Elektromigrační metody
Princip •metoda využívaná k separaci makromolekul na základě náboje, konformace nebo velikosti •migrace nabité částice v elektrickém poli je úměrná jejímu celkovému náboji, velikosti a tvaru frikční koeficient
v = q.E / f
rychlost celkový náboj
(popisuje tvar a velikost molekuly)
intenzita el. pole + +
pI > pH pI < pH
kladný náboj záporný náboj
+
•malé částice s velkým nábojem – velká pohyblivost •velké částice s malým nábojem – malá pohyblivost •volná elektroforesa •zónová elektroforesa •rovnovážná elektroforesa – isoelektrická fokusace •kapilární elektroforesa
+
+
-+ + -
-
Volná elektroforesa pufr •vložením elektrod do pufru se molekuly proteinů začnou pohybovat k elektrodám s opačnou polaritou a rozdělí se na základě rozdílných nábojů a koeficientů tření – vzniknou pohyblivá rozhraní mezi jednotlivými druhy proteinů •nevýhody: konvekční míchání zón, mnoho vzorku, složitá aparatura vzorek
Zónová elektroforesa elektroforesa na nosiči nosiče: •filtrační papír – celulosa •agarosa •polyakrylamid
omezení konvenčního míchání lepší rozdělení menší spotřeba vzorku
elektroforéza na celulóze •pohyb iontu v rozhodující míře závislý na poměru náboje k velikosti částice elektroforéza v gelu •porózní gely umožňují separaci na principu molekulového síta a zároveň elektroforetické pohyblivosti •provedení •v trubičkách •plošná •vertikální •horizontální
Aparatury pro trubičkové gely
Gely AGAROSA •polysacharid z červených mořských řas •extrémně jednoduchá příprava •pory větší než 10 nm •teplota tání 35°C - 95°C – „low melting“ agarosa (teplota tání ~ 65°C) •velikost pórů: 150 nm – 1 % gel 500 nm – 0,16 % gel •široký separační rozsah, ale relativně nízkou rozpustnost •koncentrační rozsah – 0,5 % - 4 % fragmenty DNA 100 – 50 000 bp (větší fragmenty pulsní elektroforesa – 50 000 – 1 000 000 bp)
•velmi velké proteiny a proteinové agregáty PUFR:
Tris-acetát-EDTA (TAE) nebo Tris-borát-EDTA (TBE)
NANÁŠECÍ PUFR („loading buffer“-PLB): sacharosa, glycerol, ... bromphenolová modř a xylen-cyan
Nukleové kyseliny •analysa a purifikace DNA restrikičních fragmentů •Ethidium bromid, SYBR Green citlivost 100 pg – 1 ng/proužek
% agarosa
rozsah [kb]
0,7
0,8 - 20
0,9
0,5 - 7
1,2
0,4 - 6
1,5
0,2 - 4
2,0
0,1 - 3
Pulsní gelová elektroforesa (PFG) použití: separace nukleových kyselin (20 000 až 12 000 000 bp)
Uspořádání PFG field inversion gel electrophoresis (FIGE) transverse alternating field electrophoresis (TAFE) rotating gel electrophoresis (RGE) clamped homogeneous electric field (CHEF)
FIGE
23 kb
48,5 kb
12 kb
0,5 kb
Figure 2. Increased separation of the 20-50 kb range with field inversion gel electrophoresis (FIGE). Run conditions: 230 V, 7.9 V/cm, 16 hrs., 50 msec. pulse, forward:reverse pulse ratio = 2.5:1, 1% GTG agarose, 0.5X TBE, 10 C.a) 1 kb ladder, 0.5-12 kb; b) Lambda/Hind III, 0.5-23 kb; and c) High molecular weight markers, 8.3-48.5 kb.
