ČESKÁ ZEMĚDĚLSKÁ UNIVERZITA V PRAZE FAKULTA ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ
Výskyt a potenciální dopady chytridiomykózy v České republice Disertační práce
Autor: Ing. Petr Civiš Školitel: prof. Mgr. Miroslav Šálek, Dr.
Praha 2013
Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracoval samostatně. Veškeré zdroje, prameny a literatura, které jsem v práci použil, jsou řádně citovány s uvedením úplného odkazu na příslušný zdroj. V Kutné Hoře dne 20.10.2013
........................................................
Za významnou pomoc při tvorbě a vedení práce upřímně děkuji Ing. Jiřímu Vojarovi, Ph.D. a Mgr. Vojtechovi Balážovi, Ph.D. Výzkum byl podpořen Ministerstvem životního prostředí ČR v rámci národního programu Ochrana biodiverzity ‒ projekty č. 120937 a 200923, Technologickou agenturou ČR ‒ projektem č. TA01020881, z části projektem OPAL (Obojživelníci, plazi a lidé), realizovaným za finanční podpory Státního fondu životního prostředí ČR a Ministerstva životního prostředí ČR, dále grantem Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR ‒ projektem č. MSM6215712402, Interní grantovou agenturou FŽP ČZU v Praze ‒ projekty č. 200942110049, 201042110042, 421101312/423134, 42900/1312/3114, 42110-1312-3116 a 42110/1313/3111 a Magistrátem hl. m. Prahy ‒ projektem č. OOP/A579/2007. Manipulace se zvláště chráněnými druhy obojživelníků (stěry z pokožky) byla prováděna na základě udělené výjimky podle §56 zákona č. 114/1992 Sb., o ochraně přírody a krajiny, v platném znění.
Abstrakt: Závažným onemocněním chytridiomykózou bylo celosvětově postiženo více než 350 druhů obojživelníků, přičemž téměř desetina z nich kvůli této nemoci vyhynula. Houba Batrachochytrium dendrobatidis způsobující tuto nemoc je v současnosti rozšířena na všech kontinentech kromě Antarktidy. Komplexní monitoring provedený kolektivem autora disertační práce objevil tuto nemoc na území České republiky u ropuchy obecné (Bufo bufo), ropuchy zelené (Bufo viridis), čolka horského (Ichthyosaura alpestris), skokanů zelených (Pelophylax spp.), kuňky obecné (Bombina bombina) a kuňky žlutobřiché (Bombina variegata). Předkládaný soubor prací shrnuje doposud známé informace o působení tohoto patogenu na území České republiky, srovnává jeho vliv na populace obojživelníků v evropském kontextu a prostřednictvím distribučního modelování předpovídá potenciální rozšíření nemoci na našem území.
Klíčová slova: Batrachochytrium
dendrobatidis,
houbové
onemocnění,
chytridiomykóza,
PCR,
obojživelníci, vymírání obojživelníků, kuňka obecná, Bombina bombina, distribuční modelování druhů, MaxEnt
Abstract: Chytridiomycosis is an emerging infectious disease that has been so far found in more than 350 amphibian species. One tenth of these species has died off because of this disease. By now, the pathogen — chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis can be found on all continents except Antarctica. Complex monitoring performed by the author's team found this disease in the following czech amphibians: Bufo bufo, Bufo viridis, Ichthyosaura alpestris, Pelophylax spp., Bombina bombina and Bombina variegata. Presented set of papers summarises all up to date information about the pathogen's incidence in the Czech Republic, compares its impact on amphibian populations in the European context and throughout incorporating distribution modelling techniques predicts the disease's potential distribution in our country.
Key words: Batrachochytrium dendrobatidis, chytrid fungus, chytridiomycosis, PCR, amphibians, amphibian declines, Fire–bellied Toad, Bombina bombina, species distribution modeling, MaxEnt
Obsah: OBSAH: ................................................................................................................................................................. 7 1. ÚVOD................................................................................................................................................................. 8 1.1 Chytridiomykóza ....................................................................................................................................... 8 1.2 Distribuční modelování........................................................................................................................... 10 2. CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE ........................................................................................................................ 13 3. METODIKA .................................................................................................................................................... 14 3.1 Výběr druhů............................................................................................................................................. 14 3.2 Vzorkování............................................................................................................................................... 14 3.3 Analýza vzorků........................................................................................................................................ 15 3.4 Zpracování dat......................................................................................................................................... 15 4. VÝSLEDKY..................................................................................................................................................... 17 5. ZÁVĚR............................................................................................................................................................. 19 6. POUŽITÁ LITERATURA ............................................................................................................................. 20 7. SEZNAM PŘÍLOH ......................................................................................................................................... 23
7
1. Úvod 1.1 Chytridiomykóza V 90. letech minulého století bylo objeveno v Austrálii a Střední Americe dosud neznámé onemocnění
obojživelníků,
vyvolané
chytridiomycetní
houbou
Batrachochytrium
dendrobatidis (dále jen Bd), (Berger et al. 1998, Longcore et al. 1999, Obr. č. 1). Nemoc byla nazvána chytridiomykózou a od té doby byla Bd identifikována u více než 350 druhů obojživelníků a podílela se na vyhynutí řady populací, ale i celých druhů (Briggs et al. 2005, Fischer et al. 2009). Jde doposud o jediný známý druh chytridiomycetní houby, který je patogenní i pro obratlovce (Williams et al. 2002).
Obr. č. 1: Obrázek zoosporangia Bd pořízený
rastrovacím
mikroskopem.
Na
elektronovým
obrázku
jsou
dobře
viditelné výpustní trubice (discharge tubes) a příchytné
rhizoidy
kotvící
sporangia
k
povrchu. Úsečka má délku 10 μm (Berger 2001).
V Evropě byla Bd zjištěna u třetiny (29) volně žijících obojživelníků na území 18 států (Česká republika, Dánsko, Estonsko, Francie, Chorvatsko, Itálie, Lotyšsko, Lucembursko, Maďarsko, Německo,
Nizozemsko,
Portugalsko,
Rakousko,
Slovensko,
Slovinsko,
Španělsko,
Švýcarsko, Velká Británie), (Garner et al. 2005, Wood et al. 2009, Civiš et al. 2012, http://www.bd-maps.net; Příloha č. 6). V Africe decimovala populace nejméně tří druhů, v Austrálii a Novém Zélandě 52 druhů a v Americe 39 druhů (Garner et al. 2005, Wood et al. 2009). Zdokumentované extinkce vlivem chytridiomykózy zahrnují nejméně 35 druhů, konkrétně tlamorodek zázračných (Rheobatrachus silus), tlamorodek větších (Rheobatrachus vitellinus), paropuch ostronosých (Taudactylus acutirostris), paropuch skokanovitých (Taudactylus diurnus) (Berger et al. 1998), ropuch zlatých (Bufo periglenes) (Pounds et al. 2006) a 30 druhů rodu Atelopus (La Marca et al. 2005).
8
V České republice (ČR) se její přítomnost začala zjišťovat teprve v roce 2008 a byla potvrzena u ropuchy obecné (Bufo bufo) a zelených skokanů (Pelophylax spp.) v Praze a okolí (Příloha č. 16). V roce 2010 byla objevena nákaza rovněž u kuňky obecné (Bombina bombina) z oblasti mosteckých výsypek (Příloha č. 15). Navazující cílený monitoring nemoci provedený kolektivem autora této práce (31 unikátních lokalit) prokázal přítomnost tohoto patogenu u 9 z 15 testovaných druhů obojživelníků zejména u rodu Bombina a Pelophylax spp., kteří patrně fungují jako přenašeči Bd do nových oblastí (Baláž et al. 2013c; Příloha č. 4). Vzhledem k nedávnému objevení se o působení nemoci ví doposud velmi málo. Rozsah letálního působení na obojživelníky zpravidla souvisí se změnami prostředí (Mendelson et al. 2005) a funkcí kožních peptidů (Rollins–Smith et al. 2003). Následkem poruchy osmoregulačních funkcí kůže dochází zpravidla po několika dnech od nakažení k poruchám vedení vzruchů a nakonec k srdeční zástavě (Voyles et al. 2009). V současnosti se výzkum zabývá zkoumáním genetické diverzity linií Bd (Morehouse et al. 2003) a zkoumáním celého genotypu (Fischer et al. 2009). Řada publikací se věnuje objevení nemoci v nových regionech (Civiš et al. 2012, 2013b; Příloha č. 5, 6), u volně žijících i uměle chovaných obojživelníků (Fríaz–Alvarez et al. 2008), včetně retrospektivních analýz. Rovněž dochází k hodnocení dopadů chytridiomykózy na obojživelníky z hlediska synergického působení faktorů podnebí, počasí, kožních peptidů, pesticidů, virulence jednotlivých kultur Bd atd. (Kilpatrick 2010). Za zmínku stojí i objevení nového, dosud nedetekovatelného druhu chytridiomycét, který je blízce příbuzný Bd. Tento druh pojmenovaný Batrachochytrium salamandrivorans způsobuje chorobné rohovatění kůže mloků skvrnitých (Salamandra salamandra) a vyznačuje se vysokou mortalitou infikovaných jedinců (Martel et al. 2013). Z hlediska ochranářské činnosti bývají obecně hlavní zdroje zaměřovány na výzkum, kontrolu a řízení chytridiomykózy. V Austrálii, kde mají s nákazou dlouholeté zkušenosti, byl vytvořen plán na zmírnění ohrožení tímto patogenem (Threat Abatement Plan, Skerratt et al. 2007). Doporučení tohoto plánu zahrnuje otázky karantény, projekty obnovy populací ohrožených druhů a budoucí výzkum. Preventivní přístup zabraňující možným negativním dopadům nemoci byl využit i v ČR (Příloha č. 14).
9
Přes veškerý vliv globalizace se zdá, že stále existují místa (Asie, Madagaskar,...), kde chytridiomykóza buď zcela chybí, nebyla dosud zjišťována nebo se na obojživelnících vyskytuje v prevalencích nedetekovatelných současnými metodami (Civiš et al. 2013b; Příloha č. 5). Výskyt, promořenost i působení nemoci u nás a v celé střední Evropě byly doposud zkoumány pouze nahodile a na několika lokalitách (Civiš et al. 2012, Baláž et al. 2013c; Přílohy č. 4, 6), ve východní Evropě zpravidla vůbec. Absence systematického výzkumu znemožňuje stanovit potenciální rizika a návrhy efektivních ochranářských opatření.
1.2 Distribuční modelování Emergující (nově se objevující) nemoci v současnosti představují významné ekologické i ekonomické ohrožení organismů sladkých vod (Thrush et al. 2011). Moderní doba s sebou přinesla dostupnost detailních environmentálních dat, spolu s levnými a výkonnými počítači. Obojí vedlo k rychlému vývoji a nárůstu využití predikčního modelování environmentálních požadavků druhů a jejich geografické distribuce. Pro některé druhy jsou k dispozici podrobná data o jejich prezenci/absenci na konkrétních lokalitách, což umožňuje využití různých druhů standartních statistických metod (Phillips et al. 2006). Nicméně údaje o absenci pro většinu druhů často chybí. V této práci byla využita jedna z modelovacích technik ‒ prostorová a časová analýza, konkrétně metoda MaxEnt (Příloha č. 8). MaxEnt existuje i v podobě počítačového algoritmu, který umožňuje uživatelům provádět výpočty "Maximální entropie geografické distribuce druhů" ("Maximum entropy modelling of species geographic distributions"). Tento program byl napsán následujícími autory: Steven Phillips, Miro Dudík a Rob Schapire, s podporou AT&T Labs-Research, Princeton University a Centra pro Biodiverzitu a Ochranu přírody, Amerického přírodovědného muzea.
10
Obr. č. 2: Grafická ukázka modelování "vhodnosti" (pravděpodobnost výskytu) v programu MaxEnt (Beck & Sieber 2010).
Klíčová úloha tohoto programu umožňujícího modelování maximální entropie spočívá v tom, že počítá predikce geografické distribuce druhů (Obr. č. 2) jen za použití záznamů o přítomnosti. Nepoužívá tudíž data o absenci druhu. Tento software používá metody optimalizace tak, aby našel nejlepší model, který předpovídá pravděpodobnostní distribuci druhu napříč geografickým prostorem jako funkci environmentálních proměnných spojených s tímto prostorem. Pravděpodobnostní distribuce, která je vypočtena jako "nejlepší" je ta, která je v souladu s tím, co je pozorováno (data o prezenci a environmentální podmínky spojené s těmito daty) ale také ta, která vytváří nejméně nepřirozené prognózy o zbytku distribuce – ta by měla být co nejjednotnější. Program předpokládá, že pravděpodobnostní distribuce je Gibbsova distribuce, což je suma všech vážených exponenciálních funkcí environmentálních dat, normalizovaná tak, že celková pravděpodobnostní distribuce napříč geografickým prostorem se v součtu rovná jedné (tj. přítomnost druhu je v modelovaném prostředí předpokládána). Pro tyto funkce environmentálních dat se užívá termínu "features" ("vlastnosti") a mohou nabývat několika různých forem. Nejlepší pravděpodobnostní distribuce je ta, která kombinuje rovnováhu mezi 1) přidělováním nejvyšších pravděpodobností k lokalitám prezence v kontrastu s pozadím s 11
náhodnými lokalitami s žádnými záznamy o přítomnosti druhu a 2) zajištěním dostatečného srovnání mezi manipulovanými environmentálními daty ("features") a aktuálními environmentálními daty spojenými s lokalitami přítomnosti druhu (Phillips et al. 2004, Phillips et al. 2006 , Phillips & Dudík 2008, Phillips et al. 2009). Aplikace modelovacích přístupů rozšiřuje možnosti výzkumu od šetření šíření emergujících nemocí po vylepšené včasné detekce prostřednictvím aplikace rizikových přístupů při sledování nemoci. Antropogeničtí původci emergence nemoci se budou pravděpodobně vyskytovat i nadále a jejich vliv poroste. Z tohoto důvodu by měly být průzkumy nově se objevujících nemocí navrhovány způsobem, který produkuje data nezbytná ke spuštění modelů jejich šíření a dopadu tak, aby mohla být identifikována a testována patřičná opatření zabraňující jejich dalšímu šíření. Část této práce využívá nového způsobu tvorby environmentálních dat k modelování distribuce Bd v podmínkách ČR (Civiš et al. 2013a; Přílohy č. 1, 11).
12
2. Cíle disertační práce
systematický monitoring Bd v ČR,
definice reálného a potenciálního výskytu Bd v ČR,
porovnání citlivosti českých druhů vůči Bd a identifikace druhů s nejvyšší prevalencí nemoci, srovnání ČR s Evropou,
identifikace vektorových druhů, které mohou nemoc šířit do nových oblastí.
