Extracelluláris makromolekulák szerepe a gerincvelő hátsó szarvának fejlődése során egérembriókban. Készítette: Varga Rita

Extracelluláris makromolekulák szerepe a gerincvelő hátsó szarvának fejlődése során egérembriókban

Készítette: Varga Rita

Debrecen 2013

Tartalomjegyzék

Rövidítések jegyzéke ................................................................................................................ 3 1. Absztrakt ......................................................................................................................... 4 2. Bevezetés .......................................................................................................................... 5 2.1. A gerincvelő ontogenezise ......................................................................................... 5 2.2. Extracelluláris makromolekulák ................................................................................ 8 2.2.1. A hialuronsav ................................................................................................... 8 2.2.2. Proteoglikánok ................................................................................................. 9 2.3. Semaphorinok .......................................................................................................... 10 3. Célkitűzések................................................................................................................... 11 4. Anyagok és módszerek ................................................................................................. 12 4.1. Kísérleti állatok ........................................................................................................ 12 4.2. Preparátum készítése................................................................................................ 12  4.3.Hisztokémia-hisztotechnika ...................................................................................... 12  4.4. Fotódokumentáció ................................................................................................... 15  5. Eredmények................................................................................................................... 16 5.1. A ventricularis zóna méretének csökkenése a gerincvelőben a fejlődő egérembrióban ................................................................................................................ 16 5.2. Kondroitin-szulfát proteoglikánok változása a gerincvelői hátsó szarvban ............ 17 5.3. Hialuronsav megoszlása a gerincvelőben ................................................................ 20 5.4. A hialuronsav szintáz 2 (HAS2) fejeződik ki a gerincvelőben ................................ 21 6. Megbeszélés ................................................................................................................... 22 7. Köszönetnyilvánítás ...................................................................................................... 24 8. Irodalomjegyzék ........................................................................................................... 25 9. Függelék ......................................................................................................................... 28 2   

Rövidítések jegyzéke

ABC: avidin-biotin komplex

HA: hialuronsav

bHABP: biotinylated hyaluronan binding protein

HAS: hialuronsav szintáz

CD44: cluster determinant 44 CS: kondroitin-szulfát CSPG: chondroitine-sulfate proteoglican DAB: diaminobenzidin DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindole

HB: habenula HYAL: hialuronidáz gén LEC: liver endothelial cell clearance receptor LYVE-1: lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor NPY: neuropeptide Y

DMMK: dimetil-metilénkék

PBS: phosphate-buffered saline

ECM: extracelluláris mátrix

PCNA: proliferating cell nuclear antigen

FR: fasciculus retroflexus GABA: gamma-aminobutyric acid GAG: glükózaminoglikán

PG: proteoglikán Pros: prosomera

GalNAc: N-acetil-galatózamin

RHAMM: receptor for hyaluronatemediated motolity

GlcNAc: N-acetil-glükózamin

SPAM 1: sperm adhesion molecule 1

3   

1. Absztrakt A gerincvelői hátsó szarv felszínes lamináiban található neuronok felelősek elsődlegesen a fájdalominformáció fogadásáért, feldolgozásáért és továbbításáért felsőbb agyi központok felé. Ezen neuronok később differenciálódnak a ventricularis zóna azon neuroprogenitor sejtjeiből, amelyek a gerincvelő dorsalis felének legventralisabb részén találhatók. Az extracelluláris makromolekulák elengedhetetlen környezetet biztosítanak olyan idegsejtdifferenciálódási folyamatokhoz, mint a sejtmigráció, az axon- és dendritnövekedés valamint a szinaptogenezis. Jelen

munkánkban

vizsgáltuk

a

központi

idegrendszerben

jellemzően

előforduló

extracelluláris makromolekulák, a hialuronsav és a kondroitin-szulfátok expresszióinak alakulását a gerincvelő ontogenezise során, különös tekintettel a hátsó szarv legfelszínesebb lamináira. A vizsgálatainkat egérembriók fejlődési sorából készített szövettani metszeteken végeztük, amelyeket a megtermékenyítéstől számított 10-18 napokon gyűjtöttünk vemhes állatokból. A hialuronsavat egy arra specifikus biotinilált fehérje próbával mutattuk ki, míg a hialuronsav termelésért felelős hialuronsav szintáz (HAS) enzimeket immunhisztokémiai reakcióval. A kondroitin-szulfátokat

savas

dimetil-metilénkék

festéssel,

illetve

immunhisztokémiai

reakcióval tettük láthatóvá. Mind a hialuronsavat, mind pedig a kondroitin-szulfátokat ki tudtuk mutatni a vizsgált preparátumainkon, azonban megoszlásuk lényegesen változott a fejlődés előrehaladtával. A hátsó szarvban a 14. embrionális naptól kezdődően figyeltünk meg fokozott hialuronsav és kondroitin-szulfát termelődést, amely időben egybeesik a hátsó szarvi neuronok differenciációjával. Ebben az időszakban fokozott HAS2 kifejeződést tudtunk megfigyelni a formálódó felszínes laminákban és az érződúc egyes sejtjeiben is. Megfigyeléseink újabb információval szolgálhatnak ahhoz, hogy többet tudjunk meg ezen molekulák neuronális differenciációban betöltött szerepéről.

