Gedrag van antibiotica in het grondwater tijdens bodempassage

Gedrag van antibiotica in het grondwater tijdens bodempassage Onderzoek aan de hand van analyse van watermonsters in de Amsterdamse Waterleidingduinen

Corine ten Velden Thesis bachelorproject 2009 Aardwetenschappen Bèta-gamma bachelor UvA Begeleider Pim de Voogt

2

Inhoudsopgave

1. Inleiding 1.1 De stoffen 1.2 Literatuur: eerder aangetroffen concentraties

pagina 5 7 8

2. Methode en materialen 2.1 Monstername 2.2 Optimalisatie 2.3 Calibratie 2.4 Opwerking monsters 2.5 Analyse met LC-MS/MS

10 10 13 13 14 15

3. Resultaten 3.1 Kwantificatielimieten 3.2 Aangetroffen concentraties Hoge waardes Gradiënt waarneembaar

17 19 20 21 26

4. Conclusies Discussie en aanbevelingen

28 30

Literatuur

31

Bijlagen Bijlage 1: De stoffen: enkele gegevens Bijlage 2: Methode: benodigdheden Bijlage 3: Methode: procedure (uitgebreid) Bijlage 4: Tabellen samenstelling levels en calibratiegrafieken Bijlage 5: Tabellen output software LC-MS/MS sulfamethazine en sulfamethoxazol

3

35 38 40 43 46

4

1. Inleiding Ten behoeve van mens en milieu worden vanuit de overheid eisen gesteld aan zowel oppervlaktewater als drinkwater. Een onderdeel hiervan is dat er prioritaire stoffenlijsten bestaan, waarop gevaarlijke stoffen staan die een risico kunnen vormen voor mens en milieu. Hierbij valt te denken aan stoffen van zeer diverse herkomst: bijvoorbeeld uit cosmetica, schoonmaakmiddelen, verf en geneesmiddelen. Deze lijsten worden vanuit verschillende overheden gepubliceerd; zo bestaat er zowel een Europese prioritaire stoffenlijst, gepubliceerd door de Europese Unie, als een specifieke Nederlandse stoffenlijst gepubliceerd door de Nederlandse overheid. De stoffen op deze lijsten mogen niet meer of slechts in beperkte mate gebruikt worden, en worden zodoende in de gaten gehouden. Echter, er zijn genoeg stoffen die wellicht ook een risico vormen voor mens en milieu, maar die (nog) niet op deze prioritaire stoffenlijsten staan. Bijzondere aandacht hierbij verdienen stoffen die bestaan uit polaire en persistente verbindingen. Probleem met deze stoffen is namelijk dat het zuiveringsproces dat wordt toegepast door drinkwaterbedrijven niet altijd invloed heeft op deze stoffen: ze worden niet altijd uit het (drink)water gefilterd (Van Rooyen 2006). Een aandeel van deze groep stoffen wordt gevormd door de werkzame stoffen uit antibiotica. Het gaat hierbij zowel om antibiotica voor menselijk gebruik als antibiotica voor gebruik in de vee- en visindustrie (Hirsch et al. 1999). Het grootste deel van de stoffen uit deze antibiotica komt in het oppervlaktewater terecht via rioolwaterzuiveringsinstallaties. In het algemeen worden antibiotica slecht opgenomen door het organisme (zowel mens als dier): 25-75% van de bestanddelen van het medicijn verlaat ongewijzigd weer het lichaam via urine en uitwerpselen (Chee-Sanford et al. 2001 in Karthikeyan & Meyer 2006). In het filterproces van de rioolwaterzuiveringsinstallaties worden die stoffen er niet of niet volledig uitgefilterd, en zo komen ze in het oppervlaktewater terecht. Ook industriële lozingen kunnen de oorzaak zijn dat de stoffen in het oppervlaktewater terechtkomen. In de veeindustrie kunnen de stoffen via uitwerpselen direct op het land terechtkomen en zo in het grondwater infiltreren; bovendien komen ze in het grondwater terecht in landbouwgebieden waar geen vee gehouden wordt maar waar wel dierlijke mest voor bemesting van de gewassen wordt gebruikt. En dan is er nog de aquacultuur (de visindustrie): de antibiotica worden hier meestal rechtstreeks aan het water toegevoegd waarin de vissen gekweekt worden, vaak in grote hoeveelheden (Hirsch et al. 1999; Van Rooyen 2006; Versteegh et al. 2007). Het drinkwater in Amsterdam en omstreken is voor een groot deel afkomstig uit grondwater dat wordt onttrokken uit de Amsterdamse Waterleidingduinen (AWD). Het beheer van dit gebied is in handen van Waternet 1 . De bronnen voor het aanwezige water in de AWD worden zowel gevormd door regenwater dat op natuurlijke wijze infiltreert in de duinen, als door voorgezuiverd water uit de Rijn. Dit Rijnwater wordt ingenomen in het Lekkanaal ter hoogte van Nieuwegein, vervolgens voorgezuiverd en daarna kunstmatig geïnfiltreerd in de duinen. De duinen zelf vormen een ‘natuurlijk filter’: het natuurlijke verloop van het water onder de grond na infiltratie – de ‘bodempassage’ – vormt een belangrijk deel van het 1

Voorheen Waterleidingbedrijf Amsterdam (WLB); sinds 01-01-2006 Waternet. In eerdere onderzoeken wordt dus vaak de naam WLB gehanteerd.

5

zuiveringsproces in de AWD. Na deze bodempassage vinden nog een aantal chemische processen van nazuivering plaats (Waternet 2009; IBED 2009). Dit onderzoek gaat om een aantal werkzame stoffen uit antibiotica. Onderzocht wordt wat kan worden gezegd over de invloed van bodempassage op de aanwezigheid van deze stoffen in het grondwater in de Amsterdamse Waterleidingduinen. Gezien het korte tijdsbestek zal in dit onderzoek slechts een beperkt aantal meetlocaties en een beperkt aantal stoffen onderzocht worden. Het onderzoek kan gezien worden als een inventarisatie voor verder onderzoek. De selectie van stoffen die onderzocht worden: amoxicilline, tetracycline, chloortetracycline, oxytetracycline, sulfamethazine en sulfamethoxazol. Over de mate van schadelijkheid voor de mens van deze stoffen is nog weinig bekend. In het algemeen is het niet wenselijk dat mensen onbedoeld een antibioticum binnenkrijgen. Voor drie van de zes onderzochte antibiotica – amoxicilline, oxytetracycline en sulfamethoxazol – zijn wel acute toxiciteitgegevens bekend, maar deze gegevens zijn gebaseerd op de toxicologische limietwaarde voor aquatische organismen, niet voor mensen. Bovendien is hiermee nog niets gezegd over de chronische toxiciteit: de mate van giftigheid van de stoffen bij langdurige blootstelling aan lage concentraties (Schrap et al. 2003). Dit is echter binnen dit veld van onderzoek juist erg belangrijk; het gaat hier immers om drinkwater, en gezien het dagelijkse gebruik van drinkwater gaat het hier bij uitstek om langdurige blootstelling. In het algemeen geldt dat voor geneesmiddelen in drinkwater nog geen risiconormen zijn opgesteld, waardoor drinkwaterbedrijven vooralsnog de grenswaarde hanteren zoals die geldt voor pesticiden: 0,1 μg/l (Van Rooyen 2006). Bovendien is onduidelijk wat de toekomst van de geneesmiddelen is. Factoren die worden genoemd waar rekening mee gehouden moet worden met betrekking tot veranderend medicijngebruik, zijn de toenemende vergrijzing en de makkelijker wordende toegang tot bepaalde medicijnen; het is waarschijnlijk dat een verandering in medicijngebruik van invloed is op de concentratie geneesmiddelen in het oppervlaktewater (Versteegh et al. 2007). Wat bovendien een belangrijke consequentie kan zijn van de aanwezigheid van antibiotica in het grondwater is de mogelijkheid dat de in het water aanwezige bacteriën een resistentie ontwikkelen tegen deze antibiotica (Hirsch et al. 1999; Karthikeyan & Meyer 2006; Bendz et al. 2005). Gevolg zou zijn dat deze antibiotica niet meer bruikbaar zijn als geneesmiddel voor mensen en dieren. Daarbij, afgezien van mensen en menselijke geneesmiddelen, worden ecosystemen zelf en alle daar in levende organismen belast door de aanwezigheid van deze stoffen. Het is dus belangrijk dat onderzocht wordt óf en in welke mate antibiotica voorkomen in het grondwater in de AWD en hoe zij zich gedragen wanneer ze daar terecht zijn gekomen; zowel voor het ecosysteem van de duinen als voor de mensen, voor wie het drinkwater bereid wordt. De onderzoeksvraag is derhalve: Wat is te zeggen over het gedrag van antibiotica in het grondwater tijdens bodempassage in de Amsterdamse Waterleidingduinen aan de hand van analyse van watermonsters? Er zal worden gekeken naar de mate van filtering van de stoffen door het proces van bodempassage in de AWD. Er worden (grond)watermonsters genomen van het geïnfiltreerde Rijnwater, verspreid over het traject van infiltratie in de duinen tot terugwinning na de bodempassage. Het gaat hier dus om het water ná voorzuivering en vóór 6

nazuivering, dat wil zeggen hier wordt alleen het effect van de bodempassage zelf onderzocht, en niet de eventuele filtering van de stoffen tijdens het proces van nazuivering. De watermonsters worden opgewerkt door middel van SPE-extractie (‘solid-phase extraction’) en daarna geanalyseerd met behulp van een LC-MS/MS apparaat. Bovendien is eerst een proces van optimalisatie gedaan. Hierin zijn de stappen van opwerking en analyse op twee verschillende manieren uitgevoerd met standaarden (bekende hoeveelheden van de betreffende stoffen), alvorens de analyse van de echte monsters uit te voeren. Na het bepalen van de beste methode van deze twee is vervolgens een calibratie gedaan aan de hand van bekende levels van de stoffen. Hierna konden de echte monsters worden geanalyseerd. De gehele methode wordt beschreven in het volgende hoofdstuk (hoofdstuk 2). 1.1 De stoffen De stoffen die onderzocht worden – amoxicilline, tetracycline, chloortetracycline, oxytetracycline, sulfamethazine en sulfamethoxazol – zijn alle zes werkzame stoffen uit antibiotica. Het kan hierbij zowel gaan om antibiotica voor humaan gebruik als om antibiotica voor gebruik in de vee- of visindustrie. Voor structuurformules en enkele andere gegevens van de stoffen zie bijlage 1. Alle zes stoffen binnen dit onderzoek zijn in meer of mindere mate polair, dat wil zeggen dat ze beter oplossen in water dan in vet-achtige substanties (ze zijn hydrofiel). Om de polariteit van stoffen aan te geven wordt de log K ow gebruikt: de octanol-water partitiecoëfficiënt. Deze geeft de verhouding aan tussen het deel van de stof dat oplost in octanol en het deel dat oplost in water. Over het algemeen wordt aangehouden: log K ow < 1 = polair; 1 < log K ow > 3 = matig polair; log K ow > 3 = apolair (ook wel hydrofoob) 2 . De in dit onderzoek onderzochte stoffen variëren tussen log K ow = -2 en log K ow = 0,9 (voor de precieze waardes per stof zie bijlage 1), en zijn daarmee dus alle zes polair. Deze classificatie is van belang, omdat dit een indicatie geeft voor het gedrag van de stoffen in water in het algemeen, en dus ook voor het gedrag in grondwater. Wanneer stoffen namelijk apolair zijn, lossen ze niet goed op in water. De kans is dan groot dat ze sorberen aan meer polaire stoffen, zoals de organische koolstof in de bodem. Dus: hoe hoger de K ow van een stof, hoe groter het deel van die stof dat sorbeert aan de organische fase in de bodem, in verhouding tot het deel dat oplost in de waterfase en dus mobiel blijft. De te onderzoeken stoffen lossen dus eerder op in water dan te sorberen aan de bodem. Dit onderscheid is van belang bij het zuiveringsproces van het water: het kan implicaties hebben voor het filterproces. Nu zijn de stoffen die tot op heden op de prioritaire stoffenlijsten staan met name apolaire stoffen, en zijn de zuiveringsmethoden die door de drinkwaterbedrijven worden toegepast dan ook voornamelijk toegerust op het filteren van dit type stoffen. Over het filteren van de meer polaire stoffen is nog veel minder bekend. Het is daarom belangrijk om te onderzoeken in welke mate deze polaire stoffen door het huidige zuiveringsproces uit het water gefilterd worden.

2

In feite is log K ow = 0 natuurlijk de evenwichtsgrens, immers als log K ow = 0 dan is K ow = 1, wat betekent dat de verhouding octanol : water = 1 : 1. Toch wordt algemeen de grens van log K ow < 1= polair aangehouden.

