Emlősök korai embrionális génjei kifejeződésének vizsgálata molekuláris biológiai módszerekkel
Doktori értekezés
Baji Gál Árpád
Biológia Doktori Iskola, iskolavezető: Prof. Erdei Anna Szerkezeti biokémia program, programvezető: Prof. Gráf László Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Kar
Témavezető: Dr. Dinnyés András MTA doktora, kutatócsoport vezető Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöllő Genetikai Újraprogramozás Csoport
Gödöllő, 2008. május 1
„Felfedezni valamit annyit tesz, mint látni, amit mindenki lát, és közben arra gondolni, amire még senki.”
Szent-Györgyi Albert
2
Tartalomjegyzék Rövidítések......................................................................................................................................1 1. Bevezetés.....................................................................................................................................2 1.1 Genetika, epigenetika..................................................................................................3 1.2 Génexpresszió..............................................................................................................3 1.3 Epigenetikai újraprogramozódás.................................................................................4 1.3.1 DNS metiláció.................................................................................................5 1.3.2 Genomi imprinting..........................................................................................5 1.3.3 X kromoszóma inaktiválás..............................................................................5 1.3.4 Telomer fenntartás...........................................................................................6 1.3.5 Kromatin átrendeződés....................................................................................6 1.3.6 Hiszton módosítások.......................................................................................8 1.4 Hiszton-kód.................................................................................................................9 1.5 Emlősök korai egyedfejlődése...................................................................................11 1.5.1 Morfológiai leírás..........................................................................................12 1.5.2 Molekuláris megközelítés.............................................................................14 1.5.3 Megtermékenyítést követő változások..........................................................16 1.5.4 Embrionális genom aktiváció........................................................................17 1.5.5 Az első differenciálódást kísérő változások..................................................18 1.6 Embrió technológiák..................................................................................................19 1.6.1 In vitro tenyésztés..........................................................................................20 1.6.2 Parthenogenetikus aktiválás..........................................................................20 1.6.3 Krioprezerváció, vitrifikáció.........................................................................20 1.6.4 Klónozás........................................................................................................21 1.7 Molekuláris biológiai megközelítési lehetőségek......................................................22 1.7.1 Módszertár.....................................................................................................22 1.7.2 A génexpresszió vizsgálata............................................................................23 1.7.3 Reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció............25 1.7.4 Egyedi embriók és sejtek génexpressziós vizsgálata....................................26 1.8 Vizsgált gének............................................................................................................27 2. Célkitűzések...............................................................................................................................29 3. Anyagok, módszerek..................................................................................................................31 3.1 Anyagok, vegyszerek.................................................................................................31 3.1.1 Tápoldatok petesejt és embrió kinyeréséhez, tartásához és kezeléséhez......31 3.1.2 Molekuláris biológiai módszerekhez használt anyagok, oldatok..................31 3.2 Állatok, élő sejtek, embriók kezelése........................................................................32 3.2.1 Állatvédelmi szabályok.................................................................................32 3.2.2 Petesejt kinyerése..........................................................................................32 3.2.3 Embriók kinyerése.........................................................................................33 3.2.4 Embriók tenyésztése......................................................................................33 3.2.5 Embriók mélyhűtése, felmelegítése..............................................................33 3.2.6 Embriók szétválasztása blasztomer sejtekre.................................................34 3.2.7 Parthenogenetikus aktiválás..........................................................................34 3.3 Alkalmazott molekuláris vizsgálómódszerek............................................................35 3.3.1 Totál RNS izolálás emlős szövetből..............................................................35 3.3.2 mRNS izolálás...............................................................................................35 3.3.3 Reverz transzkripció......................................................................................35 3.3.4 Polimeráz láncreakció...................................................................................36 3.3.5 Agaróz gél-elektroforézis..............................................................................36 3
3.3.6 Real-time polimeráz láncreakció...................................................................36 3.3.7 Primer tervezés..............................................................................................39 3.3.8 Kvantitatív PCR adatelemzés........................................................................40 3.3.9 Génexpresszió stabilitás vizsgálat.................................................................42 3.3.10 Egyéb molekuláris biológiai módszerek.....................................................42 4. Eredmények...............................................................................................................................43 4.1 Egyedi embriókon alapuló génexpressziós protokoll kifejlesztése és validálása......43 4.1.1 Primerek tervezési eljárásának validálása.....................................................43 4.1.2 Kvantitatív RT-PCR módszerek összehasonlítása.........................................47 4.1.3 Protokoll kidolgozása, jellemzése.................................................................48 4.1.4 Protokoll ellenőrzése.....................................................................................49 4.2 Embrió mélyhűtési módszerek összehasonlítása.......................................................50 4.3 Egér egyedfejlődésének összehasonlítása különböző körülmények között...............53 4.4 Nyúl egyedfejlődésének vizsgálata............................................................................57 4.5 Egér és szarvasmarha egyedfejlődésének összehasonlítása......................................62 4.6 HDAC és HAT gének expressziójának meghatározása egér embriókban.................64 5. Tárgyalás....................................................................................................................................66 5.1 Módszer fejlesztés.....................................................................................................66 5.2 Mélyhűtés..................................................................................................................68 5.3 Egér embriók tenyésztése és a parthenogenetikus aktiválás......................................69 5.4 Nyúl embriók egyedfejlődése és tenyésztése............................................................70 5.5 Egér és szarvasmarha összehasonlítása.....................................................................71 5.6 Hiszton kód szabályozása..........................................................................................72 5.7 Gyakorlati felhasználás, távlatok...............................................................................73 6. Következtetések.........................................................................................................................75 Köszönetnyilvánítás.......................................................................................................................77 Irodalomjegyzék............................................................................................................................78 Függelékek.....................................................................................................................................91 I. Hiszton módosítások és funkcióik................................................................................91 II. Egy sejt RNS tartalma.................................................................................................92 III. A vizsgált gének szekvencia adatai............................................................................93 IV. A nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása...............................................96 Összefoglalás...............................................................................................................................103 Summary......................................................................................................................................104
4
Rövidítések ARTs bp BSA cDNS CG (CpG) COC Ct CV CZB DNS dNTP dT EBSS eCG ECS EDTA EGA EST GOI H1 H2A H2B H3 H4 H4-K12Ac HAT hCG HDAC HEPES HKG ICM ISV MMLV mRNS PCR PMSG qRT-PCR R2 RNáz RNS RT SCNT SDS SSV TAE TCM 199 TE
asszisztált reprodukciós technikák (assisted reproductive technologies) bázispár szarvasmarha szérum albumin (bovine serum albumin) (mRNS-ről átírt) komplementer DNS (complementary DNA) citozin-guanin nukleotid pár (citozin-foszfát-guanin) kumulusz-petesejt komplexek (cumulus oocyte complexes) küszöbérték ciklusszám (threshold cycle) relatív szórás, variációs együttható (coefficient of variation) Chatot Ziomek Bavister tápoldat dezoxiribonukleinsav (deoxyribonucleic acid) dezoxi-nukleotid-trifoszfátok (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) dezoxi-timin Earl-féle kiegyensúlyozott sóoldat (Earle's Balanced Salt Solution) vemhes kanca placentájában termelődő hormon (equine chorionic gonadotropin) ösztruszban lévő szarvasmarha szérum (estrous cow serum) etiléndiamin-tetraecetsav (ethylenediamine tetraacetic acid) embrionális genom aktiváció (embryonic genome activation) expresszált szekvencia címke (rövid génszakasz) (expressed sequence tag) vizsgált gén (gene of interest) hiszton 1 fehérje hiszton 2A fehérje hiszton 2B fehérje hiszton 3 fehérje hiszton 4 fehérje acetilált lizin oldallánc a H4 hiszton fehérje 12-es pozíciójában hiszton acetil-transzferáz enzim emberi korion gonadotróp hormon (human chorionic gonadotropin) hiszton-deacetiláz enzim N-2-hidroxietil-piperazin-N'-2-etán-szulfonsav háztartási gén (housekeeping gene) epiblaszt, belső sejtcsomó (inner cell mass) gyors fagyasztás műszalmában (in-straw vitrification) Moloney egér leukémia vírus (Moloney Murine Leukemia Virus) hírvivő RNS (messenger RNS) polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction) vemhes kanca szérum gonadotróp hormon (pregnant mare serum gonadotropin) kvantitatív, real-time RT-PCR (quantitative real-time RT-PCR) determinációs együttható, a korreláció négyzete (coefficient of determination) ribonukleáz (ribonuclease - RNase) ribonukleinsav (ribonucleic acid) reverz transzkripció (reverse transcription) testi sejtes sejtmagátültetés (somatic cell nuclear transfer) nátrium-dodecil-szulfát (sodium dodecyl sulphate) gyors fagyasztás szilárd felületen (solid surface vitrification) Tris-acetát-EDTA puffer (Tris-Acetate-EDTA) szövetkultúra médium 199 (tissue culture medium 199) trofoblaszt, trofektoderma (trophectoderm) 1
1. Bevezetés Ma már elfogadható mennyiségű bizonyíték áll rendelkezésre mind az orvostudományi, mind az állati és növényi genetikai tanulmányokból arról, hogy az elsődleges DNS szekvencián kívül is öröklődik információ generációkon át és befolyásolhatja az utódok fenotípusát. Ezt epigenetikai
információnak
hívják
és
molekuláris
alapjainak
felfedezése
a
kutatók
érdeklődésének középpontjában áll. A fejlődésbiológiai kutatások elsődleges célja sok év óta az emlősök egyedfejlődése során zajló sejtes folyamatok molekuláris mechanizmusainak megértése. Napjainkban jutott oda a tudomány, hogy a hagyományos genetikai és embriológiai kísérleti módszerek repertoárját kiegészítsék a molekuláris és sejtbiológiai megközelítésekkel. Ennek eredményeképpen a mai modern fejlődésbiológia több más tudományág, mint a biokémia, genomika és rendszerbiológia határterületén valósul meg. A reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció jelenleg az általánosan alkalmazott módszer, mely az mRNS mennyiségi meghatározásával, a megfelelő adatelemzésével és a nyilvánvaló követelményekkel együtt alkalmas az egyedfejlődést irányító génexpresszió vizsgálatára az orvostudományban, diagnosztikában, a mikrobiológiában és a biotechnológiában. Röviden a kutatás céljai, melyek a kutatócsoport emlős embrió technológiai (például klónozási) munkáját szolgálják: –
alkalmas módszer kifejlesztése a génexpresszió mennyiségi meghatározására egyedi sejtekben, embriókban, valamint a molekuláris, és epigenetikai újraprogramozódási folyamatoknak a vizsgálata az emlősök korai egyedfejlődése alatt;
–
a génexpresszió vizsgálata természetes és többféle módon előállított „mesterséges” embriókban (in vivo, in vitro tenyésztett, parthenogenetikusan aktivált, mélyhűtött);
–
különböző emlősállatok (egér, nyúl és szarvasmarha) összehasonlítása;
–
a hiszton-kódot szabályozó különböző (hiszton acetil-transzferáz és hiszton-deacetiláz) gének szerepének meghatározása. Az értekezés több tudományterületet érint, mint a genetikát és molekuláris biológiát, az
epigenetikát, valamint az emlős embriológiát, és a biotechnológiát. Irodalmi áttekintésük és az általánosan használt fogalmak, az alkalmazott módszerek elméleti háttere külön alfejezetekben kerültek leírásra, rámutatva a kapcsolódási pontokra, mely alapján az elvégzett kísérleti munka összefüggéseit egyszerűbben lehet majd megmagyarázni. 2
1.1 Genetika, epigenetika
Az egyedfejlődés sikeres, zavartalan lejátszódásáért jól szervezett, szabályozott molekuláris folyamatok felelnek. Középpontjukban a genom, a két ivarsejt DNS állománya áll, mely magában hordozza a teljes egyedfejlődés információját, programját. Amíg a DNS nukleotid szekvenciája - a genetikai információ - a géneket, RNS és fehérje struktúrákat kódolja, ezek programozott működését, kifejeződésük aktivációját-csöndesítését (ki- bekapcsolását), időbeli és térbeli mintázatát, szövet és sejtspecifikus kifejeződését a primer szekvencián felüli, epigenetikai információ határozza meg. Az epigenetikai mintázat tükrözi az adott sejt genotípusát, fejlődési útját, az őt érő környezeti hatásokat, és végső soron a sejt fenotípusában fejeződik ki. Minden egyedi sejtnek megvan a saját epigenetikai profilja, epigenomja (Morgan és mtsai. 2005.). Az epigenetikai tényezők összessége a DNS funkciójának, a génexpressziónak a stabil, öröklődő és visszafordítható módosulásai a sejtosztódás és fejlődés alatt anélkül, hogy a DNS szekvenciája megváltozna. A kromatin szerkezetét, összetételét, helyspecifikus átalakítását érintik például a DNS metilációjával vagy a DNS-t körülvevő hiszton fehérjék kémiai módosításaival, melyek meghatározzák a DNS hozzáférését, transzkripciós aktivitását (Jones és Takai 2001., Jaenish és Bird 2003.). 1.2 Génexpresszió
A génkifejeződés - génexpresszió - folyamatait a centrális dogmában foglalták össze először (Crick 1970.). Első lépése a transzkripció, mely során általában egy génről a szabályozó régiók (promóter) és a stop jel közötti információt hordozó, kódoló szakaszok (exonok) és a köztes nem kódoló régiók (intronok) íródnak át a kétszálú DNS-ről egyszálú RNS-re. Az RNS érése során (splicing) kivágódnak az intronok és létrejön az érett mRNS. Ezt követi a transzláció, amikor az mRNS-ről fehérje szintetizálódik, végül a fehérje felveszi aktív formáját, egyéb utólagos módosításokon eshet át, melyek után betölthetik specifikus szerepüket és kialakítják az adott fenotípust (1. ábra). A genetikai információ - a DNS szekvencia - egy emlős szinte minden, a zigótából kifejlődő sejtmaggal rendelkező testi sejtjében azonos (kivétel néhány specifikus sejttípus, mint a limfociták). Alakjuk, felépítésük és működésük mégis egészen eltérő lehet, mivel változó génkészlet fejeződik ki a különböző fejlődési stádiumokban és az egyes sejtvonalakban, megadva a differenciálódott szöveti sejtek jellegét.
3
1. ábra: Génkifejeződés. A DNS molekulán az exonok rózsaszínnel, az intronok zölddel, a promóter és a stop jel pirossal vannak jelölve. (Forrás: http://hu.wikipedia.org/)
1.3 Epigenetikai újraprogramozódás
A preimplantációs egyedfejlődés során az epigenetikai módosítások szabályozzák például az X kromoszóma inaktivációját, a genomi imprintinget, a telomerek hosszának szabályozását. Központi szerepet töltenek be a génexpressziós mintázatának kialakításában a gének aktiválásával, csöndesítésével. A sejtek elsődlegesen azáltal szabályozzák a génjeik aktivitását, hogy növelik vagy csökkentik az adott gén transzkripcióját, amit fehérjéken, transzkripciós faktorokon keresztül valósítanak meg a gének szabályozó régióihoz kapcsolódva. A megtermékenyítést követő korai egyedfejlődés során - ahol a sejtek fejlődési potenciálja nagymértékben
megváltozik
-
az
emlősök
epigenomja
a
teljes
genom
szintjén
újraprogramozódik: az elősejtmagokban meglévő epigenetikai mintázat törlődik, és egy új mintázat alakul ki. (Erről részletesebben olvasható az Egyesült Államok Élelmiszer és Gyógyszerhatósága tanulmányában (FDA; Rudenko és mtsai. 2007.a,b).) Habár a kutatások középpontjában főként a korai egyedfejlődésben zajló epigenetikai változások állnak, ezek később, a felnőtt egyedben is lejátszódnak, például az ivarsejtek képzésekor. Szintén valószínűsíthető, hogy a különböző orvosi beavatkozások, táplálékok és a környezeti kitettség (vegyszerek) ezeknek a véletlenszerű megzavarásához vezethet, vagyis általában a környezethez való adaptálódásnak is szükséges és normális része, melynek a folyamatait azonban még alig ismerik (Bartolomei és Bickmore 2005.). Az epigenetikai újraprogramozódással foglalkozó tudományág viszonylag fiatal. Még 4
nem minden epigenetikai változást ismernek részleteiben, mivel a mögöttük rejlő molekuláris folyamatok igen összetettek. Mindezzel együtt nagyon sok mindent tudnak már arról, hogy a genom kifejeződését hogyan szabályozzák az egyedek, sejtek élete során. Ezek a különböző típusú epigenetikai folyamatok: DNS metiláció, genomi (molekuláris) imprinting, X kromoszóma inaktiválás, telomer fenntartás, kromatin átrendeződés (a kromatin szerkezet szabályozott változásai), hiszton módosítások. 1.3.1 DNS metiláció
A DNS metilációs állapotát központi szerepűnek tartják a génexpresszió epigenetikai szabályozásában, s mivel mind jobban kezdik megérteni ebben betöltött szerepét, ez az egyik legaktívabban kutatott terület (Holliday 2005.; Scarano és mtsai. 2005.). A genomi DNS metilációs mintázata a DNS nagy részén megtalálható metilált citozinokat, főként a CG dinukleotidok 5' citozinjait jelenti, és a bizonyos régiókba - CpG szigetekbe - csoportosuló nem metilált citozinokat. Az emlősök genomjában 30-40 ezer ilyen sziget található, főként háztartási gének promóter régiói közelében, de szövet specifikus gének környezetében is (Antequera 2003.). A CG dinukletidokban lévő citozinokon megjelenő metiláció helyes mintázata szükséges a normális egyedfejlődéshez, és szerepet játszik az X kromoszóma inaktiválásában és az imprintingben is (Li és mtsai. 1993., Beard és mtsai. 1995.). A DNS metilációja az egyik legstabilabb módosításnak tűnik, ezért ez az első számú jelölt, mely felelős a generációk közötti epigenetikai öröklődésért. Azonban egy nemrégiben megjelent tanulmány alapján kijelenthető, hogy az egérben (Mus musculus) nem ez a keresett epigenetikai jel (Blewitt és mtsai. 2006.). 1.3.2 Genomi imprinting
Emlősökben az anyai és apai genomok mindegyike szükséges a normális embrionális egyedfejlődéshez. Működésbeli egyenlőtlenségüket epigenetikai folyamat, a genomi imprinting határozza meg azáltal, hogy bizonyos gének aktivitása a szülői eredetétől függően szabályozódik - vagyis vagy csak az apai, vagy csak az anyai kromoszómán elérhető és szabályozható, míg a másikon nem. Így funkcionális különbség alakul ki a két szülői genom között, mely az ivarsejtekben továbbítódik és a korai embrionális újraprogramozódás alatt is érintetlen marad (Surani és mtsai. 1984.). 1.3.3 X kromoszóma inaktiválás
Az emlősök egyedfejlődésének már korai szakaszában az egyik X kromoszóma transzkripcionálisan inaktiválódik, hogy az X kromoszóma géntermékeinek dózis kompenzációja 5
biztosítva legyen. Az inaktív X jellemzői a késői DNS replikáció és az epigenetikai módosítások, mint a DNS metiláció, valamint hogy a hiszton 3 (H3) és hiszton 4 (H4) fehérjék kevéssé acetiláltak, ellentétben az aktív X kromoszómával (Shi és mtsai. 2003.). 1.3.4 Telomer fenntartás
A telomerek az eukarióta kromoszómák végein található speciális, nem kódoló, ismétlődő DNS szakaszok. A legtöbb testi sejtben védik a kromoszómák végeit a lebomlástól, elősegítik a DNS replikáció befejezését és a sejtmagban való elhelyezkedésben is szerepük van. A sejtosztódások során fokozatosan megrövidülnek, végül emiatt az osztódási képességüket is elveszítik a sejtek. Ezt a jelenséget hívják a sejtek elöregedésének (Greider 1990.). 1.3.5 Kromatin átrendeződés
A kromoszóma anyaga a kromatin, mely eukarióta sejtekben kettős szálú DNS és fehérjék komplexéből áll. A kromatin szerveződésének több szintje van, melyben a DNS molekula tömören össze van csomagolva. A DNS két szála bázispárosodás révén kettős hélix szerkezetet vesz fel, mely a hiszton fehérjékkel nukleoszómákat formálnak és mint
a
gyöngyök
szakaszonként
-
füzérszerűen ezért
hívják
ismétlődnek gyöngyfüzér
struktúrának. Ezek szabályosan összetömörödve alkotják
a
kromatin
működésétől
függően
feltekeredésével,
szálat. a
A
kromoszóma
kromatin
hurkolódásával
szál további
kondenzálódás érhető el (2. ábra). Szerkezete dinamikusan
változik
az
egyedfejlődés
és
differenciálódás alatt. Fontos szerepet tölt be a gének kifejeződésében, és a DNS megkettőződésében, a replikációban is. A kromatin nem egységes a gének eloszlása és a transzkripció aktivitása tekintetében. Az eukariótákban a genom transzkripcionálisan aktív 2. ábra: A kromatin szerveződése. (eukromatin) és inaktív (heterokromatin) részekre A) DNS kettős hélix; B) gyöngyfüzér; C) kromatin szál; D) fellazult és E) kondenzált kromoszóma
tagolt. Az eukromatin a kromatin egy típusa, mely részlet; F) mitózisos kromoszóma. (Forrás: Alberts és mtsai. 2002.a) 6
gazdag génekben. A hiszton fehérjék nem kötődnek szorosan a DNS-hez, biztosítva ezáltal egyfajta laza, nyitott szerkezetet, melyen sokféle molekula, fehérje hozzáférést nyerhet a DNS megfelelő (szabályozó, kódoló) régióihoz. A génexpresszió aktív, szinte folyamatos az mRNS átírás. Ezzel szemben a magasabb fokon rendeződött, zárt szerkezetű heterokromatin inaktív. A DNS-t körülvevő hiszton fehérjék szoros kapcsolata miatt az RNS polimeráz (DNS-ről RNS átírást végző) enzim nem fér hozzá a DNS-hez. A gének elhelyezkedése ezekben a részekben ezért fontos szabályozója az expressziójuknak. Áthelyeződésük a nyitott és zárt kromatin szerkezet között szükséges az expressziójuk hosszú távú változásához. A
kromatin
alapegysége
a
nukleoszóma, 146 bázispárnyi (bp) DNS-t tartalmaz, mely két körben tekeredik fel egy magot alkotó fehérje-komplexre (3. ábra). A fehérje magot nyolc hiszton határozza meg: két-két hiszton 2A (H2A), hiszton 2B (H2B), H3 és H4 (Luger és mtsai. 1997.). Az
egyes
nukleoszómákat
egy
rövid
„összekapcsoló” DNS szakasz és egy hiszton 1 fehérje (H1) köti össze. A hisztonok kis méretű, bázikus fehérjék. Öt fő típusuk van (H1, H2A, H2B, H3 és H4), egyenként
körülbelül
hosszúak.
Mindegyik
130 gazdag
aminosav pozitív
töltésű, bázikus aminosavakban (arginin, lizin,
hisztidin),
melyek
szoros
kölcsönhatásba lépnek a negatívan töltött DNS foszfát csoportjaival. A nukleoszómák szerkezetükön keresztül szabályozzák a transzkripciós komplexek kötődését a DNS megfelelő régióihoz. A kromatin fellazulása és
a
átrendeződése 3. ábra: A nukleoszóma térbeli szerkezete.
nukleoszómák
előfeltétele a transzkripció aktiválásának. A A két körben feltekeredő DNS kettős szála barna-zöld fentiekre
nézve
csak
a
színekkel, a magot képező hiszton fehérjék sárga (H2A),
hímivarsejtek piros (H2B), kék (H3) és zöld (H4) színekkel, a Mn2+ és Clvilágoskék és sötétkék golyókkal vannak jelölve. PDB jelentenek kivételt. A képzésük során ionok kód: 2CV5. Ábrázolás: UCSF chimera programmal (spermiogenezis) a kromatin jelentősen (Pettersen és mtsai. 2004.). (Forrás: Tsunaka és mtsai. 2005.) 7
szorosabb formába tömörül, a génexpresszió teljesen felfüggesztődik és a hisztonok nagyrészt a protaminnak nevezett, arginin-gazdag fehérjékkel helyettesítődnek (Braun 2001.). 1.3.6 Hiszton módosítások
A magasabb fokon rendeződött kromatin szerkezet szoros összefüggésben áll a nukleoszómák magját alkotó hiszton fehérjék kinyúló N-terminálisának, ritkábban Cterminálisának kovalens, transzláció utáni módosításaival. A hiszton H3 és H4 N-terminálisa az eukarióták egyik legkonzervatívabb szekvenciája (Eberharter és Becker 2002.). A mostani kutatásokból kiderül, hogy mennyire komplex rendszerről van szó, amit példáz a DNS metilációjának,
és
a
hisztonok
acetilációjának,
metilációjának,
foszforilációjának
és
ubiquitinációjának az óriási számbeli és minőségbeli változatossága is (Kanka 2003.; Quivy és mtsai. 2004.; Cheung és Lau 2005.; Fuks 2005.; Verschure és mtsai. 2005.). Az eltérő hiszton módosítások együttműködő vagy ellentétes kölcsönhatást gyakorolnak a kromatinhoz kötődő fehérjékkel, amivel a transzkripcionálisan aktív vagy csöndes állapotok közti dinamikus átmeneteket szabályozzák és szerepet játszanak a DNS megkettőződésében, a DNS hibák javításában és a mitózisban is (részletesebben: Függelékek: I. Hiszton módosítások és funkcióik) (Peterson és Laniel 2004.; Zhang és mtsai. 2007.). A hisztonok pozitív töltésű lizin oldalláncai a DNS negatív töltésű foszfát csoportjaihoz szorosan kapcsolódnak. Az aktív géneknél a hisztonok - főként a H3 és H4 - nagyon acetiláltak. Az acetilációjuk során semlegesítődnek, és a nukleoszómális „gyöngyfüzér” becsomagoltsága csökken, így a DNS hozzáférhető lesz a transzkripciós faktorok számára (4. ábra). Ezáltal a hiszton acetiláció, mint a kromoszómákon található epigenetikai jel, a transzkripcióra való alkalmasságot jelöli, de az aktív transzkripcióval nincs közvetlenül összefüggésben. Deacetilációjukkal ellentétes folyamat játszódik le, a transzkripció gátlódik, és a kinyúló végek represszor fehérjéket kötnek meg (Grunstein 1997.). Mint
a
preimplantációs
embriófejlődés
génexpressziójának
legfontosabb
epigenetikai
szabályozója, a DNS metiláció mellett ez a másik igen sokat tanulmányozott folyamat. Egyes esetekben a DNS metiláció és a hiszton deacetiláció egyidejűleg eredményezi a géncsöndesítést (Santoro és mtsai. 2002.). Az hiszton végeken található acetilált lizin aminosavakat a bromodomének, bizonyos kromatin átrendező és transzkripciót aktiváló fehérje szakaszok kötik, melyek körülbelül 100 aminosav hosszúak és négy α-hélixből állnak (Winston és Allis 1999.; Owen és mtsai. 2000.). A kromatin szerkezet dinamikus átmeneteit a kapcsolódó nem-hiszton típusú kromoszómális fehérjék biztosítják. Közülük kiemelkedő fontosságúak a „hiszton kódot” előállító és azt leolvasó fehérjék, mint például a hiszton acetil-transzferáz (HAT) és a hiszton-deacetiláz (HDAC) 8
enzimek, melyek közösen együttműködve határozzák meg az általános genom szintű hiszton acetiláltsági állapotot, és ennélfogva a transzkripciós állapotok közötti központi kapcsolóként működnek (Shi és mtsai. 2003.). Érdekes módon olyan területeket is találtak a genomban, amelyeken a génkifejeződés nincsen összhangban a helyi hiszton fehérjék módosításaival. Ez egybecseng azzal az elképzeléssel, miszerint a genomnak jóval nagyobb része íródik át DNS-ről RNS-re, mint korábban gondolták, és nem csak a klasszikus mRNS-eket kódolja, amelyek a fehérjék szerkezetéhez szükséges információt hordozzák. A genom számos régiójáról fehérjéket nem kódoló RNS-ek is átíródnak, amelyek elsősorban a génszabályozásban játszanak fontos szerepet. Úgy tűnik, hogy ezeken a fehérjét nem kódoló genomi szakaszokon nem jelennek meg az ismert hiszton módosítási mintázatok.
4. ábra: A hiszton acetiláció szerepe a génexpresszió szabályozásában. A hisztonok lizin oldalláncainak acetilációjával a nukleoszómák fellazulnak, létrehozva egy nyitottabb kromatin szerkezetet, így a transzkripciós faktorok hozzáférhetnek a DNS-hez, a génexpresszió aktív (bal oldal). Ezzel ellentétes folyamat játszódik le a lizin oldalláncok deacetilációjával, géncsöndesítést okozva (jobb oldal). HDAC: hiszton-deacetiláz; HAT: hiszton acetil-transzferáz; N: hiszton N-terminális; Ac: acetiláció; TF: transzkripciós faktorok; RF: represszor fehérjék.
1.4 Hiszton-kód
A lehetséges sokféle kombináció alapján felállították az úgynevezett „hiszton-kód” elméletét. Ez egy bonyolult szabályozó rendszer, amely jelentős mértékben kiterjeszti a genetikai kód információtartalmát és a génexpresszió specifikus szabályozására egy epigenetikai jelrendszert határoz meg (5. ábra). A de/acetiláció következetes mintázatára génről génre, 9
valamint a kód kombinatorikus felhasználásár azonban napjainkig nagyon kevés bizonyítékot találtak (Turner 2000.; Strahl és Allis 2000.; Jenuwein és Allis 2001.; Kurdistani és mtsai. 2004.; Nightingale és mtsai. 2006.).
5. ábra: Hiszton módosítások. Az emberi hiszton fehérjék eddig ismert transzláció utáni módosításai: acetiláció (Ac), metiláció (Me), foszforiláció (P), ubiquitináció (U). A vastag sötétebb régiók az alfa-hélix struktúrát jelölik. (Forrás: www.histone.com/modification_map.htm)
A hiszton-kód acetil jelét létrehozó és szabályozó enzimek (HAT és HDAC) nagy számban fordulnak elő az emlősökben. A hiszton acetil-transzferáz aktivitással rendelkező, transzkripciót szabályozó koaktivátor fehérjék több különböző fehérjecsaládba tartoznak, melyek különböző szubsztrátokat részesítenek előnyben, és más-más feladatokat látnak el a sejtekben. Többségük a transzkripciót szabályozó, nagy komplexekben fordul elő, ezzel tovább tágítva a viszonylag gyenge szubsztrát specificitásukat. A családok közötti szekvencia hasonlóság kicsi, általában csak a hiszton acetil-transzferáz doménre korlátozódik (Marmorstein és Roth 2001.). A 10
HAT enzimek katalizálják az acetil csoport áthelyezését az acetil-koenzim A-ról a hiszton fehérjék nukleoszómából kinyúló N-terminálisán található lizinek ε-amino csoportjára (4. ábra) (Carrozza és mtsai. 2003.). Fontos szerepüket írták le egérben az egyedfejlődés során, valamint emberben (Homo sapiens) rákos elváltozások okaként. A hiszton-deacetiláz aktivitással rendelkező fehérjéket két családba sorolják, az egyik a klasszikus HDAC család. Közös jellemzőjük a kromatin szerkezethez való kötődési képességük a katalitikus doménen keresztül, valamint az acetil csoport eltávolítása a hiszton fehérjékről. Mint a génexpressziós aktivitás szabályozói, aktívan kutatják a kóros génműködés szabályozásában betöltött szerepüket a rákos elváltozásokban (Khochbin és mtsai. 2001.; de Ruijter és mtsai. 2003.). Több vizsgálatot végeztek preimplantációs stádiumú emlős embriókban a különböző ismert HDAC és HAT gének expressziós mintázatának feltárására egérben, szarvasmarhában (Bos taurus) és bundermajomban (Macaca mulatta), azonban egyik tanulmányba sem a teljes készletet, hanem csak néhány (1-10) kiválasztott gént vontak be, és az újabban leírt HDAC gének expresszióját még senki nem jellemezte (Schuettengruber és mtsai. 2003.; Hayashi és mtsai. 2003.; McGraw és mtsai. 2003.; Zheng és mtsai. 2004.). 1.5 Emlősök korai egyedfejlődése
Az
embrionális
egyedfejlődés
első,
preimplantációs
szakasza
a
petesejt
megtermékenyítésével kezdődik és az embrió méhbe való beágyazódásáig tart. Viszonylag lassú folyamat, egérben átlagosan 4,5 napot vesz igénybe - míg embernél 6-7 napot, szarvasmarhában 17-34, birkában (Ovis aries) és sertésben (Sus scrofa) 14-16 napot (Ko 2004.). Lassú, de funkcionálisan eseménydús sejtosztódások jellemzik, melyek során az embrió méretbeli, tömegbeli növekedést nem mutat. Ez alatt történik meg az egyesülő ivarsejtek genomjának epigenetikai újraprogramozódása, az embrionális genom aktivációja (EGA) és az első differenciálódás. A laboratóriumi (házi) egér széles körben, általánosan elfogadott és választott modell szervezet az egyedfejlődés és az emberi betegségek tanulmányozásában. Az egér és az ember számos fiziológiai és patológiai tulajdonsága azonos. Az idegi, szív- és érrendszeri, endokrin, immun-, és egyéb belső szervrendszeri, valamint izom- és vázszerkezeti hasonlóságokról óriási irodalom áll rendelkezésre (Rosenthal és Brown 2007.). A
szarvasmarha,
mint
nagy
testű
kísérleti
modell
állatfaj
preimplantációs
egyedfejlődéséről szintén sok információ gyűlt már össze és ma is intenzíven tanulmányozzák. 11
Több vonatkozásban is eltér az egérétől, mint például a kisebb genom aktivációnak (minor genome activation) és az EGA-nak az időzítése. A nyúl
(Oryctolagus
cuniculus),
mint
klasszikus
modellállat
preimplantációs
egyedfejlődése, az embrionális genom aktivációja hasonló a nagy emlősökhöz és az emberhez, és e mellett metabolizmus tanulmányokban, antitest termelésben és gyógyszer hatóanyagok tesztelésében is előszeretettel használják (Graves és Moreadith 1993.). Az irodalomban ennek ellenére nincs elegendő információ az embriók molekuláris biológiai és génexpressziós vizsgálatáról. A különböző fajok génexpressziós mintázatainak összehasonlításából közelebb lehet jutni a jelenségek faji különbségektől független, általános megértése felé. Példaként az egér, mint a legkönnyebben vizsgálható és az egyik legjobban tanulmányozott emlős modellállat korai egyedfejlődése kerül bemutatásra röviden. 1.5.1 Morfológiai leírás
A petefészekből kiszabaduló érett petesejt az ampullába, a petevezeték végső kitágult szakaszába jut és itt a megtermékenyítés hatására esik át a meiózis második szakaszán. A zigótában még két külön elősejtmagban lévő haploid szülői génállományok replikálódnak, majd lezajlik az első sejtosztódás. Mivel a petesejtek érése, ovulációja és megtermékenyítése, valamint a
sejtosztódások
összehangoltak,
nem aszinkron
zajlanak, az egyes embrionális stádiumokat és a sejtosztódások időpontjait
bizonyos
időtartamokkal megadni
lehet
(6.