4   

2. Bevezetés 2.1 A gerincvelő ontogenezise A központi idegrendszer az embrionális élet harmadik hetében kezd el kifejlődni. Az ectoderma megvastagodásából alakul ki a velőlemez, melynek sejtjeiből létrejön a neuroectoderma. A neuroectoderma megjelenése indukálja a neurulatio folyamatát. A velőlemez két oldala emelkedik, kialakítva a velőredőt, amelyek a fejlődés későbbi szakaszában összenőnek. Létrejön a velőcső. A velőcső falában neuroepithel sejteket találunk, amelyek a cső záródása után elkezdenek gyorsan osztódni. Az így képzett sejtréteget neuroepithelrétegnek vagy neuroepitheliumnak hívjuk. A velőcső záródása után a neuroepithel sejtekből neuroblastok alakulnak ki. Ezek alakítják ki a neuroepithel sejtek körül az úgynevezett köpenylemezt. Ez lesz a gerincvelő szürkeállománya. Egyre több neuroblast vándorol be, ami miatt a velőcső dorsalis és ventralis oldala is megvastagszik. A ventralis rész az alaplemez, ami a gerincvelő motoros részét adja. A dorsalis oldal a szárnylemez, amely az érző neuronok régiója (T. W. Sadler,1999). Az agyban kialakuló fájdalomérzet egy igen összetett neuronhálózaton keresztül jut el a perifériától a magasabb agyi központokba. Ezen folyamat első fontosabb átkapcsoló állomása a gerincvelő hátsó szarvában található. Az itt található idegsejtek multiszinaptikus rendszere a bejövő érzőinformációt fogadja és feldolgozza, majd összegzi és továbbítja a felsőbb agyi központok felé. A gerincvelőben levő, fájdalom információ fogadásáért, feldolgozásáért és továbbításáért felelős idegsejtek működésének megértése fontos lehet a fájdalom kialakulásának és csillapítási lehetőségeinek szempontjából. A gerincvelő fehér és szürkeállományból áll, ahol a fehérállomány a felszálló, a leszálló és az intersegmentális idegpályákat, míg a szürkeállomány az idegsejteket és nyúlványait (neuropil) tartalmazza. A gerincvelő szürkeállománya dorso-ventralisan lamináris elrendezést mutat, amelyet először az 50-es években írt le Rexed (1952)(1.ábra). Az elsődleges nociceptiv afferensek a gerincvelő legfelszínesebb lamináiban végződnek (I-II). Az információ innen a gerincvelő hátsó szarvában található projekciós neuronok axonjai által létrejött tractus spinothalamicus útján felsőbb agyi központok felé továbbítódik (Christensen és Perl, 1970; Menétrey és mtsai., 1977; Craig és Kniffki, 1985; Bester és mtsai., 2000). Ilyen projekciós neuronok például az I. laminában található neurokinin-1 receptort tartalmazó Waldeyer sejtek, melyek axonjai a medulla oblongata caudalis ventrolateralis részében, az 5   

area parabrachialisban, a substantia grisea centralisban és közvetlenül a thalamusban végződhetnek (Willis, 1999; Polgár és mtsai., 2002). Hasonló projekciós sejtek a III. és IV. laminában is találhatók, melyek a medulla ventrolateralis részében és a parabrachialis area-ban végződnek. A gátlósejtek fontos moduláló szereppel bírnak ebben az összetett hálózatban, amelyek részleteiben történő megismerése még folyamatban van. A nociceptív projekciós sejtek gátló bemeneteit elsősorban a III. és IV. laminában található GABA és NPY tartalmú interneuronok adják (Todd és Sullivan 1990).

1. ábra. A gerincvelő anatómiai és funkcionális tagolódása (Röhlich Pál- Szövettan, 2006). Az elsődleges nociceptiv afferensek a gerincvelő I. és II. laminájában végződnek. Az információ innen a tractus spinothalamicus útján felsőbb agyi központok felé továbbítódik. A szürkeállományt a sárga szín, míg a laminákat a számok jelölik.

A gerincvelő működésének és kapcsolatainak mélyebb megértéséhez fontos adatokkal szolgálhat a központi idegrendszer fejlődésének ismerete. A gerincvelő neuron diverzitását kialakító mechanizmusokról még hiányosak az ismereteink. Az idegrendszer változatosságát adó neuroepithel sejtek időben és térben való szabályozása révén valósul meg. A gerincvelő 6   

hátsó szarvát dorso-ventralisan jól elkülönülő 6 neuroprogenitor sejtből differenciálódó 8 postmitotikus neurontípus adja (2. ábra). Ezek közül 6 időben korábban, míg 2 később differenciálódik (Helms és Johnson, 2003; Lewis 2007).

2. ábra. Gerincvelői progenitor sejtek és postmitotikus neuronok expressziós eloszlása (Alaynick és mtsai., 2011). A progenitor sejtek utódsejtjei közül azok, melyek időben később differenciálódnak (dILA , dILB ) a hátsó szarv felszínes lamináiba vándorolnak és válnak a fájdalom ingerületek feldolgozására specializált idegsejtekké. A zöld szín a transzkripciós faktorokat jelöli. A színes körök a progenitor és postmitotikus sejttípusokat mutatják.

A később differenciálódó populáció vándorol a gerincvelő legfelszínesebb lamináiba, míg a korábbiak a hátsó szarv mélyebb lamináit alakítják ki. A gátlósejtek genetikai profiljában meghatározó a Pax2 és a Ptf1a gének működése, míg a serkentő neuronokra a Tlx1 és Tlx3 expresszió a jellemző. A postmitotikus sejtek lefűződésük után a gerincvelőben radiális és tangenciális irányban is migrálnak (Leber és Sanes, 1995).      

7   

2.2. Extracelluláris makromolekulák 2.2.1. A hialuronsav A hialuronsav negatív töltésű, nagy molekulatömegű polisacharid, amely D-glükoronsav és N-acetil-D-glükózamin disacharid egységeket tartalmaz. Bár a glükózaminoglikánok osztályába sorolják, különbözik a többitől. Molekulasúlya ~2x105 és ~108Da között van és teljes hossza 2-25 µm közé tehető. A többi GAG-nak relatíve kisebb a mérete <50kDa, általában 15-20 kDa rövid lánchosszúsággal (Laurent és Fraser, 1992; Lee és Spicer, 2000; Toole, 2004). A hialuronsav a gerincesek majdnem minden szövetében megtalálható, de legnagyobb mennyiségben a laza kötőszövet ECM-ban (Fraser és mtsai., 1983). A szövet eredetétől függően, a polimer 2000-25 000 disacharid egységet tartalmaz. Emlősökben a köldökzsinórban, bőrben, synovialis folyadékban és az üvegtestben a legmagasabb a koncentrációja (Girish és Kemparaju, 2007). Legfőbb tulajdonsága, hogy jelentős vízmegkötő képessége van. Ezen kívül a molekulának több fontos funkcióját írták le, mely szerint autocrin szabályozás révén kötődik a sejtfelszíni receptorokhoz illetve paracrin hatást fejt ki a szomszédos sejtek ECM molekuláin (Tammi és mtsai., 2002;Turley és mtsai., 2002; Toole, 2004). Képes több száz fehérjét megkötni és az így kialakult komplexek HA receptorok révén kötődnek a sejtfelszínhez. A hialuronsav receptorai már ismertek. Ilyen a CD44, RHAMM, LYVE-1, LEC receptor és a TLR-4. (Laurent és mtsai., 1996; Vercruysse és mtsai., 1999; Toole és mtsai., 2002; Turley és mtsai., 2002; Toole,2004; Spicer és Tien, 2004; Adamia és mtsai., 2005; Taylor és Gallo, 2006).