7

1.2 Literatuur: eerder aangetroffen concentraties Om een idee te hebben van de te verwachten waarden, en om de levels voor de calibratie te kunnen bepalen, is in de literatuur gezocht naar de eerder aangetroffen concentraties van de bewuste stoffen. Het is hierbij belangrijk om een onderscheid te maken tussen de verschillende typen ‘waterbronnen’: gaat het om afvalwater, oppervlaktewater, grondwater of drinkwater? Binnen dit onderzoek gaat het zowel om oppervlaktewater (namelijk het infiltrerende Rijnwater) als om grondwater. Bovendien is er nog een verschil tussen grondwater dat ontstaat door oeverinfiltratie en grondwater dat ontstaat door duininfiltratie, zoals het bemonsterde grondwater in de AWD. Nu is er in de literatuur nog vrij weinig te vinden specifiek over deze stoffen en dit type infiltratie. Een van de onderzoeken waar dit wel specifiek in terug komt is het onderzoek van Van Rooyen (2006). De aangetroffen concentraties in dat onderzoek voor sulfamethoxazol in grondwater bij duininfiltratie liggen in een range van 10 tot 40 ng/l. Ook zijn metingen gedaan aan het oppervlaktewater, namelijk aan het Lekkanaal bij Nieuwegein, bij het innamepunt van Rijnwater. Deze concentraties beslaan voor sulfamethoxazol samen een range van 10-68 ng/l. Bovendien benadrukt Van Rooyen dat sulfamethoxazol een vrij persistente stof is: nog vóór duininfiltratie wordt door de stoffen een traject afgelegd in de Rijn zelf tussen Lobith (waar de Rijn Nederland binnenkomt) en Nieuwegein (waar het Rijnwater, via het Lekkanaal, wordt ingenomen voor infiltratie in de duinen). Dit traject kan soms een aardig verdunnend effect hebben op bepaalde stoffen, maar dat blijkt dit niet het geval te zijn voor sulfamethoxazol. Hieraan valt volgens Van Rooyen te zien dat het hier om een vrij persistente stof gaat (Van Rooyen 2006). Ook Bendz et al. (2005) komen tot de conclusie dat sulfamethoxazol in hoge mate persistent is (Bendz et al. 2005). Versteegh et al. (2007) hebben ook onderzoek gedaan naar het voorkomen van sulfamethoxazol. De hoogst gemeten waarde die Versteegh vindt in oppervlaktewater is 160 ng/l. Bovendien wordt sulfamethoxazol ook aangetroffen in het drinkwater zelf: de hoogst gemeten waarde die hij aantreft in het drinkwater is 25 ng/l. Hij treft deze stof zelfs ‘vaak’ aan volgens eigen classificatie (i.e. ‘vaak’ = >10% van de metingen). De concentraties in het oppervlaktewater zijn dus wel beduidend hoger dan de eventueel nog voorkomende concentraties in het drinkwater zelf. Versteegh benadrukt dan ook dat duinpassage wel degelijk effect heeft op de concentratie sulfamethoxazol, maar dat de stof niet volledig wordt verwijderd (Versteegh et al. 2007). Eén van de meetlocaties van Versteegh bevindt zich in de AWD; hij meet daar eveneens voorgezuiverd Rijnwater uit het Lekkanaal na bodempassage. In deze meting geeft hij voor sulfamethoxazol een waarde van 20 ng/l (Versteegh et al. 2007). Hirsch et al. (1999) hebben watermonsters onderzocht op alle zes genoemde stoffen. De monsters zijn afkomstig van het afvalwater van rioolwaterzuiveringsinstallaties (rwzi’s), oppervlaktewater en grondwater in landbouwgebieden. In de rwzi’s en oppervlaktewatermonsters werd alleen sulfamethoxazol aangetroffen; de andere stoffen werden in het geheel niet aangetroffen. De maximaal gemeten waarde voor sulfamethoxazol was 2 μg/l (2000 ng/l) in de afvalwatermonsters en 0,48 μg/l (480 ng/l) in de oppervlaktewatermonsters. In de grondwatermonsters werd zowel sulfamethoxazol als sulfamethazine – sporadisch – aangetroffen; voor sulfamethoxazol was de hoogst gemeten waarde 0,47 μg/l (470 ng/l); voor sulfamethazine 0,16 μg/l (160 ng/l). Schrap et al. (2003) doen onderzoek naar de stoffen amoxicilline, sulfamethoxazol, tetracycline, chloortetracycline en oxytetracycline. Schrap treft de stoffen tetracycline en 8

chloortetracycline in het geheel niet aan. Sulfamethoxazol wordt redelijk vaak aangetroffen, in een range van 10-100 ng/l. Oxytetracycline wordt enkele keren aangetroffen, in een range van 28 tot 90 ng/l. Amoxicilline wordt slechts één keer aangetroffen, in een concentratie van 25 ng/l. Karthikeyan & Meyer (2006) doen onderzoek naar het voorkomen van stoffen in rwzi effluent: zij onderzoeken op de stoffen sulfamethazine, sulfamethoxazol, tetracycline, chloortetracycline en oxytetracycline. Tetracycline en sulfamethoxazol worden vaak aangetroffen, met een maximale concentratie van respectievelijk 850 en 370 ng/l; sulfamethazine wordt af en toe aangetroffen en de overige twee stoffen worden helemaal niet aangetroffen. De genoemde maximumwaardes voor tetracycline en sulfamethoxazol zijn vrij hoog, men moet hier echter wel bedenken dat het ook hier gaat om (voorgezuiverd) afvalwater en dat de daarin gevonden concentraties meestal beduidend hoger zijn dan die in oppervlaktewater en grondwater. Deze concentraties komen nog lang niet in de buurt van de werkzame hoeveelheid die wordt ingenomen wanneer de stoffen daadwerkelijk als geneesmiddel worden gebruikt. Zo is voor de stof sulfamethoxazol de dagelijkse voorgeschreven dosis minimaal 2 gram, maximaal 3 gram (Martindale 1999 in Versteegh et al. 2007). Aangezien de aangetroffen concentraties in het water in de range van maximaal enkele microgrammen liggen, gaat het hier om een heel andere orde van grootte. Echter, het is onduidelijk wat de toekomst zal zijn van het medicijngebruik: zoals eerder gezegd noemt Versteegh factoren als de toenemende vergrijzing en het steeds makkelijker toegang krijgen tot bepaalde medicijnen, waardoor ook de concentraties in het water zouden kunnen veranderen (Versteegh et al. 2007).

9

2. Methode en materialen Voor een gedetailleerde beschrijving van de methode en de benodigde materialen, zie bijlage 2 en 3. 2.1 Monstername De watermonsters zijn genomen in het noordelijke deel van de Amsterdamse Waterleidingduinen. Er is gekozen voor een raai die al eerder is gebruikt voor onderzoek naar waterkwaliteit: het ‘Van der Vliet-transect’ (o.a. Eschauzier 2009), zie de kaart in figuur 1. Het voorgezuiverde Rijnwater infiltreert hier in het (naamloze) infiltratiekanaal dat is omcirkeld links op de kaart, en legt vervolgens onder de grond de weg af tot het Van der Vliet-kanaal rechts op de kaart, waar het weer boven komt (het terugwinkanaal). Verspreid over deze raai zijn peilbuizen geplaatst door Waternet; dit zijn de nummers op de kaart. Voor dit onderzoek zijn vijf watermonsters genomen: één monster uit het infiltratiekanaal, drie monsters uit peilbuizen verdeeld over de raai en één monster uit het terugwinkanaal: het Van der Vliet-kanaal (boven dam 11). Dit zijn de vijf omcirkelde locaties, met de drie peilbuizen v.l.n.r.: 24H478, 24H481 en 24H484. Bovendien is een veldblanco gemaakt. Dit is een fles die op de plek van peilbuis 24H484 is gevuld met subboiled water, en verder niet meer opengemaakt en op dezelfde wijze behandeld als de andere flessen. Bij terugkomst in het lab zijn alle flessen direct in de koelkast geplaatst. Bij de opwerking is gekozen om één van de monsters uit de peilbuizen in duplo op te werken, dit is het monster uit peilbuis 24H478. Opwerking in duplo komt de betrouwbaarheid van het onderzoek ten goede, maar gezien het tijdsbestek van het onderzoek was het niet mogelijk om alle monsters in duplo op te werken. Eén duplo opwerking geeft echter ook al een indruk van de betrouwbaarheid van de methode. Inclusief veldblanco en duplo zijn in totaal dus zeven monsters geanalyseerd.

Figuur 1 De raai met de monsterlocaties. Links het infiltratiekanaal, rechts het terugwinkanaal (Van der Vliet-kanaal), tussenliggend de peilbuizen. De vijf monsterpunten zijn omcirkeld. Bron: Eschauzier 2009 (aanduiding locaties toegevoegd).

10

De monsters zijn genomen op 14-05-2009. Per peilbuis zijn er verschillende minifilters, door middel waarvan water opgepompt kan worden van verschillende dieptes. Om te bepalen welke minifilters gebruikt moesten worden, is een overzicht van Stuyfzand gebruikt (Stuyfzand 1993), zie figuur 2 en 3. Dit overzicht is al enkele tientallen jaren oud, maar wordt af en toe gecontroleerd en blijkt nog steeds up to date te zijn (Eschauzier 2009). Beide figuren geven een dwarsdoorsnede van het genoemde transect; links rood omcirkeld het infiltratiekanaal, rechts rood omcirkeld het Van der Vliet-kanaal en daartussen rood omcirkeld de bemonsterde peilbuizen. Voor dit onderzoek wordt alleen het infiltrerende Rijnwater bemonsterd en niet het regenwater, omdat niet te verwachten is dat de te onderzoeken antibiotica zich in het regenwater bevinden. Het is dus van belang om ónder de regenwaterbel te bemonsteren, die in figuur 2 is aangegeven door de gestippelde en gearceerde delen. Binnen het korte tijdsbestek van dit onderzoek kon niet op verschillende dieptes per peilbuis worden bemonsterd. De dieptes zijn dus zo gekozen dat wel duidelijk ónder het regenwater is bemonsterd en dat de verschillende monsters van verschillende ouderdom zijn en dus een verschillend waterpakket vertegenwoordigen. In figuur 2 is aangegeven welke minifilters zijn gebruikt. In figuur 3 is hieraan af te lezen wat ongeveer de ouderdom van het water uit deze minifilters is, zie voor het overzicht tabel 1.

Figuur 2 Dwarsdoorsnede van het gemeten transect. De gebruikte monsterpunten zijn rood omcirkeld; de gebruikte minifilters zijn donkerblauw omcirkeld. Met rode peilen is grofweg de loop van het grondwater aangegeven. Bron: Stuyfzand in Eschauzier 2009 (aanduiding locaties en minifilters toegevoegd).

11

Figuur 3 Dwarsdoorsnede van het gemeten transect. De grote getallen op de isochronen (‘4’-‘24’) geven de verblijftijd van het grondwater aan. (De kleine getallen, ‘<53’-‘78’, geven het jaar van infiltratie aan. Hier moet men binnen dit onderzoek niet naar kijken: het is een oud onderzoek dus die getallen zijn nu niet meer van toepassing; de ondergrondse loop van het water en de verblijftijden op de isochronen kloppen echter nog wel). Bron: Stuyfzand in Eschauzier 2009 (aanduiding locaties toegevoegd).

Peilbuis Minifilter nr. Ouderdom water (jr) 24H478 15 4 24H481 13 9 24H484 6 18 Tabel 1 Overzicht van de gebruikte minifilters en bijbehorende ouderdom van het grondwater per peilbuis.

De monsters zijn genomen in voorgespoelde groene glazen 1-literflessen. Per peilbuis is het juiste minifilter aangesloten op een pomp en werd het water opgevangen in met methanol voorgespoelde glazen flessen. De eerste inhoud werd weggegooid. Vervolgens werd per peilbuis 800 ml monster verzameld en overgespoeld in de groene monsterflessen. De monsters in de twee kanalen werden genomen door de flessen onder te dompelen (ook hier werd de eerste inhoud weggegooid). Bij alle monsters werd tussen de fles en de dop een stukje aluminiumfolie gedaan om contaminatie te voorkomen. Bij terugkomst in het lab werden de flessen direct in de koelkast geplaatst.