Základním cílem disertační práce byl první systematický monitoring chytridiomykózy v ČR včetně porovnání citlivosti druhů a definice reálného i potenciálního výskytu nemoci u nás. Navazujícím cílem bylo identifikování oblastí s významnějším výskytem nemoci.
13
3. Metodika Pro splnění hlavních cílů bylo nejprve nutné provést vzorkování pomocí stěrů pokožky pro následnou qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) detekci na různých druzích a současně tak, aby vzorkované populace rovnoměrně pokryly jejich areál výskytu v ČR.
3.1 Výběr druhů Prioritními druhy byly Bombina bombina a kuňka žlutobřichá (Bombina variegata), druhy s pravděpodobně nejvyšším zastoupením Bd v populacích u nás (Civiš et al. 2010; Příloha č. 7). V rámci ČR byly přednostně vzorkovány lokality monitorované AOPK ČR a lokality v blízkosti těch s již prokázaným výskytem Bd. Zde proběhlo vzorkování, a to jak na kuňkách, tak na všech syntopických druzích, s přihlédnutím k získaným výjimkám ze zákazů u zvláště chráněných druhů (§ 56 odst. 1 zákona č. 114/1992 Sb., o ochraně přírody a krajiny). Kvůli zvýšení efektivnosti finančně náročných genetických analýz byly tyto vzorky analyzovány jako směsné (cca po pěti kusech). V dalších letech byly vzorkovány pouze ty lokality, kde byla prokázána přítomnost patogenu s tím, že analyzovány byly již jednotlivé vzorky (možnost identifikovat nakažené zvíře). Současně s terénním průzkumem byl provozován systém hlášení podezřelých jedinců přes webový formulář na adrese chytrid.herp.cz/formular.html, umožňující komukoliv zanést data o potenciálně nakažených obojživelnících na území ČR. Po celou dobu řešení projektu byla část finančních prostředků vyhrazena pro odběry vzorků z lokalit, kde došlo k nevysvětlitelným úmrtím obojživelníků a u všech veřejností nahlášených a odůvodněných podezření na nemoc.
3.2 Vzorkování Odběr kožního materiálu živých obojživelníků byl prováděn na základě stěrů pokožky standardizovanými výtěrkami (dryswab mw100 finetip) a podle uznávané metodiky (http://amphibiaweb.org/chytrid/swab_instruction07.pdf,
verze
z
6.6.2007).
Všichni
vzorkovaní jedinci byli měřeni, váženi a detailně fotografováni (pro možnou zpětnou detekci změn na pokožce pozitivních). Způsob odběru vzorků představoval zcela neinvazivní metodu nepoškozující jedince. Celková doba manipulace s jedním živočichem se pohybovala v řádu desítek sekund. Ovzorkovaný jedinec byl neprodleně navrácen na stejné místo, kde byl odchycen. Byl kladen důraz na dodržování veškerých preventivních hygienických opatření 14
(např. Civiš et al. 2010; Příloha č. 7) a s jedinci bylo manipulováno pouze na základě udělených výjimek od příslušných orgánů státní správy. V případě nálezu mrtvých jedinců došlo k odstřihnutí dvou posledních článků prstů a tyto pak byly umístěny do zkumavky s 95 % lihem.
3.3 Analýza vzorků U vzorků (stěrů z pokožky obojživelníků) byla provedena qPCR analýza na přítomnost Bd, již zajištěná na Veterinární a farmaceutické univerzitě v Brně (kontaktní osoba Mgr. Vojtech Baláž), se kterou v tomto ohledu řešitelé projektu spolupracují. Jde o jediné pracoviště v ČR, které tyto analýzy provádí (dříve jsme v tomto směru spolupracovali se Zoologickým institutem v Londýně, jmenovitě s T. W. J. Garnerem). Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, společně s kolektivem řešitele disertační práce, jsou jedinými pracovišti, která se touto problematikou v ČR zabývají.
3.4 Zpracování dat Po obdržení výsledků genetických analýz stěrů byly identifikovány lokality s pozitivními nálezy chytridiomykózy a byla provedena zpětná kontrola fotodokumentace pro identifikaci možných vizuálních projevů nemoci u nakažených jedinců. Intenzita nákazy byla porovnána v rámci druhů i mezi pohlavími a věkovými stádii – juvenil – subadult – adult. Výše uvedený rozsah vzorkování umožnil modelovat prostorové rozšíření výskytů chytridiomykózy v ČR. Po zanesení veškerých souřadnic pozitivních lokalit do aplikace ArcGIS a přípravě vhodných podkladových dat byly zkoumány vztahy pozitivních nálezů s faktory prostředí pomocí aplikace MaxEnt (Příloha č. 8). K tomu účelu byl vytvořen datový soubor s vrstvami představujícími environmentální proměnné specifické pro ČR (dostupný na http://chytrid.herp.cz/czechclim.rar).
Metodický
postup
tvorby
podkladových
environmentálních vrstev představuje Supporting online material k článku Přílohy č. 1. Předpokládaný model rozšíření Bd na území ČR z hlediska klimatu, nadmořské výšky a dalších abiotických faktorů je též součástí tohoto článku. Tento model může být v budoucnu na základě dalších pozitivních nálezů zpřesňován a ověřován přímo v terénu. Se zvyšující se přesností by mohl posloužit jako účinná ochranářská pomůcka při snaze zabránit dalšímu
15
šíření nemoci a k vytipování "Bd hotspotů" (místa, odkud se nemoc šíří dále do krajiny – rezervoáry Bd) a "Bd refugií" (místa bez Bd – útočiště zdravých jedinců).
16
4. Výsledky Na základě výsledků počátečních detekcí a pozorování z okolních států byly stanoveny prioritní druhy, na které se monitoring zaměřil. Toto zacílení tak umožnilo nejefektivněji zmapovat distribuci Bd v ČR. Zvoleny byly Bombina bombina, Bombina variegata a Pelophylax spp., druhy s pravděpodobně nejvyšším zastoupením Bd v populacích u nás (Přílohy č. 12, 13). Zpětná analýza evropského datového souboru později potvrdila vysokou citlivost vůči Bd u rodů Bombinatoriade a Alytidae (Baláž et al. 2013c; Příloha č. 4). V rámci ČR byly přednostně vzorkovány lokality monitorované AOPK ČR a lokality v blízkosti těch s již prokázaným výskytem Bd.
Přeshraniční spoluprací byly současně
získávány vzorky z okolních států i mimo Evropu, sloužící zejména k porovnání zahraničních a domácích výsledků (Civiš et al. 2013b; Příloha č. 5). Rozšíření Bd se zdá být značné, avšak údaje o její přesné geografické distribuci a hostitelských druzích v podmínkách střední a východní Evropy zůstává stále málo probádané a jde zpravidla o dílčí studie obsahující značné geografické a taxonomické mezery (Czeczuga et al. 2011; Sztatecsny & Glaser 2011; Civiš et al. 2012; Sura et al. 2012; Příloha č. 6). Souborné hodnocení působení nemoci na infikované populace v ČR v porovnání s celou Evropou bylo publikováno a je uvedeno v Příloze č. 4. K doplnění celkového obrazu rozšíření chytridiomykózy je třeba ještě mnoha mapovacích průzkumů na řadě dosud netestovaných druhů. Přesto výzkum kolektivu autora za pomoci stěrů z pokožky a standardních protokolů pro detekci Bd pomocí qPCR (Boyle et al. 2004) nemoc identifikoval u 41 z 466 (9 %) vzorkovaných obojživelníků (Baláž et al. 2013b; Příloha č. 2). Lze shrnout, že dodnes byla chytridiomykóza zaznamenána u 29 evropských druhů obojživelníků. U nás a na území okolních států byla infekce Bd zaznamenána již u 13 z celkového počtu 21 našich druhů obojživelníků. Přímo z našeho území jsou známy pozitivní nálezy u Bufo bufo, ropuchy krátkonohé (Bufo calamita), ropuchy zelené (Bufo viridis), čolka horského (Ichthyosaura alpestris), Pelophylax spp., Bombina bombina a Bombina variegata. Tři posledně jmenované druhy se zřejmě řadí mezi plošně nejnakaženější v rámci střední Evropy. Výsledky českých analýz poukázaly na stálou střední míru infekce u rodu Bombina a nadprůměrné hodnoty prevalence u Pelophylax spp. (Baláž et al. 2013b, Příloha č. 2). V rámci evropského vzorkování vodních skokanů byly výsledky mezi lokalitami vysoce variabilní a tento rod tak může být využit ke studiu faktorů určujících prevalenci a dopad nemoci. Dosud získané údaje naznačují, že jeho populace nejsou přímo ohrožené 17
chytridiomykózou, avšak absence klinických příznaků předurčuje tento druh jako přenašeče nemoci do nových míst (Baláž et al. 2013c; Příloha č. 4). Prevalence nemoci u domácích druhů je podobná ostatním státům střední Evropy, přičemž nebyly zaznamenány žádné události snižování početnosti či vymírání populací v důsledku chytridiomykózy (Civiš et al. 2010, 2012; Přílohy č. 6, 7, 10, 13), což je v souladu se studiemi okolních států (Ohst et al. 2011; Sztatecsny & Glaser 2011). Během pěti let vzorkování byly identifikovány řádově pouze jednotky kusů úhynů u Bufo viridis a Bombina variegata, nesoucích velké množství zoospor Bd. Oba druhy však vykazovaly schopnost se z infekce vyléčit (Baláž et al. 2013a, 2013b; Přílohy č. 2, 3). Na základě nasbíraných dat byly v rámci ČR definovány oblasti s významnějším výskytem nemoci. Propojením vrstev environmentálních proměnných s vrstvou s výskyty Bd pomocí aplikace ArcGIS a MaxEnt byl sestaven model potenciální distribuce chytridiomykózy u nás. Výsledný model zobrazuje pravděpodobný výskyt nemoci na území ČR a může být použit pro zacílení managementových opatření zabraňujících šíření nemoci do dalších oblastí. Pravděpodobnější výskyt Bd model předpovídá zejména v nížinách (200‒400 m n. m.). Nejdůležitější vysvětlující proměnné představovaly srážky nejteplejšího čtvrtletí (21,7 %), sezónnost srážek (16,1 %), průměrná teplota nejteplejšího čtvrtletí (13,2 %) a faktor vlivu člověka (12,8 %). Prahování modelu vedlo ke značnému rozdrobení předpovídané prezence, což přímo souvisí i s rozlišením podkladových map environmentálních proměnných. Nově vzniklé podkladové mapy s vysokým rozlišením rovněž nabízejí širší možnosti modelování na různých organismech (Civiš et al. 2013a; Přílohy č. 1, 9). Veškeré výsledky výzkumu prováděného v rámci doktorského studia byly průběžně publikovány na vědeckých konferencích, v popularizačních recenzovaných časopisech, odborných recenzovaných časopisech a časopisech s impakt faktorem. Významnější výstupy výzkumu byly řešeny formou mezinárodní spolupráce studentů a odborníků na problematiku chytridiomykózy. Kompletní seznam publikovaných výstupů je uveden v kapitole 7.
18
5. Závěr Snahou této práce bylo zejména získání nových poznatků o působení a rozšíření chytridiomykózy na území ČR. Po genetickém rozboru vzorků bylo možné rozšíření nemoci hodnotit na úrovni druhové i geografické. Přítomnost Bd lze očekávat u všech domácích druhů, přičemž její vyšší kumulaci nalézáme u rodů Bombina a Pelophylax spp., které je možné potenciálně považovat za vektory rozšiřující nemoc do nových oblastí. Přes veškeré hrozby, kterými Bd disponuje, nenacházíme na nakažených jedincích vizuální příznaky nemoci. Množství zoospor u nakažených jedinců odpovídající evropskému průměru. Nízká mortalita vlivem nemoci, ale i její samotná přítomnost u odolnějších druhů, jen podtrhává nepatrný vliv nemoci na populace našich obojživelníků v porovnání s působením ostatních negativních vlivů, avšak nevylučuje jejich synergické působení. Z prostorového hlediska lze očekávat lokální rozšíření nemoci po celém území ČR, přičemž v menších nadmořských výškách – v oblastech hustě obydlených a člověkem značně přeměněných není vyloučena její vyšší kumulace. Od roku 2008 se náš tým zaměřuje na informovanost odborné i laické veřejnosti o přítomnosti nemoci, jejím možném působení, prevenci šíření, kontrole trhu s terarijními zvířaty, dezinfekci aj. Veřejnost se překvapivě k tomuto problému nestaví netečně a nadále dochází k realizaci řady projektů, které pomáhají populacím obojživelníků ohrožených nejen chytridiomykózou. Naděje na udržení životaschopných populací a jejich zachování pro budoucí generace tak stále existuje.
19
6. Použitá literatura Baláž V., Kubečková M., Civiš P., Rozínek R., Vojar J. 2013a: Fatal chytridiomycosis and infection loss observed on wildinfected toads in captivity. Acta Veterinaria Brno, manuskript přijat k publikování 5. 3. 2013. Baláž V., Vojar J., Civiš P., Šandera M., Rozínek R. 2013b: Assessing the risk of chytridiomycosis to amphibians using surveillance data from Czech Republic: recognising the culprits from victims. Diseases of Aquatic Organisms, submitováno 11.8.2013. Baláž V., Vörös J., Civiš P., Vojar J., Hettyey A., Sós E., Dankovics R., Jehle R., Christiansen D. G., Clare F., Fisher M., Garner T. W. J., Bielby J. 2013c: Assessing risk and guidance on monitoring of Batrachochytrium dendrobatidis in Europe through identification of taxonomic selectivity of infection. Conservation Biology, manuskript přijat k publikování 4.4.2013. Beck J. & Sieber A. 2010: Is the spatial distribution of mankind's most basic economic traits determined by climate and soil alone? PLoS ONE, 5: e10416. Berger L. 2001: Diseases in Australia frogs. PhD Thesis. James Cook University. Berger L., Speare R., Daszak P., Green D. E., Cunningham A. A., Goggin C. L., Slocombe R., Ragan M. A., Hyatt A. D., McDonald K. R., Hines H. B., Lips K. R., Marantelli G., Parkes H. 1998: Chytridiomycosis causes amphibian mortality associated with population declines in the rain forests of Australia and Central America. Proceedings of the National Academy of Science, USA, 95: 9031–9036. Boyle D. G., Olsen V., Morgan J. A., Hyatt A. D. 2004: Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms, 60: 141–148. Briggs C. J., Vredenburg V. T., Knapp R. A. & Rachowicz L. J. 2005: Investigating the population–level effects of chytridiomycosis: an emerging infectious disease of amphibians. Ecology, 86(12): 3149–3159. Civiš P., Vojar J., Baláž V. 2010: Chytridiomykóza, hrozba pro naše obojživelníky? Ochrana přírody, 65(4): 18–20. Civiš P., Vojar J., Baláž V. 2012: Current state of Bd occurrence in the Czech Republic. Herpetological Review, 43: 150–159. Civiš P., Vojar J., Baláž V. 2013a: Utilizing custom data for large–scale species distribution modeling: demonstrated on Batrachochytrium dendrobatidis in the Czech Republic. Journal for Nature Conservation, submitováno 27.10.2013. Civiš P., Vojar J., Baláž V., Kohutka A., Ulbrichová I., Dvořák V. 2013b: Sampling for Batrachochytrium dendrobatidis in Russia. Herpetological Journal, 23: 55–58. Czeczuga B., Semeniuk A., Czeczuga-Semeniuk E. 2011: Chytridiomycosis in three species of Rana genus from northeastern Poland. Current Trends in Microbiology, 7: 15–20.
