll frakció értékét, a különbséget egymintás t-próbával hasonlítottuk a 0-hoz. Az eredményt a különbségek átlagaként és ennek 95%-os konfidencia intervallumaként ábrázoltuk. Ha a konfidencia intervallum nem tartalmazza a 0-t, a különbség p<0,05 mellett szignifikánsnak tekinthető. Az analízishez és az ábrázoláshoz a Microsoft Excel és az SPSS 15.0 programokat használtuk. 7.3. Eredmények:
7.3.1. A teljes vér és plazmaviszkozitás változásai A vér szobahőmérsékleten való tárolásakor sem az alacsony (10 1/s), sem a közepes (90 1/s), sem a magas (240 1/s) sebességgrádiensen mért vérviszkozitás-értékek nem változtak szignifikánsan az első 6 óra szobahőmérsékleten való tárolás során. A Casson illesztés paraméterei, azaz a Casson-viszkozitás és a küszöbfeszültség, valamint a plazmaviszkozitás esetén sem mutatkozott szignifikáns eltérés (7.1. ábra). A változás konfidencia intervalluma a 10 1/s mellett mért vérviszkozitás és a Casson-viszkozitás esetén is mind abszolút, mind relatív értelemben igen széles volt, és hasonlót tapasztaltunk a küszöbfeszültségnél is. A 90 és 240 1/s melletti vérviszkozitás, valamint a plazmaviszkozitás változása szűk konfidencia intervallummal rendelkezik, az eltérések a berendezés pontatlanságával is magyarázhatóak, melyet a gyártó 3%-nak adott meg. A 4ºC-on való tárolásnál a 90 és 240 1/s melletti vérviszkozitás már 24 óra elteltével szignifikánsan magasabbnak mutatkozott. A 10 1/s melletti vérviszkozitásnál ez a tendencia csak 48 óra elteltével vált szignifikánssá, valószínűleg a paraméter jelentős szórása miatt. A plazmaviszkozitás 24 óra elteltével már jelentősen emelkedett. A Casson viszkozitás és a küszöbfeszültség ugyan nem változott szignifikánsan, de az igen széles konfidencia intervallum miatt ez a jelenség korlátozottan értékelendő. A kapilláris hematokrit a teljes kísérlet során változatlan maradt.
31
7.1. ábra: Hemoreológiai paraméterek relatív változása 2, 4 és 6 órás szobahőmérsékleten, illetve 24 és 48 órás 4ºC-on való tárolás után. (a) A 10, 90, 240 1/s sebességgrádiens mellett mért vérviszkozitás illetve a Casson-viszkozitás változása. (b) A küszöbfeszültség változása. (c) A plazmaviszkozitás változása. (* p<0.05, # p<0.01, † p<0.001)
7.3.2. A vörösvérsejt deformabilitás változásai Egyik nyírófeszültségen mért elongációs index sem változott szignifikánsan 1 illetve 2 óra szobahőmérsékleten való tárolás során. Három óra elteltével az 1,69 Pa és magasabb nyírófeszültségek mellett mért EI azonban már szignifikáns csökkenést mutatott. Hat óra elteltével a fenti eltérés még markánsabb lett, és már 0,95 Pa mellett is szignifikáns csökkenés látszott (7.2/a ábra). Egy nap 4ºC-on való tárolás nem okozott szignifikáns eltérést. Két nap után a következő látszott: az EI alacsony nyírófeszültségeken (9,49 Pa alatt) tendenciózusan
32
növekedett, míg magas nyírófeszültségeken (9,49 Pa felett) csökkent. Az egy hetes tárolás során ez a tendencia szignifikánssá erősödött (7.2/b ábra). A centrifugálás okozta mechanikus stressz még 3x10 perc után sem okozott kimutatható deformabilitás változást. Az ábrán szignifikánsnak tűnő eltérést első fajú hibának tekintjük, nem valódi változásnak (7.2/c ábra). A háromszori pufferes mosás hatására a 0,95 Pa-nál nagyobb nyírófeszültségeknél mért EI szignifikánsan csökkent (7.2/d ábra).
7.2. ábra: Az Elongációs Index változás a mintaelőkészítés során. (a) Az 1, 2 ,3 illetve 6 órás szobahőn való tárolás hatása. (b) Az 1, 2 és 7 napos 4ºC-on való tárolás hatása. (c) A 2500 gn való centrifugálás hatása. (d) A háromszori pufferes mosás hatása. (* p<0.05, # p<0.01, † p<0.001)
33
7.3.3. A vörösvérsejt aggregáció változásai A LORCA esetén sem az aggregációs index, sem a küszöbgrádiens nem mutatott szignifikáns változást 2, 4 vagy 6 óra szobahőmérsékleten való tárolás során. A minta állva hagyásának vagy folyamatos keverésének ténye sem okozott mérhető eltérést. 4ºC-on tárolva az AI kiszámíthatatlan ingadozása látszott: bár az átlagos változás nem volt szignifikáns, a variancia jelentősen megnőtt (7.3/a ábra). A küszöbgrádiens ezzel szemben szignifikánsan csökkent (7.3/b ábra). A Myrenne esetén mind az M, mind az M1 index jelentősen csökkent már 2 óra szobahőmérsékleten való tárolás után is, ez a későbbiekben még szembetűnőbbé vált. A folyamatosan kevert frakciókban az indexek tendenciózusan tovább csökkentek az álló frakciókhoz képest (7.3/c ábra). A LORCA AI és a Myrenne M index között nem találtunk korrelációt, míg az AI és M1 között mérsékelt korreláció állt fenn. A tárolás során azonban ez a korreláció gyengült, majd eltűnt (7.1. táblázat).
Paraméterek közötti korrelációs együtthatók Tárolás ideje AI – M
AI – M1
M – M1
Friss
-0,030
0,591 #
0,534 *
2 órás
-0,089
0,274
0,772 †
4 órás
-0,092
0,348
0,449 *
6 órás
-0,111
0,325
0,331
24 órás (4ºC)
-0,040
0,362
0,485 *
48 órás (4ºC)
-0,161
0,168
0,317
1 hetes (4ºC)
0,338
0,113
0,335
7.1. táblázat: LORCA aggregációs index (AI) illetve Myrenne M és M1 indexek közötti korrelációk változása a tárolás során (* p<0.05, # p<0.01, † p<0.001).
34
7.3. ábra: Aggregációs paraméterek változása 2, 4 és 6 órás szobahőmérsékleten, illetve 1, 2 és 7 napos 4ºC-on való tárolás során. A teli karikák az állva hagyott, az üres karikák a folyamatos keverés mellett tárolt mintákat jelölik. (a) A LORCA aggregációs index (AI) változása. (b) A LORCA küszöbgrádiens változása. (c) A Myrenne M index változása. (d) A Myrenne M1 index változása. (* p<0,05, # p<0,01, † p<0,001)
35
7.4. Diszkusszió
7.4.1. A vörösvérsejt deformáció változásai A vörösvérsejtek deformabilitását alapvetően három tényező határozza meg: a felülettérfogat arány, a sejt belső viszkozitása, valamint a membrán viszkoelasztikus tulajdonságai. A többi tényező változatlansága esetén a belső viszkozitás növekedése illetve a membrán merevségének fokozódása a deformabilitás csökkenéséhez, míg a felület-térfogat arány növekedése a deformabilitás javulásához vezet [24]. A tárolás során ez a három tényező nem izoláltan, hanem egyszerre, eltérő dinamikával változik. Az említett tényezők jelentősége valószínűleg eltérő különböző nyírófeszültségek esetén. Egy másik tanulmányunkban megmutattuk, hogy a szuszpendáló közeg viszkozitása szintén befolyásolja a deformációt, mivel azonban a méréseinkhez azonos viszkozitású médiumot használtunk, ezt a zavaró tényezőt kiküszöböltük. A mintákat mindig közvetlenül mérés előtt szuszpendáltuk, így valószínűtlen, hogy az eredményeket a minta és a szuszpendáló közeg közti interakciók jelentősen torzítanák. Számos tanulmány vizsgálta, miként változnak a vérbankban tárolt vér tulajdonságai, és mi ennek a molekuláris háttere. A rövidtávú tárolás kérdése jóval kevésbé kutatott. A tárolás során a vérsejtek energetikailag kimerülnek, a membrán Na-K-pumpa nem képes az iongrádiens fenntartására. A sejt a K/Cl kotranszporteren káliumot, és emiatt ozmotikusan vizet is veszít. Ez egyfelől a hemoglobin koncentrálódásához, a belső viszkozitás növekedéséhez, azaz a deformabilitás csökkenéséhez vezethet. Másfelől a zsugorodás miatt a felület-térfogat arány növekedése ezt ellensúlyozhatja. Hosszútávú 4ºC-on való tárolás során a sejtek duzzadását írták le, ám ha ezeket saját plazmájukban órákon át 37ºC-on inkubáljuk, káliumot veszítenek és zsugorodnak [34]. Németh és mtsai patkányok és beagle kutyák esetén nem igazolták az átlagos sejttérfogat (MCV) változását rövid távú tárolás során, míg a többnapos 4ºC-on való tárolás után inkább a sejtek duzzadása volt kimutatható [33]. A sejtek tárolás során glükózt metabolizálnak, és tejsavat termelnek. A savas környezet megváltoztathatja a membránfehérjéket, és fokozhatja a sejt rigiditását. Mivel a vér pufferkapacitása magas, jelentős pH változás nem valószínű, így ezen hatás jelentősége is vitatható.