állatvilágban embrionális
ábra).
Az
az
első
ezek
sejtosztódások
leghosszabbak, vesznek
csak
12-24
a órát
igénybe. A létrejövő
utódsejtek még teljesen azonosak, totipotens blasztomerek, vagyis képesek
bármilyen
sejttípust
létrehozni, differenciálódni, vagy akár egyetlen blasztomer sejt is élő állattá fejlődni.
6. ábra: Az egér preimplantációs egyedfejlődése. Az 1. napon, az éjszakai fázisban történik meg a megtermékenyítés és a fejlődő embrió az 5. napon jut el a méhbe való beágyazódásig a különböző stádiumokon keresztül. (Forrás: Nagy és mtsai. 2003.a) 12
Az első néhány sejtosztódás során az embrió végighalad a petevezetéken és eljut a méhig. Habár a blasztomerek is aszinkron osztódnak, megkülönböztetjük a kétsejtes, négysejtes, nyolcsejtes, szedercsíra (vagy kompakt morula) (8-16 sejt), hólyagcsíra (vagy blasztociszta) (3264 sejt) stádiumokat, mint jellemző állapotokat (7.A ábra). A nyolcsejtes stádium végén megkezdődik egy szintén emlősökre jellemző speciális folyamat, a kompaktálódás, így a következő stádiumot kompakt morulának is nevezik (7.B ábra).
7. ábra: Egér embrió stádiumok. A) Fázis kontraszt mikroszkóppal készített fényképek: petesejt (a), zigóta (b), kétsejtes (c), négysejtes (d), korai nyolcsejtes (e), szedercsíra (f), hólyagcsíra állapot (g); ICM: belső sejtcsomó; TE: trofektoderma; B) nyolcsejtes embrió kompaktálódás előtti (h) és utáni (i) scanning elektronmikroszkópos felvétele (Forrás: Gilbert 2006.); C) beágyazódás előtt a peteburokból kibújó hólyagcsíra (j).
Az eddig gömbölyű, hézagosan elhelyezkedő blasztomer sejtek ellaposodnak, szorosabban összerendeződnek. Ezt a struktúrát a külső sejtek által kialakított számos sejt-sejt kapcsolat stabilizálja, elzárva a belső összekapcsolódó sejteket. 13
A 16 sejtes szedercsírában történik meg az első differenciálódás, kialakul az első két különböző sejttípus. A kevesebb belső sejt hozza létre az embrionális sejteket, a belső sejtcsomót (ICM), míg a többségében külső sejtek az extraembrionális sejteket, a trofektodermát (TE). Ezzel együtt elindul egy másik jelentős folyamat is: fokozatosan csökken a sejtek fejlődési potenciálja, már csak pluripotensek - vagyis sokféle, de nem minden sejttípust képesek létrehozni, valamint egymást nem képesek helyettesíteni. Az ICM sejtekből alakul ki többek között az embrió, valamint a petehártya, allantoisz, amnion, míg a TE sejtek az embrió fejlődéséhez szükséges járulékos struktúrákat, mint például a méhlepény embrionális részét, külső magzatburkot hozzák létre. A következő osztódások során a 64 sejtes állapotra lejátszódik még egy folyamat, az üregesedés. Az embrió gömbölyű felszínét adó TE sejtek folyadékot termelnek belülre, létrehozva egy üreget, a blasztocölt, melyben a TE belső felszínére kapcsolódik egyik oldalon az ICM. Ezt a jellegzetes stádiumot hívják hólyagcsírának. Itt az embrió fejlődése lelassul, a folytatáshoz szükséges a méhbe való beágyazódás. Eddig az embriót a petesejt burka, egy extracelluláris mátrix (zóna pellucida) veszi körül, mely védi az embriót az idő előtti megtapadástól a petevezetékben. A méhbe érve éri el körülbelül azt a késői hólyagcsíra állapotot, amikor a TE sejtek termelte enzimek segítségével „ki tud bújni” ebből a burokból (7.C ábra), és megtörténhet a méh falán a megtapadás, és beágyazódás (Nagy és mtsai. 2003.a; Gilbert 2006.). 1.5.2 Molekuláris megközelítés
A fent leírt embriológiai és morfológiai változások hátterében számos összetett molekuláris folyamat húzódik. A petesejt és a korai stádiumú embriók kis mérete ellenére molekuláris biológiai és genetikai kutatásokból sok információ összegyűlt a genom, az RNS és fehérje szintézis változásairól, szabályozásáról (Schultz 1986.; Edwards 2003.). Az egymást követő sejtosztódások alatt az egész genomra kiterjedő, jól szervezett és gyorsan változó génexpressziós mintázat valósul meg a normális egyedfejlődés biztosítására, szemben a felnőtt szervezet differenciálódott sejtjeivel, melyek génexpressziójára egy állandó alapmintázat a jellemző, és csak a genom kisebb része mutat változást a különféle környezeti hatásokra. Az emlősök egyedfejlődése során két jelentős epigenetikai újraprogramozódás megy végbe, mely során a génexpressziós mintázatok is megváltoznak minden sejtben. Először közvetlenül a megtermékenyítés után (preimplantációs), majd később az ivarsejtek képződésekor. Az elsőben a két ivarsejt nagyon eltérő epigenetikai mintázatú, kromatin szerveződésű és sejtciklus fázisú haploid genomjából alakul ki a zigóta diploid génállománya. Míg a kis méretű hímivarsejtben a DNS protamin fehérjékkel szorosan összetekerve, kompaktan 14
szállítódik, addig az óriási méretű emlős petesejtben a genom a testi sejtekre is jellemző hiszton fehérjékkel lazábban szervezett kromatin struktúrában van jelen. Ahhoz, hogy kialakuljon az egységesen működő genom, a két különböző struktúrának át kell alakulnia. A második genom szintű újraprogramozódás az ivarsejtek képződésekor megy végbe az előbbihez képest sokkal lassabban. Már a 11-12 napos embrióban megkezdődik egy általános DNS demetiláció a primordiális csírasejtekben (primordial germ cells: PGC), melyet de novo metiláció követ, kialakítva az ivarspecifikus imprinting mintázatot is. A hímivarsejtek esetén a folyamat a 18. napon befejeződik, míg a petesejtnél az ovulációig tart (8. ábra).
8. ábra: Az epigenetikai újraprogramozódási ciklus egérben. A preimplantációs egyedfejlődés alatt (jobb oldal), és az ivarsejtek képződésekor (bal oldal) lezajló folyamatok. ICM: belső sejtcsomó; TE: trofektoderma; PGC: primordiális csírasejtek. (Forrás: Morgan és mtsai. 2005.)
A gének aktiválásának és inaktiválásának pontos időzítése kulcsfontosságú a normális preimplantációs egyedfejlődésben. Az adott gének kifejeződésének hiánya, vagy bármilyen késése rendellenességekhez vezet, ezért az újraprogramozódásban hibátlan aktiválási időzítésnek és jól szervezett génkifejeződési mintázatnak kell megvalósulnia ahhoz, hogy megkezdődjön és folytatódjon is az embrionális egyedfejlődés. Összehasonlító tanulmányokból kiderül, hogy bár minden vizsgált emlősfajban lejátszódik az újraprogramozódás, annak mértéke és időzítése jelentősen eltérhet a fajok között a preimplantációs egyedfejlődés során (Morgan és mtsai. 2005.).
15
1.5.3 Megtermékenyítést követő változások
A megtermékenyítés után az első órától kezdve az apai kromatin szerkezet nagy átalakuláson megy keresztül, amikor a protaminok lecserélődnek a petesejtben tárolt hiszton fehérjékre, melyek közül főként a H3 és H4 hisztonok nagyon acetiláltak. Ezt követően a DNS genom szintű demetilációja kezdődik el - bizonyos régiók kivételével, mint például a centromerek heterokromatinja, és az apai metilált imprinting gének. A kromatin fellazul, és létrejön az apai elősejtmag (Santos és Dean 2004.). Ezalatt fejeződik be a petesejt második meiotikus osztódása kialakítva az anyai elősejtmagot. Általános hiszton deacetiláció zajlik le az egér petesejtben a meiózis alatt, mely szerepet játszhat a genom újraprogramozódásában. Ez elengedhetetlen előfeltétele annak, hogy a differenciálódott petesejt átalakulhasson totipotens zigótává. A meiózis két szakasza között kimutatható a kromatin szerkezet ideiglenes változása. A H4 hiszton 12-es acetilált lizinje (H4K12Ac) kulcsfontosságú epigenetikai jel, mely az aktív géneken található meg (Smith és mtsai. 2002.). Az apai és anyai elősejtmag eltérő epigenetikai - DNS metilációs, hiszton acetilációs mintázata feltehetőleg az eltérő transzkripciós aktivitást határozza meg. Amíg a petesejt megtermékenyítésekor mindkét genomban azonos mennyiségű, kevéssé acetilált hiszton H4 mutatható ki, addig ez a kiegyenlített állapot hamar megváltozik, és az apai elősejtmagban már nagyobb mennyiségben van jelen a többszörösen acetilált H4 (9. ábra) (Adenot és mtsai. 1997.).
9. ábra: Újraprogramozódás az anyai és apai elősejtmagban. Az aktív transzkripciót okozó módosítások zöld színnel, a gátlók pirossal, a protaminok lilával vannak jelölve, a színátmenetek a módosítások intenzitását, a pöttyözés a centromerek környékén található heterokromatint, valamint az imprinting mintázatot jelölik a megtermékenyítéstől a két elősejtmag egyesüléséig. Ac: acetiláció; Me: metiláció. (Forrás: Morgan és mtsai. 2005.)
Az anyai genomban több heterokromatin szerkezet található és ezzel összhangban alacsonyabb a transzkripciós aktivitás, szemben az apaival, ahol több eukromatikus régió, és lényegesen aktívabb transzkripció mutatható ki (Reik és mtsai. 2003.). Ezt az apai genomról kimutatható 16
kisebb mértékű mRNS átírást hívják kisebb genom aktiválásnak (Memili és First 2000.). A két elősejtmag egyesül, majd replikálódik, és végbemegy az első sejtosztódás létrehozva a két utódsejtet (blasztomert), melyekben már egy sejtmagban együtt található meg a két szülői genom. A kromatin szerkezeten alapuló, általános transzkripcionálisan gátolt állapot alakul ki, melyért főként a HDAC enzimek a felelősek, és amelyet később a hiszton fehérjék fokozott acetilációja vált fel (10. ábra) (Taylor és mtsai. 2003.).
10. ábra: A génexpresszió változása a korai egyedfejlődés során az egér embrióban.
1.5.4 Embrionális genom aktiváció
Az egérben az első sejtosztódás után megy végbe az első nagy fejlődésbeli átmenet: az „anyaiból embrionálisba történő átmenet”, más néven az embrionális genom aktiváció, de ezzel egyidejűleg több más jelentős molekuláris folyamat is lezajlik (Aoki és mtsai. 1997.). Az egyedfejlődési programot eredendően az anyai - petesejt - eredetű RNS-ek és fehérjék indítják el. Már a petesejtek fejlődése alatt mindenféle RNS - köztük az mRNS-ek - és fehérjék szintetizálódnak és halmozódnak fel, melyek jellemzően nagyon stabilak. A petesejt növekedése és érése során nagymértékben megváltozik az újan szintetizált fehérjék mintázata, valamint az mRNS-ek közel fele lebomlik (Bachvarova 1985.). A fejlődés zavartalan továbbviteléhez azonban új gének kifejeződése szükséges, az EGA során megtörténik a fő genom aktiváció: –
A petesejtben felhalmozott és tárolt specifikus RNS és fehérje tartalékok lebontása, melyek a megtermékenyítéshez,
az
azt
követő
első
sejtosztódáshoz
és
a
genetikai
újraprogramozódáshoz nélkülözhetetlenek, és amiket azután már nem expresszál tovább az 17
embrió. Jellemző az anyai fehérjék nagyobb lecserélődési sebessége. –
Az anyai RNS-ek leváltása embrionálisokra, amikre mind a petesejtnek, mind a korai embriónak folyamatosan szüksége van.
–
A génexpresszió elindítása, új RNS-ek átírása, amik a petesejtben még nem voltak jelen, de az embrió továbbfejlődéséhez szükségesek (Schultz 2002.). Az egérben már a kétsejtes stádium közepétől számos embrionális gén aktiválódik, és megjelennek az embrió saját maga termelte RNS-ek, fehérjék (11. ábra) (Piko és Clegg 1982.).
11. ábra: Az egér embrionális genom aktivációját kísérő molekuláris folyamatok. Pirossal az anyai, kékkel az apai, sárgával az embrionális genomhoz kapcsolódó események vannak jelölve, a színátmenetek az intenzitás változását jelzik az egyedfejlődés során. (Forrás: Schultz 2002.)
A különböző fajok között eltérés lehet, így például más rágcsálókban, mint a patkány (Rattus norvegicus) (Zernicka-Goetz 1994.), vagy aranyhörcsög (Mesocricetus auratus) (Seshagiri és mtsai. 1992.), szintén két sejtes állapotban, míg a szarvasmarhában (Mann és Bartolomei 2002.), kecskében (Capra hircus) (Sakkas és mtsai. 1989.), birkában, nyúlban később, a nyolcsejtes állapotban, a macskában (Felis catus) (Hoffert és mtsai. 1997.) és az emberben pedig a négy-nyolcsejtes állapotban zajlik le (Telford és mtsai. 1990.). 1.5.5 Az első differenciálódást kísérő változások
A génexpresszió változása sokszor a környező sejtek differenciálódására indukálódik, különböző faktorok kiválasztásával, vagy a sejt-sejt kapcsolatok változásával. Ez történik például a szedercsíra állapotban (Kidder 2002.). Az egysejtes stádiumtól kezdődően a DNS metiláció és hiszton módosítások genom szintű mintázata is folyamatosan változik az osztódásokkal. A hólyagcsíra állapot létrejöttéig 18
folyamatos a DNS demetilációja, majd amikor az embrionális (ICM) és extraembrionális (TE) sejtek külön válnak, jelentkezik először az epigenetikai mintázatban is eltérés. A TE sejtekben alacsony DNS metilációs szint mutatható ki, például az inaktív X kromoszómán. Az ICM-ben széleskörű de novo metiláció zajlik már a szedercsíra állapottól kezdve, valamint a hiszton acetiláció is fokozottabb (12. ábra). Ez az átprogramozódás szükséges az ICM sejtek pluripotenciájának fenntartásához, a későbbi sejtvonalak génexpresszió
kialakításához, helyes
valamint
beindításához
is
a az
embrióban. A két sejttípus génexpressziójának eltérő 12. ábra: Epigenetikai különbségek az egér embrió indukálása a kutatások középpontjában áll. Egér
első két sejttípusában.
ICM: belső sejtcsomó; TE: trofektoderma; Xi: inaktív X
embrionális őssejtek (embrionic stem cells: kromoszóma; többit lásd: 9. ábra. (Forrás: Morgan és ESC)
vizsgálatából
sikerült
olyan
mtsai. 2005.)
kulcsfontosságú géneket azonosítani, név szerint a Pou5f1 (Oct-4) és a Nanog homeobox transzkripciós faktorokat, melyek specifikusak az ICM sejtekre és azok pluripotenciájának fenntartásáért felelősek (Boiani és mtsai. 2002.; Mitsui és mtsai. 2003.). 1.6 Embrió technológiák
A legtöbb embrió technológia részét képezi az embriók hosszabb-rövidebb ideig tartó in vitro körülmények közötti tenyésztése, ami - mint egy nem természetes fiziológiai környezet hatással van a génexpresszióra, ezen keresztül a fejlődés menetére is (Niemann és mtsai. 2002.). Az anyai környezetből kivett és in vitro körülmények közt tenyésztett embriók a mesterséges beavatkozások hatására minőségükben, fejlődésükben eltérnek a természetes módon létrejövő, in vivo megfelelőjüktől. Feltehetőleg a tápanyagok (metionin, homocisztein, poliaminok, B12 vitamin, fólsav, urea) és környezeti hatások olyan finom változásokat indukálnak az epigenetikai újraprogramozódásban, melyek csak később nyilvánulnak meg a fenotípusban, mint a korai magzati elhalás, a születési súlyban való óriási különbségek, vagy számos felnőttkori betegség (Taylor és mtsai. 2003.). Ezért a normális egyedfejlődés folyamatainak molekuláris szintű meghatározása előfeltétele a terhesség alatti táplálkozás optimális kialakításának és a különböző embrió technológiák javításának is. Az in vitro tenyésztett embriók óriási előnye, hogy lényegesen egyszerűbb és könnyebb kísérleteket végezni velük, azonban vizsgálatukból mégsem kapható az in vivo megfelelőjükkel teljesen azonos eredmény, és ezekből nem minden esetben lehet egyértelműen következtetni a természetes fejlődési folyamatokra. A különböző biotechnológiai úton előállított emlős embriók 19
összehasonlítása fontos különbségeket tárhat fel, ezért szükség van olyan további állatmodell kísérletekre, amelyekből megérthető a korai embriók egyedfejlődési rugalmassága és amelyek eredménye által javíthatók az embrió technológiák hatékonysága és mérsékelhetők a kedvezőtlen következmények. A fontosabb mesterséges beavatkozások, melyek a későbbiekben a vizsgálatok tárgyát képezik: in vitro tenyésztés, parthenogenetikus aktiválás, krioprezerváció (fagyasztás) és vitrifikáció (mélyhűtés), valamint a sejtmagátültetés (klónozás). 1.6.1 In vitro tenyésztés
A preimplantációs egyedfejlődés mesterséges körülmények között, in vitro is hasonlóképpen végigmegy, de a folyamat nem teljesen zavartalan. Valamivel hosszabb időre van szükség a hólyagcsíra stádium eléréséig, mint in vivo, az egyes stádiumokba lassabban jutnak el az embriók, vagyis a fejlődés általános lelassulása jellemző (Harlow és Quinn 1982.). Számos kísérlet irányul az in vitro tenyésztés optimális körülményeinek feltárására, az in vivo állapot modellezésére. A fejlődéshez speciális tápoldatra, inkubációs hőmérsékletre és oxigén, illetve szén-dioxid tartalomra van szükség (lásd a „3. Anyagok, módszerek” fejezetben: „3.2.4 Embriók tenyésztése”). Az in vitro tenyésztéssel a külső környezeti feltételek hatásait lehet vizsgálni. 1.6.2 Parthenogenetikus aktiválás
A parthenogenetikus aktiváláskor a petesejtet kémiai anyagokkal indukálják. Ennek hatására megtermékenyítés nélkül megkezdi az egyedfejlődést. A petesejt mesterséges aktiválása a klónozásnak is fontos lépése. Az embrionális fejlődés beindításáért felelős, de gyakorlati alkalmazásán túl lehetőséget nyújt a belső környezeti feltételek, a petesejt és genomjának hatásai, valamint a megtermékenyülés alatt bekövetkező sejt- és molekuláris szintű változások tanulmányozására is. Ezzel az eljárással a tisztán anyai génállományú diploid sejt in vitro körülmények között szintén képes eljutni a hólyagcsíra állapotig. Élő állatot azonban nem lehet így létrehozni, mert a petesejt érésekor lezajló imprinting eredményeképpen bizonyos kulcsfontosságú gének inaktívak maradnak (Nagy és mtsai. 2003.a). 1.6.3 Krioprezerváció, vitrifikáció
A krioprezerváció (fagyasztva tartósítás, fagyasztás) lényege, hogy élő sejteket, embriókat, vagy szöveteket a hőmérséklet megfelelő mértékű csökkentésével konzerválnak, és egy későbbi időpontban - akár több évvel később - felhasználnak, így lehetővé teszi a mintanyerés és felhasználás időbeli és térbeli elkülönítését (Nagy és mtsai. 2003.b). Különleges, gyors fagyasztási eljárás a vitrifikáció (mélyhűtés): gyors fagyasztás szilárd 20
felületen (SSV), vagy műszalmában (ISV). A krioprezervációval szemben ezek során nagyobb koncentrációban alkalmaznak krioprotektáns anyagokat, több lépésben történik az ekvilibráció és nagy a hűtési sebesség, így a víztartalom amorf formában szilárdul meg, nincs ideje kristályosodni. Egér embriókon alkalmazták először sikeresen (Rall és Fahy 1985.), azóta egyszerűsége, olcsó és gyors kivitelezhetősége miatt széleskörűen elterjedt (Dinnyes és mtsai. 2000.; Vajta 2000.). Nagyon kevés információ található az embrió mélyhűtést kísérő molekuláris biológiai jelenségekről, a preimplantációs stádiumú embrió genom aktivációját, további fejlődését befolyásoló hatásairól. A beavatkozást kísérő génexpressziós változások vizsgálata magyarázatot adhat számos megfigyelt fejlődési különbségre, rendellenességre. A hűtési terhelés indukálta sejtszintű válasz során elindul a sokat kutatott programozott sejthalál folyamata is, és a felmelegítés során szintén számos gén aktiválódik (Sonna és mtsai. 2002.). 1.6.4 Klónozás
Mikromanipulációs technikával egy idegen sejt sejtmagját injektálva olyan petesejtbe, amelyiknek előzőleg eltávolították a saját sejtmagját, majd mesterségesen aktiválva képes élő állattá fejlődni (13. ábra). A testi sejtes sejtmagátültetés (SCNT) módszerét már 10 éve szinte minden gazdasági haszonállatfajon „rutinszerűen” alkalmazzák, mindennek ellenére igen alacsony hatékonyságú és növelése érdekében a technika összes lépésének javítása szükséges
13. ábra: A testi sejtes sejtmagátültetés (klónozás) lépései.
(Wilmut és mtsai. 1997.; Dinnyes és mtsai. 2002.). Sejtmag átültetéses (vagy klónozási) kísérletekből kiderült, hogy a két-, négy- és nyolcsejtes embriók, vagy a hólyagcsíra ICM és TE sejtjeinek, sőt a felnőtt egyed testi sejtjének sejtmagja is képes élő állatot létrehozni, ha azt petesejtbe viszik át (Cheong és mtsai. 1993a,b; Tsunoda és Kato 1998.; Wakayama és mtsai. 1998.). Ezt azt jelenti, hogy a petesejt citoplazmája hordozza azt a képességet, amivel át tudja 21
programozni a sejtmagot. Az értekezésnek nem lesz tárgya a továbbiakban, mégis itt említem meg a tenyésztési nehézségek, a meddőség kikerülésére alkalmazott számos mesterséges reproduktív módszert, összefoglaló nevükön asszisztált reprodukciós technikákat (ARTs), melyek az ivarsejtek mindennemű manipulációját foglalják magukba. Sok tulajdonságuk közös a klónozással, és gyakran együtt tárgyalják ezeket (Nagy és mtsai. 2003.c). A szöveti, differenciálódott sejtek sejtmagjának rendkívüli alakíthatósága ellenére a klónozás és más ARTs hatékonysága meglehetősen alacsony, eredménye nem jósolható, és rendellenességek özönét írták le a klónozott embriókban, magzatokban és utódokban. Ezekben a módszerekben az első testi sejtből klónozott emlős - Dolly nevű birka - előállítása óta sem következett be nagy áttörés. Az állatok klónozásánál felmerült problémák közül a legfontosabbak a korai vetélések gyakorisága, a vemhesség és a szülés során fellépő különféle problémák, az utód születési és fejlődési rendellenességei, illetve a klónozott utódok gyakori korai elpusztulása, melyek a gyakorlati felhasználás fő akadályai. Ezen problémák pontos oka még nem ismert, de a rendszer bonyolultságából adódóan számos technikai tényező a felelős, valamint genom újraprogramozódási hiányosságokra vezethetők vissza (Wilmut és mtsai. 2002). Az igen alacsony hatékonyságnak az egyik legfőbb oka a nem teljes vagy nem tökéletes epigenetikai újraprogramozódás, mely felveti az epimutációk jelentőségét, öröklődő jellegét is (Reik és mtsai. 2003.). 1.7 Molekuláris biológiai megközelítési lehetőségek
Az emlősök preimplantációs egyedfejlődése az egyik legnehezebben vizsgálható folyamat, melynek több gyakorlati oka is van. Az állatvilágban az emlősök petesejtje az egyik legkisebb méretű. Maradva az egér példájánál, egy frissen kiszabadult petesejt átlagosan 85 µm átmérőjű, 8 pg DNS, 0,35-0,5 ng RNS - melyből csupán 1-20 pg az mRNS - és 23 ng fehérje tartalommal, így nem meglepő, hogy nagyon nehéz kísérletekbe vonni, manipulálni. Másrészről csak kis számban termelődik, általában kevesebb, mint 10 petesejt szabadul ki egy ciklusban. Harmadsorban a beágyazódás előtti szakasz normálisan az anya szervezetén belül zajlik. Ezért a petesejtek, embriók molekuláris biológiai vizsgálata nagy kihívást jelent (Nagy és mtsai. 2003.a; Gilbert 2006.). 1.7.1 Módszertár
Korunk fejlődő molekuláris módszereinek az alkalmazásával újabb ismeretek szerezhetők az emlősök korai egyedfejlődéséről, valamint segíthetnek az állattenyésztés különböző 22
biotechnológiai módszereinek, a klónozás és az ARTs hatékonyságának, és a terápiás alkalmazások javításában (Kanka 2003.). Ilyen embrió genomikai és transzkriptomikai módszerek: a teljes genom szekvenálások, a teljes cDNS könyvtárak és EST-szekvencia (cDNSből származó rendszertelen DNS szakasz) gyűjtemények, az mRNS megkülönböztető megjelenítés (differential display: DD), a szupresszív szubtraktív hibridizáció (suppression subtractive hybridization: SSH), a szekvenáláson alapuló részleges génexpresszió vizsgálat (serial analysis of gene-expression: SAGE), a reverz transzkripcióval (RT) kombinált polimeráz láncreakció (PCR) (RT-PCR) különböző típusai (hagyományos-végpont, és kvantitatív, realtime), és napjaink forradalmian új eszköze, a DNS mikrocsip technológia (DNS síkmátrix technika) (Ko 2004., Diachenko és mtsai. 1996., Velculescu és mtsai. 1995., DeRisi és mtsai. 1996.). Az egyes azonosított expresszált embrionális gének jelentőségét és szerepét az RNS interferenciával lehet tovább vizsgálni. A kromatin epigenetikai mintázatának vizsgálatára a kromatin immunprecipitációs technika (chromatin immunoprecipitation: ChIP) szolgál. Ezeket egészíti ki számos alap fehérjevizsgáló biokémiai módszer, mint a kétdimenziós SDSpoliakrilamid gélelektroforézis, Western blot, fluoreszcens in situ hibridizáció (fluorescence in situ hybridization: FISH). 1.7.2 A génexpresszió vizsgálata
A sejtben zajló folyamatok működésbeli változásai általában akkor történnek meg, amikor a fehérjék aktivációs állapota, vagy mennyisége megváltozik. Ezzel együtt gyakran a környezeti hatásokra, a differenciálódásra adott első sejtes válaszok a gének transzkripciójában jelentkeznek, és sok nem kódoló mRNS is létezik, amelyek RNS formájában fejtik ki hatásukat (Taylor és mtsai. 2003.). Mindezek alapján a sejtek környezeti hatásokra, például az eltérő ingerekre a normális fejlődési folyamatokban, a különféle embrió technológiákra adott azonnali reakcióját a gének transzkripciójának vizsgálatával, a génspecifikus mRNS-ek mennyiségének meghatározásával, a szűkebb értelemben vett génexpresszió nyomon követésével lehet kimutatni. Az egy sejtben egy időpontban található átlagos mRNS mennyisége a 100000-es nagyságrendnek felel meg, mely körülbelül 10000 gén expressziójából ered (részletesebben: Függelékek: II. Egy sejt RNS tartalma). Ezek közül több ezer gén csak nagyon alacsony szinten (≤ 10 mRNS/sejt) fejeződik ki, ami nagymértékben megnehezíti és problémássá teszi ezeknek a globális elemzését (Kuznetsov és mtsai. 2002.). Amikor kis számú molekula határozza meg egy kémiai egyensúlyban a reakció sorsát, bizonyos fokú véletlenszerű ingadozás várható. Ahogy növekszik a molekulák (mRNS) száma, úgy nő a reakció jósolhatósága (a szintetizálódó fehérjék 23
száma) (Raser és O'Shea 2005.). Például ha egy transzkripciós aktivátor molekulából kevés található a sejtekben, nagyfokú mRNS szint különbségek várhatók a sejtek között (Fiering és mtsai. 2000.). Ezek a hatások hozzájárulnak a kimutatható nagy egyedi génexpressziós különbségekhez, valamint ez a változékonyság előre vetíti fontos szerepüket az aszimmetria létrehozásával a biológiai folyamatokban, például az egyedfejlődésben is, melyben a sejtek differenciálódását határozza meg (Elowitz és mtsai. 2002.; Peixoto és mtsai. 2004.). A sejtek génjei (DNS-e) viszonylag stabilnak, állandónak tekinthetők, ezzel szemben az RNS, különösen az mRNS állományuk, összetételük nagymértékben változó, és tükrözi a gének adott időben, adott helyen, adott környezeti tényezők melletti kifejeződését. Az RNS lényegesen instabilabb a ribonukleáz (RNáz) fehérjék jelenlétének következtében, melyek az RNS molekulákat bontják le. Az RNázok nagyon stabil enzimek, nem igényelnek kofaktorokat a működésükhöz, igen kis mennyiségben is hatékonyak, nehéz őket inaktiválni, és gyakoriak. Az RNáz szennyeződések megtalálhatók az ember bőrén, a levegőben, a porszemcséken is, ahol baktériumok, gombák tenyésznek. Ezért az RNS tisztítása és vizsgálata sajátságos technikát, különleges tisztaságot igényel. A molekuláris biológia fejlődésének köszönhetően a korai embriófejlődés során expresszált ismert gének száma fokozatosan növekszik. Mára már több mint 10000 gén működését leírták a petesejttől a hólyagcsíra állapotig terjedő időszakban, az egér genom közel egyharmadát (Ko és mtsai. 2000.; Zeng és mtsai. 2004.,2005.). Ezeknek a géneknek az mRNS mintázata igen hasznos eszköz az embriók minősítésében, kulcsfontosságú gének funkciójának a feltárásában, valamint az in vitro körülmények optimalizálásában. A normális egyedfejlődés szabályozásáról ad információt az embrió stádium specifikus génexpressziós mintázatának meghatározása. A különbségek azonosítása és a különböző rendellenes fenotípusokhoz társítása hozzájárul a molekuláris folyamatok megismeréséhez. Ezenkívül a génexpresszió minőségi és mennyiségi változásai, amik eltérést mutatnak a normálishoz képest, a későbbi fejlődési rendellenességek
lehetséges
(rejtett)
előjelei
lehetnek. A génexpressziós
mintázatok
összehasonlításával megállapítható, hogy a fejlődés normális vagy rendellenes, ami különösen fontos a preimplantációs embrió technológiákban (ARTs, SCNT). Az első alapvető lépések az összetett génszabályozó hálózatok megértése felé a génexpressziós mintázatok jellemzése a különböző embrionális stádiumokban, valamint a különböző módon előállított embriókban (in vivo, in vitro, parthenogenetikusan aktivált, mélyhűtött,
klónozott)
és
az
újraprogramozódási
folyamatok
mechanizmusának,
szabályozásának megismerése (Lechniak 2002.). Azonban több nemrégen közölt génexpressziós 24
tanulmányban nem vettek figyelembe, illetve teljesen mellőztek fontos szempontokat az eredmények értelmezésekor és tárgyalásakor. Sok génről írtak le rendellenes expressziót különböző embrió technológiák alkalmazása során, melyek azonban nem álltak összefüggésben a megfigyelt fenotípussal. Számos esetben pedig még ha a módszereket precízen alkalmazták is, a kapott különbségek funkcionális jelentőségét ritkán értelmezték (Skern és mtsai. 2005.). A génexpresszió végeredményben az egyedi sejtek szintjén szabályozódik. Ennek ellenére ma a legtöbb génexpressziós vizsgálat még mindig több száz, ezer vagy akár millió sejt felhasználásával történik gyakorlati megfontolásokból. Az így kapott „átlagos sejt” eredménye elfedi az egyedek közti különbségeket, így nem valószínű, hogy ez kitűnik egy kis sejtpopulációban, amikor teljes sejtkultúrát vagy szövetet vizsgálnak (Levsky és Singer 2003.; Bengtsson és mtsai. 2005.). 1.7.3 Reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció
Az RT-PCR új lehetőséget teremtett a preimplantációs egyedfejlődés során zajló génexpressziós változások tanulmányozásában. A módszer lényege, hogy a kis számú petesejtből, embrióból kinyert RNS-t (mRNS-t) először cDNS-sé írják át (reverz transzkripció), melyet a polimeráz láncreakció segítségével szekvencia (gén) specifikusan sokszorosítanak, hogy valamilyen módszerrel aztán könnyen detektálható, akár számszerűsíthető jelet kapjanak. A legáltalánosabban elfogadott és bevált technika a kvantitatív, reverz transzkripcióval kombinált real-time polimeráz láncreakció (qRT-PCR) módszere. Összehasonlítva a hagyományos, vagy más néven végpont RT-PCR-rel, számos előnye közül a legfontosabbak: érzékenyebb, sokkal kényelmesebb (egyszerűbben kivitelezhető), szélesebb a kimutatási tartománya, pontosabban reprodukálható (kisebb a variabilitása) és megbízhatóbb (Gal és mtsai. 2006.). A real-time PCR az eredeti PCR egyszerű elméletét (Mullis és Faloona 1987.) párosítja a fluoreszcens detektálás gyakorlatával, melyben a mennyiségi meghatározás újdonsága és alapja a küszöbérték ciklusszám (Ct). A real-time PCR során a detektálási stratégia többféle is lehet. A kísérletek során a fluoreszcens SYBR Green I festékre esett a választás, mely a szekvenciától függetlenül minden kettős szálú DNS-hez kötődik, és ekkor megnő a fluoreszcencia intenzitása. A mennyiségi mérések alapgondolata, hogy a PCR-be vitt specifikus DNS szekvencia és a kimutatható termék mennyisége között számszerű összefüggés van. A PCR során minden ciklusban egyszer, általában a végén mérik a kétszálú DNS termék fluoreszcens jelét. A mért fluoreszcencia értékeknek az idő (itt a PCR ciklusok száma) függvényében ábrázolt görbéje alapján számítható ki a Ct értéke, vagyis a PCR azon ciklusszám értéke, amelynél a reakcióban felhalmozódó termék fluoreszcens jele először meghaladja a háttértől jól elkülöníthetően a 25
kimutatási küszöbértéket. A Ct fordítottan arányos a bevitt, mérni kívánt DNS mennyiségével, vagy közvetve a kiindulási RNS mennyiségével a szigmoid görbe felfutó, exponenciális szakaszában, ahol a PCR ideális körülményei feltételezhetők. Minél kisebb ciklusszámnál mutatható ki a fluoreszcens jel, annál nagyobb a DNS/RNS kópiaszáma (Walker 2002.). A fluoreszcens alapú PCR kémia az elmúlt 6 évben központi tudományos technológiává fejlődött, és mára az „arany standard”-ként vált elfogadottá fertőző vírusok és baktériumok mennyiségi meghatározásában a klinikai mintákból, egyszerű nukleotid polimorfizmus (single nucleotide polymorphism: SNP) vizsgálatokban, genetikai változatok kimutatásában akár egyetlen sejtből is, ivari meghatározásra emberi blasztomerekből, betegségek (például tumor) diagnosztizálására, génterápia követésére, preimplantációs embriók RNS vizsgálatára, mikrochip eredmények ellenőrzésére, vagy a biotechnológiai alkalmazásokban az élelmiszerek genetikai módosításának mennyiségi meghatározására és a transzgenikus állatok zigóta jellegének, ploidia fokának pontos meghatározására, és még több más alkalmazásban (Bustin 2004.). 1.7.4 Egyedi embriók és sejtek génexpressziós vizsgálata
Munkám során a génexpresszió (az mRNS mennyiség) változásának követésére, összehasonlítására legalkalmasabb módszert, a qRT-PCR módszerét választom, mely kiválasztásának indoklását a „4. Eredmények” fejezet: „4.1.2 Kvantitatív RT-PCR módszerek összehasonlítása” részben ismertetem. A különböző felhasználási területen kipróbált módszer számtalan változata közül kiválasztottam egyet, mely reményeim szerint alkalmazható és kellően érzékeny az egyedi preimplantációs embrió minták vizsgálatára is. Részletes leírását a „3. Anyagok, módszerek” fejezet „3.3.6 Real-time polimeráz láncreakció” és „3.3.8 Kvantitatív PCR adatelemzés” részekben tárgyalom. Általában a beágyazódás előtti embriók génexpressziós vizsgálatában 5-20 egybegyűjtött embriót használnak fel a mérésekhez (Zhang és mtsai. 1994.; Gutierrez-Adan és mtsai. 1997.; Lighten és mtsai. 1997.; Wrenzycki és mtsai. 1998.; Edashige és mtsai. 2000.), és csak kivételes esetekben egyedi embriókat (Steuerwald és mtsai. 1999., Hartshorn és mtsai. 2003.). Így csak a csoport átlagos génexpressziós értéke kapható meg statisztikai értékelés nélkül, az egyedi különbségeket nem lehet vizsgálni. Az embriók közti morfológiai, fejlődési különbségek mögött bizonyosan génexpressziós különbségek állnak, melyeket eltérő epigenetikai mintázatok okoznak és így ezeknek egyéb közvetett hatásai is feltételezhetők. Fontos szempont tehát az eredmények helyes értelmezéséhez, hogy nem heterogén mintákon, hanem egyedi embriókon végezzenek kísérleteket.
