Fény- és fluoreszcens mikroszkópia A mikroszkóp felépítése Brightfield mikroszkópia
Történeti áttekintés 1595. Jensen (Hollandia): első összetett mikroszkóp (2 lencse, állítható távolság) 1625. Giovanni Faber: „mikroszkóp” 1665. Robert Hook (1638–1703): Micrographia; „sejt” 1673. Antonie van Leeuwenhoek (1632–1723): egyedi, kézzel csiszolt lencse, „egyszerű” nagyítás (<500x, ~1 µm felbontás!) 1858. Joseph von Gerlach: agyszeletek festése 1876. első olaj-immerziós objektívek 1873. Camillo Golgi ezüst impregnáció 1900. Santiago Ramón y Cajal 1886. apochromat objektívek (színkorrekció) 1896: Paul Mayer – hematoxilin-eozin festés 1904: Gustav Giemsa – eozin-metilénkék 1924: Feulgen reakció: DNS hidrolízis és festés 1970’s: peroxidáz reakció immunhisztokémiához
Történeti áttekintés ~1850s: Stokes – fluoreszcencia elmélete; 1871: Bayer – fluoreszcein szintézis 1873. Ernst Abbe: diffrakciós limit (optikai rendszer felbontása; numerikus apertúra) 1890s-. Zeiss, Schott: apokromatikus lencsék 1904. August Köhler / 1911. Oskar Heimstädt: fluoreszcens mikroszkóp 1935. August Zernicke: fáziskontraszt mikroszkóp (1953. Nobel díj) 1938. plan-Apochromat objektívek 1939. W. J. Schmidt / 1953. Shinya Inoué: polarizációs mikroszkóp 1942. Albert Coons: fluoreszcens ellenanyagok 1961. Nimsky, Petrán: konfokális mikroszkóp (pinhole) alapelve; 1987. gyakorlati megvalósítás 1967. dichroikus tükör (fluoreszcens mikroszkóp)
Történeti áttekintés 1972, 1976. Fluorescence correlation spectroscopy, FRAP, Förster resonance energy transfer (FRET) 1980s. fluoreszcens Ca2+ indikátorok 1981. total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF) 1983. dekonvolúciós mikroszkópia 1990. 2-foton mikroszkópia 1994. GFP 1997. fluoreszcens bioszenzorok (FRET: Ca2+ szint, PKA, stb...) 1999. vörös fluoreszcens fehérjék 2002. fotoaktiválható fluoreszcens fehérjék 2000 / 2006. szuperrezolúciós mikroszkópia (STED / PALM / STORM)
A mikroszkóp optikai elemei
megvilágítás / fényforrás megvilágítás modulálása kondenzor tárgy (prepi)
objektív kép modulálása okulár detektor http://www.microscopyu.com/articles/optics/components.html
Az upright mikroszkóp
Az inverz mikroszkóp
A kép keletkezése a fénymikroszkópban
Ernst Abbe / Rayleigh egyenlet:
d (felbontás) = 1.22 x (λ/2NA) http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/imageformation.html
Az objektívek jellemzői felbontás és numerikus apertúra (NA) NA = n(sin µ)
n: törésmutató az objektív frontlencséje és a fedőlemez között µ: az anguláris apertúra-érték fele
„száraz” objektív: NA max. 1 (de inkább kisebb) törésmutató növelése: víz (1.33), glicerin (1.47), immerziós olaj (1.51) NA 1 – 1.4 között http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/numaperture.html
Az objektívek jellemzői felbontás és numerikus apertúra (NA) a felbontás a nagyítástól nem, csak a megvilágító fény hullámhosszától és a NA-tól függ!
a fénymikroszkóp maximális (elméleti) x-y felbontása ~ 200 nm <-> STED és szuperrezolúciós mikroszkópia!
Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/aberrationhome.html
szférikus aberráció ált. a törésközeghez való jobb alkalmazkodás segít – objektíven korrekciós gallér kromatikus aberráció Apochromat lencsék: korrigáltan
Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk komatikus aberráció középtengelytől eltérő megvilágítás – mikroszkóp optikai tengelyének centrálása mezőgörbület Plan/Plano objektívek
Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk geometrikus aberráció főleg sztereomikroszkópban
Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk
Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk
Az objektívhibák (aberrációk) és korrigálásuk
http://www.microscopyu.com/articles/optics/objectivespecs.html http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/objectives.html http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/objectives.html
Az objektívek jelölése
A kondenzor cél: a preparátum/látótér egyenletes megvilágítása az objektív NA-jának megfelelő fényoszlop jusson az objektívbe
http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy /condensers.html
A kondenzor Köhler-féle megvilágítás: optikai fényút centrálása, egyenletes megvilágítás beállítása
konjugált síkok a megvilágító és a képalkotó optikai útban: optimálisan mindegyiken egyszerre éles a kép
http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/kohler.html
A fénymikroszkóp konjugált síkjai
http://zeisscampus.magnet.fsu.edu/tutorials/basics/ microscopeconjugateplanes/index.html
A Köhler-féle megvilágítás beállítása 1. megfelelő objektív kiválasztása 2. kondenzor apertúra az objektív NA-jának megfelelő kinyitása 3. tárgy (prepi) fókuszsíkba hozása (=élesre állás) 4. mezőrekesz beszűkítése (-> kép konjugált síkjának definiálása) 5. kondenzor lencse magasságának állításával a mezőrekesz képét a fókuszsíkba hozzuk (= kép konjugált sík) 6. a kondenzor centrálása: a kondenzor centráló csavarok segítségével a kondenzor lencsét középre hozzuk -> látótér egyenletes 2. megvilágítása 7. mezőrekesz kinyitása ~1/3 átmérővel tágabbra, mint az objektív látótere http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/transkohler.html http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/kohlerjava.html
5.
4. 7.
Hasznos honlapok
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html http://www.olympusmicro.com/index.html http://www.microscopyu.com/
Az Airy korongok