20
Department of the Environment and Heritage. Threat abatement plan, Infection of amphibians with chytrid fungus resulting in chytridiomycosis. Commonwealth of Australia 2006, (http://www.environment.gov.au/biodiversity/threatened/publications/tap/chytrid/index.html, verze z 1.11.2007). Fischer M. C., Bosch J., Yin Z., Stead D. A., Walker J., Selway L., Brown A. J. P., Walker L. A., Gow N. A. R., Stajich J. E., Garner T. W. J. 2009: Proteomic and phenotypic profiling of the amphibian pathogen Batrachochytrium dendrobatidis shows that genotype is linked to virulence. Molecular Ecology, 18: 415–429. Frías–Alvarez P., Vredenburg V. T., Familiar–López M., Longcore J. E., González–Bernal E., Santos– Barrera G., Zambrano L., Parra–Olea G. 2008: Chytridiomycosis Survey in Wild and Captive Mexican Amphibians. Ecohealth, 5: 18–26. Garner T. W. J., Walker S., Bosch J., Hyatt A. D., Cunningham A. A., Fisher M. C. 2005: Chytrid fungus in Europe. Emerging Infectious Diseases, 11(10): 1639–1641. Kilpatrick A. M., Briggs C. J., Daszak P. 2010: The ecology and impact of chytridiomycosis: an emerging disease of amphibians. Trends in Ecology & Evolution, 25(2): 109–118. La Marca E., Lips K. R., Lötters S., Puschendorf R., Ibáñez R., Ruenda–Almonacid J. V., Schulte R., Marty C., Castro F., Manzanilla–Puppo J., García–Pérez J. E., Bolaños F., Chaves G., Pounds J. A., Toral E., Young B. E. 2005: Catastrophic Population Declines and Extinctions in Neotropical Harlequin Frogs (Bufonidae: Atelopus). Biotropica, 37(2): 190–201. Longcore J. E., Pessier A. P. & Nichols D. K. 1999: Batrachochytrium dendrobatidis gen et sp. nov., a chytrid pathogen to amphibians. Mycologia, 91: 219–227. Martel A., Spitzen-van d. S., Blooi M., Bert W., Ducatelle R., Fisher M. C., Woeltjes A., Bosman W., Chiers K., Bossuyt F., Pasmans F. 2013: Batrachochytrium salamandrivorans sp. nov. causes lethal chytridiomycosis in amphibians. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110(38): 15325. Mendelson J. R., Lips K. R., Gagliardo R. W., Rabb G. B., et al. 2005: Confronting amphibian declines and extinctions - Amphibian Conservation Summit Declaration. Science Supporting Online Material, (www.sciencemag.org/cgi/content/full/313/5783/48/DC1, verze z 7.1.2008). Morehouse E. A., James T. Y., Ganley A. R. D., Vilgaly R., Berger L., Murphy P. J., Longcore J. E. 2003: Multilocus sequence typing suggests the chytrid pathogen of amphibians is a recently emerged clone. Molecular Ecology, 12: 395–403. Ohst T., Gräser Y., Mutschmann F., Plötner J. 2011: Neue Erkenntnisse zur Gefährdung europäischer Amphibien durch den Hautpilz Batrachochytrium dendrobatidis. Zeitschrift für Feldherpetologie, 18: 1–17. Phillips S. J., Anderson R. P., Schapire R. E. 2006: Maximum entropy modeling of species geographic distributions. Ecological Modelling, 190: 231–259. Phillips S. J., Dudík M. 2008: Modelling of species distributions with Maxent: new extensions and a comprehensive evaluation. Ecography, 31: 161–175.
21
Phillips S. J., Dudík M., Schapire R.E. 2004: A maximum entropy approach to species distribution modeling. Proceedings of the Twenty–First International Conference on Machine Learning, 655–662. Phillips S.J., Dudík M., Elith J., Graham C.H., Lehmann A., Leathwick J., Ferrier S. 2009: Sample selection bias and presence-only distribution models: implications for background and pseudo-absence data. Ecological Applications, 19: 181–197. Pounds A. J., Bustamante M. R., Coloma L. A., Consuegra J. A., Fogden M. P. L., Foster P. N., la Marca E., Masters K. L., Merino–Viteri A., Puschendorf R., Ron S. R., Sanchez–Azofeifa G. A., Still C. J., Young B. E.. 2006: Widespread amphibian extinctions from epidemic disease driven by global warming. Nature, 439: 161–167. Rollins-Smith L. A., Carey C., Conlon J. M., Reinert L. K., Doersam J. K., Bergman T., Silberring J., Lankinen H. & Wade D. 2003: Activities of temporin family peptides against the chytrid fungus (Batrachochytrium dendrobatidis) associated with global amphibian declines. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 47: 1157–1160. Skerratt L. F., Berger L., Speare R., Cashins S., McDonald K. R., Phillott A. D., Hines H. B. & Kenyon N. 2007: Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth, DOI: 10.1007/s10393-007-0093-5. Sura P., Janulis E., Profus P. 2010: Chytridiomikoza – śmiertelne zagrożenie dla płazów. Chrońmy Przyrodę Ojczystą, 66(6): 406–421. Sztatecsny M., Glaser F. 2011. From the eastern lowlands to the western mountains: first records of the chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis in wild amphibian populations from Austria. Herpetological Journal, 21: 87–90. Thrush M. A., Murray A. G., Brun E., Wallace S., Peeler E. J. 2011: The application of risk and disease modelling to emerging freshwater diseases in wild aquatic animals. Freshwater biology, 56(4): 658–675. Voyles J., Young S., Berger L., Campbell C., Voyles W. F., Dinudom A., Cook D., Webb R., Alford R. A., Skerratt L. F., Speare R. 2009: Pathogenesis of Chytridiomycosis, a Cause of Catastrophic Amphibian Declines. Science, 326: 582–585. Williams E. S., Yuill T., Artois M., Fischer J., Haigh S. A. 2002: Emerging infectious diseases in wildlife. Revue Scientifique et Technique–Office International des Epizooties, 21(1): 139–157. Wood L. R., Griffiths R. A., Schley L. 2009: Amphibian chytridiomycosis in Luxembourg. Bulletin de la Société des Naturalistes Luxembourgeois, 110: 109–114.
22
7. Seznam příloh Příloha č. 1: Článek do časopisu Journal for Nature Conservation (submitováno; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 1.535) Příloha č. 2: Článek do časopisu Diseases of Aquatic Organisms (v recenzním řízení; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 2.201) Příloha č. 3: Článek do časopisu Acta Veterinaria Brno (manuskript přijat k publikování; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 0.431) Příloha č. 4: Článek do časopisu Conservation Biology (manuskript přijat k publikování; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 4.692) Příloha č. 5: Článek do časopisu Herpetological Journal (publikováno; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 0.812) Příloha č. 6: Článek do časopisu Herpetological Review (publikováno; recenzovaný časopis) Příloha č. 7: Článek do časopisu Ochrana přírody (publikováno; recenzovaný časopis) Příloha č. 8: Abstrakt z konference Zoologické dny 2013 (Brno) Příloha č. 9: Abstrakt z konference Zoologické dny 2013 (Brno) Příloha č. 10: Abstrakt z konference Zoologické dny 2013 (Brno) Příloha č. 11: Abstrakt z konference Zoologické dny 2012 (Olomouc) Příloha č. 12: Abstrakt z konference Zoologické dny 2011 Příloha č. 13: Abstrakt z konference Zoologické dny 2010 Příloha č. 14: Abstrakt z konference UCOLIS 2010 Příloha č. 15: Abstrakt z konference ECCB 2009 Příloha č. 16: Abstrakt z konference Zoologické dny 2009
23
Příloha č. 1: Článek do časopisu Journal for Nature Conservation (submitováno; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 1.535)
Utilizing custom data for large-scale species distribution modeling: demonstrated on Batrachochytrium dendrobatidis in the Czech Republic Petr Civiš1* · Jiří Vojar1 Vojtech Baláž2 1
Department of Ecology, Faculty of Environmental Sciences, Czech University of Life Sciences Prague,
Kamýcká 129, Prague 6, 165 21, Czech Republic 2
Department of Biology and Diseases of Wildlife, Faculty of Veterinary Hygiene and Ecology, University of
Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Palackého tř. 1/3, Brno 612 42, Czech Republic *Corresponding author: Petr Civiš; e-mail:
[email protected]; phone: +420 224 382 128
Abstract Species distribution modeling (SDM) has become a powerful tool in conservation biology during the past decade thanks to low-cost hardware workstations and readily available global environmental datasets. While these datasets are useful for large-scale modeling, they contain insufficient information to enable precise modeling on a smaller spatial level (due to imprecise variable approximation and low resolution). Herein, we present the first prediction modeling of the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis found in Czech wild amphibian populations on a precise, high-resolution dataset created especially for the conditions of this country. For cases in other countries when similar long-term data or other variables are deficient or inaccurate, we present guidelines for how to create custom variables to be used in maximum entropy SDM. Our model, applied for the amphibian chytrid fungus, predicted the pathogen to occur at lower altitudes and to display a widespread patchy pattern. The occurrence of the pathogen was explained mainly by precipitation, temperature and human footprint variables. Although infection rates in examined populations did not seem to change over time during our survey, advance measures should be taken toward preserving species potentially threatened by this pathogen.
Keywords Amphibian chytrid fungus · Bombina · Distribution modeling · Maximum entropy
Introduction Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), the fungus causing the disease chytridiomycosis, has been known to be affecting amphibian populations since its first report in 1933 (Soto−Azat et al., 2009). The pathogen persists in many geographically different parts of the world (Olson et al., 2013). In recorded history, probably no other disease has had such a giant impact on biodiversity (Skerratt et al., 2007). Today, almost one-third (32 %) of 7,179 known amphibian species are threatened with extinction and are listed under the IUCN Red List of Threatened Species (amphibiaweb.org, 15 September 2013). Chytridiomycosis, together with other amphibian diseases, represents the third main cause of amphibian threat right after habitat destruction, and degradation and pollution (Baillie et al., 2004). Numerous studies have described varying susceptibility to Bd among amphibian taxa, but no satisfactory explanations for this variability are known (Searle et al., 2011; Baláž et al., in press b). In vitro studies of Bd have revealed its physiology and survival, establishing 4‒28°C as the temperature range for its growth. At 28°C its growth is inhibited and it dies if exposed to 30°C for longer time periods (Piotrowski et al., 2004). Again, varying results as to symptoms in relation to Bd infection are presented across different studies. Some report that amphibians carrying Bd infection live significantly longer at warmer temperatures (Andre et al., 2008; Bustamante et al., 2010), whereas others present findings to the contrary and show Bd to be least pathogenic in cool conditions (Berger et al., 1998, 2004; Longcore et al., 1999; Piotrowski et al., 2004). Generally, climate dependence of the Bd host–pathogen system has been confirmed (Lips et al., 2008; Rödder et al., 2010). Species distribution models (SDMs) predicting the potential distribution of species, and subsequently their diseases, have become very powerful tools for conservation biologists
(Araújo et al., 2004; Kremen et al., 2008) utilizing powerful computer workstations and modern environmental datasets. Therefore, modeling approaches are now commonly applied (e.g., Peterman et al., 2013; Tarrant and Armstrong 2013). The most accurate and comprehensive modeling uses the maximum entropy algorithm known as Maxent (Phillips et al., 2006). This method benefits from presence-only data and performs much better than other modeling techniques (Elith et al., 2006; Hernandez et al., 2006). The principle of this method lies in estimating a target probability distribution across a study area by finding the probability distribution of maximum entropy (closest to uniform), subject to a set of constraints that represent our incomplete information about the target distribution (Phillips et al., 2006). SDMs can be applied for any species using habitats characterized by different environmental variables. These variables must be chosen wisely so that they are meaningful and important for the particular species (Hijmans et al., 2013). Some efforts in modeling Bd’s potential distribution using climatic variables have been successfully applied already (e.g., Ron 2005; Lötters et al., 2009; Puschendorf et al., 2009). Especially bioclimatic variables have been confirmed to correlate with Bd prevalence and infection rates, as proven in many modeling attempts both in the laboratory and in the field (e.g., Rödder et al., 2009; Ghirardi et al., 2011; Menéndez-Guerrero and Graham 2013). Equally important as variable choice for the model’s accuracy is the variable quality. Variables included in freely accessible datasets are sufficient for large-scale modeling (e.g., whole world, continents, large countries) although these are not so applicable at the level of smaller countries. Low data resolution and frequent roughly interpolated data in less inhabited parts of the world are the key limitations when using these environmental layers on a smaller scale. One of the main goals of our study, therefore, was to create a precise prediction for a small area using available map resources. We include here (see Online Resource 1) comprehensive
guidelines describing how to create custom variables suitable for maximum entropy SDM. At the same time, the dataset was used for the first potential distribution modeling of Bd within the boundaries of the Czech Republic. Assuming specific climatic conditions could favor the disease’s presence, proliferation and spreading, we targeted those areas where the disease has been documented to exist in order to further understand which factors influence Bd’s occurrence in the Czech Republic and in which stage Bd is found here, as well as to assess how high could its potential negative impact be on this country’s amphibian diversity.
Materials and methods Before modeling any prediction, reasonable data must be gathered and analyzed to avoid future inaccuracies and errors (e.g., due to incorrect spatial resolution, differences in coordinate systems). Toward achieving a precise model for our designated target, we first evaluated the frequently used WorldClim dataset (worldclim.org). We found this to be insufficient, however, because the variables for our country were derived from only two climate stations (see Hijmans et al., 2005). Therefore, we decided to create a completely new dataset with an emphasis on the data’s resolution and its long-term validity. Other European countries which also should consider using a locally constructed alternative to the WorldClim data set on their country levels include, for example, Sweden, Finland, Hungary, Poland or Slovakia. Because the Czech Hydrometeorological Institute provides no archived data for the public, the maps used for creating climatic layers were based on the Climate Atlas of Czechia (Czech Hydrometeorological Institute 2005), which currently provides the best long-term climate maps conveying precise information interpolated from a period of 40 years (1961‒2000).