36
A membrán összetétele szintén megváltozik a tárolás során. A felszín negatív töltöttsége csökken, valószínűleg a sziálsav eltávolítása miatt, mely 6 napos 4ºC-on való tárolás után már a rigiditás szignifikáns növekedését okozza [35-37]. A foszfolipidek átrendeződését és fázisszeparációját ugyancsak leírták 5 napos tárolás után [38]. Többhetes tárolás után fontos membrán és citoszkeletális proteinek is degradálódnak, a hemoglobin a sejtmembránhoz kötődik [39-41]. A membrán összetétel változása echinocyták képződéséhez [42] és foszfolipidekben gazdag, fehérjékben szegény vezikulák lehasadásához vezet [43]. A vörösvérsejtek immunogenitása szintén megváltozik, ez komplement faktor- és makrofágaktivációt okoz, ami szintén a membrán további károsodását és végül a sejt hemolízisét okozhatja [35]. Bár a fenti változásokat többnyire hetekig vagy hónapokig tárolt mintákban írták le, a sejtek degradálódása egy folyamatos jelenség, és a változások kisebb mértékben már néhány nap után is jelen lehetnek. A vérbankokban a tárolás során használt tartósító és állagjavító anyagok befolyásolhatják az eredményeket, artefaktokat képezhetnek, vagy megnyújthatják a változás időbeli lefutását. A lipid összetétel változása és a membrán-fluiditás növekedése [37] okozhatja, hogy a 7 napig tárolt minták alacsony nyírófeszültségeken jobban deformálódnak, míg a felszín csökkenése és a megnövekedett fehérje/lipid arány [44,45] a magas nyírófeszültségek melletti csökkent deformációért lehet felelős. Eredményeink hasonlóságot mutatnak azzal, amit Németh és mtsai állatoknál talált: a maximálisan elérhető deformáció és a maximális deformáció felének eléréséhez szükséges nyírófeszültség szintén csökkent [33]. Uyuklu és mtsai humán vér tárolása esetén hasonló eredményre jutottak, ők azonban szignifikáns eltérést csak 6-8 óra elteltével találtak [46]. Számos szerző írta le a hosszan (1-1,5 hónapig) tárolt sejtek deformabilitásának
vagy
filterabilitásának
csökkenését
[36,44,47,48],
jóllehet
ezen
méréseknél csak magas nyírófeszültségeket alkalmaztak. A fokozott mechanikus stressz a sejtek irreverzibilis károsodását okozza. Eredményeink szerint az általában használt centrifugálás nem éri el ezt a szintet, a mérési eredményt nem befolyásolja. A pufferes mosás során a mintákat szintén centrifugáljuk, ám a fentiek szerint ennek hatása elhanyagolható. Az eljárás során eltelt idő sem olyan hosszú, hogy a deformabilitás változást magyarázhassa. Ha a mosópuffer nem tökéletesen izoozmotikus a sejtekkel, némi duzzadás vagy zsugorodás előfordulhat. Kísérletileg kimutattuk azonban, hogy különböző ozmolaritású közegben előinkubált sejtek a végső ozmotikus ekvilibrium a méréséhez használt szuszpendáló közegtől függ, deformabilitásuk az előinkubációtól függetlenül azonos.
37
Sejtésünk szerint a mosással eltávolítjuk a plazmafehérjéket és a sejtmembránhoz lazán kötődő proteinek egy részét is, és ez a deformálhatóság csökkenését okozza. Eredményeinknek ellentmond az a tanulmány, amely a tárolt vér transzfúzió előtti átmosásakor további deformabilitás változást nem talált [49].
7.4.2. A vörösvérsejt aggregáció változásai A vörösvérsejt aggregátumok kialakulása a vonzó és taszító erők eredője. Utóbbit főként a negatívan töltött sejtfelszínek közötti elektrosztatikus taszítás okozza. Ahogy ez a töltés csökken a tárolás során [35,36], az aggregáció gyorsabb és erősebb lesz. Standard dextrán tartalmú pufferben tárolva a sejteket az aggregabilitás fokozódását írták le. Autológ plazmában ezzel szemben az aggregáció nem változott jelentősen, valószínűleg a fibrinogén párhuzamos lebomlása miatt [50]. Később, mikor nagy mennyiségben vannak jelen echinocyták, az aggregáció folyamata megváltozik, az aggregátumok stabilabbá válnak [51]. A leírtakkal ellentétben mi az aggregációt a tárolás során változatlannak, illetve csökkenőnek találtuk. Elképzelhető, hogy a fibrinogén lebomlása korábban megkezdődik, mint a sejtfelszín negatív töltésének csökkenése, de lehet, hogy a pH csökkenés miatti stomatocyta-képződés is szerepet játszik. Németh és mtsai hasonló eredményeket kaptak beagle kutyákban. Patkányoknál a kezdeti aggregáció csökkenést egy későbbi aggregáció növekedés követte [33]. Nagyobb testű élőlényeknél ez a folyamat valószínűleg lassabban zajlik le [52], és kísérletünkben embernél ennek csak az elejét észleltük. A LORCA és Myrenne közti korreláció meglepően gyengének adódott, jólehet mindkét módszer az első 10 másodperc közbeni fényerősség változást veszi alapul. A LORCA ezt az értéket korrigálja az aggregáció miatt egyáltalán lehetséges fényerősség változás mértékével. Az Aggregációs Indexet így valószínűleg kevésbé befolyásolják a minta kezdeti optikai sajátosságai, mint pl. változás a fényelnyelés spektrumában, a szabad hemoglobin, vagy a minta hematokritja. A LORCA 37°C-on mér, míg a Myrenne szobahőmérsékleten, márpedig a hőmérséklet befolyásolja az aggregációt és a deformabilitást is [38,53]. Ezen kívül a LORCA a visszavert, míg a Myrenne az áteresztett fény intenzitását rögzíti. A visszaverődés mértékét inkább a minta felszínén, míg a fény áteresztését inkább a minta belsejében elhelyezkedő sejtek tulajdonságai befolyásolják [54]. A visszavert fény intenzitásának időbeli lefutását gyorsabbnak írták le, mint az áteresztett fényét. A mintára
38
bocsátott fény nem csak visszaverődik vagy áthalad a mintán, de oldalra és előre is szóródhat, így a két módszer által észlelt intenzitásváltozás nem egyezik meg [55]. Meglepő, hogy az álló cilinderek mellett mért LORCA AI erősebb összefüggést mutatott a „lassú nyírású” üzemmód M1 indexével, mint a „nyírásmentes” üzemmóddal kapott M indexszel. 37°C-on a vörösvérsejtek Brown-mozgása kifejezettebb, mint szobahőmérsékleten, és lehet, hogy ez jobban hasonlít ahhoz az állapothoz, amikor a sejteket lassú mozgásban tartjuk. Kimutatták, hogy a tárolás miatti változások gyorsabban jönnek létre, ha a vörösvérsejteket hagyják kiülepedni, mintha rendszeresen felkeverik a plazmában [56]. Ennek oka valószínűleg a gyorsabb lokális glükóz fogyasztás és metabolitfelszaporodás a relatíve kisebb kompartmentben. Kísérletünkben a vér keverésével a változásokat későbbre vártuk volna, LORCA esetében ilyen tendencia látható volt, de a szignifikanciát nem érte el. A Myrenne-nél pont az ellenkezőjét tapasztaltuk: a kevert mintában a változások még kifejezettebbek voltak. A forgatás miatt a vörösvérsejtek többet érintkeznek a cső falával, és ez valószínűleg markánsabb hatást jelent, mint amit a megváltozott metabolikus környezet jelentene. Kísérletünkben polipropilén csöveket használtunk, más anyag, pl. üveg esetleg más eredményre vezethetett volna. Összességében a LORCA AI és küszöbgrádiens is megbízhatónak látszik még 6 órás szobahőmérsékleten való tárolás után is, míg a Myrenne M és M1 index már 2 óra elteltével is megváltozik. Egy napos 4°C-on való tárolás után sem használható az M és M1 index. A LORCA AI változásának konfidencia intervalluma egy napos 4°C-on való tárolás után jelentősen kiszélesedik. A nagy egyéni variabilitás miatt így az AI-t sem tekinthetjük megbízhatónak. A küszöbgrádiens szignifikáns csökkenése is a hosszú tárolás ellen szól. Uyuklu és mtsai mérései szerint ezzel szemben az M index stabil marad 4 órás szobahőmérsékleten, vagy 12 órás 4ºC-on való tárolás után is, és csak ezután látszott lassú csökkenés [46].
7.4.3. A teljes vér és plazmaviszkozitás változásai A teljes vér viszkozitás legfontosabb meghatározói: a plazmaviszkozitás, a hematokrit, a vörösvérsejt aggregáció és deformabilitás [57-59]. Kísérletünkben a hematokritot kapilláris centrifugával határoztuk meg, mert korábbi tapasztalatunk szerint ez jobban korrelál a teljes vér viszkozitással, mint a sejtanalizátor által meghatározott érték. A hematokritot 1% pontossággal tudtuk leolvasni. A kapilláris hematokrit rendszerint magasabb, mint a
39
sejtanalizátor hematokrit, mivel a centrifugálás során a vörösvérsejt-frakcióban a sejtek közé plazma is szorul [58]. A deformabilitás romlásával a jelenség egyre kifejezettebb lesz, a hematokrit virtuális növekedése látszik. A hemolízis a hematokritot csökkenti. Kísérletünkben a hematokritot változatlannak találtuk. Az deformabilitáscsökkenés és a hemolízis okozta hematokritváltozás vagy teljesen kiegyenlítette egymást, vagy még valószínűbb, hogy mindkét jelenség hatása olyan kisfokú, hogy az 1%-os pontossággal kimutathatatlan. A plazmaviszkozitást főként a szolubilis makromolekulák, különösképp a fibrinogén határozzák meg. Ezen molekulák degradációjával a plazmaviszkozitás csökkenését várnánk, nem a tapasztalt emelkedést. Elképzelhető, hogy a degradáció olyan konformációváltozással jár, mely a viszkozitás alakításában fontos szerepet játszik. A sejtekben bekövetkezett változás is hatással lehetett a plazmára: a vörösvérsejtek felszínéről vagy belsejéből kiszabadulhattak a viszkozitást növelő fehérjék. A sejtek duzzadása a plazmából vizet von el, azt koncentrálja; habár a kapilláris hematokrit változatlansága valószínűtlenné teszi, hogy jelentős átrendeződés lett volna a két folyadéktér között. Alacsony sebességgrádiensen a vörösvérsejt aggregáció igen számottevő, ez felelős a vér viszkozitásának jelentős részéért. Korábban éppen az alacsony nyírású viszkozimetriával jellemezték a vörösvérsejt aggregációt [58,60], mára a kifinomultabb módszerek mellett ez elavult. Magas sebességgrádiensen az aggregáció jelentősége kisebb, csak a tengelyáramban maradnak aggregátumok, a fal felé a nyíróerők ezeket szétzilálják. Ilyenkor a vörösvérsejtek deformabilitása a fontosabb tényező a viszkozitás alakításában [61]. Az alacsony sebességgrádiensen mért megnövekedett viszkozitás az aggregáció fokozódását sugallná. Ez egyezik más szerzők tapasztalataival [50], de ellentmond az optikai módszerrel mért eredményeinknek. A gyakorlatban a 90 1/s mellett mért teljes vér viszkozitást használjuk. Ezen sebességgrádiensen az aggregáció és a deformabilitás hatása is kifejezett, de nem zavaróan domináns. Másrészt a 90 1/s érték a mért pontokból interpolációval számítható, míg a 10 és 240 1/s-os értékek kevésbé pontos, extrapolált értékek. A Casson viszkozitás és a küszöbfeszültség függvényillesztéssel kapott, származtatott paraméterek. Ahogy várható, ezen paraméterek változása jóval szélesebb konfidencia intervallumot mutatott, közülük a 240 1/s melletti viszkozitás a legmegbízhatóbb. Alexy és mtsai. más berendezésssel mérve a vér viszkozitását 8 órás szobahőmérsékleten való tárolás mellett is stabilnak találták [62].