HSI Laboratories, Hoefer Scientific Instruments San Francisco, CA
RGE
Figure 3. Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomyces cercevisiae chromosomes (245-2190 kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, 60-120 sec. pulse ramp, 0.5X TBE, 1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 32 samples, a maximum of 72 are possible HSI Laboratories, Hoefer Scientific Instruments San Francisco, CA
Imunoelektroforesa ZÓNOVÁ ELEKTROFORESA/IMUNODIFUSE •směs antigenù je nejprve elektroforeticky rozdělena, po té je do podélného žlábku nanesena směs protilátek a provedena imunodifuse •tvorba precipitačních linií dojde-li k tvorbě komplexu Ag-Pl
ELEKTROIMUNODIFUSE - RAKETKOVÁ TECHNIKA •gel obsahuje definovanou koncentraci protilátky
POLYAKRYLAMID •chemicky inertní a mechanicky stabilní •„obtížnější“ příprava oproti agarosovému gelu T – celková koncentrace akrylamidu C – stupeň prokřížení – podíl dimeru k monomeru
a+b .100[%] V b C= .100[%] a+b
T=
a...hmotnost akryamidu [g] b…hmotnost methylenbisakrylamidu [g] V…objem [ml]
Fergusonova analýza log U T = log U 0 − K R .T
UT...relativní pohyblivost U0...volná relativní pohyblivost KR...tzv. retardační koeficient
200
log UT
K R = 2,43.10 −2 + 5,53.10 −7.M r 150
100 0
5 10 koncentrace gelu [% T]
15
Ferguson, K.A. (1964) Starch-gel electrophoresis-application to the classification of pituitary proteins and polypeptides. Metabolism 13, 985–1002
PAGE Uspořádání:
kontinuální diskontinuální
ZAOSTŘOVACÍ GEL: nižší hodnota pH, nižší koncentrace polyakrylamidu DĚLÍCÍ GEL: má vyšší hodnotu pH než rozdělovací
ELEKTRODOVÝ PUFR: Tris/Glycin/SDS
zaostřovcí gel velké póry
dělící gel malé póry
princip zaostřování
SDS-PAGE Tris/Gly/SDS •anionický detergent •po zahřátí na 100 °C rozbaluje protein a váže se na něj (1 molekula SDS na 2 AK, 1,4 g SDS na 1 g proteinu)
•velký náboj velká pohyblivost •vysoké rozlišení •dobrá fixace proužků •lze odstranit z gelu, aniž by se uvolnily proteiny •10x vyšší detekční limit než nativní elfo Nevýhody: •za nízkých teplot krystalizuje •mnoho proteinů se chová anomálně -v důsledku neuniformní vazby SDS -proteiny s velkým záporným, velkým kladným nábojem a na prolin bohaté proteiny NANÁŠECÍ PUFR („loading buffer“-PLB): SDS, glycerol, DTT, pufr, bromfenolová modř, H2O
SDS-PAGE Tris/Tricin/SDS separace proteinů < 14 kDa
lineární rozlišení 1-100 kDa
Tricin = N-Tris(hydroxymethyl) methyl glycine
SDS-PAGE Tris/Borát/EDTA elektroforesa glykoproteinů
SDS se neváže na sacharidy
CTAB-PAGE CTAB •kationický detergent •pro záporně nabité proteiny, silně bazické nukleoproteiny •nedenaturuje protein, tj. řada proteinů má i po CTAB PAGE enzymatickou aktivitu •kyselé prostředí – pH 3-5
Nativní-PAGE •i jiné pufry HEPES, MOPS, MES •zymogramy
Gradientová gelová elektroforesa
Gradientová gelová elektroforesa
Preparativní PAGE
2D-PAGE
Gradientová gelová elektroforesa
Gradientová gelová elektroforesa
Preparativní PAGE
2D-PAGE
PAGE Nukleových kyselin sekvenování poslední krok sekvenace TBE pufr teplota > 50°C, přítomnost močoviny