Using ArcGis 9.3 with the Spatial Analyst extension (ESRI 2008), these maps were manually digitized, adjusted, georeferenced, reclassified, cropped to within Czech Republic boundaries, and exported in 100 x 100 cell size resolution as ASCII files to be used in environmental modeling software tools. Temperature (minimum, maximum and mean) and precipitation layers were created for each month of the year. Bioclimatic variables (19 layers) were derived from monthly temperature and precipitation values in order to generate more biologically meaningful variables (Hijmans et al., 2005). Only physiologically relevant variables important for Bd were used for modeling the specie’s range (Piotrowski et al., 2004; Woodhams and Alford 2005; Lötters et al., 2009). These included all bioclimatic layers, global human footprint layer (WCS and CIESIN 2005), aspect and slope. Correlation between all variables was checked using ENM Tools (Warren et al., 2010), and highly correlated variables (r > 0.6) were removed. Other maps contained in our dataset but not used for Bd prediction modeling because of their correlation with other variables and/or irrelevance for the pathogen include altitude, highways and main car routes, large water bodies and water courses. The 2D Cartesian coordinate system S-JTSK Krovak East-North, which is a historically important and commonly used geographical projection system in the Czech Republic, was applied to each map. As occurrence records, we used coordinates of all localities (mostly water bodies) where since 2008 amphibians had been sampled for Bd and the analysis results came out positive (Civiš et al., 2012; Baláž et al., in press b). The complete dataset contained 1,562 samples from 15 species with 206 (i.e., 13 %) positive records. Adjacent localities (closer than 500 m) were clustered into one centroid coordinate. Altogether 31 unique localities were extracted from the dataset. For the distribution modeling itself, we used MaxEnt software version 3.3.3k (Phillips and Dudík 2008). Linear, quadratic and product features with logistic output were run. With the
exception of random test percentage (set to 20 %, which was the percentage of occurrence points used for model testing) all values were set to default to improve the model’s performance on “high-quality” empirical datasets as tested in Phillips and Dudík (2008). Jackknife operations measuring the importance of each variable and response curves showing how each variable affects the model were included into the run (Phillips and Dudík 2008). Output of the model (asc file) was thresholded (to create maps of relative suitability for Bd) using the equal training sensitivity and specificity logistic threshold (correct predicting of all presences vs. all absences is in balance), which had performed well in previous studies (Liu et al., 2005; Jiménez-Valverde and Lobo 2007; Menéndez-Guerrero and Graham 2013).
Results Environmental layers One of the main outcomes of our study was the creation of high-resolution environmental layers suitable for niche modeling of various species, including pathogens. The final dataset can be downloaded here: www.chytrid.herp.cz/czechclim.rar. It contains 74 environmental layers designed for the Czech Republic, including the following: 12 maximum annual temperature, 12 minimum annual temperature, 12 mean annual temperature, 12 annual precipitation, 19 bioclimatic variables, 1 altitude, 1 ground exposition, 1 global human footprint, 1 terrain slope, 1 car routes, 1 water bodies and 1 water courses. Custom variables can be added any time with the aid of one layer used to transfer the spatial dimensions, extent and resolution of the entire dataset. Prediction of Bd occurrence Results of the first distribution modeling of Bd’s presence in the Czech Republic, based on precise map groundwork and the vast range of Bd’s host species (seven amphibians:
Ichthyosaura alpestris, Bombina bombina, Bombina variegata, Bufo bufo, Bufo calamita, Bufo viridis, Pelophylax spp.), are shown in Fig. 1. Predictive performance of our best distribution model was high (AUC = 0.880, test AUC = 0.852). Suitable areas using the logistic equal training sensitivity and specificity threshold (0.410) covered 21 % (16,651 km2) of the Czech Republic’s area. Variables contributing the most to our resulting model (Table 1) were precipitation of the warmest quarter (21.7 %), precipitation seasonality (16.1 %), mean temperature of the warmest quarter (13.2 %) and human footprint effect (12.8 %). The contributions of other variables to the model were each less than 10 %. The map depicting the assumptive prediction suggests that Bd’s occurrence in the area is widespread and patchy on a local scale. Lowlands (200‒400 m a.s.l.) seem to best meet Bd’s physiological demands. These areas correspond with the occurrence of our target species, showing that undetected populations carrying Bd could extend its potential distribution into a much wider area.
Discussion The Czech Republic is inhabited by 8 Caudate and 13 Anuran species, 19 of which have been proven to carry Bd infection either in this country directly or in neighboring countries (Ohst et al., 2011; Sztatecsny and Glaser 2011; Civiš et al., 2012). The genus Bombina, considered to be a good target species for Bd surveillance purposes, as it carries constant intermediate infection rates (Baláž et al., in press b), constituted most of our positive samples. During the mating season, Bombina variegata, identified as most often positive among the sampled amphibians, favors shallow, frequently desiccating ponds which are fully exposed to the sun (Barandun et al., 1997) and some of which dry out completely during summer months. Therefore the prediction variables (precipitation, temperature conditions and human land use) strongly affect the species’ fitness and its subsequent reproduction success. Temperatures outside Bd’s optimum range (i.e., <4°C and >28°C) may reduce the infection loads and lead
to a given individual’s clearance of the disease. It is known that elevated temperatures can allow post-metamorphic amphibians to clear Bd infection (Woodhams et al., 2003; RichardsZawacki 2010; Searle et al., 2013). Maximum air temperature in the Czech Republic (up to 33°C in August) does not greatly exceed the physiological optimum for Bd’s survival, although high air temperatures in summer months can easily cause water to warm in very shallow ponds. This points to the possibility for the genus Bombina to reduce the disease’s impact or to be completely cured of it due to temperature fluctuation extending outside Bd’s optimum. The minimum temperature, which falls to −22°C in January, may prevent the disease from overwintering outside the amphibian host. Nevertheless, only limited data is available about the persistence of Bd on the Czech Republic’s hibernating amphibians (Baláž et al., in press a), all of which maintain temperatures above the freezing point during winter. The importance for amphibians of rainfall quantity has been discussed intensely (e.g., Ron 2005; Rödder et al., 2008), and it has been suggested that increased moisture at a site promotes higher individual activity of amphibians and therefore facilitates disease transmission, proliferation and spread. Even when sites dry out completely, studies show that Bd is capable to persist in moist soils and continues growing when the site is flooded again (Johnson and Speare 2005). The overall infection prevalence on frogs breeding in temporary water bodies differs across studies, however, with some demonstrating low infection levels (Kriger and Hero 2007; Skerratt et al., 2007; Baláž et al., in press b) and others moderate and high levels (Riley et al., 2013). This emphasizes that Bd’s impact is species-specific, irrespective of the amphibian’s breeding behavior. Our sampling data were not equally distributed to cover all of the various habitats in the country, but, based on results of studies covering the whole of Europe including the Czech Republic (Ron et al., 2005; Lötters et al., 2009), we can expect the chytrid fungus to be ubiquitous in the Czech Republic. Puschendorf et al. (2013) showed that opportunistically
collected data can be biased if species are not in equilibrium with their environments or because environmental gradients have not been adequately sampled. All of these factors frequently lead to underestimating the distribution of Bd, which could be the case also in the Czech Republic. Nevertheless, our model can still be used to target the most affected populations of species used for the model’s building. At sites where the most infection has been detected, Bombina bombina and Pelophylax spp. were inhabiting small ponds together with at least three other amphibian species, thus supporting the hypothesis that species richness increases the likelihood for the infection to emerge and the disease to be transmitted (Olson et al., 2013). Therefore, the genera Bombina and Pelophylax may function as vector species, propagating Bd’s spread across sites. By contrast, high population densities of some amphibian species, and especially when in their larval states, lead to shorter larval periods and therefore to lower infection severity after metamorphosis (Loman 2002; Searle et al., 2013). Several crowded sites occurred in our study which manifested constant infection rates on subadults, thus suggesting that after metamorphosis individuals can be exposed to the infection within their first mating season. During our four-year study, only singular cases of conspicuous chytridiomycosis were observed and no vast population diminutions or collapses were noticed. This observation indicates that the majority of Czech amphibian species carrying the infection may be resistant to Bd infection, strains occurring in this country are not lethal, or that climate affects the host– pathogen interaction such that infected species carry nonlethal Bd loads (Longo et al., 2010; Daskin et al., 2011). Some studies, such as that of Tobler et al. (2012), provide evidence that populations of amphibian species that are susceptible to Bd can persist and even grow despite a high prevalence of the pathogen. The individual-level effects of the disease (mortality of individuals) do not necessarily translate into population-level effects (negative population growth rates). However, the mechanism allowing the populations to persist has not been
clarified. Observed long-term persistence of the fungus at infected sites in the Czech Republic suggests that the disease may be capable of overwintering in Czech temperate conditions or that it can survive on an amphibian with non-lethal parasite loads during hibernation. It remains unclear which species help the disease to overwinter. Such knowledge could be useful in directing future conservation steps. Our results underline the importance of external abiotic conditions of the host–pathogen system in temperate zone amphibian species, and they point to lowlands as suitable areas for Bd’s incidence and persistence. Amphibian populations in these areas are under pressure of the surrounding agglomerations, which most likely multiply the impact on amphibian populations and can lead to disease susceptibility. This corresponds to the importance of the human footprint variable identified by our model. Our study offers a new look upon using SDMs on a local scale. Unsuitable online global datasets can be easily substituted with custom datasets transformed from generally obtainable maps. Our dataset covering the Czech Republic can be used to model niches of any other species, not just amphibian pathogens. Although commonly investigated global patterns provide a general overview of the studied phenomenon, the influence of local patterns seems to be neglected. On the other hand, more and more high-resolution data can be obtained in a very short time for a small area, and that creates huge potential for future research approaches that enable modeling while using almost current conditions on the scale of a single population. Such protected habitats hosting vulnerable amphibian species as national parks, protected landscape areas, and other sites safeguarded by the government should benefit from our research, and the potential threats posed by Bd should not be underestimated. Especially small, already diminished, and vulnerable populations of critically endangered species should be included into the continuous disease surveillance. Early laboratory tests should be made that take a minimal number of individuals of vulnerable species from their natural sites,
incubate these, and test them using the local Bd strain to determine their response to Bd loads. Results of in vitro studies should prioritize which species need ex situ conservation measures if outbreaks of the disease appear. A combination of laboratory findings and SDMs which can directly apply effective conservation strategies at predicted Bd hotspots can help in preserving target species from possible extinction.
Acknowledgments This study was supported by the Czech University of Life Sciences Prague (Grant No. 42110/1313/3111) and by the Technology Agency of the Czech Republic (Grant No. TA01020881).
References Andre, S. E., Parker, J., & Briggs, C. J. (2008). Effect of temperature on host response to Batrachochytrium dendrobatidis infection in the Mountain Yellow-legged Frog (Rana muscosa). J Wildl Dis, 44, 716–720. Araújo, M. B., Cabeza, M., Thullier, W., Hannah, L., & Williams, P. H. (2004). Would climate change drive species out of reserves? An assessment of existing reserve-selection methods. Glob Chang Biol, 10,1618– 1626. Baillie, J. E. M., Hilton–Taylor, C., & Stuart, S. N. (2004). 2004 IUCN Red List of Threatened Species. A Global Species Assessment. IUCN, Gland, Switzerland and Cambridge, UK, xxiv + 191 pp. Baláž, V., Kubečková, M., Civiš, P., Rozínek, R., & Vojar, J. (in press a). Fatal chytridiomycosis and infection loss observed on wild-infected toads in captivity. Acta Vet Brno. Baláž, V., Vörös, J., Civiš, P., Vojar, J., Hettyey, A., Sós, E., Dankovics, R., Jehle, R., Christiansen, D. G., Clare, F., Fisher, M., Garner, T. W. J., & Bielby, J. (in press b). Assessing risk and guidance on monitoring of Batrachochytrium dendrobatidis in Europe through identification of taxonomic selectivity of infection. Conserv Biol. Barandun, J., Reyer, H.–U., & Anholt, B. (1997). Reproductive ecology of Bombina variegata: characterisation of spawning ponds. Amphibia–Reptilia, 18 (2), 143–154.
Berger, L., Speare, R., Daszak, P., Green, D. E., Cunningham, A. A., et al. (1998). Chytridiomycosis causes amphibian mortality associated with population declines in the rain forests of Australia and Central America. Proc Nat Acad Sci U S A, 95, 9031–9036. Berger, L., Speare, R., Hines, H. B., Marantelli, G., Hyatt, A. D., et al. (2004). Effect of season and temperature on mortality in amphibians due to chytridiomycosis. Aust Vet J, 82, 434–439. Bustamante, H. M., Livo, L. J., & Carey, C. (2010). Effects of temperature and hydric environment on survival of the Panamanian golden frog infected with a pathogenic chytrid fungus. Integr Zool, 5, 143–153. Civiš, P., Vojar, J., & Baláž, V. (2012). Current state of Bd occurrence in the Czech Republic. Herp Rev, 43, 150–159. Czech Hydrometeorological Institute (2005). Climate Atlas of Czechia. http://old.chmi.cz/meteo/ok/atlas/index.html. Accessed 4 October 2012. Daskin, J. H., Alford, R. A., & Puschendorf, R. (2011). Short-term exposure to warm microhabitats could explain amphibian persistence with Batrachochytrium dendrobatidis. PLoS ONE, 6(10), e26215. doi:10.1371/journal.pone.0026215. Elith, J., Graham, H., Anderson, C. P., Dudík, R., Ferrier, M., et al. (2006). Novel methods improve prediction of species’ distributions from occurrence data. Ecography, 29, 129–151. doi:10.1111/j.2006.09067590.04596.x. ESRI (2008). ArcGIS 9.3. Environmental System Research Institute, Redlands, CA, U.S.A. Ghirardi, R., Perotti, M. G., Steciow, M. M., Arellano, M. L., & Natale, G. S. (2011). Potential distribution of Batrachochytrium dendrobatidis in Argentina: implications in amphibian conservation. Hydrobiologia, 659, 111–115. Hernandez, P. A., Graham, C. H., Master, L. L., & Albert, D. L. (2006). The effect of sample size and species characteristics on performance of different species distribution modeling methods. Ecography, 29, 773– 785. Hijmans, R. J., Cameron, S. E., Parra, J. L., Jones, P. G., & Jarvis, A. (2005). Very high resolution interpolated climate surfaces for global land areas. Int J Climatol, 25, 1965–1978. Hijmans, R. J., & Elith, J. (2013). Species distribution modeling with R. The Comprehensive R Archive Network. http://cran.r-project.org/web/packages/dismo/vignettes/sdm.pdf. Accessed 20 September 2013. Jiménez–Valverde, A., & Lobo, J. M. (2007). Threshold criteria for conversion of probability of species presence to either–or presence–absence. Acta Oecol, 31, 361–369.
