Dr. E. Vandermarliere wil ik bedanken voor het controleren van de context en opmaak

Immunohistochemische benadering van borstkankerstamcellen.

Woord vooraf Naar aanleiding van de module ‘MLT_08 Eindwerk’ heb ik dit eindwerk geschreven met als titel ‘Immunohistochemische benadering van borstkankerstamcellen’. Het was een zeer boeiende maar ook zeer intensieve zoektocht waarvoor zeker meerdere personen bedankt moeten worden. Als eerste wil ik alle MLT’ers van het N. Goormaghtigh Instituut voor Pathologische Anatomie bedanken. Zij moesten naast hun dagdagelijks werk, tijd maken om mijn soms lastige vragen te beantwoorden. Ook wil ik professor M. Praet en professor P. Pauwels bedanken om mij toe te laten op de dienst pathologische anatomie. Graag zou ik Dr. K. Lambein bedanken, het was een lange weg voor ons beiden met tegenslagen maar ook veel successen. Ik wil haar ook bedanken voor alle tijd die nog na mijn onderzoekstage in het project werd gestopt en voor het verbeteren van vele fouten. Mijn stagebegeleidster Dr. Sc. N. Kellner bedank ik met veel plezier. Haar peptalkjes tijdens de stagebezoeken waren belangrijk voor mij alsook de tijd die ze nam om de vele vragen te beantwoorden en voor het corrigeren van fouten in mijn eindwerk. Dr. E. Vandermarliere wil ik bedanken voor het controleren van de context en opmaak. Als laatste wil ik mijn ouders bedanken voor de vele steun tijdens mijn studies en ook voor het financieren van de voorbije drie jaren. Zonder hen was dit niet mogelijk. Dit eindwerk is het resultaat geworden van veel overuurtjes en toch ook wat bloed, zweet en tranen. Niet enkel het schrijven van de literatuurstudie maar ook de onderzoekstage liet mij meer en meer ontpoppen. Beste lezer ik hoop dat ik U wat meer kennis kan geven over het meer en meer besproken thema kankerstamcellen.

1


Samenvatting De kankerstamcelhypothese is een hypothese waar momenteel op experimenteel vlak weinig over gekend is. De meeste bewijzen zijn dan ook afkomstig uit dierenproeven en cellijnen. Er is dus nood aan bewijzen op histologisch vlak. In de literatuurstudie wordt de volledige theorie rond de kankerstamcelhypothese beschreven.

Het hoofdstuk 2.1 handelt over de stamcellen, daarin wordt de definitie

stamcel verklaart. Hoofdstuk 2.2 is het belangrijkste gedeelte dat handelt over de kankerstamcelhypothese. Hierin wordt de evolutie van de kankermodellen en de bijhorende dierenproeven besproken.

Het hoofdstuk 2.3 handelt over borstkankerstamcellen. Het doel van dit

eindwerk is deze cellen immunohistochemisch aan te tonen. In dit gedeelte van de literatuurstudie

wordt

het

experimenteel

bewijs

van

het

bestaan

van

borstkankerstamcellen uitgebreid besproken. In de daaropvolgende hoofdstukken worden de merkers ALDH, CD24, CD44, CD133 en Oct4, die gebruikt worden tijdens het experimentele gedeelte van het eindwerk, besproken. Het laatste hoofdstuk van de literatuurstudie handelt over de gebruikte immunohistochemische methode. Het experimentele gedeelte van dit eindwerk wordt ingedeeld in twee stukken; het op punt stellen van de merkers en het scoren van patiëntenweefsel na aankleuring. Deze indeling loopt ook door in het gedeelte resultaten. Als besluit kan gesteld worden dat het nog vroeg is om te concluderen dat borstkankerstamcellen immunohistochemisch aantoonbaar zijn in borsttumoren. Hiervoor is er meer onderzoek nodig. Wel kan er besloten worden dat de kleuring van de merkers ALDH, CD24 en CD44 op punt staat en verder kan gebruikt worden. Uit de scores kan er afgeleid worden in welke richting er meer onderzoek moet uitgevoerd worden. Een voorbeeld hiervan is het uitbreiden van de reeks borsttumoren die de tripel negatief zijn.