manuální sekvenování – radioaktivní značení 32P - chromogenní nebo chemiluminiscenční detekce na membráně pomocí značené proby - barvení gelu stříbrem
08_dideoxy_sequencing.swf
automatizované sekvenování 4 rozdílné fluorescenční značky 1 fluorescenční značka - fluorescein
PAGE nukleových kyselin fragmentů DNA % akrylamid
rozsah [bp]
3,5
100 -1000
5,0
80 -500
8,0
60 - 400
12,0
40 - 200
20,0
10 - 100
ARDRA – restrikční analysa amplifikované rDNA rozdělení po restrikčním štěpení
specifický obraz
Figure 1. Restriction patterns obtained after restriction digestion with CfoI, AluI, MboI, RsaI and MspI for amplified 16S rDNA of different Acinetobacter species
DNA „fingerprinting“ RFLP „restriction fragment lenth polymorphism“
DNA „fingerprinting“ Analýza VNTR pomocí PCR (highly variable repeat sequences)
Variable Number of Tandem Repeat (VNTR) loci – regiony na chromosomalní DNA, na kterých se různěkrát opakuje krátký motif jako je GC nebo AGCT
RAPD – náhodně amplifikovaná polymorfní DNA •rychlá detekce polymorfismu širokého spektra organismů •2 krátké primery, nízká teplota amplifikace sady různých DNA fragmentů o různé velikosti
RAPD různých variet kvasinek
Silver-stained polyacrylamide gel showing three distinct RAPD profiles generated by primer OPE15 for Haemophilus ducreyi isolates from Tanzania, Senegal, Thailand, Europe, and North America.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/probe/doc/TechRAPD.shtml
DGGE –ELEKTROFORESA S GRADIENTEM DENATURUJÍCÍHO ČINIDLA detekce jednobodové mutace rozdílná elektroforetické pohyblivost částečně denaturovaných molekul (6 M močovina + 20-40 % formamid)
TGGE –ELEKTROFORESA S TEPLOTNÍM GRADIENTEM teplotní gradient (katoda – 15 °C, anoda 70 °C)
PCR Amplification Mixed Population of DNA
G+C-Tailed Product
PCR Primers
Separate on Denaturing Gradient Gel
+ G+C-Rich “Clamp”
16S rRNA Gene
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis A
B
C
D Increasing Denaturant
Negative image of an ethidium bromide stained DGGE gel loaded with 16S rRNA coding gene
http://en.wikipedia.org/wiki/Temperature_gradient_gel_electrophoresis
Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID fluorescenční barva – interkalační činidlo •do gelu •do pufru •barvení po elfu
SYBR GREEN
Barvení proteinů Coommassie Brilliant Blue
Coomassie Blue x barvení stříbrem
Porovnání identických gelů po barvení Coomassie Blue (dráhy 1–3) a po barvení stříbrem (dráhy 4–6). [B. S. Dunbar, ‘‘Two-Dimensional Electrophoresis and Immunological Techniques’’, Plenum Press, New York,1987.]
DIGE – DIFERENČNÍ GELOVÁ ELEKTROFORESA Cy2
excitace 488 nm emise 520 nm
Cy3
excitace 532 nm emise 580 nm
Cy5
excitace 633 nm emise 670 nm
Barva
Amax (nm)
Použití
Amidočerň10B
620
barvení proteinů
Coomassie Brilliant Blue R-250
590
barvení proteinů, 10 x citlivější než amidočerň
Coomassie Brilliant Blue G-250
595
barvení proteinů
Alcian Blue
630
Glykoproteiny
Methylene Blue
665
RNA, RNase
Methyl Green
635
Nativní DNA, neutrální nebo kyselá dělící barva
Fast Green FCF
610
barvení proteinů
Basic Fuschin
550
Glykoproteiny, nukleové kys., glykoproteiny bohaté na sialovou kys.
