Fizikai módszerek az élettudományi y kutatásban: mikroszkópia tömegspektrometria mikroszkópia,
O Orvosi i fi fizika ik é és statisztika t ti tik II II. Varjú Katalin 2012. április 16. 1
Mikroszkópos módszerek
sztereo-mikroszkóp használata műtét közben
mikroszkóp szövettani, bakteriológiai alkalmazása
cél: apró részletek láth tó á tétele: láthatóvá tét l : nagyítás feloldóképesség é kontraszt és k növelése 2
Méret feloldóképesség Méret, a kép mérete, illetve a részletek f l ldh tósá a látós feloldhatósága látószögtől ö től fü függ
h D
D
minél közelebb hozzuk, annál nagyobbnak tűnik ű k DE a közelpontnál közelebb már nem tudunk p róla éles képet alkotni gyűjtőlencsével űjtől é l előállíthatunk lőállíth t k nagyított ít tt képet
3
Egyszerű nagyító (lupe) a tárgy max. látószöge
tg
T a a
lá ól ké látószöge lá ó a látszólagos kép
K T tg k t szögnagyítás
1 1 tg T a N a tg t T f k
közelpont
ha a kép a tisztánlátás távolságában van
1 1 a 1 N a f a f 4
tárgy az objektív fók fókusztávolságán kívül
látszólagos, lá ól nagyított, fordított állású végső kép
Mikroszkóp
tárgylencse objektív b k í
szemlencse okulár
tubushossz (fók t k (fókuszpontok távolsága)
valódi, nagyított, fordított állású közbülső kép, az okulár fókusza közelében 5
Mikroszkóp szögnagyítása tubushossz
N
tisztánlátás táv.
d a f1 f 2
objektív f.t. nagyítás, feloldóképesség f l ldóké é
okulár f.t. ft nagyítás
6
Feloldóképesség (felbontóképesség)
© Damjanovich – Fidy- Szöllősi
7
Optikai p rács mikroszkóp p tárgyaként gy -1. rend k 0. rend
1. rend t 2. rend
8
Képalkotás h a diffraktált ha diff ktált nyaláb láb nem jut j t az objektívre, bj ktí akkor kk a képről ké ől hiányoznak a részletek (nincs feloldva) k sin k sin d
feloldási határ: távolságú tá l á ú pontok t k feloldása, k=1 k
n sin
NA
kör alakú keresztmetszet t
0,61
n sin
0,61
NA 9
NA hatása a feloldóképességre minél i él nagyobb bb a NA NA, annál ál több t bb rend d fér fé az objektívre (részlet-gazdagabb kép)
NA n sin
10
Feloldóképesség diffrakciós értelmezése minden i d pontt az apertúrán tú á való ló elhajlás lh jlá miatt gyűrűrendszerré képeződik le
minél nagyobb a NA, annál kisebb egyetlen pont diffrakciós képe 11
Numerikus apertúra
növelése: immerziós objektív
12
Nagyítás és feloldóképesség Nagyítás: N ítá az objektív és az okulár nagyításának szorzata Feloldóképesség: az objektív NA-ja határozza meg Ha az okulárral a nagyítást túlságosan nagyra választjuk, amihez nem társul megfelelő feloldóképesség: üres nagyítás
13
Nagyítás és feloldóképesség tubushossz
tisztánlátás táv.
közeg kö törésmutató
d a N f1 f 2 objektív f.t.
NA n sin
okulár k lá f.t. ft
objektív átmérő
D sin 2 f1 objektív f.t.
