ENZIM DAN BIOENERGITIKA
Oleh: Mohammad Hanafi Dan Trimartini FK UNAIR 1
PENDAHULUAN MAKANAN
DICERNA
DIMETABOLISME
dalam saluran pencernaan
dalam sel
• METABOLISME : – KATABOLISME MOLEKUL YG LEBIH BESAR Æ MOLEKUL YG LEBIH KECIL GLUKOSA Æ CO2 + H2O + ENERGI
– ANABOLISME = SINTESIS MOLEKUL YG LEBIH KECIL Æ MOLEKUL YG LEBIH BESAR GLUKOSA Æ GLIKOGEN ENZIM
SEL
JARINGAN
ORGANISME
tersusun dari molekul2 REAKSI KIMIA
2
Organisme
sel
molekul enzim Endoplasmik retikulum
ribosom
cytoskeleton
inti
mitochondrion
Golgi app. sitosol
Sel eukariot
lisosom peroxisom 3
• I. BIOKIMIA SUSUNAN KIMIAWI PROSES2 KIMIA
• ENZIM :
DALAM ORGANISME virus, bakteri, tumbuhan, hewan, manusia
PROTEIN Æ BIOKATALISATOR
• ALUR METABOLIK E E E E E E E (A ) ⎯⎯→ (P ) B ←⎯→ C ←⎯→ D ←⎯→ E ←⎯→ F ←⎯→ G ⎯⎯→ 1
• • • •
2
3
4
5
6
7
A= substrat awal P= produk akhir B,C,D,E,F,G= senyawa2 antara (intermediates) E1 searah E. regulator
4
• LETAK ENZIM DALAM SEL – BERKAITAN DGN FUNGSI ORGANEL Ybs. – E. MITOKONDRIAL Æ REAKSI PENGADAAN ENERGI Reaksi oksidasi Æ Energi Rantai respirasi Æ dalam mitokondria
– E. RIBOSOMAL Æ SINTESIS PROTEIN
• KATALISATOR Æ mempercepat reaksi – IKUT SERTA DALAM REAKSI KIMIA & MEMPERCEPAT REAKSI KIMIA, TETAPI PD. AKHIR REAKSI AKAN DIDAPAT KEMBALI SEPERTI SEMULA – DIBUTUHKAN DLM. JUMLAH KECIL CELAH AKTIF
E
+
+
S KOMPLEKS [ES]
E
P 5
• 1. 2. 3. 4.
KATALISATOR INORGANIK H+, OH-, Pt E. aktivasi ↓ -
1. 2. 3. 4.
ENZIM PROTEIN Æ biokatalisator E aktivasi ↓↓ BEREAKSI SPESIFIK TIDAK TAHAN PANAS
6
kead. transisi tanpa katalisator
E. bebas
E. level
=
G Ea Ea'
dgn katalisator inorg dgn enzim
Ea'' kead. awal
ΔG = Perubahan E. bebas kead. akhir
Perjalanan reaksi 7
keadaan awal Æ pd suhu tertentu Reaksi kimia : A Æ P Lab kimia : dipanasi di + katalisator Sistem biologis : - suhu konstan - + Enzim A+B C+D ΔG = 0 → seimbang ΔG < 0 → Rx ke kanan bersifat eksergonik ΔG > 0 → Rx ke kanan bersifat endergonik 8
• Ea = ENERGI AKTIVASI ÆJUMLAH ENERGI YG DIPERLUKAN UNTUK MEMBAWA SEMUA MOLEKUL DLM. 1 MOLE SUATU BAHAN PD. SUATU SUHU TERTENTU DR. KEADAAN AWAL MENUJU KEADAAN TRANSISI ÆMENGATASI HAMBATAN ENERGI • ΔG : PERUBAHAN ENERGI BEBAS Æ TIDAK DIPENGARUHI KATALISATOR
9
ENZIM BEREAKSI SPESIFIK artinya : SUATU ENZIM HANYA DAPAT BEREAKSI DGN. SUATU SUBSTRAT TERTENTU atau PD. SEJUMLAH KECIL SENYAWA SEJENIS CONTOH : LAKTOSA Æ GLUKOSA + GALAKTOSA Laktase Heksokinase : - GLUKOSA - HEKSOSA LAIN: FRUKTOSA DAYA IKAT (AFINITASNYA) BEDA Æ Km beda