26
1.8 Vizsgált gének
A különböző kísérletekben vizsgált gének teljes nevét, a dolgozatban használt rövidített nevét, valamint leírását az 1. táblázatban gyűjtöttem össze. Rövid név Gén neve Actb actin, beta, cytoplasmic
Funkció A fehérje minden eukarióta sejtben megtalálható nagy számban. A sejt alakjának fenntartásában és mozgásképességében játszik szerepet. Általában használják referenciának, mint háztartási gén (Cleveland és mtsai. 1980.; Alonso és mtsai. 1986.; Kreuzer és mtsai. 1999.). Cenpf centromere protein F A kromoszómák szétválásában játszik szerepet a mitózis során, másik neve mitozin (Zhu és mtsai. 1995.). Cirbp cold inducible RNA binding Hűtési stresszben van szerepe a sejtmagban (Nishiyama és mtsai. 1997.). protein Dazap2 DAZ associated protein 2 RNS kötő fehérje, a DAZ infertilitási faktorhoz kötődik (Yang és mtsai. 1997.). Eef1e1 eukaryotic translation A fehérje szintézisben van szerepe (Quevillon és Mirande 1996.). elongation factor 1 epsilon 1 Eif1a eukaryotic translation A fehérje szintézis megkezdésében van szerepe, és a szállításban, mint initiation factor 1A membránfehérje (Roth és mtsai. 1987.). Eif4e eukaryotic translation A fehérje szintézis szabályozásában játszik szerepet a citoplazmában initiation factor 4E (Altmann és mtsai. 1989.). G6pdx glucose-6-phosphate A sejt anyagcseréjében szerepet játszó enzim (Ruddle és Roderick 1968.). dehydrogenase X-linked Gapdh glyceraldehyde-3-phosphate Klasszikus háztartási gén, a glikolízis energiatermelő fázisában részt vevő dehydrogenase enzim (Crew és Mirskaia 1931.). H2afz H2A histone family, A kromoszómák szerveződésében és a nukleoszóma felépítésében játszik member Z szerepet (Misawa és mtsai. 2000.). Hist2h2aa2 histone cluster 2, H2aa2 A nukleoszóma felépítésében, a kromoszómák kondenzálódásában és feltekeredésében, a génexpresszió szabályozásában szerepet játszó hiszton fehérje. Háztartási gén, közismert neve H2A (Sittman és mtsai. 1983.). Hprt1 hypoxanthine guanine A purinok bioszintézisét és lebontását, valamint a hipoxantin és dopamin phosphoribosyl transferase 1 lebontását végzi (Coleman 1962.). Hspa1a heat shock protein 1A A hőhatásra adott stressz válaszban, a DNS hibák javításában, és a telomerek hosszának fenntartásában játszik szerepet, közismertebb neve Hsp70 (Lowe és Moran 1986.). Nanog Nanog homeobox Egy újonnan felfedezett transzkripciós faktor. Expresszióját korai stádiumú embriókban, embrionális őssejtekben, és többféle szövetben mutatták ki. A hólyagcsírában csak az ICM-ben van jelen, azok pluripotenciáját tartja fenn, valamint gátolja az extraembrionális endodermává differenciálódását (Kawai és mtsai. 2001.). Pgk1 phosphoglycerate kinase 1 A glikolízisben részt vevő transzferáz enzim (Kozak és mtsai. 1974.). Polr2a polymerase (RNA) II (DNA Az RNS polimeráz II legnagyobb alegysége, mRNS szintetizáló enzim directed) polypeptide A (Pravtcheva és mtsai. 1986.). Pou5f1 POU domain, class 5, Transzkripciós faktor, közismert neve Oct-4. Expresszióját korai stádiumú transcription factor 1 embriókban, embrionális őssejtekben, az érett petesejtben, és a csírasejtvonalban mutatták ki. A hólyagcsíra állapotú embrióban csak az ICM-ben van jelen, azok pluripotenciáját tartja fenn (Schöler és mtsai. 1989.; Palmieri és mtsai. 1994.). Ppia peptidylprolyl isomerase A Peptidil-prolil cisz-transz izomeráz aktivitása révén a fehérjék feltekeredésében játszik szerepet, másik neve ciklofillin A (Handschumacher és mtsai. 1984.). Rbm3 RNA binding motif protein Szerepet játszik a hűtési stresszben, a transzlációban riboszóma-kötési 3 képessége által, valamint a mikroRNS-ek közvetítette géncsöndesítésben (Derry és mtsai. 1995.). 27
Rövid név Gén neve Sfrs3 splicing factor, arginine/serine-rich 3 Slc2a3 solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 3
Funkció Az mRNS érésben játszik fontos szerepet, másik neve SRp20 (Ayane és mtsai. 1991.). Egy plazmamembrán transzportfehérje, közismert neve Glut-3. Felnőtt egérben főként az agy neuronsejtjeiben található meg, és ez az egyik első embrionálisan kifejeződő glükóz-transzporter fehérje a korai hólyagcsíra állapotú embrió trofektoderma sejtjeiben (Kayano és mtsai. 1988.; Pantaleon és mtsai. 1997.). Sod1 superoxide dismutase 1, Az oxidatív és hő stresszben, öregedésben játszik fontos szerepet. A soluble reaktív oxigén gyökök eltávolítására képes a citoplazmában, részt vesz a DNS kettős szálú töréseinek javításában, másik neve CuSOD (Selander és mtsai. 1969.). Sod2 superoxide dismutase 2, Az előbbihez hasonló, de a mitokondriumban található enzim, másik neve mitochondrial MnSOD (Creagan és mtsai. 1973.). Trp53 transformation related Egy transzkripciós faktor, a sejtciklust blokkolja, kulcsszerepe van a DNS protein 53 károsodást követő jelátvitelben, a programozott sejthalálban, közismertebb neve p53 fehérje (Oren és mtsai. 1983.). Ubc ubiquitin C Fehérjék transzláció utáni módosítását végző kisméretű szabályozó fehérje (Board és mtsai. 1992.). Ywhaz tyrosine 3-monooxygenase/ A jelátvitelben szereplő fehérje, foszforilált szerin oldalláncot képes tryptophan 5megkötni (Suen és mtsai. 1995.). monooxygenase activation protein, zeta polypeptide Hiszton-deacetilázok: közös tulajdonságuk, hogy a kromatin szerkezet módosításával, a hisztonok deacetilációjával a transzkripció szabályozását végzik. Hdac1 histone deacetylase 1 (Yang és mtsai. 1996.) Hdac2 histone deacetylase 2 (Yang és mtsai. 1996.) Hdac3 histone deacetylase 3 (Mahlknecht és mtsai. 1999.) Hdac4 histone deacetylase 4 (Jeong és mtsai. 2004.) Hdac5 histone deacetylase 5 (Verdel és Khochbin 1999.) Hdac6 histone deacetylase 6 (Verdel és Khochbin 1999.) Hdac7 histone deacetylase 7 (Kao és mtsai. 2000.) Hdac8 histone deacetylase 8 (Kawai és mtsai. 2001.) Hdac9 histone deacetylase 9 (Zhang és mtsai. 2001.) Hdac10 histone deacetylase 10 (Kao és mtsai. 2002.) Hdac11 histone deacetylase 11 (Strausberg és mtsai. 2002.) Hiszton acetil-transzferázok: hiszton acetil-transzferáz aktivitásuk révén a transzkripció szabályozását végzik. Crebbp CREB binding protein (Chrivia és mtsai. 1993.) Ep300 E1A binding protein p300 (Missero és mtsai. 1993.) Gcn5l2 GCN5 general control of amino acid synthesis-like 2 (yeast) (Xu és mtsai. 1998.) Hat1 histone aminotransferase 1 (Bulfield 1978.) Htatip HIV-1 tat interactive protein, homolog (human) (Ran és Pereira-Smith 2000.) Pcaf p300/CBP-associated factor (Xu és mtsai. 1998.) Taf1 TAF1 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-associated factor (Derry és Barnard 1989.) 1. táblázat: Az értekezésben szereplő vizsgált gének.
28
2. Célkitűzések A Genetikai Újraprogramozás Csoport 2002-ben jött létre a Wellcome Trust és az EUFP6 támogatásával a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpontban. Elsődleges célja Magyarországon meghonosítani, továbbfejleszteni és optimalizálni a különböző embrió technológiákat emlősállatokon, mint az in vitro embrió előállítást, parthenogenetikus aktiválást, mélyhűtést, embrionális őssejt tenyésztést és a testi sejtes sejtmagátültetést (klónozást). Ezek a módszerek alapvető fontosságúak a hazai biotechnológiai kutatások szempontjából, mivel lehetőséget nyújtanak új, genetikailag módosított, emberi betegségeket modellező állatok létrehozására. Jelenleg egéren és nyúlon folynak kísérletek, valamint nemzetközi együttműködés keretében patkányon, sertésen és szarvasmarhán is. A kutatások előrehaladását jelentősen segítené, ha az egyedfejlődésben, a pluripotencia kialakításában szerepet játszó gének működése vizsgálható lenne. Az értekezésben leírt kísérletek ezeket a célokat támogatták molekuláris biológiai megközelítésben. Céljaim között szerepeltek a következő vizsgálatok. (1) Egy olyan új érzékeny módszer kifejlesztése, mellyel a sejtek, embriók génexpressziós aktivitását egyedi szinten vizsgálni tudom, és nem csak csoportátlagokat, hanem a csoporton belül az egyedek közti eltéréseket, a csoport homogenitását is értékelni lehet. Kétféle reverz transzkripcióval kombinált polimeráz láncreakció (RT-PCR) módszer összehasonlítására vállalkoztam (végpont RT-PCR és real-time RT-PCR), majd egy teljes protokoll kifejlesztésére és jellemzésére. Az ellenőrzésére négy-nyolcsejtes egér embriók egyedi blasztomer sejtjeiben vizsgáltam a génexpressziót. (2) Az embrionális genom aktiváció (EGA) előtti és utáni egér embrióknak a mélyhűtésre, és az azt követő felmelegítésre, mint stresszre (terhelésre) adott válaszának összehasonlítása két különböző embrió mélyhűtési módszer alkalmazása során (gyors fagyasztás szilárd felületen és műszalmában). A referencia génnek használt Actb expressziójában tapasztalt változás miatt újabb referencia gének kiválasztása vált szükségessé. (3) Az in vitro tenyésztési körülmények és a parthenogenetikus aktiválás hatásának vizsgálata az egyedfejlődésre egér embriókban több háztartási gén expressziójának meghatározásával és ezek alapján megfelelő referencia gének kiválasztása. (4) Alkalmas referencia gének kiválasztása in vivo és in vitro előállított nyúl embriókban, valamint két, a nyúlban eddig le nem írt pluripotencia fenntartásáért felelős gén (Pou5f1 (Oct-4), Nanog) azonosítása és jellemzése. (5) Az egér és szarvasmarha preimplantációs egyedfejlődésének vizsgálata a kisebb genom 29
aktiváció és az EGA vonatkozásában. (6) Különböző hiszton acetil-transzferáz (HAT) és hiszton-deacetiláz (HDAC) enzimeket kódoló gének expressziós mintázatának meghatározása és mennyiségi jellemzése egér embriókban. Óriási előrelépést jelentene, ha a széles spektrumból ki lehetne választani azokat, amelyek aktívan szerepet játszanak a preimplantációs egyedfejlődés során lezajló újraprogramozódás molekuláris folyamataiban, valamint az EGA alatt.
30
3. Anyagok, módszerek Külön alfejezetekre bontva tárgyalom 1) a felhasznált anyagokat és vegyszereket, 2) az állatok, élő sejtek, embriók, valamint szöveti minták kezelését, és 3) az alkalmazott molekuláris biológiai módszereket. 3.1 Anyagok, vegyszerek
Az értekezésben szereplő összes kémiai anyag, vegyszer a Sigma-Aldrich Kft-től (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA) származik, kivéve ahol az eltérő eredetet zárójelben jelölöm. 3.1.1 Tápoldatok petesejt és embrió kinyeréséhez, tartásához és kezeléséhez
CZB tápoldat: 81,62 mM NaCl, 4,83 mM KCl, 1,18 mM KH2PO4, 1,18 mM MgSO4, 1,7 mM CaCl2, 25,12 mM NaHCO3, 31,3 mM nátrium-laktát, 0,27 mM nátrium-piruvát, 1 mM Lglutamin, 0,11 mM EDTA, 3 mg/ml szarvasmarha szérum albumin (BSA), 10 µg/ml gentamicin, 10 µg/ml fenolvörös (Chatot és mtsai. 1989.). M2 tápoldat: 94,62 mM NaCl, 4,78 mM KCl, 1,19 mM KH2PO4, 1,19 mM MgSO4, 4,15 mM NaHCO3, 1,71 mM CaCl2, 5,56 mM D-glükóz, 23,28 mM nátrium-laktát, 0,33 mM nátriumpiruvát, 4 mg/ml BSA, 100 egység/ml nátrium-penicillin G, 50 µg/ml streptomicin, 10 µg/ml fenolvörös, 20,85 mM HEPES. módosított TCM 199: TCM 199 (Biochrom, Berlin, Germany) kiegészítve: L-glutamin, 25 mM HEPES, 22 µg/ml piruvát, 2,2 µg/ml NaHCO3, 50 µg/ml gentamicin, 10 egység/ml vemhes kanca placentájában termelődő hormon (eCG), 5 egység/ml emberi korion gonadotróp hormon (hCG), 10 % ösztruszban lévő szarvasmarha szérum (ECS). EBSS (Earl-féle kiegyensúlyozott sóoldat): 200 µg/ml CaCl2, 6,8 mg/ml NaCl, 400 µg/ml KCl, 140 µg/ml NaH2PO4, 200 µg/ml MgSO4, 2,2 mg/ml NaHCO3, 1 mg/ml D-glükóz, 10 µg/ml fenolvörös (Earle és mtsai. 1943.). 3.1.2 Molekuláris biológiai módszerekhez használt anyagok, oldatok
Gélfuttató puffer: 25 % Ficoll 400, 0,25 % xiléncianol, 25 mM EDTA. Agaróz/TAE gél (2 %): 8 g agaróz por oldva 400 ml TAE pufferben. TAE puffer: 50x TAE puffer (242 g Tris, 57,1 ml jégecetsav, 100 ml 0,5 M EDTA (pH 8), 1 l-re kiegészítve desztillált vízzel) desztillált vízzel hígítva 50-szeresre. 31
A többi felhasznált anyag, oldat leírása megtalálható „Sambrook: Molecular cloning Appendix 1” fejezetében (Sambrook és Russel. 2001.a). 3.2 Állatok, élő sejtek, embriók kezelése 3.2.1 Állatvédelmi szabályok
A kísérletekbe vont állatok (egér és nyúl) tartása, a rajtuk alkalmazott kísérleti eljárások, valamint az állatokból kinyert petesejtek, embriók kezelése a Munkahelyi Állatvédelmi Bizottság „Állatkísérlet végzésre szóló engedély”-ével történtek (Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Gödöllő; engedély szám: 126/3/2003.). 3.2.2 Petesejt kinyerése
A
nagyobb
mennyiségű
petesejt
minta
kinyerésére
a
többszörös
ovulációt
(szuperovulációt) kiváltó gyakorlati módszert alkalmaztuk. Svájci albínó ICR (CD1) kültenyésztett egértörzsből 8 hetes nőstényeket kezeltünk intraperitoneálisan 5 egység vemhes kanca szérum gonadotróp hormonjával (PMSG, Folligon® Intervet, The Netherlands), majd 48 órát követően 5 egység hCG-vel (Choragon® Richter Gedeon Rt., Hungary). A hCG kezelés után 16 órával a nyak eltörésével (cervikális diszlokáció) megölt állatokból kivettük a petevezetéket. A kumulusz sejtektől körülvett érett petesejteket (COC) kimostuk a petevezeték ampulla részéből. A kumulusz sejteket CZB-HEPES tápoldatban (Millipore, Billerica, MA, USA) oldott 1 mg/ml hialuronidázzal távolítottuk el. Nőstény Hycole hibrid nyulakat 120 egység PMSG intramuszkuláris, majd 72 órával később 170 egység hCG intraperitoneális beadással kezeltük. A hCG kezelés után 16 órával a petesejteket kimostuk a megölt állatok petevezetékének ampulla részéből. A kumulusz sejteket M2 tápoldatban oldott 0,1 %-os hialuronidázzal távolítottuk el és a meiózis második szakaszában lévő érett petesejteket kiválogattuk. A vágóhídi szarvasmarha petefészkekből kivágott 20-25 COC-et szilikonolajjal fedett módosított TCM 199 tápoldat cseppekben tartottuk párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 39 °Con. 24 óra múlva a morfológiailag érett petesejteket elkülönítettük a kumulusz sejtektől (Eckert és Niemann 1995.). A petesejteket átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam további felhasználásig -80 °C-on.
32
3.2.3 Embriók kinyerése
A petesejthez hasonlóan a nagyobb mennyiségű embrió minta kinyerésére a szuperovulációs módszert alkalmaztuk a fent leírtak szerint. A PMSG-val és hCG-val kezelt ICR nőstény egereket pároztattuk hím egyedekkel. A hCG kezelés után 20 órával a kumulusz sejtektől körülvett zigótákat kimostuk a megölt állatok petevezetékéből. A kumulusz sejteket CZB-HEPES tápoldatban oldott 1 mg/ml hialuronidázzal távolítottuk el. A későbbi stádiumú embriókat a hCG oltást követő 38 (korai kétsejtes), 46 (késői kétsejtes), 58 (négysejtes), 65 (nyolcsejtes), 78 (szedercsíra), 93 (hólyagcsíra és késői hólyagcsíra) órában megölt állatok petevezetékéből, illetve méhéből mostuk ki. A PMSG-val és hCG-val kezelt nőstény Hycole hibrid nyulakat pároztattuk hím egyedekkel. A hCG kezelés után 20 órával a zigótákat kimostuk a megölt állatok petevezetékéből M2 tápoldattal. Morfológiájuk alapján minősítve mikroszkóp alatt válogattuk ki a két elősejtmaggal, két sarki testtel, tömör sejtplazmával rendelkezőket. A későbbi stádiumú embriókat a hCG oltást követő 26 (kétsejtes), 41 (korai nyolcsejtes), 47 (késői nyolcsejtes), 62 (szedercsíra), 98 (hólyagcsíra) órával megölt állatok petevezetékéből, illetve méhéből mostuk ki. Az embriókat átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam további felhasználásig -80 °C-on. 3.2.4 Embriók tenyésztése
A fent leírt módon kinyert egér zigótákat 20 µl 5 mg/ml BSA tartalmú CZB-HEPES oldatcseppekben, ásványolaj alatt tartottuk párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 37 °C-on. A későbbi stádiumú embriókat a hCG oltást követő 38 (korai kétsejtes), 46 (késői kétsejtes), 65 (nyolcsejtes), 93 (hólyagcsíra és késői hólyagcsíra) óráig tenyésztettük. A fent leírt módon kinyert nyúl zigótákat 50 µl EBSS (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) cseppekben, ásványolaj alatt tartottuk párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 38,5 °C-on (Mitalipov és mtsai. 1999.). Az embriókat a hCG oltást követő 26 (kétsejtes), 44 (korai nyolcsejtes), 54 (késői nyolcsejtes), 68 (szedercsíra), 103 (hólyagcsíra) óráig tenyésztettük. Az embriókat átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam további felhasználásig -80 °C-on. 3.2.5 Embriók mélyhűtése, felmelegítése
Gyors fagyasztás szilárd felületen (SSV) (Dinnyes 2000.): Az egér embriókat alapoldatban (4 mg/ml BSA-tartalmú CZB-tápoldat) való mosásuk után ekvilibráló oldatban (4 33
% etilénglikol az alapoldatban) tartottuk szobahőmérsékleten 5-10 percig. Háromszor öblítettük vitrifikációs oldat cseppekben (35 % etilénglikol, 5 % poli(vinil-pirrolidon), 400 mM trehalóz az alapoldatban) fél-fél percig, majd egy félig folyékony nitrogénbe merülő (körülbelül -180 °C-ra lehűtött) acélkocka száraz felszínére csöppentettük. Az 1-2 µl-es cseppekben vitrifikált embriókat kriocsövekben tároltuk további felhasználásig -196 °C-on folyékony nitrogénben. Felmelegítéskor a mélyhűtött mintákat 37 °C-os 300 mM trehalóz oldatba tettük 1 percre, majd rehidratáltuk szobahőmérsékleten: 150 mM trehalóz oldatba tettük 2 percre, majd 75 mM trehalóz oldatba 2 percre, aztán alapoldatba további 2 percre, végül CZB-tápoldatban tartottuk a további vizsgálatokig. Gyors fagyasztás műszalmában (ISV) (Kasai és mtsai. 1990.) módosított oldatokkal: A vitrifikációs oldat 40 % etilénglikolt, 5 % poli(vinil-pirrolidon)t, 400 mM trehalózt tartalmaz a fent leírt alapoldatban, mely így nem képez látható jégkristályokat sem a folyékony nitrogén hőmérsékletére való lehűtéskor, sem a felolvasztáskor. Az egér embriókat 4 % etilénglikol tartalmú alapoldatban tartottuk szobahőmérsékleten 5-10 percig, majd ekvilibráló oldatban 1 percig. A mintákat 250 µl-es műszalmába töltöttük, és lezárás után folyékony nitrogén gőzébe helyeztük 3 percig, végül folyékony nitrogénbe merítve tároltuk további felhasználásig -196 °Con. Felmelegítéskor a mélyhűtött mintákat 10 másodperc levegőn tartás után 37 °C-os vízfürdőbe tettük 15-20 másodpercre, majd 37 °C-os 300 mM trehalóz oldatba további 1 percre, végül rehidratáltuk a fent leírt módon. 3.2.6 Embriók szétválasztása blasztomer sejtekre
A kinyert négy- és nyolcsejtes egér embriókról savas Tyrode-oldattal (Nagy és mtsai. 2003.d) távolítottuk el a petesejt burkát (zóna pellucida) (Nicolson és mtsai. 1975.). A blasztomer sejteket tompa végű kapillárissal való finom pipettázással, mechanikusan választottuk el egymástól. Az ép, szétválasztott sejteket átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam további felhasználásig -80 °C-on. 3.2.7 Parthenogenetikus aktiválás
A kinyert érett egér petesejteket kezeltük 10 mM SrCl2-dal Ca2+-mentes, 5 µg/ml citokalazin B-vel kiegészített CZB-tápoldatban 5 órát. A sikeresen aktivált petesejteket, melyekben kialakult az egy, vagy mindkét elősejtmag, tenyésztettük tovább CZBoldatcseppekben, ásványolaj alatt, párásított, 5 % CO2 tartalmú levegőn, 37 °C-on a korai kétsejtes, késői kétsejtes, nyolcsejtes, hólyagcsíra stádiumig. Az embriókat átmosva, RNáz mentes desztillált vízben egyenként fagyasztva tároltam további felhasználásig -80 °C-on. 34
3.3 Alkalmazott molekuláris vizsgálómódszerek 3.3.1 Totál RNS izolálás emlős szövetből
A különböző állati szövetekből (pl. máj) az RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) segítségével izoláltam nagy mennyiségű RNS-t a további RT-PCR alkalmazásokhoz a használati utasításnak megfelelően. Röviden összefoglalva: 20 mg frissen fagyasztott szövetdarab homogenizálása és lízise után a 200 bp-nál hosszabb RNS-eket szilikagél membránhoz kötöttem, majd többszöri tisztító mosás után leoldottam RNáz mentes desztillált vízzel. A kinyert RNS minta koncentrációját 260 nm-en mért abszorpciója alapján határoztam meg, tisztaságát 260/280 nm-en mért abszorpciós hányadossal (> 1,95) ellenőriztem. További felhasználásig fagyasztva tároltam -80 °C-on. 3.3.2 mRNS izolálás
A különböző stádiumú embriókból, petesejtből a Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit (Invitrogen
Dynal,
CA,
USA)
segítségével
izoláltam
mRNS-t
a
további
RT-PCR
alkalmazásokhoz a használati utasításnak megfelelően. A módszer lényege, hogy mágneses polisztirol gyöngyökhöz kapcsolt 25 nukleotid hosszú dT szekvcenciák (oligo (dT)25) segítségével a feltárt sejtekben lévő, 3' végen poliA farokkal bíró mRNS-eket a bázispárosodás révén igen tisztán elválasztja a sejt többi alkotójától. Röviden összefoglalva: A sejtek, embriók lízise után hozzáadtam az oligo (dT)25 szuszpenzióját, majd a rövid inkubáció leteltével speciális mágnesre helyezve a mintákat a felülúszó többszöri lecserélésével átmostam a kötött mRNS mintát, végül rövid hőkezeléssel RNáz mentes desztillált vízben leoldottam a mágneses gyöngyökről. Az mRNS-t azonnal átírtam cDNS-sé, tisztaságát (genomi DNS szennyezés jelenlétét) az úgynevezett -RT reakcióval ellenőriztem. 3.3.3 Reverz transzkripció
Az általam használt reverz transzkripció (RT) reakcióját Sambrook: Molecular cloning 8. fejezetében leírt általános ismertetéséből, és az ajánlott módszeréből kiindulva alkalmaztam (Sambrook és Russel 2001.b). Az MMLV RT kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) felhasználásával összemért reakcióelegy a következőket tartalmazta: enzim puffer, 5 mM MgCl2, 1 mM dNTP, 2,5 µM random hexamer primer, 20 egység RNáz inhibitor, 50 egység MMLV reverz transzkriptáz enzim, RNáz mentes desztillált vízzel kiegészítve. A frissen izolált mRNS mintát, vagy fagyasztva tárolt szöveti RNS mintát (maximum 1 µg/reakció) 5 perces 70 °C-on történő hőkezelés után a reakcióelegyhez adtam 20 µl végtérfogatban. A reakció inkubációs 35
körülményei: 10 perc 25 °C-on (primer feltapadás), 60 perc 42 °C-on (cDNS szintézis), 5 perc 99 °C-on (inaktiválás). Az átírt cDNS-t -20 °C-on tároltam a későbbi felhasználásig. A genomi DNS szennyezés jelenlétét -RT reakcióval ellenőriztem, amelyben a reverz transzkriptáz enzim kihagyásával az inkubáció során a minta RNS tartalma elbomlik, míg az esetleges, épen maradt DNS tartalom az ellenőrző PCR vizsgálattal kimutatható. 3.3.4 Polimeráz láncreakció
Az általam használt polimeráz láncreakciót (PCR) Sambrook: Molecular cloning 8. fejezetében leírt általános ismertetéséből, és az ajánlott módszeréből kiindulva alkalmaztam (Sambrook és Russel 2001.b). Az összemért reakcióelegy a következőket tartalmazta: enzim puffer, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,5-0,5 µM specifikus primer, 1 egység Taq DNS polimeráz enzim (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), cDNS minta, desztillált vízzel kiegészítve 50 µl végtérfogatra. A reakció inkubációs programját MJ PT-200 PCR készüléken (MJ Research, Waltham, MA, USA) futtattam: 2 perc 97 °C-on (cDNS denaturálás), 2 perc 72 °C-on (enzim hozzáadás), majd 25-43 ciklusban: 15 másodperc 95 °C-on (denaturálás), 15 másodperc 57 °Con (primer feltapadás), 15 másodperc 72 °C-on (cDNS szintézis). A ciklusok után 5 perc 72 °Cos cDNS szintézis, végül 5 perc 8 °C-on történő leállítás következett. A reakció termékét agaróz gélen futtattam meg. 3.3.5 Agaróz gél-elektroforézis
Az agaróz gél-elektroforézist Sambrook: Molecular cloning 5. fejezetében leírt általános ismertetéséből, és az ajánlott módszeréből kiindulva alkalmaztam (Sambrook és Russel 2001.c). A PCR leállítását követően a mintákhoz gélfuttató puffert adtam. Az előre elkészített, 0,5 µg/ml etídium-bromidot tartalmazó, 2 %-os agaróz/TAE gélre 25 µl mintát vittem fel és futtattam meg 4,5 V/cm elektromos térerőn 1 órán át. A gélt High Performance Ultraviolet Transilluminator (Ultraviolet Products, Cambridge, UK) ultraibolya fényében Quantix digitális kamerával (Photometrics, Tucson, AZ, USA) fényképeztem le és az IPLab-Gel denzitometriás képelemző program (Scanalytics, Fairfax, VA, USA) segítségével értékeltem. 3.3.6 Real-time polimeráz láncreakció
A különböző kísérletekben eltérő készülékeket, reagenseket, inkubációs programokat használtam, az azonos kísérlethez tartozókat zárójelbe tett római számmal (I-II-III-IV) jelölöm (Bustin és Nolan 2004.). Az összemért reakcióelegy a következőket tartalmazta: - QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Germantown, MD, USA) (I), QuantiTect iQ 36
SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) (II), SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) (III), SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix (IV); - 0,3 (II, III, IV)-0,5 (I) µM specifikus primer; - cDNS minta; - desztillált vízzel kiegészítve 10 (I)-25 (II, III, IV) µl végtérfogatra. A reakció inkubációs programját LightCycler (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) (I), iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) (II), ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) (III), Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Mortlake, Australia) (IV) real-time PCR készüléken futtattam: - 2 (II, IV)-10 (III)-15 (I) perc 95 °C-on (cDNS denaturálás, enzim aktiválás); - majd 45 (III, IV)-50 (I, II)-55 (I) ciklusban (a denaturálás-primer feltapadás-cDNS szintézis): 15 másodperc 94 °C-on - 20 másodperc 57 °C-on - 20 másodperc 72 °C-on (I), 20 másodperc 95 °C-on - 20 másodperc 60 °C-on - 20 másodperc 72 °C-on (II), 15 másodperc 95 °C-on - 60 másodperc 60 °C-on (III), 15 másodperc 95 °C-on - 20 másodperc 60 °C-on - 30 másodperc 72 °C-on (IV). Minden ciklus végén mértem a kétszálú DNS termék fluoreszcens jelét. A küszöbérték ciklusszámokat (Ct), ahol a készülék először mért fluoreszcens jelet a háttérzaj fölött, a Rotor-Gene Real-Time Analysis Software (version 6.0.27) (Corbett Research, Mortlake, Australia) programmal határoztam meg, melyet a kétszer derivált görbék maximumának 20 %-ánál állapít meg (14. ábra). A szekvencia specifikus termék tisztaságát a reakció lezajlása után olvadáspont méréssel ellenőriztem: 30 másodperc 95 °C-on, majd visszahűtés 30 másodperc 65 °C, végül 0,1 °C/másodperc sebességgel felmelegítve 98 °C-ra folyamatosan mérve a fluoreszcens jelet. A fluoreszcencia intenzitás hirtelen csökkenése a DNS két szálának hő hatására történő szétválását, “felolvadását” jelzi. A felvett DNS olvadási görbe alapján ábrázolható a mért fluoreszcencia negatív első deriváltja a hőmérséklet függvényében (15. ábra). A kapott görbe csúcsa megadja a PCR termék olvadáspontját, a görbe alatti terület pedig arányos a termék mennyiségével (Ririe 1997.).