14
üres nagyítás í á
nagyítás feloldóképesség növelésével
15
Lencsék leképezési hibái • színi í i hib hiba (kromatikus aberráció)
• gömbi hiba (szférikus aberráció)
16
Lencsék leképezési p hibái • asztigmatizmus ti ti
• párna-hordó torzítás: görbült képsíkok
• kóma-hiba
17
Objektív korrekció
Objective Type
Spherical Aberration
Chromatic Aberration
Field Curvature
Achromat
1 Color
2 Colors
No
Plan Achromat
1 Color
2 Colors
Yes
Fluorite
2-3 Colors
2-3 Colors
No
Plan Fluorite
3 4 Colors 3-4
2 4 Colors 2-4
Yes
Plan Apochromat
3-4 Colors
4-5 Colors
Yes 18
$ 63,99 63 99
$ 23 480
19
Alkotóelemek
Megvilágítás (lámpa, tükör) (7) Írisz / kondenzor lencse (8) Objektív (3) Okulár (1) Objektív revolver (2) Minta asztal (9) Fókusz állító csavar (4 durva – 5 finom)
20
Objektívek Magnification 1/2x 1x 1 25 1.25x 1.5x 2x 2.5x 4x 5x 10x 16x 20x 25x 32x 40x 50x 60x 63x 100x 150x 250x Immersion Media Oil Glycerol Water Special
Color Code No Color Assigned Black Bl k Black Black Brown Brown Red Red Yellow Green Green Turquoise Turquoise Light Blue Light Blue Cobalt Blue Cobalt Blue White White White Color Code Black Orange White Red
21
Okulárok szem törőhibájának korrekciója
okulár-mikrométer (hitelesítés)
pointer i t
22
Binokuláris- vs. vs sztereo-mikroszkóp a két okulár k lá csak k kényelmi funkció
valódi 3D képet ad
23
Megvilágítás homogén h é megvilágítás ilá ítá minimális szórt fény (kontrasztot csökkenti) ált.: világos látóterű – fehér fény, átmenő megvilágítás az eltérő optikai tulajdonságú részek más intenzitású területekként mutatkoznak meg festett minták: a festék tulajdonságai szerint különböző alkotóelemek válnak láthatóvá
24
Kritikus (Nelson) megvilágítás a fényforrás (izzószál) leképeződik a mintára
homogén minta
Köhler megvilágítás
kritikus megvilágítás 25
Köhler megvilágítás g g
1) az izzószál nem a mintára képeződik le 2) a kollektor fényrekesz a mintára képeződik le, így a minta átvilágított területe szabályozható
26
Köhler megvilágítás
27
Speciális mikroszkópok
28
Darkfield- / sötét látóteres- / ultramikroszkóp „oldalfényt” ld lfé t” kapott k tt láthatatlan láth t tl részecskék é kék világítanak ilá ít k
fényszórás
29
Darkfield- / sötét látóteres- / ultramikroszkóp
30
Floureszcencia mikroszkópia megvilágítás ilá ítá hatására h tá á fényt fé t bocsát b át ki natív vagy szelektíven kötődő fluoreszcens festékek alkalmazása f m gerjesztés rövidebb hullámhossz
gerjesztés specifikus hullámhosszal
a gerjesztő fény kiküszöbölése 31
Polarizáció kettős törés Polarizáció,
a kettősen törő (anizotróp, pl: s jtm mb án h ánt sík lt izom, i m sejtmembrán, harántcsíkolt idegsejtek mielinhüvelye) anyagban a törésmutató függ a polarizáció l á ó síkjától ík á ól a két komponens szétválik, és az analizátor után interferenciájukat figyelhetjük meg 32
Polarizációs mikroszkóp
csont
harántcsíkolt izom 33
Kontraszt eredete amplitudó-moduláció
fázis-moduláció
34
Fáziskontraszt fázis fá i szemmel, l kamerával k á l nem detektálható d t ktálh tó fázisrács: a komponensek abszorpciója nem nagyon gy különbözik,, csak a törésmutatója m j kontraszt növelése átlátszó mintákban fixálás, festés nélkül működik, így időbeli folyamatok vizsgálhatók
35
Fáziskontraszt-mikroszkóp
diffraktált nyaláb (±1. rend) direkt nyaláb (0. rend)
36
fázismaszk nélkül
közvetlen nyaláb diffraktált nyaláb eredő
az eredő dő és é a közvetlen nyaláb intenzitása megegyezik
fázismaszkkal
közvetlen nyaláb diffraktált nyaláb eredő
az eredő és a közvetlen nyaláb y intenzitása eltér! 37
fá i fázismaszk k változtatásával ált t tá á l a kontraszt k t t változik ált ik
38
Fáziskontraszt felvételek Bronchiogenic Carcinoma
nyelv
Coronary Atherosclerosis 39
Pásztázó mikroszkópos módszerek • morfológiai f ló i i részletek é l t kf feloldásának l ldá á k növelése atomi méretekben • pontosság tized Å • lézerek elterjedésével egyre gyakoribb • az anyag felszínével kölcsönhatás: valamilyen mérhető fizikai paraméter • pásztázás elve: fordított piezoelektromos hatás 40