12

2.2 Optimalisatie Zoals gezegd is eerst een optimalisatie van het analyseproces uitgevoerd. In verschillende eerdere onderzoeken wordt gebruik gemaakt van twee verschillende typen SPE-kolommen. In het optimalisatieproces van dit onderzoek wordt getest welke van beide kolommen in dit geval het meest geschikt is voor analyse van de te meten stoffen. De gebruikte SPEkolommen zijn een MCX-kolom en een HLB-kolom (voor specificaties zie bijlage 2). Tijdens deze optimalisatie wordt de hele procedure 4x uitgevoerd: per kolom wordt zowel een standaardoplossing als een blanco met alleen subboiled water opgewerkt. De standaardoplossing bestaat uit subboiled water waaraan 2 ml van een spikemix wordt toegevoegd; deze mix bestaat uit een bekende hoeveelheid van elk van de stoffen, zodat later teruggerekend kan worden hoeveel wordt teruggevonden na analyse. Bovendien worden in deze optimalisatie de extracten die worden verkregen opgevangen in verschillende fracties, om te weten te komen in welke fase van de elutie de te meten stoffen meekomen met het eluens. Deze informatie kan weer worden gebruikt bij elutie van de echte monsters. Na analyse van de resultaten van dit optimalisatieproces bleek de HLB SPE-kolom het meest geschikt voor analyse van deze stoffen. De opwerking van de genoemde blanco’s en standaardoplossingen is op dezelfde manier gebeurd als de opwerking van de echte monsters; zie de volgende paragraaf. Kanttekening hierbij is dat de stof sulfamethoxazol niet is meegenomen in dit optimalisatieproces. Dit komt door het feit dat de standaard van deze stof te laat geleverd werd om nog te kunnen meenemen in de optimalisatie van de SPE-extractie. Voor sulfamethoxazol is daarom uitgegaan van dezelfde methode als voor de andere stoffen: SPEextractie over een HLB-kolom. 2.3 Calibratie Om de berekeningen met betrekking tot de hoeveelheden van de te onderzoeken stoffen in de monsters te kunnen uitvoeren, moet een calibratie worden gedaan. Dat houdt in dat een calibratiegrafiek is gemaakt voor de verschillende stoffen aan de hand van bekende hoeveelheden van de stoffen. Hiervoor zijn er ‘levels’ samengesteld: van de standaarden van alle zes stoffen zijn mixen gemaakt in verschillende – bekende – hoeveelheden. Deze levels zijn geanalyseerd in het LC-MS/MS apparaat. Er is in eerste instantie gekozen voor vijf verschillende levels: er zijn vijf mixen gemaakt waaraan per mix iedere stof steeds in een bekende – oplopende – hoeveelheid is toegevoegd. Deze mixen werden niet eerst opgewerkt door middel van SPE-extractie, maar werden rechtstreeks geïnjecteerd in het LC-MS/MS apparaat. Per level werden er drie injecties gedaan; al deze waardes werden meegenomen in de calibratiegrafiek die werd gemaakt door middel van lineaire regressie. Deze grafiek wordt gebruikt als ijklijn: de geïnjecteerde hoeveelheden worden handmatig ingevoerd in het rekenprogramma van het apparaat, en zo kan een verhouding worden berekend tussen de gevonden piekoppervlakken en de hoeveelheden geïnjecteerde stof. De samenstelling van de levels is bepaald naar aanleiding van de te verwachten aan te treffen concentraties van de stoffen in het grondwater (uit de gepubliceerde literatuur kan hiervan een indruk worden verkregen, zie paragraaf 1.2). Het is namelijk van belang dat de te verwachten concentraties binnen de range van de levels vallen, dus tussen het hoogste en laagste level (zogenaamde ‘bracketing’), omdat dan de ijklijn bij terugrekenen de meest 13

betrouwbare resultaten geeft. Wanneer de concentraties namelijk buiten de brackets vallen, moet worden geëxtrapoleerd en dat maakt dat de resultaten (de berekende concentraties) minder betrouwbaar worden. Uiteindelijk is één van de stoffen aangetroffen binnen de range van de eerste calibratie. Om deze reden is nog een calibratie gedaan met een set met lagere levels. Binnen deze calibratie is ook één stof aangetroffen. De samenstellingen van de levels en de bijbehorende calibratiegrafieken zijn te vinden in bijlage 4. 2.4 Opwerking monsters Per monster wordt 400 ml afgemeten. Dit wordt met waterstofchloride aangezuurd tot pH 2,5. Aan het monster worden vervolgens recovery standaarden toegevoegd (‘interne standaarden’). Aan de hand van deze interne standaarden is achteraf de recovery te berekenen: de hoeveelheid van de stof, aanwezig vóór opwerking, die daadwerkelijk wordt gemeten. Het is namelijk van tevoren precies bekend hoeveel van de interne standaard (IS) aan het monster wordt toegevoegd. Stel dat van de IS uiteindelijk 80% wordt gemeten van wat er oorspronkelijk is toegevoegd, dan is de recovery dus 80%. Dat niet 100% van de IS wordt teruggevonden in de meting kan verschillende oorzaken hebben. Zo zou het kunnen dat er een deel van deze stof verloren is gegaan tijdens het proces van opwerking van het monster, bijvoorbeeld omdat het eluens niet alles van de SPE-kolom heeft kunnen extraheren. Ook zou het kunnen dat het LC-MS/MS apparaat een afwijking in de meting vertoont. Wat de oorzaak ook is, in dit onderzoek is dat niet van groot belang; waar het om gaat is dat aan de hand van het recovery-percentage van de IS ook te zeggen is hoeveel van de analyt (de te meten stof) wordt teruggevonden in de meting. De recovery is namelijk hetzelfde voor de IS als voor de analyt, door de similariteit van de stoffen, dus aan de hand van dit recoverypercentage wordt de uiteindelijke hoeveelheid in het monster aanwezige analyt berekend. De stof die dient als interne standaard moet dan natuurlijk zo worden gekozen, dat hij zich precies zo gedraagt als de analyt (dezelfde fysisch-chemische eigenschappen heeft), maar daar niet mee te verwarren is. In dit experiment is daarom gekozen voor 13C sulfamethoxazol als IS voor het bepalen van de recovery van sulfamethoxazol, en voor 13C sulfamethazine als IS voor het bepalen van de recovery van sulfamethazine en de andere vier stoffen (want niet voor alle stoffen was een 13C-variant beschikbaar). De varianten van sulfamethoxazol en sulfamethazine waarop wordt onderzocht in dit onderzoek zijn bij beide de 12C-variant. Dit is de normale verschijningsvorm van de stof. Het voordeel van de 13Cvariant is dat deze niet vrij in de natuur voorkomt, en dus niet te verwarren is met de 12Cvariant, maar wel dezelfde fysisch-chemische eigenschappen heeft. De SPE-patronen worden onder glazen kolommen geklemd en geconditioneerd met achtereenvolgens methanol en aangezuurd subboiled water. Vervolgens wordt de afgemeten 400 ml monster opgegoten. De SPE-methode is er op gebaseerd dat de te meten stoffen op de vaste fase van het SPE-patroon blijven zitten. Wanneer alle 400 ml over de kolom is gegoten, wordt nog nagespoeld met aangezuurd subboiled water en vervolgens worden de patronen een uur gedroogd door er stikstof overheen te blazen. Hierna wordt over de gedroogde SPE-patronen een eluens gegoten; in dit geval is dat methanol. De stoffen waar het om gaat lossen op in de mobiele fase (het eluens) en spoelen zo mee uit; dit eluens wordt opgevangen. Op deze manier ontstaat een extract dat de voordelen heeft dat het veel geconcentreerder is dan het oorspronkelijke monster, dat het minder vervuild is (minder niet-doelstoffen bevat), en dat het als basis methanol heeft in plaats van water. 14

Dit extract wordt vervolgens ingedampt om het nog geconcentreerder te maken, van ongeveer 2 ml tot 200 μl; dit wordt weer verdund met 800 μl subboiled water. De laatste stap vóór injectie in het LC-MS/MS apparaat is filtratie. Dit gebeurt om er geheel zeker van te zijn dat alle eventueel aanwezige vaste stofdeeltjes uit het monster verwijderd zijn. Het monster wordt hierbij in een polypropyleen spuit door een acrodisc filter geperst (voor specificaties van het filter zie bijlage 2). 2.5 Analyse met LC-MS/MS Per monster (extract) wordt twee keer 50 μl geïnjecteerd in het LC-MS/MS apparaat. Dit apparaat bestaat uit twee delen: HPLC en MS/MS. HPLC staat voor High Performance Liquid Chromatography (vloeistofchromatografie) en MS staat voor Mass Spectrometry (massaspectrometrie). Voor de specificaties van het apparaat zie bijlage 3. Het apparaat bestaat uit een LC Shimadzu (HPLC-deel) gekoppeld aan een Applied Biosystems MDS SCIEX: 4000 Q TRAP LC/MS/MS System (MS-deel). Vloeistofchromatografie is gebaseerd op een mobiele fase die langs een stationaire fase geleid wordt. Het extract wordt geïnjecteerd in de LC Shimadzu. Door de opwerking zoals beschreven is getracht dit extract zo ‘schoon’ mogelijk te maken en zoveel mogelijk voor dit onderzoek irrelevante stoffen te verwijderen. Echter er blijven altijd verschillende stoffen in het extract aanwezig. Door injectie worden de stoffen meegevoerd, met een continue vloeibare mobiele fase, langs de stationaire fase van de kolom in de Shimadzu. De verschillende stoffen hebben allemaal een verschillende aanhechtingskracht aan de stationaire fase van de kolom, en de verschillende chemische interacties met de stationaire fase zorgen er dus voor dat alle stoffen een verschillende ‘verblijftijd’ in de kolom hebben. Dit wordt de retentietijd genoemd en deze ligt vast per stof: dat is de voor een stof karakteristieke tijd vanaf het binnengaan van de kolom tot aan detectie. In de hierop aangesloten massaspectrometer MDS SCIEX (MS/MS) worden de verschillende stoffen vervolgens geïdentificeerd op grond van hun massa, en de aanwezige hoeveelheid van de stoffen wordt bepaald aan de hand van het signaal dat de ionen van een stof uitzenden. De resultaten (output) worden vervolgens weergegeven in een chromatogram: een grafiek waarin de retentietijden op de x-as worden uitgezet tegen de intensiteit van het signaal op de y-as. Een chromatogram wordt echter gemaakt per injectie, niet per stof: alle gemeten ionen worden dus weergegeven in één grafiek; per aangetroffen stof ziet men in de grafiek een piek. Aan de retentietijd (de x-as) kan vervolgens worden gezien om welk ion het gaat; en de intensiteit (de y-as) geeft een indicatie van de mate waarin de stof voorkomt; het piekoppervlak onder de pieken in de grafiek van een stof wordt dan ook gebruikt om de aanwezige hoeveelheid van een stof in een injectie te berekenen. Om de betrouwbaarheid van de methode te toetsen, is zoals gezegd één van de monsters in duplo opgewerkt: binnen het tijdsbestek van dit onderzoek was het onmogelijk om alle monsters in duplo op te werken, maar één duplo opwerking geeft toch ook al een indruk van de betrouwbaarheid van de methode. Uiteindelijk zijn dus zeven verschillende monsters volgens bovenstaande methode opgewerkt en geanalyseerd: een monster van het infiltratiekanaal, een monster van het terugwinkanaal, vier grondwatermonsters (de monsters uit de drie peilbuizen, waarvan één in duplo), en een veldblanco.

15

Bovendien zijn zoals gezegd meerdere injecties per monster gedaan. Bij de calibratie zijn per level drie injecties gedaan; bij de echte monsters is extract twee keer geïnjecteerd. In de resultaten is steeds het gemiddelde van deze twee waardes genomen.

16

3. Resultaten Van de zes onderzochte stoffen zijn er binnen dit onderzoek twee in de monsters aangetroffen: sulfamethazine en sulfamethoxazol. De overige vier stoffen – amoxicilline, tetracycline, chloortetracycline en oxytetracycline – zijn niet aangetroffen. Een voorbeeld van de output uit het LC-MS/MS apparaat in de vorm van een chromatogram is te zien in figuur 4 (volgende pagina). Dit chromatogram geeft de analyse weer van monster ‘478_1’, dat wil zeggen het grondwatermonster uit peilbuis 24H478, eerste van duplo opwerking, eerste injectie. Voor de gehele codering van alle monsters zie onderstaande tabel (tabel 2). Voor de codering van de stoffen zie tabel 3. Codering onder elkaar steeds eerste injectie en tweede injectie

Monster

5LNF_1 Infiltratiekanaal 5LNF_2 478_1 24H478 – duplo opwerking 1 478_2 778b_1 24H478 – duplo opwerking 2 778b_2 381_1 24H481 381_2 284_1 24H484 284_2 1VDV_1 Terugwinkanaal 1VDV_2 (Van der Vliet-kanaal) 6VB_1 Veldblanco 6VB_2 Tabel 2 Codering van de monsters. Links de code zoals gebruikt in de chromatogrammen, rechts de verklaring (het bijbehorende monster). Per monster zijn twee injecties gedaan; voor de duidelijkheid zijn bij de codering beide injecties gegeven.

Codering Stof AMXC Amoxicilline TC Tetracycline CTC Chloortetracycline OTC Oxytetracycline SM Sulfamethazine SMX Sulfamethoxazol Tabel 3 Codering stoffen.

17

Figuur 4 Chromatogram van monster 478_1. Bovenaan het gehele chromatogram inclusief alle aangetroffen ionen, eronder de verschillende stoffen in aparte chromatogrammen.