Pyronin Y
510
RNA, kyselá dělící barva
Bromocresol Green
dělící barva pro DNA agarosovou elfo
Bromophenol Blue
595
neutrání nebo alkalická dělící barva
Crocein Scarlet
505
Immunoelektroforesa
Ethidium Bromide Toluidine Blue O
Fluorometrická detekce DNA 620
RNA, RNase, mukopolysacharidy
Isotachoforesa •migrace všech iontů stejnou rychlostí •separace složek jako „iontového vlaku“ •zonový zaostřovací efekt diskontinuální systém – vedoucí a terminační elektrolyt
migrace všech iontů stejnou rychlostí
separace složek jako „iontového vlaku“
zonový zaostřovací efekt
Isoelektrická fokusace •agarosa nebo polyakrylamid •konstantní teplota - pKa je závislé na teplotě – 10°C •volné nosiče gradientu pH – pomocí ampholytů •imobilisovaný gradient pH – lineární gradient dvou různých polymerizačních směsí –deriváty akrylamidu
Blotování - přenos •difusní přenos •kapilární přenos •přenos vakuem •elektropřenos
Membrány •nitrocelulosa - nejběžnější •polyviniliden difluorid – vysoká vazebná kapacita •nylon – nukleové kyseliny •diazobenzyloxymethyl – chemická aktivace •ionexové membrány - preparativní •aktivovaná skleněná vlákna – pro přímou sekvenaci
Detekce HYBRIDIZACE
•radioaktivní proba – vysoká senzitivita, Southern blot •neradioaktivní proba – biotin – streptavidin, dioxigenin
REAKCE SE SUBSTRÁTEM nativní enzym, nedifundující substrát “IMUNOBLOTTING“
125I-protein
A enzymem značená sekundární protilátka – konjugace s peroxidasou (tetrazoliová sůl), alkalickou fosfatasou zlatem značená sekundární protilátka (100 pg) chemiluminiscence – nejcitlivější
Kapilární elektroforesa Probrané elektromigrační metody mají tři hlavní nedostatky: • značná produkce Jouleova tepla během elektroforesy, hodnota vloženého napětí je tím limitována, použití nižšího napětí - odtud časová náročnost • detekce - nutné barvení po elektroforese • je obtížné automatizovat
kapilární elektroforesa (CE) metoda byla vyvíjena od počátku 80. let (Jorgensen a Lukacs), první komerční přístroj se objevil v roce 1988
Způsoby provedení kapilární elektroforesy •kapilární zonální elektroforesa •micelární elektrokinetická chromatografie •kapilární gelová elektroforesa •kapilární izoelektrická fokusace •kapilární izotachoforesa
-
+ + + -- + + + + + + + + + - + + - - + + + + + -
stacionární vrstva (Sternova)
mobilní vrstva (Guy-Chapmanova)
princip: pohyb podle velikosti náboje + elektroosmotický tok Lineární elektroforetická rychlost
U ve = µe .E = µe . L N=
νe
µe E U L D
L2 t = L / ve = µe .U
µe .U 2D
... rychlost toku …elektroforetická pohyblivost ... intenzita elektrického pole ... napětí ... délka kapiláry …difusní koeficient analytu
Elektroosmotický tok
ζ =
4.π .η .µ EOF
µEOF ζ
ε η r
vEOF = µ EOF .E =
ε
ε .ζ .E 4.π .η
... elektroosmotická pohyblivost ... zeta potenciál ... dielektrická konstanta ... viskosita elektrolytu ... poloměr kapiláry
Celková rychlost pohybu analytu µ= µe + µEOF
U v = (µ e + µ EOF ).E = (µ e + µ EOF ). L
N=
t = L/v =
(µe + µ EOF ).U 2D
L2
(µe + µ EOF ).U
Kapilární zonální elektroforesa
CE Czech.swf
Kapilára
polyimidový povlak
•tavený křemen •ochranný polyimidový povlak •délka 25 – 100 cm •vnitřní průměr 25 – 100 µm •vnitřní povrch lze modifikovat tavený křemen
Detekce •UV/Vis absorpce •fluorescence •radiometrie •MS
Kapilární gelová elektroforesa
•na základě velikosti – polymerní síta (agarosa, bis-polyakrylamid, methylcelulosa) •kapilára je naplněna gelem - zvyšuje rozdíly mezi elektroforetickými rychlostmi velkých iontů různých tvarů, které jsou nuceny migrovat póry gelu •nevzniká elektroosmotický tok - lze dělit pouze jeden druh iontů •používá se pro velké ionty jako peptidy, bílkoviny, sacharidy, štěpy DNA a RNA
Dodnes však nenahradila klasickou gelovou vertikální a horizontální elfo. Výhody: - vysoká rychlost průchodu vzorku - přímá kvantifikace -možnost automatizace Nevýhody: -drahé přístrojové vybavení Pro sekvencování DNA se na přístroji Applied Biosystems 3730 DNA analyzer paralelně používá 96 kapilár, to umožňuje až 1000 analýz za 24 hodin. PAA gely pro proteiny, PAA a agarosové gely pro nukleové kyseliny. Modifikace při přípravě gelů (lineárně polymerovaný PAA), možnost použití řidších gelů oproti konvenčním.
