A ércsoport rendszereket rintő A vvércsoport rendszereket éérintő genetikai ációk, szerep ük aa genetikai vari variációk, szerepük mindennapi úziológiai mindennapi transzf transzfúziológiai gyakorlatban gyakorlatban Tordai Attila OVSZK Molekuláris Diagnosztikai Labor
Transzfúziólógiai szinten tartó tanfolyam Bp. 2013. ápr.
Tartalomjegyz ék Tartalomjegyzék
1. A vércsoport antigének genetikai háttere 2. Ízelítő a módszerekből 3. A genotipizálás jelentősége a transzfúziológiai gyakorlatban
A ércsoport antig ének molekul áris ttörténelme örténelme A vvércsoport antigének molekuláris •
Egy vvs membrán fehérje (glikoforin A) aminosavsorrendjének első meghatározása, M/N vércsoport molekuláris háttere: 1975-1976 (Tomita&Marchesi)
•
Egy vércsoport antigént kódoló cDNS (glikoforin C, Gerbich) szekvencia első leírása: 1986 (Colin)
•
A két legfontosabb vércsoport antigén, az ABO és az Rh molekuláris alapjainak első közlése: 1990 (Yamamoto; Avent)
•
2009: 30 vércsoport rendszer, 270 antigén, jóval több allél.
A A 30 30 db db vvércsoport ércsoport molekul áris molekuláris hháttere áttere 19/30 (66%) TM; 4/30 (14%) GPI (glikozilfoszfatidil-inozitol); 1/30 plazmából adszorb. 6/30 (20%) transzferáz
Veldhuisen 2009; Vox Sang és Mollison’s
Antig ének Antigének éés s all élek allélek megoszl ása megoszlása csopor csoportonk ént tonként
Avent 2008; Brit J Haematol 144:3.
A ás DNS -szintű mechanizmusai A variabilit variabilitás DNS-szintű mechanizmusai Egyetlen bázist érintő nukleotid-variáns: single nucleotid polymorphism (SNP) – aminosavcsere: az antigének mintegy 2/3-ánál
Storry 2004; Br J Haemat 126:759.
Egyes ércsoport antig ének molekul áris szerkezete Egyes minor minor vvércsoport antigének molekuláris szerkezete
Klein HG & Anstee DJ eds 2005; Mollison’s Blood Transfusion
A ércsoport antig ének molekul áris szerkezete A vvércsoport antigének molekuláris szerkezete
Reid ME & Lomas-Francis C eds 2004; The Blood Group Antigen Facts Book
Az ének molekul áris hháttere áttere Az ABO ABO antig antigének molekuláris
A antigén: csak α-N-acetil-galaktozaminil transzferáz aktivitás (176Arg, 235Gly, 266Leu & 268Gly)
B antigén: csak α-galaktozil transzferáz aktivitás (176Gly, 235Ser, 266Met & 268Ala) AB antigén: mindkettő (összetett heterozigóta) O antigén: egyik sem (1 bp deléció, frameshift mutáció, megrövidült fehérje termék)
Az án feh érje Az RhD RhD transzmembr transzmembrán fehérje
Parciális D
Gyenge D
minőségi
mennyiségi
Allo-antitest
klinikailag jelentős
igen ritkán képződik
RhD fehérje variáció
extracelluláris
transzmembrán/intra celluláris
Expresszió
normál (10 000/sejt)
csökkent (100/sejt)
Variáns
1. A vércsoport antigének genetikai háttere 2. Ízelítő a módszerekből 3. A genotipizálás jelentősége a transzfúziológiai gyakorlatban
C élkeresztben aa DNS Célkeresztben DNS
Bázis komplementaritás
DNS -izolálás, pre -analitika DNS-izolálás, pre-analitika Kiindulási anyag: • Alvadásgátolt vér/csontvelő (EDTA) (fagyasztható, illetve hűtve több napig tárolható); • Szűrőpapírra cseppentett és beszárított vér (ujjszúrás); • Magzati sejtek: chorion boholy mintavétel (CVS) vagy amnion folyadék sejtjei (AC); • Szájöblítés útján nyert szájnyálkahártya sejtek; • Szövetminta. Módszer: saját (házi) reagensek, illetve gyári kitek. Vörösvérsejt-mentesítést követően: • Fehérje mentesítés + nukleinsav precipitáció („kisózás”); • Specifikus nukleinsav adszorpció speciális felületekhez.
Amplifik áció ---- PCR Amplifikáció PCR 5’ 3’
Duplaszálú DNS minta
3’ 5’
A) Denaturálás (95°C) 5’
3’
3’
Egyszálú DNS minta
B) Primer kitapadás (50-65°C) 5’
3’
5’
A reakció összetevői: 1.) DNS templát 2.) Taq polimeráz 3.) dNTP 4.) Primerek: • 18-25 bp oligonukleotid • cél-szekvencia specifikus 5.) Megfelelő pH, ionok
Primerek kitapadása C) Lánchosszabbítás (72°C)
5’
ISMÉTLÉS: 25-40 x 3’
Taq DNS polimeráz
Amplifik áció ---- PCR Amplifikáció PCR 3. CIKLUS Kettős szálú DNS templát
1. CIKLUS
2. CIKLUS
n. CIKLUS
Polimer áz lláncreakció áncreakció (PCR) észülékek Polimeráz (PCR) kkészülékek
Post -PCR munkafolyamatok Post-PCR munkafolyamatok • Termék-kimutatás gél-elektroforézissel: PCR-SSP (sequence specific primers), PCR-SSO (sequence specific oligonucleotides) • Emésztés restrikciós endonuklázzal: RFLP (restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus) • Fluoreszcens detektálás: • Hibridizációs oligonukleotid („probe”) – FRET (fluoreszcencia energia transzfer) • Szekvencia-analízis láncterminációs technikával (Sanger) • Hidrolízis oligonukleotid („probe”) – TaqMan • …………………… • ……………………
V ércsoport tipiz álás PCR -SSP-vel Vércsoport tipizálás PCR-SSP-vel
Prager 2007; Transfusion 47:54S.
