Fény- és fluoreszcens mikroszkópia Szuperrezolúciós mikroszkópia
Szuperrezolúció: nanométeres mérettartomány • „hagyományos” fénymikroszkópia: l és NA által limitált felbontás Resolutionx,y = λ / 2[η • sin(α)] (~180-200 nm) Resolutionz = 2λ / [η • sin(α)]2 (~400-600 nm)
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/ introduction.html
• fénymikroszkópos „szuperrezolúció”: x, y, z febontás egyaránt ~50-100 nmes nagyságrendben (3-7x növelés) elméleti lehetőségek a felbontás növelésére: 1. l csökkentése - gerjesztés elektronnyalábbal •
TEM, SEM (transmission/scanning electron microscopy)
Szuperrezolúció: nanométeres mérettartomány elméleti lehetőségek a felbontás növelésére (folyt.): 2. nagy felbontású minta-scannelés (scanning probe / tunelling microscopy) 2-5 nm (z); 20 nm (xy) • AFM (atomic force microscopy) • near-field scanning optical microscopy (NSOM v. SNOM) - a minta a gerjesztő fény l-nál közelebbi távolságon belül vizsgált: evaneszcens hullámok detektálása - csak felszíni detekció
3. PSF méretének módosítása („far field”) • z sík: 4Pi / I5M (2 objektív lencse) • STED (stimulated emission depletion) • GSD (ground state depletion) • SSIM (saturated structured illumination microscopy) 4. egyedi molekula detekció és lokalizáció („far field”) • PALM (photoactivated localization microscopy ) • STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) • FPALM (fluorescence photoactivation localization microscopy)
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) • nem szuperrezolúció, de határfelszínek (ld. sejtmembrán) közeli detekcióra (max 100-150 nm mélyen) jó • eltérő törésmutatójú határfelszínek: kritikus beesési szög alatt teljes visszaverődés + evaneszcens fény az alacsonyabb törésmutatójú közegben közeli molekula gerjesztése http://www.olympusmicro.com/primer/java/tirf/reflect/index.html
• nagy beesésszögű lézerfény: prizmával vagy nagy NA-jú (>1.4) objektívvel http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence /tirf/tirfintro.html
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy)
4Pi /
I5M
mikroszkópia
z felbontás 3-7x növelése (nem igazán szuperrezolúció......): ~ 100 nm
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution /introduction.html
4Pi: 2 egymással szemben elhelyezett objektív, ugyanabba a síkba fókuszálva -> koherens megvilágítás (lézer) és emittált fény detektálás; konfokális pinhole gerjesztési és detekciós térszög növelése (1 objektívre ez max. 2p (bár igazán csak ~1.3p, azaz ~140˚) -> 2 objektívre 4p)
I5M (incoherent-illumination imaging microscopy / image interference microscopy): 2 egymással szemben elhelyezett objektív, ugyanabba a síkba fókuszálva -> inkoherens, interferencián alapuló widefield megvilágítás, z síkok váltása lényeg: standing wave microscopy – interferencia a kapott kép megjelenítése csak dekonvolúciós elemzés után (PSF side lobe)
A diffrakciós határ áttörése
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution /introduction.html
RESOLFT: reversible saturable (or switchable) optical fluorescence transitions • reverzibilis fotoswitching a fluoreszkáló „on” és a sötét „off” állapot között: - STED: S0 / S1 singlet gerjesztési állapot - GSD: S1 singlet és sötét triplet állapot - reverzibilisen fotokonvertálható molekulák (Cy5, kindling, Dronpa): PALM, STORM • az adott gerjesztési állapot valószínűsége fordított exponenciális arányban áll a gerjesztési intenzitással • szaturációs intenzitás: az a gerjesztési intenzitás, aminél a fotoswitching (adott valószínűséggel) állapotváltás lezajlik – az adott állapot életidejével fordítottan arányos • ha a gerjesztési > szaturációs intenzitás -> fotoswitching reakció • hosszú (gerjesztési) életidő -> jobban variálható gerjesztési / szaturációs intenzitások
A diffrakciós határ áttörése
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution /introduction.html