10
• KEKHUSUSAN ENZIM – K. ABSOLUT – K. RELATIF – K. OPTIK Æ MALTASE Æ α – K. GUGUS Æ ALKOHOL DEHIDROGENASE • DIPENGARUHI OLEH: – IKATAN E-S active site – SIFAT GUGUS KATALITIK – KOFAKTOR E
•
S
A+B ⎯ ⎯→ C 2x 2A + 2B ⎯⎯→ 2C 3x 3A + 3B ⎯⎯→ 3C x
• E / K TIDAK BERHUBUNGAN SECARA STOIKIOMETRIK DENGAN REAKTAN / PRODUK 11
KLASIFIKASI & TATANAMA ENZIM •
NAMA ENZIM – DULU Æ SEDERHANA Mis: EMULSIN, PTYALIN – ‘S’ + ASE Mis: UREASE, LIPASE JENIS REAKSI + ASE Mis: TRANSFERASE, DEHIDROGENASE ‘S’ + JENIS REAKSI + ASE Mis: MALAT DEHIDROGENASE ‘S’ Jenis reaksi – TATANAMA ENZIM IUBMB: REAKSI & ENZIMNYA DIBAGI DALAM 6 KELAS UTAMA 2. NAMA ENZIM T.D. 2 BAGIAN: 1.
Bgn. 1 Æ NAMA SUBSTRAT Bgn. 2 Æ JENIS REAKSI + ASE 12
KLASIFIKASI & TATANAMA ENZIM (lanjutan)
Mis: 1.1.1.1 Alkohol : NAD Oksidoreduktase = alkohol dehidrogenase 3.
INFORMASI TAMBAHAN DALAM (
)
Mis: Æ 1.1.1.37 L-MALAT : NAD OKSIDOREDUKTASE (decarboxylating) L-MALAT + NAD+ Æ PIRUVAT + CO2 + NADH + H+ Æ 1.1.1.37 L-MALAT : NAD OKSIDOREDUKTASE L-MALAT + NAD+ Æ OKSALOASETAT + NADH + H+
13
NOMOR KODE SISTEMATIK Enzim yg dimaksud Mis : EC.2.7.1.1 Heksokinase
Transferase
Akseptor gugus alkohol Transfer fosfat
α-D-GLUKOSA Æ α-D-GLUKOSA 6-P Glukokinase/Heksokinase 14
KELAS-KELAS ENZIM MENURUT IUBMB, ADA 6 KELAS (GOLONGAN) UTAMA: 1.
OKSIDOREDUKTASE : Æ MENGKATALISIS REAKSI OKSIDASI – REDUKSI. P.U. : ENZIM2 PD. PROSES OKSIDASI BIOLOGIS Laktat dehidrogenase PIRUVAT + NADH + H+
2.
Æ
LAKTAT + NAD+
TRANSFERASE : Æ MENGKATALISIS TRANSFER/PEMINDAHAN GUGUS FUNGSIONAL (BUKAN HIDROGEN) ANTARA SEPASANG SUBSTRAT S–G + S’ Æ S’–G + S Heksokinase/Glukokinase
α-D-GLUKOSA+ATP Æ α-DGLUKOSA-6-P +ADP 15
3. HIDROLASE : MENGKATALISIS PEMBELAHAN HIDROLITIK Contoh : Enzim - Amilase - Lipase - Karboksi peptidase A
β-D-GALAKTOSIDA + H2O Æ suatu alkohol + D-galaktosa
16
4.
LIASE (LYASE) : MENGKATALISIS REAKSI PEMBENTUKAN ATAU PEMECAHAN IKATAN RANGKAP DUA, ATAU PEMBELAHAN LAIN YG. MENYANGKUT PENYUSUNAN KEMBALI ELEKTRON Contoh : Æ
∼ ALDOLASE : KETOSA-I-P Æ ALDOSA + DIHIDROKSI ASETON-P ∼ FUMARASE : HO – CH – COOH H – C – COOH | = || + H 2O CH2 – COOH HOOC – C – H MALAT FUMARAT ∼ PIRUVAT DEKARBOKSILASE : O O || || – OOC – C – CH + H+ CO2 + H – C – CH3 3 PIRUVAT
ASETALDEHID 17
5.