37
14. ábra: A küszöbérték ciklusszám (Ct) meghatározása egy hígítási sor 5 mintájában. Felül: Jellegzetes real-time PCR grafikon. A vízszintes tengelyen a ciklusszám (idő), a függőlegesen a fluoreszcencia intenzitása van feltüntetve; a görbék színárnyalata a kiindulási minta koncentrációját, a zöld görbe a negatív kontrollt jelzi. Alul: A görbék maximumának 20 %-ánál meghúzott kék vízszintes vonal és a görbék metszéspontjánál leolvashatók a Ct értékek (függőleges kék vonal).
15. ábra: PCR termékek olvadáspontjának meghatározása emlős mintákból. Felül: Jellegzetes olvadási görbe a real-time PCR specifikusságának ellenőrzésére. Alul: A leolvasható PCR termékek olvadáspontja: 24 egér minta: 89,5°C; 7 szarvasmarha minta: 86°C; a negatív kontrollban mért primer dimer: 73,5°C. (Forrás: Gal és mtsai. 2006.) 38
3.3.7 Primer tervezés
A kísérleteimben vizsgált gének szekvencia adatait (teljes szekvencia, exon-intron határok) az Ensembl (Ensembl Project database, http://www.ensembl.org) (Hubbard és mtsai. 2007.)
és
az
NCBI
(National
Center
for
Biotechnology
Information;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov) adatbázisaiból gyűjtöttem ki. A gének szekvencia adatai részletesebben megtalálhatók: Függelékek: III. A vizsgált gének szekvencia adatai. A génspecifikus primerek tervezését a Primer Express Software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) és az Oligo 6 primer elemző program (Molecular Biology Insights, Cascade, CO, USA) segítségével végeztem. A tervezés során számos feltételnek próbáltam eleget tenni: - az esetleges genomi DNS szennyezés PCR-t zavaró hatásának elkerülésére az 5' és 3' primereket eltérő exonokra helyeztem; - a primer párok legyenek hasonló hosszúak (15-30 nukleotid), és hasonló G és C nukleotid tartalmúak; - a primerek lehetőleg hasonló magas feltapadási hőmérsékletűek legyenek (± 2 °C), mely a nem specifikus feltapadás és a reakció gátlásának lehetőségét csökkenti; - a termék mérete kicsi, 80-200 bp közötti, a primerektől eltérő olvadáspontú legyen; - a cél mRNS molekula térbeli szerkezetét az RNAstructure (Version 4.5) program segítségével modelleztem (Mathews és mtsai. 2004.). Ezzel ellenőriztem, hogy a primerek megfelelő szakaszra tapadnak fel, ahol az RNS nyitottabb hurokszerű szerkezetet vesz fel és nem bázispárosodik önmagával; - a nem specifikus bázispárosodás elkerülésére nem ismétlődő szakaszokat kerestem; - az RNS tisztítás, kezelés során előforduló töredezés zavaró hatása miatt főként a gének 3' végét részesítettem előnyben, mely nagyobb valószínűséggel marad épen; - lehetőleg hasonló sokszorosítási hatékonyságúak legyenek a primer párok; - primer dimer képződés ne legyen (számottevő), a primerek 3' vége ne legyen gazdag G és C nukleotidokban, vagyis a primerek összetapadásának energiája lényegesen kisebb legyen a primer 3' vége és a termék bázispárosodási energiájánál; - a kiválasztás segítésére az Amplify 3 (Version 3.1.4) programmal modelleztem a reakciót (Engels 1993.);
39
- a nem génspecifikus bázispárosodás ellenőrzésére az összes primer párt összevetettem az NCBI nukleotid gyűjtemény, illetve egér genomi és transzkripciós adatbázisával (Nucleotide collection; Mouse genomic + transcript) a BLASTN 2.2.18 program segítségével (Basic BLAST: nucleotide blast: blastn (blastn)) (Altschul és mtsai. 1997.). Végül azokat a primer párokat választottam ki, melyek a legtöbb feltételnek eleget tettek, és a kísérleteket csak ezekkel végeztem el. 3.3.8 Kvantitatív PCR adatelemzés
A real-time PCR készüléken mért nagy mennyiségű számadatokat a megfelelő LightCycler Quantification Software 3.5 (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) (I), Bio-Rad iCycler iQ Multicolor Real-Time PCR Optical System Software Version 3.1. (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) (II), ABI PRISM 7000 SDS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA) (III), és a Rotor-Gene Real-Time Analysis Software (version 6.0.27) (Corbett Research, Mortlake, Australia) (IV) programokkal dolgoztam fel elsődlegesen, hogy kiértékelhető, összehasonlítható adatokhoz jussak. Az eljárásnak jelentős hatása van a végső eredményre, ezért ennek a menetét részletesen tárgyalom. Kísérleteimben általában a standard görbe módszerrel számítottam ki a relatív mRNS mennyiségeket a mért Ct értékekből (Rasmussen 2001.). Ennek
lényege,
hogy
először
megmértem
ismert
mennyiségű kiindulási standard mintából - májból, vagy 510 egybegyűjtött embrióból előállított cDNS törzsoldatból készített hígítási sor Ct értékeit minden egyes génre, melyből megállapítható a két mennyiség közti összefüggés. Minden hígítási sort háromszor ismételtem meg. A kapott adatsorra féllogaritmikus ábrázolásban lineáris trendvonalat illesztve számítható a regressziós egyenes (standard görbe) egyenlete:
a
meredekség
és
az
y-tengellyel
való
metszéspont, valamint a korreláció négyzete, vagyis a determinációs együttható (R2), mely az illeszkedés jóságát
16. ábra: Standard görbe módszer. Három
független
hígítási
sor
5-5
jellemzi, és esetlegesen megállapítható a kimutathatósági mintájában mért Ct értékei különböző színnel vannak ábrázolva, valamint kékkel határ is (16. ábra). a rájuk illesztett trendvonal egyenlete, A reakció exponenciális szakaszában elméletileg a PCR hatékonysága 100 %-os, vagyis minden ciklusban 40
determinációs együtthatója (R2), és az ebből számítható PCR hatékonysága (E). Az alsó kimutathatósági határ ebben az esetben a körülbelül 0,001 embrióból kapott cDNS mennyiség.
megkétszereződik a kiindulási célszekvencia mennyisége. A gyakorlatban ez általában nem teljesül és szekvenciánként, primerenként, mintánként, reakciónként is eltérő lehet, ezért a DNS, és közvetve az RNS mennyiségi meghatározásánál nagyon fontos a reakció hatékonyságát figyelembe venni: Xn = X0(1+E)n ahol Xn az n ciklus után mért cDNS mennyiség, X0 a kiindulási (meghatározandó) mennyiség, E a PCR hatékonysága (PCR efficiency), és n a ciklusszám. Meghatározására többféle módszer is használatos, mely jól közelíti a valós értéket (Rasmussen 2001.; Tichopad és mtsai. 2003.; Ramakers és mtsai. 2003.). A standard görbe meredekségéből számítható a PCR hatékonysága a következő képlettel: E = (10-1/meredekség)-1. A másik általam alkalmazott számítási módszerrel a reakciónkénti egyedi hatékonyságot vettem figyelembe a Rotor-Gene Real-Time Analysis Software (version 6.0.27) (Corbett Research, Mortlake, Australia) program Comparative Quantitation Analysis alkalmazásának segítségével. Mint minden mennyiségi értékelés esetén, az mRNS szintek összehasonlító vizsgálatánál is alapvetően szükséges az adatokat azonos viszonyítási alapra hozni, normalizálni, mely során a génexpressziós értékeket korrigálom a minták közti sejtszám, RNS tartalom és degradáció, valamint az RT hatékonyság eltéréseire, és az esetleges bemérési különbségekre. A szakirodalom sokféle lehetőséget kínál, melyek közül a háztartási gén (HKG) expressziós értékével történő normalizálás széles körben elterjedt módszer a legkülönbözőbb kísérletekben (Bustin 2000., 2002.; Huggett és mtsai. 2005.). Ezek olyan folyamatosan expresszálódó gének, amelyek termékei általában alapvetőek és nélkülözhetetlenek a minimális sejtfunkciók fenntartásában, mint például a transzkripciót, transzlációt, vagy jelátvitelt szabályozó fehérjék (Butte és mtsai. 2001.). A vizsgált gének (GOI) expressziós értékeit normalizáltam a referenciának választott gén(ek) - általában valamilyen, a kísérleti körülményektől, fejlődési stádiumoktól függetlenül változatlanul, stabilan expresszálódó háztartási gén(ek) - értékeivel: az egyes mintákban mért adott gén RNS mennyiségét elosztottam az ugyanabban a mintában mért referencia, vagy több referencia RNS mennyisége mértani középértékével. A
mintákban
mért
küszöbérték
ciklusszámokból,
és
a
meghatározott
PCR
hatékonyságokból ki tudtam számítani egy adott mintához, mint kontrollhoz - általában petesejthez, vagy blasztomer sejthez, egysejtes embrióhoz - viszonyított relatív RNS mennyiségeket (R). Az alábbi képlet leírja a számítás menetét: R = (EGOI)ΔCt(GOI)/(EHKG)Ct(HKG) ahol ΔCt = Ctkontroll-Ctminta (Livak 1997., Livak és Schmittgen 2001.; Pfaffl 2001., Pfaffl és mtsai. 2002.). Ezeket az R értékeket tüntettem fel az ábrákon.
41
Részletesebben az adott kísérlet eredményeinél, illetve a megfelelő ábráknál tárgyalom ettől az általános kiértékeléstől való eltéréseket, készülék specifikus számításokat. 3.3.9 Génexpresszió stabilitás vizsgálat
A legmegfelelőbb referencia gének kiválasztását, valamint a különböző embrió stádiumok közti génexpresszió stabilitás vizsgálatát a geNorm Visual Basic application for Microsoft Excel program segítségével végeztem (Vandesompele és mtsai. 2002.). A meghatározásnak az az alapelve, hogy két ideális referencia gén expressziójának (mRNS mennyiségének) aránya azonos minden mintában függetlenül azok eredetétől, típusától. Számítása az expressziós arányok logaritmusának szórásából történik. Egy választott gén stabilitási értéke (M) egyenlő a többi génnel páronkénti összehasonlításából kapott szórások átlagával. Az M értékek alapján sorba rendezhetők a gének, és minél kisebb az M, annál stabilabb az expresszió a vizsgált minták között. Végül a kiválasztott 3 legstabilabb referencia gén expressziójából számítható az általános normalizációs faktor (NF) is, mely a későbbiekben használható a vizsgálni kívánt gének expressziójának normalizálására. 3.3.10 Egyéb molekuláris biológiai módszerek
Az egyéb alapvető módszereket (plazmid DNS gyors alkalikus tisztítása, kompetens sejt készítése, transzformálás, DNS izolálás emlős szövetből, DNS izolálás vérből, koncentráció mérés spektrofotométerrel, DNS fenolos tisztítása, ligálás, emésztés) Sambrook: Molecular cloning 1., 6., és Appendix 8 fejezeteiből vettem át (Sambrook és Russel 2001.d).
42
4. Eredmények 4.1 Egyedi embriókon alapuló génexpressziós protokoll kifejlesztése és validálása 4.1.1 Primerek tervezési eljárásának validálása
A módszer validálása (megerősítése) több vizsgálattal történt: –
A PCR optimalizálására különböző primer koncentráció kombinációkat (0,1/0,1; 0,1/0,3; 0,3/0,1; 0,3/0,3; 0,1/0,5; 0,3/0,5; 0,5/0,1; 0,5/0,3; 0,5/0,5 µM) alkalmazva választottam ki a leghatékonyabb párosítást.
–
Az esetleges PCR-t gátló anyagok (sejtalkotók, vegyszerek) jelenlétét a minta cDNS-ben az úgynevezett SPUD módszerrel ellenőriztem (Nolan és mtsai. 2006.a).
–
Minden reakció után a felvett hőmérsékleti görbe segítségével megmértem a termék(ek) olvadáspontját, mely jellemzően szekvenciaspecifikus (15. ábra).
–
A PCR termék(ek) méretét először agaróz gélelektroforézissel ellenőriztem (17. ábra). Ehhez rendeltem hozzá az olvadáspont értékeket, így a későbbiekben
ezeket
használhattam
a
célszekvencia azonosítására. –
Ahhoz, hogy mennyiségileg összehasonlítható legyen a különböző gének különböző szakaszának expressziója különböző PCR-ben, számításba kell venni a primerek PCR hatékonyságát is. Ezt 17.
ábra: PCR termékek agaróz elektroforézis fényképe emlős mintákból.
általában
hólyagcsíra
cDNS
hígítási
sorral
gél-
A negatív kontrollban (Ne) a primer dimer
határoztam meg, mivel a korai embrionális gének képződése, az egér (E) és szarvasmarha (Sz) mintákban 182 bp nagyságú termék mutatható ki. M: molekulatömeg marker.
mindegyike kifejeződik ebben a mintában.
Összesítettem az általam sikeresen megtervezett, és a különböző kísérletekben felhasznált primer párok adatait: szekvenciájukat, pozíciójukat, ideális feltapadási hőmérsékletüket, és a specifikus PCR termék méretét (2. táblázat). A standard görbék adatait, a PCR hatékonyságokat, és a PCR termékek olvadáspontját a 3. táblázatban adom meg.
43
Gén rövid neve Actb Actb (NY) Cenpf (SZ) Cirpb Crebbp Dazap2 Eef1e1 Eef1e1 (EEF1E1) (NY) Eif1a Eif4e Ep300 G6pdx (G6PD) (NY) Gapdh Gapdh (NY) Gcn5l2 H2afz H2afz (H2AV_RABIT) (NY) Hat1 Hdac1 Hdac2 Hdac3 Hdac4 Hdac5 Hdac6 Hdac7 Hdac8
Primer párok Szekvencia (5' → 3') ATGAGCTGCCTGACGGCCAGGTCATC TGGTACCACCAGACAGCACTGTGTTG TCCGCCGCCGGCCCACACT AGTCCTTCTGGCCCATGC CCAGCTGTTGGTTTGGAGG TTGTAAAGAAAGGGTTTGC AGCTCGGGAGGGTCCTACA GACGCGGAGGGCTTTTACT GGCCAGGACCGCTTTGTTTAT GGGCTCTTGGACTGTGGCTCACC CTTATTATCCAGTTGGTCCC GTTACAAGGACGTTGGC GCGGAGTTGAGGCTGCTGGAGA AGACTCGGGCCATTGTTTGTCTG ACCGCAGAAGAGAAAGCCATAG AGCGATGTAGCCCATAGTAGAGGA AAGAAGTCTGAAGGCCTATG CAGAGAACTTGGAATGTAGC ACTGCTGTGCCTTATTGGAG CGGAGGAAGTCCTAACCTTT ATCCAGCGGTCAAGCACCAGTGTC CGGCTAGGAACAGGAGAAGGTGAA AGCCCGCCTCCACTGACTCC ACCACGTTGTCCGCCTGCAC TGACGTGCCGCCTGGAGAAA AGTGTAGCCCAAGATGCCCTTCAG CAAGTTCCACGGCACGGTCA CTCGGCACCAGCATCACCC GGGAAAGGAGAAGGGCAAGGAG CGACTGCGCAACCGTTCTGTCAT ACAGCGCAGCCATCCTGGAGTA TTCCCGATCAGCGATTTGTGGA AGAGCCGGCTGCCAGTTCC CAGTCGCGCCCACACGTCC GTGGATGATGAAAGATGGCACTACT GTGGCCCTGACCTTGAAATGGA TTCAACTTGCCCATGCTGATGC TGGTCATGTTGGAAGGGCTGATGT CCGGTGTTTGATGGACTCTTTGAGTT TCCAGCCCAATTGACAGCCATATCAG CACCCGCATCGAGAATCAGAAC TCGGCCTCGTCAGTCCTGTCATAC ACCGCTATGACGATGGGAACTTCT AGGCCACCCGTGAAAGCCATGTTG ACCGCCATCTGTGATGCCTCTGA AGTGTGGCAACCGCATTGACGCT GTTATGCCCACCTCACCCACCTAC TGGATGACCTCACTGATTGAAACC GGGCTTCAATGTCAACGTGGCTTGG AGCAAACTCTCGGGCAATGG TACTATTGCCGGAGATCCAATGTGT CGAGCCGTGTTGGCAAGGTTATAGC 44
Pozíció 798-823 964-989 42-60 212-229 8992-9011 9145-9164 545-565 597-615 5282-5302 5456-5478 319-328 483-499 30-51 117-139 103-124 269-292 654-670 805-824 413-432 568-587 2770-2793 2905-2928 842-861 910-929 728-747 802-825 230-249 329-347 2184-2205 2359-2381 314-335 494-515 61-79 127-145 612-636 767-788 885-906 1045-1068 512-537 597-622 1029-1050 1158-1181 2672-2695 2754-2777 3305-3327 3398-3420 1472-2495 2650-2673 2365-2389 2457-2476 885-909 998-1022
Ta Termék (°C) mérete (bp) 60
192
60
188
50
173
60
71
60
197
55
181
60
110
68
190
55
171
55
175
60
159
60
88
60
98
68
118
60
198
60
202
59
85
60
177
60
184
56
111
60
153
60
106
60
116
60
202
60
112
60
138
Gén rövid neve
Primer párok Szekvencia (5' → 3') Hdac9 CGTCCCTGCCCAATATCACTCTG AACGTGGCTGGAGGACGCTGCAATG Hdac10 TGGAATCATGGATGGGCAGATAAGA TGTCCCAGGGCCACACAGAG Hdac11 CATCTTTCTTCCCAACTTCCTTGTG CTCCACAGCCAGCTTCCCTGC Hist2h2aa2 GTCGTGGCAAGCAAGGAG GATCTCGGCCGTTAGGTACTC Hprt1 GCTTGCTGGTGAAAAGGACCTCTCGAAG CCCTGAAGTACTCATTATAGTCAAGGGCAT Hprt1 (O46381_RABIT) (NY) ACGTCGAGGACTTGGAAAGGGTGTT GGCCTCCCATCTCCTTCATCACATC Hspa1a AAGAACGCGCTCGAGTCCTAT TTGTCAGCCTCGCTGAGCTT Htatip CCGCCTCAAGCCGTGGTACTTC GAGATGGTGCCCTTGCGGTAAAT Nanog TGGTTGAAGACTAGCAATGGT GTCTGGCTGCCCCACAT Pcaf TAAAGAGCCCAAAGACCCTGAGCA CCCGGAGCTTCTGTTCTCTTCACT Pgk1 (PGK1) (NY) TGTTGGTCGGGCGAAGCAG CAGTGTCTCCACCGCCGATG Polr2a (POLR2A) (NY) AGACTTCTCGGCCCGCACTG ACTTGGCGCCTGGGTACTGG Pou5f1 CCACCATCTGTCGCTTCG CACCAGGGTCTCCGATTTG Pou5f1 (ember) AGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAG AGGAGTACAGTGCAGTGAAGTGAG Pou5f1 CGAGTGAGAGGCAACTTGG (ENSOCUG00000017160) CGGTTACAGAACCACACACG (NY) Ppia CGCGTCTCCTTCGAGCTGTTTG TGTAAAGTCACCACCCTGGCACAT Ppia (PPIA_RABIT) (NY) TCCAGGGTTTATGTGCCAGGGTG CGTTTGCCATGGACAAGATGCC Rbm3 CACCTTCACAAACCCAGAGCAT GATTTGGCGCCCATCCA Sfrs3 GCGCAGATCCCCAAGAAGG ATCGGCTACGAGACCTAGAGA Slc2a3 CTTCTGAGAGCGGCTTCTG CAACAGTCACGGCGAACA Sod1 ACCTCATTTTAATCCTCACTCTAAGAAAC ATTGGCCACACCGTCCTTT Sod2 TTACAGATTGCTGCCTGCTCTAAT ATCCCCAGCAGCGGAATAA Taf1 CCCCGTGTGCTTCAAGAGAATAC GGGTGTTGGACTTGGGATCAGG Trp53 GCTTCTCCGAAGACTGGATGA AGAGGGAGCTCGAGGCTGAT Ubc CGTCGAGCCCAGTGTTACCACCAAGAAGG CCCCCATCACACCCAAGAACAAGCACAAG
45
Pozíció 974-996 1113-1137 1611-1635 1726-1745 336-360 412-432 51-68 212-232 579-606 666-695 83-107 154-178 1618-1638 1684-1703 720-741 877-899 664-684 778-794 2115-2138 2211-2234 972-989 1101-1120 1077-1096 1233-1252 573-590 691-710 628-653 1039-1062 718-736 823-842 100-121 226-249 102-124 217-238 232-253 291-307 336-354 472-452 29-47 163-181 302-330 389-407 543-566 595-613 3547-3569 3679-3700 520-540 567-586 1920-1948 2003-2031
Ta Termék (°C) mérete (bp) 60
164
60
135
60
97
60
182
60
117
68
96
60
86
60
180
60
131
60
120
60
149
68
176
60
138
60
435
57
125
60
150
68
137
60
76
60
137
60
153
60
106
60
71
60
154
60
67
60
112
Gén rövid neve Ywhaz (YWHAZ) (NY)
Primer párok Szekvencia (5' → 3') GGTCTGGCCCTTAACTTCTCTGTGTTCTA GCGTGCTGTCTTTGTATGATTCTTCACTT
Ta Termék (°C) mérete (bp)
Pozíció 505-533 68 618-646
142
2. táblázat: Primer adatok. Ta: feltapadási hőmérséklet; NY: nyúl szekvenciára tervezett primerek; SZ: szarvasmarha szekvenciára tervezett primerek. Gén rövid neve
Y tengely Meredekség Determinációs PCR Tm (°C) metszéspontja együttható (R2) hatékonyság (E)
Actb
22,16
-2,96
0,99
1,17
86
Actb (NY)
21,88
-3,37
0,98
0,98
92
Cirpb
36,56
-2,64
0,97
1,40
78
Eef1e1
26,95
-2,87
0,96
1,23
86
Eef1e1 (EEF1E1) (NY)
20,73
-3,51
0,97
0,93
84
G6pdx (G6PD) (NY)
23,84
-3,48
0,99
0,94
86
Gapdh
21,69
-3,49
0,98
0,93
86
Gapdh (NY)
18,58
-3,43
0,99
0,96
87
H2afz
21,20
-3,81
0,99
0,83
86
H2afz (H2AV_RABIT) (NY)
19,18
-3,62
0,99
0,89
88
Hist2h2aa2
41,43
-3,72
0,98
0,86
89,5
Hprt1
23,02
-3,57
0,97
0,91
82
Hprt1 (O46381_RABIT) (NY)
22,87
-3,44
0,99
0,95
82
Hspa1a
37,83
-2,58
0,96
1,44
83
Nanog
38,52
-3,50
0,97
0,93
86,5
Pgk1 (PGK1) (NY)
17,12
-3,55
0,99
0,91
86
Polr2a (POLR2A) (NY)
22,33
-3,42
0,96
0,96
89
Pou5f1
29,51
-3,65
0,99
0,88
87
Pou5f1 (ENSOCUG00000017160) (NY)
17,32
-3,83
1,00
0,82
88
Ppia
20,84
-3,71
0,98
0,86
84
Ppia (PPIA_RABIT) (NY)
16,31
-3,55
1,00
0,91
86
Rbm3
35,04
-2,54
0,93
1,48
79
Slc2a3
44,72
-3,32
0,96
1,00
86
Sod1
33,48
-3,20
0,99
1,05
82
Sod2
33,03
-3,01
1,00
1,15
78
Trp53
37,41
-2,98
0,95
1,17
79
Ubc
23,32
-3,67
0,97
0,87
84
Ywhaz (YWHAZ) (NY)
20,09
-3,42
0,99
0,96
82
3. táblázat: Standard görbe, PCR hatékonyság, és olvadáspont adatok. Tm: a PCR termékek olvadáspontja; NY: nyúlban mért értékek.
46
4.1.2 Kvantitatív RT-PCR módszerek összehasonlítása
A kvantitatív végpont és real-time RT-PCR (I) összehasonlításakor vizsgáltam a két módszer érzékenységét (alsó kimutatási határát), mérési tartományát, és a megbízhatóságát (reprodukálhatóságát). Egér máj cDNS törzsoldatból készített hígítási sorában mértem a Hist2h2aa2 (H2A) gén expresszióját, melyből azt az eredményt kaptam, hogy a real-time RT-PCR: –
több mint két nagyságrenddel érzékenyebb, vagyis alacsonyabb az alsó kimutatási határa (1 pg mRNS) szemben a végpont RT-PCR-rel (50 pg mRNS);
–
legalább két nagyságrenddel nagyobb a mérési tartománya (1 pg-50 ng mRNS) szemben a végpont RT-PCR-rel (50 pg-50 ng mRNS), azonban a felső határt nem sikerült elérni;
–
standard görbéjének determinációs együtthatója jobban közelít az 1-hez (R2=0,982) szemben a végpont RT-PCR-rel (R2=0,937), vagyis az illeszkedés jósága miatt megbízhatóbbak az így mért eredmények (18. ábra) (4. táblázat).
18. ábra: A kétféle RT-PCR módszerrel kapott standard görbék.
Jellemzők Real-time RT-PCR Végpont RT-PCR Mérési tartomány 1 pg - 50 ng cDNS 50 pg - 50 ng cDNS Alsó kimutatási határ 1 pg cDNS 50 pg cDNS 2 Standard görbe determinációs együtthatója R = 0,982 R2 = 0,937 Mért értékek Relatív szórás Mintaszám Kiindulási minta
Ct: 35,43 ± 0,29 CV = 18,63 % n = 32 50 pg cDNS
Denzitometriás érték: 134789 ± 50893 CV = 37,76 % n = 31 500 pg cDNS
4. táblázat: A kétféle RT-PCR módszer összehasonlítása.
Egy-egy kiválasztott hígítási ponton mérve a reprodukálhatóságot, a 30 mérés ismétlése alapján a real-time RT-PCR bizonyult megbízhatóbbnak. Az adott standard törzsoldathoz viszonyított RNS mennyiségek relatív szórás értéke (CV=18,63 %) kevesebb, mint fele volt a végpont RT-PCR értékénél (CV=37,76 %) (4. táblázat). A minta számának növekedésével ez a 47
különbség az n=8 mintáig nem volt kimutatható (19. ábra).
19. ábra: A kétféle RT-PCR módszer reprodukálhatósága.
4.1.3 Protokoll kidolgozása, jellemzése
A kiválasztott real-time RT-PCR módszer lépéseinek - az mRNS tisztítás, RT és PCR technikai hibáját úgy mértem meg, hogy az egér máj RNS törzsoldat egy kiválasztott, az egyedi egér embriók expressziós szintjét közelítő hígítása A) 10 azonos mennyiségű mintájából izoláltam mRNS-t, átírtam cDNS-sé; B) 10-szeres mennyiségű mintájából izoláltam mRNS-t, és 10 egyenlő részét átírtam cDNS-sé; C) 10-szeres mennyiségű mintájából izoláltam mRNS-t, átírtam cDNS-sé, és 10 egyenlő részre osztottam; majd real-time PCR-rel (I) mértem a Hist2h2aa2 gén expresszióját minden mintában. Az így kapott 10-10-10 ismétlés relatív szórása: A) az mRNS tisztítás, RT és PCR együttes technikai hibája (CV=27,43 %); B) az RT és PCR (CV=12,74 %); C) a PCR technikai hibája (CV=21,21 %). A protokollban rejlő hibát összehasonlítottam 4-6 egyedi, in vivo egér zigótában, nyolcsejtes embrióban és hólyagcsírában mért CV értékeivel: 58,28 %, 159,06 % és 49,62 %, melyek a minták közti egyedi eltérésekből - a biológiai különbségekből - és a mérés technikai hibájából tevődnek össze (5. táblázat). Az embrió minták CV értékei 2-5,5-szer nagyobbak voltak a technikai hibáknál, vagyis a „mérési zaj”-on túl is kimutathatók az embriók, egyedi sejtek közti expressziós különbségek. Lépések, minták Szórás real-time PCR CV = 21,21 % (Ct: 35,41 ± 0,33) RT + real-time PCR CV = 12,74 % (Ct: 35,11 ± 0,21) mRNS tisztítás + RT + real-time PCR CV = 27,43 % (Ct: 35,21 ± 0,48) Zigóta Nyolcsejtes embrió Hólyagcsíra
Megjegyzés C) cDNS standardból (n = 10) B) mRNS standardból (n = 10) A) RNS standardból (n = 10)
CV = 58,28 % (Ct: 34,66 ± 0,50) (n = 5) CV = 159,06 % (Ct: 34,54 ± 1,48) (n = 6) CV = 49,62 % (Ct: 35,28 ± 0,56) (n = 4)
5. táblázat: A real-time PCR-en alapuló protokoll egyes lépéseinek technikai hibái és a biológiai különbségek. 48
4.1.4 Protokoll ellenőrzése
Hat darab négy- és hat darab nyolcsejtes egér embriót blasztomer sejtjeire szétválasztva vizsgáltam az egyedi sejtekben a kiválasztott gének expresszióját: Actb (referencia), Nanog, Pou5f1, Slc2a3 (II). Sikerült a négysejtes embriók 21 sejtjéből kimutatni a Nanog és a Pou5f1 géneket (20. ábra). A nyolcsejtes embriók 60 sejtjéből mindhárom vizsgált gén relatív mRNS szintjét meghatároztam (21. ábra). Egyes sejtekben semmilyen mRNS-t nem sikerült kimutatni, feltehetőleg azok a szétválasztás, és gyűjtés során sérültek meg, illetve vesztek el. A négysejtes blasztomerjeiben Slc2a3
embriók nem
expressziót,
találtam a
Nanog
expressziójában 9-szeres, a Pou5f1 expressziójában
10-szeres
különbségeket mértem egy embrió 4 sejtje között. A nyolcsejtes embriók sejtjeiben a Nanog génnél nagyobb, 28-szoros
expressziós
különbségeket, a Pou5f1-nél kisebb,
20. ábra: Génexpresszió négysejtes embriók egyedi sejtjeiben.
2-8-szoros, és a Slc2a3 génnél 12- Az azonos embrióból származó értékek azonos színnel és betűvel vannak jelölve: A, B, C, D, E, F jelű embriók 1, 2, 3, 4 számú sejtjei. X
szeres
különbségeket
kaptam. jellel vannak megkülönböztetve azok a minták (E/1; F/1; F/2),
Egyazon embrió blasztomer sejtjei
amikben nem volt kimutatható génexpresszió.
között egy a négyből kiemelkedően magas Pou5f1 expressziót mutatott a négysejtes embriókban, és kettő a nyolcból kiemelkedően magas Nanog expressziót a nyolcsejtes embriókban.
49
21. ábra: Génexpresszió nyolcsejtes embriók egyedi sejtjeiben. Az azonos embrióból származó értékek azonos színnel és betűvel vannak jelölve: G, H, I, J, K, L jelű embriók 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 számú sejtjei. X jellel vannak megkülönböztetve azok a minták (I/8; J/7; J/8; K/7), amikben nem volt kimutatható génexpresszió. Egy mintánál két sejtet nem sikerült szétválasztani, ott két sejtből (G/1-2) történtek a mérések.
4.2 Embrió mélyhűtési módszerek összehasonlítása
A kísérletben vizsgáltam a Cirpb, Hspa1a, Rbm3, Sod1, Sod2, Trp53 és Actb (referencia) gének expressziójának változását egy- és nyolcsejtes egér embriók szilárd felületen (SSV) és műszalmában (ISV) történő vitrifikációja során. A felmelegítés után 3 órával az RNS szintjén azonnal bekövetkező gyors reakciót, a felmelegítés után 10 órával jelentkező lassú reakciót, 50
amikor a sejtosztódások már elkezdődtek, vagy teljesen le is zajlottak, valamint a hólyagcsíra állapotig in vitro tovább tenyésztett embriókban az esetleges maradandó változásokat mértem csoportonként 6-6 egyedben. A közös viszonyítási pont az in vivo egy- és nyolcsejtes egér embriók, kontrollként a mélyhűtés nélkül in vitro tenyésztett, megfelelő időpontokban vett embriók génexpressziós értékei szolgáltak (III). Az egysejtes embriókban az ISV-nél a 3 órás időpontban mind a hat vizsgált gén expressziója megemelkedett a kontrollhoz képest 2-33-szoros mértékben, míg az SSV-t követően csak kisebb mértékű (0,3-2-szeres) változásokat mértem. Az ISV embriókban 10 órával a felmelegítés után mind a hat gén expressziós értéke visszacsökkent a kontrollhoz közeli értékre, a Cirbp, a Hsp70 és a Trp53 értéke szignifikánsan kisebb a 3 órás értékekhez képest. Az SSV-nél ugyanakkor csak kismértékű eltérések találhatók a kontrollhoz és a 3 órás értékekhez képest is. Figyelemre méltó a Trp53 csökkenése 10 óránál mindkét kezelésnél (22. ábra).
22. ábra: Mélyhűtés hatása a génexpresszióra egysejtes egér embriókban. A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve; a és b: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05). K: in vivo kontroll; V: in vitro kontroll; SSV: gyors fagyasztás szilárd felületen; ISV: gyors fagyasztás műszalmában; 3 és 10: a felmelegítéstől eltelt idő órában.