A hialuronsav expressziója és lebontása A HA bioszintézise három transzmembrán glikozidáz által szabályozott folyamat. Ezen hialuronsav szintáz izoformák (HAS1, HAS2, HAS3) feladata sejt és szövet specifikusan jelenik meg, de a pontos funkciójuk a sejt szignalizációban még tisztázatlan. Az egér és a humán hialuronsav szintáz gének különböző kromoszómákon lokalizálódnak azt sugallva, hogy

a

génduplikáció

és

a

divergens

evolúció

a

kódolt

szintázok

különböző

génszabályozásainak és kinetikus tulajdonságainak eredménye. (Toole, 2004; Adamia és mtsai., 2005).

8   

A hialuronsavat a hialuronidáz enzim bontja, mely pro- és eukariótákban is expresszálódik. A hialuronidáz általi HA lebontás megnöveli a kötőszövet permeabilitását és csökkenti a testfolyadékok viszkozitását, továbbá részt vesz a bakteriális patogenezisben és egyéb folyamatokban. (Girish és Kemparaju, 2007). Az elnevezés Karl Meyertől származik, aki három különböző csoportba osztotta a hialuronidázokat biokémiai analízis és a keletkezett végtermék alapján. (Meyer, 1971). Így megkülönböztetünk emlős, méreg és mikrobiális hialuronidázokat. Az első két csoport rendelkezik hidrolitikus és transzglikozidáz aktivitással is, míg az utóbbinak nincs hidrolitikus aktivitása. (Cramer és mtsai., 1994) Egy másik besorolás alapját a pH aktivitás képezi, mely szerint vannak savas (pH 3-4) és neutrális (pH 5-8) környezetben aktív hialuronidázok. (Kreil,1995; Stern, 2004; Kemparaju és Girish, 2006). Hat hialuronidáz gént azonosítottak emberekben. A HYAL1, HYAL2 és a HYAL3 a harmadik kromoszómán lokalizálódik, míg a másik három gén HYAL4, PHYAL1 (pszeudogén) és a SPAM1 a hetedik kromoszómán. A testi szövetekben megtalálható legfőbb hialuronidáz a HYAL1 és HYAL2. (Csoka és mtsai., 2001) Ezzel szemben az egér genomban hét hialuronidáz gén szekvencia van. (Miller és mtsai., 2007; Reitinger és mtsai., 2007) Hyal1-et izolálták és írták le először (Csoka és mtsai., 1999; Afify és mtsai., 1993). A Hyal1 minden méretű hialuronsavat képes szubsztrátként használni. (Stern, 2004; Csoka és mtsai., 1998)

2.2.2. Proteoglikánok A proteoglikánok (PG-k) olyan glikozilált fehérjék, melyek központi régiójához egy vagy több glükózaminoglikán oldallánc kapcsolódik kovalens kötéssel. A GAG molekulák szét nem ágazó polisacharidok, melyek ismétlődő disacharid egységekből állnak. A disacharid alegységek N-acetil-glükózamint vagy N-acetil-galaktózamint illetve glukuronsavat vagy iduronsavat tartalmaz. A glükózaminok lehetnek szulfatált és nem szulfatált formában. Nem szulfatált formája a hialuronsav, míg szulfatált a kondroitin-szulfát, heparán-szulfát vagy a keratán-szulfát. A kondroitin-szulfátokat D-glukuronát és GalNAc szulfatált egysége alkotja, míg a hialuronsav polimert D-glukuronát és GlcNAc. A leggyakrabban előforduló GAG a kondroitin-szulfát, mely fehérjéhez kötődve kondroitin-szulfát proteoglikánokat hoz létre. Ezt a családot lektikánoknak hívjuk, ide tartozik az aggrekán, a brevikán, a verzikán és a neurokán.

Ezen

proteoglikánok

alkotják

az

extracelluáris

mátrix

főbb

részét.

(http://themedicalbiochemistrypage.org) 9   

2.3. Semaphorinok A semaphorinok szekretált vagy membránhoz kötött proteinek, melyek az axon növekedési kúp irányításában vesznek részt. Nyolc fő csoportjukat írták le. Az első hét osztályt számmal (1-7), míg a nyolcadikat betűvel (V) jelölik, ahol a ’V’ vírust jelent. Az első és második osztály kizárólag gerinctelenekben, a 3. 4. 6. 7. csak gerincesekben, az 5. mindkettőben illetve a ’V’ vírusokban fordul elő. ( C.S. Goodman és mtsai., 1999) Joris De Wit és Joost Verhaagen 2007-ben végzett kutatása szerint (3. ábra) a semaphorinok axon növekedésére kifejtett hatását erősen befolyásolhatják az extracelluláris mátrix GAG molekulái. Ezt a hatásmechanizmust jól szemlélteti a diencephalonban leírt kísérlet. A habenula rostjainak két szomszédos prosomera között kell átnőnie ahhoz, hogy a középagyban végződhessen. A prosomerákban történő végződésüket két semaphorin expressziója akadályozza meg, a Sema3F és a Sema5A. Utóbbi taszító hatását a kondroitinszulfátokkal való kölcsönhatása teszi lehetővé, mivel bármelyik komponens kísérletesen kialakított hiánya ezt a taszító hatást megakadályozza. (Joris De Wit és Joost Verhaagen 2007).

3. ábra. A semaphorinok kölcsönhatása a kondroitin-szulfát proteoglikánokkal (Joris De Wit és Joost Verhaagen 2007). A diencephalonban végzett kísérlet bizonyítja, hogy a Sema5 taszító hatását kondroitin-szulfátokkal kölcsönhatásban fejti ki. Normál körülmények között a semaphorinok taszító hatása következtében a rostok átnőnek a prosomerák között. A Sema5A illetve a kondroitin-szulfát eltávolítása után ez a hatás megszűnik. HB- habenula; FRfasciculus retroflexus; pros-prosomera 10   

3. Célkitűzések

Annak érdekében, hogy jobban megértsük a felületes hátsó szarvi fájdalom feldolgozó neuronhálózatok szerveződési alapelveit, követni akarjuk az extracelluláris makromolekulák expresszióját a felületes hátsó szarvi neuronok differenciációja során. Kísérleteinkben két kulcskérdésre keresünk válaszokat: 1) Hogyan változik a progenitor és postmitotikus neuronok aránya a gerincvelő fejlődése során? 2) Hogyan változik a hialuronsav, a kondroitin-szulfát megoszlása ezen idegsejtek morfogenetikus érése során? A kérdéseinket az alábbi célok megvalósításával kívánjuk megválaszolni: 1) A neuroprogenitor sejteket tartalmazó ventricularis zóna viszonylagos méretének változásának nyomon követése a fejlődő gerincvelőben. 2) A hialuronsav és a kondroitin-szulfát hisztokémiai módszerekkel történő nyomon követése a gerincvelő hátsó szarvának ontogenezise során.