40
7.5. Összefoglalás A teljes vér és plazma viszkozitás 6 órás szobahőmérsékleten való tárolás után is stabilnak tekinthető. Az 1 napos 4°C-on való tárolás kerülendő. A vörösvérsejt deformabilitás 2 órás szobahőmérsékleten, vagy 1 napos 4°C-on való tárolás mellett nem változik szignifikánsan. Ennél hosszabb tárolás az eredményeket már befolyásolhatja. A centrifugálás a deformabilitást nem befolyásolja, a pufferes mosás viszont jelentősen megváltoztatja az eredményeket. A LORCA aggregációs index és küszöbgrádiens 6 órás szobahőmérsékleten való tárolás mellett is stabil, de 1 napos 4°C-os tárolás után már megbízhatatlan. A Myrenne M és M1 index már 2 óra szobahőmérsékleten való tárolás után is megváltozik. A teljes vér és plazmaviszkozitást 6 órás szobahőmérsékleten való tárolás nem befolyásolja, de az 1 napos 4°C-os tárolás kerülendő. Ezen eredmények alapján javasolható, hogy a hemoreológiai mérések lehetőség szerint a vérvételtől számított 2 órán belül kerüljenek elvégézésre.
41
8. MÓDSZERTANI MEGFONTOLÁSOK EKTACYTOMETRIA KAPCSÁN: ADATREDUKCIÓ.
8.1. Bevezetés A deformálhatóság a vörösvérsejtek fontos jellemzője, mely lehetővé teszi, hogy a sejtek saját átmérőjüknél kisebb kapillárisokon is keresztül tudjanak haladni. A deformabilitás mérésének egyik módszere az ektacytometria. Ennek során a sejteket kontrollált nyírófeszültségeknek tesszük ki, és az alakváltozás mértékét számszerűsítjük. Az iparágban több berendezés is létezik, mely az ektacytometria elvét alkalmazza; laboratóriumunkban LORCA (Laser-assisted Optical Rotational Cell Analyzer, Mechatronics BV, Hollandia) készüléket használunk [63]. A berendezésben egy álló belső és egy forgó külső cilinder található, melyek közt Couette-áramlás, kvázi-homogén sebességgrádiens jön létre. A sebességgrádiens a konstans geometriai paraméterektől és a cilinder fordulatszámától függ. A vizsgálandó vörösvérsejtekből egy ismert viszkozitású vivőoldattal igen híg szuszpenziót készítünk (25 µl vér/5 ml oldat, kb. 0,2% hematokrit), ennek viszkozitása gyakorlatilag a vivőoldatéval azonos. A szuszpendáló közeg viszkozitása és a sebességgrádiens meghatározza a sejtekre ható nyírófeszültséget. A vörösvérsejtek, ha homogén nyírómezőbe kerülnek, és a külső viszkozitás a sejt belső viszkozitásánál nagyobb, ellipszoiddá deformálódnak, a membrán „lánckerékszerű mozgással” örvénylik a citoplazma körül, és a sejt hossztengelye szöget zár be a mező tengelyével [64,65]. A deformálódott sejtek lézersugár előtt haladnak el, mely diffrakciót szenved rajtuk. A diffrakciós kép izointenzív pontjai ellipszist alkotnak. A deformációt az elongációs indexszel (EI) számszerűsítjük, mely az említett ellipszis hosszabb (A) és rövidebb (B) tengelyeivel számítható (A-B)/(A+B) képlet szerint. A cilinder fordulatszámának változtatásával a nyírófeszültség (SS – shear stress) széles tartománya mellett határozható meg az elongációs index; az SS-EI pontok halmazát nevezzük ektacytogramnak. Egy ilyen halmazt nehéz kezelni, értelmezni és a görbéket egymással statisztikailag összehasonlítani. Az SS és EI között az ektacytogramon determinisztikus kapcsolat látszik. Hasznos lenne, ha az összefüggést kevés és lehetőleg szemléletes paraméterrel információvesztés nélkül le lehetne írni, és segítségükkel az eredeti adatokat reprodukálni
42
lehetne. Az irodalomban két ilyen adatredukciós módszert találtunk (Lineweaver-Burke [66] és Streekstra-Bronkhorst [67,68]). Tanulmányunkban megvizsgáltuk ezek alkalmazhatóságát és korlátait.
8.2. Módszerek Nyers mérési adatként egy reprezentatív ektacytogramot adó mintát használtunk. Egy egészséges önkéntes heparinnal antikoagulált véréből 25 µl-nyit 5 ml 27,1 mPas viszkozitású polivinilpirrolidon oldatban szuszpendáltunk. A mérést a vérvételtől számított 2 órán belül végeztük el. Az elongációs indexet a jó felbontás érdekében 100 nyírófeszültség mellett határoztuk meg 0,30 és 30 Pa között logaritmikus léptékben. Az adathalmazra Wolfram Mathematica 6.0 programcsomag segítségével illesztettük a diszkusszióban részletezett regressziós görbéket. Az algoritmus megkeresi a paraméterek azon értékeit, melyek mellett az adatpontok és a regressziós görbe közti reziduálisok négyzetösszege minimális. Az illesztés erősségét az r2 értékkel jellemeztük, mely az adathalmaz teljes varianciájából a regressziós görbe által megmagyarázott arány. A szisztematikus eltérések megítéléséhez megvizsgáltuk a reziduálisok elrendeződését a nyírófeszültségek függvényében. Megvizsgáltuk, hogy az illesztési paraméterek változatlanok maradnak-e, ha az illesztés a teljes adathalmaz helyett annak részhalmazaira történik.
8.3. Eredmények és diszkusszió
8.3.1 A Lineweaver-Burke illesztés Ha a nyírófeszültség és az elongációs index is lineáris skálázású, a konkáv ektacytogram az első rendű enzimkinetika diagramjára emlékeztet (8.1/a ábra), mely a Lineweaver-Burke reciprok transzformációval oldható meg. A Linewever-Burke módszernél analóg módon az 1/EI-t az 1/SS függvényében ábrázoljuk, és a kapcsolatot lineáris regresszióval írjuk le. A függőleges tengelymetszet az 1/EImax-ot jelöli, ahol EImax a végtelen nyírófeszültségnél létrejövő deformáció. Az egyenes meredeksége SS½/EImax, ahol SS½ az EImax/2 deformációt létrehozó nyírófeszültség [66].
43
A (1/SS; 1/EI) pontpárok nem illeszthetők tökéletesen egy egyenesre (8.1/b ábra). A regresszió során alkalmazott legkisebb négyzetek módszere a pontok és az egyenes közötti abszolút eltérést minimalizálja. Ugyanazon abszolút különbség, ami magas 1/SS magas 1/EI értékeinél kis relatív eltérést jelent, az alacsony 1/SS alacsony 1/EI értékeinél óriási relatív eltérést okozhat; ám erre a regresszió érzéketlen. Az alacsony (1/SS; 1/EI) pontok jelentőségét a módszer „elhanyagolja”. Minél közelebb esik az alacsony nyírófeszültségekhez tartozó EI a nullához, annál magasabb az 1/EI, ami „félrehúzza” a regressziós egyenest. Mindezek eredményeként az EImax általában jelentősen felülbecsült, akár az 1-et is meghaladhatja (8.1/c ábra), ami pedig a paraméter értékének teoretikus maximuma. Speciális problémát jelent, ha az EI nulla vagy negatív. Említettük, hogy a deformálódó vörösvérsejtek hossztengelye az áramlás vektorából kitér. A lézersugár így a hossztengely valóságosnál rövidebb vetületét látja. Ha a mérést magas nyírófeszültségeken kezdjük, a sejtek egységesen orientálódnak, ami az alacsony nyírófeszültségeken is fennmarad. Ilyenkor a hossztengely vetülete a rövid tengelynél is rövidebbnek adódhat, az elongációs index negatív lehet. A mérést alacsony nyírófeszültségen kezdve és magasabb felé haladva az orientáció nem alakul ki elég gyorsan, negatív elongációs index nem fordul elő. A reciprok transzformációval a nulla EI matematikailag értelmezhetetlen, a negatív EI-k mellett pedig a lineáris regresszió alkalmazása inkorrekt: Az 1/SS növekedésével az 1/EI előbb meredeken nő, majd egy szakadási pont után hirtelen nagy, majd kevésbé negatív értéket vesz fel. Az illeszkedés javítható, ha a magas 1/EI-vel járó alacsony nyírófeszültségeket (pl. 1 Pa alatt) kizárjuk az elemzésből. Ez mindenképp információveszteséget jelent, és értelemszerűen ezen pontok a regressziós paraméterekkel nem is reprodukálhatóak megbízhatóan.
44
8.1. ábra: A Lineweaver-Burke illesztés. (a) Lineáris-lineáris skálázású, konkáv ektacytogram. (b) Reciprok transzformáció utáni lineáris regressziós egyenes illesztése. (c) A visszatranszformált regressziós görbe az EImax-ot jelentősen felülbecsüli. (d) A nonreciprociális függvény illesztése után maradó reziduálisok alakulása.
A Lineweaver-Burke összefüggés nem-reciprociális formájával is elvégezhető a függvényillesztés:
Ebben az esetben a magas (SS; EI) pontok jobb egyezést adnak, az EImax megítélése jóval pontosabb. Ekkor azonban hasonló okok miatt sajnos az alacsony (SS, EI) pontok lesznek „elhanyagolva”. Az 8.1/d ábrán az adatpontok és a nem-reciprociális függvény közti reziduálisokat tüntettük fel. A pozitív illetve negatív értékek csoportosan helyezkednek el. Eszerint az adatpontok és a függvény közötti eltérés szisztematikus jellegű, nem tudható be pusztán a véletlennek. A modell nem írja le korrekt módon a valóságot, csak becsli azt.
45
Alacsony nyírófeszültségeknél az illesztett függvény az EI-t felülbecsüli. Az ábrán feltüntetett számok abszolút eltérések, az alacsony EI miatt arányaiban ez sokkal kifejezettebb. A magas nyírófeszültségeknél a reziduálisok negatívba hajlanak, így az EImax alulbecsült lesz. A függvény értéke nem lehet nulla vagy negatív. Ilyen EI-k esetén az illesztés ugyan matematikailag elvégezhető, de ezen függvény sem fog az ilyen EI-kre jó illeszkedést adni. A nem-reciprociális függvényillesztés az eredeti Lineweaver-Burke módszernél jobban közelíti az EImax-ot, de az alacsony nyírófeszültségek modellezésében nem jobb. Ezenkívül elvesztjük lehetőséget, hogy a feladatot egy egyszerű reciprok transzformációval és lineáris regresszióval oldjuk meg; a nem-lineáris függvény illesztése bonyolultabb probléma.
8.3.2 A Streekstra-Bronkhorst illesztés Ha az ektacytogrammon az elongációs indexet lineárisan, míg a nyírófeszültséget logaritmikusan skálázzuk, egy S alakú görbét kapunk. Streekstra és Bronkhorst ezt egy xm/(xm+1) típusú függvénnyel közelítette. Az alapfüggvényt konstansokkal bővítve lehet jól illeszkedő helyzetbe nyújtani és tolni (8.2/a ábra).