18

In deze figuur is bovenaan het chromatogram te zien zoals dat door het apparaat gegeven wordt voor het gehele monster. Daaronder zijn de chromatogrammen per stof weergegeven. Hiervoor is per stof op de bijbehorende retentietijd van het betreffende ion gescand, en als op die retentietijd een piek is gevonden is die weergegeven. Zo valt te zien dat de tweede en derde grafiek van boven een duidelijk te onderscheiden piek weergeven, en de grafieken daaronder niet. De stoffen in deze twee grafieken zijn dus aangetroffen; de stoffen in de grafieken daaronder niet. Echter, het apparaat geeft ook het achtergrondsignaal weer dat het meet, de ‘ruis’. Dit is een redelijk continue achtergrondsignaal dat niet voor een bepaalde stof staat. Om te bepalen wanneer een piek hoog genoeg is om van de ruis onderscheiden te worden en dus van enige betekenis te zijn, wordt een kwantificatielimiet gebruikt (‘limit of quantification’: LOQ). Om vast te stellen bij welke ‘hoeveelheid injectie’ deze ondergrens bereikt wordt, zijn de levels uit de calibratie gebruikt. Per stof is het laagste level genomen dat nog een piek (signal) gaf, en op grond daarvan is berekend wat de laagst meetbare hoeveelheid is: de LOQ 3 . Zie de volgende paragraaf. 3.1 Kwantificatielimieten Binnen dit onderzoek is de LOQ zo vastgesteld dat een piek minimaal 2 keer zo hoog moet zijn als de gemiddelde ruishoogte om van enige betekenis te zijn. Dat wil zeggen: S/N = 2 (‘Signal-to-Noise ratio’ = 2). Hiervoor wordt eerst de S/N ratio van het betreffende level vastgesteld: S/N Vervolgens wordt aan de hand van de bekende (want zelf toegevoegde) hoeveelheid analyt de concentratie per liter voor dat level berekend, op dezelfde manier als wanneer het om een monster zou gaan. De injectie voor de monsters is immers slechts 50 μl uit 1 ml, en die 1 ml komt uit de oorspronkelijke 400 ml, dus voor omrekenen naar de concentratie in ng/l: Amount in level * 20 * 2,5 Om om te rekenen naar de minimumhoeveelheid die dus geïnjecteerd moet worden om een signaal te geven: Concentratie level / (S/N ratio) Omdat ten slotte zoals gezegd is vastgesteld, om onzekerheden te voorkomen, om de ondergrens op S/N = 2 vast te stellen, moet hiervoor gecorrigeerd worden:

3

In verschillende onderzoeken en verschillende laboratoria bestaat een grote verscheidenheid aan soorten limieten en bijbehorende waarden die worden gehanteerd. Zo wordt soms een kwantificatielimiet gehanteerd, maar soms ook een detectielimiet. Ook de gebruikte methoden om deze vast te stellen en de waarden van de limieten variëren behoorlijk. De hier beschreven methode en waarde zijn vastgesteld in overleg met Frans van der Wielen, analist in het UvA-lab waar de analyses zijn uitgevoerd.

19

LOQ = Concentratie level / (S/N ratio) * 2 Alle LOQ-waarden zijn gegeven in tabel 4. Voor deze berekening zijn de gemiddelde ruishoogtes geschat; de piekhoogtes zijn gegeven in de output van de software van het apparaat. Steeds is de eerste injectie van het betreffende level gebruikt. Stof AMXC TC CTC OTC SM SMX

Type calibratie

Gebruikt level

Hoogte Hoogte piek ruis

S/N ratio

Amount in Concentratie level (ng) level (ng/l)

LOQ (ng/l): Correctie naar S/N = 2

Hoge calibratie lev1_1 1740 15 116,0 0,66 33 Lage calibratie lev3V_1 210 8 26,3 0,231 11,55 Hoge calibratie lev3_1 344 25 13,8 12,6 630 Hoge calibratie lev2_1 212 10 21,2 3,75 187,5 Lage calibratie lev1V_1 193 10 19,3 0,0321 1,605 Lage calibratie lev1V_1 188 13 14,5 0,0633 3,165 Tabel 4 Kwantificatielimieten. De kwantificatielimieten in de laatste kolom; de overige gegevens relevant voor berekening ervan in de rest van de tabel.

Aan de chromatogrammen (figuur 4) is dus te zien dat de tweede en derde stof daadwerkelijk een signaal van betekenis geven (S/N > 2), op de onderste vier chromatogrammen is slechts ‘ruis’ te zien. Zoals gezegd wordt op de y-as de intensiteit weergegeven; de schaal verschilt per chromatogram. Zo is aan deze schaal te zien dat hoewel de stoffen SM en SMX beide aanwezig zijn, de intensiteit van het signaal in het tweede chromatogram (SMX) een stuk groter is dan die in het derde chromatogram (SM): SMX is dus in hogere mate aanwezig dan SM. 3.2 Aangetroffen concentraties Op grond van het piekoppervlak dat wordt gemeten door het apparaat kan nu de aanwezige concentratie van de betreffende stof in het monster worden berekend. In eerste instantie worden de concentraties berekend en gegeven door de software van het apparaat. Echter om de berekeningen inzichtelijk te maken en om een controle van deze automatische berekeningen te kunnen doen, wordt de methode van berekenen in dit hoofdstuk uitgebreid besproken. De aanwezige concentratie per stof wordt berekend aan de hand van de calibratiegrafiek die is gemaakt op basis van de levels (zie paragraaf 2.3) en de interne standaarden. De gebruikte calibratiegrafieken van sulfamethoxazol en sulfamethazine zijn opgenomen in bijlage 4. Een calibratiegrafiek wordt gemaakt op grond van de verhouding tussen de gemeten waarden van de analyt en van de interne standaard. Op de y-as staat de verhouding ‘Analyte Area/ IS Area’; op de x-as de verhouding ‘Analyte Conc./ IS Conc.’ (‘Conc.’ = Concentration). Bij de levels zijn al deze waardes bekend, en zo kan een grafiek getekend worden. Per level wordt het gemiddelde van drie injecties gebruikt, en na lineaire regressie levert dit een calibratielijn op, waarbij het programma een formule geeft: y=r*x

20

0,57 0,88 91,57 17,69 0,17 0,44

In deze formule is r de richtingscoëfficiënt van de grafiek. Wanneer men nu de aangetroffen concentratie in de monsters wil berekenen, zijn alle gegevens bekend, behalve de ‘Analyte Conc.’. De Analyte Area en de IS Area zijn namelijk de gemeten piekoppervlakken van respectievelijk de te meten analyt en van de interne standaard van het monster. Ook de IS Conc. is bekend: deze is gebaseerd op de hoeveelheid van de interne standaard die aan het monster is toegevoegd. Zoals gezegd zijn in alle monsters slechts twee van de zes onderzochte stoffen duidelijk aangetroffen: sulfamethoxazol en sulfamethazine. In onderstaande tabel (tabel 5) alle aangetroffen concentraties. Wanneer een stof niet aangetroffen is, wordt de LOQ gegeven (‘< LOQ’: de desbetreffende stof is niet aangetroffen boven de kwantificatielimiet). De gegeven concentraties zijn in ng/l, en zijn steeds het gemiddelde van de twee injecties. In de tabel is ook te zien dat in de veldblanco’s geen van de stoffen is aangetroffen. Infiltratie24H478 24H478 24H481 24H484 TerugwinVeldkanaal (1) (2) kanaal blanco Amoxicilline <0,57 <0,57 <0,57 <0,57 <0,57 <0,57 <0,57 Tetracycline <0,88 <0,88 <0,88 <0,88 <0,88 <0,88 <0,88 Chloortetracycline <91,57 <91,57 <91,57 <91,57 <91,57 <91,57 <91,57 Oxytetracycline <17,69 <17,69 <17,69 <17,69 <17,69 <17,69 <17,69 <0,17 Sulfamethazine 6,41 6,64 8,78 14,95 17,25 <0,17 <0,44 <0,44 <0,44 Sulfamethoxazol 937,00 558,50 565,00 <0,44 Tabel 5 Aangetroffen concentraties in ng/l per stof per monsterpunt. De waardes in de tabel zijn steeds het gemiddelde van de twee injecties.

Hoge waardes Het eerste dat opvalt, is dat de aangetroffen concentraties sulfamethoxazol erg hoog zijn. De in de literatuur gevonden waardes variëren van enkele tientallen tot enkele honderden nanogrammen per liter (zie paragraaf 1.2), terwijl de gevonden waardes in dit onderzoek liggen tussen grofweg 500 en 1000 ng/l. Hoewel Hirsch et al. (1999) ook een waarde vinden voor sulfamethoxazol in grondwater van 470 ng/l, zijn de hier gevonden waardes wel erg hoog. Het gaat in dit onderzoek immers om water dat het stadium van voorzuivering al gepasseerd is; bovendien gaat het onderzoek van Hirsch et al. niet over de AWD, en liggen de gemeten waardes uit de onderzoeken die wél over de AWD gaan een stuk lager (Van Rooyen 2006; Versteegh et al. 2007, zie paragraaf 1.2). Het is dus onwaarschijnlijk dat de concentraties voor sulfamethoxazol in de watermonsters werkelijk zo hoog zijn, maar het is niet duidelijk waar deze hoge waardes precies vandaan komen. Het zou kunnen duiden op een fout bij de opwerking, of een fout in de berekeningen, of een meetfout van de apparatuur. De opwerking is vrij nauwkeurig gedaan en een fout in de apparatuur ligt ook niet voor de hand, temeer daar voor andere stoffen wel normale waardes worden gemeten. Het ligt dus voor de hand dat er een fout is gemaakt in de berekeningen; bovendien is dat het enige deel van het proces dat achteraf nog te controleren is. Daarom volgt nu een uitgebreide beschrijving, en daarmee een controle, van de berekeningen van de concentraties zoals berekend door de software van het apparaat.

21

Hierbij moet opgemerkt worden dat het gehele proces van controle en narekenen erg lastig is door het feit dat niet geheel duidelijk lijkt wat de kolommen voorstellen in de resultatentabellen die door het programma gegeven worden – aanduidingen die overigens wel handmatig ingevoerd zijn. Zo lijkt niet altijd het verschil tussen ‘hoeveelheid’ en ‘concentratie’ adequaat ingevoerd, terwijl dit voor de interpretatie van de resultaten erg belangrijk is. Om een indruk te geven van deze output zoals die door de software gegeven wordt, en om eventueel op de volgende pagina’s genoemde waardes na te kunnen zoeken, is een selectie van de relevante kolommen van de twee stoffen die zijn aangetroffen (sulfamethoxazol en sulfamethazine) als tabel opgenomen in bijlage 5. In deze tabellen (bijlage 5) krijgen de vierde en de vijfde kolom de aanduiding ‘Concentration’ (concentratie): ‘Analyte Concentration (ng)’ en ‘Calculated Concentration (ng)’. Analyte Concentration staat voor de zelf toegevoegde hoeveelheid van de te meten stof, daarom is deze kolom ook alleen ingevuld bij de levels en niet bij de echte monsters; bij de echte monsters is dat immers juist de onbekende die door het apparaat gemeten moet worden. Calculated Concentration staat voor de door het apparaat berekende hoeveelheid van de stof aan de hand van het gemeten piekoppervlak. Nu wordt de zesde kolom aangeduid met ‘conc in ng per liter’: concentratie in nanogram per liter. Echter wat is nu de relatie tussen deze kolommen, die alle drie aangeduid worden met ‘concentratie’? Neem bijvoorbeeld de eerste tabel, de resultaten van SMX, hoge calibratie. Ter voorbeeld: bij monster 478_1 staat bij ‘Calculated Concentration’ de waarde 224 ng. Dit is om te beginnen al vreemd: een concentratie is per definitie een hoeveelheid per volume (zoals nanogram per liter), terwijl bij deze kolom alleen de aanduiding ‘nanogram’ staat; in dat geval is er dus sprake van een hoeveelheid in plaats van een concentratie. Wanneer men nu kijkt naar de volgende kolom, ‘conc in ng per liter’, van hetzelfde monster, is de gegeven waarde 0,560 ng/l. Hoewel nog niet precies duidelijk is waar beide waarden vandaan komen, is wel duidelijk hoe de waarde ‘conc in ng per liter’ is berekend, namelijk: 224 / 400 = 0,560. Dit heeft ongetwijfeld iets te maken met het feit dat in dit onderzoek steeds 400 ml watermonster gebruikt is om op te werken. Nu lijkt dus helemaal duidelijk dat het bij de kolom ‘Calculated Concentration’ gaat om een hoeveelheid en niet om een concentratie: door te delen door een volume (400 in het voorbeeld) wordt vervolgens wél een concentratie verkregen (0,560 in het voorbeeld). Het gaat in de kolom Calculated Concentration dus eigenlijk om een hoeveelheid, en blijkbaar om een hoeveelheid per 400 ml (i.e. dus de hoeveelheid per monster). Het gaat hier dus om de hoeveelheid van de analyt per 400 ml. Vervolgens wil men de concentratie uiteraard berekenen per liter, en waarschijnlijk is om deze reden 224 / 400 gedaan. Echter dit geeft niet de concentratie in nanogram per liter, maar in nanogram per milliliter; om dus de uiteindelijke concentratie per liter te krijgen, moet de waarde 224 ng, die geldt per monster van 400 ml, vermenigvuldigd worden met 2,5; in plaats van gedeeld te worden door 400. Dit komt op hetzelfde neer als de waardes uit de kolom ‘conc in ng per liter’ vermenigvuldigen met 1000, namelijk om om te rekenen van milliliter naar liter. Nog een controle voor de gebruikte grootheid is de volgende. Als het in de kolommen ‘Analyte Concentration’ en ‘Calculated Concentration’ zou gaan om concentratie in ng/l, zou dit te lage waarden opleveren in de lage calibratie. Wanneer men namelijk kijkt in de tabel van de lage calibratie van sulfamethazine (SM) is de laagste waarde van de Calculated Concentration ‘0,0259’. Indien het hier inderdaad zou gaan om een concentratie, dus om het aantal nanogram per liter, zou dit neerkomen op een waarde van 0,518 picogram per injectie voor sulfamethazine (namelijk omrekenen naar 50 μl injectie geeft 0,0259 / 2,5 / 20 = 5,18 * 22