A nyolcsejtes embriókban eltérő génexpressziós mintázatot kaptam. Az ISV-nél a 3 órás időpontban hasonlóan az egysejtes embriókhoz mind a hat vizsgált gén expressziója 51
megemelkedett - közülük a Cirbp és a Sod2 szignifikánsan. Ezzel ellentétben az SSV-t követően a Hsp70 és a Trp53 mutatott jelentős növekedést. Mindkét kezelésben 10 órával a felmelegítés után hasonló expressziós mintázatot, megemelkedett szinteket kaptam, kivéve az Rbm3 esetében, valamint az ISV-nél a Sod1 és a Trp53 esetén (23. ábra). Fontos felhívni a figyelmet arra, hogy a referencia Actb gén expressziója a nyolcsejtes ISV embriókban váratlanul megemelkedett, míg az összes többi esetben nem tapasztaltam eltérést, viszonylag állandó szintet mértem (24. ábra). Ebből kifolyólag a nyolcsejtes eredményeket nem sikerült normalizálni, melyet az ábrán is külön kihangsúlyoztam.
23. ábra: Mélyhűtés hatása a génexpresszióra nyolcsejtes egér embriókban. A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a és b: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05). K: in vivo kontroll; V: in vitro kontroll; SSV: gyors fagyasztás szilárd felületen; ISV: gyors fagyasztás műszalmában; 3 és 10: a felmelegítéstől eltelt idő órában.
A hólyagcsírákban nem találtam szignifikáns különbségeket, az egysejtes embriók esetében 2,6-szoros, a nyolcsejtes embrióknál 5-szörös volt a legnagyobb eltérés a különböző csoportok között.
52
24. ábra: Az Actb gén expressziójának változása a mélyhűtés hatására. A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a és b: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05). K: in vivo kontroll; V: in vitro kontroll; SSV: gyors fagyasztás szilárd felületen; ISV: gyors fagyasztás műszalmában; 3 és 10: a felmelegítéstől eltelt idő órában.
4.3 Egér egyedfejlődésének összehasonlítása különböző körülmények között
A kísérlet célja volt több különböző és független sejtfunkciókban szerepet játszó, az irodalomban klasszikusnak számító háztartási gén alkalmasságának vizsgálata egér petesejtekben és embriókban. A gének expressziós stabilitásának meghatározásával és sorba rendezésével kiválaszthatók a normalizálásra legalkalmasabbak a jövőbeni kísérletekhez. A kiindulási 12 génből (Actb, Bmp7, Eef1e1, Gapdh, H2afz, Hist2h2aa2, Hprt1, Polr2a, Ppia, Tbp, Tubb4, Ubc) elővizsgálatok és optimalizálás után választottam ki az összehasonlító vizsgálatba vont 7 legalkalmasabbat: Actb, Gapdh, Eef1e1, H2afz, Hprt1, Ppia, Ubc. A három különböző kezelésitenyésztési csoport (in vivo, in vitro, valamint a parthenogenetikus aktivált és in vitro tenyésztett) közös viszonyítási pontjául az in vivo kinyert petesejtek szolgáltak. A vizsgálatban a korai és késői kétsejtes, nyolcsejtes, hólyagcsíra és késői (kibújó) hólyagcsíra stádiumú embriókban mértem csoportonként 6-6 egyedben a kiválasztott 7 gén expresszióját, kivéve a parthenogenetikus aktivációt, ahol a késői hólyagcsíra állapotig nem jutnak el az embriók (IV). Általánosságban mindhárom csoportban a legtöbb gén expressziója növekedett a korai kétsejtes állapotban, legnagyobb mértékben az Eef1e1 (4-8-szorosan), majd lecsökkent a késői kétsejtes állapotban, kivéve a H2afz és a Ppia géneket, melyek folyamatos emelkedést mutattak. A kétsejtes állapottól kezdve a késői hólyagcsíráig mindegyik gén expressziója növekedett a fejlődés előrehaladtával és a sejtszám növekedésével. Az összehasonlításból jól látható, hogy az in vivo embriókban a két hólyagcsíra állapot között a növekedés tovább folytatódott (1,3-2,6szoros), ezzel szemben az in vitro mintákban hasonló expressziós szinteket kaptam (25-27. ábrák).
53
25. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vivo egér embriókban. A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c és d: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
54
26. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vitro egér embriókban. A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c és d: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
55
27. ábra: A referencia gének expressziós mintázata parthenogenetikusan aktivált egér embriókban. A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b és c: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
A csoportok közti eltéréseket értékelve a kétsejtes állapotban hasonló expressziót mutattak a különböző csoportok, kivéve a korai kétsejtes állapotban a H2afz és Ppia gének, ahol szignifikánsan alacsonyabbak voltak az in vitro és parthenogenetikus minták értékei, valamint a késői kétsejtes állapotban a Gapdh gén, melynél szignifikánsan magasabb volt az in vitro minták értéke. A nyolcsejtes állapotban az in vitro értékek valamivel magasabbak voltak, a hólyagcsíra állapotokban ellenben az in vitro és parthenogenetikus minták értékei alacsonyabbak voltak, melyek közül szignifikánsan eltértek az Actb, Eef1e1 és H2afz géneké (28. ábra).
56
28. ábra: A referencia gének expressziójának összehasonlítása a különböző egér embriókban. A grafikonon az n=6 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; * az in vivo mintáktól, # az in vitro mintáktól való szignifikáns eltéréseket jelöli (p<0,05).
A gének expressziós stabilitási értékeit (M) a geNorm Visual Basic application for Microsoft Excel program segítségével határoztam meg a három csoportban külön-külön (29. ábra). A H2afz, Hprt1 és Ppia gének mutatkoztak a legstabilabbaknak, majd sorra következtek: Ubc, Gapdh, Eef1e1, és Actb gének. A legkevésbé stabil az Actb volt az in vivo és az in vitro csoportok
esetében,
míg
a
parthenogenetikus csoportban az Eef1e1. A három csoportból az in vivo M értékek voltak
a
legalacsonyabbak,
és
parthenogenetikusé a legmagasabbak.
a 29. ábra: A referencia gének expressziós stabilitási értékei a különböző egér embriókban.
4.4 Nyúl egyedfejlődésének vizsgálata
A kiindulási 13 génből (Actb, B2m, Eef1e1, G6pdx, Gapdh, H2afz, Hprt1, Pgk1, Polr2a, Ppia, Tbp, Ubc, Ywhaz) elővizsgálatok és optimalizálás után választottam ki az összehasonlító vizsgálatba vont 10 legalkalmasabbat: Actb, Eef1e1, G6pdx, Gapdh, H2afz, Hprt1, Pgk1, Polr2a, Ppia, Ywhaz. A választott 10 referencia gén expresszióját sikerült megmérni és azonosítani 57
petesejtben, egysejtes embriókban, az in vivo és in vitro kétsejtes, korai és késői nyolcsejtes, és hólyagcsíra stádiumú embriókban csoportonként 5-5 mintában (IV). A más fajokban már meghatározott homológ Pou5f1 és Nanog szekvenciák összehasonlításából kiindulva próbáltam azonosítani ezeket a géneket nyúlban is. A kiindulási viszonyítási pont az in vivo gyűjtött petesejtek voltak, az egysejtes embriók szintén csak in vivo álltak rendelkezésre. Az Actb gén esetében különös körültekintéssel jártam el. Három különböző szekvenciára is terveztem primereket, melyek közül végül az X60733 azonosítójú, és hibásan „ACT-5”-nek (gamma nonmuscle actin) nevezett NCBI referencia szekvenciát választottam. A nukleotid és az aminosav szekvenciák ortológ szekvenciákkal történő összehasonlítása is megerősítette, hogy ez hasonlít a legjobban a többi fajban leírt Actb génhez, és az adatbázis kezelői is visszajeleztek, hogy a megnevezésük valóban hibás. Az egysejtes állapotra csökkent az Eef1e1, G6pdx, H2afz, Hprt1, Pgk1 és Ppia gének expressziós szintje, ellenben növekedett az Actb, Gapdh és Polr2a géneké. Általában a referencia gének expressziós mintázata hasonló volt mindkét tenyésztési körülmények között: a nyolcsejtes állapotig csökkenő mRNS szinteket, majd a szedercsíra és hólyagcsíra állapotokban kimagaslóan magas értékeket mértem az Actb, Gapdh és Ppia esetében. A H2afz, Hprt1, Ywhaz géneknél folyamatos emelkedett az expresszió, és a nyolcsejtes állapotban sem történt visszaesés (30-31. ábrák).
58
30. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vivo nyúl embriókban. A grafikonon az n=5 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c, d és e: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
59
31. ábra: A referencia gének expressziós mintázata in vitro nyúl embriókban. A grafikonon az n=5 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve NEM normalizált értékekkel; a, b, c, d és e: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05); * az in vivo mintáktól való szignifikáns eltéréseket jelöli (p<0,05).
Az in vitro tenyésztés hatását elemezve a génexpressziós mintázatok nagy hasonlóságot mutattak mind a 10 referencia génre. Általában az in vivo embriókban mért expresszió magasabb volt (kivéve az Actb és Pgk1) szignifikáns eltéréssel a kétsejtes állapotban az Eef1e1, G6pdx, 60
Ppia és Ywhaz géneknél, a szedercsíra állapotban az Actb, Gapdh, H2afz, Ppia és Ywhaz géneknél, valamint a hólyagcsíra állapotban a Hprt1 és Polr2a gének esetében. Ezzel szemben a nyolcsejtes állapotban az in vitro embriókban volt magasabb az expressziós érték, az Actb, Eef1e1, Gapdh és Ywhaz géneknél szignifikáns különbséggel (30-31. ábrák). A gének expressziójának stabilitását elemezve hasonló M értékeket és a sorrendben kisebb eltérést kaptam az in vivo és in vitro mintákban. A három legstabilabb gén az in vivo minták esetén: H2afz, Hprt1, Ywhaz, majd sorra: Actb, Ppia, G6pdx, Gapdh, Eef1e1, Polr2a, Pgk1. Az in vitro minták esetén: H2afz, Ywhaz, Hprt1, majd G6pdx, Ppia, Gapdh, Eef1e1, Polr2a, Actb, Pgk1, vagyis a három legstabilabb gén mindkét esetben ugyanaz volt (32. ábra).
32. ábra: A referencia gének expressziós stabilitási értékei a különböző nyúl embriókban.
Az egyes fajokból származó ismert Nanog és Pou5f1 szekvenciákat számítógépes programok segítségével elemezve a konzervált régiók homológ szakaszaira olyan univerzális PCR primer párokat terveztem, melyekkel reményeim szerint a nyúl embrió mintákból génspecifikus cDNS szakaszokat lehet kimutatni, kinyerni és azonosítani. A teljes genom szintű összehasonlítások alapján a nyúl genomja az ismertek közül az emberéhez hasonlít a legjobban. Az emberi szekvenciára optimalizált univerzális primer párokkal sikerült egy 131 nukleotid hosszú Nanog, és egy 435 nukleotid hosszú Pou5f1 cDNS részletet kimutatni 10 egybegyűjtött embrió mintából, valamint meghatározni a szekvenciáját a nyúlban elsőként. Szekvencia elemzésnek alávetve, a homológiaviszonyok alapján csak a több más fajban már leírt Pou5f1 génekkel mutatott nagyfokú hasonlóságot (Függelékek: IV. A nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása), míg a feltételezett nyúl Nanog szekvencia egér és emberi pszeudogénekhez is hasonlított. Ezek alapján új, már nyúl specifikus primerekkel és a kiválasztott referencia génekkel lehetett a Pou5f1 expresszióját meghatározni a különböző
szöveti
mintákban,
és
33.
ábra:
A
Pou5f1
embrió expressziója nyúlban.
gén
szövetspecifikus
stádiumokban. A szövetspecifikus vizsgálatban a A PCR termékek agaróz gél-elektroforézis Pou5f1 gén expresszióját mutattam ki agyban, fényképe különböző szöveti mintákból: A: agy; I: izom; B: bőr; L: lép; M: máj; V: vese; P: petefészek; MM: molekulatömeg marker.
lépben, vesében és a petefészekben (33. ábra). 61
Az
in
vitro
embrió
mintákban kapott fejlődési stádiumspecifikus expressziós mintázat: a petesejtekben
és
a
zigótákban
viszonylag magas mRNS szinteket mértem, majd a megtermékenyítést követően folyamatosan csökkent a nyolcsejtes
stádiumig,
34. ábra: A Pou5f1 gén expressziós mintázata in vitro nyúl
ettől embriókban. kezdve enyhén növekedni kezdett (34. ábra).
és
A grafikonon az n=5 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve; a, b és c: szignifikáns eltéréseket jelöl (p<0,05).
4.5 Egér és szarvasmarha egyedfejlődésének összehasonlítása
Az alapelgondolás szerint olyan petesejt/embrió specifikus, egyedfejlődésben szerepet játszó transzkripciós faktorokat és géneket választottam, amelyeket a szarvasmarhában korábban azonosítottak a kisebb genom aktiváció során: Cenpf, Dazap2, Eif1a, Eif4e, Sfrs3. A szarvasmarha genomja még nem ismert minden részletében, így a kiválasztásra került, vizsgált gének közül néhánynak a teljes szekvenciája helyett csak töredék szekvenciákra alapoztam a primerek tervezését, az expressziójuk mérését. A két fajban közösen használt primereket egy meghatározott, a két szekvencia homológiaviszonyain alapuló, úgynevezett konszenzus szekvenciára terveztem, melyek az Eif1a kivételével minden gén esetében mindkét fajban jól működtek. Mivel a két fajban az embrionális genom aktiváció más stádiumban zajlik le, az egérnél különválasztottam a korai és késői kétsejtes, míg a szarvasmarhánál a korai és késői nyolcsejtes állapotokat. A szarvasmarha esetében 8-20 egybegyűjtött embrió minták átlagos egy embrió egyenértékű részében mértem az mRNS szinteket (IV). A protokolltól eltérően ebben a kísérletben nem referencia gén expressziós értékével normalizáltam, hanem külső referenciával, vagyis egy idegen eredetű, a mintákhoz hozzáadott ismert és azonos mennyiségű kontroll RNS észak-amerikai szentjánosbogár (Photinus pyralis) luciferáz gén (Promega, Madison, WI, USA) - mért értékével. További eltérés volt a mennyiségi kiértékelésben, hogy a reakciónkénti egyedi hatékonyságot vettem figyelembe a PCR készülék programjának (Comparative Quantitation Analysis) segítségével. Szarvasmarhában az Eif1a gén expresszióját nem sikerült mérni, a többi 4 gén a petesejthez képest 3-5-szörös emelkedést mutatott a nyolcsejtes állapotig, ahol lecsökkent az expressziójuk, majd a hólyagcsíra állapotig újra emelkedett (35. ábra). Az egérben nem kaptam hasonló mintázatot. A késői kétsejtes állapotig enyhe csökkenést mutattak, és egyedül az Eif4e 62
gén mutatott kisebb expressziós növekedést a késői kétsejtes állapottól kezdve (36. ábra).
35. ábra: A vizsgált gének expressziós mintázata szarvasmarha embriókban.
36. ábra: A vizsgált gének expressziós mintázata egér embriókban. A grafikonon az n=3 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve. 63
4.6 HDAC és HAT gének expressziójának meghatározása egér embriókban
A rendelkezésre álló ismeretek birtokában az eddig leírt 11 HDAC, 7 HAT gén és 3 referencia gén expressziós mintázatának mennyiségi összehasonlítására vállalkoztam az egér preimplantációs egyedfejlődése során in vivo petesejtekben és a különböző stádiumú embriókban. Az összesen 21 gén (Crebbp, Ep300, Gcn5l2, Hat1, Hdac1, Hdac2, Hdac3, Hdac4, Hdac5, Hdac6, Hdac7, Hdac8, Hdac9, Hdac10, Hdac11, Htatip, Pcaf, Taf1, és referenciának: H2afz, Hprt1, Ppia) expressziójának méréséhez az egy embrió korlátozott mennyisége miatt a stádiumonként (petesejt, egy-korai és késői két-négy-nyolcsejtes, szedercsíra és hólyagcsíra) 6-6 egyedet kettéválasztottam, és csak háromban mértem a Hdac1-7 géneket, a másik háromban a többi gént (IV). A működési és szerkezeti (szekvencia) hasonlóság nagyfokú a HDAC enzimek esetében, ezért nagy hangsúlyt kapott a génspecifikus primerek tervezése a keresztreakciók elkerülése miatt. A Hdac1 és Hdac2 géneket különös figyelemmel kísértem, mivel az adatbázisban fellelhető információk a kísérlet tervezése és kivitelezése alatt megváltoztak. Esetükben új primerek és mérések váltak szükségessé. A mennyiségi kiértékelésben a reakciónkénti egyedi hatékonyságot vettem figyelembe a PCR készülék programjának (Comparative Quantitation Analysis) segítségével. Több gén nem volt kimutatható a petesejtben, mint kiindulási alapban (Hdac5, Hdac6, Hdac10, Pcaf), vagy egyik stádiumban sem (Hdac7, Hdac11), így ezek esetében más, általában a kétsejtes stádiumhoz viszonyított expressziós értékeket tüntettem fel. A korai és késői kétsejtes állapotok közötti EGA, mint fontos választóvonal szempontjából tekintve az eredményeket: –
a Hdac1 expressziója a petesejttől kezdve folyamatosan csökkent, majd az EGA alatt újra megemelkedett és lassan csökkent le a további sejtosztódások alatt;
–
a HDAC gének közül a Hdac3, Hdac8 és Hdac9 expressziója mutatott növekedést a kisebb genom aktiváció alatt, a korai kétsejtes állapotig, majd folyamatos csökkent;
–
az EGA alatt fejeződött ki legerősebben a Hdac5, Hdac6 és Hdac10, hasonlóan a HAT gének közül a Crebbp és Pcaf;
–
a petesejttől kezdve folyamatos csökkenés volt tapasztalható függetlenül az EGA-tól a Hdac2 és Hdac4, valamint az Ep300, Gcn5l2, Hat1, Htatip és Taf1 gének esetében (37-38. ábrák).
64
37. ábra: A HDAC gének expressziós mintázata egér embriókban. A grafikonon az n=3 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve.
38. ábra: A HAT gének expressziós mintázata egér embriókban. A grafikonon az n=3 minta átlaga és standard hibája (S.E.) van feltüntetve.
65
5. Tárgyalás 5.1 Módszer fejlesztés
A két RT-PCR módszer összehasonlításából kiderült, hogy a real-time RT-PCR több mint két nagyságrenddel érzékenyebb a végpont RT-PCR-nél, melyet a nagyobb mennyiségű kiindulási mintával, embriók egybegyűjtésével lehet valamiképpen ellensúlyozni. Az egyedi embriók, blasztomer sejtek génexpressziójának mennyiségi méréséhez azonban a real-time RTPCR az alkalmasabb. A megbízhatóság, a reprodukálhatóság tekintetében szintén ez a módszer adott szignifikánsan jobb eredményt. Ez következik abból, hogy míg a real-time RT-PCR esetében a reakcióelegy összeállítása után zárt csőben folyik a mérés a kísérletező személy minden további beavatkozása nélkül, addig a végpont RT-PCR-nél több lépés is szükséges még, amíg a denzitometriás mennyiségi értékek meghatározhatóak. Ezek a lépések egyenként növelik a bevitt hibát, rontva a megbízhatóságot. A sokkal nagyobb különbségek másik oka, hogy a reakció befejezésekor a végpontján mért értékek nem csak a kiindulási minta mennyiségével, hanem a reakciót befolyásoló tényezőkkel, mint például a PCR hatékonyságának változásával, a kiindulási anyagok csökkenésével, gátló anyagok felhalmozódásával is kapcsolatosak. Sok esetben mégis használható eredményt ad a végpont RT-PCR is, amikor az embriók különböző kezelések hatására adott átlagos, nagymértékű reakcióját vizsgálják és nem az egyedi, finom különbségek kimutatása a cél. Az eredményeim összefüggésben állnak a mások által tapasztaltakkal. A real-time RT-PCR-re korábban meghatározott 0,4 % relatív szórás a Ct-re számítva (Wittwer és mtsai. 1997.), vagy 0-5 % (Bustin 2000.) és 14 % (Schmittgen és mtsai. 2000.) az RNS mennyiségére számítva, valamint a végpont RT-PCR 14 % (Zhang és mtsai. 1997.) és 45 % (Schmittgen és mtsai. 2000.) relatív szórás értékei összevethetők a sajátommal: CV = 19 % (real-time RT-PCR) és CV = 38 % (végpont RT-PCR). A kismértékű eltérés az általam alkalmazott magas mintaszámmal (n=30) magyarázható. Ezt a real-time RT-PCR módszert sikerült tovább fejlesztenem egy teljes génexpressziós protokollá a petesejtek, embriók gyűjtésétől kezdve az RNS kinyerésén és átírásán keresztül a mennyiségi meghatározásig, illetve az adatok helyes kiértékeléséig, valamint jellemeztem a rendszer alkalmasságát, érzékenységét. A protokoll kidolgozása során a technikai hibák két fő összetevőjét határoztam meg: a PCR a teljes hiba nagy részét képezte és hasonló arányban járult hozzá az mRNS izolálás is, míg az RT lépésnek nem volt számottevő szerepe. A teljes hibát a 6-6 embrió mintában mért relatív szóráshoz viszonyítva megállapítható, hogy az egyedek közt kimutatható különbségek lényegesen nagyobbak a teljes protokoll technikai hibájánál, vagyis a 66
mért különbségek valóban a köztük lévő biológiai különbségekből eredtek, nem a mérési hibák összességéből. Felvethető ugyanakkor, hogy a preimplantációs stádiumú embriók rendkívül rugalmasak és képesek átmenetileg a génexpresszió szélsőséges változásait is elviselni. Ilyen összehasonlítást eddig az irodalomban nem írtak le, ezt először állapítottam meg. Az általam kidolgozott módszer ennél fogva alkalmas a biológiai különbségek okainak feltárására és újabb tényezők azonosítására is. A mennyiségi, egy sejten alapuló mRNS expressziós kísérletekkel ezeket az alapvető kérdéseket lehet megcélozni. Emellett más real-time RT-PCR módszereket is leírtak, melyek szintén megbízhatóak, azonban többségében csak egyes lépései, mint például az RNS kinyerés, az RT, a PCR, vagy az adatelemzés alkalmazhatóságát tárgyalják részletesen és nem adnak egy teljes átfogó módszertant (Jeong és mtsai. 2005., Stahlberg és mtsai. 2004., Larionov és mtsai. 2005., Skern és mtsai. 2005.). Egyik tanulmányban például kétlépcsős egyesített (multiplex) PCR módszert dolgoztak ki, mely egyszerre 20 gén mérésére is alkalmas egyetlen sejtből (Peixoto és mtsai. 2004.). Egy másik módszer, a PurAmp protokoll szintén új próbálkozás az egyedi sejtekből egyszerre történő DNS és RNS tisztítás után a real-time PCR-rel való mennyiségi meghatározásra, azonban gyakorlati megvalósítása komolyabb laboratóriumi felkészültséget, speciális felszerelést is igényel, mint a steril környezet, termosztálható mikroszkópos berendezés, pontos nl-es nagyságrendű kimérés üvegkapillárissal (Hartshorn és mtsai. 2005.). Az értekezés készítése közben jelent meg egy új közlemény, melyben teljes körűen leírnak többféle mRNS mennyiségi meghatározására szolgáló real-time RT-PCR módszert (Nolan és mtsai. 2006.b). Hasonlóan a kidolgozott protokollomhoz az alapvető technikai lépések egységesítését célozza meg a bennük rejlő ismert, de általában figyelembe nem vett hibalehetőségek kiküszöbölésére. Másik megközelítési lehetőség akár egy minta összes mRNS-ének, a teljes génexpressziós mintázatnak a mennyiségi meghatározására, összehasonlítására a mikrocsipen alapuló kísérletek. Ezek óriási hátránya jelenleg, hogy az egyedi sejtekből kinyerhető mRNS mennyiség nem elég a kimutatáshoz, ezért a mérést megelőzően a kiindulási kevés nukleinsav mennyiségét RNS polimerázzal vagy PCR-rel sokszorosítják, mely a különböző szekvenciák eloszlásának tekintetében nagyfokú hibalehetőséget rejt magában (Kamme és Erlander 2003.; Kurimoto és mtsai. 2006.; Hartmann és Klein 2006.). Végeredményben a real-time RT-PCR módszer nagyobb érzékenységet, megbízhatóságot és mérési tartományt nyújt összehasonlítva más alternatív génexpressziós módszerekkel (Bustin 2000., Peixoto és mtsai. 2004.). Hangsúlyozni kell azonban, hogy az ezzel a módszerrel nyert adatok csupán pillanatfelvételek arról, hogy az adott mRNS-ből mennyi található az adott időpontban, az adott 67
sejtben, embrióban, vagy szöveti mintában. Amellett, hogy az értelmezhető eredmények megszületéséhez precízen kell megtervezni a kísérletet és kiértékelni a mért adatokat, a szabályozó RNS-ek, fehérjék mennyiségéről, aktivitásáról, és lehetőség szerint a metabolizmus funkcióinak méréséről, valamint az epigenetikai változásokról nyert információkat is szükséges hozzátenni a változó mRNS szintekből történő minden további biológiai következtetés levonásához, diagnosztikai jelzőként való alkalmazásához (Taylor és mtsai. 2003.; Nolan és mtsai. 2006.b). A protokoll ellenőrzése során jelentős egyedi különbségeket tudtam kimutatni a négysejtes egér embriók blasztomer sejtjei között a Nanog és Pou5f1 expressziójában, valamint a nyolcsejtes embrióknál a Nanog expressziójában. Hasonló vizsgálatokban korábban már találtak különbségeket egyedi emberi blasztomer sejtekben a Pou5f1 expressziójában (Hansis és mtsai. 2001.). Mindkét gén a később kialakuló hólyagcsíra állapotú embrió belső sejtcsomójában (ICM) kifejeződő transzkripciós faktor. Amennyiben következetesen tapasztalható az ICM specifikus gének expressziós különbsége a blasztomer sejtek között, feltehető, hogy ezek a különbségek nagyon korai jelei a sejtek egy bizonyos fejlődési irányban való elköteleződésének. Ehhez hasonló következtetésekre jutottak mások is az egérben, melyben a különbségek okainak térbeli polaritásokat feltételeznek. Ennek bizonyítása azonban további kutatásokat igényel (ZernickaGoetz 2002.). 5.2 Mélyhűtés
A mélyhűtés hatására előidézett molekuláris változások ismeretének hiányosságait tártam fel
különböző
stádiumú
egér
embriókban
két
különböző
vitrifikációs
módszer
összehasonlításával (vitrifikáció szilárd felületen (SSV) és műszalmában (ISV)). Az ISV módszernél az egysejtes embriókban megemelkedett expressziós aktivitást tapasztaltam a különböző stressz válaszban szerepet játszó vizsgált géneknél a felmelegítést követően 3 órával. Ezek a különbségek eltűntek 10 órára, valamint később a hólyagcsíra állapotban. Érdekessége, hogy az eljárás képes volt már az embrionális genom aktiváció előtt is gyors, kiugró génexpressziót indukálni, mely aztán hamar lecsengett. Ezek a változások korai jelei lehetnek az ISV-n átesett embriók csökkent életképességének. A nyolcsejtes embriók esetében nem találtam ilyen egyértelmű összefüggéseket. Ennek okai lehetnek, hogy a 8 blasztomer sejt sokkal összetettebb rendszert képez, melyben az egyedi sejtek is eltérően reagálhatnak, kiegyenlítve egymás expressziós aktivitását, és hogy ilyenkor már az embrionális genom teljes aktivitással működik. Több gén bevonásával, esetleg az egyedi sejtek vizsgálatával tovább lehet finomítani az eredményeket. Az SSV embriók morfológiailag nem különböztek a kontrollhoz képest, a 68
génexpresszióban mégis észleltem finom különbségeket. Összehasonlítva a két mélyhűtési módszert az SSV hatására kevésbé változott a különböző stressz gének expressziója és a morfológiai, életképességbeli megfigyelések alapján is ez bizonyult hatékonyabbnak. A referenciának választott háztartási gén (Actb) mérési eredménye arra mutat, hogy az ISV hatással volt az expressziójára. Elképzelhető, hogy közvetve kihatott a gén szintű reakcióra is a nagy mennyiségben alkalmazott krioprotektáns anyag a sejtek vázszerkezetének befolyásával. Az irodalomban többen leírták például az Actb és a Gapdh alkalmatlanságát, mint referencia gén (Radonić és mtsai. 2004.). Ebből levonható a következtetés, miszerint az Actb gén nem megfelelő referencia az embrió mélyhűtési vizsgálatokban, és több más háztartási gén vizsgálata is szükséges a legalkalmasabb(ak) kiválasztásához. 5.3 Egér embriók tenyésztése és a parthenogenetikus aktiválás
Az egérben a kétsejtes embrióban zajlik le az EGA, ezért a korai és késői kétsejtes stádiumok különválasztásával a várható génexpressziós aktivitás változások is nyomon követhetőek. Érdekes, eddig nem vizsgált megfigyelést tettem, miszerint a korai és késői kétsejtes stádiumok között a legtöbb háztartási gén aktivitása is jelentősen változik az egér embrióban. E mögött az a jelenség áll, hogy az anyai RNS-eket felváltják az embrió genomjáról átíródó RNS-ek. Különösen fontos ezért a két stádium elkülönített vizsgálata, hogy az ilyenkor is stabil referencia géneket ki lehessen választani. A tenyésztési körülményeknek a génexpressziós mintázatra gyakorolt hatása régóta ismert (Rinaudo és Schultz 2004.), azonban a háztartási génekre ilyen kiterjedten és egyedi, különböző stádiumú embriókon még nem vizsgálták egyszerre in vivo, in vitro tenyésztésben és parthenogenetikus aktiválásban is. A hólyagcsírák között talált szignifikáns különbségeket részben magyarázza, hogy az in vitro és parthenogenetikus hólyagcsírák sejtszáma is alacsonyabb volt. További összehasonlító vizsgálatokra van szükség azonban, hogy ennek a pontosabb biológiai okai feltáruljanak. A parthenogenetikus aktiválás nem váltott ki nagy hatást a különböző háztartási gének expressziójára a korai egyedfejlődés során. A nyolcsejtes állapotban szinte azonos mintázatot mutatott, mint az in vivo embrióké, ugyanakkor az in vitro tenyésztés önmagában is magasabb expressziót eredményezett. Elsőként írtam le a parthenogenetikusan aktivált embriók génexpressziójának vizsgálatát. Az aktiváció a testi sejtes klónozási eljárásnak (SCNT) is fontos része, így az eredmények megfelelő kontrollként szolgálhatnak a későbbiekben. A vizsgálat alapján sikerült kiválasztani három olyan stabilan expresszáló referencia gént 69
(H2afz, Hprt1 és Ppia), amelyek viszonylag állandó szinten fejeződnek ki a különböző stádiumokban, beleértve a korai és késői kétsejtes állapotokat is, valamint az in vivo, in vitro és parthenogenetikusan aktivált embriókban. Nagy előnye a megbízhatóságot tekintve, hogy egyedi embriókban mértem a gének expresszióját. Hasonló vizsgálatokat végeztek már egéren, de egyikben sem vállalkoztak ilyen kiterjedt és részletes elemzésre (Jeong és mtsai. 2005.; Willems és mtsai. 2006.). A három legstabilabb gén expressziós értékei alapján kiszámoltam azokat a normalizációs faktor értékeket, melyekkel elvégezhető a vizsgált gének normalizálása. Fontos hangsúlyozni, hogy ezeket az értékeket csak abban az esetben lehet felhasználni a kiértékelésekben, ha ugyanezeket a módszereket, protokollt, ugyanezen embrió stádiumokat és tenyésztési körülményeket alkalmazták. A gyakran referenciának használt Actb gén mutatkozott a legkevésbé stabilnak, melyet alátámaszt a korábban leírt mélyhűtési kísérletben tapasztalt expressziós változás is. 5.4 Nyúl embriók egyedfejlődése és tenyésztése
A korábban egérben elvégzett referencia gének kiválasztásának mintájára a nyúlban is hasonlóképpen jártam el. Ezidáig ilyen vizsgálatot - egyszerre 10 referencia gén, 7 stádiumon, in vivo és in vitro egyedi embriókban - nem végeztek el annak ellenére, hogy a normalizáláshoz megfelelő helyes referencia génekre nagy szükség van. A nyúlban a nyolcsejtes embrióban zajlik le az EGA, ezért itt a korai és késői nyolcsejtes stádiumok különválasztása volt indokolt. Az egérnél tapasztalt jelenséget itt is tapasztaltam, mely szerint több háztartási gén a legalacsonyabb expressziót az EGA alatt mutatta, vagyis a nyolcsejtes állapotban. A két tenyésztési csoportban mért génexpressziós stabilitási értékek hasonlósága alapján feltehető, hogy az in vitro körülmények nagyon jól közelítik az in vivo állapotot, illetve a nyúl embriók kevésbé érzékenyek az in vitro tenyésztési eltérésekre a háztartási gének expressziójának vonatkozásában. Érdekes eredményt adott az Actb gén, mely az in vivo mintákban stabil, ellenben az in vitro mintákban az egyik legkevésbé stabil volt. Ez ismét felveti, hogy mint azt korábban az egérnél is tapasztaltam, az Actb gén a nyúlban sem alkalmas referenciának a különböző kezelések során. Ennek biológiai okainak kiderítése a jövőben tervezett. A három választott referencia gén (H2afz, Hprt1 és Ywhaz) mért expressziós értékeiből kiszámolhatók a normalizációs faktor értékek, melyek általánosan felhasználhatók a jövőben nyúlon végzendő génexpressziós vizsgálatokban. Munkám során sikerült először azonosítani a két gént (Pou5f1 és Nanog) nyúlban, majd meghatározni a Pou5f1 gén expressziójának szövet és fejlődési stádium specifikus mintázatát. Az 70
embriókban kapott eredményből látszik, hogy a petesejtből származó mRNS mennyisége lecsökkent a nyolcsejtes állapotra és az ekkor lezajló EGA alatt maradt a legalacsonyabb szinten, majd már az embrió genomjáról szintetizálódva újra emelkedett. Nagyon hasonlít az irodalomban található, emberben (Abdel-Rahman és mtsai. 1995., Cauffman és mtsai. 2005.), egérben (Pan és mtsai. 2002.) és szarvasmarhában (van Eijk és mtsai. 1999.) leírt expressziós mintázatokra, mely további igazolást ad a referencia gének helytállóságához, a génexpressziós protokoll megerősítéséhez is. A feltételezett Pou5f1 cDNS részlet az összehasonlító szekvencia elemzések alapján a többi fajban leírt hasonló génekkel mutatott csak hasonlóságot, a DNS kötő POU doménen belül (Pan és mtsai. 2002.). Időközben az emberi genom projekt kiterjesztése más fajokra, többek között a nyúlra is, felgyorsította a nyúlon, mint modellállaton végzett kutatások ütemét és leírták a Pou5f1 teljes szekvenciáját is a nyúl genom szekvenálás eredményeként (Shi és mtsai. 2008.). Az általam leírt szekvencia összehasonlításakor teljes egyezést mutatott vele, mely megerősítette a Pou5f1 gén azonosítását. A Nanog szekvenciánál egérben és emberben nemrég leírt pszeudogének jelenlétéből eredő ellentmondások miatt a további vizsgálatokat felfüggesztettem (Booth és Holland 2004.). A nyúlon folytatott embriológiai kísérleteim úttörő jellegűek, jelenleg igen csekély információ áll rendelkezésre a nyúl embrió preimplantációs fejlődését irányító gének expressziójáról. Közvetlen felhasználója a kutatócsoport nyúl klónozási csoportja, ahol a sejtmag átültetéses kísérletekből nyert klónozott embriók fejlődési potenciáljának elemzéseben nélkülözhetetlenek a kapott eredmények. Továbbiakban célom a két gén teljes kódoló régiójának molekuláris klónozása, a szekvencia meghatározása, valamint az általuk kódolt fehérjék nyúl embrióban mutatott aktivitásának in situ hibridizációval történő vizsgálata. Várakozásaim szerint eredményeim a pluripotencia kialakításában szerepet játszó gének és mechanizmusok jobb megértéséhez vezetnek. Hosszabb távon pedig a csoport által végzett molekuláris biológiai kutatás fontos eredményekkel szolgálhat az orvosbiológiai és biotechnológiai tudományok számára. 5.5 Egér és szarvasmarha összehasonlítása
A szarvasmarhában leírt, választott gének expressziós mintázata jól követte a várt kisebb és embrionális genom aktiváció eseményeit. Ugyanez az egérben kevéssé volt szembetűnő. Ennek egyik magyarázata lehet, hogy a kiválasztott gének fajspecifikus expressziós különbségeit sikerült kimutatni. Másrészről az egér esetében nehezebb szétválasztani a két genom aktivációt, mivel az EGA korán, már a kétsejtes állapotban lezajlik, így az egysejtes állapotban lehet csak a kisebb genom aktivációt kimutatni. Itt további, különböző időpontokban kinyert egysejtes 71
embriókat is bevonok a vizsgálatba, melyek mérése és kiértékelése jelenleg még folyik. Az egyedfejlődés korai szakaszában az egyes fajok közötti különbségek jelentősek lehetnek a génexpresszió, és a molekuláris szintű újraprogramozódás folyamatainak vonatkozásában is. A kérődzők és az egér génexpressziós mintázata közti különbségek természetének és következményeinek feltárására nem csak a haszonállatok tenyésztése, hanem az ember egyedfejlődésének jobb, nagy testű emlősökön való modellezése tekintetében is szükség van. A szarvasmarha embriók egyedfejlődése több vonatkozásban is sokkal inkább hasonlít az emberéhez, mint az egéré, például a petesejt érésének időzítése, és ciklikus természete, az embrionális genom késői aktivációja, a magzat fiziológiája és fejlődése, a hosszú terhesség, és az ikerterhesség (Taylor és mtsai. 2003.). Ezért felvethető, hogy az egér általánosan mégsem
használható
modell
szervezetként.