Az EImax és az EImin a görbe felső és alsó aszimptotái, az EImax a végtelen, az EImin a zérus nyírófeszültségnél kapott deformációt jelöli. Bár zérus nyírófeszültség mellett nincs deformáció, az EI az orientációs jelenség miatt 0-tól eltérő lehet. Az SS½ az (EImin+EImax)/2 közepes deformációhoz szükséges nyírófeszültséget jelöli, az m pedig a görbe meredekségével kapcsolatos paraméter. A Streekstra-Bronkhorst módszer képes a negatív EI értékek kezelésére is [67]. Szeretnénk rámutatni, hogy az elgondolásukat a szerzők hibásan alkalmazták. Amennyiben egy x–y
grafikon S-alakú, az y→xm/(xm+1) összefüggés alkalmazható a
leírására. Ha azonban a logx–y grafikon az S-alakú, úgy az y→logxm/(logxm+1) összefüggés alkalmazandó. Mivel esetünkben a logSS–EI grafikon az S-alakú, a formulában logSS és log SS½ kifejezést kellett volna alkalmazni az SS és SS½ helyett. A jelen formula a lineárislineáris skálázású ektacytogramot írja le, ami viszont konkáv és nem S-alakú. A matematika iróniája, hogy az illeszkedés így is igen erős. Az xm/(xm+1) egy flexibilis függvény, mely m≤1
46
esetén konkáv, m>1 esetén viszont S alakúvá válik (8.2/b ábra). Méréseink során az ektacytogramokra illesztett görbék m paraméterei 1 alattinak adódtak, bizonyítva, hogy az illesztés valójában a konkáv görbékhez történt (8.2/c ábra). Mellékes, hogy a regressziós görbék loglineáris skálázás mellett szintén S-alakúak. Bár nem a szerzők elképzelése szerinti módon, a Streekstra-Bronkhorst görbe igen erős illeszkedést biztosít. Vegyük észre azonban, hogy a mért pontok és a regressziós görbe közt szisztematikus eltérés mutatkozik (8.2/d). A görbe mindkét szélén az EI értékek alulbecsültek, és a görbe folytatásával a különbség még tovább nőne. Ez azt jelenti, hogy mind az EImax, mind az EImin érték alulbecsült. Az m a fentiek tükrében semmilyen szemléletes jelentéssel nem bír, az illeszkedéshez szükséges kényszerparaméter.
8.2. ábra: A Streekstra-Bronkhorst illesztés. (a) A log-lineáris skálázású, S-alakú ektacitogram. (b) A flexibilis y→xm/(xm+1) függvény az m különböző értékeinél. (c) A regressziós görbe a lineáris-lineáris ektacytogramra illesztve. (d) Az illesztés után maradó reziduálisok alakulása.
47
A fent említett gondolatmenet szerint a logaritmusok hozzátételével módosítottuk a Streekstra-Bronkhorst képletet:
A kifejezés értelmezhetetlen, ha logSS/logSS½ negatív, ami pedig elkerülhetetlen az 1 Pa-nál kisebb nyírófeszültségeken. A probléma áthidalható, ha előzőleg minden SS értéket átskálázunk, azaz felszorzunk egy konstanssal, hogy 1-nél nagyobb értékeket kapjunk, így végezzük el az illesztést, és a kapott SS½ értéket visszaosztjuk a használt konstanssal. Hasonlóképp, ha a paraméterek segítségével akarunk reprodukálni egy EI értéket, akkor ezen konstanssal felszorozzuk az SS-t és SS½-t, és ezeket helyettesítjük a képletbe. A leírtakkal a Streekstra-Bronkhorst módszerhez hasonló erősségű illeszkedést lehet elérni, mindazonáltal ezen módszer mellett is mutatkoznak szisztematikus hibák. Mivel a módszerünk érdemben nem ad jobb eredményt, mint a Streekstra-Bronkhorst, viszont körülményesebb, mi is az eredeti formula használatát javasoljuk. Az illesztés paraméterei a vörösvérsejt intrinsic tulajdonságait hivatottak jellemezni, így elviekben függetlennek kell lenniük attól, hogy a mérést milyen nyírófeszültség tartományban végezzük. Ennek ellenőrzésére az eredeti adathalmazról levágtuk az alacsony illetve a magas nyírófeszültségekhez tartozó tartományokat, és így is elvégeztük az illesztést. Az eredmény a 8.3. ábrán látható. A paraméterek jelentős mértékben változnak. A paraméterek helyes megítéléséhez fontos, hogy a görbe nevezetes szakaszai meglegyenek. A felső kar csonkolásával a felső aszimptota és az EImax megítélése nehézkessé válik. Az alsó kar az EImin helyes megítéléséhez fontos. Mivel az alsó kar alaphelyzetben is rövidebb, a további levágásaira a paraméterek érzékenyebben reagálnak. Természetesen valamely paraméter aránytalan torzulása az összes többit is magával húzza. Az illeszkedés erőssége az r2 vonatkozásában magas maradhat, de a paraméter fizikailag értelmét veszti (pl. negatív SS½, vagy -0,5 alatti EImin).
48
8.3. ábra: Streekstra-Bronkhorst paraméterek alakulása a mérési tartomány változtatása (adathalmaz csonkolása) mellett. A teli karikáknál a vizsgált tartomány a (0,30 Pa; nyírófeszültség), az üres karikáknál a (nyírófeszültség; 30 Pa) intervallumot jelenti.
8.2.3. Általános megjegyzések Az r2 értékkel a korrelációs görbe illeszkedésének szorosságát jellemezzük. A nemreciprociális Lineweaver-Burke illesztés esetén ez 0,9896-nak, a Streekstr-Bronkhorst illesztésnél 0,9986-nak adódott. Ezek kiemelkedően szoros illeszkedést jelentenek. A magas r2 érték annak is köszönhető, hogy az ektacytogram precíz, zajmentes görbe, a sejthető determinisztikus alapvonaltól való sztochasztikus eltérése minimális. Pont ez adott lehetőséget arra, hogy a kifejezetten kicsi szisztematikus eltéréseket is felfedezzük. A magas r2 azért szavatol, hogy a regressziós görbe jól leírja azon mérési pontokat, amelyekre illesztették, a paraméterek segítségével ezen pontok jó közelítéssel reprodukálhatóak. Mivel sem a regressziós görbe, sem az ektacytogram nem tesz hirtelen kilengéseket, a regressziós függvénnyel a mérési tartományon belülre eső egyéb pontok is jó pontossággal képezhetőek. A magas r2 nem jelenti azt, hogy a regressziós függvény alkalmas a mérési tartományon kívül
49
eső pontok helyes jóslására, pl. a maximális deformáció meghatározására. Erre hívja fel a figyelmet a paraméterek mérési tartománytól való függősége. A becslés pontossága valószínűleg javítható, ha a deformáció jelenségéről több információnk van, azaz a mérési tartományt kiszélesítjük. Ennek lefelé az szabhat gátat, hogy a minimális nyíróerők mellett már a Brown-mozgás is arányaiban jelentékennyé válhat, romlik a jel/zaj arány, pontatlanabb lesz a kapott érték. A nyírófeszültség túlzott növelése esetén pedig a sejtek szenvednének irreverzibilis károsodásokat, maga a mért rendszer változna meg. A legkisebb négyzetek módszere a reziduálisok minimalizálásánál a reziduális abszolút nagyságát veszi figyelembe. Azonos súllyal esik latba, a 0,08 és 0,10, illetve a 0,58 és 0,60 közötti eltérés. Előbbinél ez relatív értelemben 20%, utóbbinál 3,3% eltérést jelent. Vitatható azonban az is, hogy az EI esetén van-e értelme olyan kifejezéseknek, mint relatív eltérés, relatív hiba, vagy standardizált differencia, melyeket az irodalomban is gyakran használnak [68]. A fenti fogalmak arányskálákon használatosak. Az elongációs index sokkal inkább egy alul és felül korlátos intervallumskála, amelyen azonos nagyságú léptékek biológiailag nem is azonos nagyságú változást jelentenek. Az EI-ből könnyen képezhetjük a diffrakciós ellipszis két átmérőjének arányát A/B=(1+EI)/(1-EI) szerint. A kört jelölő nulláról a 0,3-ra növekedő EI egy olyan ellipszist jelent, ahol az átmérők aránya 1,86, míg a 0,8-ról 0,9-re változó EI a 9-szeresről 19-szeresre nyúló átmérőarányt takar. Az arányok szemszögéből értelmezhetetlen egy negatív és pozitív EI összehasonlítása is.
8.3. Összefoglalás A Lineweaver-Burke transzformáció a maximális deformáció értékét felülbecsüli, ha 1 Pa-nál kisebb nyírófeszültségeken is történik mérés. A nem-reciprociális formula bár alulbecsüli, jobban közelíti az EImax-ot, viszont figyelmen kívül hagyja az alacsony nyírófeszültségeket. A Streekstra-Bronkhorst illesztés jobb hatásfokú adatredukciót biztosít. Bár a formula elméleti felépítése részben téves, a gyakorlati használhatósága nem kérdőjelezhető meg. A módszer segítségével az információ kevés paraméterrel konzerválható és reprodukálható. A paramétereknek szemléletes jelentés tulajdonítható, ám ezek pontatlanok lehetnek. A maximális és minimális deformáció kissé alulbecsült.
50
9. MÓDSZERTANI MEGFONTOLÁSOK EKTACYTOMETRIA KAPCSÁN: A KÖZEGVISZKOZITÁS SZEREPE
9.1. Bevezetés Az ektacytometria a vörösvérsejtek deformációjának számszerűsítésére használatos módszer. Ennek részleteivel az előző fejezetben részletesen foglalkoztam. Az elongációs indexszel a vörösvérsejt-minta deformációját jellemezzük. A deformabilitás fogalmat akkor használjuk, ha a mérést standard környezeti tényezők (hőmérséklet, közegviszkozitás, ozmolaritás, pH, stb.) mellett végezzük. Azonos minta, azaz azonos deformabilitású sejtek deformációja eltérő lehet, ha a mérés körülményei megváltoznak. Szuszpendáló közegként polivinilpirrolidon (PVP) por foszfátpufferes oldatát használjuk. Az oldat elkészítése és a viszkozitás beállítása technikailag nehézkes, így a deformabilitásmérés standard körülményei nehezen biztosíthatók. Az irodalomban a különböző szerzők eltérő viszkozitású közeget használnak, ezért a kapott deformációk egymással korlátozottan hasonlíthatók össze. Tanulmányunkban megvizsgáltuk, hogy a közeg viszkozitásának változása hogyan befolyásolja a deformációt. A berendezés a közeg viszkozitása alapján állítja be a cilinder fordulatszámát, hogy a kívánt nyírófeszültséget létrehozza, A közegviszkozitás helytelen megadása helytelen nyírófeszültséghez és téves elongációs indexhez vezet. Megvizsgáltuk, hogyan lehet az ilyen eredményeket retrospektív módon korrigálni.
9.2. Minták és módszerek Méréseinkhez 11 egészséges önkéntes heparinnal antikoagulált vérét használtuk. Öt különböző PVP oldatot készítettünk, melyek viszkozitását Oswald viskoziméterrel 13,5, 17,5, 20,9, 25,1 és 37,8 mPas-nak mértük. A méréseket a vérvételtől számított 2 órán belül végeztük. Az elongációs indexet 0,30 és 30 Pa között logaritmikus léptékben 25 nyírófeszültségen mértük.