Johnson, M. L., & Speare, R. (2005). Possible modes of dissemination of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis in the environment. Dis Aquat Organ, 65, 181–186. Kremen, C., Cameron, A., Moilanen, A., Phillips, S. J., et al. (2008). Aligning conservation priorities across taxa in Madagascar with high-resolution planning tools. Science, 320, 222–226. Kriger, K. M., & Hero, J. (2007). The chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis, is non-randomly distributed across amphibian breeding habitats. Divers Distrib, 13,781–788. Lips, K. R., Diffendorfer, J., Mendelson, J. R., & Sears, M. W. (2008). Riding the wave: reconciling the roles of disease and climate change in amphibian declines. PLoS Biol, 6(3), 72. Liu, C., Berry, P. M., Dawson, T. P., & Pearson, R. G. (2005). Selecting thresholds of occurrence in the prediction of species distributions. Ecography, 28, 385–393. Loman, J. (2002). Rana temporaria metamorph production and population dynamics in the field – Effects of tadpole density, predation and pond drying. J Nat Conserv, 10(2), 95–107. Longcore, J. E., Pessier, A. P., Nichols, D. K. (1999). Batrachochytrium dendrobatidis gen. et sp. nov., a chytrid pathogenic to amphibians. Mycologia, 91, 219–227. Longo, A. V., Burrowes, P. A., Joglar, R. L. (2010). Seasonality of Batrachochytrium dendrobatidis infection in direct-developing frogs suggests a mechanism for persistence. Dis Aquat Organ, 92, 253–260. Lötters, S., Kielgast, J., Bielby, J., Schmidtlein, S., Bosch, J., Veith, M., Walker, S. F., Fisher, M. C., & Rödder, D. (2009). The link between rapid enigmatic amphibian decline and the globally emerging chytrid fungus. EcoHealth, 6, 358–372. Menéndez–Guerrero, P. A., & Graham, C. H. (2013). Evaluating multiple causes of amphibian declines of Ecuador using geographical quantitative analyses. Ecography, 36, 756–769. Ohst, T., Graser, Y., Mutschmann, F., & Plötner, J. (2011). Neue Erkenntnisse zur Gefährdung europäischer Amphibien durch den Hautpilz Batrachochytrium dendrobatidis. Zeitschrift für Feldherpetologie, 18, 1– 17. Olson, D. H., Aanensen, D. M., Ronnenberg, K. L., Powell, C. I., Walker, S. F., et al. (2013). Mapping the global emergence of Batrachochytrium dendrobatidis, the amphibian chytrid fungus. PLoS ONE, 8(2), e56802. doi:10.1371/journal.pone.0056802. Peterman, W. E., Crawford, J. A., & Kuhns, A. R. (2013). Using species distribution and occupancy modeling to guide survey efforts and assess species status. J Nat Conserv, 21(2), 114–121.
Phillips, S. J., Anderson, R. P., & Schapire, R. E. (2006). Maximum entropy modeling of species geographic distributions. Ecol Model, 190, 231–259. Phillips, S. J., & Dudík, M. (2008). Modeling of species distributions with Maxent: new extensions and a comprehensive evaluation. Ecography, 31, 161–175. Piotrowski, J. S., Annis, S. L., & Longcore, J. E. (2004). Physiology of Batrachochytrium dendrobatidis, a chytrid pathogen of amphibians. Mycologia, 96(1), 9–15. Puschendorf, R., Carnaval, A. C., VanDerWal, J., Zumbado-Ulate, H., Chaves, G., Bolaños, F., & Alford, R. A. (2009). Distribution models for the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis in Costa Rica: proposing climatic refuges as a conservation tool. Divers Distrib, 15, 401–408. Puschendorf, R., Hodgson, L., Alford, R. A., Skerratt, L. F., & VanDerWal, J. (2013). Underestimated ranges and overlooked refuges from amphibian chytridiomycosis. Divers Distrib, 19, 1313–1321. Richards–Zawacki, C. L. (2010). Thermoregulatory behavior affects prevalence of chytrid fungal infection in a wild population of Panamanian golden frogs. Proc R Soc B, 277, 519–528. Riley, K., Berry, O. F., & Roberts, J. D. (2013). Do global models predicting environmental suitability for the amphibian fungus, Batrachochytrium dendrobatidis, have local value to conservation managers? J Appl Ecol, 50(3), 713–720. Rödder, D., Kielgast, J., Bielby, J., Schmidtlein, S., Bosch, J, Garner, T. W. J., Veith, M., Walker, S. F., Fisher, M. C., & Lötters, S. (2009). Global amphibian extinction risk assessment for the panzootic chytrid fungus. Diversity, 1, 52–66. Rödder, D., Kielgast, J., & Lötters, S. (2010). Future potential distribution of the emerging amphibian chytrid fungus under anthropogenic climate change. Dis Aquat Organ, 92(2–3), 201–207. Rödder, D., Veith, M., & Lötters, S. (2008). Environmental gradients explaining the prevalence and intensity of infection with the amphibian chytrid fungus: the host’s perspective. Anim Conserv, 11(6), 513–517. Ron, S. R. (2005). Predicting the Distribution of the Amphibian Pathogen Batrachochytrium dendrobatidis in the New World. Biotropica, 37(2), 209–221. Searle, C. L., Gervasi, S. S., Hua, J., Hammond, J. I., Relyea, R. A., Olson, D. H., & Blaustein, A. R. (2011). Differential host susceptibility to Batrachochytrium dendrobatidis, an emerging amphibian pathogen. Conserv Biol, 25, 965–974. Searle, C. L., Xie, G. Y., & Blaustein, A. R. (2013). Development and infectious disease in hosts with complex life cycles. PLoS ONE, 8(4), e60920. doi:10.1371/journal.pone.0060920.
Skerratt, L. F., Berger, L., Speare, R., Cashins, S., McDonald, K. R., Phillott, A. D., et al. (2007). Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth, 4, 125–134. Soto–Azat, C., Clarke, B. T., Poynton, J. C., & Cunningham, A. A. (2009). Widespread historical presence of Batrachochytrium dendrobatidis in African pipid frogs. Divers Distrib, 16(1), 126–131. Sztatecsny, M., & Glaser, F. (2011). From the eastern lowlands to the western mountains: First records of the chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis in wild amphibian populations from Austria. Herpetol J, 21, 87–90. Tarrant, J., & Armstrong, A. J. (2013). Using predictive modelling to guide the conservation of a critically endangered coastal wetland amphibian. J Nat Conserv, 21(5), 369–381. Tobler, U., Borgula, A., & Schmidt, B. R. (2012). Populations of a susceptible amphibian species can grow despite the presence of a pathogenic chytrid fungus. PLoS ONE, 7(4), e34667. doi:10.1371/journal.pone.0034667. Warren, D. L., Glor, R. E., & Turelli, M. (2010). ENMTools: a toolbox for comparative studies of environmental niche models. Ecography, 33(3), 607–611. WCS (Wildlife Conservation Society), CIESIN (Center for International Earth Science Information Network) (2005). Columbia University. http://sedac.ciesin.columbia.edu/data/set/wildareas-v2-human-footprintgeographic. Accessed 14 July 2012 Woodhams, D. C., & Alford, R. A. (2005). Ecology of chytridiomycosis in rainforest stream frog assemblages of tropical Queensland. Conserv Biol, 19, 1449–1459. Woodhams, D. C., Alford, R. A., Marantelli, G. (2003). Emerging disease of amphibians cured by elevated body temperature. Dis Aquat Organ, 55, 65–67.
Table 1 Variable contributions (in percent of explained variability) to the model predicting potential distribution of Batrachochytrium dendrobatidis in the Czech Republic
Variable
Explained variability [%]
Precipitation of warmest year quarter
21.7
Precipitation seasonality
16.1
Mean temperature of warmest year quarter
13.2
Human footprint
12.8
Aspect
8.7
Isothermality
8.4
Mean temperature of coldest year quarter
4.2
Precipitation of driest year quarter
4.2
Precipitation of driest month
3.9
Temperature seasonality
2.9
Fig. 1 Predicted distribution of Batrachochytrium dendrobatidis using high-resolution environmental variables. Gray areas, representing values above the equal training sensitivity and specificity logistic threshold (0.41), show habitats suitable for Bd in the context of those variables used
Supporting online material for Journal for Nature Conservation article: Utilizing custom data for large-scale species distribution models: demonstrated on Batrachochytrium dendrobatidis in the Czech Republic Petr Civiš1* · Jiří Vojar1· Vojtech Baláž2 1
Department of Ecology, Faculty of Environmental Sciences, Czech University of Life Sciences Prague,
Kamýcká 129, Prague 6, 165 21, Czech Republic 2
Department of Biology and Diseases of Wildlife, Faculty of Veterinary Hygiene and Ecology, University of
Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Palackého tř. 1/3, Brno 612 42, Czech Republic *Corresponding author: Petr Civiš; e-mail:
[email protected]; phone: +420 224 382 128
Creating variable datasets suitable for niche modeling in Maxent based on custom paper/digital maps Software requirements: ArcGis (ArcMap with Spatial Analyst extension, ArcCatalog), graphic program (e.g., Adobe Photoshop, Gimp,...)
Example To create custom maps suitable for Species Distribution Modeling (e.g., in Maxent), we must first digitize the image of the map (if it is not digitized already). Begin by scanning the paper map with the legend into a digital image in high resolution (e.g., 300 dpi or more), then crop it using a graphic program to within the border of your area of interest. It is good to have a reference border, such as the border of a country.
In our example, we have a temperature map containing rivers (blue) and the state border (purple) together with six different colors representing temperature intervals. Setting up Spatial Reference Now we open ArcCatalog and search for our first prepared image (e.g., January temperature map). Right-click the image and choose Properties. Scroll down to Spatial Reference and click Edit. Now choose the coordinate system commonly used in your area of interest. Most common is WGS84 (GPS), but any other system can be used. Note that the system chosen at this point must match the system used to locate your occurrence coordinate points. Preparing the mask Now we should prepare a cropping mask for our area of interest. You can create your mask manually using the Editor tool but if you want all of your maps to be cropped with a specific shape (e.g., a precise state border, which would be difficult to create manually) it is wise to search the internet to find a vector GIS file representing the state borders. Once you download
a file containing vectorized state borders, you can select the state shape and export it as raster data to be used as a cropping mask. To do so, run ArcMap, go to Tools > Extensions and make sure Spatial Analyst is ticked. Now load the shape file with your state borders into ArcMap (with the corresponding coordinate system) and double-click the Feature to Raster (conversion) tool inside ArcToolbox. Within the Input features field, choose the name of the layer containing your state border. Inside the Output Raster choose the path where your new raster mask will be saved. Reasonable Output cell size should be chosen based on the extent of your survey area. If you are not sure which resolution to choose, start with 100 and check the size of the resulting file. Click OK and the new raster layer with the state border should be created (e.g., “border_mask”) and placed into the layers area. Now you can remove the original vector file and leave just the raster mask. Georeferencing the map Load the first image file with your map (e.g., January temperature), right-click on its layer, then choose Zoom to Layer. Open the Georeferencing panel (View > Toolbar > Georeferencing) and click the Layers icon and choose the map from the combo box. Now click the Add Control Points icon. Zoom inside our map to one reference point (identifiable both in the map and in the mask) and click on it once. Now right-click our “border_mask” layer and choose Zoom to Layer. Zoom in and click on the same spot but now onto our empty mask. Repeat this entire process for second and third points. The more points you create the more precise the georeferencing will be. It is recommended that the first two points be chosen far from one another. Also, it is useful to make the topmost layer semitransparent. Right-click on it, then select Properties > Display > Transparency and type in e.g., “50” %. Now your map should lie exactly on top of the mask and copy the country border line. When done, click Update Georeferencing on the Georeferencing panel. Now you can save the entire ArcMap project and close the application to edit the source image of our map.
Modifying map image features Open your graphics application. Load the source image of the map georeferenced in the previous steps. Use tools inside your graphics application to erase unwanted elements (e.g., rivers and state borders in our case). If some elements could cause problems on the border lines, you can draw the edge color pattern to cover and cross the line. Graphics outside the mask will be cropped later on. Once finished with editing and simplifying your map the result can look like this.
Save the image in your graphics application and close it.
Cropping the map with the mask Open your ArcMap project and the image of your map should be automatically updated. Inside ArcToolbox find and double-click Extract by Mask. Inside the Input Raster field, our retouched map should be selected. The Input raster or feature mask data field must
contain our border mask (e.g., “border_mask”). Output Raster specifies the name of the new cropped file and its placement. On the bottom of the dialog window, click Environments. Inside General Settings, choose Input Coordinate System: Same as Layer: “border_mask” (this takes the coordinate system from the mask and applies it to the new layer). Extent Same as Layer: “border_mask” (applies the extent of the mask). Inside Raster Analysis Settings go to Cell Size (applies the cell size of the mask) and choose: Same as Layer: “border_mask” and Mask: Same as Layer: “border_mask”. Click OK and confirm the whole dialog window by clicking OK. Reclassifying the map Your map is now cropped and contains information about your variables but the values of each color pixel do not yet match the values they represent in reality. To fix this, you must reclassify all of the pixels to their correct values. Go to your source image with the legend and examine the first color of the color gradient. In our example, the brightest color on the left of the legend represents the temperature range between 15 and 16°C. Now switch back to ArcMap, click the Identify icon in the main toolbar, then click on the spot corresponding to the value of the first color in the legend (e.g., 15–16°C). Pixel value should be shown inside a table. Write down that, for example, pixel value “162” can be replaced with 15.5 (real temperature information). Once you have a list of all the colors used, go to the ArcToolbox, where you will search and double-click the Reclassify (sa) tool. Input raster is our cropped map where we identified pixel values. Reclass field is the value field. Now click Classify... and recreate your table. Make single entries or intervals so that all the ascertained pixel values from our map are replaced with their real values (e.g., temperature). Choose the destination and file name inside the Output raster field and click OK. The resulting map should be created and should be categorized in the same way as the paper map.
If any visualization problems occur, right-click the map layer, choose Properties and click on the tab Unique Values, for example, depending on your layer. Notice that changes in the Visualization table change the categories (visual look) only in ArcMap and will not affect the source data. To be able to use the correct categories outside ArcGis, always use the Reclassify tool. Converting to ASC Now you just have to convert your reclassified map into a format suitable for your modeling application. For Maxent, .ASC files are used. Inside ArcToolbox, search and double-click Raster to ASCII. As Input Raster, select the reclassified map. As Output, you can choose a folder where your final maps will be stored. Click on the folder icon, switch below .txt to .asc, type in the name of your layer, then click Save and OK. Your map is now ready to be used in species distribution modeling in Maxent. Note: If multiple layers are required (e.g., one temperature for each month of the year), the procedure described in this document must be repeated for each month layer using still the same mask (“border_mask”).