ISOMERASE : Æ MENGKATALISIS PENYUSUNAN KEMBALI INTRAMOLEKULER All Trans – retinin 11 – cis – retinin
6.
LIGASE : Æ MENGGABUNGKAN 2 MOLEKUL, DISERTAI PEMUTUSAN IKATAN PIROFOSFAT PD. ATP ATAU SENYAWA SEJENIS Mis : ~ PIRUVAT KARBOKSILASE : O || – OOC – C – CH + CO 3 2
O || – OOC – C – CH – COO – 2 ATP
PIRUVAT
ADP+Pi
OKSALOASETAT
18
LIGAND ÆMOLEKUL KECIL YG BISA TERIKAT PADA MOLEKUL BESAR S E E A
S=SUBSTRAT I=INHIBITOR A=AKTIVATOR E=ENZIM S I A
E I
LIGAND
19
STRUKTUR PROTEIN
ujung amino bebas
»
»+
H O | C–C | | O– R ujung karboksil bebas
IKATAN PEPTIDA
H | R – C – COOH | NH2 asam amino H3N
H O H O | || | || C–C–N–C–C–––N– | | | | R2 H R3 H
||
H O | || +H N – C – C – N – 3 | | R1 H
• ASAM AMINO DALAM LARUTAN SELALU BERMUATAN • ∴ PROTEIN JUGA SELALU BERMUATAN
COO– aa1
aa2
aa3
aa4
aa5
RANTAI PEPTIDA Æ 20 jenis a.a. dasar
aa6 20
STRUKTUR PRIMER PROTEIN : •
URUTAN ASAM AMINO PD. RANTAI PEPTIDA DR. UJUNG AMINO BEBAS SAMPAI UJUNG KARBOKSIL BEBAS (awal)
(akhir)
URUTAN a.a JUMLAH a.a
PD. TIAP JENIS RANTAI PROTEIN TIDAK SAMA (BERBEDA)
letak ujung NH3+ letak ujung –COOH– letak suatu a.a H | R – C – COOH | NH3+ pH < iep
+H+
H | R – C – COO– | NH3+ iep Σmuatan=0
+OH–
H | R – C – COO– | NH2 pH>iep pKa COOH < NH3+
21
STRUKTUR SEKUNDER : H H O | | || –N–C–C– | CH2 | S ikatan | disulfida S | CH2 | –N–C–C– | | || H H O
* α Helix
R | C–C–N– || | | O H H : : : : ikatan : : Hidrogen : : H H O | | || –N–C–C | R
* Lain2 : * LIPIT β = β - PLEATED * KUMPARAN ACAK = RANDOM COIL Cys – SH
Cys – SH
22
STRUKTUR TERSIER : celah aktif
E Dari satu untai rantai polipeptida
monomer
- Contoh : MIOGLOBIN (MYOGLOBINE) Æ MONOMER - Struktur Tersier : - IKATAN HIDROGEN 2 YG. LEMAH IKATAN 2 - GAYA VAN DER WAALS 23
STRUKTUR KUARTERNER : T.D. SATU UNTAI RANTAI POLIPEPTIDA
•
Æ MONOMER PROTOMER
•
HANYA SAMPAI STRUKTUR TERSIER
Æ DIMER subunit
•
Æ TETRAMER subunit
TERMASUK STRUKTUR KUARTERNER
• OLIGOMER POLIMER 24
STRUKTUR KUARTERNER : • SATU MOLEKUL T.D. > 1 RANTAI PEPTIDA • T.D. 2 SUBUNIT ATAU LEBIH Æ 1 SUBUNIT ~ 1 RANTAI PEPTIDA • DIIKAT OLEH : IKATAN2 YG – IKATAN HIDROGEN LEMAH – IKATAN ELEKTROSTATIK • KEGUNAAN : – SUPAYA MOLEKULNYA LEBIH STABIL – UNTUK MENDAPAT FUNGSI TERTENTU ENZIM CELAH AKTIF (ACTIVE SITE)