51
Mindegyik mintából mindegyik közegben készítettünk szuszpenziót. Minden keveréket háromszor mértünk le anélkül, hogy közben kicseréltük volna őket. Egy viszkozitást egy alkalommal helyesen adtuk meg, a másik két alkalommal egy másik közeg viszkozitás értékét tápláltuk be, lehetőség szerint egy kisebb és egy nagyobb viszkozitásúét. A LORCA a Couette-áramlás sebességgrádiensét a γ=SSnominális/ηnominális formula szerint állítja be, mely SSvalós=γ*ηvalós=SSnominális*ηvalós/ηnominális nyírófeszültséget eredményez. Ha a viszkozitást helyesen adjuk meg, ηnominális=ηvalós, így SSvalós=SSnominális, ha azonban a viszkozitást tévesen adjuk meg a valódi nyírófeszültség eltérő lesz, és téves ektacytogramot kapunk. Elsőként a téves (SSnominális; EI) adatpontokat helyes (SSvalós; EI) pontokká konvertáltuk, majd interpolációval kiszámoltuk a standard SS értékekhez tartozó EI-ket. A legalsó illetve legfelső nyírófeszültségek interpolációval nem számíthatóak, ezeket kihagytuk. A helyesen mért és a helytelenül mért, transzformációval korrigált pontok egyezését BlandAltman analízissel vizsgáltuk minden nyírófeszültségen. Ugyanazon minta különböző médiumban felvett ektacytogramjait együttesen ábrázoltuk. A különbségeket szemikvantitatíven értékeltük, és megadtuk a StreekstraBronkhorst paraméterek változását is.
9.3. Eredmények és diszkusszió A téves viszkozitással mért ektacytogramok konverziója a 9.1. ábrán látható. A konvertált téves és a helyes adatpontok egyezését Bland-Altman analízissel vetettük össze. Egyik nyírófeszültségnél sem találtunk szisztematikus torzítást, és a sztochasztikus hiba is a LORCA mérési pontosságán belül maradt. A módszer tökéletes korrekcióra ad lehetőséget. A helyes és téves mérések ugyanazon viszkozitású közegben történtek, a fizikai körülmények azonosak voltak, így azonos valós nyírófeszültség mellett azonos EI várható. Az egyetlen különbséget a SS nominális értéke jelentette. Nem meglepő, hogy ezt a szigorúan matematikai jellegű hibát korrigálni lehet. A módszer azonban csapdát rejt. Kísérletünkben 25 ponton mértünk a jó felbontás érdekében, így az interpoláció pontos volt. Ha kevesebb pont áll rendelkezésünkre (a LORCA alapbeállítások szerint 9 pontot vesz fel), ez pontatlanabb lehet. Emellett a szélső adatpontok nem interpolálhatók, így elvesznek.
52
9.1. ábra: Hibásan megadott viszkozitásértékkel történő mérés korrekciója. (a) Reprezentatív minta azonos valós, de különböző nominális viszkozitás melletti ektacytogramjai. (b) A téves nyírófeszültség értékek valós értékekre való konverziója. (c) A konvertált adatpontok interpolációja közös nyírófeszültség értékekre. (d) Helyes és konvertált téves adatpontok összehasonlítása Bland-Altman szerint (torzítás és 95% CI). A téves ektacytogramokat jellemző Streekstra-Bronkhorst paraméterek konverzióját is megvizsgáltuk. A hibás mérések során kapott EImax és EImin értékeket változatlanul hagytuk, hisz a végtelen és nulla nyírófeszültségnél mérhető értéknek azonos fizikai körülmények közt azonosnak kell lennie. A SS½ értéket a korábbiakhoz hasonlóan SS½*ηvalós/ηnominális szerint képeztük. Az m paramétert is változatlanul hagytuk, mert nem láttuk miért és hogyan kellene transzformálni. A Bland-Altman analízis szerint a konvertált hibás paraméterek eltérnek a helyes paraméterektől. Ha a nominális viszkozitás a valósnál magasabb volt, az EImax-ot alul-, az EImin-t és a SS½-t pedig felülbecsültük. Ha a nominális viszkozitás a valósnál alacsonyabb volt a torzítás fordított irányú volt (9.1. táblázat). Épp ezért, ha lehetséges, az eredeti adatokat és ne az adatredukciós paramétereket konvertáljuk!
53
∆EImax
∆EImin
∆SS½
∆m
ηnominális>ηvalós
-0,012±0,013
0,034±0,023
0,139±0,095
0,087±0,072
ηnominális<ηvalós
0,032±0,028
-0,166±0,285
-0,286±0,279
-0,163±0,120
9.1. táblázat: A helyesen mért és konvertált hibásan mért Streekstra-Bronkhorst paraméterek összevetése Bland-Altman szerint (torzítás ± szórás).
A vörösvérsejtek deformabilitását elsősorban a felület-térfogat arány, a membrán viszkoelasztikus tulajdonságai és a sejt belső viszkozitása határozza meg [24,25]. Az ektacytometriával mért deformációt a szuszpendáló közeg viszkozitása is befolyásolja. Ha a közegviszkozitás a belső viszkozitásnál kisebb, a sejt alig deformálódik, és bukdácsoló mozgást végez. Ha a közegviszkozitás a belső viszkozitásnál nagyobb a sejtek ellipszoiddá deformálódnak, egységesen orientálódnak és a membrán lánctalpszerűen áramlik a citoplazma körül [65]. Morris és társai 150 Pa extrém nyírófeszültségnek tettek ki vörösvérsejteket különböző viszkozitású közegben. Kis külső viszkozitás mellett a deformáció minimális volt (EI=0,1 3 mPas mellett), és a sejtek sem sérültek. Hat mPas-os külső viszkozitás felett azonban az EI és a hemolizáló sejtek aránya meredeken nőtt [69]. Korin és társai matematikailag modellezték a vörösvérsejtek homogén nyírómezőben történő deformációját. Elemzésükben a környező viszkozitás nem módosította jelentősen az elongációs indexet [70]. A modell azonban a nyugvó vörösvérsejteket ellipszoid testekként kezelte, nem bikonkáv korongként, mint a valóságban. A kezdeti alak és a membránban ébredő hajlító erők valószínűleg fontosak a deformáció és a külső viszkozitás kapcsolata szempontjából. Tanulmányunkban a magasabb viszkozitású közeghez tartozó ektacytogramok általában a magasabb EI értékek felé tolódtak. A Streekstra-Bronkhorst EImax és m paraméterek szignifikáns pozitív, míg az SS½ szignifikáns negatív korrelációt mutattak a közegviszkozitással. Az EImin is tendenciózusan nőtt a magasabb viszkozitások felé. Megkíséreltünk egy transzformációs szabályt létrehozni, mellyel akár a nyers EI, akár a Streekstra-Bronkhorst paraméterek tetszőleges viszkozitáshoz kiszámolhatók. Az EI és a viszkozitás kapcsolatát egy 1/x típusú hyperbola és kapcsolódó konstansai segítségével többé-
54
kevésbé le lehetett írni, ha a mérések átlagát vettük alapul. Ez a szabály a konstansaival egyedi esetre vetítve azonban használhatatlannak bizonyult, az egyéni eseteknél számolt konstansok pedig rendkívül eltérően viselkedtek, így a modellt elvetettük. Ezen eltérő viselkedést a 9.2. ábrán szemléltetjük. Néhány mintánál az ektacytogramok magas nyírófeszültségeknél széttérnek, más esetekben ez nem számottevő. Hasonlóan, az alacsony nyírófeszültségeknél is eltérő mértékben látható a görbék összetartása. Az esetek többségében a görbék párhuzamosan futnak, egyes esetekben azonban kereszteződés figyelhető meg.
9.2. ábra: A közegviszkozitás hatása az ektacytogramra. (a) Az összes mérés átlaga. (b-d) Egyedi ektacytogramok viselkedése. (b) Széttartás magas nyírófeszültségen. (c) Összetartás alacsony nyírófeszültségen. (d) Egymást keresztező görbék. (e) Streekstra-Bronkhorst paraméterek változása a közegviszkozitás függvényében.
Ez rámutat arra, hogy különböző szerzők különböző viszkozitású közegben történt mérései nehezen vethetők össze egymással. Szintén hibára számíthatunk, ha korábbi méréseinket egy utóbb készített és eltérő viszkozitású közegben mért eredményeinkkel akarjuk összehasonlítani. A mérési módszer standardizálása ezért igen fontos. Másfelől az a tény, hogy a minták eltérően viselkednek a közegviszkozitással kapcsolatban, az ektacytometria újfajta alkalmazásának adhat teret. A Pekingi Egyetem munkacsoportjai az
55
alacsony viszkozitású ektacytometriát már sikerrel alkalmazták a membránfluiditás vizsgálatában [71,72]. A magas viszkozitású ektacytometria a vörösvérsejtek stressztűréséről adhat információt, és valószínűleg a belső viszkozitáshoz közeli átmeneti zóna alkalmazása is hasznos információt szolgáltathat. Ahogy az ozmotikus grádiens ektacytometria sokat elárult a sejtek tulajdonságairól [73], úgy a „viszkozitás grádiens ektacytometria” is egy potenciális jövőbeli alkalmazási terület lehet. 9.4. Összefoglalás Ha az ektacytometriás mérésnél a közegviszkozitást hibásan adjuk meg, az eredmények később tökéletesen korrigálhatók, mindössze a nyírófeszültségeket kell ηvalós/ηnominális értékkel szorozni. Másfelől a Streekstra-Bronkhorst paraméterek korrekciója hibát eredményezhet. A közegviszkozitás befolyásolja a deformációt. Magasabb viszkozitású közegben a nyírófeszültség-elongációs index görbe a magasabb EI értékek felé tolódik, a maximális deformáció (EImax) nő, míg a maximális deformáció felének létrehozásához szükséges nyírófeszültség (SS½) csökken. Ezen a téren jelentős egyéni különbségek tapasztalhatóak, így az adatok transzformációja nem oldható meg egyszerűen. Másfelől ez teret nyithat új módszereknek, mint az alacsony/átmeneti/magas viszkozitású ektacytometria vagy a viszkozitás grádiens ektacytometria.