Příloha č. 2: Článek do časopisu Diseases of Aquatic Organisms (v recenzním řízení; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 2.201)
Assessing the risk of amphibian chytridiomycosis using surveillance data from the Czech Republic: recognising the culprits from victims Short title: Chytridiomycosis risk in the Czech Rep.
*Vojtech Baláž1, Jiří Vojar2, Petr Civiš2, Martin Šandera3, Roman Rozínek4
1
Department of Biology and Diseases of Wildlife, Faculty of Veterinary Hygiene and Ecology, University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno, Palackého tř. 1/3, Brno 612 42, Czech Republic,
[email protected];
2
Department of Ecology, Faculty of Environmental Sciences, Czech University of Life Sciences Prague, Kamýcká 129, Prague 6, 165 21, Czech Republic
3
Museum of Nature Bohemian Paradise, Prachov 37, Jičín, 506 01, Czech Republic
4
NaturaServis Ltd., Říčařova 66, Hradec Králové, 503 01, Czech Republic
Keywords: Bombina, Pelophylax, chytridiomycosis, Batrachochytrium dendrobatidis, Czech Republic, PCR inhibition
Abstract The surveillance data of Batrachochytrium dendrobatidis presence collected in the Czech Republic in between 2008-2012 were analysed for the host preferences of the fungus and basic patterns of prevalence and infection intensity between species, age groups and localities. We checked for the possible bias in the data due to PCR inhibition. The clearly over-infected was the genus Pelophylax. However the genera Bombina and Bufo regularly carry infection, with first mortalities putatively caused by chytridiomycosis being detected. Differences between localities seem to modulate the proliferation of the pathogen and the overall result of individual infections by the fungus. The PCR inhibition occurred significantly more often in samples from the genus Pelophylax. Within the Bombina spp. we did not find any completely inhibited samples, however the GE values were lower within the sample set done with and without BSA in the reaction mixture. We propose that the water frogs of genus Pelophylax possess traits allowing these frogs to transmit the pathogenic fungus, while other species are in the role of potential victims. It is possible that Pelophylax frogs evaded the recognition of their role in B. dendrobatidis spread due to a large amount of false negatives and overall understatements of their prevalence and infection intensity.
Introduction Batrachochytrium dendrobatidis (further referred as Bd) is a novel fungal pathogen infecting wide range of amphibians (Olson et al. 2013), often causing wide impact on populations including mortalities (Bosch et al. 2001, Lips et al. 2006, Schloegel et al. 2006, Vredenburg et al. 2010). There is a substantial variability in susceptibility to infection and incidence of disease outbreaks between different taxa (Searle et al. 2011, Baláž et al. in press) influenced by geographic, life history and habitat factors (Becker et al. 2012, Murray & Skerratt 2012). The pathogen´s original biological and geographic setting is still an object of lively debate (Weldon et al. 2004, Fisher 2009, Schloegel et al. 2012), yet it seems to be clear that the major part of the pathogen’s impact is caused by novel genetic lineages that spread across the world (James et al. 2009, Farrer et al. 2011, Schloegel et al. 2012). The impact of chytridiomycosis in Europe seems to be localised to few sites of mass mortality (Bosch et al. 2007, Bielby et al. 2009) and population declines (Stagni et al. 2004, Bosch & Rincon 2008), despite the broad distribution across the continent and present amphibian taxa (Garner et al. 2005, Ohst et al. 2011, Baláž et al. in press). The Czech Republic is inhabited by a rich assemblage of amphibian species (13 Anurans and 8 Caudates). The area is lined by edges of distribution ranges (e.g. Bufo calamita) and patchy by separated populations with strong insular effect (e.g. B. variegata in western Bohemia, Lissotriton montandoni in east and L. helveticus in west). Most of the species have a very wide distribution across Europe (exceptions: Lissotriton montandoni, Triturus carnifex and T. dobrogicus). Many Czech populations are considered vulnerable to declines, or are believed to have already experienced declines (Mikátová & Vlašín 2002, Zavadil & Moravec 2003). All amphibians in the Czech Republic receive legal protection and several are part of direct conservation efforts. Although European and global mapping of the amphibian chytrid fungus datasets have been recently analysed with interesting results on host preference (Baláž et al. in press) and geographic predictions (Olson et al. 2013), more localised well analysed investigations for the area around the Czech Republic are absent. Outcomes of the Bd monitoring in the Czech Republic since 2008 till 2012 were so far restricted to simple lists of positive/negative results (Civiš et al. 2012) and presented mostly on local conferences, e.g. Baláž et al. (2009). When all the generated data are summarized, it allows running robust tests of the preference for species, age group and site effects. Results of such analyses can then be used to prioritize the areas and species when designing surveillance schemes, conservation projects and detection
of potential negative effects on amphibian populations. However possible biases due to undergone development of used detection methods have to be avoided. Materials and Methods The sampling took place at 9 areas (Figure 1) throughout the Czech Republic from 2010 to 2012 and the obtained data were amended with previous results (Civiš 2008, Civiš et al. 2012, Baláž et al. in press, V. Baláž unpub. data). The overall dataset contained 1562 samples from 15 species, collected at various types of habitats (e.g. ephemeral puddles, man constructed reservoirs, sky ponds on spoil banks, fish breeding ponds, natural wetlands). The animals were caught by hand or by landing nets. Each individual was manipulated with a new pair of gloves. Used nets and other equipment were dried out completely or a new set was use between localities. The overall sampling procedure followed the method of Hyatt et al. (2007). The adult and juvenile amphibians were sampled by taking smears from the pelvic patch, ventral surface of legs and feet using a fine-tipped swab (MW100-100; Medical Wire & Equipment Co). When sampling tadpoles, mouth discs were swabbed. The samples were let dry and were stored in 4°C until processing. Basic data on species, age group (adult; subadult = post-metamorphic animal not yet reaching maturity; tadpole), locality and date of sampling were collected. The laboratory sample processing took place at University of Veterinary and Pharmaceutical Sciences Brno following the guidelines of Boyle et al. (2004) and Hyatt et al. (2007) with slight modifications. The infection status was detected using Bd specific qPCR (Boyle et al. 2004), with addition of BSA to reduce PCR inhibition (Garland et al. 2010), however no internal positive controls were used (Hyatt et al. 2007). The reactions were run in triplicates in Light Cycler 480 II system with reaction volume of 10µl, using original reagents designed for the Light Cycler system. A sample was considered positive by criteria described by Hyatt et al. (2007): measured genomic equivalents were over 0.1, sample produced clear sigmoid growth of fluorescence, the standard deviation between wells did not reach the detected quantity, the standards performed in normal way. Genomic standards were obtained from the Institute of Zoology, Zoological Society of London. Part of the dataset originated from previously published data which were obtained by the original method of Boyle et al. (2004) without addition of BSA or detection of inhibition. Therefore, we needed to account for this difference. We re-checked part of the old samples from 2010 using two reaction settings – one containing the IPC (Hyatt et al. 2007) to detect
the presence of PCR inhibition and second with the BSA (Garland et al. 2010) to detect potential positives that were not detected originally. As we were limited in the resources and availability of older samples we used only sample subsets. To assess whether taxonomy played a role in the incidence of PCR inhibition we used samples from six taxa (Bufo bufo n=30, Bufo viridis n=43, Bombina bombina n=43, Pelophylax spp. n=39, Pelobates fuscus n=9 and Rana dalmatina n=8). Statistical analyses The data from individual species were grouped by genera in case of Pelophylax, Rana and Bufo to obtain fewer groups with higher number of datapoints. Grouping Pelophylax was also inevitable as the subadult stages of the three species (P. ridibundus, P. lessonae and the hybridogenic P. kl. esculentus) are practically indistinguishable in field conditions. First of all analyses was the comparison of the datasets (all data vs. data with the use of BSA; Table 1 and 2). Confidence intervals and frequency analysis by chi-square tests were computed. To check for yearly changes detected by our dataset we plotted the data from the Bombina spp. as the taxon seems to be the most reliable target for surveillance, and eventual trends in temporary change are expected to be most apparent. Using the permutation analysis as described in detail in (Baláž et al. in press) and (Bielby et al. 2006), we tested which of the taxa showed higher than average chance to carry infection. To demonstrate the possible bias due to presence of false negatives we performed the permutation tests on both the complete dataset (years 2008-2012) as well as on the dataset that contained only data obtained by the improved detection method (2010-2012). For each dataset from three selected taxa (Bombina bombina, Bombina variegata and Pelophylax spp.) which contained only data generated with the use of BSA, we tested whether infection load (defined as GE) differed between the age group and the localities, and whether there was interaction between these two. We used GLM with infection intensity (genomic equivalents of a zoospore, further referred as GE) as response variable with negative binomial distribution (Crawley 2007), and age group and locality as explanatory variables. To be able to use the GE values, that are by rule fractions (being a mean of three separated qPCR reactions) with negative binomial distribution, which operates only with whole numbers, we needed to transform the values at first. This was done by rounding each GE value on two decimals and then multiplication by 100. Simple rounding toward integers would conceal
differences within the small infection loads and cause some of the data points to turn into zero values. The basic statistical analyses (mean prevalence and Sterne’s confidence intervals) were run using Quantitative Parasitology (Rózsa et al. 2000), permutation analyses and generalized linear models (GLM) were performed in R statistical freeware, version 2.15.0 (R Development Core Team, 2009). Results Infection by Bd was detected in 9 out of 15 tested species and in all 9 areas, yet not all localities (Figure 1). The infection intensity had a great span from the lower limit of detection up to 13750±21 GE (found in Bufo viridis, individual that died shortly after sampling (V. Baláž unpub. data). High infection loads were most commonly found in subadults of Pelophylax and Bombina variegata. The only case of field observed mortality in B. variegata occurred in animal with GE 8294±3261 at the end of September 2012. No mortalities were ever found in field among Pelophylax despite the highest intensity reaching GE 7655±2213. According to the global dataset the Bd was encountered most often in Bombina bombina, Bombina variegata and genus Pelophylax (Table 1). However when data from detections with PCR inhibition reduced were analysed separately the results showed striking differences: the prevalence of Pelophylax was 1.5 × higher than in the compiled dataset and the prevalence in Bufo spp. grew by 6 × (this being likely influenced by limited sample size of Bufo in the second dataset). However the prevalence in neither Bombina species showed any major change (Table 2). The difference can be partially explained by the variable incidence of PCR inhibition between taxa. Although the overall rate of inhibition (24 %) was similar to already published results (Hyatt et al. 2007), there was significant difference within the six species we included in the analysis (Chi-square stat. = 77.144, p<0.001). The highest proportion of completely inhibited samples was found in genus Pelophylax (74 % samples being inhibited!), both Bufo bufo and Bufo viridis contained inhibited samples as well, while in the sample sets of Rana dalmatina, Pelobates fuscus and Bombina bombina all IPC reactions performed similarly to the standards (Table 3). The dataset of yearly changes of prevalence based on Bombina spp. results did not show any significant trend (Figure 2). The effect of BSA treatment on GE values detected in positive samples was significant according to Mann Whitney test.