11   

4. Anyagok és módszerek 4.1. Kísérleti állatok Kísérleteinket a Crl:CD1 (ICR) törzs egereivel végeztük, melyek a Charles River Laboratories-ból származnak. Olyan albínó egerek, melyekre jellemző a gyors növekedés, és a kezelhetőség. Magas reprodukciós rátával rendelkeznek, mely 11-12 egeret jelent almonként. A vemhességi idejük 19-20 nap. A hisztotechnikai vizsgálatokhoz kilenc különböző fejlődési stádiumban levő egérembriót gyűjtöttünk az embrionális fejlődés 10,5-18,5 napjain (E10,5-E18,5) időre pároztatott vemhes egerekből. Az embriókat 4%-os pufferelt paraformaldehidben illetve Saint Marie fixálószerben fixáltuk.

4.2. Preparátum készítése A vízoldékony extracelluláris molekulák szövetekben való megőrzése érdekében mintáinkat alkoholos Saint-Marie fixálóoldatban fixáltuk egy éjszakán át 4°C-on, melyeket felszálló alkoholsorral való dehidrálás után paraffinba ágyaztunk. A kiöntés során az embriók teljes fejlődési sorából származó mintákat egy parafinos blokkba öntöttük ki egy ún. embrió fejlődési sor ’array’ (a ’tissue array’ mintájára) blokkot létrehozva ezzel. A nyaki vagy felső thoracalis gerincvelői szegmentumok keresztmetszeteit tartalmazó embriókból 5 μm vastag szövettani metszeteket készítettünk. Az egyes immunhisztokémiai reakciók kivitelezéséhez az embrió mintáinkat 4%-os paraformaldehidben fixáltuk egy éjszakán át 4°C.Rövid PBS-ben történő mosás után a mintákat 20%-os szacharóz krioprotektáns oldatba tettük, majd kriosztáttal (LeicaCM3050S) 20 µm vastagságú metszeteket készítettünk.

4.3 Hisztokémia-hisztotechnika Szulfatált glükózaminoglikánok festése Rutin hisztotechnikai eljárások során a szulfatált glükózaminoglikánokat toluidinkékkel vagy annak (kisebb mérete miatti) intenzívebb festődést adó származékával, a dimetil12   

metilénkékkel lehet specifikusan kimutatni a szövettani metszetekben azok metakromáziás festődése miatt. A festékmolekula vizes oldata bázikus jellegű, így a szövetalkotók negatív töltésű komponenseihez kötődik hozzá. A szulfatált glükózaminoglikánok szulfátcsoportjai egyrészt erősen anionos jellegűek, másrészt az általuk hordozott negatív töltések közelsége miatt a bekötődött festékmolekulák elektronfelhője átfed egymással, ami a festékmolekula színének változásában jelenik meg. Ezek alapján a szulfatált glükózaminoglikánokat savas dimetil-metilénkék festéssel mutattuk ki a kriosztáttal készített szövettani metszeteinkben. A dimetil-metilénkék festéket 0,1%-os koncentrációban 3% ecetsavban oldva használtuk (pH 2.58 és pH 1.8). A kationos DMMK festék a fixált szövetben az anionos karakterű komponenseket festi. A festőoldat kémhatásának csökkentésével a DMMK affinitása is csökkenni fog az anionos jellegű kémiai csoportokhoz. Igen alacsony pH-n (1.5-2) már csak a legerősebben anionos szulfátcsoportok fognak reagálni a festékkel. A szövetekben az ilyen szulfátcsoportokat főként az extracelluláris mátrixban található proteoglikánok szulfatált glükózaminoglikán

oldalláncai

tartalmazzák

nagy

mennyiségben.

A

szulfatált

glükózaminoglikánok ezen túlmenően azok szulfát csoportjainak egymáshoz viszonyított közelsége miatt metakromáziásan is festődnek DMMK-val. A kontroll kísérletekben a DMMK festést megelőzően a szulfatált glükózaminoglikánokat és a hialuronsavat enzimatikus emésztéssel eltávolítottuk a szövetekből. Az emésztéshez kondroitináz ABC (2U/ml, Sigma) és hialuronidáz (10 U/ml, Fluka) enzimeket használtunk 0.1 M Tris-HCl (pH8.3) 2mM MgCl2 pufferben egy éjszakán át, 37°C-on. A nukleinsavak alacsony pH-n történő DMMK-hoz való kötődésének elkerüléséhez a szövettani preparátumainkat DNáz és RNáz (Sigma) enzimekkel kezeltük egy éjszakán át 37°C-on. Az enzimeket 10 U/ml koncentrációban használtuk 0.1M Tris-HCL (pH8.3) 2mM MgCl2 pufferben.

Hialuronsav kimutatása affinitás-hisztokémiai reakcióval A hialuronsavat egy arra specifikus próbával mutattuk ki, amelyet finn kollaborációs partnereinktől kaptunk (M. Tammi és R. Tammi, Kuopioi Egyetem, Kuopio, Finnország). A próba szarvasmarha ízületi porcából származó aggrekán hialuronsav-kötő ún. G1 doménjét tartalmazó fehérje, amelyet izolálás és tisztítás után biotinnal konjugáltak. Az így készült próbát (bHABP) 5 mg/ml koncentrációban használtuk a hialuronsav szövettani metszetekben történő kimutatásához. A hisztotechnikai reakció során a paraffinos metszeteket deparaffinálás és rehidrálás után PBS-ben mostuk. A szövetekben az endogén peroxidázt 3% 13   

H2O2-t tartalmazó metanolos kezeléssel gátoltuk 30 percig szobahőmérsékleten. A metszeteket pufferes mosásukat követően bHABP próbával inkubáltuk 10% BSA mellett 4 ºC-on, két napon át. Ismételt mosásokat követően a bekötődött próbát avidin-biotin-peroxidáz komplex-szel inkubáltuk a gyári előírás szerint (Vectastain ABC-kit, Vector Laboratories). A próbához kötődő peroxidáz enzim jelenlétét DAB enzim-szubsztrát reakcióval mutattuk ki a gyártó által javasolt előírást betartva (DAB substrate kit, Vector Laboratories).