56
10. ÚJ EREDMÉNYEK
Tanulmányaink az alábbi új eredményekre vezettek: 1. A hematokrit-vérviszkozitás arány segítséget nyújthat a kardiális morbiditás és mortalitás előrejelzésében. 2. A bemutatott módszerrel kevés mintából gyorsan és egyszerűen felrajzolható a hematokrit-vérviszokzitás profil, és számítható a maximális oxigénszállító intenzitást adó virtuális optimális hematokrit. 3. Bíztató eredményeket találtunk arra vonatkozóan, hogy a virtuális optimális hematokrit
segítséget
felmérésében,
nyújthat
amennyiben
a
beteg
lehetőség
globális van
a
optimális
hematokritjának
hemodinamikai
viszonyok
feltérképezésére. 4. Megmutattuk, hogy a hemoreológiai mérések elvégzése előtt a minták mennyi ideig tárolhatóak az eredmény torzulása nélkül: •
Teljes vér viszkozitás és plazma viszkozitás: 6 óra szobahőmérsékleten. A 4°C való 24 órás tárolás kerülendő
•
Vörös
versejt
aggregáció:
LORCA-nál
6
óra,
Myrenne-nél
2
óra
szobahőmérsékleten. A 4°C való 24 órás tárolás kerülendő •
Vörösvérsejt deformabilitás: 2 óra szobahőmérsékleten, vagy 24 óra 4°C-on
5. Rámutattunk az ektacitometriás eredmények adatredukciójára használt módszerekkel kapcsolatos néhány hibalehetőségre: •
Az eredeti Lineweaver-Burke transzformáció használata esetén az 1 Pa alatti értékeket ne használjuk! Ezen pontokat a nem-reciprociális formula is rosszul becsüli.
•
A Streekstra-Bronkhorst illesztés is szisztematikus hibákat hordoz. A maximális és minimális deformáció kissé alulbecsült.
6. Bemutattuk egy módszert, mellyel az ektacytometria során a közegviszkozitás téves megadásából eredő hiba korrigálható. 7. Megmutattuk, hogy a deformabilitás és a közegviszkozitás közötti kapcsolat egyénenként változó, így ezen összefüggés vizsgálata információt adhat az egyénről.
57
12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Szeretnék
köszönetet
mondani
programvezetőmnek,
Prof.
Dr.
Tóth
Kálmánnak,
témavezetőmnek Dr. Késmárky Gábornak, valamint Prof. Dr. Bogár Lajosnak, amiért segítettek
a
kutatás
irányvonalának
megtalálásában,
és
tudományos
fejlődésemet
menedzselték. PhD-s elődeimnek, Dr. Fehér Gergelynek és Dr. Koltai Katalinnak az elinduláshoz szükséges információkért, és mert megtanítottak kritikusan szemlélni a dolgokat. Fiatal munkatársaimnak, Dr. Rábai Miklósnak és Tóth Andrásnak a mérések kivitelezésében, értékelésében és az eredmények formába öntésében nyújtott segítségéért, és hogy végighallgatták a fárasztó gondolataimat is. Dr. Juricskay Istvánnak a matematikai és fizikai kérdések terén nyújtott hasznos tanácsaiért. Tapasztóné Fazekas Kornéliának és Nagy Lászlóné Erzsinek a laboratóriumi munkához nyújtott fáradhatatlan asszisztenciáért. Családomnak és barátaimnak a támogatásért és a bátorításért, hogy ez a dolgozat megszülessen.
58
11. IRODALOMJEGYZÉK 1. Toth K, Kesmarky G, Clinical Significance of Hemorheological Alterations. In: Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. Eds.: Baskurt OK, Hardeman MR, Rampling MW, Meiselman HJ. IOS Press 2007; 392-432. 2. Kensey KR. The mechanistic relationships between hemorheological characteristics and cardiovascular disease. Curr Med Res Opin 2003;19:587-96. 3. Bogar L. Hemorheology and hypertension: not "chicken or egg" but two chickens from similar eggs. Clin Hemorheol Microcirc 2002;26:81-3. 4. Yanbaeva DG, Dentener MA, Creutzberg EC, Wesseling G, Wouters EF. Systemic effects of smoking. Chest 2007;131:1557-66. 5. Shin S, Ku Y, Babu N, Singh M. Erythrocyte deformability and its variation in diabetes mellitus. Indian J Exp Biol 2007;45:121-8. 6. Lowe GDO, Smith WCS, Tunstall-Pedoe HD, Crombie IK, Lennie SE, Anderson J et al. Cardiovascular risk and haemorheology - Results from the Scottish Heart Health Study and the MONICA Project, Glasgow. Clin Hemorheol 1988;8:517-24. 7. Yarnell JW, Baker IA, Sweetnam PM, Bainton D, O’Brien JR, Whitehead PJ. Fibrinogen, viscosity, and white cell count are major risk factors for ischemic heart disease. The Caerphilly and Speedwell collaborative heart disease studies. Circ 1991;83:836-44. 8. Vincent JL. The relationship between oxygen demand, oxygen uptake, and oxygen supply. Intensive Care Med 1990;16 Suppl 2:S145-8. 9. Gagnon DR, Zang TJ, Brand FN, Kannel WB. Hematocrit and the risk of cardiovascular disease - The Framingham Study: A 34-year follow-up. Am Heart J 1994;127:674-82. 10. Höffkes HG, Ehrly AM. Optimal hematocrit in patients with intermittent claudication. Exercise induced muscle tissue oxygen pressure after stepwise isovolemic hemodilution. Clin Hemorheol 1992;12:321-7. 11. Isbister JP. Hyperviscosity: Clinical Disorders, In: Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. Eds.: Baskurt OK, Hardeman MR, Rampling MW, Meiselman HJ. IOS Press 2007; 371-391. 12. Stadler AA, Zilow EP, Linderkamp O. Blood viscosity and optimal hematocrit in narrow tubes. Biorheol 1990;27:779-88.
59
13. Bogar L, Juricskay I, Kesmarky G, Kenyeres P, Toth K. Erythrocyte transport efficacy of human blood: a rheological point of view. Eur J Clin Invest 2005;35:687-90. 14. Danesh J, Collins R, Peto R, Lowe GDO. Haematocrit, viscosity, erythrocyte sedimentation rate: meta-analyses of prospective studies of coronary heart disease. Eur Heart J 2000;21:515-20. 15. Chien S, Usami S, Taylor HM, Lundberg JL, Gregersen MI. Effect of hematocrit and plasma proteins on human blood rheology at low shear rates. J Appl Physiol 1966;21:81-7. 16. Woodward M, Rumley A, Tunstall-Pedoe H, Lowe GDO. Does sticky blood predict a sticky end? Associations of blood viscosity, haematocrit and fibrinogen with mortality in West of Scotland. Br J Haematol 2003;122:646-50. 17. Howard BV, Ruotolo G, Robbins DC. Obesity and dyslipidemia. Endocrinol Metab Clin North Am 2003;32:855-67. 18. Stoltz JF, Gaillard S, Dehlon A, Palmier C, Benisti G, Lauressergues H. Plasma viscosity and biochemical parameters in the "fatty" rat. Atherosclerosis 1981;39:1259. 19. Lund-Johansen P. The hemodynamics of the aging cardiovascular system. J Cardiovasc Pharmacol 1988;8:S20-32. 20. Kenyeres P, Juricskay I, Tarsoly P, Kesmarky G, Mühl D, Toth K, Bogar L, Low hematocrit per blood viscosity ratio as a mortality risk factor in coronary heart disease, Clin Hemorheol Microcirc 2008;38:51-6. 21. Effect of Hematocrit. In: Clinical Hemorheology. Eds.: Chien S, Dormandy J, Ernst E, Matrai A. Martinus Nijhoff Publishers 1987;55-6. 22. Cokelet GR, Meiselman HJ, Macro- and Micro-Rheological Properties of Blood. In: Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. Eds.: Baskurt OK, Hardeman MR, Rampling MW, Meiselman HJ. IOS Press 2007; 45-71. 23. Cokelet GR, Meiselman HJ. Basic Aspects of Hemorheology. In: Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. Eds.: Baskurt OK, Hardeman MR, Rampling MW, Meiselman HJ. IOS Press 2007; 21-33. 24. Mohandas N, Clark MR, Jacobs MS, Shohet SB. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest 1988;66:563-73. 25. Stuart J. Erythrocyte rheology. J Clin Pathol 1985;38:965-77.
60
26. Marton Zs, Horvath B, Alexy T, Kesmarky G, Czopf L, Habon T, Kovacs L, Papp E, Halmosi R, Mezey B, Roth E, Toth K. Follow-up of hemorheological parameters and platelet aggregation in patients with acute coronary syndromes. Clin Hemorheol Microcirc 2003;29:81-94. 27. Dunn A, Lo V, Donnelly S. The role of the kidney in blood volume regulation: the kidney as a regulator of the hematocrit. Am J Med Sci 2007;334:65-71. 28. ICSH Expert Panel on Blood Rheology. Guidelines for measurement of blood viscosity and erythrocyte deformability. Clin Hemorheol 1986;6:439-53. 29. Uyuklu M, Cengiz M, Ulker P, Hever T, Tripette J, Connes P, Nemeth N, Meiselman HJ, Baskurt OK. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc 2009;41:269-78. 30. Baskurt OK, Boynard M, Cokelet GC, Connes P, Cooke BM, Forconi S, Liao F, Hardeman MR, Jung F, Meiselman HJ, Nash G, Nemeth N, Neu B, Sandhagen B, Shin S, Thurston G, Wautier JL. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. International Expert Panel for Standardization of Hemorheological Methods. Clin Hemorheol Microcirc 2009;42:75-97. 31. Kesmarky G, Toth K, Habon T, Vajda G, Juricskay I. Hemorheological parameters in coronary artery disease. Clin Hemorheol Microcirc 1998;18:245-51. 32. Mátrai Á, Fendler K, Lissák K. Sorozatmérésre alkalmas capillaris mikroviszkoziméter. Kísérletes Orvostudomány 1977;29:200-207. 33. Nemeth N, Baskurt OK, Meiselman HJ, Kiss F, Uyuklu M, Hever T, Sajtos E, Kenyeres P, Toth K, Furka I, Miko I. Storage of laboratory animal blood samples causes hemorheological alterations: Inter-species differences and the effects of duration and temperature. KA Rheol J 2009;21:127-33. 34. Olivieri O, Franceschi L, Gironcoli M, Girelli D, Corrocher R. Potassium loss and cellular dehydration of stored erythrocytes following incubation in autologous plasma: role of the KCl cotransport system. Vox Sang 1993;65:95-102. 35. Danon D, Marikovsky Y. The aging of the red blood cell. A multifactor process. Blood Cells 1988;14:7-18. 36. Godin C, Caprani A. Effect of blood storage on erythrocyte/wall interactions: implications for surface charge and rigidity. Biophys J 1997;26:175-82.