2


Lijst met afkortingen en symbolen ABC

Avidine-biotinecomplex

AC133

Antilichaam gericht tegen CD133

Al

Antilichaam

ALDH

Aldehyde dehydrogenase

AML

Acute myeloïde leukemie

CD

‘Cluster of differentiation’, differentiatiecluster

CXCR4

CXC chemokine receptor of fusine, deze receptor bindt stromal derived factor

CSC

Kankerstamcellen

DAB

Diaminobenzidine

DCIS

Ductaal carcinoma in situ

DNA

Desoxyribonucleïnezuur

ESA

Epitheel specifiek antigeen

GPI

‘Glycosylphosphatidylinositol’, glycosylfosfatidylinositol

Her2

Humaan epidermale groeifactor receptor 2

HRP

‘Horse radish peroxidase’, mierikswortelperoxidase

I

Intensiteit

Lin

Lineage

mRNA

Messenger ribonucleïnezuur

NOD/SCID

‘Non obese diabetic/severe combined immunodefiency’

RAM

‘Rabbit anti mouse’, konijn anti muis

U

Uitgebreidheid

WWB

Warmwaterbad

3


Verklarende woordenlijst Apoptose

Geprogrammeerde celdood

Autoloog

Op zichzelf betrekking hebbend

Blastocyst

De fase in de ontwikkeling van het embryo waar een holte gevormd word met daar rond het blastoderm

Caco-2

Deze onsterfelijk gemaakte cellijn bestaat uit humane epitheliale colorectale adenocarcinoom cellen

Carcinogenen

Kankerverwekkende stoffen

E-selectine

Een celadhesiemolecule dat enkel op endotheliale cellen voorkomt die geactiveerd werden door cytokines

HeLa

Een

onsterfelijk

gemaakte

cellijn

bestaand

uit

cervixcarcinoomcellen afkomstig van Henrietta Lacks Hoechst 33342

Een kleuring van DNA op basis van fluorescentie die gebruikt kan worden in de fluorescentie microscopie en ook voor fluorescent geactiveerde celsortering

Klonogeen

In staat zijn om meerdere klonen van zichzelf te produceren

Matrix metalloproteïnases

Een groep enzymen die in staat zijn om extracellulaire matrix-proteïnen af te breken

Osteopontine

Een extracellulair structureel proteïne van het bot en andere weefsels. In het bot is het een belangrijke factor bij bothervorming

POU-familie

Een familie van transcriptiefactoren die gerelateerd zijn met de ontwikkeling van het organisme. De famillie bevat het hypofyse specifieke Pit-1, de octameer transcriptiefactoren en het neurale Unc-86 transcriptiefactor

P-selectine

Een

celadhesiemolecule

aanwezig

op

geactiveerde

endotheliale cellen en bloedplaatjes Tumorigeen

Tumorinitiërend 4


Lijst van tabellen en figuren Figuren Figuur 2-1: Drie genklassen die een doorslaggevende rol spelen in de beginfase van het kankerproces

12

Figuur 2-2: Schematische weergave van het stochastische en kankerstamcelmodel

14

Figuur 2-3: Weergave van de normale hematopoiese en acute myeloïde leukemie

16

Figuur 2-4: Mogelijke theorieën rond de oorsprong van kankerstamcellen

17

Figuur 2-5: Vergelijking van de celcyclus tussen tumorigene en niet tumorigene borstkankercellen

19

Figuur 2-6: Principe ABC methode

26

Figuur 3-1: NexES® IHC Ventana

29

Figuur 4-1: Membranaire kleuring CD44 in een borsttumor

36

Figuur 4-2: Membranaire kleuring CD24 borstumor

37

Figuur 4-3: Cytoplasmatische kleuring ALDH in een levermetastase van borstkanker

39

Figuur 4-4: Kernkleuring Oct4 in levermetastase van borstkanker

40

Tabellen Tabel 2-1: Tumorontwikkeling in NOD/SCID muizen na injectie met kankercellen ......... 18 Tabel 3-1: Merker met bijhorende positieve controle....................................................... 27 Tabel 4-1: Score patiëntencoupes .................................................................................. 41

5


Inhoudsopgave Woord vooraf .................................................................................................................. 1 Samenvatting .................................................................................................................. 2 Lijst met afkortingen en symbolen ................................................................................ 3 Verklarende woordenlijst ............................................................................................... 4 Lijst van tabellen en figuren........................................................................................... 5 Inhoudsopgave ............................................................................................................... 6 1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling ................................................. 9

2

Literatuurstudie ............................................................................................... 11

2.1

Stamcellen ........................................................................................................ 11

2.2

Kankerstamcellen.............................................................................................. 12

2.2.1

Het ontstaan van kanker ................................................................................... 12

2.2.2

Klassieke hypothese versus alternatieve hypothesen........................................ 13

2.2.3

Het stochastisch tumormodel ............................................................................ 13

2.2.4

Het hiërarchisch tumormodel of de kankerstamcelhypothese............................ 13

2.2.5

Het eerste experimenteel bewijs van het bestaan van kankerstamcellen .......... 15

2.2.6

Beperkingen bij de kankerstamcelhypothese..................................................... 16

2.3

Borstkankerstamcellen ...................................................................................... 17