10^-4 ng = 0,518 pg per injectie). Vergeleken met eerdere onderzoeken is dit een veel te lage, want in het geheel niet te detecteren, waarde: de detectielimieten in andere onderzoeken liggen rond 10 ng/l. Het moet in deze kolom, ‘Calculated Concentration’ (en hetzelfde geldt dus voor de kolom ‘Analyte Concentration’), dus wel gaan om de hoeveelheid per level (of per monster in het geval van de monsters), en niet om de concentratie per liter. Samengevat zijn dus de volgende aanpassingen gedaan. Er is van uitgegaan dat in de resultatentabellen ‘Analyte Concentration (ng)’ en ‘Calculated Concentration (ng)’ eigenlijk vervangen zouden moeten worden door respectievelijk ‘Analyte Amount (ng)’ en ‘Calculated Amount (ng)’; en dat de waardes in de kolom ‘conc in ng per liter’ met 1000 vermenigvuldigd moeten worden om daadwerkelijk de concentratie in ng/l te krijgen. Deze aanpassingen zijn al toegepast in bovenstaande berekening van de kwantificatielimieten (paragraaf 3.1) en in de tabel met aangetroffen concentraties, tabel 5 op pagina 19. Ook in de genoemde bijlage 5 is hier in de tabellen een aantekening van gemaakt. Voor de volledigheid (en het nazoeken) zijn echter de aanduidingen van de kolommen in principe zo gelaten als in de output van de software. Bovendien staan de aanduidingen onveranderd in de twee gegeven calibratiegrafieken in bijlage 4; deze grafieken worden immers rechtstreeks door de software vervaardigd. Echter men moet hier dus in feite voor de xassen lezen: ‘Analyte Amount/ IS Amount’ in plaats van ‘Analyte Conc./ IS Conc.’. De calibratiegrafieken, die zijn gemaakt aan de hand van de levels, worden gemaakt op grond van verhoudingen, dus niet absolute waardes. Op de y-as staat de verhouding ‘Analyte Area/ IS Area’; op de x-as (na aanpassing van het bovenstaande, zie vorige alinea) de verhouding ‘Analyte Amount/ IS Amount’. Bij de levels zijn al deze vier waarden bekend. Ter voorbeeld wordt hier de berekening uitgevoerd met sulfamethoxazol (SMX), hoge calibratie, level 3; de gebruikte interne standaard (IS) is 13C SMX. Voor de drie injecties van level 3 van SMX ligt de verhouding Analyte Area/ IS Area tussen 10,3 en 10,8. De verhouding Analyte Amount/ IS Amount is voor alle drie injecties hetzelfde, omdat bij de levels zowel de concentratie van de analyt als van de interne standaard bekend en zelf ingevoerd zijn; deze ligt op: Analyte Amount/ IS Amount = 158/ 1,238 ≈ 127,6. De calibratielijn die door het programma via lineaire regressie door het nulpunt wordt uitgevoerd, levert een formule op voor de grafiek: y = 0,0818 x (ook door het programma gegeven). In deze formule staat y dus voor Analyte Area/ IS Area en staat x voor Analyte Amount/ IS Amount. Tot zover de calibratie. Voor de daadwerkelijke watermonsters nu geldt dat de Analyte Area, de IS Area en de IS Amount bekend zijn (de twee Areas zijn de rechtstreekse metingen uit het apparaat; de IS Amount is wederom een zelf ingevoerde waarde). Alleen de Analyte Amount is onbekend; dat is immers juist de waarde die met behulp van deze calibratiegrafiek berekend dient te worden. Als voorbeeld het monster 478_1 (wederom voor de stof SMX, aan de hand van de hoge calibratie). y = Analyte Area/ IS Area = 1,92 * 10^5/ 2,60 * 10^5 ≈ 0,7385 en aangezien y = 0,0818 x (zie boven) is x = 0,7385/ 0,0818 ≈ 9,0281 x = Analyte Amount/ IS Amount IS Amount = 24,76 (dit is de zelf ingevoerde waarde) dus Analyte Amount = x * IS Amount = 9,0281 * 24,76 ≈ 224 ng

23

Dit klopt inderdaad met de waarde van 224 ng/l die het programma geeft, ook al is dit erg hoog. De enige stap waar het hier mis zou kunnen zijn gegaan, is bij de bekende en dus zelf ingevoerde waardes. Dit lijkt echter hoogst onwaarschijnlijk, aangezien de analisten die dit gedaan hebben hier erg veel ervaring mee hebben en weten dat daar alle berekeningen verder van afhangen. Een volgende stap in de controle is om een vergelijking te maken tussen de piekoppervlakken van de monsters en de piekoppervlakken van de levels: wanneer de piekoppervlakken van een level en een monster in dezelfde orde van grootte liggen, zijn de daarbij behorende analyt-waardes voor het level en het monster dan ook vergelijkbaar, wat logisch zou zijn? Dit blijkt niet zo te zijn: bij vergelijkbare piekoppervlakken tussen de levels en de monsters lopen de analyt-waardes van de levels in de tientallen nanogrammen, maar de analyt-waardes voor de monsters in de honderden nanogrammen (ook dit is na te lezen in de tabellen met de output van de software van het apparaat, opgenomen in bijlage 5). Nu kan wel de vraag worden gesteld: hoe kan het dat vergelijkbare piekoppervlakken van de monsters en de levels zulk een groot verschil in berekende concentratie geven? Het is wel te zeggen waar dit verschil vandaan komt, hoewel het daarmee nog niet verklaard is. Als men namelijk kijkt naar de piekoppervlakken van de interne standaard bij de levels en bij de monsters, dan verschillen deze wel enigszins, maar liggen wel in dezelfde range: - piekoppervlakken IS bij de levels: 4,38 * 10^4 – 3,48 * 10^5 cps (counts per second); - piekoppervlakken IS bij de monsters: 7,43 * 10^4 – 2,90 * 10^5 cps (” ). Echter bij de levels is in alle gevallen de bekende concentratie voor de IS gebruikt van 1,238 ng/l. Voor de monsters daarentegen is in alle gevallen de IS concentratie 24,76 ng/l gebruikt. Terwijl dus de IS bij de levels en de monsters ongeveer dezelfde piekoppervlakken genereert, is volgens de zelf ingevoerde gegevens de concentratie van de IS bij de monsters wel twintig keer zo hoog. Dit zou kunnen wijzen op tóch handmatig verkeerd ingevoerde ISconcentraties, of op een meetafwijking in het apparaat tussen het meten van de levels en van de echte monsters. Aangezien alle andere waardes die via de calibratiegrafiek worden verkregen hier indirect van afhangen, is het duidelijk dat dit het punt is waardoor de analytconcentraties zo hoog berekend zijn. Hiermee is echter nog niet gezegd of deze waardes nu correct zijn of niet, maar in ieder geval is de methode doorzichtig gemaakt en zijn mogelijke fouten aangewezen. Het lijkt dus nuttig om nog iets dieper in te gaan op de waardes die handmatig ingevoerd zijn. Deze waardes staan allemaal in een overzicht in het programma. Na bestudering van deze waarden lijken toch de handmatig ingevoerde aanduidingen van de kolommen niet te kloppen. Zoals al eerder duidelijk gemaakt (pagina 20), moeten de aanduidingen ‘Analyte Concentration (ng)’ en ‘Calculated Concentration (ng)’ eigenlijk veranderd worden in ‘Analyte Amount (ng)’ en ‘Calculated Amount (ng)’, en moet daarbij de concentratie zoals gegeven in de kolom ‘conc per liter’ vermenigvuldigd worden met 1000 om daadwerkelijk de concentratie in ng/l te krijgen. Het lijkt bovendien zo te zijn dat er een verschil is tussen de betekenis van de handmatig ingevoerde waardes van de monsters en van de levels. De op dezelfde wijze ingevoerde en dus ook op dezelfde wijze in de berekeningen gebruikte waarden van de interne standaarden bij de levels en de interne standaarden bij de monsters lijken eigenlijk een ander soort waarde vertegenwoordigen. De ingevoerde waarde bij de levels lijkt de daadwerkelijk geïnjecteerde

24

hoeveelheid analyt voor te stellen (dus aantal ng per 50 μl), terwijl het bij de monsters de hoeveelheid analyt per monster lijkt voor te stellen (dus aantal ng per 400 ml). Voor de levels is deze ingevulde hoeveelheid 1,238 ng/l. Voor de monsters is de ingevulde hoeveelheid 24,76 ng. Indien het klopt dat dit inderdaad de hoeveelheid per monster is, dan wil dat zeggen 24,76 ng/ 400 ml; na extraheren en indampen zitten alle nog aanwezige stoffen van dit monster in 200 μl, dit is met water aangelengd tot 1000 μl, en vervolgens is 50 μl geïnjecteerd (zie voor de hele procedure hoofdstuk 2). Dit zou betekenen dat in totaal 24,76/ 20 = 1,238 ng daadwerkelijk geïnjecteerd is. (Het is ook logisch als het de geïnjecteerde hoeveelheid is waar mee gerekend wordt, aangezien het piekoppervlak dat wordt gegeven natuurlijk per definitie een piek is van de geïnjecteerde hoeveelheid.) Dus als nog een keer hetzelfde voorbeeld wordt berekend met deze nieuwe aanname: monster 478_1 (voor SMX, hoge calibratie): y = Analyte Area/ IS Area = 1,92 * 10^5/ 2,60 * 10^5 ≈ 0,7385 en aangezien y = 0,0818 x (zie boven) is x = 0,7385/ 0,0818 ≈ 9,0281 x = Analyte Amount/ IS Amount IS Amount = 1,238 (de veranderde waarde) dus Analyte Amount = x * IS Amount = 9,0281 * 1,238 ≈ 11,2 ng in 50 μl injectie Dit is een veel plausibeler waarde dan de 558,5 ng die is berekend door de software (zie tabel 5). Echter, in de handmatig nagerekende concentratie is heel duidelijk dat de verkregen waarde van 11,2 slaat op de hoeveelheid analyt in de injectie, dus niet op de concentratie per liter. Immers, er wordt gerekend met het piekoppervlak, en het piekoppervlak is per definitie een meting van de geïnjecteerde hoeveelheid. Daarbij wordt deze berekening uitgevoerd aan de hand van de calibratiegrafiek van de levels, dus als het bij de levels gaat om de geïnjecteerde hoeveelheid en niet om de concentratie per liter, dan geldt dat ook wanneer aan de hand van deze levels teruggerekend wordt bij de echte monsters. Als deze 11,2 ng inderdaad de hoeveelheid is die is geïnjecteerd per 50 μl en de bijbehorende Analyte Amount slaat dus ook op die geïnjecteerde hoeveelheid; dan zou de concentratie per liter als volgt te berekenen zijn: 11,2 x 20 = 224 ng/ 400 ml 224 x 2,5 = 560 ng/l Dit is wederom die hoge concentratie. Het zou dus wat betreft orde van grootte van de analyt-hoeveelheden logischer zijn als deze 11,2 ng niet de aangetroffen hoeveelheid per injectie zou zijn (50 μl), maar als dit de hoeveelheid in 400 ml zou zijn. Echter, dat zou betekenen dat de gegeven hoeveelheden van de levels, aangezien ze in dezelfde kolom staan, ook gegeven zouden zijn in aantal ng per 400 ml, en dát is erg onwaarschijnlijk. De levels zijn namelijk helemaal niet opgewerkt vanaf 400 ml (zoals de monsters en de optimalisatie), maar direct geïnjecteerd. Conclusie is dat het bij de berekende 11,2 ng dus niet kan gaan om hoeveelheid ng per 400 ml, en dus wel moet gaan om hoeveelheid ng per injectie.

25

Dat betekent dus dat op de plek waar bij Calculated Amount ‘224’ staat eigenlijk ‘11,2’ zou moeten staan. Dat ligt meer in de range van piekoppervlakken en bijbehorende concentraties zoals bij de levels, en dat komt wel neer op de uiteindelijke concentratie van 560 ng/l. Aangezien niet te zeggen is ten eerste óf en ten tweede wáár het eventueel echt fout gegaan zou zijn, zijn in de resultaten van het onderzoek toch de hoge waardes gebruikt uit deze berekeningen. Gradiënt waarneembaar Tot zover de bespiegelingen over de hoogte van de gegeven waardes. Het volgende dat opvalt in de resultaten is dat er een gradiënt waar te nemen is in de aangetroffen concentraties van beide stoffen. Bij sulfamethoxazol gaat dit om een afname van de stof over het transect van infiltratiekanaal naar terugwinkanaal; bij sulfamethazine gaat het juist om een toename. Dit wordt duidelijker wanneer het wordt gevisualiseerd met behulp van een grafiek: zie figuur 5 en figuur 6.

Figuur 5 Visualisatie van de aangetroffen concentraties sulfamethoxazol.

26

Figuur 6 Visualisatie van de aangetroffen concentraties sulfamethazine.