25
26
RANTAI POLIPEPTIDA Æ ADA YG SAMA SEMUA, ADA YG. BEDA Hb : α2β2 LDH : M4 H4 M3 H M2H2 MH3
gen rantai α ≠ β susunan a.a rantai α ≠ β
ISOZIM MENGKATALISIS REAKSI YG SAMA
27
~
: DIMER
OLIGOMER
: TETRAMER
POLIMER ~ T.D. BANYAK SUBUNIT (BANYAK RANTAI POLIPEPTIDA)
4 RANTAI POLIPEPTIDA 4 SUBUNIT
~ PH↑↑/PH↓↓, t°↑ Æ DENATURASI STRUKTUR PROTEIN RUSAK, TP. TIDAK SAMPAI MERUSAK STRUKTUR PRIMER ikt peptida
~ IKATAN PEPTIDA
IKATAN DISULFIDA
~ PROTEIN :
- ENZIM - KOLAGEN
IKATAN YG. KUAT, TIDAK RUSAK
→ FUNGSIONAL → STRUKTURAL
28
CARA KERJA ENZIM celah aktif = celah katalitik = celah pengikat substrat
~ E
+
E : ENZIM S : SUBSTRAT P : PRODUK
S
E Kompleks E-S
+ P
~ UKURAN MOLEKUL E : BESAR UKURAN MOLEKUL S : KECIL ~ DALAM SISTEM BIOLOGIS : Æ KADAR E << KADAR SUBSTRAT ~ IKATAN E–S Æ IKATAN YG, LEMAH
29
KEKHUSUSAN ENZIM • BILA ADA KESESUAIAN ANTARA CELAH AKTIF DGN. SUBSTRAT PD. STRUKTUR 3 DIMENSINYA MAUPUN GUGUS REAKTIF YG. DIMILIKI KEDUANYA.
30
~ GUGUS REAKTIF ASAM AMINO Æ GUGUS YG. PUNYA POTENSI UNTUK BEREAKSI, TDP. PD. RANTAI ‘R’. SH R | CH2 | + H3 N – C – COO– | H Cysteine (Cys) C SISTEIN
H R – C – COO– | NH3+
OH R | CH2 | + H3 N – C – COO– | H Serin (Ser) S
S
~ E
• •
GUGUS REAKTIF YG. BERPERAN LANGSUNG PD. PROSES KATALISIS ADALAH GUGUS REAKTIF PD. CELAH AKTIF – LOGAM BERAT Æ MENGIKAT GUGUS –SH Æ E MENJADI INAKTIF Hg++
31
CELAH AKTIF (ACTIVE SITE) • CELAH KATALITIK • CELAH PENGIKAT ‘S’
• •
•
CELAH AKTIF TERBENTUK O. K. ADANYA STRUKTUR TERSIER PD. CELAH AKTIF DIDAPATKAN GUGUS2 REAKTIF DARI ASAM2 AMINO YG. AKAN MELAKUKAN REAKSI KATALITIK. ASAM2 AMINO TSB. MUNGKIN BERJAUHAN DLM. STRUKTUR PRIMERNYA, TTP. BERDEKATAN DLM. STRUKTUR TERSIERNYA. GUGUS2 REAKTIF DI CELAH AKTIF : – GUGUS2 PENGIKAT S – GUGUS2 KATALITIK 32
MEKANISME KATALISIS ENZIM + MOLEKUL BESAR
E
S
MOLEKUL KECIL
+ P
Kompleks ES
→ ACTIVE SITE (BENTUK CELAH)
= CATALYTIC SITE = SUBSTRATE BINDING SITE ↓ GUGUS2 PENGIKAT ‘S’ GUGUS2 KATALITIK ↓ GUGUS REAKTIF ASAM2 AMINO DI DAERAH TSB.