Micelární elektrokinetická chromatografie •dělení elektroneutrálních látek (hydrofobní a hydrofilní) na základě rozdílných rozdělovacích koeficientů mezi vodní a micelární fází •povrchově aktivní látka přidána do pufru (detergent, např. SDS, deoxycholát sodný, CTAB) •koncentrace detergentu musí být větší než je kritická micelární koncentrace (CMC). •povrchově nabité micely migrují uvnitř pufru vlastní elektroforetickou rychlostí a unáší molekuly a ionty separovaných sloučenin, které jsou více či méně přítomny uvnitř hydrofobních dutin micel •stupeň solvatace molekul micelami udává rychlost unášení těchto molekul micelami
+
-
Kapilární isoelektrická fokusace •dělí molekuly mající amfolytickou povahu na základě jejich rozdílných isoelektrických bodů pI •dělící kapilára se naplní roztokem dělených amfolytických látek a pomocného amfolytu, který je schopen pufrovat celý rozsah pH •z opačných konců migrují do kapiláry OH- a H+ ionty, které v ní vytvářejí spojitý lineární pH gradient •dělené molekuly (ionty) putují roztokem dokud nedosáhnou pH, které se rovná jejich pI vytvoří úzkou zónu (fokusují) •po fokusaci se zóny mobilizují (uvedou do pohybu), aby prošly detektorem a byly detekovány •kapilární izoelektrické fokusování je použitelné pouze pro amfolytické molekuly
Kapilární izotachoforesa •dělí ionty na základě jejich rozdílných elektroforetických mobilit •roztok dělených iontů je dávkován jako rozhraní dvou rozdílných pufrů – vedoucí, terminační iont •každý separovaný iont vytváří během analýzy svoji vlastní zónu •zóny všech dělených iontů jsou uzavřeny mezi vedoucí a terminační pufr a jsou seřazeny bezprostředně za sebou podle klesající elektroforetické pohyblivosti dělených iontů •kapilární izotachoforéza je použitelná pouze pro molekuly s nábojem •během jednoho experimentu lze dělit a detekovat pouze jeden druh iontů
Aplikace • Analysa cukrů • Analysa anorganických iontů • DNA profil • Identifikace proteinů
• výhody • • • •
rychlost málo vzorku relativně levný automatizované
• nevýhody • nelze identifikovat neutrální látky • nelze rozlišit tvar
Při CE lze měnit několik parametrů pro lepší separaci. Optimální hodnoty jsou ale vždy důsledkem kompromisu. Př. Zmenšení průměru kapiláry umožňuje použití vyššího napětí (lepší odvod tepla). Zvýší se rozlišení a sníží doba analýzy. Snížením průměru se ale sníží tloušťka optické dráhy detektoru, tím poklesne citlivost detekce. Prodloužení kapiláry umožňuje opět použití vyššího napětí, avšak prodlouží se doba analýzy, vyšší difuze. Důležitá je volba vhodného pufru. S rostoucí iontovou silou roste vodivost, ale i produkce tepla.