The GLM results for all 3 tested taxa showed that both locality and age influence the detected GE value (Table 4). Interaction of locality and age was significant in both Pelophylax and B. variegata, while non-significant in B. bombina. The effect of locality was very strong in all 3 taxa, suggesting the external environment effects the proliferation of the fungus. Discussion Altogether 19 of the 21 species present in the Czech Republic have been reported to carry infection by the chytrid fungus directly in the country or in surroundings (Ohst et al. 2011, Sztatecsny & Glaser 2011, Baláž et al. in press). This is in accordance with the trend that widespread species have higher chance of acquiring infection (Murray & Skerratt 2012). This setting seems to be proper for the analysis of host selectivity of the fungus. While all common amphibians in the Czech Republic can get infected, only two genera frequently carry the pathogen: Bombina and Pelophylax. Permutation analyses of both used datasets showed significant over-infection of the genus Pelophylax. The position of Bombina species changed between the datasets, but in general it can be considered as a good target for Bd surveillance as it carried constant intermediate infection rates. The remaining taxa did not contain sufficiently large sample sizes to consider the results as definitive. The detected taxonomic pattern of infection is partially in accordance to previous results of the authors (Baláž et al. in press) as well as published literature (Ohst et al. 2011, Sztatecsny & Glaser 2011). The differences between taxa in proneness to infection are present even in localities inhabited by several species, e.g. locality Temelín (details in Appendix 1.). This supports the role of biological differences in ability to avoid or clear infection within the studied amphibians. There is a great risk of biased results if data collected by different methods are incorporated into one analysis. This clearly applies even to molecular DNA detection methods differing only in one “small” detail. More importantly, the observation that taxa differ non-randomly in the amount of PCR inhibition warns against the use of such data. Our sampling was far from sufficient to allow re-calculating the results from past obtained using the old protocol e.g. Civiš et al. (2012), and also it is clear that other factors than taxonomy influence the inhibition. We perceive this as an important problem of the present and future global analyses based on the data shared among different research teams (Fisher et al. 2009, Olson et al. 2013, Baláž et al. in press). The databases should contain specification of exact detection method
used (or whether inhibition was accounted for) if assessments of false patterns of pathogen presence are to be avoided. The observation of great variability of infection intensity among localities shows the role of external environment in the infection outcomes. The strong interaction between the age and locality in B. variegata suggests that different habitat conditions modulate the infection between age groups, some conditions pose risk to adults, other to juveniles. The difference in infection prevalence between Bombina bombina and B. variegata is quite intriguing. Lack of cases of high infection loads in B. bombina may imply it possesses ability to prevent infection proliferation. On the other hand, B. variegata and the frogs of Pelophylax genus repeatedly carry infection loads in order of thousands GE. Our data are too scarce to assess the impact of infection to these species, but already published literature provides some support for that. Pelophylax spp. were reported as carriers of the infection with no observed morbidities or mortalities (Di Rosa et al. 2007, Baláž et al. in press). Experimental work on this taxon (Woodhams et al. 2012) showed susceptibility to infection but high resistance to the disease itself ‒ mortality associated with chytridiomycosis was exceptional even in animals artificially infected with high pathogen doses. B. variegata on the other hand experienced local population declines (Stagni et al. 2004, Canestrelli et al. 2013) linked with the B. dendrobatidis. Whether the anecdotic report of B. variegata population decrease up to 90 % from western parts of the Czech Republic in 1990s (Mikátová & Vlašín 2002) is as well linked to the pathogen requires further historical analyses. There is a limited evidence of B. variegata juveniles experiencing high chytrid-linked mortality during hibernation (R. Rozínek unpub. data). However our four years of surveillance support the idea that the level of prevalence in Bombina spp. is in a stable, probably endemic stage. Given the observed patterns of infection prevalence, infection intensity and detected mortality we can assume the two taxa Pelophylax spp. and Bombina variegata are the most important for B. dendrobatidis spread, persistence and impact in the area. In years with exceptionally good conditions the Pelophylax froglets are produced in thousands and disperse to all available water bodies (including flowing water, ephemeral puddles, intensive fish production ponds – V. Baláž pers. obs.). Although there is no study on the dispersal distances achieved by juveniles, the adult Pelophylax frogs are known to move several kilometres (Tunner 1991, Holenweg & Peter 2001). If the juvenile frogs carry infection, several factors triggering chytridiomycosis outbreaks are accumulated (Briggs et al. 2010) – the overcrowding of puddles, inflow of new animals susceptible to infection able to allow the pathogen
proliferation and high re-infection rates. If disease susceptible species are present in such setting, we can expect such species to experience mortality events caused by the disease, as observed in the case of B. variegata and B. viridis in our data. Construction of water bodies that support high Pelophylax population in habitats where they would otherwise be rare or absent can trigger disease outbreaks in more susceptible species. Well-meant projects can thus lead to facilitating disease transmission and outbreaks eventually leading to reduction of more susceptible species. Furthermore Pelophylax are common in fish production ponds and live fish transports, which represent one of the important modes of pathogen transmission (Peeler et al. 2011). If conservation and disease mitigation are planned using data biased by the nonrandom PCR inhibition, even species that have great impact on the spread and persistence of the pathogen could be listed as unimportant and thus omitted. Acknowledgments This study was supported by the Czech University of Life Sciences Prague (grant no. 42110/1313/3111) and by Technology Agency of the Czech Republic (grant no. TA01020881). Bibliography Baláž V, Balážová A, Haleš J (2009) Epidemická nemoc obojživelníků už i v ČR. In: Bryja J, Řehák Z, Zukal J (eds) Zoologické dny. Institute of Vertebrate Biology. AS CR, Brno, p 25 Baláž V, Vörös J, Civiš P, Vojar J and 9 others (in press) Assessing risk and guidance on monitoring of Batrachochytrium dendrobatidis in Europe through identification of taxonomic selectivity of infection. Conserv Biol provisionally accepted for publication (4.4.2013) Becker CG, Rodriguez D, Longo AV, Talaba AL, Zamudio KR (2012) Disease risk in temperate amphibian populations is higher at closed-canopy sites. PLoS ONE 7: e48205 Bielby J, Bovero S, Sotgiu G, Tessa G and 7 others (2009) Fatal chytridiomycosis in the Tyrrhenian painted frog. EcoHealth 6:27-32 Bielby J, Cunningham AA, Purvis A (2006) Taxonomic selectivity in amphibians: Ignorance, geography or biology? Anim Conserv 9:135-143 Bosch J, Carrascal LM, Duran L, Walker S, Fisher MC (2007) Climate change and outbreaks of amphibian chytridiomycosis in a montane area of Central Spain; is there a link? Proc. R. Soc. B 274:253-260 Bosch J, Martinez-Solano I, Garcia-Paris M (2001) Evidence of a chytrid fungus infection involved in the decline of the common midwife toad (Alytes obstetricans) in protected areas of Central Spain. Biol Conserv 97:331-337 Bosch J, Rincon PA (2008) Chytridiomycosis-mediated expansion of Bufo bufo in a montane area of Central Spain: An indirect effect of the disease. Divers Distrib 14:637-643 Boyle DG, Boyle DB, Olsen V, Morgan JAT, Hyatt AD (2004) Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time TaqMan PCR assay. Dis Aquat Org 60:141-148 Briggs CJ, Knapp RA, Vredenburg VT (2010) Enzootic and epizootic dynamics of the chytrid fungal pathogen of amphibians. Proc Natl Acad Sci USA 107:9695-9700
Canestrelli D, Zampiglia M, Nascetti G (2013) Widespread occurrence of Batrachochytrium dendrobatidis in contemporary and historical samples of the endangered Bombina pachypus along the Italian peninsula. PLoS ONE 8:e63349 Civiš P (2008) Problematika chytridiomykóz u obojživelníků. Bachelor thesis. Czech University of Life Sciences, Prague. Civiš P, Vojar J, Baláž V (2012) Current state of Bd occurrence in the Czech Republic. Herp Rev 43:150-159 Crawley MJ (2007) The R Book. John Wiley & Sons Ltd., Chichester, England Di Rosa I, Simoncelli F, Fagotti A, Pascolini R (2007) Ecology - the proximate cause of frog declines? Nature 447:E4-E5 Farrer RA, Weinert LA, Bielby J, Garner TWJ and 11 others (2011) Multiple emergences of genetically diverse amphibian-infecting chytrids include a globalized hypervirulent recombinant lineage. Proc Natl Acad Sci USA 108:18732-18736 Fisher MC (2009) Endemic and introduced haplotypes of Batrachochytrium dendrobatidis in Japanese amphibians: Sink or source? Mol Ecol 18:4731-4733 Fisher MC, Garner TWJ, Walker SF (2009) Global emergence of Batrachochytrium dendrobatidis and amphibian chytridiomycosis in space, time, and host. Annu Rev of Microbiol 63:291-310 Garland S, Baker A, Phillott AD, Skerratt LF (2010) BSA reduces inhibition in a TaqMan assay for the detection of Batrachochytrium dendrobatidis. Dis Aquat Org 92:113-116 Garner TWJ, Walker S, Bosch J, Hyatt AD, Cunningham AA, Fisher MC (2005) Chytrid fungus in Europe. Emerg Infect Dis 11:1639-1641 Holenweg Peter AK (2001) Dispersal rates and distances in adult water frogs, Rana lessonae, R. ridibunda, and their hybridogenetic associate R. esculenta. Herpetologica 57:449-460 Hyatt AD, Boyle DG, Olsen V, Boyle DB and 11 others (2007) Diagnostic assays and sampling protocols for the detection of batrachochytrium dendrobatidis. Dis Aquat Org 73:175-192 James TY, Litvintseva AP, Vilgalys R, Morgan JAT and others (2009) Rapid global expansion of the fungal disease chytridiomycosis into declining and healthy amphibian populations. PLoS Pathog 5: e1000458 Lips KR, Brem F, Brenes R, Reeve JD and 6 others (2006) Emerging infectious disease and the loss of biodiversity in a neotropical amphibian community. Proc Natl Acad Sci USA 103:3165-3170 Mikátová B, Vlašín M (2002) Ochrana obojživelníků (Protection of Amphibians). Czech Union for Nature Conservation, Brno Murray KA, Skerratt LF (2012) Predicting wild hosts for amphibian chytridiomycosis: Integrating host lifehistory traits with pathogen environmental requirements. Hum Ecol Risk Assess 18:200-224 Ohst T, Gräser Y, Mutschmann F, Plötner J (2011) Neue erkentnisse zur gefährdung europäischer Amphibien durch der Hautpilz Batrachochytrium dendrobatidis. Zeits Feldherp 18:1-17 Olson DH, Aanensen DM, Ronnenberg KL, Powell CI & Bd Grp. (2013) Mapping the global emergence of Batrachochytrium dendrobatidis, the amphibian chytrid fungus. PLoS ONE 8: e56802 Peeler EJ, Oidtmann BC, Midtlyng PJ, Miossec L, Gozlan RE (2011) Non-native aquatic animals introductions have driven disease emergence in Europe. Biol Invasions 13:1291-1303 R Development Core Team (2009) R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria Rózsa L, Reiczingel J, Majoros G (2000) Quantifying parasites in samples of hosts. J Parasitol 86:228-232 Searle CL, Gervasi SS, Hua J, Hammond JI, Relyea RA, Olson DH, Blaustein AR (2011) Differential host susceptibility to Batrachochytrium dendrobatidis, an emerging amphibian pathogen. Conserv Biol 25:965-974 Schloegel LM, Hero JM, Berger L, Speare R, McDonald K, Daszak P (2006) The decline of the sharp-snouted day frog (Taudactylus acutirostris): The first documented case of extinction by infection in a freeranging wildlife species? EcoHealth 3:35-40
Schloegel LM, Toledo LF, Longcore JE, Greenspan SEand others (2012) Novel, panzootic and hybrid genotypes of amphibian chytridiomycosis associated with the bullfrog trade. Mol Ecol 21:5162-5177 Stagni G, Dall’Olio R, Fusini U, Mazzotti S, Scoccianti C, Serra A (2004) Declining populations of Apennine yellow bellied toad Bombina pachypus in Northern Apennines (Italy): Is Batrachochytrium dendrobatidis the main cause? Ital J Zool 71(Suppl 2):5-13 Sztatecsny M & Glaser F (2011) From the eastern lowlands to the western mountains: First records of the chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis in wild amphibian populations from Austria. Herpetol J 21:8790 Tunner HG (1991) Locomotory behaviour in water frogs from Neusiedlersee (Austria, Hungary). 15 km migration of Rana lessonae and its hybridogenetic associate Rana esculenta. In: Korsos Z, Kiss I (eds) Proc Sixth Ord Gen Meet SEH, Budapest, p 449-452 Vredenburg VT, Knapp RA, Tunstall TS, Briggs CJ (2010) Dynamics of an emerging disease drive large-scale amphibian population extinctions. Proc Natl Acad Sci USA 107:9689-9694 Weldon C, du Preez LH, Hyatt AD, Muller R, Speare R (2004) Origin of the amphibian chytrid fungus. Emerg Infect Dis 10:2100-2105 Woodhams DC, Bigler L, Marschang R (2012) Tolerance of fungal infection in european water frogs exposed to Batrachochytrium dendrobatidis after experimental reduction of innate immune defenses. BMC Vet Res 8:197 Zavadil V., Moravec J. (2003): Červený seznam obojživelníků a plazů České republiky (Red List of Amphibians and Reptiles of the Czech Republic). Příroda, Praha, 22: 83-93.
Table 1: Results of permutation tests using the complete dataset not accounting for different detection approaches; Bd+ stands for number of positive results of Bd infection, the 95 % confidence intervals and mean prevalence are shown, p-values of permutation analyses for overinfection and underinfection: − taxon with no significant trend, ↑ taxon infected significantly more often and ↓ taxon infected less often than the background prevalence. Taxon
Sample size
Bd+ 95 % CI max 95 % CI min prevalence
p-value ↑
p-value↓ result
Bombina bombina
513
72
17 %
11%
14.0 %
0.2704
0.7844
−
Bombina variegata
425
85
24 %
17%
20.0 %
0.0000
1.0000
↑
Pelophylax sp.
173
36
28 %
15%
20.8 %
0.0025
0.9987
↑
Bufo spp.
260
12
8%
3%
4.6 %
1.0000
0.0000
↓
Rana spp.
29
0
12 %
0%
0.0 %
1.0000
0.0168
↓
Pelobates fuscus
31
0
11 %
0%
0.0 %
1.0000
0.0130
↓
Triturus s.l. Salamandra salamandra
109
1
5%
0%
0.9 %
1.0000
0.0000
↓
0.0 % 13.2 %
1.0000
0.0470
↓
22 0 15 % 0% 1562 206 Chi-square statistic = 69.805, d.f. =7, min exp. count 2.9, P-value ˂0.001
Table 2: Results of permutation tests using only the data obtained with PCR inhibition suppressed by BSA. Taxon
samplesize
Bd+
Bd-
95% CI max
Bombina bombina
289
44
245
20 %
11 %
15 %
Bombina variegata
399
80
319
24 %
16 %
Pelophylax sp.
109
34
75
41 %
Bufo spp.
39
11
28
Pelobates fuscus
27
0
Pleurodelinae
39
Salamandra salamandra
12 914
Chi-square statistic = 32.057 df = 6
p-value↓
result
0.9731
0.0413
−
20 %
0.1861
0.8585
−
23 %
31 %
0.0006
0.9996
↑
45 %
16 %
28 %
0.0868
0.9588
−
27
12 %
0%
0%
1
0.0017
↓
1
38
14 %
0%
3%
0.9996
0.0025
↓
0 170
12 744
24 %
0%
0% 19 %
NA
NA
Min. expected count: 2.2 P-value ˂ 0.001
95% CI min prevalence p-value ↑
Table 3: Inhibition incidence between some amphibian taxa. Species
N
complete % of inhibited inhibition samples 43 5 12 % Bufo viridis 30 7 23 % Bufo bufo 43 0 0% Bombina bombina 74 % Pelophylax 39 29 9 0 0% Pelobates fuscus 8 0 0% Rana dalmatina 172 41 24 % Chi-square statistic=77.144, df = 5, Min. expected count: 1.9 P-value ˂ 0.001
95% CI min 5% 11 % 0% 58 % 0% 0%
95% CI max 25 % 42 % 9% 86 % 32 % 36 %
Table 4: Effects of locality (loc), age stage (age) and their interaction in three taxa with sufficient amount of data. A separate GLM was used for each taxa. In case of Pelophylax spp., it was not possible to compute interaction between the locality and age stage, because not all age stages occurred at all localities. Taxa Variable Bombina bombina Bombina variegata Df p Df p loc 5 <10-3 7 0.001 age 1 <10-4 2 <10-6 loc:age 2 0.22 3 <10-4
Pelophylax spp. Df p 2 <10-5 1 0.43 -
Figure 1: Map of sampling. Full circles representing positive localities, empty circles localities with no B. dendrobatidis detected based on all collected data between 2008 – 2012. The pie charts show proportion of infected individuals based on data produced by the upgraded protocol.
Figure 2: Temporal changes within the Bombina spp., no detectable differences between years based on chi-square test of the year summary results (Chi-square statistic = 0.412, df = 3, P-value = 0.938).