In beide grafieken wordt op de x-as de verblijftijd van het grondwater weergegeven (het aantal jaren dat het geïnfiltreerde Rijnwater al onder de grond zit); op de y-as de aangetroffen concentratie in ng/l. De punten in de grafiek staan voor de verschillende monsterpunten. Omdat echter de verblijftijd van het water een interessantere parameter is, is hier op de x-as de verblijftijd in jaren aangegeven in plaats van de nietszeggender namen van de monsterpunten zelf. De verblijftijden zijn afgeleid uit de gebruikte figuren uit het onderzoek van Stuyfzand (1993), zoals uitgelegd in hoofdstuk 2 (zie figuur 2 en 3 op pagina 9 en 10). Dat wil zeggen dat x = 0 staat voor het monster uit het infiltratiekanaal en dat x = 19 staat voor het monster uit het terugwinkanaal. N.B.: Het tweede monster, uit peilbuis 24H478, was in duplo opgewerkt; om de grafieken zo inzichtelijk mogelijk te maken is dus voor dit punt (in de grafieken het tweede punt van links) het gemiddelde van de twee waarden genomen, in plaats van ze beide weer te geven (dit geldt voor beide grafieken). De blauwe lijn is de trendline van de aangetroffen concentraties; de roze lijn is de LOQ met daarop de punten waar niets is aangetroffen (‘beneden LOQ’) 4 . In het volgende hoofdstuk zal worden ingegaan op de mogelijke verklaringen voor deze gradiënt in de gemeten concentraties.

4

N.B. Voor de overige stoffen zijn geen grafieken gemaakt, omdat dit slechts neer zou komen op een rechte lijn ter hoogte van de waarde van de LOQ.

27

4. Conclusies Wat kan worden geconcludeerd uit de gemeten resultaten? De onderzoeksvraag die in de inleiding is gesteld luidde: Wat is te zeggen over het gedrag van antibiotica in het grondwater tijdens bodempassage in de Amsterdamse Waterleidingduinen aan de hand van analyse van watermonsters? Bij de stof sulfamethoxazol is een afname zichtbaar in concentratie over het transect van infiltratiekanaal naar terugwinkanaal. Afgezien van de hoge waardes van de concentraties is dit patroon op zich duidelijk waarneembaar. Dit is interessant, want het zou kunnen betekenen dat bodempassage wel degelijk van invloed is op de aanwezigheid van de stof. Dat is een mogelijke conclusie, echter, het kan niet al te snel geconcludeerd worden. Immers de monsterpunten zijn zo gekozen, dat grondwater van verschillende ouderdom bemonsterd is. Men moet zich echter realiseren dat hier geen sprake is van hetzelfde waterpakket. Het infiltrerende water legt weliswaar door de jaren heen ongeveer dezelfde weg af, echter de monsters zijn gelijktijdig genomen, wat wil zeggen dat het per monsterpunt om een ander waterpakket gaat. Het is dus van belang om gegevens te hebben over de samenstelling van het infiltrerende water door de jaren heen. Indien de samenstelling van het nu infiltrerende Rijnwater nog grotendeels hetzelfde is als de samenstelling twintig jaar geleden, dan is de kans groot dat het proces van bodempassage inderdaad van invloed is op de aanwezigheid van de stof sulfamethoxazol. Echter wanneer de samenstelling van het Rijnwater erg veranderd blijkt te zijn, kan dit ook een oorzaak zijn van het feit dat sulfamethoxazol in afnemende concentratie is aangetroffen. Waar zou nu deze eventuele verandering van samenstelling van het Rijnwater vandaan kunnen komen? Om op deze vraag een antwoord te kunnen geven, moet bijvoorbeeld worden gekeken naar het medicijngebruik: heeft dit antibioticum in de afgelopen jaren meer of minder toepassingen gekregen, wordt het vaker of minder vaak voorgeschreven, is de toepassing in de vee- of visindustrie ruimer of juist minder geworden? Et cetera. In dit specifieke geval werd de stof sulfamethoxazol in het monster van ca. vier jaar oud nog aangetroffen, maar in het monster van ca. negen jaar niet meer. Een mogelijke oorzaak voor de afname van concentratie zou dus kunnen zijn, dat dit antibioticum tien jaar geleden nog niet of nauwelijks gebruikt werd, of zelfs nog helemaal niet ontwikkeld was. Voor beantwoording van deze vraag kunnen literatuuronderzoek en medische statistische databases uitkomst brengen. Dit kan echter lastig zijn, omdat veel gegevens omtrent medicijngebruik ontbreken of niet openbaar zijn. Het al dan niet aantreffen van geneesmiddelen in oppervlaktewater (en daarmee indirect in de bodem, omdat het hier gaat om infiltrerend Rijnwater) is daarom niet altijd goed te verklaren (Schrap et al. 2002 in Van Rooyen 2006). Als men echter deze gegevens kan achterhalen en als toch blijkt dat de stof tien jaar geleden in dezelfde mate gebruikt werd, dan ligt het wel degelijk voor de hand om te concluderen dat het proces van bodempassage invloed heeft op de aanwezigheid van de stof in het grondwater. Dan is de volgende stap om te onderzoeken welke processen in de bodem hiervoor verantwoordelijk zouden kunnen zijn. Gezien het tijdsbestek van dit onderzoek

28

reikt het te ver om daar binnen deze thesis diep op in te gaan, maar hier zal wel vast een aanzet gegeven worden in de richting van wat het zou kunnen zijn. Processen waar aan gedacht kan worden zijn bijvoorbeeld sorptie van de stof aan de vaste fase van de bodem, of afbraak van de stof. Deze processen zijn zowel afhankelijk van de eigenschappen van de bodem als van de eigenschappen van de betreffende stof. Zo zijn voor de stof eigenschappen relevant als persistentie en polariteit, en voor de bodem gaat het om paramaters als redoxmilieu, pH, temperatuur en ionsterkte (Stuyfzand in Van Rooyen 2006). De mate van sorptie aan de vaste fase hangt voor een deel af van de bodem en voor een deel van de stof. Een belangrijke factor is in veel gevallen het organische-stofgehalte van de bodem. In veel gebieden waar intensief grondwater wordt gewonnen is het organischestofgehalte laag (Van der Linden et al. 1999). Bovendien kan bij niet-stationair grondwater sprake zijn van uitspoeling van organische stof. Het proces van bodempassage in de AWD maakt dat hier sprake is van niet-stationair grondwater (Van der Linden et al. 1999). Daarbij komen de stofeigenschappen: zoals uitgelegd in paragraaf 1.1 gaat het in dit onderzoek om vrij polaire stoffen. De stoffen hebben een vrij lage K ow -waarde (zie bijlage 1) en dat wil dus zeggen dat deze stoffen een hoge affiniteit hebben voor water, en dus niet voor de vaste fase van de bodem. Ze zullen dus eerder in het water blijven zitten dan dat ze aan de bodem sorberen. Het waarschijnlijk lage organische-stofgehalte van de bodem en de lage K ow waarde van de stof sulfamethoxazol maken dat het niet voor de hand ligt dat sorptie aan de vaste fase van de bodem een belangrijke rol speelt in de afname van concentratie van de stof. De eventuele afbraak van de stof hangt in sterke mate af van het redoxmilieu van de bodem: in een oxische omgeving vindt nauwelijks afbraak plaats, in een anoxische omgeving wel (Van Rooyen 2006). Van Rooyen zegt dan ook dat bodempassage slechts een matige barrière vormt voor de verwijdering van sulfamethoxazol, en hij benadrukt bovendien dat sulfamethoxazol een vrij persistente stof is. Het is in dit verband dus nuttig om verder onderzoek te verrichten naar het specifieke redoxmilieu over dit transect in de AWD, om te weten te komen of afbraak van sulfamethoxazol een rol speelt bij het afnemen van de concentratie. In het geval van de stof sulfamethazine daarentegen lijkt juist sprake van het omgekeerde. Hoewel het om kleinere concentraties gaat dan bij sulfamethoxazol, is ook hier duidelijk een trend waar te nemen: de concentratie lijkt juist toe te nemen naarmate de monsters ouder worden. Wat kan hier een verklaring voor zijn? Wat in dit geval plausibel lijkt, is een verandering in verbruik van deze stof. Aangezien de concentratie steeds oploopt naarmate het waterpakket langer in de bodem heeft doorgebracht, zou dit goed verband kunnen hebben met een afname in verbruik van de stof gedurende de laatste twintig jaar. Ook hier kunnen literatuuronderzoek en medische statistieken uitkomst bieden. Wat eventueel ook een verklaring zou kunnen zijn, is een eventueel aangepast proces van voorzuivering. Zoals uitgelegd in hoofdstuk 1 wordt het Rijnwater voorgezuiverd vóór het infiltreert in de AWD. Het is mogelijk dat dit proces in de afgelopen twintig jaar is aangepast, en daarmee voor deze specifieke stof adequater is geworden. Echter dit lijkt toch niet geheel op te gaan: immers, de stof sulfamethoxazol is vergelijkbaar met sulfamethazine (beide stoffen horen tot de stofgroep van de sulfonamiden), terwijl de concentratie sulfamethoxazol juist hoger ligt in de jongere waterpakketten. Het is erg onwaarschijnlijk dat de twee stoffen een tegenovergestelde reactie zouden vertonen op de voorzuiveringsmethode, dus een

29

aangepast proces van voorzuivering lijkt niet de verklaring voor de afnemende concentratie sulfamethazine in de jongere waterpakketten. Wat valt nu te zeggen over de stoffen die niet zijn aangetroffen – amoxicilline, tetracycline, chloortetracycline en oxytetracycline? Het feit dat deze stoffen in de monsters niet zijn aangetroffen, betekent nog niet dat ze er zeker niet zijn, maar alleen dat ze binnen dit onderzoek niet aangetroffen zijn. Hiervoor kunnen verschillende verklaringen zijn. Het zou kunnen dat de stoffen er wel zijn, maar in zulke lage concentraties dat ze beneden de kwantificatielimiet liggen. (LOQ amoxicilline = 0,6 ng/l; LOQ tetracycline = 0,9 ng/l; LOQ chloortetracycline = 91,6 ng/l; LOQ oxytetracycline = 17,7 ng/l, zie paragraaf 3.1). Het zou ook kunnen dat de gebruikte methode toch niet de meest geschikte is voor het detecteren van deze stoffen. Zo hebben bijvoorbeeld ook Hirsch et al. (1999) onderzoek gedaan naar deze vier stoffen. Ook zij hebben alle vier deze stoffen niet aangetroffen, terwijl dat wel in de lijn der verwachting lag afgaand op eerder onderzoek. Waar het de tetracyclines betreft (tetracycline, chloortetracycline en oxytetracycline) geven zij hiervoor sorptie als verklaring: deze stofgroep bindt makkelijk aan vrije ionen in de bodem, zoals calcium. Hierdoor komen de tetracyclines niet voor als losse moleculen in de bodem, maar als stabiele verbindingen met ionen in opgeloste materie (suspended matter) of in het sediment. Op deze manier zijn ze dus wel aanwezig, maar niet meetbaar in de watermonsters (Hirsch et al. 1999). Voor amoxicilline geven Hirsch et al. afbraak als verklaring: door hydrolyse wordt de stof afgebroken en is daardoor niet meer in zijn oorspronkelijke vorm aanwezig, en dus niet meer meetbaar. Discussie en aanbevelingen Punt van discussie binnen dit onderzoek is natuurlijk, zoals uitgebreid aan de orde gekomen in het vorige hoofdstuk, de voor sulfamethoxazol erg hoog uitgevallen concentraties. Het is onvoldoende duidelijk geworden of het hier daadwerkelijk gaat om erg hoge waardes, of er fouten zijn gemaakt tijdens de procedure van opwerking, of dat er fouten zijn gemaakt in de berekeningen. Wel lijkt aangetoond, ondanks het lage aantal monsters, dat toch sprake is van een gradiënt in de aanwezige concentratie: de concentratie sulfamethoxazol neemt af naarmate het grondwaterpakket al langer in de bodem verblijft. Het verdient dus aanbeveling om wat betreft de stof sulfamethoxazol nader onderzoek te doen naar de processen die deze afname van de stof in het grondwater veroorzaken, waar in dit hoofdstuk al een aanzet toe gegeven is. Voor de stof sulfamethazine lijkt duidelijk aangetoond dat sprake is van een omgekeerde gradiënt: de aanwezige concentratie neemt juist toe naarmate het waterpakket ouder wordt. Het verdient hier dus aanbeveling om in eerste instantie goed te kijken naar het verbruik van de stof: het ligt voor de hand dat de toename van de stof in de bodem met de tijd te danken is aan een verminderde toevoer van de stof met het infiltrerende Rijnwater de laatste jaren. Voor de stoffen amoxicilline, tetracycline, chloortetracycline en oxytetracycline geldt dat ze in het geheel niet boven de kwantificatielimiet zijn aangetroffen binnen dit onderzoek. Deze stoffen zouden dus opnieuw gemeten kunnen worden, wellicht met behulp van een andere methode. Ook kan nader onderzocht worden of hier inderdaad processen zoals sorptie bij de tetracyclines en afbraak (hydrolyse) bij amoxicilline de oorzaak zijn van het niet aantreffen van deze stoffen.