33
TEORI KUNCI & ANAK KUNCI Æ FISHER
TEORI KESESUAIAN IMBAS (KOSHLAND INDUCE FIT THEORY)
PENGIKATAN S
KESESUAIAN BENTUK
PERUBAHAN KONFIRMASI (SUSUNAN ATOM DLM RUANG)
FIT = PAS
• BENTUK BERPASANGAN TERJADI SETELAH E MENGIKAT S 34
KOFAKTOR • ENZIM : – SEDERHANA Æ PROTEIN SAJA – YG. LEBIH KOMPLEKS Æ PROTEIN + KOFAKTOR • KOFAKTOR : – LOGAM – SENYAWA ORGANIK NON PROTEIN YG. SPESIFIK (KOENZIM) • IKATAN ENZIM – KOFAKTOR : – ADA YG. KUAT (KOVALEN) – ADA YG. LEMAH • ENZIM YG. PERLU KOFAKTOR HARUS MENGIKAT KOFAKTORNYA TERLEBIH DAHULU SEBELUM MELAKUKAN PROSES KATALISIS. Mg++ • Ex. : GLUKOSA + ATP GLUKOSA–6P + ADP Heksokinase
35
KOFAKTOR LOGAM • •
~ IKATAN KUAT / KOVALEN : METALLO-ENZIM ~ IKATAN YG. LEMAH FUNGSI : 1. IKUT LANGSUNG PD. PROSES KATALISIS ~ GUGUS KATALITIK 1. STABILISATOR TEMPAT KATALISIS 2. IKATAN DGN. ‘S’ DAN ‘E’ (MENDEKATKAN ‘S’ DAN ‘E’) E–S–L L–E–S E–L–S
L | S
| |
• • •
E
– Zn++ Æ KARBOKSIPEPTIDASE – Mg++ Æ HEKSOKINASE – Fe++ / Fe+++ Æ SISTEM SITOKROM 36
KOENZIM
KOENZIM + APOENZIM
HOLOENZIM
BGN PROTEIN KOFAKTOR BERUPA SENYAWA ORGANIK NON PROTEIN YG. SPESIFIK
KATALITIK AKTIF
APOENZIM : - BAGIAN PROTEIN DR. ENZIM - JK. SENDIRIAN Æ TIDAK AKTIF
IKATAN :
KUAT / KOVALEN : GUGUS PROSTETIK H2O2 + H2O2
Katalase
2H2O + O2
KATALASE : GUGUS PROSTETIKNYA SUATU HEME SELAMA E BEKERJA, HEME MENGALAMI OKSIDASI DAN REDUKSI
LEMAH : KO-SUBSTRAT
mengandung Fe (di slide berikutnya) 37
LEMAH : KO-SUBSTRAT PIRUVAT + NADH + H+ ÅÆ
LAKTAT + NAD+
Laktat Dehidrogenase S
Ko-substrat
- MENGHUBUNGKAN 2 MACAM REAKSI DGN. 2 MACAM ENZIM Pd GLIKOLISIS : Gliseraldehid 3-P
S
1,3-Bisfosfogliserat
+ NAD+
P
+ Pi
+ NADH + H+ KE R.R. (O2)
Bila O2 \ / anaerob :
PIRUVAT + NADH + H+
LDH
LAKTAT + NAD+ 38
FUNGSI KOENZIM PERANTARA PEMBAWA GUGUS, ATOM TERTENTU ATAU ELEKTRON CONTOH: R.R – NAD+ + → FAD S → NAD – NADP+ ↓ ATOM H KoQ – FMN ↓ – FAD Sistem sitokrom – KoQ ↓ ½ O2 – ELEKTRON : HEME – GUGUS LAIN : ATP → FOSFAT PIRIDOKSAL FOSFAT → –NH2 VITAMIN B TERMASUK KOENZIM – TPP Æ THIAMIN – NAD Æ NIASIN – NADP Æ NIASIN – FAD Æ RIBOFLAVIN – KoA Æ ASAM PANTOTENAT Æ
39
PROENZIM=ZYMOGEN • ENZIM YG. DISEKRESI DALAM BENTUK YG. BELUM AKTIF • TUJUAN : – MELINDUNGI ORGAN TUBUH – MENYEDIAKAN BAHAN SETENGAH JADI • CONTOH : PEPSINOGEN • UNTUK MENGAKTIFKAN DIGUNAKAN ENZIM PROTEOLITIK ATAU H+ PEPSINOGEN
H+
/ PEPSIN
PEPSIN H+ / Enzim proteolitik
PEPSINOGEN PEPSIN 40
ISOZIM • MENGKATALISIS REAKSI YG. SAMA • CONTOH : LAKTAT DEHIDROGENASE (LDH) • •
T.D. 4 RANTAI POLIPEPTIDA 2 JENIS RANTAI :