A
szarvasmarhán
(kérődzőkön)
végzett
génexpressziós vizsgálatok lényegesen informatívabbak az emberben hasonlóan lejátszódó folyamatok modellezésére. Ellenben alátámasztják az egér használhatóságát azok a jelenlegi, emberi genomban tárolt információ „lefordítására” irányuló kezdeményezések a betegségek nagyon pontos modellezéséhez, melyek során az egér összes génjének funkcióját jellemzik mutagenezissel, molekuláris vizsgálatokkal és fenotipizálással. Ezek az egerek olyan biogyógyászati kísérletekbe vonhatók majd be, amelyek beteg embereken nem lennének lehetségesek (Rosenthal és Brown 2007.). Az ilyen és ehhez hasonló fajok közti összehasonlítások hozzájárulnak továbbá az egyedfejlődési folyamatok evolúciós változásainak megértéséhez is. 5.6 Hiszton kód szabályozása
Először sikerült részletesen meghatározni az összes eddig ismert hiszton-deacetiláz és néhány fontosabb hiszton acetil-transzferáz gén expressziós mintázatát az egér preimplantációs egyedfejlődése alatt, különös hangsúllyal a korai és késői kétsejtes állapotok közt lezajló EGAra. Az eredmények érdekessége, hogy szinte mindegyik gén aktívan jelen volt már a petesejtben is, és a különböző gének jellegzetes expressziós mintázatokat mutattak. Különösen a HDAC gének közül többnek az expressziója is fokozódott a kisebb genom aktivációban, másik részüknek pedig csak a embrionális genom aktiváció alatt volt magas az expressziós szintje. Ez arra enged következtetni, hogy a különböző HDAC gének jól szabályozottan, egymást váltva töltik be funkciójukat a preimplantációs egyedfejlődés során. Elképzelhető, hogy funkcionálisan gén fölösleg (redundancia) áll fenn, vagyis az egyik gén működésének meghibásodása esetén a többi képes ellensúlyozni annak speciális szerepét. Ugyanakkor a HAT gének legtöbbje már a petesejtben felhalmozva jelen volt, és később a fejlődés alatt nem expresszálódtak kivéve kettőt, 72
melyek az EGA alatt szintén aktív expressziós szintet mutattak. Ismerve a hiszton-deacetiláz és hiszton acetil-transzferáz enzimek epigenetikai újraprogramozódásban betöltött szerepét a kromatin és a nukleoszómák betömörítésén és fellazításán keresztül, feltehetően fontos szabályozó funkciót látnak el a génexpresszióban és végeredményben a normálisan működő embrionális genomot eredményezik. A teljes expressziós mintázat leírása elősegíti a hiszton acetiláció szabályozásának megértését és ezáltal a kritikus összetevők meghatározását az újraprogramozódás során. Ehhez hasonló érdekes megfigyelést közöltek egy tanulmányban nemrégiben, miszerint a petesejtben a hímivarsejt eredetű kromatinon a HAT aktivitás van túlsúlyban, ezzel szemben a testi sejtből átültetett sejtmagban az ellenkezője, vagyis a HDAC dominál a HAT aktivitás fölött (Yoshida és mtsai. 2007.). Ez azt jelzi, hogy a petesejt képes szabályozni a hiszton acetiláció homeosztázisát a kétféle aktivitás egyensúlyának változtatásával. Mások mikrochip mérések és génszabályozó hálózatok elemzésével jutottak arra a következtetésre, hogy az összes jelenlévő HDAC közül csak a Hdac1-nek van központi szerepe az egérben kétsejtes állapotra jellemző általános transzkripciós gátoltság kialakításában (Zeng és Schultz 2005.; Schultz 2005.). A megkezdett kísérletek folytatása egyéb embrió technológiával előállított (például klónozott) embriók bevonásával segíteni fog a jelenség pontosabb hátterének, szereplőinek feltárásában. 5.7 Gyakorlati felhasználás, távlatok
A fehérjék és nukleinsavak olyan kivételes tulajdonságokkal rendelkező anyagok, amelyek kiválóan alkalmasak önszerveződő molekuláris rendszerek építésére. Érdemes ellesni az élő szervezetektől a bennük található, alulról építkező, molekuláris nanotechnológiát használó rendszerek szerveződési elveit, megfejteni működésük mechanizmusát, hogy ezután létre lehessen hozni új nanoméretű biotechnológiai eszközöket, gyógyászati alkalmazásokat. A preimplantációs egyedfejlődés során több olyan kritikus molekuláris esemény zajlik, például az EGA és az első sejt differenciálódás, melyek mögött epigenetikai folyamatok állnak és amelyekhez szorosan kapcsolódnak a gének expressziós változásai is. Ezek molekuláris szintű vizsgálata és jellemzése segíteni fog a különböző módon előállított (in vitro tenyésztett, mélyhűtött, parthenogenetikusan aktivált, klónozott) „mesterséges” embriók életképességének, valamint a módszerek hatékonyságának javításában, a klónozási problémák megoldásában, a rendellenes egyedfejlődés okainak feltárásában, betegségek alapokainak tisztázásában, és új gyakorlati alkalmazásokban való felhasználásában. Az eredmények a szaporodásbiológiában és a jövő gyógyászatában (klinikai felhasználásban, sejtterápiákban és a regeneráló gyógyításban), 73
valamint a gyógyszerkutatás és fejlesztés folyamatában hasznosulhatnak. A genomika, a farmakogenetika alkalmazása, az új biotechnológiai kutatási módszerek és az adatbázisok összekapcsolása ma már nem csupán új gyógyszer célpontok azonosításában kínál eredményekre vezető, gyors előrejutási lehetőséget, hanem olyan új gyógyszer-hatóanyagok kifejlesztésében is, amelyek a fejlődési rendellenességekben (mint például a szellemi visszamaradottság) és a rákos elváltozásokban nélkülözhetetlen, megváltozott epigenetikai állapotokat okozó szabályozókat céloznak meg. Ezáltal az új generációs, biztonságos és hatékony gyógyszerek kifejlesztése az orvostudomány gyakorlatát tökéletesítik (Li 2002.; Shi és mtsai. 2003.; Roses 2005.). Hazánkban a gödöllői kutatócsoport állított elő elsőként testi sejtből klónozott állatot. Klonilla, a klónozott egér 2006. november 6-án született meg. Kézenfekvő, hogy a jövőben számos epigenetikai újraprogramozódási folyamat és génexpressziós változás vizsgálata válik lehetővé klónozott, különböző fejlődési stádiumú embriókon is, melyhez kész, teljesen kidolgozott, validált molekuláris eszközrendszert sikerült felállítani. Ennek révén remélhetőleg felgyorsul az emlősök egyedfejlődését szabályozó epigenetikai folyamatok megismerése. A tudományos kihívás az egyedi molekulák szerepének leírásán túl az, hogy érthetővé váljon a különböző fehérjék összeállása szabályozó komplexekké és hogy ezek a fehérje komplexek hogyan célozzák meg a specifikus géneket és kromoszómális régiókat. A napjainkban kezdődő poszt-genomikai, epigenomikai kutatások célja pedig megérteni a genom egészének komplexitását, szerkezetét és rendszerként való működését (Mikkelsen és mtsai. 2007.; Barski és mtsai. 2007.). Az értekezésben leírt eredmények minden bizonnyal hozzájárulnak majd ezeknek az epigenomikai eredményeknek a finomításához és igazolásához is.
74
6. Következtetések Az értekezésben leírt kísérletekből született új tudományos eredményeim röviden összegyűjtve: (1) Kidolgoztam egy teljes mennyiségi génexpressziós protokollt a primer tervezési eljárástól kezdve az adatok helyes kiértékeléséig, mely az egyedi embriók között kimutatott biológiai különbségeknél jóval alacsonyabb technikai hibája révén alkalmas egyedi sejtekből, embriókból egyszerre 10-15 gén mRNS szintjének meghatározására is. Alkalmazásával lehetővé válik a biológiai különbségek okainak felismerése, a génexpresszió finomabb különbségeinek felfedése és az eredmények pontosabb statisztikai elemzése. A négy- és nyolcsejtes embriók blasztomer sejtjei között jelentős expressziós különbségeket mutattam ki, melyek a bizonyos fejlődési irányban való elköteleződésük korai jelei lehetnek. (2) A két mélyhűtési módszer összehasonlításából kiderült, hogy a gyors fagyasztás sokkal hatékonyabb szilárd felületen, mint műszalmában. A vizsgált gének expressziós változásait sikerült összefüggésbe hozni az embriók morfológiai, és életképességben tapasztalt eltéréseivel. Az egyéni embriók szintjén történő real-time RT-PCR módszer új lehetőséget nyújt a mélyhűtés okozta molekuláris események megértéséhez, olyan kulcsfontosságú marker gének azonosításához, melyek a mélyhűtési módszerek további fejlesztését segítik. (3) Kimutattam, hogy az in vitro tenyésztésnek és a parthenogenetikus aktiválásnak jelentős hatása van a háztartási gének expressziójára a preimplantációs egyedfejlődés során, vagyis alapos körültekintéssel kell meghatározni minden kísérlet előtt a normalizáláshoz alkalmazott legstabilabb referencia géneket a félrevezető következtetések levonásának elkerülése érdekében. Az egér embriók esetében egységesen a H2afz, Hprt1 és Ppia géneket találtam alkalmasnak a különböző preimplantációs stádiumokban. (4) A nyúl embriókban a H2afz, Hprt1 és Ywhaz génekről sikerült igazolni, hogy expressziójuk a legstabilabb a korai egyedfejlődés alatt az in vivo és in vitro mintákban. Azonosítottam a Pou5f1 (Oct-4) transzkripciós faktort a nyúlban és igazoltam, hogy jelen van a preimplantációs egyedfejlődése során hasonlóan más emlős fajokhoz. (5) A szarvasmarhában és az egérben jelentős és feltehetőleg fajspecifikus génexpressziós különbségeket sikerült kimutatni az embrionális genom aktivációhoz kapcsoltan, mely mutatja az egér, mint modell állat korlátait. A különböző fajokból nyert génexpressziós mintázatok összehasonlításából következtetni lehet a molekuláris szintű újraprogramozódás folyamatainak eltéréseire, azok konzervált voltára, valamint az evolúciós változásokra is. 75
(6) A preimplantációs egyedfejlődés alatt több hiszton-deacetiláz és hiszton acetiltranszferáz együttes expresszióját mutattam ki, mely arra világít rá, hogy nem csak egy-egy gén felelős az újraprogramozódásért és az embrionális genom aktivációért, hanem feltehetőleg közösen, egymást kiegészítve töltik be a szerepüket. A folyamat részletes megértéséhez még további átfogó vizsgálatok szükségesek. Összegzésül: A kutatócsoport általános céljaihoz sikerült megteremtenem a molekuláris biológiai hátteret és információt nyerni a génexpressziós eszközrendszer segítségével több, az embrió technológiákat támogató vizsgálatban. A munkám során elvégzett kísérletek eredményei igazolják a felállított rendszer alapelveinek helyességét a többváltozós elemzésekre és bizonyítékát adják a széles spektrumú alkalmazhatóságának. Nyilvánvaló azonban, hogy még jelentős erőfeszítést igényel az emlősök egyedfejlődésében szerepet játszó epigenetikai folyamatoknak, a betegségekben megnyilvánuló zavaruknak a megismerése, és mesterséges befolyásolása. Az újonnan létrehozott eszközökkel jelentős előrelépés várható, idézve a szakterület úttörőjének véleményét (Vastag 2001.): Sheep cloner Ian Wilmut recently said that for human cloning to succeed, "we need a step as big as the one that produced Dolly". If that step ever comes, it will likely involve the nascent field of epigenetics.
76
Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt köszönöm családomnak kitartó támogatásukat: Feleségemnek, hogy szívvel-lélekkel velem volt mindvégig, és mindhárom Gyerekemnek, akik időközben sorba „bekapcsolódhattak” munkámba. Köszönettel tartozom Dr. Dinnyés Andrásnak, vezetőmnek mind a kutatócsoportban biztosított kutatási lehetőségek, mind a felelősségteljes feladat felvállalása tekintetében. Külön megköszönöm Prof. Gráf Lászlónak, és az ELTE Biokémia Tanszékének, hogy szakmai műhelyükben folytathattam tanulmányaimat és bár kísérletes munkámat Gödöllőn végeztem, hozzájuk is ugyanolyan szervesen tartoztam. Hálásan köszönöm a gödöllői Genetikai Újraprogramozás Csoport alapító tagjainak, kutatótársaimnak, valamint a kutatócsoport külföldi partnereinek a kísérleti munkában nyújtott mindennemű segítőkészségüket, név szerint: Dr. Adorján Márta, Dr. Balogh Emese, Bara Sándorné, Dr. Bodó Szilárd, Deák Edit, Dr. Görhöny Botond, Kungl Györgyi, Polgár Zsuzsanna, Táncos Zsuzsanna, különösen: Duangjai Boonkusol, Dr. Mamo Solomon, Lucie Nemcova, Jiri Kanka, Joseph W. Carnwath. Munkám létrejöttéhez nyújtott legmeghatározóbb támogatását külön megköszönöm oktatóimnak: Tania Nolan, Vladimir Benes, Stephen A. Bustin, Mikael Kubista. Köszönöm a „B.E.Sz.T.”-nek a lelkesítő háttér biztosítását:
A Kárpátok tetején
Végezetül de nem utolsó sorban szeretném ajánlani jelen munkámat volt tanáraimnak, Klotz Istvánnénak, Wittmayer Zsuzsannának, Bálint Miklósnak, és volt vezetőimnek, Olasz Ferencnek, Csomor Katalinnak, Dr. Thaler Györgynek, akik tudtukon kívül segítettek a doktori iskola megkezdéséhez. Megköszönöm nekik is közvetett hozzájárulásukat. 77
Irodalomjegyzék Abdel-Rahman B, Fiddler M, Rappolee D, Pergament E. 1995 Expression of transcription regulating genes in human preimplantation embryos. Hum Reprod.; 10(10):2787-92. Adenot PG, Mercier Y, Renard JP, Thompson EM. 1997 Differential H4 acetylation of paternal and maternal chromatin precedes DNA replication and differential transcriptional activity in pronuclei of 1-cell mouse embryos. Development.; 124(22):4615-25. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002a DNA and Chromosomes (The Global Structure of Chromosomes); in Molecular Biology of the Cell (Fourth Edition, Garland Science) pp. 191-234. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. 2002b Cell Chemistry and Biosynthesis (The Chemical Components of a Cell); How Cells Read the Genome: From DNA to Protein (From DNA to RNA); in Molecular Biology of the Cell (Fourth Edition, Garland Science) pp. 47-128.; pp. 299-374. Alonso S, Minty A, Bourlet Y, Buckingham M. 1986 Comparison of three actin-coding sequences in the mouse; evolutionary relationships between the actin genes of warmblooded vertebrates. J Mol Evol.; 23(1):11-22. Altmann M, Müller PP, Pelletier J, Sonenberg N, Trachsel H. 1989 A mammalian translation initiation factor can substitute for its yeast homologue in vivo. J Biol Chem.; 264(21):12145-7. Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ. 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res.; 25(17):3389-402. Antequera F. 2003 Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell Mol Life Sci.; 60(8):1647-58. Aoki F, Worrad DM, Schultz RM. 1997 Regulation of transcriptional activity during the first and second cell cycles in the preimplantation mouse embryo. Dev Biol.; 181(2):296-307. Ayane M, Preuss U, Köhler G, Nielsen PJ. 1991 A differentially expressed murine RNA encoding a protein with similarities to two types of nucleic acid binding motifs. Nucleic Acids Res.; 19(6):1273-8. Bachvarova R. 1985 Gene expression during oogenesis and oocyte development in mammals. Dev Biol; 1:453-524. Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schones DE, Wang Z, Wei G, Chepelev I, Zhao K. 2007 High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell.; 129(4):823-37. Bartolomei MS, Bickmore AW. 2005 Editorial Hum Mol Genet.; 14 Spec No 1:R1-2. Beard C, Li E, Jaenisch R. 1995 Loss of methylation activates Xist in somatic but not in embryonic cells. Genes Dev.; 9(19):2325-34. Bengtsson M, Stahlberg A, Rorsman P, Kubista M. 2005 Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Res.; 15(10):1388-92. Blewitt ME, Vickaryous NK, Paldi A, Koseki H, Whitelaw E. 2006 Dynamic reprogramming of DNA methylation at an epigenetically sensitive allele in mice. PLoS Genet.; 2(4):e49. Board PG, Coggan M, Baker RT, Vuust J, Webb GC. 1992 Localization of the human UBC 78
polyubiquitin gene to chromosome band 12q24.3. Genomics.; 12(4):639-42. Boiani M, Eckardt S, Scholer HR, McLaughlin KJ. 2002 Oct4 distribution and level in mouse clones: consequences for pluripotency. Genes Dev.; 16(10):1209-19. Booth HA, Holland PW. 2004 Eleven daughters of NANOG. Genomics.; 84(2):229-38. Braun RE. 2001 Packaging paternal chromosomes with protamine. Nat Genet.; 28:10-12. Brown TA. 2002 Transcriptomes and Proteomes; in Genomes (2nd Edition, Wiley-Liss) pp. 69-92. Bulfield G. 1978 Genetic variation in the activity of the histidine catabolic enzymes between inbred strains of mice: a structural locus for a cytosol histidine aminotransferase isozyme (Hat-1). Biochem Genet.; 16(11-12):1233-41. Bustin SA, Nolan T. 2004 Chemistries; Instrumentation; The PCR Step; in A-Z of Quantitative PCR (Ed) Bustin SA. (International University Line Biotechnology Series, 5) pp. 215-278.; pp. 329-358.; pp. 397-438. Bustin SA. 2000 Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol.; 25(2):169-93. Bustin SA. 2002 Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol.; 29(1):23-39. Bustin SA. 2004 Quantification of nucleic acids by PCR; in A-Z of Quantitative PCR (Ed) Bustin SA. (International University Line Biotechnology Series, 5) pp. 3-46. Butte AJ, Dzau VJ, Glueck SB. 2001 Further defining housekeeping, or "maintenance," genes Focus on "A compendium of gene expression in normal human tissues". Physiol Genomics.; 7(2):95-6. Carrozza MJ, Utley RT, Workman JL, Côté J. The diverse functions of histone acetyltransferase complexes. Trends Genet. 2003 Jun;19(6):321-9. Cauffman G, Van de Velde H, Liebaers I, Van Steirteghem A. 2005 Oct-4 mRNA and protein expression during human preimplantation development. Mol Hum Reprod.; 11(3):173-81. Chatot CL, Ziomek CA, Bavister BD, Lewis JL, Torres I. 1989 An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprod Fertil.; 86(2):679-88. Cheong HT, Kanagawa H. 1993a Assessment of cytoplasmic effects on the development of mouse embryonic nuclei transferred to enucleated zygotes. Theriogenology.; 39(2):451-61. Cheong HT, Takahashi Y, Kanagawa H. 1993b Birth of mice after transplantation of early cellcycle-stage embryonic nuclei into enucleated oocytes. Biol Reprod.; 48(5):958-63. Cheung P, Lau P. 2005 Epigenetic regulation by histone methylation and histone variants. Mol Endocrinol.; 19(3):563-73. Chrivia JC, Kwok RP, Lamb N, Hagiwara M, Montminy MR, Goodman RH. 1993 Phosphorylated CREB binds specifically to the nuclear protein CBP. Nature.; 365(6449):855-9. Clegg KB, Piko L. 1983 Poly(A) length, cytoplasmic adenylation and synthesis of poly(A)+ RNA in early mouse embryos. Dev Biol.; 95(2):331-41. Cleveland DW, Lopata MA, MacDonald RJ, Cowan NJ, Rutter WJ, Kirschner MW. 1980 Number and evolutionary conservation of alpha- and beta-tubulin and cytoplasmic betaand gamma-actin genes using specific cloned cDNA probes. Cell.; 20(1):95-105. 79
Coleman DL. 1962 Effect of genic substitution on the incorporation of tyrosine into the melanin of mouse skin. Arch Biochem Biophys.; 96:562-8. Creagan R, Tischfield J, Ricciuti F, Ruddle FH. 1973 Chromosome assignments of genes in man using mouse-human somatic cell hybrids: mitochondrial superoxide dismutase (indophenol oxidase-B, tetrameric) to chromosome 6. Humangenetik.; 20(3):203-9. Crew FAE, Mirskaia L. 1931 The character of "hairless" in the mouse. J Genet; 25:17-24 Crick F. 1970 Central dogma of molecular biology. Nature.; 227(5258):561-3. de Ruijter AJ, van Gennip AH, Caron HN, Kemp S, van Kuilenburg AB. 2003 Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family. Biochem J.; 370(Pt 3):737-49. DeRisi J, Penland L, Brown PO, Bittner ML, Meltzer PS, Ray M, Chen Y, Su YA, Trent JM. 1996 Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat Genet.; 14(4):457-60. Derry JM, Barnard PJ. 1989 Localisation of the Ccg-1. gene on the mouse X chromosome. Cytogenet Cell Genet.; 51:988. Derry JM, Kerns JA, Francke U. 1995 RBM3, a novel human gene in Xp11.23 with a putative RNA-binding domain. Hum Mol Genet.; 4(12):2307-11. Diachenko L, Lau YF, Campbell AP, Chenchik A, Mogadam F, Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov ED, Siebert D. 1996 Suppression Subtracive Hybridization: A method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.; 93(12): 6025-6030. Dinnyes A, Dai Y, Jiang S, Yang X. 2000 High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic cell nuclear transfer. Biol Reprod.; 63(2):513-8. Dinnyes A, De Sousa P, King T, Wilmut I. 2002 Somatic cell nuclear transfer: recent progress and challenges. Cloning Stem Cells.; 4(1):81-90. Earle WR, Schilling EL, Stark TH, Straus NP, Brown MF, Sbelton E. 1943 Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. J. Nat. Cancer Inst.; 4:165-212. Eberharter A, Becker PB. 2002 Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics. EMBO Rep.; 3(3):224-9. Eckert J, Niemann H. 1995 In vitro maturation, fertilization and culture to blastocysts of bovine oocytes in protein-free media. Theriogenology.; 43(7):1211-25. Edashige K, Sakamoto M, Kasai M. 2000 Expression of mRNAs of the aquaporin family in mouse oocytes and embryos. Cryobiology.; 40(2):171-5. Edwards RG. 2003 Aspects of the molecular regulation of early mammalian development. Reprod Biomed Online.; 6(1):97-113. Elowitz MB, Levine AJ, Siggia ED, Swain PS. 2002 Stochastic gene expression in a single cell Science.; 297(5584):1183-6. Engels WR. 1993 Contributing software to the internet: the Amplify program. Trends Biochem Sci.; 18(11):448-50. FDA:
A Risk-Based Approach to Evaluate Animal (http://www.fda.gov/cvm/CloningRA_ChapterIV.htm) 80
Clones
and
Their
Progeny
Fiering S, Whitelaw E, Martin DI. 2000 To be or not to be active: the stochastic nature of enhancer action. Bioessays.; 22(4):381-7. Fuks F. 2005 DNA methylation and histone modifications: teaming up to silence genes. Curr Opin Genet Dev.; 15(5):490-5. Gal AB, Carnwath JW, Dinnyes A, Herrmann D, Niemann H, Wrenzycki C. 2006 Comparison of real-time polymerase chain reaction and end-point polymerase chain reaction for the analysis of gene expression in preimplantation embryos. Reprod Fertil Dev.; 18(3):365-371. Gilbert SF. 2006 The early development of vertebrates: Fish, birds, and mammals; in Developmental Biology (Eighth Edition, Sinauer Associates, Inc., Publishers) pp. 325-372. Graves KH, Moreadith RW. 1993 Derivation and characterization of putative pluripotential embryonic stem cells from preimplantation rabbit embryos. Mol Reprod Dev.; 36(4):424-33. Greider CW. 1990 Telomeres, telomerase and senescence. Bioessays.; 12(8):363-9. Grunstein M. 1997 Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature.; 389(6649):349-52. Gutierrez-Adan A, Behboodi E, Murray JD, Anderson GB. 1997 Early transcription of the SRY gene by bovine preimplantation embryos. Mol Reprod Dev.; 48(2):246-50. Handschumacher RE, Harding MW, Rice J, Drugge RJ, Speicher DW. 1984 Cyclophilin: a specific cytosolic binding protein for cyclosporin A. Science.; 226(4674):544-7. Hansis C, Tang YX, Grifo JA, Krey LC. 2001 Analysis of Oct-4 expression and ploidy in individual human blastomeres. Mol Hum Reprod.; 7(2):155-61. Harlow GM, Quinn P. 1982 Development of preimplantation mouse embryos in vivo and in vitro. Aust J Biol Sci.; 35(2):187-93. Hartmann CH, Klein CA. 2006 Gene expression profiling of single cells on large-scale oligonucleotide arrays. Nucleic Acids Res.; 34(21):e143. Hartshorn C, Anshelevich A, Wangh LJ. 2005 Rapid, single-tube method for quantitative preparation and analysis of RNA and DNA in samples as small as one cell. BMC Biotechnol.; 5(1):2. Hartshorn C, Rice JE, Wangh LJ. 2003 Differential pattern of Xist RNA accumulation in single blastomeres isolated from 8-cell stage mouse embryos following laser zona drilling. Mol Reprod Dev.; 64(1):41-51. Hayashi S, Yang J, Christenson L, Yanagimachi R, Hecht NB. 2003 Mouse preimplantation embryos developed from oocytes injected with round spermatids or spermatozoa have similar but distinct patterns of early messenger RNA expression. Biol Reprod.; 69(4):1170-6. Hoffert KA, Anderson GB, Wildt DE, Roth TL. 1997 Transition from maternal to embryonic control of development in IVM/IVF domestic cat embryos. Mol Reprod Dev.; 48(2):208-15. Holliday R. 2005 DNA methylation and epigenotypes. Biochemistry (Mosc).; 70(5):500-4. Hubbard TJ, Aken BL, Beal K, Ballester B, Caccamo M, Chen Y, Clarke L, Coates G, Cunningham F, Cutts T, Down T, Dyer SC, Fitzgerald S, Fernandez-Banet J, Graf S, Haider S, Hammond M, Herrero J, Holland R, Howe K, Howe K, Johnson N, Kahari A, Keefe D, Kokocinski F, Kulesha E, Lawson D, Longden I, Melsopp C, Megy K, Meidl P, Ouverdin B, Parker A, Prlic A, Rice S, Rios D, Schuster M, Sealy I, Severin J, Slater G, Smedley D, Spudich G, Trevanion S, Vilella A, Vogel J, White S, Wood M, Cox T, Curwen V, Durbin R, Fernandez-Suarez XM, Flicek P, Kasprzyk A, Proctor G, Searle S, Smith J, Ureta-Vidal A, Birney E. 2007 Ensembl 2007. Nucleic Acids Res.; 35(Database issue):D610-7. 81
Huggett J, Dheda K, Bustin S, Zumla A. 2005 Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immun.; 6(4):279-84. Jaenisch R, Bird A. 2003 Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet.; 33 Suppl:245-54. Jenuwein T, Allis CD. 2001 Translating the histone code. Science.; 293(5532):1074-80. Jeong BC, Hong CY, Chattopadhyay S, Park JH, Gong EY, Kim HJ, Chun SY, Lee K. 2004 Androgen receptor corepressor-19 kDa (ARR19), a leucine-rich protein that represses the transcriptional activity of androgen receptor through recruitment of histone deacetylase. Mol Endocrinol.; 18(1):13-25. Jeong YJ, Choi HW, Shin HS, Cui XS, Kim NH, Gerton GL, Jun JH. 2005 Optimization of real time RT-PCR methods for the analysis of gene expression in mouse eggs and preimplantation embryos. Mol Reprod Dev.; 71(3):284-9. Jones PA, Takai D. 2001 The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science.; 293(5532):1068-70. Kamme F, Erlander MG. 2003 Global gene expression analysis of single cells. Curr Opin Drug Discov Devel.; 6(2):231-6. Kanka J. 2003 Gene expression and chromatin structure in the pre-implantation embryo. Theriogenology.; 59(1):3-19. Kao HY, Downes M, Ordentlich P, Evans RM. 2000 Isolation of a novel histone deacetylase reveals that class I and class II deacetylases promote SMRT-mediated repression. Genes Dev.; 14(1):55-66. Kao HY, Lee CH, Komarov A, Han CC, Evans RM. 2002 Isolation and characterization of mammalian HDAC10, a novel histone deacetylase. J Biol Chem.; 277(1):187-93. Kasai M, Komi JH, Takakamo A, Tsudera H, Sakurai T, Machida T. 1990 A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J Reprod Fertil.; 89(1):91-7. Kawai J, Shinagawa A, Shibata K, Yoshino M, Itoh M, Ishii Y, Arakawa T, Hara A, Fukunishi Y, Konno H, Adachi J, Fukuda S, Aizawa K, Izawa M, Nishi K, Kiyosawa H, Kondo S, Yamanaka I, Saito T, Okazaki Y, Gojobori T, Bono H, Kasukawa T, Saito R, Kadota K, Matsuda H, Ashburner M, Batalov S, Casavant T, Fleischmann W, Gaasterland T, Gissi C, King B, Kochiwa H, Kuehl P, Lewis S, Matsuo Y, Nikaido I, Pesole G, Quackenbush J, Schriml LM, Staubli F, Suzuki R, Tomita M, Wagner L, Washio T, Sakai K, Okido T, Furuno M, Aono H, Baldarelli R, Barsh G, Blake J, Boffelli D, Bojunga N, Carninci P, de Bonaldo MF, Brownstein MJ, Bult C, Fletcher C, Fujita M, Gariboldi M, Gustincich S, Hill D, Hofmann M, Hume DA, Kamiya M, Lee NH, Lyons P, Marchionni L, Mashima J, Mazzarelli J, Mombaerts P, Nordone P, Ring B, Ringwald M, Rodriguez I, Sakamoto N, Sasaki H, Sato K, Schönbach C, Seya T, Shibata Y, Storch KF, Suzuki H, Toyo-oka K, Wang KH, Weitz C, Whittaker C, Wilming L, Wynshaw-Boris A, Yoshida K, Hasegawa Y, Kawaji H, Kohtsuki S, Hayashizaki Y; RIKEN Genome Exploration Research Group Phase II Team and the FANTOM Consortium. 2001 Functional annotation of a full-length mouse cDNA collection. Nature.; 409(6821):685-90. Kayano T, Fukumoto H, Eddy RL, Fan YS, Byers MG, Shows TB, Bell GI. 1988 Evidence for a family of human glucose transporter-like proteins. Sequence and gene localization of a protein expressed in fetal skeletal muscle and other tissues. J Biol Chem.; 263(30):15245-8.