Kondroitin-szulfát proteoglikánok kimutatása immunhisztokémiai reakcióval A

kondroitin-szulfátok

jelenlétét

immunhisztokémiai

reakcióval

mutattuk

ki.

Az

immunhisztokémiai reakciók során használt monoklonális antitest (Monoclonal AntiChondroitin Sulphate IgM, C8035, 1:10, Sigma) a proteoglikánok glükózaminoglikán oldalláncát köti. Az antitest a gyártó közlése szerint specifikusan reagál a kondroitin-szulfát A-val és C-vel, de nem köti a kondroitin-szulfát B-t, amely például a dermatán-szulfátok oldalláncát adja. A reakció során az antitestet 25mM MgCl2-ot tartalmazó tris-pufferben (TBS, pH 7.6) hígítva egy éjszakán át 4°C-on inkubáltuk a metszeteken 5 % nem immunizált kecskeszérummal történő – az antitest nem specifikus kötődését elkerülő – blokkolást követően. A nem kötődött antitest PBS-sel történő mosását követően biotinilált másodlagos antitestet (Anti-mouse IgM, 1:200, Vector Laboratories) és 5 % kecskeszérumot tartalmazó pufferrel inkubáltuk a metszeteinket egy órán át szobahőmérsékleten. Ismételt PBS-sel történő mosás után a bekötődött antitestet avidin-biotin peroxidáz komplex-szel inkubáltuk a gyártó által előírt leirat szerint (Vectastain ABC-kit, 1:50, Vector Laboratories). A próbához kötődő peroxidáz enzim jelenlétét DAB enzim-szubsztrát reakcióval mutattuk ki a gyártó által javasolt előírást betartva (DAB substrate kit, Vector Laboratories) Az antitest antigén-specifikus kötődését kontroll kísérletekben is ellenőriztük, amelynek során a metszetekből a kondroitin-szulfátot kondroitináz ABC enzimmel (2U/ml; C-2905, Sigma) emésztettük tris-Na-acetát (pH8) pufferben egy éjszakán át 37 ºC-on. Az emésztést követően elvégzett immunhisztokémiai reakció nem adott jelet.

14   

Hialuronsav szintáz kimutatása immunhisztokémiai reakcióval A hialuronsavat termelő hialuronsav szintázokat (HAS1, HAS2 és HAS3) azokra specifikus poliklonális antitestekkel mutattuk ki a szövettani preparátumokon. A felhasznált antitestek főbb paramétereit a 1. táblázat tartalmazza. Az elsődleges antitesttel a metszeteket egy éjszakán át inkubáltuk 5% (a második antitestet adó fajból származó) normál szérumot is tartalmazó pufferben. A bekötődött antitest kimutatása a kondroitin-szulfát immunreakcióval azonos módon történt a biotinilált fajazonos másodlagos antitestek felhasználásával.

Elsődleges antitest anti-HAS2 (Y-14) (Santa-Cruz)

antitestet adó állatfaj

Másodlagos antitest

nyúl

Hígítás

anti-kecske IgG

kecske

anti-HAS2 (H-60) (Santa-Cruz)

Hígítás

1:50 1:500

anti- HAS3 (abcam) nyúl anti-HAS3 (sigma) nyúl 1. táblázat. HAS antitestek főbb jellemzői

anti-nyúl IgG

1:200

anti-nyúl IgG anti-nyúl IgG

Osztódó sejtek kimutatása immunfluoreszcens reakcióval A proliferáló sejteket PCNA ellen termelt monoklonális antitesttel (1:100, Millipore) mutattuk ki (inkubáció egy éjszakán át 4°C-on, 5% normál kecskeszérumot tartalmazó PBS-ben) különböző életkorból származó szövettani metszeteken. Az inkubációt követő pufferes mosások után a kötődött antitestet zölden fluoreszkáló Alexa fluor 488 konjugált másodlagos antitesttel (1:500, Invitrogen) tettük láthatóvá (inkubáció 2 órán át, szobahőmérsékleten PBSben). A sejtmagokat DAPI-val (4′,6-diamidino-2-phenylindole) festettük (100 nM) 10 percig, majd a metszetek PBS-sel történő mosását követően Mowiol-lal (Sigma) fedtük.

4.4. Fotódokumentáció A metszeteket áteső vagy epi-fluoreszcens fényforrással szerelt mikroszkóphoz (Nikon ECLIPSE E800, Japán) kapcsolt hűtött digitális kamerával fényképeztük (Olympus DP72, Japán). A képek szerkesztése Adobe Photoshop programmal történt. 15   

5. Eredmények 5.1. A ventrikuláris zóna méretének csökkenése a gerincvelőben a fejlődő egérembrióban

Az osztódó sejtek kimutatásával megnéztük (4. ábra), hogy hogyan változik a ventrikuláris zóna viszonya az intermedier illetve a marginális zónákhoz képest a különböző életkorú egérembriókból származó szövettani metszeteken annak érdekében, hogy pontosabb képet kapjunk a hátsó szarv differenciálódásának időszakáról. A fejlődés során a PCNA immunopozitív sejtekkel jelölt ventrikuláris zóna viszonylagos mérete csökken. A vizsgált egérembrió törzsben a hátsó szarv kialakulása a cervicalis szakaszokon, a mellső szarvhoz képest időben később, a gestatio 13. napját követően történik meg.

4. ábra. A ventricularis zóna változása a gerincvelő érése során. Az ábrákon különböző fejlődési stádiumokból származó (E10-13) gerincvelő keresztmetszeteken elvégzett PCNA immunfluoreszcens reakciók eredményei láthatók (zöld). A sejtmagokat DAPI-val festettük (kék). A progenitor sejteket tartalmazó zóna (nyilak) méretének csökkenése figyelhető meg az életkor előrehaladtával. A hátsó szarv sejtjeinek megjelenésére a 13. napot követően lehet számítani. Lépték: 100μm. 16   

5.22. A kondrooitin-szulfáát proteogliikánok válttozása a gerrincvelői hátsó szarvb ban Munkánnk során saavas dimetiil-metilénkéék festést alkalmaztunk a k illetve a kontraszt növelése n érdekébben a nukleiinsavak festték-kötődéssének mértéékét részlegges DNáz éss RNáz eméésztéssel csökkenntettük. Azz ilyen módon elkészzített preparrátumainkban azonbann a fejlődéés késői stádium mában, közvetlenül a születést megelőző napokon tudtunk sszemmel láthatóan metakroomáziásan festődött szövetalkotóókat kimutaatni (5. ábra). A festtődés elsőssorban a mellső szarvban s a nagy n motonneuronok köörül volt jelllemző.