30

Literatuur Adams, C., Y. Wang, K. Loftin en M. Meyer (2002), ‘Removal of antibiotics from surface and distilled water in conventional water treatment processes’, Journal of environmental engineering, 2002, Vol. 128; Issue 3, pp. 253-260. Bendz, D., N.A. Paxéus, T.R. Ginn en F.J. Loge (2005), ‘Occurrence and fate of pharmaceutically active compounds in the environment, a case study: Höje River in Sweden’, Journal of Hazardous Materials, 2005, Vol. 122, Issue 3, pp. 195-204. Eschauzier, C., onder supervisie van J. Haftka en P. de Voogt (2009), PFCs in the dunes: Behavior and presence of perfluorinated compounds in dune infiltration water at Waternet in Leiduin, the Netherlands, UvA. EU, List of priority substances, http://ec.europa.eu/environment/water/waterdangersub/lib_pri_substances.htm#dir105. Hirsch, R., T. Ternes, K. Haberer en K.-L. Kratz (1999), ‘Occurrence of antibiotics in the aquatic environment’, The Science of the Total Environment, 1999, Vol. 225, Issues 1-2, pp. 109118. Hogenboom, A.C., J.A. van Leerdam, P. de Voogt (2009), ‘Accurate mass screening and identification of emerging contaminants in environmental samples by liquid chromatography-LTQ FT Orbitrap mass spectrometry’, Journal of Chromatography A, 2009, Vol. 1216, Issue 3, pp. 510-519. IBED UvA, Map Bachelorproject Aardwetenschappen 2009. Kapila, S. (2009), Lecture notes, Missouri University of Science & Technology, http://web.mst.edu/~kapilas. Karthikeyan, K.G. en M.T. Meyer (2006), ‘Occurrence of antibiotics in wastewater treatment facilities in Wisconsin, USA’, Science of The Total Environment, 2006, Vol. 361, Issues 1-3, pp. 196-207. Linden, A.M.A. van der, C.G.E.M. van Beek, J.J.T.I. Boesten, M. Leistra, C.R. Meinardi, L.M. Puijker (1999), Beoordeling van het gedrag van bestrijdingsmiddelen in de verzadigde zone van de bodem, RIVM rapport 715801 005. McMaster, M.C. (2005), LC/MS – A practical user’s guide (John Wiley & Sons, Inc.; New Jersey 2005). NCBI 2009 (National Center for Biotechnology Information), PubChem Substance database, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pcsubstance.

31

RIVM 2009, Nederlandse prioritaire stoffenlijst, http://www.rivm.nl/rvs/stoffen/prio/totale_prior_stoffenlijst.jsp. Rooyen, N. van (2006), Gedrag van ‘vergeten stoffen’ tijdens bodempassage na duininfiltratie, KWR 06.015, MSc Thesis, Open Universiteit, Nieuwegein 2006. Schrap, S.M., G.B.J. Rijs, M.A. Beek, J.F.N. Maaskant, J. Staeb, G. Stroomberg, J. Tiesnitsch (2003), Humane en veterinaire geneesmiddelen in Nederlands oppervlaktewater en afvalwater: een screening in 2002, RIZA rapport 2003.023. Stuyfzand, P.J. (1993), Hydrochemistry and hydrology of the coastal dune area of the Western Netherlands (KIWA N.V., Nieuwegein 1993). Swaab, B., begeleider J. Parsons (2007), Gedrag van perfluorverbindingen in de Amsterdamse Waterleidingduinen, Bachelorthesis, UvA. Versteegh, J.F.M., N.G.F.M. van der Aa en E. Dijkman (2007), Geneesmiddelen in drinkwater en drinkwaterbronnen; resultaten van het meetprogramma 2005/2006, RIVM rapport 703719016/2007. Voogt, P. de, F. Sacher, M.-L. Janex-Habibi, L. Puijker en M. Mons (2009), ‘Development of a common priority list of pharmaceuticals relevant for the water cycle’, Water Science & Technology, 2009, Vol. 59, Issue 1, pp. 39-46. Waternet 2009, http://www.waternet.nl/over_de_watercyclus/drinkwater.

32

Bijlagen

33

34

Bijlage 1 De stoffen: enkele gegevens Bron gegevens stoffen, inclusief figuren structuurformules: NCBI (2009).

Amoxicilline Molecuulformule: C 16 H 19 N 3 O 5 S Structuurformule: zie hiernaast Log K ow = -2 Stofgroep: penicillinen Molecuulgewicht: 365,40416 g/mol

Tetracycline Molecuulformule: C 22 H 24 N 2 O 8 Structuurformule: zie hiernaast Log K ow = -1,3 Stofgroep: tetracyclines Molecuulgewicht: 444,43456 g/mol

35

Chloortetracycline Molecuulformule: C 22 H 23 ClN 2 O 8 Structuurformule: zie hiernaast Log K ow = -0,6 Stofgroep: tetracyclines Molecuulgewicht: 478,87962 g/mol

Oxytetracycline Molecuulformule: C 22 H 24 N 2 O 9 Structuurformule: zie hiernaast Log K ow = -0,9 Stofgroep: tetracyclines Molecuulgewicht: 460,43396 g/mol

36

Sulfamethazine Molecuulformule: C 12 H 14 N 4 O 2 S Structuurformule: zie hiernaast Log K ow = 0,3 Stofgroep: sulfonamiden Molecuulgewicht: 278,33016 g/mol

Sulfamethoxazol Molecuulformule: C 10 H 11 N 3 O 3 S Structuurformule: zie hiernaast Log K ow = 0,9 Stofgroep: sulfonamiden Molecuulgewicht: 253,27764 g/mol

37

Bijlage 2 Methode: benodigdheden Benodigdheden veldwerk -

pomp voor minifilters flessenset voor pomp 6x voorgespoelde groene literflessen om monster in op te vangen + afvalfles (voor MeOH) aluminiumfolie etiketten + marker kaart van het gebied met nummers van de peilbuizen fles subboiled water om te spoelen en om veldblanco te maken fles MeOH om te spoelen

Benodigdheden optimalisatie Glaswerk (alles 3x spoelen met MeOH) - 8x erlenmeyer (4 voor opbrengen, 4 voor opvangen) - 24x 10ml-vial - 24x 2ml-vial - 4x glazen kolom - grote trechter - kleine trechter - 10ml-maatcilinder Overige benodigdheden - 2x SPE-patroon: Waters OASIS HLB 6cc 500mg, part.no. 186000115 - 2x SPE-patroon: Waters OASIS MCX 6cc 500mg, part.no. 186000776 - spikeoplossing met bekende hoeveelheden 12C standaarden en 13C interne standaarden - ammoniumoplossing: 5% NH 4 OH in MeOH voor elutie MCX-patronen Benodigdheden opwerken echte monsters Glaswerk (uitgaande van 1 duplo opwerking) (alles 3x spoelen met MeOH) - 14x 500ml erlenmeyer (7 voor opbrengen, 7 voor opvangen) (kan niet tegelijk: opwerking monsters in twee sessies) - 14x 10ml-vial - 7x 2ml-vial - 7x glazen kolom - grote trechter - kleine trechter

38

- 10ml-maatcilinder Overige benodigdheden - 7x SPE-patroon: Waters OASIS HLB 6cc 500mg, part.no. 186000115 - spikeoplossing met 13C standaarden, voor samenstelling zie onderaan deze pagina Benodigdheden beide (zowel optimalisatie als opwerken echte monsters) -

subboiled water 5% waterige HCl-oplossing voor aanzuren subboiled water en aanzuren monsters zelf MeOH (zowel voor opwerken monsters als voor spoelen glaswerk) magneet-roermachine roerboon pincet roerstaafje pH-papier glaswol pasteurpipetten precieze pipetten voor afmeten 200 μl voor spiken handschoenen filter voor verwijdering vaste stofdeeltjes vóór injectie in LC-MS/MS: GELMAN acrodisc 13 CR PTFE 0,45 μm polypropyleen spuit voor filtratie stikstofapparaat voor droogblazen kolommen warmtebad en stikstofinstallatie voor indampen extracten

Samenstelling spikeoplossing interne standaarden echte monsters -

200 μl stockoplossing Sulfamethazine 13C, concentratie 6,23 ng/μl 100 μl stockoplossing Sulfamethoxazol 13C, concentratie 12,38 ng/μl aanvullen tot 10 ml (met MeOH)

De hoeveelheid 13C sulfamethazine in de spikeoplossing is dus 6,23 * 200 = 1246 ng in 10 ml. Hiervan wordt vervolgens 200 μl genomen om te spiken. Hierin zit dus 1246 / 100 * 2 = 24,9 ng. De hoeveelheid 13C sulfamethoxazol in de spikeoplossing is 12,38 * 100 = 1238 ng in 10 ml. In de 200 μl die wordt genomen om te spiken zit dus 1238 / 100 * 2 = 24,8 ng. Uiteindelijk wordt aan ieder watermonster van 400 ml dus als interne standaard 24,9 ng 13 C sulfamethazine en 24,8 ng 13C sulfamethoxazol toegevoegd. Dit komt per injectie (van 50 μl) dus neer op 1,245 ng voor 13C sulfamethazine en 1,240 ng voor 13C sulfamethoxazol.

39

Bijlage 3 Methode: procedure (uitgebreid) Het gaat hier zowel om de procedure van het opwerken van de standaardoplossingen (de optimalisatie) als om de procedure van het opwerken van de echte monsters. Het grootste verschil in procedure is dat in de optimalisatie twee verschillende typen patronen zijn gebruikt (HLB en MCX), en dat in de optimalisatie de extracten worden opgevangen in verschillende fracties. Voor de opwerking van de echte monsters zijn zoals gezegd de HLBpatronen gebruikt en de extracten worden als één fractie opgevangen; wanneer dit voor een verschil zorgt in de procedure is dit aangegeven. Voorspoelen monsterflessen Spoelen met 2x aceton en 2x hexaan, 1 nacht laten drogen in zuurkast, aluminiumfolie erop, dop erop, blanco etiketten vast erop. Standaardoplossingen voor optimalisatie De oplossingen die worden opgewerkt voor optimalisatie: 1. Standaardoplossing over HLB-patroon 2. Standaardoplossing over MCX-patroon 3. Subboiled water over HLB-patroon (blanco) 4. Subboiled water over MCX-patroon (blanco) Echte monsters De zeven monsters die worden opgewerkt zijn vier grondwatermonsters uit de peilbuizen (waarvan één duplo opwerking), één monster uit het infiltratiekanaal, één monster uit het terugwinkanaal en één veldblanco. Voor de precieze codering van de monsters zie tabel 2 op pagina 15. Voor alle monsters wordt een HLB-kolom gebruikt. Gereed maken Per opwerking wordt gewerkt met 400 ml vloeistof. Voor de optimalisatie wordt in vier erlenmeyers 400 ml subboiled water pH 2,5 afgemeten. Dit is subboiled water aangezuurd door middel van het geleidelijk toevoegen van 5% waterige HCl-oplossing, met behulp van een roermachine met roerboon, tot de pH ongeveer 2,5 heeft bereikt; gemeten aan de hand van pH-papier. Twee van de vier erlenmeyers worden beladen met 200 μl van de 12Cstandaarden oplossing. Bij de echte monsters wordt ook steeds 400 ml afgemeten en dit wordt eveneens aangezuurd met 5% waterige HCl-oplossing tot pH 2,5; en hier wordt vervolgens 200 μl van de spikeoplossing met interne standaarden toegevoegd (voor de samenstelling hiervan zie bijlage 2). Op de SPE-patronen (zowel bij de HLB-patronen als bij de MCX-patronen) wordt een beetje glaswol aangebracht tegen het verstoppen van de patronen. De patronen worden onder de vier glazen kolommen geklemd; die worden vervolgens bevestigd aan het stikstofapparaat. Conditioneren Beide typen patronen worden geconditioneerd met 18 ml MeOH (niet droog laten lopen). Vervolgens:

40

HLB: 2x 9 ml subboiled water pH 2,5; beide porties 1 minuut laten inwerken (niet droog laten lopen); - MCX: 2x 9 ml subboiled water pH 2,5; beide porties 1 minuut laten inwerken (niet droog laten lopen). De spoelmiddelen worden opgevangen en weggegooid. -

Opbrengen monster Beide typen patronen: het monster wordt opgebracht. De na te streven doorloopsnelheid is 10 ml/min. Aangezien 1 druppel ongeveer staat voor 50 μl 5 , gaat het om ongeveer 200 druppels per minuut, i.e. 33 druppels per 10 seconden. Dit is min of meer aangehouden (door te tellen, en soms de druk met behulp van stikstof iets op te voeren), maar is niet precies te bepalen. Hier is dus aangehouden: beter iets te langzaam dan te snel doorlopen, want dan heeft de oplossing tenminste goed de tijd om aan de vaste fase van het patroon te hechten 6 . Ook hier geldt: niet droog laten lopen, zowel tussendoor als na het laatste deel van het opgebrachte monster. Het doorgelopen water wordt opgevangen. Het is niet meer nodig voor verdere analyse, maar het wordt voor de zekerheid bewaard (in de koelkast). Spoelen De patronen worden nagespoeld met 2x 10 ml subboiled water pH 2,5. Drogen De patronen worden gedroogd door er een uur lang stikstof overheen te blazen. Het apparaat wordt zo ingesteld dat de stikstof rustig over de patronen geblazen wordt. Dit komt neer op een druk van ca. 1,1 bar (= 0,1 bar overdruk). Elutie De procedures voor elutie verschillen erg voor optimalisatie en voor de echte monsters, daarom worden deze apart beschreven. Elutie optimalisatie De patronen worden geëlueerd en in verschillende fracties opgevangen. - HLB: er wordt geëlueerd met 5x 2 ml MeOH; steeds 1 minuut laten inweken; al deze fracties worden apart opgevangen. Als laatste een ‘noodfractie’ met 10 ml MeOH: waarschijnlijk zijn op dit punt de te meten stoffen er al uit, maar deze fractie is voor de zekerheid, zodat zeker alles er uit is. Tussendoor niet droog laten lopen. - MCX: eerst wordt geëlueerd met 2,5 ml MeOH, vervolgens 4 keer met 2 ml ammoniumoplossing (5% NH 4 OH in MeOH); steeds 1 minuut laten inweken; alle fracties worden apart opgevangen. Er wordt afgesloten met een noodfractie: 10 ml van de genoemde ammoniumoplossing. Tussendoor niet droog laten lopen. Elutie echte monsters Bij de echte monsters zijn alleen de HLB-patronen gebruikt. Uit de resultaten van de optimalisatie is gebleken dat bij de HLB-patronen alle stoffen met het eluens meekomen in de eerste vijf fracties, en dat er niets meer in de noodfractie zit. Dit betekent dat bij de elutie van de echte monsters deze eerste vijf fracties van 2 ml samen kunnen worden opgevangen. 5 6

Vakkennis van één van de analisten van het UvA-lab, Peter Serné. Idem.