Appendix 1: Summary of all surveillance data from the Czech Republic 2008 – 2012. number of samples
Bd positive Reference if data from literature
year
locality
GPS
Species
life stage (adult, subadult,tadpole)
2011
Moravský písek, pískovna
49° 0'37.40"N, 17°20'35.33"E
Bombina bombina
adult
33
6
2012
Ledce – pískovna
50°21'37.777"N, 15°5'18.044"E
Bombina bombina
adult
14
0
2012
rybník Strašidlo
50°23'41.986"N, 15°27'13.011"E Bombina bombina
adult
4
2
2012
rybník Hluboký
50°23'5.248"N, 15°27'6.381"E
Bombina bombina
adult
17
3
2012
Dobrá Voda, Hořice
Bombina bombina
adult
33
6
2012
Temelín
50°20´19.44''N 15°36´16.47'E' aprox 49° 10' 49.13"N 14°22'33.56"E
Bombina bombina
adult
23
0
2012
Dobrá Voda, Hořice
50°20´19.44''N E15°36´16.47''E
Bombina bombina
subadult
2
2
2012
rybník Strašidlo
50°23'41.986"N, 15°27'13.011"E Bombina bombina
subadult
30
4
2012
rybník Hluboký
50°23'5.248"N, 15°27'6.381"E
Bombina bombina
subadult
13
6
2011
Růžodolská
50°34'57.166"N, 13°37'23.292"E Bombina bombina
subadult
16
4
2012
Ledce – pískovna
50°21'37.77"N, 15°5'18.044"E
Bombina bombina
subadult
16
1
2011
Moravský písek, pískovna
49° 0'37.40"N, 17°20'35.33"E
Bombina bombina
tadpole
10
0
2012
rybník Strašidlo
50°23'41.986"N, 15°27'13.011"E Bombina bombina
tadpole
30
0
2011
Velké Karlovice
49°23'2.68"N 18°18'18.89"E
Bombina variegata adult
18
2
2011
pravý svah nad Salaškou
49°8'7.25"N 17°20'28.27"E
Bombina variegata adult
3
0
2011
nad Salašem
49° 8' 44.42"N 17°20'14.91"E
Bombina variegata adult
2
1
2011
Chřiby, hasičská nádrž Salaš
49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E
Bombina variegata adult
17
7
2011
nad Salašem pod památníkem
49° 8'52.94"N 17°19'57.45"E
Bombina variegata adult
1
0
2011
Cesta Vlčák – Samota
49° 9'16.68"N 17°16'56.16"E
Bombina variegata adult
1
0
2011
odbočka k Stříleckému hradu Skelná Huť, zelená značka na Cimburk 300m od mostu přes Kyjovku
49° 7'49.92"N 17°13'41.63"E
Bombina variegata adult
2
0
49° 6'26.40"N 17°13'48.99"E
Bombina variegata adult
6
2
2011
Skelná Huť, zelená značka na Cimburk, SV roh velke paseky
49° 6'16.34"N 17°13'47.83"E
Bombina variegata adult
1
0
2011
Cimburk, hradní rybníček
49° 5'59.82"N 17°13'11.05"E
Bombina variegata adult
7
0
2011
pod Cimburkem
49° 5'54.80"N 17°12'35.68"E
Bombina variegata adult
1
0
2012
49° 5'59.82"N 17°13'11.05"E
Bombina variegata adult
7
0
2012
Cimburk, hradní rybníček Cimburk, svah pod žlutou značkou směr U Křížku 1
49° 5' 54.32"N 17° 12' 25.89"E
Bombina variegata adult
8
1
2012
Chřiby, Halenkovické údolí
49° 11' 16.14"N 17° 26' 35.85"E
Bombina variegata adult
26
8
2012
Chřiby, hasičská nádrž Salaš
49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E
Bombina variegata adult
16
3
2012
Chřiby, Jankovické údolí
49° 10' 4.01"N 17° 22' 25.69"E
Bombina variegata adult
6
0
2012
Chřiby, Nad Zlackou studánkou 49° 9' 1.33"N 17° 22' 4.38"E Chřiby směs neg. Lok (Ocásek, Pila, Kudlovice, Pěkná hora, Pod Hroby, Serpentína u Krytin, Stříbrník)
Bombina variegata adult
2
0
Bombina variegata adult
18
0
49° 6' 5.28"N 17° 13' 52.86"E
Bombina variegata adult
8
2
49° 6'26.40"N 17°13'48.99"E
Bombina variegata adult
11
3
2012
Pod Kazatelnou Skelná Huť, zelená značka na Cimburk 300m od mostu přes Kyjovku Skelná Huť, zelená značka na Cimburk, SV roh velke paseky
49° 6'16.34"N 17°13'47.83"E
Bombina variegata adult
4
1
2012
Zlechovský potok pod Kozincem
49° 7' 18.95"N 17°18' 34.32"°E
Bombina variegata adult
4
2
2012
Dobřany u Plzně
Bombina variegata adult
33
2
2011
Chřiby, hasičská nádrž Salaš
49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E
Bombina variegata subadult
16
0
2012
Chřiby, Halenkovické údolí
49° 11' 16.15"N 17° 26' 35.86"E
Bombina variegata subadult
30
26
2012
Chřiby, hasičská nádrž Salaš Chřiby, Hodělčina, retenční nádržka
49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E
Bombina variegata subadult
23
0
49° 7'19.45"N 17°21'46.90"E
Bombina variegata subadult
2
0
Chřiby, Jankovické údolí 49° 10' 4.01"N 17° 22' 25.7"E Cimburk, svah pod žlutou 49° 5' 54.33"N 17° 12' 25.9"E značkou směr U Křížku 1 Chřiby, hasičská nádrž Salaš 49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E Chřiby směs neg. Lok (Ocásek, Pila, Kudlovice, Pěkná hora, Pod Hroby, Serpentína u Krytin, Stříbrník)
Bombina variegata subadult
2
2
Bombina variegata subadult Bombina variegata subadult
2 7
1 5
Bombina variegata subadult
2
0
2011
2012 2012 2012
2012 2012 2012 2012 2012
Skelná Huť, zelená značka na Cimburk, SV roh velke paseky
49° 6'16.34"N 17°13'47.83"E
2012
Zlechovský potok pod Kozincem
2011
Chřiby, hasičská nádrž Salaš
2011
2012
nad Salašem pod památníkem Skelná Huť, zelená značka na Cimburk 300m od mostu přes Kyjovku Skelná Huť, zelená značka na Cimburk, SV roh velke paseky Skelná Huť, zelená značka na Cimburk 300m od mostu přes Kyjovku
2011
Chřiby, hasičská nádrž Salaš
2012
2012
Bombina variegata subadult
9
4
49° 7' 18.95"N 17° 18' 34.32"E
Bombina variegata subadult
7
0
49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E
Bombina variegata tadpole
9
0
49° 8'52.94"N 17°19'57.45"E
Bombina variegata tadpole
21
0
49° 6'26.40"N 17°13'48.99"E
Bombina variegata tadpole
2
2
49° 6'16.34"N 17°13'47.83"E
Bombina variegata tadpole
19
0
49° 6'26.40"N 17°13'48.99"E
Bombina variegata tadpole
8
0
Bufo bufo
adult
1
0
Temelín
49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E aprox N 49.180314° E14.375991°
Bufo bufo
adult
1
0
2011
Vřesová + Erika, Z Čechy
N50.245044° E12.671663°
Bufo calamita
adult
27
4
2011
Chřiby, hasičská nádrž Salaš
49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E
bufo viridis
adult
1
0
2011
Vřesová + Erika, Z Čechy
Bufo viridis
adult
9
7
2012
Temelín
Pelophylax sp.
adult
10
4
2012
Pelophylax sp.
adult
1
0
2011
Temelín mokřad u rybníků severně od Mor. Písku
N 50° 12.766´ E 012° 36.341´ aprox 49°10'49.13"N 14°22'33.57"E aprox 49°10'49.13"N 14°22'33.57"E 49° 0'37.40"N, 17°20'35.33"E
Pelophylax
subadult
35
0
2012
Chřiby, Halenkovické údolí
49° 11' 18.51"N 17° 26' 29.05"E
Pelphylax sp.
subadult
33
11
2010
Moravský písek, pískovna
Pelophylax sp.
subadult
26
18
2012
4
1
49°9'33.630"N 17°17'33.727"E
adult
2
0
2012
Bojanovice, Praha
Pelophylax sp. Salamandra salamandra Salamandra salamandra
subadult
2011
Temelín Chřiby, Pod Vlčákem u přítoku Salašky
49° 0'37.40"N, 17°20'35.33"E aprox 49°10'49.13"N 14°22'33.57"E
adult
10
0
2012
Temelín
49°10'49.13"N 14°22'33.57"E
Triturus vulgaris
adult
7
0
2011 2011
aprox 49°10'49.13"N 14°22'33.57"E
Ichtyosaura alpestris
2012
Temelín
2011
Božice, Znojmo
48° 50' 15.22"N 16° 16' 57.35"E
Bombina bombina
adult
20
5
2009
Most, Růžodolská spoil bank
50°34'57.166"N, 13°37'23.29"E
Bombina bombina
adult
1
0
Balaz et al in press.
2009
Most, Růžodolská spoil bank
50°34'57.166"N, 13°37'23.29"E
Bombina bombina
subadult
15
3
Balaz et al in press.
2008
Prague, Albertov
50° 4'7.79"N, 14°25'31.99"E
Bufo bufo
adult
20
0
Balaz et al in press.
2008
Prague, Albertov
50° 4'7.79"N, 14°25'31.99"E
Bufo bufo
subadult
45
1
Balaz et al in press.
2008
Prague, Prokopské údolí
50° 2'38.71"N, 14°20'59.83"E
bufo bufo
adult
2
0
Balaz et al in press.
2008
Prague, Petřín
50° 4'45.08"N, 14°23'54.11"E
Bufo bufo
adult
2
0
Balaz et al in press.
2008
Prague, Petřín
50° 4'45.08"N, 14°23'54.11"E
Bufo bufo
subadult
5
0
Balaz et al in press.
2009
Most
50° 33' 46.34"N, 13° 34' 53.92"E Bufo bufo
adult
31
0
Balaz et al in press.
2009
Tuchoraz
50° 2' 59.999"N 14°50' 23.999"E Bufo bufo
adult
32
0
Balaz et al in press.
2008
Prague, Říčanský potok
50° 3'7.06"N, 14°35'27.84"E
Bufo viridis
adult
1
0
Balaz et al in press.
2008
Prague, Prokopské udoli
50° 2'38.71"N, 14°20'59.83"E
Pelophylax sp.
adult
35
0
Balaz et al in press.
2008
Prague, Říčanský potok
50° 3'7.06"N, 14°35'27.84"E
Pelophylax sp.
adult
26
2
Balaz et al in press.
2008
Prague, Říčanský potok
50° 3'7.06"N, 14°35'27.84"E
Rana temporaria
adult
5
0
Balaz et al in press.
2009
Tuchoraz
50° 2' 59.999"N 14°50' 23.999"E Rana temporaria
adult
1
0
Balaz et al in press.
2009
Most, Růžodolská spoil bank
50°34'57.166"N, 13°37'23.292"E Triturus cristatus
adult
30
0
Balaz et al in press.
2008
Prague, Albertov
50° 4'7.79"N, 14°25'31.99"E
Triturus vulgaris
adult
2
0
Balaz et al in press.
2008
Prague, Albertov
50° 4'7.79"N, 14°25'31.99"E
Triturus vulgaris
subadult
3
0
Balaz et al in press.
2009
Most, Růžodolská spoil bank
50°34'57.166"N, 13°37'23.292"E Triturus vulgaris
subadult
24
0
Balaz et al in press.
2009
Most, Růžodolská spoil bank
50°34'57.166"N, 13°37'23.292"E Triturus vulgaris
adult
7
0
Balaz et al in press.
2010
Karlovy Vary, Albeřické rybníky
50° 9'27.80"N, 13°10'56.47"E
Bombina bombina
adult
30
2
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Moravský písek, pískovna
49° 0'37.40"N, 17°20'35.33"E
Bombina bombina
adult
38
9
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Hrutov Karlovy Vary, rybník u obce Teleč
49°15'10.84"N, 15°41'35.77"E
Bombina bombina
adult
1
0
Civiš et al 2010 - Herp. Review
50° 7'18.11"N, 13° 3'25.68"E
Bombina bombina
subadult
36
1
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
adult
7
0
2010
Moravský písek, pískovna
49° 0'37.40"N, 17°20'35.33"E
Bombina bombina
subadult
19
1
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Hrutov
49°15'10.84"N, 15°41'35.77"E
Bombina bombina
subadult
9
0
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Most, Kopišťská spoil bank
50° 32'20.87"N 13° 35' 44.016"E Bombina bombina
subadult
30
3
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Most, Růžodolská spoil bank
subadult
39
3
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Temelín, Nuclear power plant
50°34'57.166"N, 13°37'23.292"E Bombina bombina aprox 49°10'49.13"N 14°22'33.57"E Bombina bombina
subadult
30
9
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Moravský Písek, pískovna
49° 0'37.40"N, 17°20'35.33"E
Bombina bombina
subadult
4
2
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Chřiby, hasičská nádrž Salaš
49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E
Bombina variegata adult
21
6
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Chřiby, hasičská nádrž Salaš
49° 8'28.68"N 17°21'55.46"E
Bombina variegata subadult
43
5
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Most, Hornojiřetínská spoil bank
subadult
40
0
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Moravský Písek, pískovna
tadpole
31
0
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Most, Růžodolská spoil bank
Pelobates fuscus Pelophylax 50°34'57.166"N, 13°37'23.292"E ridibundus
adult
3
0
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Most, Kopišťská spoil bank
NA
23
0
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Bojanovicve
50°34'57.166"N, 13°37'23.292"E Rana dalmatina aprox 49°10'49.13"N Salamandra 14°22'33.57"E salamandra
adult
10
0
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
4
0
Civiš et al 2010 - Herp. Review
49° 9'19.42"N, 17°21'20.83"E
Triturus cristatus Ichtyosaura alpestris
adult
2010
Most Chřiby, údolí Bunčovského potoka
adult
25
1
Civiš et al 2010 - Herp. Review
2010
Staré Město (u hřbitova)
49° 4'26.44"N, 17°27'5.34"E
Bufo viridis
adult
43
0
Civiš et al 2010 - Herp. Review
1562
206
Bufo bufo 49° 0'37.40"N, 17°20'35.33"E
Příloha č. 3: Článek do časopisu Acta Veterinaria Brno (manuskript přijat k publikování; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 0.431)
Příloha č. 4: Článek do časopisu Conservation Biology (manuskript přijat k publikování; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 4.692)
Příloha č. 5: Článek do časopisu Herpetological Journal (publikováno; impakt faktor pro rok 2012 ‒ 0.812)
Příloha č. 6: Článek do časopisu Herpetological Review (publikováno; recenzovaný časopis)
Příloha č. 7: Článek do časopisu Ochrana přírody (publikováno; recenzovaný časopis)
Příloha č. 8: Abstrakt z konference Zoologické dny 2013 (Brno)
Příloha č. 9: Abstrakt z konference Zoologické dny 2013 (Brno)
Příloha č. 10: Abstrakt z konference Zoologické dny 2013 (Brno)
Příloha č. 11: Abstrakt z konference Zoologické dny 2012 (Olomouc)
Příloha č. 12: Abstrakt z konference Zoologické dny 2011
Příloha č. 13: Abstrakt z konference Zoologické dny 2010
Příloha č. 14: Abstrakt z konference UCOLIS 2010
Příloha č. 15: Abstrakt z konference ECCB 2009
Příloha č. 16: Abstrakt z konference Zoologické dny 2009