E17

5. ábraa. Glükózaaminoglikáánok megooszlási min ntázata. Feestődést cssak az emb brionális fejlődéss 17. napjánn tapasztaltuunk a mellsső szarv mo otoneuronjaai körül. A jobb felső képen a hátsó szzarv egy résszlete láthattó kinagyítvva, míg az alsó a képen a mellső szaarv. A nyíl a mellső szarv naagy motoneeuronjára mutat, m amelyyek körül jó ól látható meetakromáziáás DMMK festődés figyelheető meg. Azz ábrán a szám az emb mbrionális naapot jelöli. Lépték: baloldali paneelen 100 μm, a joobb oldali paneleken p 200 μm. A DMMK festésssel készüllt preparátuumokon teett megfigyyeléseink aalapján kétt kérdés vetetődöött fel. Eggyrészt elégg érzékeny-e ez a módszer m a kis k mennyiiségben jellen levő glükózaaminoglikánnok expresssziós változzásának vizzsgálatára? Másrészt van-e egyááltalán a gerincveelő korábbbi fejlődésii stádiumaaiban kimu utatható meennyiségű glükózamin noglikán expresszzió? 17   

Kérdéseeink megválaszolásáraa immunhiisztokémiaii módszertt alkalmazttunk mono oklonális kondroiitin-szulfát elleni antiteestet felhaszználva. Ugy yanabban az életkorbaan, amelyikb ben csak gyenge metakromááziás festőddést láttunk a neuronok k körül, az immunopoz i zitív jelölőd dés jóval intenzívvebb volt (6. ábra), bizonyítvaa az imm munhisztokém miai reakcció jóval nagyobb n érzékennységét a DMMK D feestési eljárááshoz képeest. Megfiggyeltük, hoogy a jelö ölődés a középvoonalról szinnte hiányzikk, míg a sejtek körül és a fehérállom mányban iss intenzív. Az A elülső szarvbaan a nagy motoneuronok körül erősebb, a hátsó szaarvban a kkisebb sejteek körül halványyabb jelet lááttunk.

E17 6. ábraa. Kondoitiin-szulfát proteogliká p ánok (CSPG-k) expreessziója a gerincvelőben. Az ábrán a kondroiitin-szulfát immunhissztokémiai reakció képe k láthaató fél geerincvelő keresztm metszeten a 17. embriionális napoon (E17). A fehérálloományban éés a sejtek körül is látható immunopozzitív jelölődés. A hátssó szarv feelszínes zónnáiban halvványabb (jobb felső nabban a panel), míg a mellsső szarvbann intenzívebbb jel figyellhető meg (jjobb alsó panel) ugyan D festtési reakció ónál. Léptékk: bal oldalii panelen 10 00 μm, a fejlődéssi stádiumbaan, mint a DMMK jobb olddali panelekken 20 μm. Mivel a hátsó szarrvi sejtek megjelenésé m ére és az ittt zajló éréssi folyamattok kezdetéére a 13. naptól kell k számítaani, így ezeen és a rákkövetkező em mbrionális napokon iss tanulmány yoztuk a 18   

kondroitin-szulfát proteoglikánokexpressziós mintázatának alakulását (7. ábra, bal oldali panelek).

E13

E14

7. ábra. A CSPG-k expressziós mintázata jelentősen megváltozik a gerincvelő ontogenezise során. A képen kondroitin-szulfát immunreakció látható két egymást követő embrionális napon (E13, E14). Pozitív reakció figyelhető meg a fehérállományban (kék nyilak) és radier rajzolatok formájában a szürkeállományban (piros nyilak). A comissura anterior és posterior területén a reakció hiánya figyelhető meg (fekete nyilak). A reakció képe a 14. napra jelentősen megváltozik. A mellső szarv intenzív reakciója látható, míg a hátsó szarvban radier rajzolatok figyelhetők meg. Lépték: felső képeken 100 μm, az alsókon 50 μm.

Az immunopozitívitás hiánya a középvonal mentén a 13. napon is megfigyelhető volt, amely a commissura anterior és posterior kialakulásában lehet fontos tényező. A szürkeállományban 19   

a dorsalis és a ventralis fél mintázata eltérő volt. A ventralis részben a ventricularis zónában jól látható radier rajzolatú jelölődés volt tapasztalható, míg a dorsalis részben nem, vagy csak nagyon halvány volt az immunopozitivitás. Érdekesnek találtuk a ventricularis zóna laterális határán megfigyelhető reakciót, illetve a fehérállomány jelölődését. A reakció mintázata a 14. napra jelentősen megváltozott (7. ábra, jobb oldali panelek). Az elülső szarv és a hátsó szarv immunreakciója közti különbség igen kontrasztos képet mutat. Míg a mellső szarv intenzíven jelölődött, addig a hátsó szarvban csak néhány radier rajzolat látható. Ez utóbbiak feltételezhetően idegrostok, amelyek a fehérállományban is jellemzően immunopozitívak. A 15. és 16. napon jelentős változást nem tapasztaltunk. A hátsó szarv terültén is fokozatosan megjelennek a kondroitin-szulfát proteoglikánok, mint ahogy az a 17. napon is látható volt. Jelentős változást azonban csak az alábbi két napon tapasztaltunk.

5.3. Hialuronsav megoszlása a gerincvelőben Korábbi kutatások hialuronsav neuronális differenciációra gyakorolt hatását már igazolták, így ezen glükózaminoglikán molekula megoszlását is vizsgáltuk a gerincvelő érése során. A szövettani preparátumainkban a hialuronsav jelenlétét affinitás-hisztokémiai próbával (bHABC) mutattuk ki.

