Fény- és fluoreszcens mikroszkópia Optikai szeletelés
Widefield mikroszkópia Z
Focal plane
Z Focal plane
Widefield mikroszkópia vs optikai szeletelés
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/opticalsectioning/confocalwidefield/index.html
Optikai szeletelés – dekonvolúció (COSM: computational optical sectioning microscopy) • widefield mikroszkópia + különböző síkokban felvett képek (nem „digitális konfokális”! Köhler-féle megvilágítás: fókuszsíkban maximálisan egyenletes gerjesztő fény – max. out-of-focus) • mikroszkóp optikai sajátságainak, illetve a PSF ismeretében elvégzett matematikai számítások – fókuszból származó információ relatív felerősítése
NNS: nearest neighbours MPPI:MoorePenrose pseudoinverse WHF: WienerHelstrom filter JvC: Jansson-van Cittert
Optikai szeletelés – struktúrált megvilágítás (SIM – structured illumination microscopy)
Z Focal plane Z • 3 kép, más rácspozícióval -> fókuszon kívüli fény matematikai „kivonása” (a fizikai rács árnyéka a konjugált képsíkra, azaz a fókuszsíkba vetül) • alapvetően fixált preparátumokhoz! (1 síkban 3 kép rögzítése)
Optikai szeletelés – struktúrált megvilágítás (Apotome / OptiGridQT)
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/tutorials/opticalsectioning/apotome/ index.html
Optikai szeletelés – struktúrált megvilágítás (Apotome / OptiGridQT) http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/tutorials/opticalse ctioning/apotomemechanics/index.html
• rel. olcsó • csak fixált prepin! • widefield felvétel: gyorsabb, mint a laser scanning
Optikai szeletelés – konfokális mikroszkópia
[Minsky, 1955] lényeg: fókuszon kívüli reflektált fény kiszűrése „konfokális”: gerjesztés a fókuszpontban történik: max. fókuszált megvilágítás kettős scanning: 1) a kép részletenkénti megvilágítása, majd összerakása 2) emittált fény szűrése: csak a fókuszpontból érkező fényt kell pontonként detektálni szükségszerűen lassabb, mint a widefield mikroszkópia
Optikai szeletelés – konfokális mikroszkópia • konfokális apertúra: csak a fókuszsíkból érkező fényt engedi át („Airy apertúra”)
• összehangolt megvilágítás és detekció: konfokális scanning mikroszkópia (CSM)
(pinhole)
PMT: photomultiplier tube
Optikai szeletelés – konfokális mikroszkópia gerjesztő fény diffrakciós sajátságai -> 1.22 ∗ λ d = point spread function (PSF) NA
widefield konfokális
a widefield és a konfokális mikroszkóp PSF-e
A PSF (point spread function)
FWHM xy = FWHMz =
0.4λ NA 1.4λ n
xy resolution (confocal): ~ 200nm
z resolution (confocal): ~ 600nm
NA² With λ = 635 nm
„konfokális” vagy „Airy” apertúra: 1.22λ/NA értékre állítva
Konfokális lézer scanning mikroszkópia (CLSM) scanning típusok: • tárgy scannelése: fix fókuszpont, prepi mozog • megvilágítás scannelése: prepi fix, fókuszált fény mozog (ált. ez) a) single beam scanning - mozgatható (oszcilláló) galvanikus tükrök - PMT (photomultiplier tube) detekció: pixelenként - relatíve lassú (512x512 pixel, 30 frame/s = >15000 /s rezgés)
-> line scanning - fokális pontban nagy gerjesztési intenzitás kell (1 frame/sec, 512x512 pixel = 4µs/pixel – 80 µW fényerő/pixel)
http://www.microscopyu.com/articles/confocal/confocalintrobasics.html http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/confocalintro.html
Spinning disc konfokális mikroszkóp (SDCM) b) multiple beam scanning - szinkronizált sebességgel forgó tárcsá(k), sok pinhole, többszörös párhuzamos megvilágítás
Nipkow / Petrán / Lichtmann http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/spinningdisk/introduc tion.html
Spinning disc konfokális mikroszkóp (SDCM) b) multiple beam scanning - CCD / EMCCD kamera, teljes látótér - gyors 20000 pinhole, 25 µm-es átmérő, 2000 rpm -> 700 frame/s, < Airy apertúra -> CLSM-hez hasonló felbontás
- ált. fix pinhole, kis megvilágítási/emissziós hatékonyság - nem kell feltétlenül lézer hozzá
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/spinningdisk/ introduction.html http://www.olympusmicro.com/primer/techniq ues/confocal/confocalscanningsystems.html
Spinning disc konfokális mikroszkóp (SDCM) - 2 disc, felsőben lencsék, alsó lemez pinhole-jára fókuszált megvilágítás -> 40-60% gerjesztési intenzitás a 4-6% helyett
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/spinningdis k/introduction.html
Konfokális scanning mikroszkóp - problémák - bleaching: in-focus és out-of-focus területek is megvilágítva – egyforma bleaching mindenütt + hosszabb scan, erősebb fényintenzitás - SNR (signal to noise ratio) javítása: - gerjesztési intenzitás - PMT - scan speed - prepi vastagság, fényszóródás - filter: átlagolás, Kalman - konfokális apertúra: ideális az „airy” apertúra 60-80%-a - időbeli felbontás - bleedthrough: linear unmixing
Kétfoton mikroszkópia (2PM) • gerjesztés 2, szimultán (~femtosec) elnyelt fotonnal (nem lineáris): adott fluorochrom ~ hasonlóan gerjeszthető 2, 2xλ hullámhosszú fotonnal - ált. IR tartomány, kisebb energia -> kisebb photodamage, mélyebb penetráció (>80 µm), kisebb szóródás szövetben is – főleg agyszeletek - gerjesztési fókusz jóval kisebb, mint az 1-foton rendszernél: 80% gerjesztési intenzitás a fókusz 1 µm-es sugarában http://www.microscopyu.com/articles/fluoresce - ált. jóval nagyobb Stokes-shift, nce/multiphoton/multiphotonintro.html mint az 1-foton gerjesztésnél - fókuszált gerjesztés miatt nincs pinhole, így jobb a detektálás hatásfoka is - nagy lézerintenzitás (pulse laser; Ti-Sa, 7501100 nm; 1.000.000x fotonsűrűség!) - DE rosszabb felbontás, mint a hagyományos konfokálisnál (λ nagyobb!) - emissziós nem, de abszorpciós spektrum más, mint 1PM-nél!
Multi-Kétfoton (három)foton mikroszkópia (3PM) mikroszkópia (2PM)
• sokkal kisebb bleaching és photodamage • mélyebb penetráció • több emittált fény • jobb SNR • dye uncaging: lokalizált fotoaktiváció • vmivel rosszabb térbeli felbontás
• gerjesztés 3, szimultán elnyelt fotonnal (nem lineáris)
http://www.microscopyu.com/arti cles/fluorescence/multiphoton/m ultiphotonintro.html
- 2PM-hez képest „csak” 10x foton denzitás kell - szimultán gerjesztés: 1050 3PM [350 nm abszorpció] = 525 2PM - felhasználása: 720 nm 3PM = 270 nm 1fotonM (deep UV!)