RESOLFT: reversible saturable (or switchable) optical fluorescence transitions • a gerjesztő, ill. a depléciós megvilágítás intenzitása eltér: - STED: az S1 -> S0 „kikapcsoláshoz” igen nagy energia kell - GSD / fotokonverzió: az S1 -> T „kikapcsoláshoz” v. a metastabil sötét állapot „bekapcsolásához” sokkal kevesebb energia is elég! • egyedi molekula detekció (PALM, STORM): kisebb energia, de sztochasztikus aktiváció • nem könnyű megfelelő fluorokrómokat kiválasztani: nagy intenzitás – erős bleaching
STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia • 10 – 300 psec pulzus gerjesztő / depléciós lézerek • STED lézer: fázismoduláció -> ”lyukas fánk” depléciós minta (250 MW/cm2!) -> fluoreszcencia nélküli visszatérés az S0 állapotba -> PSF redukció a megmaradt fluorokrómoknál
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/superresolution/stedconcept/index.html
Donut Mode for Depletion
Excitation Beam
Depletion Beam
+
In focal point
Result
=
ZOOM
Depletion Beam direction Reception of photons through the pinhole
Emission of excited photons
Direction of emission of photons depleted
STED depléciós lézer
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/superresolution/steddepletion/index.html
STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia feltételek: • a fluorochróm a depléciós hullámhosszon ne gerjesztődjön • fotostabilitás mindkét hullámhosszon • igen ritka Triplet-átmenet • gyenge photobleaching (legyen reverzibilis!) • piko/femtoszekundum pulse lézerek < 20 nm (x, y) és ~40-50 nm (z) felbontás
STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia
STED (stimulated emission depletion) mikroszkópia x-y mellett már Z síkban is alkalmazható a depléció: STED 3x
Examples… 40nm beads
Confocal STED
Examples… neurons CONFOCAL STED
Actin microfilaments of dendritic spines in culture Olivier thoumine and ph Legros.
Examples… Chromosomes
Immunomarquage de la protéine Sycp3 sur spermatocytes de souris au stade pachytène
Bernard de Massy et julien Cau UPR 1142 CNRS Institut de Génétique humaine, équipe Méiose et recombinaison, Montpellier et BIC
PALM (photoactivated localization microscopy) • egyedi molekulák lokalizációja nm-es felbontással, ha - elegendő foton gyűjthető - ritka molekulák (<100/mm2) - ~200 nm-es körzetben nincs más - kis hányad fluoreszkál emittáló molekula • átfedő PSF-ek is elkülöníthetőek, ha az egyik szignál kioltható • több cikluson át: sztochasztikus és kis arányú gerjesztés (alacsony gerjesztési lézer intenzitás) -> képrögzítés -> aktivált fluorochrómok photobleachelése • gyak. hagyományos mikroszkópokon is alkalmazható, EM-CCD kamerával (single foton detekció) • a jó SNR-hez nagy kontrasztú, fotoaktiválható molekulák kellenek • gyakran TIRF mikroszkópiával kombinálva
PALM (photoactivated localization microscopy)
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/palm/practicalaspects.html
PALM (photoactivated localization microscopy ) Technique à très haute résolution microscopie Molecules Off (inactive)
PALM: Photoactivation Localization Microscopy
Activation
Photoconversion
Localisation
Acquire
15 Molecules
Single Molecules On
before
after
Reconstruction
Bleach Reconstruction
Molecules Off
35 Molecules
Activation
wavelength
Localisation
Acquire
Absorption Emission Single Molecules On
Reconstruction
100 Molecules
Bleach Molecules Off
7000 Molecules
PALM (photoactivated localization microscopy) • fluorochrómok mérete és sejten belüli penetrációja korlátozó tényező -> ált. membrán-fehérjék extracelluláris nyomonkövetése
• szintetikus festékek (Alexa, Atto, Cy) jelölésre jók, de fotoaktivációjuk élő sejtekre toxikus
STORM (stochastic optical reconstruction microscopy) dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) PALMIRA (PALM with independently running acquisition) • gyakorlatilag azonos elv, más technikai megvalósítás / gyártó
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/articles/superresoluti on/introduction.html http://www.microscopyu.com/articles/sup erresolution/stormintro.html
STED és STORM összehasonlítás
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/superresolution/stedvsstorm/index.html
STED depléciós lézer
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/superresolution/steddepletion/index.html