8. 8. ábra. Hialuronsav megoszlása a gerincvelő fejlődése során. A 13. napig a reakció mintázata nagyban hasonlít a CSPG eloszlásához (felső panelek). A 14. naptól kezdődően azonban ettől eltérő mintázatú hialuronsav reakció volt megfigyelhető (alsó panelek) a hátsó szarvban. A számok az embrionális napokat jelölik. Lépték: 100 μm. 20   

A reakció mintázata az embrionális életkor 10-13. napjáig hasonló volt a kondroitin-szulfát immunreakcióhoz (8. ábra). A 14. napon azonban a hátsó szarv bHABC reakciója intenzív volt a mellső szarvihoz hasonlóan. Ellentétben a kondroitin-szulfát immunoreaktivitással, ebben az esetben nem találtunk szemmel látható különbséget a hátsó és a mellső szarv reakciójának intenzitásában. 5.4. A hialuronsav szintáz 2 (HAS2) fejeződik ki a gerincvelőben A hialuronsavat membránhoz kötött hialuronsav szintáz enzimek termelik, amelyből a gerincesekben három izoenzimet azonosítottak (HAS1, HAS2 és HAS3). Immunhisztokémiai reakcióval HAS1 expressziót nem tudtuk kimutatni a gerincvelőben egyik általunk vizsgált fejlődési stádiumban sem. A HAS3 kifejeződése a gerincvelő kezdetleges kötőszövetes burkaira és az erek mentén volt jellemző a fehérállományban. A HAS2 immunreakció azonban a szürkeállományban is kimutatható volt (9. ábra). A hátsó szarvban a hialuronsav megjelenésével párhuzamosan a 14. naptól kezdődően tudtunk immunopozitív jelet regisztrálni. Azonban ellentétben a hialuronsav megoszlását a HAS2 pozitív területek réteges elrendeződését tudtuk megfigyelni a későbbi stádiumokban.

9. ábra. A hialuronsav szintáz 2 (HAS2) expressziója a gerincvelő hátsó szarvában a fejlődés során. A nyilak a hátsó szarv felszínes zónájában megjelenő HAS2 immunopozitív területeket mutatják. A reakció fokozódása figyelhető meg a hátsó szarv felszínes zónájának érése során a 14. naptól kezdődően. Lépték: 50 μm.

21   

6. Megbeszélés A gerincvelő érésével arányosan csökkent az osztódó sejtek száma a ventrikuláris zónában és váltak postmitotikus sejtekké. Megfigyelésünk alapján – összhangban az irodalmi adatokkal – kijelenthető, hogy az egérembrióban a gerincvelő hátsó szarvának kialakulása csak a mellső szarv kialakulását követően történik meg (Alaynick és mtsai., 2011 összefoglaló). A központi idegrendszer érési folyamataihoz a differenciálódó sejteket körülvevő extarcelluláris mátrix biztosítja a megfelelő környezetet. Munkánk során az extracelluláris mátrix két fő komponensének, a hialuronsav és azzal molekuláris kapcsolatban álló kondroitin-szulfát proteoglikánok kifejeződésének változásait követtük nyomon sorozatos mintavételezéssel az egérembrió gerincvelő fejlődése során. A kondroitin-szulfát proteoglikánok ún. ’core protein’-hez kötve találhatók meg az ECM-ban, melyek glikoziláltsági foka változó. Szerepük a központi idegrendszer fejlődésében nagyon változatos. Egyes adatok szerint erősen negatív töltésük miatt az extracelluláris környezetben ionok, például kalcium puffereiként szolgálhatnak a sejtek működéséhez megfelelő lokális ionkoncentrációt biztosítva ezáltal. Mások szerint a proteoglikánok központi fehérjéje tartalmaz növekedési faktor doméneket, amelyek a proteoglikánok mátrix metalloproteinázok általi emésztése során válnak aktívvá. Arra, hogy hogyan képesek más növekedési faktorok axonnövekedésre kifejtett hatását módosítani csupán néhány kísérletes adattal rendelkezünk (Joris De Wit és Joost Verhaagen 2007). A kísérleteink adatai szerint a 13. napig a gerincvelő hátsó szarvában ventricularis zóna kivételével kondroitin-szulfát proteoglikán expressziót nem tudtunk kimutatni. A hátsó szarv viszonylagos CSPG hiánya a kondroitin-szulfátok differenciációban betöltött serkentő szerepét feltételezi, hiszen az érési folyamat során fokozódó termelődését tudtuk kimutatni a hátsó szarvban. Számos kísérleti adat szól arról, hogy a szinaptogenezis plasztikus fázisának (kritikus periódus) végét jelentheti a központi idegrendszerben a CSPG-k megjelenése (Pizzorusso és mtsai., 2002). Ahhoz, hogy ezt igazoljuk a gerincvelőben is, további vizsgálatok szükségesek. A CSPG-k organizációját az ECM-ben a hialuronsav végzi. A kondroitin-szulfátok axonok növekedésére gyakorolt hatásához hasonló tulajdonságokat írtak le a hialuronsav esetében is. Feltételezzük, hogy a gerincvelő fejlődésében a hialuronsavnak ellentétes szerepe lehet vagy más folyamatokban vehet részt, mint a kondroitin-szulfátoknak a gerincvelő hátsó szarvának kialakulása során, mivel a hátsó szarv megjelenésének kezdetén eltérő reakciót (pozitív) mutatott. A hialuronsav szintézisét adataink szerint a HAS2 végezheti, amely a nagy 22   

molekullatömegű szzénhidrátformát szinteetizálja. A gerincvelőbe g en mutatottt immunopo ozitív jel réteges elrendeződése felveti a primer aff fferens rosto ok szerepét a hialuronssav termelőd désében. ükségesek, amelyek m magukban foglalják f Spekuláációnk igazzolásához toovábbi vizssgálatok szü többek között azz antitestünnk specifikkus kötődéésének méélyebb elleenőrzését követően k különbööző neuronáális markereekkel (idegssejt és axon)) történő kettős jelöléseeket.

23   

8. Irodalomjegyzék 1. Adamia, S.; Maxwell, C. A. & Pilarski, L. M. (2005), Hyaluronan and hyaluronan synthases: potential therapeutic targets in cancer.,Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord5(1), 3-14. 6. Afify, A.M., Stern, M., Guntenhoener, M., Stern, R., (1993),Purification and characterization of human serum hyaluronidase.Arch Biochem Biophys305, 434–441. 7. Alaynick, W. A.; Jessell, T. M. & Pfaff, S. L. (2011), SnapShot: spinal cord development.,Cell146(1), 178-178.e1. 8. Bester, H.; Chapman, V.; Besson, J. M. & Bernard, J. F. (2000), Physiological properties of the lamina I spinoparabrachial neurons in the rat.,J Neurophysiol83(4), 2239-2259. 9. C.S Goodman, A.L Kolodkin, Y. L. A. P. J. R. (1999), Unified Nomenclature for the Semaphorins/Collapsins, Cell97, 551–552. 10.