82
Khochbin S, Verdel A, Lemercier C, Seigneurin-Berny D. 2001 Functional significance of histone deacetylase diversity. Curr Opin Genet Dev.; 11(2):162-6. Kidder GM. 2002 Trophectoderm development and function: the roles of Na+/K(+)-ATPase subunit isoforms. Can J Physiol Pharmacol.; 80(2):110-5. Ko MS, Kitchen JR, Wang X, Threat TA, Wang X, Hasegawa A, Sun T, Grahovac MJ, Kargul GJ, Lim MK, Cui Y, Sano Y, Tanaka T, Liang Y, Mason S, Paonessa PD, Sauls AD, DePalma GE, Sharara R, Rowe LB, Eppig J, Morrell C, Doi H. 2000 Large-scale cDNA analysis reveals phased gene expression patterns during preimplantation mouse development. Development.; 127(8):1737-49. Ko MS. 2004 Embryogenomics of pre-implantation mammalian development: current status. Reprod Fertil Dev.; 16(2):79-85. Kozak LP, McLean GK, Eicher EM. 1974 X linkage of phosphoglycerate kinase in the mouse. Biochem Genet.; 11(1):41-7. Kreuzer KA, Lass U, Landt O, Nitsche A, Laser J, Ellerbrok H, Pauli G, Huhn D, Schmidt CA. 1999 Highly sensitive and specific fluorescence reverse transcription-PCR assay for the pseudogene-free detection of beta-actin transcripts as quantitative reference. Clin Chem.; 45(2):297-300. Kurdistani SK, Tavazoie S, Grunstein M. 2004 Mapping global histone acetylation patterns to gene expression. Cell.; 117(6):721-33. Kurimoto K, Yabuta Y, Ohinata Y, Ono Y, Uno KD, Yamada RG, Ueda HR, Saitou M. 2006 An improved single-cell cDNA amplification method for efficient high-density oligonucleotide microarray analysis. Nucleic Acids Res.; 34(5):e42. Kuznetsov VA, Knott GD, Bonner RF. 2002 General statistics of stochastic process of gene expression in eukaryotic cells. Genetics.; 161(3):1321-32. Larionov A, Krause A, Miller W. 2005 A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics.; 6(1):62. Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG. 2007 Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics.; 23(21):2947-8. Lechniak D. 2002 Quantitative aspect of gene expression analysis in mammalian oocytes and embryos. Reprod Biol.; 2(3):229-41. Levsky JM, Singer RH. 2003 Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol.; 13(1):4-6. Li E, Beard C, Jaenisch R. 1993 Role for DNA methylation in genomic imprinting. Nature.; 366(6453):362-5. Li E. 2002 Chromatin modification and epigenetic reprogramming in mammalian development. Nat Rev Genet.; 3(9):662-73. Lighten AD, Hardy K, Winston RM, Moore GE. 1997 Expression of mRNA for the insulin-like growth factors and their receptors in human preimplantation embryos. Mol Reprod Dev.; 47(2):134-9. Livak KJ, Schmittgen TD. 2001 Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods.; 25(4):402-8. Livak KJ. 1997 ABI Prims 7700 Sequencer detection system. User bulletin 2. PE Applied Biosystems: 1-36. 83
Lowe DG, Moran LA. 1986 Molecular cloning and analysis of DNA complementary to three mouse Mr = 68,000 heat shock protein mRNAs. J Biol Chem.; 261(5):2102-12. Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. 1997 Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature.; 389(6648):251-60. Mahlknecht U, Bucala R, Verdin E. 1999 Assignment of the histone deacetylase gene (Hdac3) to mouse chromosome 18B3 by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet.; 84(3-4):192-3. Mann MR, Bartolomei MS. 2002 Epigenetic reprogramming in the mammalian embryo: struggle of the clones. Genome Biol.; 3(2):REVIEWS1003. Marmorstein R, Roth SY. 2001 Histone acetyltransferases: function, structure, and catalysis. Curr Opin Genet Dev.; 11(2):155-61. Mathews DH, Disney MD, Childs JL, Schroeder SJ, Zuker M, Turner DH. 2004 Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc Natl Acad Sci U S A.; 101(19):7287-92. McGraw S, Robert C, Massicotte L, Sirard MA. 2003 Quantification of histone acetyltransferase and histone deacetylase transcripts during early bovine embryo development. Biol Reprod.; 68(2):383-9. Memili E, First NL. 2000 Zygotic and embryonic gene expression in cow: a review of timing and mechanisms of early gene expression as compared with other species. Zygote.; 8(1):87-96. Mikkelsen TS, Ku M, Jaffe DB, Issac B, Lieberman E, Giannoukos G, Alvarez P, Brockman W, Kim TK, Koche RP, Lee W, Mendenhall E, O'Donovan A, Presser A, Russ C, Xie X, Meissner A, Wernig M, Jaenisch R, Nusbaum C, Lander ES, Bernstein BE. 2007 Genomewide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature.;448(7153):553-60. Misawa K, Nosaka T, Morita S, Kaneko A, Nakahata T, Asano S, Kitamura T. 2000 A method to identify cDNAs based on localization of green fluorescent protein fusion products. Proc Natl Acad Sci U S A.; 97(7):3062-6. Missero C, Serra C, Stenn K, Dotto GP. 1993 Skin-specific expression of a truncated E1a oncoprotein binding to p105-Rb leads to abnormal hair follicle maturation without increased epidermal proliferation. J Cell Biol.; 121(5):1109-20. Mitalipov SM, White KL, Farrar VR, Morrey J, Reed WA. 1999 Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabbit embryos activated with inositol 1,4,5-trisphosphate. Biol Reprod.; 60(4):821-7. Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, Segawa K, Murakami M, Takahashi K, Maruyama M, Maeda M, Yamanaka S. 2003 The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell.; 113(5):631-42. Morgan HD, Santos F, Green K, Dean W, Reik W. 2005 Epigenetic reprogramming in mammals. Hum Mol Genet.; 14 Spec No 1:R47-58. Mullis KB, Faloona FA. 1987 Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol.; 155:335-50. Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003a Summary of mouse development; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 31-140. Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003b Cryopreservation, rederivation, 84
and transport of mice; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 599-628. Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003c Parthenogenesis, pronuclear transfer, and mouse cloning; Assisted reproduction: ovary transplantation, in vitro fertilization, artificial insemination, and intracytoplasmic sperm injection; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 541-564.; pp. 565-598. Nagy A, Gertsenstein M, Vintersten K, Behringer R. (Eds) 2003d Appendix 1: Buffers and Solutions; in Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 725-734. Nicolson GL, Yanagimachi R, Yanagimachi H. 1975 Ultrastructural localization of lectin-binding sites on the zonae pellucidae and plasma membranes of mammalian eggs. J Cell Biol.; 66(2):263-74. Niemann H, Wrenzycki C, Lucas-Hahn A, Brambrink T, Kues WA, Carnwath JW. 2002 Gene expression patterns in bovine in vitro-produced and nuclear transfer-derived embryos and their implications for early development. Cloning Stem Cells.; 4(1):29-38. Nightingale KP, O'Neill LP, Turner BM. 2006 Histone modifications: signalling receptors and potential elements of a heritable epigenetic code. Curr Opin Genet Dev.; 16(2):125-36. Nishiyama H, Itoh K, Kaneko Y, Kishishita M, Yoshida O, Fujita J. 1997 A glycine-rich RNAbinding protein mediating cold-inducible suppression of mammalian cell growth. J Cell Biol.; 137(4):899-908. Nolan T, Hands RE, Bustin SA 2006b Quantification of mRNA using real-time RT-PCR Nat Protoc.; 1(3):1559-82. Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA. 2006a SPUD: a quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Anal Biochem.; 351(2):308-10. Oren M, Levine AJ. 1983 Molecular cloning of a cDNA specific for the murine p53 cellular tumor antigen. Proc Natl Acad Sci U S A.; 80(1):56-9. Owen DJ, Ornaghi P, Yang JC, Lowe N, Evans PR, Ballario P, Neuhaus D, Filetici P, Travers AA. 2000 The structural basis for the recognition of acetylated histone H4 by the bromodomain of histone acetyltransferase gcn5p. EMBO J.; 19(22):6141-9. Palmieri SL, Peter W, Hess H, Scholer HR. 1994 Oct-4 transcription factor is differentially expressed in the mouse embryo during establishment of the first two extraembryonic cell lineages involved in implantation. Dev Biol.; 166(1):259-67. Pan GJ, Chang ZY, Schöler HR, Pei D. 2002 Stem cell pluripotency and transcription factor Oct4. Cell Res.; 12(5-6):321-9. Pantaleon M, Harvey MB, Pascoe WS, James DE, Kaye PL. 1997 Glucose transporter GLUT3: ontogeny, targeting, and role in the mouse blastocyst. Proc Natl Acad Sci U S A.; 94(8):3795-800. Peixoto A, Monteiro M, Rocha B, Veiga-Fernandes H. 2004 Quantification of multiple gene expression in individual cells. Genome Res.; 14(10A):1938-47. Peterson CL, Laniel MA. 2004 Histones and histone modifications. Curr Biol.; 14(14):R546-51. Pettersen EF, Goddard TD, Huang CC, Couch GS, Greenblatt DM, Meng EC, Ferrin TE. 2004 UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem.; 25(13):1605-12. 85
Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. 2002 Relative expression software tool (REST) for groupwise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res.; 30(9):e36. Pfaffl MW. 2001 A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res.; 29(9):e45. Piko L, Clegg KB. 1982 Quantitative changes in total RNA, total poly(A), and ribosomes in early mouse embryos. Dev Biol.; 89(2):362-78. Pravtcheva D, Rabin M, Bartolomei M, Corden J, Ruddle FH. 1986 Chromosomal assignment of gene encoding the largest subunit of RNA polymerase II in the mouse. Somat Cell Mol Genet.; 12(5):523-8. Quevillon S, Mirande M. 1996 The p18 component of the multisynthetase complex shares a protein motif with the beta and gamma subunits of eukaryotic elongation factor 1. FEBS Lett.; 395(1):63-7. Quivy V, Calomme C, Dekoninck A, Demonte D, Bex F, Lamsoul I, Vanhulle C, Burny A, Van Lint C. 2004 Gene activation and gene silencing: a subtle equilibrium. Cloning Stem Cells.; 6(2):140-9. Radonić A, Thulke S, Mackay IM, Landt O, Siegert W, Nitsche A. 2004 Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun.; 313(4):856-62. Rall WF, Fahy GM. 1985 Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification. Nature.; 313(6003):573-5. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. 2003 Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neurosci Lett.; 339(1):62-6. Ran Q, Pereira-Smith OM. 2000 Identification of an alternatively spliced form of the Tat interactive protein (Tip60), Tip60(beta). Gene.; 258(1-2):141-6. Raser JM, O'Shea EK. 2005 Noise in gene expression: origins, consequences, and control. Science.; 309(5743):2010-3. Rasmussen R. 2001 Quantification on the LightCycler; in Rapid Cycle Real-time PCR, Methods and Applications (eds) Meuer S, Wittwer C, Nakagawara K. (Springer Press, Heidelberg) pp. 21-34. Reik W, Santos F, Dean W. 2003 Mammalian epigenomics: reprogramming the genome for development and therapy. Theriogenology.; 59(1):21-32. Rinaudo P, Schultz RM. 2004 Effects of embryo culture on global pattern of gene expression in preimplantation mouse embryos. Reproduction.; 128(3):301-11. Ririe KM, Rasmussen RP, Wittwer CT. 1997 Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem.; 245(2):154-60. Rosenthal N, Brown S. 2007 The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol.; 9(9):993-9. Roses AD. 2005 Applying technologies Biotechniques.;39(4):563-4.
towards
safe
and
effective
medicines.
Roth WW, Bragg PW, Corrias MV, Reddy NS, Dholakia JN, Wahba AJ. 1987 Expression of a gene for mouse eucaryotic elongation factor Tu during murine erythroleukemic cell differentiation. Mol Cell Biol.; 7(11):3929-36. 86
Ruddle FH, Roderick TH. 1968 Allelically-determined isozyme polymorphisms in laboratory populations of mice. Ann N Y Acad Sci.; 151(1):531-9. Rudenko L, Matheson JC, Sundlof SF. 2007a Animal cloning and the FDA--the risk assessment paradigm under public scrutiny. Nat Biotechnol.; 25(1):39-43. Rudenko L, Matheson JC. 2007b The US FDA and animal cloning: risk and regulatory approach. Theriogenology.; 67(1):198-206. Sakkas D, Batt PA, Cameron AW. 1989 Development of preimplantation goat (Capra hircus) embryos in vivo and in vitro. J Reprod Fertil.; 87(1):359-65. Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001a Appendix 1: Preparation of Reagents and Buffers Used in Molecular Cloning; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. A1.1 Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001b In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 8.1-8.113. Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001c Gel Electrophoresis of DNA and Pulsed-field Agarose Gel Electrophoresis; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 5.1-5.86. Sambrook J, Russel DW. (eds.) 2001d Plasmids and Their Usefulness in Molecular Cloning; Preparation and Analysis of Eukaryotic Genomic DNA; Appendix 8: Commonly Used Techniques in Molecular Cloning; in Molecular cloning, a laboratory manual (3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.) pp. 1.1-1.162.; pp. 6.16.62.; pp. A8.1 Santoro R, Li J, Grummt I. 2002 The nucleolar remodeling complex NoRC mediates heterochromatin formation and silencing of ribosomal gene transcription. Nat Genet.; 32(3):393-6. Santos F, Dean W. 2004 Epigenetic reprogramming during early development in mammals. Reproduction.; 127(6):643-51. Scarano MI, Strazzullo M, Matarazzo MR, D'Esposito M. 2005 DNA methylation 40 years later: Its role in human health and disease. J Cell Physiol.; 204(1):21-35. Schmittgen TD, Zakrajsek BA, Mills AG, Gorn V, Singer MJ, Reed MW. 2000 Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction to study mRNA decay: comparison of endpoint and real-time methods. Anal Biochem.; 285(2):194-204. Schöler HR, Hatzopoulos AK, Balling R, Suzuki N, Gruss P. 1989 A family of octamer-specific proteins present during mouse embryogenesis: evidence for germline-specific expression of an Oct factor. EMBO J.; 8(9):2543-50. Schuettengruber B, Simboeck E, Khier H, Seiser C. 2003 Autoregulation of mouse histone deacetylase 1 expression. Mol Cell Biol.; 23(19):6993-7004. Schultz GA. 1986 Molecular bioology of the early mouse embryo. Biol Bull.; 171: 291-309. Schultz RM. 2002 The molecular foundations of the maternal to zygotic transition in the preimplantation embryo. Hum Reprod Update.; 8(4):323-31. Schultz RM. 2005 From egg to embryo: a peripatetic journey. Reproduction.; 130(6):825-8. Selander RK, Hunt WG, Yang SY. 1969 Protein polymorphism and genie heterozygosity in two European subspecies of the house mouse. Evolution.; 23:379-90. 87
Seshagiri PB, McKenzie DI, Bavister BD, Williamson JL, Aiken JM. 1992 Golden hamster embryonic genome activation occurs at the two-cell stage: correlation with major developmental changes. Mol Reprod Dev.; 32(3):229-35. Shi JJ, Cai DH, Chen XJ, Sheng HZ. 2008 Cloning and characterization of the rabbit POU5F1 gene. DNA Seq.; 19(1):56-61. Shi W, Zakhartchenko V, Wolf E. 2003 Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer. Differentiation.; 71(2):91-113. Sittman DB, Graves RA, Marzluff WF. 1983 Structure of a cluster of mouse histone genes. Nucleic Acids Res.; 11(19):6679-97. Skern R, Frost P, Nilsen F. 2005 Relative transcript quantification by quantitative PCR: roughly right or precisely wrong? BMC Mol Biol.; 6(1):10. Smith CM, Haimberger ZW, Johnson CO, Wolf AJ, Gafken PR, Zhang Z, Parthun MR, Gottschling DE. 2002 Heritable chromatin structure: mapping "memory" in histones H3 and H4. Proc Natl Acad Sci U S A.; 99 Suppl 4:16454-61. Sonna LA, Fujita J, Gaffin SL, Lilly CM. 2002 Invited review: Effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. J Appl Physiol.; 92(4):1725-42. Stahlberg A, Kubista M, Pfaffl M. 2004 Comparison of reverse transcriptases in gene expression analysis. Clin Chem.; 50(9):1678-80. Steuerwald N, Cohen J, Herrera RJ, Brenner CA. 1999 Analysis of gene expression in single oocytes and embryos by real-time rapid cycle fluorescence monitored RT-PCR. Mol Hum Reprod.; 5(11):1034-9. Strahl BD, Allis CD. 2000 The language of covalent histone modifications. Nature.; 403(6765):41-5. Strausberg RL, Feingold EA, Grouse LH, Derge JG, Klausner RD, Collins FS, Wagner L, Shenmen CM, Schuler GD, Altschul SF, Zeeberg B, Buetow KH, Schaefer CF, Bhat NK, Hopkins RF, Jordan H, Moore T, Max SI, Wang J, Hsieh F, Diatchenko L, Marusina K, Farmer AA, Rubin GM, Hong L, Stapleton M, Soares MB, Bonaldo MF, Casavant TL, Scheetz TE, Brownstein MJ, Usdin TB, Toshiyuki S, Carninci P, Prange C, Raha SS, Loquellano NA, Peters GJ, Abramson RD, Mullahy SJ, Bosak SA, McEwan PJ, McKernan KJ, Malek JA, Gunaratne PH, Richards S, Worley KC, Hale S, Garcia AM, Gay LJ, Hulyk SW, Villalon DK, Muzny DM, Sodergren EJ, Lu X, Gibbs RA, Fahey J, Helton E, Ketteman M, Madan A, Rodrigues S, Sanchez A, Whiting M, Madan A, Young AC, Shevchenko Y, Bouffard GG, Blakesley RW, Touchman JW, Green ED, Dickson MC, Rodriguez AC, Grimwood J, Schmutz J, Myers RM, Butterfield YS, Krzywinski MI, Skalska U, Smailus DE, Schnerch A, Schein JE, Jones SJ, Marra MA; Mammalian Gene Collection Program Team. 2002 Generation and initial analysis of more than 15,000 fulllength human and mouse cDNA sequences. Proc Natl Acad Sci U S A.; 99(26):16899-903. Suen KL, Bustelo XR, Barbacid M. 1995 Lack of evidence for the activation of the Ras/Raf mitogenic pathway by 14-3-3 proteins in mammalian cells. Oncogene.; 11(5):825-31. Surani MA, Barton SC, Norris ML. 1984 Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature.; 308(5959):548-50. Taylor J, Fairburn H, Beaujean N, Meehan R, Young L. 2003 Gene expression in the developing embryo and fetus. Reprod Suppl.; 61:151-65. Telford NA, Watson AJ, Schultz GA. 1990 Transition from maternal to embryonic control in early mammalian development: a comparison of several species. Mol Reprod Dev.; 88
26(1):90-100. Tichopad A, Dilger M, Schwarz G, Pfaffl MW. 2003 Standardized determination of real-time PCR efficiency from a single reaction set-up. Nucleic Acids Res.; 31(20):e122. Tsunaka Y, Kajimura N, Tate S, Morikawa K. 2005 Alteration of the nucleosomal DNA path in the crystal structure of a human nucleosome core particle. Nucleic Acids Res.; 33(10):3424-34. Tsunoda Y, Kato Y. 1998 Not only inner cell mass cell nuclei but also trophectoderm nuclei of mouse blastocysts have a developmental totipotency. J Reprod Fertil.; 113(2):181-4. Turner BM. 2000 Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays.; 22(9):836-45. Vajta G. 2000 Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals. Anim Reprod Sci.; 60-61:357-64. van Eijk MJ, van Rooijen MA, Modina S, Scesi L, Folkers G, van Tol HT, Bevers MM, Fisher SR, Lewin HA, Rakacolli D, Galli C, de Vaureix C, Trounson AO, Mummery CL, Gandolfi F. 1999 Molecular cloning, genetic mapping, and developmental expression of bovine POU5F1. Biol Reprod.; 60(5):1093-103. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. 2002 Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol.; 3(7):RESEARCH0034. Vastag B. 2001 Epigenetics is seen as possible key to cloning. JAMA.; 286(12):1438-40. Velculescu VE, Zhang L, Vogelstein B, Kinzler KW. 1995 Serial analysis of gene expression. Science.; 270(5235):484-7. Verdel A, Khochbin S. 1999 Identification of a new family of higher eukaryotic histone deacetylases. Coordinate expression of differentiation-dependent chromatin modifiers. J Biol Chem.; 274(4):2440-5. Verschure PJ, van der Kraan I, de Leeuw W, van der Vlag J, Carpenter AE, Belmont AS, van Driel R. 2005 In vivo HP1 targeting causes large-scale chromatin condensation and enhanced histone lysine methylation. Mol Cell Biol.; 25(11):4552-64. Wakayama T, Perry AC, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. 1998 Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature.; 394(6691):369-74. Walker NJ. 2002 Tech.Sight. A technique whose time has come. Science.; 296(5567):557-9. Willems E, Mateizel I, Kemp C, Cauffman G, Sermon K, Leyns L. 2006 Selection of reference genes in mouse embryos and in differentiating human and mouse ES cells. Int J Dev Biol.;50(7):627-35. Wilmut I, Beaujean N, de Sousa PA, Dinnyes A, King TJ, Paterson LA, Wells DN, Young LE. 2002 Somatic cell nuclear transfer. Nature.; 419(6907):583-6. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KH. 1997 Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature.; 385(6619):810-3. Winston F, Allis CD. 1999 The bromodomain: a chromatin-targeting module? Nat Struct Biol.; 6(7):601-4. Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, Rasmussen RP. 1997 Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques.; 22(1):130-1, 134-8. Wrenzycki C, Herrmann D, Carnwath JW, Niemann H. 1998 Expression of RNA from 89
developmentally important genes in preimplantation bovine embryos produced in TCM supplemented with BSA. J Reprod Fertil.; 112(2):387-98. Xu W, Edmondson DG, Roth SY. 1998 Mammalian GCN5 and P/CAF acetyltransferases have homologous amino-terminal domains important for recognition of nucleosomal substrates. Mol Cell Biol.; 18(10):5659-69. Yang W, Musci TS, Mansour SL.1997 Trapping genes expressed in the developing mouse inner ear. Hear Res.; 114(1-2):53-61. Yang WM, Inouye C, Zeng Y, Bearss D, Seto E. 1996 Transcriptional repression by YY1 is mediated by interaction with a mammalian homolog of the yeast global regulator RPD3. Proc Natl Acad Sci U S A.; 93(23):12845-50. Yoshida N, Brahmajosyula M, Shoji S, Amanai M, Perry AC. 2007 Epigenetic discrimination by mouse metaphase II oocytes mediates asymmetric chromatin remodeling independently of meiotic exit. Dev Biol.; 301(2):464-77. Zeng F, Baldwin DA, Schultz RM. 2004 Transcript profiling during preimplantation mouse development. Dev Biol.; 272(2):483-96. Zeng F, Schultz RM. 2005 RNA transcript profiling during zygotic gene activation in the preimplantation mouse embryo. Dev Biol.; 283(1):40-57. Zernicka-Goetz M. 1994 Activation of embryonic genes during preimplantation rat development. Mol Reprod Dev.; 38(1):30-5. Zernicka-Goetz M. 2002 Patterning of the embryo: the first spatial decisions in the life of a mouse. Development.; 129(4):815-29. Zhang CL, McKinsey TA, Lu JR, Olson EN. 2001 Association of COOH-terminal-binding protein (CtBP) and MEF2-interacting transcription repressor (MITR) contributes to transcriptional repression of the MEF2 transcription factor. J Biol Chem.; 276(1):35-9. Zhang J, Desai M, Ozanne SE, Doherty C, Hales CN, Byrne CD. 1997 Two variants of quantitative reverse transcriptase PCR used to show differential expression of alpha-, betaand gamma-fibrinogen genes in rat liver lobes. Biochem J.; 321 (Pt 3):769-75. Zhang K, Sridhar VV, Zhu J, Kapoor A, Zhu JK. 2007 Distinctive Core Histone PostTranslational Modification Patterns in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE.; 2(11):e1210. Zhang X, Kidder GM, Zhang C, Khamsi F, Armstrong DT. 1994 Expression of plasminogen activator genes and enzymatic activities in rat preimplantation embryos. J Reprod Fertil.; 101(1):235-40. Zheng P, Patel B, McMenamin M, Paprocki AM, Schramm RD, Nagl NG Jr, Wilsker D, Wang X, Moran E, Latham KE. 2004 Expression of genes encoding chromatin regulatory factors in developing rhesus monkey oocytes and preimplantation stage embryos: possible roles in genome activation. Biol Reprod.; 70(5):1419-27. Zhu X, Chang KH, He D, Mancini MA, Brinkley WR, Lee WH. 1995 The C terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem.; 270(33):19545-50.
90
Függelékek I. Hiszton módosítások és funkcióik
A napjainkig leírt és ismert hiszton módosításokat és a hozzájuk rendelt feltételezett funkciókat a 6. táblázat tartalmazza. Hiszton Aminosav Módosítás H2A S1 P K5 Ac K9 Ac K119 U T120 P H2AX S139 P H2B K5 Ac K12 Ac S14 P K15 Ac K20 Ac S32 P K120 U H3 T3 P K4 Ac K4 Me K9 Ac K9 Me S10 P T11 P K14 Ac R17 Me K18 Ac K23 Ac K27 Ac K27 Me S28 P K36 Me K79 Me ? U H4 S1 P R3 Me K5 Ac K8 Ac K12 Ac K16 Ac K20 Me K59 Me
Feltételezett funkció Mitózis Transzkripció aktiválása Transzkripció aktiválása Spermiogenezis Mitózis DNS hibajavítás Transzkripció aktiválása Transzkripció aktiválása Programozott sejthalál Transzkripció aktiválása Transzkripció aktiválása Programozott sejthalál Meiózis Mitózis Transzkripció aktiválása Aktív eukromatin (tri-Me), transzkripció elongáció/memória (tri-Me), transzkripció aktiválása Hiszton depozíció, transzkripció aktiválása Géncsöndesítés (tri-Me), DNS metiláció (tri-Me), imprinting Mitózis, meiózis, transzkripció aktiválása Mitózis Transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás, transzkripció elongáció Transzkripció aktiválása Transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás, DNS replikáció Transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás Transzkripció aktiválása Géncsöndesítés, X kromoszóma inaktiváció (tri-Me) Mitózis Transzkripció elongáció, géncsöndesítés? Aktív eukromatin, transzkripció elongáció/memória Spermiogenezis Mitózis Transzkripció aktiválása Hiszton depozíció, transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás Transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás Hiszton depozíció, telomer csöndesítés, transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás Transzkripció aktiválása, DNS hibajavítás Géncsöndesítés (mono-Me) Géncsöndesítés?
6. táblázat: Az ismert hiszton módosítások. Ac: acetiláció, Me: metiláció, P: foszforiláció, U: ubiquitináció. 91
II. Egy sejt RNS tartalma
Egy tipikus emlős sejt 10-30 pg RNS-t tartalmaz, mely nem több mint a sejt egészének 1 %-a. A többsége, mint a transzfer RNS (tRNS) és riboszómális RNS (rRNS) nem tartozik a fehérjéket kódoló hírvivő RNS-ekhez (mRNS), melynek mennyisége csupán 1-5 %-ot tesz ki, függően a sejt típusától és fiziológiás állapotától (39. ábra). Ez körülbelül 360000 molekulának felel meg, mely 12000 különböző génről íródik át, átlagosan 10-100 példányban vannak jelen és átlagos méretük 1900 nukleotid (7. táblázat). Egyes mRNS-ek a teljes mRNS tartalomnak a 3 %át is kiteszik (gyakoriak), míg a nagy hányaduk nem éri el a 0,01 %-ot sem (8. táblázat). Ezek a ritka mRNS molekulák csupán 1-10 példányban találhatóak meg a sejtekben, de 11000-féle gén termékei és összességében az mRNS állomány 45 %-át alkotják (Alberts és mtsai 2002.b) Totál RNS
10-30 pg
rRNS (28S, 18S, 5S)
80-85 %
tRNS, snRNS, alacsony molekulasúlyú RNS-ek
10-15 %
mRNS (átlagos méret: 1900 nukleotid)
2 (1–5) % (360000 (200000-2000000) darab)
7. táblázat: Egy tipikus emlős sejt RNS tartalma.
39. ábra: Az RNS-ek megoszlása.
Csoport
Zölddel az eukarióta, kékkel a bakteriális, pirossal a közös RNS fajták vannak jelölve; snRNS: kis sejtmagi RNS; snoRNS: kis sejtmagvacskában található RNS; scRNS: kis citoplazmatikus RNS; tmRNS: transzferhírvivő RNS. (Forrás: Brown 2002.)
Ritka
Darab/sejt (gyakoriság) <30 (<0,004 %)
mRNS féleség/sejt >11000
Közepes 100-500 (<0,1 %) 500-1000 Gyakori >10000 (<3 %)
<10
8. táblázat: Az mRNS-ek megoszlása a gyakoriságuk alapján.
Ettől az átlagos megközelítéstől nagymértékben eltérhet a preimplantációs állapotú embrió sejtek RNS tartalma. Folytatva az egér példáján, a petesejttől hólyagcsíra stádiumig meghatározták egy embrió mRNS és totál RNS mennyiségét is: 9. táblázat (Piko és Clegg 1982., Clegg és Piko 1983.). Stádium
RNS mennyiség mRNS darabszám
petesejt
0,35-0,43 ng
17000000 (20 pg)
egysejtes
nincs adat
24000000
kétsejtes
0,24 ng
7000000
szedercsíra (8-16 sejt)
0,69 ng
13000000
hólyagcsíra (32 sejt)
1,47 ng
34000000
13 napos embrió
450 µg
(13 µg)
9. táblázat: Különböző fejlődési stádiumú egér embriók RNS-tartalma. 92
III. A vizsgált gének szekvencia adatai
A szekvencia adatokat külön csoportosítottam egérre (10. táblázat), szarvasmarhára (11. táblázat) és nyúlra (12. táblázat). Gén rövid neve
Ensembl gén azonosító (kromoszóma: pozíció)
Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia szekvencia)
mRNS hossza (nukleotid)/exonok száma/fehérje hossza (aminosav)
Actb
ENSMUSG00000029580 (5: 143,664,795-143,668,403)
ENSMUST00000031564 (NM_007393.3)
1889/6/375
Bmp7
ENSMUSG00000008999 (2: 172,695,191-172,765,794)
ENSMUST00000009143 (NM_007557.2)
1964/7/430
Cenpf
ENSMUSG00000026605 (1: 191,464,495-191,511,965)
ENSMUST00000027900 (NM_001081363.1)
11093/19/2,98
Cirbp
ENSMUSG00000045193 (10: ENSMUST00000105365 79,630,584-79,634,398) (NM_007705.2)
1258/7/172
Crebbp
ENSMUSG00000022521 (16: ENSMUST00000023165 4,084,048-4,213,390) (NM_001025432.1)
7493/31/2441
Dazap2
ENSMUSG00000000346 (15: ENSMUST00000000356 100,446,057-100,451,162) (NM_011873.2)
1828/4/168
Eef1e1
ENSMUSG00000001707 (13: ENSMUST00000001757 38,737,567-38,750,897) (NM_025380.2)
1032/4/174
Eif1a
ENSMUSG00000057561 (18: ENSMUST00000078079 46,757,358-46,769,862) (NM_010120.4)
2862/3/144
Eif4e
ENSMUSG00000028156 (3: 138,189,155-138,220,563)
2882/8/217
Ep300
ENSMUSG00000055024 (15: ENSMUST00000068387 81,416,644-81,482,507) (NM_177821.6)
8749/31/2412
Gapdh
ENSMUSG00000057666 (6: 125,111,872-125,115,613)
1242/7/337
Gcn5l2
ENSMUSG00000020918 (11: ENSMUST00000006973 100,566,062-100,573,766) (NM_001038010.1; NM_020004.4)
3028/18/829
H2afz
ENSMUSG00000037894 (3: 137,527,505-137,529,882)
ENSMUST00000041045 (NM_016750.2)
1011/5/128
Hat1
ENSMUSG00000027018 (2: 71,227,314-71,279,679)
ENSMUST00000028408 (NM_026115.3)
1579/11/416
Hdac1
ENSMUSG00000028800 (4: 129,193,348-129,219,890)
ENSMUST00000102597 (NM_008228.2)
1971/14/482
Hdac2
ENSMUSG00000019777 (10: ENSMUST00000019911 36,694,350-36,721,694) (NM_008229.2)
2004/14/488
Hdac3
ENSMUSG00000024454 (18: ENSMUST00000043498 38,096,625-38,114,642) (NM_010411.2)
2005/15/428
Hdac4
ENSMUSG00000026313 (1: 93,829,334-94,044,970)
3952/26/910
Hdac5
ENSMUSG00000008855 (11: ENSMUST00000107152 102,057,063-102,091,486) (NM_001077696.1; NM_010412.3)
3796/27/1115
Hdac6
ENSMUSG00000031161 (X: ENSMUST00000033501 7,507,256-7,524,953) (NM_010413.2)
4006/29/1152
Hdac7
ENSMUSG00000022475 (15: ENSMUST00000088402 97,623,119-97,662,102) (NM_019572.2)
4120/24/938
ENSMUST00000029803 (NM_007917.3)
ENSMUST00000073605 (NM_008084.2)
ENSMUST00000008995 (NM_207225.1)
93
Gén rövid neve
Ensembl gén azonosító (kromoszóma: pozíció)
Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia szekvencia)
mRNS hossza (nukleotid)/exonok száma/fehérje hossza (aminosav)
Hdac8
ENSMUSG00000067567 (X: ENSMUST00000087916 99,479,978-99,700,698) (NM_027382.3)
1936/11/377
Hdac9
ENSMUSG00000004698 (12: ENSMUST00000085463 34,737,166-35,213,213) (NM_024124.2)
3248/25/582
Hdac10
ENSMUSG00000062906 (15: ENSMUST00000082197 88,953,741-88,959,057) (NM_199198.1)
2335/20/666
Hdac11
ENSMUSG00000034245 (6: 91,106,798-91,124,682)
ENSMUST00000041736 (NM_144919.2)
2510/10/347
Hist2h2aa2 ENSMUSG00000063954 (3: 96,049,461-96,050,038)
ENSMUST00000074976 (NM_178212.1)
578/1/130
Hprt1
ENSMUSG00000025630 (X: ENSMUST00000026723 50,341,255-50,374,829) (NM_013556.2)
1341/9/218
Hspa1a
ENSMUSG00000067283 (17: ENSMUST00000087328 35,106,945-35,108,873) (NM_010479.2)
1929/1/642
Htatip
ENSMUSG00000024926 (19: ENSMUST00000025865 5,603,017-5,610,050) (NM_178637.1)
1964/14/513
Nanog
ENSMUSG00000012396 (6: 122,657,611-122,664,651)
2186/4/305
Pcaf
ENSMUSG00000000708 (17: ENSMUST00000000724 53,706,296-53,812,045) (NM_020005.3)
4653/18/813
Polr2a
ENSMUSG00000005198 (11: ENSMUST00000058470 69,547,612-69,571,795) (NM_009089.2)
6283/29/1970
Pou5f1
ENSMUSG00000024406 (17: ENSMUST00000025271 35,642,984-35,647,722) (NM_013633.2)
1346/5/352
Ppia
ENSMUSG00000071866 (11: ENSMUST00000090749 6,315,782-6,319,796) (NM_008907.1)
810/5/164
Rbm3
ENSMUSG00000031167 (X: ENSMUST00000115620 7,720,398-7,722,862) (NM_016809.4)
579/6/154
Sfrs3
ENSMUSG00000071172 (17: ENSMUST00000037776 29,169,618-29,179,039) (NM_013663.4)
1294/6/164
Slc2a3
ENSMUSG00000003153 (6: 122,677,843-122,692,537)
3717/10/493
Sod1
ENSMUSG00000022982 (16: ENSMUST00000023707 90,220,987-90,226,567) (NM_011434.1)
646/5/154
Sod2
ENSMUSG00000006818 (17: ENSMUST00000007012 13,200,705-13,210,985) (NM_013671.3)
3824/5/222
Taf1
ENSMUSG00000031314 (X: ENSMUST00000033676 98,728,098-98,794,864) (NM_001081008.1)
5739/38/1891
Tbp
ENSMUSG00000014767 (17: ENSMUST00000080441 15,636,852-15,654,373) (NM_013684.2)
1656/7/260
Trp53
ENSMUSG00000059552 (11: ENSMUST00000108658 69,393,483-69,405,373) (NM_011640.2)
1742/11/390
Tubb4
ENSMUSG00000062591 (17: ENSMUST00000071135 57,219,489-57,227,205) (NM_009451.3)
2228/4/444
Ubc
ENSMUSG00000008348 (5: 125,866,347-125,870,111)
2109/2/658
ENSMUST00000012540 (NM_028016.2)
ENSMUST00000032476 (NM_011401.3)
ENSMUST00000091367 (NM_019639.4)
10. táblázat: Egér szekvencia adatok. (Utoljára frissítve: 2008. április.) 94
Gén neve (Szarvasmarha gén rövid neve)
Ensembl gén azonosító (kromoszóma: pozíció)
Ensembl mRNS azonosító (NCBI referencia szekvencia)
mRNS hossz (nukleotid)/ exon száma/ fehérje hossz (aminosav)
Cenpf
-
- (XM_612376.3)
-
Dazap2 (NP_001029873.1)
ENSBTAG00000004349 (5: 27,873,627-27,877,833)
ENSBTAT00000002573 (NM_001034701.1)
1855/4/168
Eif1a
-
- (AF051848.1)
-
Eif4e
ENSBTAG00000007883 (26: ENSBTAT00000010367 8,979,376-8,980,152) (NM_174310.3)
654/4/217
Hist2h2aa2 ENSBTAG00000032456 (3: (Q2VT23_BOVIN) 18,496,498-18,496,890)
ENSBTAT00000046028 (XM_001255499.1)
393/1/130
Sfrs3 (NP_001029872.1)
ENSBTAT00000004154 (NM_001034700.1)
495/1/164
ENSBTAG00000003197 (5: 100,918,030-100,918,524)
11. táblázat: Szarvasmarha szekvencia adatok. (Utoljára frissítve: 2008. április.)