61
37. Tozzi-Ciancarelli MG, Di Massimo C, Mascioli A. Aging of human erythrocytes: the role of membrane perturbations induced by in vitro ATP-depletion. Cell Mol Biol 1992;38:303-10. 38. Wolkers WF, Crowe LM, Tsvetkova NM, Tablin F, Crowe JH. In situ assessment of erythrocyte membrane properties during cold storage. Mol Membr Biol 2002;19:5965. 39. Bosman GJ, Lasonder E, Luten M, Roerdinkholder-Stoelwinder B, Novotný VM, Bos H, De Grip WJ. The proteome of red cell membranes and vesicles during storage in blood bank conditions. Transfusion 2008;48:827-35. 40. Card RT. Red cell membrane changes during storage. Transfus Med Rev 1988;2:40-47. 41. Gaczyńska M, Bartosz G, Rosin J. Membrane self-digestion during erythrocyte storage, Cytobios 1989;57:87-92. 42. Laczko J, Szabolcs M, Jona I. Vesicle release from erythrocytes during storage and failure of rejuvenation to restore cell morphology. Haematologia (Budapest) 1985;18:233-48. 43. Greenwalt TJ, DJ Bryan Dumaswala UJ. Erythrocyte membrane vesiculation and changes in membrane composition during storage in citrate-phosphate-dextroseadenine-1. Vox Sang 1984;47:261-70. 44. Card RT, Mohandas N, Perkins HA, Shohet SB. Deformability of stored red blood cells, Relationship to degree of packing. Transfusion 1982;22:96-101. 45. Manojkumar V, Deepadevi KV, Arun P, Nair KG, Lakshmi LR, Kurup PA. Changes in the composition of erythrocyte membrane during storage of blood in di-(2-ethyl hexyl) phthalate [DEHP] plasticized poly vinyl chloride (PVC) blood storage bags. Indian J Med Res 1999;109:157-63. 46. Uyuklu M, Cengiz M, Ulker P, Hever T, Tripette J, Connes P, Nemeth N, Meiselman HJ, Baskurt OK. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc 2009;41:269-78. 47. Nagaprasad V, Singh M. Sequential analysis of the influence of blood storage on aggregation, deformability and shape parameters of erythrocytes. Clin Hemorheol Microcirc 1998;18:273-84. 48. Relevy H, Koshkaryev A, Manny N, Yedgar S, Barshtein G. Blood banking-induced alteration of red blood cell flow properties. Transfusion 2008;48:136-46.
62
49. Vroege R, Wildevuur WR, Muradin JA, Graves D, van Oeveren W. Washing of stored red blood cells by an autotransfusion device before transfusion. Vox Sang 2007;92:130-5. 50. Hovav T, Yedgar S, Manny N, Barshtein G. Alteration of red cell aggregability and shape during blood storage. Transfusion 1999;39:277-81. 51. Berling C, Lacombe C, Lelièvre JC, Allary M, Saint-Blancard J. The RBC morphological dependence of the RBC disaggregability. Biorheology 1988;25:791-8. 52. Zhang J, Zhang X, Wang N, Fan Y, Ju H, Yang J, Wen J, Qu X. What is the maximum duration to perform the hemorheological measurement for the human and mammals. Clin Hemorheol Microcirc 2004;31:157-60. 53. Singh M, Stoltz JF. Influence of temperature variation from 5 degrees C to 37 degrees C on aggregation and deformability of erythrocytes. Clin Hemorheol Microcirc 2002;26:1-7. 54. Gaspar-Rosas A, Thurston GB. Erythrocyte aggregate rheology by transmitted and reflected light. Biorheology 1988;25:471-87. 55. Baskurt OK, Uyuklu M, Hardeman MR, Meiselman HJ. Photometric measurements of red blood cell aggregation: light transmission versus light reflectance. J Biomed Opt, 2009;14:054044. 56. Högman CF, Verdier CH, Ericson A, Eriksson L, Sandhagen B. Studies on the mechanism of human red cell loss of viability during storage at +4 degrees C in vitro. III. Effects of mixing during storage. Vox Sang 1987;53:84-88. 57. Brooks DE, Evans EA, Rheology of blood cells. In: Clinical Hemorheology. Eds.: Chien S, Dormandy J, Ernst E, Matrai A. Martinus Nijhoff Publishers 1987; 73-96. 58. Molecular rheology of blood – Effect of subphases. In: Blood Microrheology. Ed.: Dintenfass L. Butterworth 1971; 48-96. 59. Stuart J, Kenny MW. Blood rheology. J Clin Pathol 1988;33:417-29. 60. Hardeman MR, Goedhart PT, Shin S. Methods in hemorheology. In: Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. Eds.: Baskurt OK, Hardeman MR, Rampling MW, Meiselman HJ. IOS Press 2007; 242-66. 61. Riquelme BD, Foresto PG, Valverde JR, Rasia JR. Alterations to complex viscoelasticity
of
erythrocytes
during
storage.
Clin
Hemorheol
Microcirc
2000;22:181-8.
63
62. Alexy T, Wenby RB, Pais E, Goldstein LJ, Hogenauer W, Meiselman HJ. An automated tube-type blood viscometer: validation studies. Biorheol 2005;42:237-47. 63. Hardeman MR, Goedhart PT, Breederveld D. Laser diffraction ellipsometry of erythrocytes under controlled shear stress using a rotational viscosimeter. Clin Chim Acta 1987;185:227-34. 64. Keller SR, Skalak R. Motion of a tank-treading ellipsoidal particle in a shear flow. J Fluid Mech 1982;120:24-7. 65. Pfafferott C, Nash GB, Meiselman HJ. Red blood cell deformation in shear flow. Effects of internal and external phase viscosity and of in vivo aging. Biophys J 1985;47:695-704. 66. Condon MR, Kim JE, Deitch EA, Machiedo GW, Spolarics Z. Appearance of an erythrocyte population with decreased deformability and hemoglobin content following sepsis. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003;284:H2177-84. 67. Bronkhorst PJH, Nijhof EJ, Sixma JJ. Parametrization of the deformation curve as a tool for standardization and interpretation of ektacytometric measurements. Clin. Hemorheol 1995;15: 803-16. 68. Baskurt OK, Meiselman HJ. Analyzing shear stress-elongation index curves: comparison of two approaches to simplify data presentation. Clin Hemorheol Microcirc 2004;31:23-30. 69. Morris DR, Williams AR. The effects of suspending medium viscosity on erythrocyte deformation and haemolysis in vitro. Biochim Biophys Acta 1979;550:288-96. 70. Korin N, Bransky A, Dinnar U. Theoretical model and experimental study of red blood cell (RBC) deformation in microchannels. J Biomech 2007;40:2088-95. 71. Liu X, Tang ZY, Zeng Z, Chen X, Yao WJ, Yan ZY, Shi Y, Shan HX, Sun DG, He DQ, Wen ZY. The measurement of shear modulus and membrane surface viscosity of
64
RBC membrane with Ektacytometry: a new technique. Math Biosci 2007;209:190204. 72. Wen Z, Gao T, Yan Z, Song L, Dou H, Sun D, Lü Z, Shi Y, Xiao H. Biophysical meanings of orientation and deformation of RBCs in shear flow field of low viscosity with new Ektacytometry. Sci China C Life Sci 1998;41:195-202. 73. Clark MR, Mohandas N, Shohet SB. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood 1986;61:899-910.
65
12. A SZERZŐ KÖZLEMÉNYEI
12.1. Teljes közlemények BOGAR L, JURICSKAY I, KESMARKY G, KENYERES P, TOTH K. Erythrocyte transport efficacy of human blood: a rheological point of view. Eur J Clin Invest 2005;35:687-90. Impakt faktor: 2,684 BOGAR L, JURICSKAY I, KESMARKY G, FEHER G, KENYERES P, TOTH K. Gender differences in hemorheological parameters of coronary artery disease patients. Clin Hemorheol Microcirc 2006;35:99-103. Impakt faktor: 1,242 BOGAR L, MOLNAR Z, TARSOLY P, KENYERES P, MARTON S. Serum procalcitonin level and leukocyte antisedimentation rate as early predictors of respiratory dysfunction after oesophageal tumour resection. Crit Care 2006;10:R110. Impakt faktor: 4,55 FEHER G, KOLTAI K, PAPP E, ALKONYI B, SOLYOM A, KENYERES P, KESMARKY G, CZOPF L, TOTH K. Aspirin resistance: possible roles of cardiovascular risk factors, previous disease history, concomitant medications and haemorrheological variables. Drugs Aging 2006;23:559-67. Impakt faktor: 2,2 BOGAR L, MOLNAR Z, KENYERES P, TARSOLY P. Sedimentation characteristics of leucocytes can predict bacteraemia in critical care patients. J Clin Pathol 2006;59:523-5. Impakt faktor: 2,245 KENYERES P, JURICSKAY I, TARSOLY P, KÉSMÁRKY G, MÜHL D, TÓTH K, BOGÁR L. Az alacsony hematokrit/viszkozitás arány, mint a koszorúérbetegségek halálozási rizikótényezője. Hematol Transzfúziológia 2006;39:174-8.
66
KENYERES P, JURICSKAY I, TARSOLY P, KESMARKY G, MUHL D, TOTH K, BOGAR L. Low hematocrit per blood viscosity ratio as a mortality risk factor in coronary heart disease. Clin Hemorheol Microcirc 2008;38:51-6. Impakt faktor: 1,242 KOLTAI K, FEHER G, KENYERES P, LENART I, ALEXY T, HORVATH B, MARTON ZS, KESMARKY G, TOTH K. Relation of platelet aggregation and fibrinogen levels to advancing age in aspirin- and thienopyridine-treated patients. Clin Hemorheol Microcirc 2008;40:295-302. Impakt faktor: 1,242 KESMARKY G, KENYERES P, RABAI M, TOTH K. Plasma viscosity: a forgotten variable. Clin Hemorheol Microcirc 2008;39:243-6. Impakt faktor: 1,242 HORVATH B, SZAPARY L, DEBRECENI L, FEHER G, KENYERES P, FULOP A, BATTYANI I, TOTH K. Effect of Sclerovit on endothelial dysfunction, hemorheological parameters, platelet aggregation, plasma concentration of homocysteine and progression of atherosclerosis in patients with vascular diseases. Clin Hemorheol Microcirc 2009;42:19-28. Impakt faktor: 0,977 NEMETH N, BASKURT O, MEISELMAN HJ, KISS F, UYUKLU M, HEVER T, SAJTOS, E, KENYERES P, TOTH K, FURKA I, MIKO I. Storage of laboratory animal blood samples causes hemorheological alterations: Inter-species differences and the effects of duration and temperature. Korea-Australia Rheol J 2009;21:127-33. Impakt faktor: 0,717 RÁBAI M, TÓTH A, KENYERES P, MÁRK L, MÁRTON ZS, JURICSKAY I, SÜMEGI B, TÓTH K. Vörösbor és alkoholmentes vörösborkivonat kedvező in vitro haemorheológiai hatásai. Érbetegségek 2009;2:45-52.
67
BÓDIS B, TSCHÜRTZ N, MAUER ZS, KESZTHELYI ZS, NAGY ZS, KENYERES P, MEZŐSI E, BAJNOK L. Az éhomi vércukorszint prediktív értéke a szénhidrátanyagcserezavarok előfordulása szempontjából. Diab Hung 2010;2:151-8. RABAI M, TOTH A, KENYERES P, MARK L, MARTON ZS, JURICSKAY I, TOTH K, CZOPF L. In vitro hemorheological effects of red wine and alcohol free red wine extract. Clin Hemorheol Microcirc 2010;44:227-36. Impakt faktor: 0,977 KENYERES P, RABAI M, TOTH A, NEMETH N, MIKO I, KESMARKY G, JURICSKAY I, ALEXY T, TOTH K. The impact of sample preparation and storage of human blood on measured hemorheological parameters. KA Rheol J; under publication. Impakt faktor: 0,717 KENYERES P, RABAI M, TOTH A, KESMARKY G, MARTON ZS, TOTH K. Methods to simplify, correct and compare ektacytometric results. Clin Hemorheol Microcirc 2009; under publication. Impakt faktor: 0,977 Kumulatív impakt faktor: 20,035.