41

Dit houdt in dat met 10 ml MeOH wordt geëlueerd en dat hieruit dus één extract ontstaat. Voor de zekerheid wordt overigens toch nog een noodfractie gemaakt: er wordt een tweede keer geëlueerd met 10 ml MeOH. Dit noodextract wordt alleen gemaakt voor het geval er iets mis blijkt te zijn gegaan bij de elutie; het wordt in principe niet gebruikt. Indampen De opgevangen fracties van de optimalisatie zijn alle ongeveer 2 ml. De noodfracties en de extracten van de echte monsters zijn 10 ml; deze worden ingedampt tot eveneens ongeveer 2 ml. Dit gebeurt door ze te plaatsen op een warmtebad (50 ºC) en stikstof eroverheen te blazen. Alle fracties worden nu overgespoeld in 2 ml-vials. Vervolgens worden ze ingedampt tot 200 μl en weer aangelengd met 800 μl subboiled water (niet aangezuurd). Filtreren De laatste stap vóór injectie in het LC-MS/MS apparaat is filtratie. Dit gebeurt om er geheel zeker van te zijn dat alle eventueel aanwezige vaste stofdeeltjes uit het monster worden verwijderd. Het monster wordt hierbij in een polypropyleen spuit door een acrodisc filter geperst: GELMAN acrodisc 13 CR PTFE 0,45 μm. Analyse in het LC-MS/MS apparaat De te meten stoffen worden gedetecteerd met behulp van het LC-MS/MS apparaat. Per extract wordt 50 μl geïnjecteerd in het LC-MS/MS apparaat. De analyse met behulp van het apparaat wordt al uitgebreid beschreven in paragraaf 2.3, daarom wordt daar hier niet verder op in gegaan. Wel volgen hier de specificaties van het apparaat. Specificaties LC-MS/MS apparaat LC Shimadzu gekoppeld aan Applied Biosystems MDS SCIEX. LC Shimadzu: - prominence degasser: DGU-20A3 - prominence liquid chromatograph (pomp): LC-20AD XR (tweemaal) - prominence auto sampler: SIL-20AC XR - prominence communications bus module: CBM-20A - liquid chromatograph (pomp) LC-10AD VP - prominence column oven: CTO-20AC, set temp. 30 °C Specificaties gebruikte kolom: - ACE 3 C18, 150 x 2,1 mm Spcificaties MS/MS Applied Biosystems: - MDS SCIEX: 4000 Q TRAP LC/MS/MS System

42

Bijlage 4 Tabellen samenstelling levels en calibratiegrafieken De eerste, hoge calibratiereeks is gedaan met vijf levels. De tweede, lagere calibratiereeks is gedaan met drie levels. Dit zijn de laagste drie levels van de hoge calibratiereeks maar dan honderd keer verdund. Voor de stoffen sulfamethoxazol (hoge calibratie) en sulfamethazine (lage calibratie) zijn de calibratiegrafieken gegeven, zie de volgende twee pagina’s. Tabel samenstelling levels hoge calibratie (ng/l)

AMXC TC CTC OTC SM SMX IS: 13C SM IS: 13C SMX

Level 1 0,66 0,93 0,51 0,75 3,21 6,33 1,246 1,238

Level 2 3,28 4,63 2,53 3,75 16,03 31,65 1,246 1,238

Level 3 16,38 23,13 12,63 18,75 80,13 158,25 1,246 1,238

Tabel samenstelling levels lage calibratie (ng/l)

AMXC TC CTC OTC SM SMX IS: 13C SM IS: 13C SMX

Level 1 0,0066 0,0093 0,0051 0,0075 0,0321 0,0633 0,01246 0,01238

Level2 0,0328 0,0463 0,0253 0,0375 0,1603 0,3165 0,01246 0,01238

43

Level 3 0,1638 0,2313 0,1263 0,1875 0,8013 1,5825 0,01246 0,01238

Level 4 32,75 46,25 25,25 37,50 160,25 316,50 1,246 1,238

Level 5 49,13 69,38 37,88 56,25 240,38 474,75 1,246 1,238

Calibratiegrafiek sulfamethoxazol, hoge calibratie

44

Calibratiegrafiek sulfamethazine, lage calibratie

45

Bijlage 5 Tabellen output software LC-MS/MS sulfamethazine en sulfamethoxazol In deze tabellen zijn de aanduidingen van de kolommen en de gemeten waardes onveranderd overgenomen uit de output van de software van het LC-MS/MS apparaat. Wel zijn in het rood de aanpassingen aangegeven zoals besproken in paragraaf 3.2. Tabel resultaten monsters SM, lage calibratie Sample Name

5LNF_1 5LNF_2 478_1 478_2 778b_1 778b_2 381_1 381_2 284_1 284_2 1VDV_1 1VDV_2 6VB_1 6VB_2

Analyte Analyte Analyte Calculated Peak Area Peak Height Concentration Concentration (counts) (cps) (ng) (ng)

2.12E+03 2.92E+03 5.37E+03 5.34E+03 6.83E+03 6.36E+03 1.03E+04 9.68E+03 7.68E+03 9.15E+03 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00

3.73E+02 5.99E+02 7.49E+02 7.84E+02 9.23E+02 8.96E+02 1.46E+03 1.39E+03 1.07E+03 1.40E+03 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00

Moet zijn: Analyte Amount (ng) N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

Moet zijn: Calculated Amount (ng) 2.46 2.66 2.70 2.61 3.70 3.32 6.13 5.86 7.23 6.57 No Peak No Peak No Peak No Peak

conc in ng IS Peak Area per liter (counts) Is eigenlijk: conc in ng per milliliter 0.00616 1.45E+05 0.00665 1.85E+05 0.00674 3.37E+05 0.00653 3.46E+05 0.00924 3.13E+05 0.00831 3.24E+05 0.01530 2.85E+05 0.01460 2.79E+05 0.01810 1.80E+05 0.01640 2.35E+05 0 7.33E+04 0 8.24E+04 0 2.34E+05 0 1.67E+05

IS Peak Height (cps)

conc in ng IS Peak Area per liter (counts) Is eigenlijk: conc in ng per milliliter #DIV/0! 4,32E+03 #DIV/0! 3,78E+03 #DIV/0! 2,56E+03 #DIV/0! 2,58E+03 #DIV/0! 2,35E+03 #DIV/0! 1,77E+03 #DIV/0! 1,80E+03 #DIV/0! 2,31E+03 #DIV/0! 2,39E+03

IS Peak Height (cps)

2.04E+04 2.74E+04 4.65E+04 4.80E+04 4.56E+04 4.66E+04 3.89E+04 3.68E+04 2.68E+04 3.20E+04 9.89E+03 1.09E+04 3.26E+04 2.33E+04

Tabel resultaten levels SM, lage calibratie Sample Name

lev1V_1 lev1V_2 lev1V_3 lev2V_1 lev2V_2 lev2V_3 lev3V_1 lev3V_2 lev3V_3

Analyte Analyte Analyte Calculated Peak Area Peak Height Concentration Concentration (counts) (cps) (ng) (ng)

1,47E+03 1,16E+03 1,10E+03 5,19E+03 5,54E+03 3,77E+03 1,90E+04 2,14E+04 2,02E+04

1,93E+02 1,73E+02 2,16E+02 7,62E+02 1,06E+03 5,72E+02 2,84E+03 3,00E+03 2,76E+03

Moet zijn: Moet zijn: Analyte Calculated Amount (ng) Amount (ng) 0,0321 0,0287 0,0321 0,0259 0,0321 0,0361 0,16 0,17 0,16 0,199 0,16 0,18 0,801 0,893 0,801 0,783 0,801 0,714

46

5,89E+02 5,05E+02 4,05E+02 3,69E+02 3,29E+02 3,07E+02 2,72E+02 3,16E+02 3,86E+02

Tabel resultaten monsters SMX, hoge calibratie Sample Name

5LNF_1 5LNF_2 478_1 478_2 778b_1 778b_2 381_1 381_2 284_1 284_2 1VDV_1 1VDV_2 6VB_1 6VB_2

Analyte Analyte Analyte Calculated Peak Area Peak Height Concentration Concentration (counts) (cps) (ng) (ng)

1.87E+05 1.98E+05 1.92E+05 2.14E+05 1.95E+05 2.15E+05 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00

2.57E+04 2.79E+04 2.55E+04 2.75E+04 2.72E+04 2.72E+04 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00 0.00E+00

Moet zijn: Analyte Amount (ng) N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A

Moet zijn: Calculated Amount (ng) 385 364 224 223 224 228 No Peak No Peak No Peak No Peak No Peak No Peak No Peak No Peak

conc in ng IS Peak Area per liter (counts) Is eigenlijk: conc in ng per milliliter 0.963 1.47E+05 0.911 1.65E+05 0.560 2.60E+05 0.557 2.90E+05 0.560 2.64E+05 0.570 2.86E+05 0 2.65E+05 0 2.70E+05 0 2.00E+05 0 2.31E+05 0 7.56E+04 0 7.43E+04 0 1.85E+05 0 1.48E+05

IS Peak Height (cps)

conc in ng IS Peak Area per liter (counts) Is eigenlijk: conc in ng per milliliter #DIV/0! 3,48E+05 #DIV/0! 3,12E+05 #DIV/0! 2,19E+05 #DIV/0! 1,32E+05 #DIV/0! 9,21E+04 #DIV/0! 7,54E+04 #DIV/0! 5,81E+04 #DIV/0! 5,06E+04 #DIV/0! 4,38E+04 #DIV/0! 5,38E+04 #DIV/0! 5,84E+04 #DIV/0! 4,95E+04 #DIV/0! 4,62E+04 #DIV/0! 6,84E+04 #DIV/0! 7,23E+04

IS Peak Height (cps)

2.03E+04 2.24E+04 3.43E+04 3.80E+04 3.62E+04 3.81E+04 3.40E+04 3.63E+04 2.83E+04 3.46E+04 9.35E+03 9.50E+03 2.59E+04 1.99E+04

Tabel resultaten levels SMX, hoge calibratie Sample Name

lev1_1 lev1_2 lev1_3 lev2_1 lev2_2 lev2_3 lev3_1 lev3_2 lev3_3 lev4_1 lev4_2 lev4_3 lev5_1 lev5_2 lev5_3

Analyte Analyte Analyte Calculated Peak Area Peak Height Concentration Concentration (counts) (cps) (ng) (ng)

1,43E+05 1,22E+05 9,13E+04 2,74E+05 1,95E+05 1,55E+05 5,98E+05 5,25E+05 4,75E+05 1,15E+06 1,21E+06 1,04E+06 1,50E+06 2,21E+06 2,11E+06

1,91E+04 1,56E+04 1,32E+04 3,86E+04 2,53E+04 2,01E+04 8,51E+04 7,08E+04 6,28E+04 1,51E+05 1,58E+05 1,37E+05 2,02E+05 2,98E+05 2,95E+05

Moet zijn: Moet zijn: Analyte Calculated Amount (ng) Amount (ng) 6,33 6,19 6,33 5,89 6,33 6,30 31,60 31,40 31,60 32,10 31,60 31,20 158,00 156,00 158,00 157,00 158,00 164,00 317,00 322,00 317,00 313,00 317,00 318,00 475,00 491,00 475,00 489,00 475,00 441,00

47

4,81E+04 4,05E+04 2,82E+04 1,74E+04 1,17E+04 1,01E+04 8,60E+03 7,09E+03 5,95E+03 7,71E+03 7,57E+03 6,73E+03 6,28E+03 9,32E+03 9,67E+03