Gén neve (Nyúl gén rövid neve)
Ensembl gén azonosító
Ensembl mRNS azonosító mRNS hossz (nukleotid)/ (NCBI referencia exon száma/ szekvencia) fehérje hossz (aminosav)
Actb
-
- (X60733)
-
Eef1e1 (EEF1E1)
ENSOCUG00000012587
ENSOCUT00000012580 (-)
297/2/99
G6pdx (G6PD)
ENSOCUG00000007866
ENSOCUT00000007866 (-)
1302/12/434
Gapdh
-
- (NM_001082253.1)
-
H2afz (H2AV_RABIT)
ENSOCUG00000001888
ENSOCUT00000001883 (AF030235.1)
381/5/126
Hprt1 (O46381_RABIT)
ENSOCUG00000003186
ENSOCUT00000003188 (AF020294.1)
657/10/218
Pgk1 (PGK1)
ENSOCUG00000014726
ENSOCUT00000014723 (-)
1203/11/401
Polr2a (POLR2A)
ENSOCUG00000017929
ENSOCUT00000017930 (-)
4950/42/1650
Pou5f1 ENSOCUG00000017160 (ENSOCUG00000017160)
ENSOCUT00000017155 (NM_001099957.1)
1083/6/360
Ppia (PPIA_RABIT)
ENSOCUG00000016662
ENSOCUT00000016662 (AF139893.1)
426/5/142
Ywhaz (YWHAZ)
ENSOCUG00000000734
ENSOCUT00000000734 (-)
738/6/245
12. táblázat: Nyúl szekvencia adatok. (Utoljára frissítve: 2008. április.)
95
IV. A nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása
A nyúl embrió mintában kimutatott PCR termék szekvenciájának összevetése az NCBI referencia szekvencia adatbázisával (Reference mRNA sequences) a BLASTN 2.2.18 program segítségével (Basic BLAST: nucleotide blast: blastn (blastn)) a következő eredményre vezetett: 89 %-os hasonlóság az emberi Pou5f1 génnel, 88 %-os hasonlóság a csimpánz (Pan troglodytes) és szarvasmarha Pou5f1 génnel, 84 %-os hasonlóság az egér és patkány Pou5f1 génnel (40. ábra) (Altschul és mtsai. 1997.). Az így talált ortológ szekvenciák homológia viszonyait a CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment program segítségével (ClustalW2) lehetett meghatározni: 41. ábra (Larkin és mtsai. 2007.). ________________________________________________________________________________ NCBI/ BLAST/ blastn/ Job Title: Nucleotide sequence (385 letters) BLASTN 2.2.18 (Mar-02-2008) Database: NCBI Transcript Reference Sequences (1,381,018 sequences; 2,272,579,530 total letters) Length=385 Sequences producing significant alignments: Accession
Description
Total score Max ident
gi|116235490| Homo sapiens POU class 5 homeobox 1 NM_203289.3 (POU5F1), transcript variant 2, mRNA
517
89%
gi|114588002| PREDICTED: Pan troglodytes similar to POU- 499 XM_001135162.1 type homeodomain-containing DNA-binding protein, transcript variant 2 (LOC735657), mRNA
88%
gi|27807048| NM_174580.1
88%
Bos taurus POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), 493 mRNA
gi|125490391| Mus musculus POU domain, class 5, NM_013633.2 transcription factor 1 (Pou5f1), mRNA
421
84%
gi|57164004| Rattus norvegicus POU domain, class 5, NM_001009178.1 transcription factor 1 (Pou5f1), mRNA
421
84%
Alignments >gi|116235490|ref|NM_203289.3| transcript variant 2, mRNA Length=1155
Homo sapiens POU class 5 homeobox 1 (POU5F1),
GENE ID: 5460 POU5F1 | POU class 5 homeobox 1 [Homo sapiens] (Over 10 PubMed links) Score = 517 bits (572), Expect = 2e-144 Identities = 345/385 (89%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus Query
1
Sbjct
396
Query
61
Sbjct
456
Query
121
Sbjct
516
Query
181
Sbjct
576
CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG ||||||||| |||||||||| ||||||||||| || |||||||| || || ||||||||| CTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAG
60
ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC || |||||||| || ||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||| |||||| ATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAAC
120
CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG ||||||||||||||| ||||||| ||||||||||||||||||||||||| ||||||||| CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAG
180
ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT ||||||||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||| |||||||||||| ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGT
240
96
455
515
575
635
Query
241
Sbjct
636
Query
301
Sbjct
696
Query
361
Sbjct
756
AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG |||||||||||||||||||| ||||||||||| |||| | | |||||||||||||||||| AACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAG
300
GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT || | || ||||| ||| ||||||| || |||| ||||||||||| || ||||||||| GCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCAT
360
TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC || ||||||||||||||||| |||| TTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCC
695
755
385 780
>gi|114588002|ref|XM_001135162.1| PREDICTED: Pan troglodytes similar to POUtype homeodomain-containing DNA-binding protein, transcript variant 2 (LOC735657), mRNA Length=1392 GENE ID: 735657 POU5F1 | POU class 5 homeobox 1 [Pan troglodytes] Score = 499 bits (552), Expect = 5e-139 Identities = 341/385 (88%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus Query
1
Sbjct
646
Query
61
Sbjct
706
Query
121
Sbjct
766
Query
181
Sbjct
826
Query
241
Sbjct
886
Query
301
Sbjct
946
Query
361
Sbjct
1006
CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG ||||||||| |||||||||| |||||||| || || |||||||| || || ||||||||| CTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGACGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAG
60
ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC || |||||||| || ||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||| |||||| ATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAAC
120
CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG ||||||||||||||| ||||||| |||||| |||||||||||||||||| ||||||||| CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCGGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAG
180
ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT ||||||||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||| | |||||||||| ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGCGTGGTTCTGT
240
AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG |||||||||||||||||||| |||||||||||||||| | | |||||||||||||||||| AACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGTGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAG
300
GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT || | || ||| | ||| ||||||| || |||| ||||||||||| || |||||| || GCTGCTGGGTCTTCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCTAT
360
TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC || ||||||||||||||||| |||| TTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCC
>gi|27807048|ref|NM_174580.1| Length=1615
705
765
825
885
945
1005
385 1030
Bos taurus POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), mRNA
GENE ID: 282316 POU5F1 | POU class 5 homeobox 1 [Bos taurus] (10 or fewer PubMed links) Score = 493 bits (546), Expect = 2e-137 Identities = 337/380 (88%), Gaps = 0/380 (0%) Strand=Plus/Plus Query
1
Sbjct
898
Query
61
Sbjct
958
Query
121
Sbjct
1018
Query
181
Sbjct
1078
CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG |||||||||||||||||||| ||||||||||| || |||||||||||||| || |||||| CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAATCTGCAGGAG
60
ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC || ||||| || |||||||| ||||||||||| ||||||||||| |||||||| |||||| ATATGCAAGGCAGAGACCCTTGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGGACGAGTATCGAGAAC
120
CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG ||||||||||||||| |||||| ||||||||||||||||||||| ||||| |||||||| CGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAGCATGTTCCTGCAGTGCCCGAAGCCCACCCTGCAGCAA
180
ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT || |||||||||||||||||||| ||||| ||||||||||||||||| |||||||| || ATTAGCCACATCGCCCAGCAGCTCGGGCTGGAGAAAGACGTGGTCCGAGTGTGGTTTTGC
240
97
957
1017
1077
1137
Query
241
Sbjct
1138
Query
301
Sbjct
1198
Query
361
Sbjct
1258
AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG ||||| ||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| |||||||||||| AACCGTCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTACTCCCAACGTGAGGATTTTGAG
300
GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT || | || ||||| ||| ||||||| || | || | ||||||||| || ||||||||| GCTGCTGGGTCTCCTTTCACAGGGGGACCCGTATCCTCTCCTCTGGCGCCAGGGCCCCAT
360
TTCGGTACCCCAGGCTATGG || |||||||||||||| || TTTGGTACCCCAGGCTACGG
>gi|125490391|ref|NM_013633.2| factor 1 (Pou5f1), mRNA Length=1346
1197
1257
380 1277
Mus musculus POU domain, class 5, transcription
GENE ID: 18999 Pou5f1 | POU domain, class 5, transcription factor 1 [Mus musculus] (Over 100 PubMed links) Score = 421 bits (466), Expect = 1e-115 Identities = 324/385 (84%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus Query
1
Sbjct
638
Query
61
Sbjct
698
Query
121
Sbjct
758
Query
181
Sbjct
818
Query
241
Sbjct
878
Query
301
Sbjct
938
Query
361
Sbjct
998
CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG ||||||||||||||| |||| ||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||| CTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAG
60
ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC || |||||| |||||||||| |||||||||||||||||||||||||| || ||||||||| ATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAAC
120
CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG || ||||| | | |||||| |||||| ||| |||||||||| ||| | || |||||| CGTGTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAG
180
ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT |||| ||||||||| | ||||| ||||| ||||| || ||||| || || ||||||||| ATCACTCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGT
240
AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG ||||||||||||||||||||| ||||||| | ||| | |||||||||||| || | |||| AACCGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAG
300
GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT || || || | || ||| |||||||| || | || ||||||||| | || || ||||| GCTACAGGGACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCAC
360
TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC || || |||||||||||||| |||| TTTGGCACCCCAGGCTATGGAAGCC
697
757
817
877
937
997
385 1022
>gi|57164004|ref|NM_001009178.1| Rattus norvegicus POU domain, class 5, transcription factor 1 (Pou5f1), mRNA Length=1141 GENE ID: 294562 Pou5f1 | POU domain, class 5, transcription factor 1 [Rattus norvegicus] (10 or fewer PubMed links) Score = 421 bits (466), Expect = 1e-115 Identities = 324/385 (84%), Gaps = 0/385 (0%) Strand=Plus/Plus Query
1
Sbjct
577
Query
61
Sbjct
637
Query
121
Sbjct
697
CTGCGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG ||||||||||||||| |||| ||||||||||| || |||||||||||||||||||||||| CTGCGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAACCTTCAGGAG
60
ATTTGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAAC || |||||| |||||||||| ||||||||||||||||||||||| || || ||||||||| ATATGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGGACTAGCATTGAGAAC
120
CGAGTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAG || ||||| | ||| ||||||||||||| |||||||||||||| ||| | ||||||||| CGTGTGAGGTGGAACCTGGAGAACATGTTTCTGCAGTGCCCGAAGCCCTCCCTGCAGCAG
180
98
636
696
756
Query
181
Sbjct
757
Query
241
Sbjct
817
Query
301
Sbjct
877
Query
361
ATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGT |||| ||| ||| ||||||| ||||| |||| || ||||| || |||||||||||| ATCACTAGCATTGCCAAGCAGCTTGGGCTGGAGAGGGATGTGGTTCGAGTGTGGTTCTGT
240
AACCGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAG ||||||||||||||||| ||| |||| |||| ||| | |||||||||||| || | |||| AACCGGCGCCAGAAGGGGAAAAGATCGAGCATTGAATATTCCCAACGAGAAGAGTATGAG
300
GCCACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCAT ||| | || || ||| |||||||| || |||| ||||||||| | || || ||||| GCCGCGGGGAAACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTGTCCTTTCCTCTGCCCCCAGGCCCCCAC
360
816
876
936
TTCGGTACCCCAGGCTATGGCAGCC 385 || ||| | ||||||||||| |||| Sbjct 937 TTTGGTGCTCCAGGCTATGGGAGCC 961 ________________________________________________________________________________
40. ábra: A feltételezett nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának elemzése. Az ábra rövidített és egyszerűsített formában mutatja az NCBI adatbázisban talált leghasonlóbb referencia szekvenciákat, és az illeszkedésüket.
________________________________________________________________________________ ClustalW2 Results Scores Table SeqA Name Len(nt) SeqB Name Len(nt) Score =============================================================== 1 nyúl 385 2 ember 1417 89 1 nyúl 385 3 egér 1324 84 1 nyúl 385 4 patkány 1059 84 1 nyúl 385 5 szarvasmarha 1615 87 1 nyúl 385 6 csimpánz 1389 89 2 ember 1417 3 egér 1324 81 2 ember 1417 4 patkány 1059 83 2 ember 1417 5 szarvasmarha 1615 85 2 ember 1417 6 csimpánz 1389 99 3 egér 1324 4 patkány 1059 93 3 egér 1324 5 szarvasmarha 1615 78 3 egér 1324 6 csimpánz 1389 81 4 patkány 1059 5 szarvasmarha 1615 81 4 patkány 1059 6 csimpánz 1389 83 5 szarvasmarha 1615 6 csimpánz 1389 86 =============================================================== Alignment CLUSTAL 2.0.5 multiple sequence alignment ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------GGAGCTGGAAGTGAAGGCCCGCATGGGGGACCTGCACCGAGAGTCTAGGAGTCTGGGGGC 60 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------TGGAGAGGGGCCTGGGTGGAGATCCCTGGCTTTCCCCTTCCAGACACCACCGCCACCAGC 120 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AGGCAAACACCCTCCGCCTCAGTTTCTCCCACCCCCACGGTCCCTTCCCCCCACCCATCC 180 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
99
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AGGGGGCGGGGCCAGAGGTCAAGGCTAGTGGGTGGGATTGGGGAGGGAGAGAGGTGTTGA 240 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
----TCCCTTCGCAAGCCCTCATTTCACCAGGCCCCCGGCTTGGGGCGCCTTCCTTCCCC -----------------CCTCATTTCACCAGGCCCCCGGCTTGGGGCGCCTTCCTTCCCC -----------------------------------------------------------GCAGTCTCTAGGAGATCCCTCGTTTTCCTAGGCCCCCGGCTCGGGGTGCCTTCCTTCCCC -----------GTGAGCCGTCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTCGGGGTGCCCACCTTCCCC ------------------------------------------------------------
56 43
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGAT ATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGAT -----------------------------------------------------------ATGGCGGGACACCTCGCTTCTGACTTCGCCTTCTCGCCCCCGCCGGGCGGTGGAGGCGAT ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTCCTCACCCCCACCAGG---TGGGGGTGAT ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTTCTCACCCCCACCTGG---TGGGGGTGAT
116 103
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGC GGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGC -----------------------------------------------------------GGGCCGGGAGGGCCAGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGATGAGCTTCCAAGGG GGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGATTCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAAGGG GGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGACCCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAGGGG
176 163
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
CCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATT CCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATT -----------------------------------------------------------CCTCCCGGTGGGTCGGGGATCGGGCCGGGGGTTGTGCCTGGCGCCGAGGTGTGGGGGCTT CCTCCAGGTGGGCCTGGAATCGGACCAGG------------CTCAGAGGTATTGGGGATC CCTCCAAGTGGGCCTGGAATCGGACCAGG------------TTCAGAGGTGCTGGGGATC
236 223
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
CCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTT CCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTT -----------------------------------------------------------CCCCCGTGCCCCCCGCCCTATGACTTGTGTGGAGGGATGGCCTACTGTGCGCCGCAGGTT TCCCCATGTCCGCCCGCATACGAGTTCTGCGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTT TCCCCGTGTCCCCCAGCATACGAGTTCTGTGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTT
296 283
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGA GGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGA -----------------------------------------------------------GGAGTGGGGCCGGTGCCCCCAGGCGGCCTGGAGACCCCTCAGCCCGAGGGCGAGGCGGGA GGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTTTGCAGCCTGAGGGCCAGGCAGGA GGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTCTGCAGCCCGAGGGCCAGGCAGGA
356 343
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGT GTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGT -----------------------------------------------------------GCCGGGGTGGAGAGCAACTCCGAGGGGGCCTCCCCGGACCCCTGCGCCGCACCCGCAGGC GCACGAGTGGAAAGCAACTCAGAGGGAACCTCCTCTGAGCCCTGTGCCGACCGCCCCAAT GCACGAGTGGAGAGCAACTCGGAGGGAGCCTCCTCTGGGCCCTGTACTGCCCGCCCCAGC
416 403
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAA GCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAA -----------------------------------------------------------GCCCCGAAGCTGGACAAGGAGAAGCTGGAGCCGAACCCTGAGGAGTCCCAGGACATCAAA GCCGTGAAGTTGGAGAAGG------TGGAACCAACTCCCGAGGAGTCCCAGGACATGAAA GCCGTGAAGTTGGAGAAGG------TGGAACCTAGTCCCGAGGAGTCCCAGGATATGAAA
476 463
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTG GCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTG -----------------------------------------------------------GCTCTTCAGAAAGACCTTGAACAATTTGCCAAGCTCCTAAAGCAGAAGAGGATCACACTA GCCCTGCAGAAGGAGCTAGAACAGTTTGCCAAGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCACCTTG GCCCTGCAGAAGGAGCTAGAGCAGTTTGCCAAGCTGCTGAAACAGAAGAGGATCACCTTG
536 523
100
300 49
360 106 57
420 166 117
480 214 165
540 274 225
600 334 285
660 394 345
720 448 399
780 508 459
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGC GGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGC -----------------------------------------------------------GGATATACCCAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC GGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC GGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGC
596 583
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
CAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTG CAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTG ---------------------------------------------------------CTG CAAACGACTATCTGCCGTTTTGAGGCTTTGCAGCTCAGTTTCAAGAACATGTGTAAGCTG CAGACCACCATCTGTCGCTTCGAGGCCTTGCAGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTG CAGACAACCATCTGCCGCTTCGAGGCCCTGCAGCTCAGCCTTAAGAACATGTGTAAGCTG ***
656 643 3 900 628 579
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
CGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATA CGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATA CGGCCCCTGCTGCAGAAATGGGTGGAGGAGGCCGACAACAACGAGAACCTTCAGGAGATT CGGCCCCTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAATCTGCAGGAGATA CGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCCGACAACAATGAGAACCTTCAGGAGATA CGGCCCCTGCTGGAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAACGAGAACCTTCAGGAGATA ****** ***** **** *********** ** ******** ** ** ** ********
716 703 63 960 688 639
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
TGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGA TGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGA TGCAAAGCGGAGACCCTCGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACGAGTATTGAGAACCGA TGCAAGGCAGAGACCCTTGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGGACGAGTATCGAGAACCGA TGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGAACTAGCATTGAGAACCGT TGCAAATCGGAGACCCTGGTGCAGGCCCGGAAGAGAAAGCGGACTAGCATTGAGAACCGT ***** * ** ***** *********** *********** ** ** ** ********
776 763 123 1020 748 699
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATC GTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATC GTGAGAGGCAACTTGGAGAACATGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACGCTGCAGCAGATC GTGAGAGGCAACCTGGAGAGCATGTTCCTGCAGTGCCCGAAGCCCACCCTGCAGCAAATT GTGAGGTGGAGTCTGGAGACCATGTTTCTGAAGTGCCCGAAGCCCTCCCTACAGCAGATC GTGAGGTGGAACCTGGAGAACATGTTTCTGCAGTGCCCGAAGCCCTCCCTGCAGCAGATC ***** * * ****** **** *** ********** *** * ** ***** **
836 823 183 1080 808 759
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
AGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAAC AGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAAC AGCCACATCGCCCAGCAGCTGGGGCTCGAGAAAGACGTGGTCCGTGTGTGGTTCTGTAAC AGCCACATCGCCCAGCAGCTCGGGCTGGAGAAAGACGTGGTCCGAGTGTGGTTTTGCAAC ACTCACATCGCCAATCAGCTTGGGCTAGAGAAGGATGTGGTTCGAGTATGGTTCTGTAAC ACTAGCATTGCCAAGCAGCTTGGGCTGGAGAGGGATGTGGTTCGAGTGTGGTTCTGTAAC * *** *** * ***** ***** **** ** ***** ** ** ***** ** ***
896 883 243 1140 868 819
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
CGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCT CGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGTGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCT CGGCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTGTTCCCAACGAGAGGATTTTGAGGCC CGTCGCCAGAAGGGCAAACGATCAAGCAGTGACTACTCCCAACGTGAGGATTTTGAGGCT CGGCGCCAGAAGGGCAAAAGATCAAGTATTGAGTATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCT CGGCGCCAGAAGGGGAAAAGATCGAGCATTGAATATTCCCAACGAGAAGAGTATGAGGCC ** *********** ** **** ** * ** * * ***** ** ** * ******
956 943 303 1200 928 879
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTT GCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTT ACCGGCTCTCCCTTCGCAGGGGGGCCTATGTCTTTTCCTCTGGCACCNGGGCCCCATTTC GCTGGGTCTCCTTTCACAGGGGGACCCGTATCCTCTCCTCTGGCGCCAGGGCCCCATTTT ACAGG-ACACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTATCCTTTCCTCTGCCCCCAGGTCCCCACTTT GCGGGGAAACCTTTCCCAGGGGGGGCTGTGTCCTTTCCTCTGCCCCCAGGCCCCCACTTT * ** ** *** ******* * * ** * ******* * ** ** ***** **
1016 1003 363 1260 987 939
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCT GGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCT GGTACCCCAGGCTATGGCAGCC-------------------------------------GGTACCCCAGGCTACGGGGGGCCTCACTTCACTACTCTGTACTCTTCGGTCCCATTCCCT GGCACCCCAGGCTATGGAAGCCCCCACTTCACCACACTCTACT---CAGTCCCTTTTCCT GGTGCTCCAGGCTATGGGAGCCCCCATTTCACCACACTCTACT---CGGTCCCTTTTCCT ** * ******** ** * *
1076 1063 385 1320 1044 996
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCCGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC GAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCCGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC -----------------------------------------------------------GAGGGTGAGGTCTTTCCCTCGGTGTCTGTCACCGCTCTGGGCTCCCCTATGCATGCAAAC GAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCCGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC GAGGGCGAGGCCTTTCCCTCTGTTCCTGTCACTGCTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAAC
1136 1123
101
840 568 519
1380 1104 1056
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
TGAGGTGCCTGCCC-TTCTAGGAATGGGGGACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGGGAAAGAA TGAGGTGCCTGCCC-TTCTAGGAATGGGGGACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGGGAAAGAA -----------------------------------------------------------TGAGGTGCCTGATCACCCCAGGAATAGGGGGCAGAGGAAGGGGAG-AGCTAGGGAGAGAA TGAGGCACCAGCCCTCCCTGGGGATGCTGTG-AGCCAAGGCAAGGGAGGTAGACAAGAGA TGA---------------------------------------------------------
1195 1182
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTTTTGGGATTAAGTTCTTCATTCACTAAGGAAGGAATT AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTTTTGGGATTAAGTTCTTCATTCACTAAGGAAGGAATT -----------------------------------------------------------C-CCTGGGGTTTGTACCAGG-CCTTTGGGATTAAGTTTTTCATTCACTAAGAAAGGAATT ACCTGGAGCTTTGGGGTTAAATTCTTTTACTGAGGAGGGATTAAAAGCACAACAGGGGTG ------------------------------------------------------------
1255 1242
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
GGGAACACAAAGGGTGG-GGGCAGGGGAGTTTGGGGCAACTGGTTGGAGGGAAGGTGAAG GGGAACACAAAGGGTGG-GGGCAGGGGAGTTTGGGGCAACTGGTTGGAGGGAAGGTGAAG -----------------------------------------------------------GGGAACACAATGGGTGTTGGGGCAGGGAGTTTGGGGAAACTGGTTGGAGGGAAGGTGAAG GGGGGTGGGATGGGGAAAGAAGCTCAGTGATGCTGTTGATCAGGAGCCTGGCCTGTCTG------------------------------------------------------------
1314 1301
ember csimpánz nyúl szarvasmarha egér patkány
TTCAATGATGCTCTTGATTTTAATCCC-ACATCATGTATCACTTTTTTCTTAAATAAAGA TTCAATGATGCTCTTGATTTTAATCCC-ACATCATGTATCACTTTTTTCTTAAATAAAGA -----------------------------------------------------------TTCAATGATGCTCTTGACTTTAATCCCCACATCACTCATCACTTTGTTCTTAAATAAA--TCACTCATCATTTTGTTCTTAAATAAAGACTGGACACACAGT----------------------------------------------------------------------------
1373 1360
1439 1163 1059
1497 1223
1557 1282
1615 1324
ember AGCCTGGGACACAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1417 csimpánz AGCCTGGGACACAGTAGATAGACACACTT--------------- 1389 nyúl -------------------------------------------szarvasmarha -------------------------------------------egér -------------------------------------------patkány -------------------------------------------________________________________________________________________________________
41. ábra: A feltételezett nyúl Pou5f1 gén szekvenciájának összehasonlítása. A tervezett primerek szürke kiemeléssel vannak jelölve a megfelelő szekvenciákon.
102
Összefoglalás Az emlősök egyedfejlődésének kezdetén számos kulcsfontosságú molekuláris esemény jól szervezetten megy végbe a preimplantációs embrióban, többek között az embrionális genom aktiváció és az első sejt differenciálódás. A háttérben a két ivarsejt genetikai információja és annak leolvasása, epigenetikai szabályozása, mint a DNS metiláció, a genomi imprinting, vagy a kromatin szerkezet átrendeződése és a hiszton fehérjék módosításai állnak, melyek a génexpresszió szabályozásán keresztül alakítják ki az embriók fejlődési programját. A modern embrió technológiai módszerek során a megtermékenyítés és természetes folyamatok helyett mesterséges beavatkozással sikerül beindítani az embrió fejlődését és a genom epigenetikai újraprogramozódását. Ezek a folyamatok és betegségekben megnyilvánuló zavaruk feltárhatók lesznek, valamint az embriológiai módszerek alacsony hatékonysága is javítható lesz a normális és a különböző módon előállított emlősállatokban való tanulmányozásukkal, melyek összességében a mai modern biotechnológiai kutatásokat is szolgálják. Az értekezésben leírt kutatások eredményeként sikerült kifejleszteni és jellemezni egy olyan érzékeny, real-time RT-PCR-en alapuló mennyiségi génexpressziós módszert, mely alkalmas egyedi embriókból és sejtekből egyszerre 10-15 gén mRNS szintjének meghatározására is (Gal és mtsai. 2006. Reprod Fertil Dev. 18(3): 365-371.). A protokoll segítségével többféle alkalmazásban vizsgáltam az embrió technológiai módszerek hatását és a preimplantációs egyedfejlődésben részt vevő gének szerepét. Feltehetőleg a korai elköteleződés jeleit tudtam kimutatni négy- és nyolcsejtes egér embriók blasztomer sejtjeiben (Baji Gál és mtsai. 2005. Állattenyésztés és Takarmányozás 54(3): 285-292.). Az egér embriók szilárd felületen és műszalmában történő mélyhűtése során sikerült visszavezetni az életképességbeli és hatékonyságbeli eltéréseket különböző stressz gének expressziós változásaira (Boonkusol és mtsai. 2006. Mol Reprod Dev. 73(6): 700-708.). Meghatároztam az in vivo, in vitro tenyésztett és parthenogenetikusan aktivált különböző stádiumú egér és nyúl embriókban is a stabilan expresszáló háztartási géneket, melyek a későbbiekben alkalmasak referenciának a génexpressziós vizsgálatok során. Az egér esetén ezek: H2afz, Hprt1 és Ppia (Mamo és mtsai. 2007. BMC Dev Biol. 7(1): 14). A nyúl esetében: H2afz, Hprt1 és Ywhaz (Mamo és mtsai. 2008. BMC Mol Biol. benyújtva). A nyúlban először mutattam ki a Pou5f1 (Oct-4) transzkripciós faktor jelenlétét a preimplantációs egyedfejlődés során (Kiss és mtsai. 2008. Mol Reprod Dev. benyújtva). Összehasonlítottam az egér és szarvasmarha embriókban több korai egyedfejlődésben szerepet játszó gén expresszióját. A fajok között talált különbségek jelentős eltérésekre vezethetnek vissza a molekuláris szintű újraprogramozódás és az embrionális genom aktiváció folyamataiban is. Átfogó kísérletben vizsgáltam a hiszton acetilációs mechanizmus szabályozását, melyben több hiszton acetil-transzferáz és a hiszton-deacetiláz együttes jelenlétét mutattam ki az egér embriókban. 103
Summary During mammalian embryo preimplantation development, a number of key molecular events take place, including the embryonic genome activation and the first cell differentiation among others. The genetic information of the two gametes and their epigenetic regulation like DNA methylation, genomic imprinting, chromatin remodeling and histone modifications stand behind them which together control embryonic developmental program through gene expression. Currently, the new modern embryo technologies can substitute natural fertilization and these artificial interventions can induce embryo development and epigenetic reprogramming of the genome. Therefore, study of these embryos will bring new knowledge about the molecular processes, underlying causes of developmental disorders and will help to improve the biotechnological procedures. The new scientific results described in this thesis work are summarized below. I successfully worked out a full sensitive real-time RT-PCR protocol for studying gene expression quantitatively which makes it suitable to determine mRNA level of 10-15 genes simultaneously even from single cells and embryos (Gal et al. 2006 Reprod Fertil Dev. 18(3): 365-371.). With its application I measured effects of the embryo technologies and selected genes expressed during preimplantation development. I could presumably measure a very early sign of cell fate determination in blastomere cells of 4-cell and 8-cell stage mouse embryos (Baji Gal et al. 2005 (Hungarian Journal of) Animal Production 54(3): 285-292.). Comparison of solid surface vitrification and in-straw vitrification revealed direct correlation between expression of the studied genes, and morphological alterations and survival rates of the mouse embryos (Boonkusol et al. 2006 Mol Reprod Dev. 73(6): 700-708.). I determined the most stable housekeeping genes in in vivo, in vitro cultured and parthenogenetically activated mouse and rabbit embryos that are suitable for further gene expression studies. For mouse, I selected H2afz, Hprt1 and Ppia genes (Mamo et al. 2007 BMC Dev Biol. 7(1): 14). For rabbit, I selected H2afz, Hprt1 and Ywhaz genes (Mamo et al. 2008 BMC Mol Biol. submitted). Moreover, I also identified and detected successfully the transcription factor Pou5f1 (Oct-4) during rabbit preimplantation development (Kiss et al. 2008 Mol Reprod Dev. submitted). I compared bovine and mouse gene expression changes through preimplantation development, and the species-specific differences identified might point out differences in molecular processes of reprogramming and embryonic genome activation. I studied extensively the regulation of histone acetilation mechanism and detected several histone deacetylases and acetyltransferases simultaneously in mouse preimplantation stage embryos. 104