12. Előadáskivonatok, poszterek BOGAR L, KESMARKY G, KENYERES P, SZELIG L, FEHER G, TOTH K. Haematocrit and blood viscosity ratio indicates rheological oxygen carrying capacity and optimal haematocrit of human blood. 13th European Conference on Clinical Hemorheology, June 2629, 2005, Siena, Italy. Abstract book 17. KOLTAI K, FEHÉR G, KENYERES P, HORVÁTH B, ALEXY T, MÁRTON ZS, KÉSMÁRKY G, TÓTH K.
Thrombocitaaggregáció-gátló terápiák hatékonysága, a
fibrinogénszint és az életkor közötti összefüggés 5136 érbetegben. A Magyar Kardiológusok
68
Társasága 2006. évi Tudományos Kongresszusa, 2006. május 11-13., Balatonfüred. Card Hung Suppl A 2006;36:A70. HORVÁTH B, SZAPÁRY L, DEBRECENI L, FEHÉR G, KENYERES P, FÜLÖP A, BATTYÁNI I, TÓTH K.
A Sclerovit hatása az endothelfunkcióra, hemoreológiai
paraméterekre, a thrombocyta aggregációra, a vér homocisztein-koncentrációjára és az atherosclerosis progressziójára igazolt vaszkuláris betegekben.
Magyar Belgyógyász
Társaság Dunántúli Szekciójának LIII. Vándorgyűlése, 2006. június 1-3., Sopron. Magyar Belorv Arch Suppl 2 2006;59:77-78. KOLTAI K, FEHER G, KESZTHELYI ZS, KENYERES P, KESMARKY G, VEKASI J, TOTH K. Smoking and lower aspirin dosage are associated with higher prevalence of aspirin resistance in type-2 diabetic patients. World Congress of Cardiology, September 2-7, 2006, Barcelona, Spain. Eur Heart J 2006;27 (Abstract Suppl.) KOLTAI K, FEHER G, KENYERES P, ALEXY T, HORVATH B, MARTON ZS, KESMARKY G, TOTH K. Association between the effectiveness of different antiplatelet therapies, fibinogen levels and ageing in 5136 vascular patients.
World Congress of
Cardiology, September 2-7, 2006, Barcelona, Spain. Eur Heart J 2006;27 (Abstract Suppl.) KOLTAI K, FEHÉR G, KENYERES P, KESZTHELYI Z, RAPP H, KÉSMÁRKY G, TÓTH K.
Roziglitazon-kezelés hatásai a hemoreológiai paraméterekre, a thrombocyta-
aggregabilitásra és más kardiovaszkuláris rizikófaktorokra. Magyar Belgyógyász Társaság 41. Nagygyűlése, 2006.11.09-11. Budapest. Magyar Belorv Arch Suppl 4 2006;59:81. CZOPF L, KENYERES P, FEHÉR G, TÓTH K. Arteriográfiás mérések értékelése kezelt érbetegeknél. Magyar Belgyógyász Társaság 41. Nagygyűlése, 2006.11.09-11. Budapest. Magyar Belorv Arch Suppl 4 2006;59:52-53. KENYERES P, KÉSMÁRKY G, TÓTH K.
In vitro öregedés hatása a vörösvérsejt
aggregációra. 5. Magyar Mikrokeringés Kongresszus, 2007. április 20-21., Balatonkenese. Érbetegségek Suppl 1 2007;9.
69
KÉSMÁRKY G, KENYERES P, TÓTH K. Plazmaviszkozitás: egy mellőzött paraméter. 5. Magyar Mikrokeringés Kongresszus, 2007. április 20-21., Balatonkenese.
Érbetegségek
Suppl 1 2007;13. SCHUMACHER E, VIGH É, BÍRÓNÉ MOLNÁR V, KENYERES P, FEHÉR G, KÉSMÁRKY G, GARAI J, TÓTH K. A kávésav in vivo hemorheológiai és trombocita aggregáció gátló hatásának vizsgálata. 5. Magyar Mikrokeringés Kongresszus, 2007. április 20-21., Balatonkenese. Érbetegségek Suppl 1 2007;16. RAPP H, FEHÉR G, KENYERES P, KÉSMÁRKY G, KÁLAI T, HIDEG K, TÓTH K. A 4hidroxi-kumarin és származékainak hatása a vörösvérsejt deformabilitásra és a trombocita agregációra. 5. Magyar Mikrokeringés Kongresszus, 2007. április 20-21., Balatonkenese. Érbetegségek Suppl 1 2007;18. KOLTAI K, FEHÉR G, KENYERES P, HORVÁTH B, RAPP H, HALMOSI R, KÉSMÁRKY G, TÓTH K. Hemoreológiai paraméterek és a thrombocyta aggregabilitás szezonális változásai acetil-szalicilsavval kezelt érbetegekben. Magyar Belgyógyász Társaság Dunántúli Szekciójának LIV. Vándorgyűlése, 2007. június 14-16., Balatonalmádi. Magyar Belorv Arch Suppl 1 2007;60:36. KESMARKY G, KENYERES P, TOTH K. Plasma Viscosity: a Fogotten Vasriable? 14th Conference of the European Society for Clinical Hemorheology and Microcirculation, June 27-30, 2007, Dresden, Germany. Abstract book. KENYERES P, KESMARKY G, TARSOLY P, JURICSKAY I, TOTH K, BOGAR L. The Impact of Hemorheological Oxygen Carrying Capacity on Cardiac Morbidity and Mortality. 14th Conference of the European Society for Clinical Hemorheology and Microcirculation, June 27-30, 2007, Dresden, Germany. Abstract book. KOLTAI K, FEHER G, KENYERES P, MARTON ZS, HALMOSI R, TIBOLD A, KESMARKY G, CZOPF L, TOTH K. Seasonal variations of hemorheological parameters and platelet aggregation in aspirin treated vascular patients.
Congress of the European
70
Society of Cardiology, September 1-5, 2007, Vienna, Austria. Eur Heart J 2007;28 (Abstract Suppl.). KENYERES P, RÁBAI M, TARSOLY P, KÉSMÁRKY G, TÓTH K, BOGÁR L. Az alacsony
hematokrit-vérviszkozitás
arány,
mint
rizikótényező
a
koszorúérbetegek
halálozásában. A Magyar Kardiológusok Társasága 2008. évi Tudományos Kongresszusa, 2008. május 7-10., Balatonfüred. Card Hung Suppl B 2008;38:B29. KESMARKY G, RABAI M, KENYERES P, MARTON ZS, TOTH K. viscosity: Is it useful or useless in clinical practice?
Whole blood
13th International Congress of
Biorheology and 6th International Conference on Clinical Hemorheology, July 9-13, 2008, State College, USA. Biorheol 2008;45:56. KENYERES P, RABAI M, TARSOLY P, KESMARKY G, TOTH K, BOGAR L. Rheological oxygen carrying capacity as a mortality risk factor in coronary heart disease. 13th International Congress of Biorheology and 6th International Conference on Clinical Hemorheology, July 9-13, 2008, State College, USA. Biorheol 2008;45:57. KENYERES P, RABAI M, TOTH A, KESMARKY G, MARTON ZS, TOTH K. Methods to simplify, correct and compare ektacytometric results.
13th International Congress of
Biorheology and 6th International Conference on Clinical Hemorheology, July 9-13, 2008, State College, USA. Biorheol 2008;45:138. RABAI M, TOTH A, KENYERES P, MARTON ZS, KESMARKY G, TOTH K. Rheological benefit of red wine and its alcohol free extract. 13th International Congress of Biorheology and 6th International Conference on Clinical Hemorheology, July 9-13, 2008, State College, USA. Biorheol 2008;45:147. KOLTAI K, FEHER G, KENYERES P, HALMOSI R, TIBOLD A, KESMARKY G, CZOPF L, TOTH K. Seasonal variations in hemorheological parameters and platelet aggregation - a possible association with meteorological factors? 25th Conference of the European Society for Microcirculation, August 26-29, 2008, Budapest, Hungary. J Vasc Res 2008,45:42.
71
KENYERES P, RABAI M, TOTH A, KESMARKY G, TOTH K. The impact of in vitro aging on erythrocyte aggregation.
25th Conference of the European Society for
Microcirculation, August 26-29, 2008, Budapest, Hungary. J Vasc Res 2008;45:78. KENYERES P, RÁBAI M, TÓTH A, KÉSMÁRKY G, BOGÁR L, TÓTH K. Egy új megközelítés az optimális hematokrit értelmezésében akut koronária szindrómás betegek adatai alapján. A Magyar Kardiológusok Társasága 2009. évi Tudományos Kongresszusa, 2009. május 6-9., Balatonfüred. Card Hung Suppl A 2009;39:A66. RÁBAI M, PÁLFI A, BARTHA É, KENYERES P, TÓTH A, MAGYAR K, SÜMEGI B, TÓTH K. Vörösbor és alkoholmentes vörösborkivonat protektív hatásai állatkísérletes és in vitro hemoreológiai modellekben.
A Magyar Kardiológusok Társasága 2009. évi
Tudományos Kongresszusa, 2009. május 6-9., Balatonfüred.
Card Hung Suppl A
2009;39:A74. RÁBAI M, TÓTH A, KENYERES P, MÁRK L, MÁRTON ZS, JURICSKAY I, SÜMEGI B, TÓTH K. hatásai.
Vörösbor és alkoholmentes vörösborkivonat kedvező in vitro haemorheológiai 6. Magyar Mikrokeringés Kongresszus, 2009. május 22-23., Balatonkenese.
Érbetegségek 2009;2:45. KENYERES P, RÁBAI M, TÓTH A, TÓTH K Új módszer a hematokrit-vérviszkozitás arány, és a virtuális optimális hematokrit meghatározására.
6. Magyar Mikrokeringés
Kongresszus, 2009. május 22-23., Balatonkenese. Érbetegségek 2009;2:59. KENYERES P, RABAI M, TOTH A, TOTH K. New method to determine hematocrit to blood viscosity ratio and virtual optimal hematocrit. 15th Conference of the European Society for Clinical Hemorheology and Microcirculation, June 28-July 1, 2009, Pontresina/St. Moritz, Switzerland. Clin Hemorheol Microcirc 2009;42:191. RABAI M, KENYERES P, TOTH A, PALFI A, BARTHA E, MAGYAR K, SUMEGI B, TOTH K. In vitro hemorheological and cardioprotective effects of red wine and alcohol free red wine extract. 15th Conference of the European Society for Clinical Hemorheology and
72
Microcirculation, June 28-July 1, 2009, Pontresina/St. Moritz, Switzerland. Clin Hemorheol Microcirc 2009;42:191-2.
73