M H
ISOZIM LDH ADA 5 : I1=H4
I2=H3M
I3=H2M2
I4=HM3
I5=M4
M & H : SUSUNAN ASAM AMINO BERBEDA DISTRIBUSI ISOZIM DLM. JARINGAN BERVARIASI → DAPAT MEMBANTU DIAGNOSIS PENYAKIT SIFAT FISIK, KIMIA, IMUNOLOGIS → SEDIKIT BEDA
41
Katoda (-)
Anoda (+)
+
–
Jant
A
N
B
Hati
C 5
4
3
2 1
A B C 5 4 3 2 1
I5: M4
Elektroforesis Selulosa asetat pH 8,6
I1=H4
A – Infark miokard B–N C – penyakit hati
LDH
42
PENGUKURAN KADAR ENZIM DLM. PLASMA → UNTUK MEMBANTU DIAGNOSIS ENZIM PLASMA FUNGSIONAL (YG. BERFUNGSI DLM. PLASMA) • MIS. : ¾ ENZ.2 PROSES PEMBEKUAN DARAH ¾ LIPOPROTEIN LIPASE
• KADAR ↓ : ¾ GANGGUAN PROSES SINTESIS DI HATI ¾ ↓/ (-) : KELAINAN GENETIK
→ DEFISIENSI F VIII : HEMOFILIA
ENZIM PLASMA NON FUNGSIONAL (YG. BERFUNGSI DI JARINGAN LAIN, TIDAK DLM. PLASMA) • •
N : PERGANTIAN SEL (SEL MATI DIGANTI SEL BARU) DIFFUSI PASIF
•
↑ : SEL MATI ↑ – – – –
RADANG Ca TRAUMA PENYAKIT GENETIK (CONTOH: DMD)
43
GEN : SUATU SEGMEN DNA YG. BERISI INFORMASI/KODE GENETIK
DARI SUSUNAN ASAM AMINO, SUATU RANTAI POLIPEPTIDA/PROTEIN DAPAT DIPAKAI SEPAKAI ACUAN UNTUK TRANSKRIPSI
(→mRNA) yang selanjutnya ditranslasi (sintesis) → POLPEPTIDA/PROTEIN
44
Pankreas : amilase, lipase Tulang : fosfatase alkali Prostat : fosfatase asam Hepar : SGOT SGPT LDH Otot : SGOT CPK (Creatine phospho kinase) LDH Paru : LDH 45
PEMERIKSAAN ENZIM PD. PENYAKIT GENETIK :
DEFISIENSI FENILALANIN HIDROKSILASE FENIL KETON URIA
DMD = DUCHENNE MUSCULAR DISTROPHY BMD = BECKER M. DISTROPHY GEN DISTROFIN CACAT
x°y
DISTROFIN CACAT SEL OTOT RUSAK CREATIN KINASE ↑↑
PEMERIKSAAN [E] Æ DALAM SERUM 46
KELAINAN GENETIK : DEFISIENSI G6PD • PD. ORANG NORMAL ENZIM G6PD >> TDP. PD : KELENJAR ADRENALIS, JARINGAN LEMAK, ERITROSIT & KELENJAR MAMMAE (LAKTASI) DLM. SERUM SEDIKIT SEKALI • DEFISIENSI G6PD : ERITROSIT MUDAH HEMOLISIS BILA TERPAPAR BAHAN OKSIDAN (Mis : PRIMAQUIN) • PEMERIKSAAN KADAR G6PD : DLM. ERITROSIT Æ DEFISIENSI G6PD Æ KADAR G6PD DLM. DARAH ↓. – G6PD Æ NADPH (HMP SHUNT) Æ GSH Æ MENGHILANGKAN H2O2 47
CACAT ENZIMATIK GENETIK • A
Enz.1
B
Enz.2
C
Enz.3
D
Enz.4
E
P
BILA GEN ENZ. 4 CACAT Æ [ENZ. 4] < Æ PENUMPUKAN METABOLIT D,C,B,A ↑
• FENIL KETON URIA : DEFISIENSI ENZ. FENILALANIN HIDROKSILASE
KELAINAN GENETIK ?
∼ ∼ ∼ ∼
↓ PENUMPUKAN METABOLIT (↑) ↓ KERUSAKAN SEL2 SARAF ↓ MENTAL RETARDASI
PREMARITAL COUNSELLING PRENATAL COUNSELLING HAMIL Æ amniosintesis dsb NEONATUS Æ SCREENING TEST (UJI SARING) PERAWATAN KHUSUS DIET KHUSUS mis : FENIL KETONURIA TERAPI GEN ? MASIH TAHAP PENELITIAN
48