A én C282Y ációjának (SNP) ása A HFE HFE ggén C282Y mut mutációjának (SNP) kimutat kimutatása PCR -RFLP m ódszerrel PCR-RFLP módszerrel 1. hasítatlan PCR termék 393 2. normál 3. heterozigóta 4. homozigóta 251 restrikciós enzim: Rsa I
142 112
1
2
3
4
SNP -vizsgálat val ós idej ű PCR -rel éés s fluoreszcens SNP-vizsgálat valós idejű PCR-rel fluoreszcens jel ölésű oligonukleotidokkal jelölésű oligonukleotidokkal
Saját tervezésű, jelölt/jelöletlen szintetikus oligonukleotidok
Normál genotípus Heterozigóta Homozigóta mutáns
Negatív kontroll
Szekvencia -analízis (Sanger) Szekvencia-analízis (Sanger) Módszer: lánctermináció fluoreszcensen jelölt didezoxi (módosított) nukleotidokkal (BigDye terminator kit) Lépések:
Amplifikáció PCR-rel PCR termék tisztítás Szekvenáló reakció Termék tisztítás Analízis: kapilláris elektroforézis
T CG T A A C G C T AG T C
Szekvencia -analízis (Sanger) Szekvencia-analízis (Sanger)
kontroll
C>T transzverzió
variáns heterozigóta
Array -technológia Array-technológia Definició: Array = makromolekulák térben rendezett, hordozóhoz (chip) rögzített sorozata.
Fajtái: o o o o o o o
Macro (10-1000 spot, méret>300µm, membrán) Micro (1000-100 000 spot, méret<300µm, szilikon chip) oligonukleotid; cDNS (komplementer DNS); DNS; fehérje; antitest.
Kulcsszó: Hibridizáció = specifikus kapcsolódás a báziskomplementaritás elve alapján.
mRNS ó öösszehasonlítás sszehasonlítás array ával mRNS expresszi expresszió array technik technikával
1. A vércsoport antigének genetikai háttere 2. Ízelítő a módszerekből 3. A genotipizálás jelentősége a transzfúziológiai gyakorlatban
Csodaszer -e aa genotipiz álás??? Csodaszer-e genotipizálás???
genotípus •
=
fenotípus
a gén nem közvetlenül az antigén fehérjét kódolja (transzferáz: ABO, H, I, P-szintáz: GLOB)
•
homológ gének (RHD & RHCE)
•
antigén hiány, null-fenotípus: nem ismert non-sense mutáció, inaktiváló mutáció, fehérje expressziót befolyásoló mutáció miatt – ál pozitív antigén predikció a recipiens tipizálásnál probléma.
A -alapú vvércsop. ércsop. tipiz álás alkalmaz ási lehet őségei A DNS DNS-alapú tipizálás alkalmazási lehetőségei Beteg oldal: 1. Közelmúltban (esetleg többször) transzfundált beteg: • elősegítheti az allo- és az autoantitestek elkülönítését, azonosítását, ellentmondó szerológiai eredmény tisztázását; • transzplantációnál donor-DNS utólagos tesztelése. 2. Immunglobulinnal fedett vvs: pl. AIHA-esetek.
3. Prenatális vizsgálat: • ÚHB újszülöttkori hemolitikus betegség (HDFN) kockázata esetén a magzati vércsoport korai előrejelzése (akár anyai plazmából); • az apai zigótaság (hetero/homo) megállapítása.
Donor oldal: 4. Donor kivizsgálás: • A gyakori antigénekre negatív donor-pool növelése – automatizálható tömeg-szűrés; • Gyenge vagy nem hozzáférhető antitest esetén: pl. anti-Doa, -Dob, Jsa, -Jsb. -CW, -V, -VS; • Ellentmondások (pl. ABO) feloldása -- minőségbiztosítás; • Gyenge, „minor” antigént kódoló variánsok, RhD-variánsok.
Ritka Ritka donorok donorok • Ha >500 donort kell vizsgálni, hogy 1 megfelelőt találjunk, • Antigén-kombináció hiánya, • Gyakori antigén hiánya. Ritka donorokra lehet szükség: • Örökletes betegségek: sarlósejtes anaemia, thalassemia, • Szerzett kórképek: autoimmun hemolitikus anaemia (AIHA), aplasztikus anaemia, myelodysplasia, antineoplasztikus kezelés. Vércsoport-tipizálás: • DNS-alapú tesztek (array-, gyöngyös rendszerek) és a hemagglutináció kombinációja: antigén-, reagens-, populáció-függő (antigének populációs gyakoriságának felmérése szükséges).
A úziológiai gyakorlatban A jelenlegi jelenlegi rutin rutin transzf transzfúziológiai gyakorlatban alkalmazott -technikák alkalmazott DNS DNS-technikák 1. Kis mintaszám (low throughput): • PCR-SSP (allél specifikus primerek) • PCR-RFLP (allél-specifikus emésztődés restrikciós enzimmel) • Fluoreszcens technikák (hibridizációs, hidrolízis oligonukleotidok) 2. Nagy mintaszám (high throughput): • Beadchip (Bioarray): 24 antigén, 18 SNP • BLOODchip (Progenika): 47 antigén, 116 SNP • Luminex xMAP (Luminex): 16 antigén, 8 SNP
Jelen
Lehets éges Lehetséges algoritmusok algoritmusok (közel)jövő
Anstee DJ. 2009; Blood 114:248.