2.3.1

Ontdekking van CSC in borsttumoren ............................................................... 17

2.3.2

Borsttumoren, hiërachisch of stochastisch model.............................................. 18

2.4

CD44................................................................................................................. 20

2.4.1

Normale functie ................................................................................................. 20

2.4.2

De rol van CD44 in de kankerontwikkeling ........................................................ 20

2.4.3

De functie van CD44 in borstkanker .................................................................. 20

2.5

CD24................................................................................................................. 21

2.5.1

Normale functie ................................................................................................. 21

2.5.2

De rol van CD24 in de kankerontwikkeling ........................................................ 21

2.5.3

De functie van CD24 in borstkanker .................................................................. 21

2.6

CD133............................................................................................................... 22 6


2.6.1

Normale functie ................................................................................................. 22

2.6.2

De rol van CD133 in de kankerontwikkeling ...................................................... 22

2.7

Oct4 .................................................................................................................. 23

2.7.1

Normale functie van Oct4.................................................................................. 23

2.7.2

Rol van Oct4 in de kankerontwikkeling.............................................................. 23

2.8

ALDH ................................................................................................................ 23

2.8.1

Normale functie ................................................................................................. 23

2.8.2

De functie van ALDH in borstkanker.................................................................. 24

2.9

De avidine-biotinecomplex methode.................................................................. 25

3

Materiaal en methode...................................................................................... 27

3.1

Inleiding............................................................................................................. 27

3.1.1

Situering............................................................................................................ 27

3.2

Immunohistochemische verwerking van formaldehyde gefixeerde in paraffine

ingebed weefsel.............................................................................................................. 28 3.2.1

Coupes snijden ................................................................................................. 28

3.2.2

Deparaffineren en rehydrateren van het weefsel ............................................... 28

3.2.3

Antigen retrieval ................................................................................................ 28

3.2.4

Aankleuren van de antigenen............................................................................ 29

3.2.5

Dehydrateren .................................................................................................... 32

3.3

Op punt stellen van merker CD 44 .................................................................... 32

3.3.1

Reagentia.......................................................................................................... 32

3.3.2

Werkwijze.......................................................................................................... 32

3.4

Op punt stellen van merker CD24 ..................................................................... 33

3.4.1

Reagentia.......................................................................................................... 33

3.4.2

Werkwijze.......................................................................................................... 33

3.5

Op punt stellen van merker ALDH ..................................................................... 33

3.5.1

Reagentia.......................................................................................................... 33

3.5.2

Werkwijze.......................................................................................................... 33

3.6

Op punt stellen van merker CD133 ................................................................... 34

3.6.1

Reagentia.......................................................................................................... 34

3.6.2

Werkwijze.......................................................................................................... 34

3.7

Immunohistochemische kleuring van Oct4 ........................................................ 35

3.7.1

Reagentia.......................................................................................................... 35 7


3.7.2

Werkwijze.......................................................................................................... 35

4

Resultaten........................................................................................................ 36

4.1


4.1.1

Testen op adenoïden ........................................................................................ 36

4.2


4.2.1

Testen op adenoïden ........................................................................................ 37

4.2.2

Testen op tuba .................................................................................................. 37

4.3

Op punt stellen van ALDH................................................................................. 38

4.3.1

Testen op lever ................................................................................................. 38

4.4

Op punt stellen van merker CD133 ................................................................... 39

4.5

Immunohistochemische kleuring van Oct4 ........................................................ 40

4.6

Scoren van het patiënten materiaal ................................................................... 40

4.6.1

Principe............................................................................................................. 40

5

Discussie ......................................................................................................... 42

5.1

Immunohistochemische kleuringen ................................................................... 42

5.2

Scores van het patiënten materiaal ................................................................... 42

6

Conclusie......................................................................................................... 44

Literatuurlijst................................................................................................................. 45 Bijlagen.......................................................................................................................... 48 Bijlage 1 – Gebruikte materialen ..................................................................................... 48 Voor akkoord verklaring............................................................................................... 50