Christensen, B. N. & Perl, E. R. (1970), Spinal neurons specifically excited by noxious

or thermal stimuli: marginal zone of the dorsal horn.,J Neurophysiol33(2), 293-307. 11. Craig, A. D. & Kniffki, K. D. (1985), Spinothalamic lumbosacral lamina I cells responsive to skin and muscle stimulation in the cat.,J Physiol365, 197-221. 12. Cramer, J.A., B. L. B. C. M. R. (1994), Kinetic andmechanistic studies with bovine testicular hyaluronidase.,Bioenergetics1200, 315-321. 13. Csóka, A. B.; Frost, G. I.; Heng, H. H.; Scherer, S. W.; Mohapatra, G.; Stern, R. & Csóka, T. B. (1998), The hyaluronidase gene HYAL1 maps to chromosome 3p21.2-p21.3 in human and 9F1-F2 in mouse, a conserved candidate tumor suppressor locus.,Genomics48(1), 63-70. 14. Csoka, A. B.; Frost, G. I. & Stern, R. (2001), The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes.,Matrix Biol20(8), 499-508. 15. Csóka, A. B.; Scherer, S. W. & Stern, R. (1999), Expression analysis of six paralogous human hyaluronidase genes clustered on chromosomes 3p21 and 7q31.,Genomics60(3), 356-361. 16. de Wit, J. & Verhaagen, J. (2007), Proteoglycans as modulators of axon guidance cue function.,Adv Exp Med Biol600, 73-89. 17. Fraser, J.R.E., A. L. L. T. (1983), Tissue uptake of circulatinghyaluronic acid. A whole body autoradiographic study, Cell TissueR233, 285–293.. 18. Girish, K. S. & Kemparaju, K. (2007), The magic glue hyaluronan and its eraser hyaluronidase: a biological overview.,Life Sci80(21), 1921-1943. 19. Helms, A. W. & Johnson, J. E. (2003), Specification of dorsal spinal cord interneurons.,Curr Opin Neurobiol13(1), 42-49. 24   

20. Kemparaju, K. & Girish, K. S. (2006), Snake venom hyaluronidase: a therapeutic target.,Cell Biochem Funct24(1), 7-12. 21. Kreil, G. (1995), Hyaluronidases—a group of neglected enzymes.,ProtSci4, 1666–1669. 22. Laurent, T.C., L. U. F. J. (1996), Serum hyaluronan as a diseasemarker.,Ann Med23, 241-253. 23. Laurent, T. C. & Fraser, J. R. (1992), Hyaluronan.,FASEB J6(7), 2397-2404. 24. Leber, S. M. & Sanes, J. R. (1995), Migratory paths of neurons and glia in the embryonic chick spinal cord.,J Neurosci15(2), 1236-1248. 25. Lee, J. Y. & Spicer, A. P. (2000), Hyaluronan: a multifunctional, megaDalton, stealth molecule.,Curr Opin Cell Biol12(5), 581-586. 26. Lewis, K. E. (2006), How do genes regulate simple behaviours? Understanding how different neurons in the vertebrate spinal cord are genetically specified.,Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci361(1465), 45-66. 27. Menétrey, D.; Giesler, Jr, G. & Besson, J. M. (1977), An analysis of response properties of spinal cord dorsal horn neurones to nonnoxious and noxious stimuli in the spinal rat.,Exp Brain Res27(1), 15-33. 28. Meyer, K. (1971), Hyaluronidases.,The Enzymes.Academic press, NY, 307–320. 29. Miller, K.A., Shao, M., Martin-Deleon, P.A.,( 2007), Hyalp1 in murine sperm function: evidence for unique and overlapping functions with other reproductive hyaluronidases.J Andrology28, 67–76. 30. Pál, R.Pál, R., ed. (2006), Szövettan, Semmelweis Kiadó. 31. Pizzorusso, T.; Medini, P.; Berardi, N.; Chierzi, S.; Fawcett, J. W. & Maffei, L. (2002), Reactivation of ocular dominance plasticity in the adult visual cortex.,Science298(5596), 1248-1251. 32. Polgár, E.; Puskár, Z.; Watt, C.; Matesz, C. & Todd, A. J. (2002), Selective innervation of lamina I projection neurones that possess the neurokinin 1 receptor by serotonin-containing axons in the rat spinal cord.,Neurosci109(4), 799-809. 33. Reitinger, S., Laschober, G.T., Fehrer, C., Greiderer, B., Lepperdinger, G., (2007). Mouse testicular hyaluronidase-like proteins, SPAM1 and Hyall5 but not Hyalp1 degrade hyaluronan.J Biochem401, 79–85. 34. REXED, B. (1952), The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat.,J Comp Neurol96(3), 414-495. 35. Sadler, T. W. (1999), Langman Orvosi embriológia, Medicina Könyvkiadó. 36. Spicer, A. P. &Tien, J. Y. L. (2004), Hyaluronan and morphogenesis.,Birth Defects Res C Embryo Today72(1), 89-108. 25   

37. Stern, R. (2004),Hyaluronan catabolism: a new metabolic pathway.,EJCB83, 317–325. 38. Tammi, M. I.; Day, A. J. & Turley, E. A. (2002), Hyaluronan and homeostasis: a balancing act.,J Biol Chem277(7), 4581-4584. 39. Taylor, K.R., G. R. (2006), Glycosaminoglycans and their proteoglycans:host-associated molecular patterns for initiation and modulation ofinflammation., J FASEB20, 9-22. 40. Todd, A. J. & Sullivan, A. C. (1990), Light microscope study of the coexistence of GABAlike and glycine-like immunoreactivities in the spinal cord of the rat.,J Comp Neurol296(3), 496-505. 41. Toole, B. P. (2004), Hyaluronan: from extracellular glue to pericellular cue.,Nat Rev Cancer4(7), 528-539. 42. Toole, B. P.; Wight, T. N. & Tammi, M. I. (2002), Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.,J Biol Chem277(7), 4593-4596. 43. Turley, E. A.; Noble, P. W. & Bourguignon, L. Y. W. (2002), Signaling properties of hyaluronan receptors.,J Biol Chem277(7), 4589-4592. 44. Vercruysse, K. P.; Ziebell, M. R. & Prestwich, G. D. (1999), Control of enzymatic degradation of hyaluronan by divalent cations.,Carbohydr Res318(1-4), 26-37. 45. Willis, W. D. (1985), Nociceptive Pathways: Anatomy and Physiology of Nociceptive Ascending Pathways, Philos Trans R Soc London [Biol]308(1136), pp. 253-268. 46. Internetes forrás - http://themedicalbiochemistrypage.org

26