Scanning probe *AFM [[atomic force microscopy]] *AFM, *BEEM, [[ballistic electron emission microscopy]] *EFM, [[electrostatic force microscope]] g tunneling g microscope]] p ]] *ESTM [[ [[electrochemical scanning *FMM, [[force modulation microscopy]] *KPFM, [[kelvin probe force microscope]] *MFM, [[magnetic force microscopy]] *MRFM [[magnetic resonance force microscopy]] *MRFM, *NSOM, [[near-field scanning optical microscopy]] *PFM, [[Piezo Force Microscopy]] p g tunneling g microscopy]] py *PSTM, [[photon scanning *PTMS, [[photothermal microspectroscopy]] *SAP, [[scanning atom probe]] *SCM, [[scanning capacitance microscopy]] *SECM SECM, [[scanning electrochemical microscopy]] *SEM, [[scanning electron microscopy]] *SGM, [[scanning gate microscopy]] *SICM, [[scanning g ion-conductance microscopy]] py *SPSM [[spin polarized scanning tunneling microscopy]] *SThM, [[scanning thermal microscopy]] *STM, [[scanning tunneling microscopy]] SVM, [[scanning voltage microscopy]] *SVM *SHPM, [[scanning Hall probe microscopy]] *SSM, [[Scanning SQUID microscope]] 41
AFM (Atomerő-mikroszkópia) • atomi t i méretre é t kih kihegyezett tt tű • a felszíntől igen kis távolságra • gyenge felfüggesztés: követi a topográfiai viszonyokat • a V alakú lemezről visszavert lé lézerfényt fé t detektálja d t ktálj • (a tű és a felszín közötti taszítóerő a Pauli-elv következménye)
42
Modern fénymikroszkópiai eljárások
43
Konfokális mikroszkóp p g élesen elválasztható rétegből g p p a minta optikailag kapunk képet felszeletelése nélkül, a más mélységből származó fényt az apertúra kizárja
~ μm
~300 nm 44
Konfokális síkban apertúra nélkül
Konfokális felvétel
20-40 μm pollenszemcse
3D rekonstruált tárgy
konfokális szeletek 45
DIC (differential interference contrast)
mouthparts of a blowfly/surface defects in a ferro-silicate alloy
46
Pásztázó közeltér mikroszkóp p (SNOM) pontszerű t ű megvilágítás, ilá ítá a diffrakciós diff k ió határnál közelebb (közeli mező, diffrakció még nem lép fel) a feloldást az apertúra mérete és nem a hullámhossz határozza meg
47
Az optikai csipesz a részecskén é ké a fény fé szóródik, ó ódik a részecske „meglökődik” a fénynyomás a részecskét a nyaláb közepén tartja
DNS „kicsavarása”
mesterséges g megtermékenyítés 48
Röntgen diffrakció röntgen-sugár: g g kis hullámhossz – nagy felbontás
rekonstruált tárgy bleomycin-DNS kötés DNS nyers diffrakciós kép 49
Elektronmikroszkópia h
elektron: hullámtermészet p 100 kV gy gyorsítófeszültség: g ≈0,004 nm feloldóképesség: ≈1Å
elektron-nyaláb kölcsönhatásai a vizsgált mintával
optikai lencsék helyett elektron-optika 50
SEM (Scanning g Electron Microscope)
pontról-pontra történő gerjesztés
szórt és másodlagos elektronok detektálása 51
TEM (Transmission Electron Microscope) vékony minta (10-100 nm): az elektronok többsége átjut rajta
erendezett struktúra: e nyaláb elhajlása (elektrondiffrakciós eljárás) leképezés esetén: különböző mértékű elnyelés, amplitudó-kontraszt lit dó k t s t 52
szívizom (TEM)
trachea epithelium (SEM)
53
szem nagyító
konfokális fény mikroszkóp elektron mikroszkóp fé mikroszkóp ik kó fény
54
Mikroszkópos p módszerek feloldóképessége
55
56
Tömegspektrometria g p gáz fázisú ionok tömegének meghatározása (0,5 – 300 kDa ≈ 8,310-22 g – 510-19 g) részecskék szétválasztása tömeg/töltés arány szerint, mágneses tér segítségével
57
Mágneses tér hatása mozgó töltött részecskére é ké
FB q v B töltés
mágneses indukció sebesség
a részecskére é ké ható h tó erő ő a sebességére b é é merőleges, ezért a részecske körpályán mozog, melynek sugara:
58
Motion of Particle in a M f a Charged g Uniform Magnetic Field The magnetic Th ti force f acting ti on a charged h d particle ti l moving i in i a magnetic ti fifield ld is perpendicular to the velocity of the particle. Now consider the special case of a positively charged particle moving in a uniform magnetic field with the initial velocity vector of the particle perpendicular to the field. The particle moves in a circle because the magnetic force FB is perpendicular to v and B and has a constant magnitude qvB. The rotation is counterclockwise for a positive charge.
59
Tömegspektrométer g p részei: ionforrás ((vizsgálandó g anyag y g gáz g halmazállapotba) p ) analizátor (ionok gyorsítása, mágneses térrel szétválasztása a tömeg/töltés arány szerint) d detektor k klasszikus
kvadrupol-tömeganalizáló
60
Vizsgára készüléshez ajánlott: • Damjanovich D j i h – Fidy Fid – Szöllősi: llő i O Orvosii biofizika bi fi ik (3. kiadás) – VI/2. VI/2 A molekuláris és sejtdiagnosztika fizikai módszerei – X/2-3, 5-7. Az élettudományi kutatómunka fizikai módszerei
• Előadás (intézeti honlap, CooSpace) • Optika tankönyvek • Internet… Int n t
61
62
copic Section through one year old ash tree (Fraxinus) wood, wood drawing made by Van Leeuwe
Replica of microscope by Van Leeuwenhoek
63
64
Végtelen tubushossz
65
66
67