8

Immunohistochemische benadering van borstkankerstamcellen Literatuurstudie

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Kanker is een algemeen gekend begrip in de maatschappij. Toch zijn heel wat aspecten van het begrip kanker nog niet volledig duidelijk. In de continue zoektocht naar carcinogenen die aan de oorzaak van kanker kunnen liggen en therapieën die bepaalde vormen van kanker genezen, wordt het onderzoek naar de mogelijke oorsprong van kanker weinig bestudeerd. Dr. K. Lambein bood de kankerstamcelhypothese aan als eindwerkonderwerp. Een hypothese die sinds enkele jaren terug aan interesse wint. Het doel is om een immunohistochemische benadering van borstkankerstamcellen te vinden via in de literatuur beschreven merkers. Het experimenteel gedeelte van dit eindwerk vindt plaats in het Universitair Ziekenhuis Gent, meer specifiek in het N. Goormaghtigh Instituut voor Anatomische Pathologie. Daar beschikt men over alle nodige apparatuur om experimentele immunohistochemische kleuringen uit te voeren. Het grote probleem rond de kankerstamcelhypothese is dat de bewijzen voornamelijk uit dierenexperimenten en experimenten met cellijnen worden verkregen. Indien deze hypothese immunohistochemisch wordt bewezen op humaan tumorweefsel kan dit zorgen voor een belangrijke doorbraak. Het mogelijk klinisch belang van het kunnen aantonen van kankerstamcellen zette ons aan tot deze poging om borstkankerstamcellen immunohistochemisch aan te tonen. Om de kankerstamcelhypothese immunohistochemisch te ondersteunen is het belangrijk de juiste kankerstamcelmerkers te gebruiken. Daarom wordt er gekozen voor de merkers ALDH (aldehyde dehydrogenase), CD24, CD44, CD133 en Oct4. Het eerste doel is dus om deze merkers op punt te stellen voor een optimale immunohistochemische kleuring. Na de optimalisatie kan het patiëntenmateriaal gebruikt worden. De patiënten zijn vrouwen

met

een

primaire

ductale

borsttumor

die

uitgezaaid

is.

Deze

immunohistochemische kleuringen worden gescoord op de intensiteit en uitgebreidheid van de aangekleurde biomoleculen ALDH, CD24, CD44, CD133 en Oct4.

9


Met deze experimenten wordt er gezocht naar opvallende kenmerken in de scores. Het streefdoel is een verband vinden tussen patiënten onderling zodat er eventueel verder onderzoek uitgevoerd kan worden.

10


2

Literatuurstudie

2.1

Stamcellen

Stamcellen worden teruggevonden in alle meercellige organismen. In zoogdieren zijn er twee grote types; namelijk de embryonale en niet-embryonale of somatische stamcellen. Embryonale stamcellen vormen de innerlijke massa van de blastocyst. Somatische stamcellen bevinden zich in kleine hoeveelheden in vele weefsels. Er wordt gedacht dat in weefsel een stamcelniche aanwezig is waar de somatische stamcellen rusten tot er vraag is naar nieuwe cellen. Voorlopig zijn in volgende volwassen weefsels stamcellen teruggevonden: hersenen, beenmerg, perifeer bloed, aders en slagaders, skeletspieren, huid, ingewanden, tanden, hart, lever, darm, ovarieel epitheel en de testis (4). Stamcellen worden gedefinieerd als cellen die zowel een asymmetrische als een symmetrische deling ondergaan. Een symmetrische deling is een deling waardoor een dochtercel ontstaat die identiek is aan de moederstamcel en dezelfde kenmerken bevat. Dit is een voorbeeld van zelfvernieuwing. De asymmetrische deling zorgt voor een meer gedifferentieerde dochtercel: de progenitorcel. De progenitorcel kan verschillende cellijnen produceren, maar kan niet aan zelfvernieuwing doen. De delingscapaciteit van de progenitorcel is beperkt en resulteert uiteindelijk in gedifferentieerde volwassen cellen (1,2). Het is van uiterst belang dat ongecontroleerde stamcelvernieuwing en celproliferatie vermeden wordt (2). Doordat stamcellen aan weefselvernieuwing en herstel bijdragen zijn ze zeer handig in de biotechnologie en geneeskunde (3).

11


2.2

Kankerstamcellen

2.2.1

Het ontstaan van kanker

Het is algemeen geweten dat kanker ontstaat na een reeks mutaties in een cel waardoor de controle over de celdeling verloren gaat. Deze mutaties worden veroorzaakt door carcinogenen die aanwezig zijn in omgevingsfactoren zoals water, lucht en zonlicht. Ook via voedsel kunnen verschillende carcinogenen opgenomen worden. Daarnaast kunnen virussen en hormonen aan de oorzaak liggen van bepaalde kankertypes. Als laatste kunnen erfelijke factoren een rol spelen in het ontstaan van kanker. Het proces van tumorvorming is een opeenstapeling van mutaties in de proto-oncogenen en de tumorsuppressorgenen van de cel. Daarnaast kunnen ook mutaties ontstaan in de DNA-herstelgenen die in normale toestand mutaties herstellen of apoptose induceren (Figuur 2-1). Dit proces kan maanden tot jaren duren voordat er een waarneembare tumor ontstaat. Door de opeenstapeling van mutaties krijgen de tumorcellen vele selectievoordelen waardoor hun overleving, groei en uitzaaiing gegarandeerd worden (5,6,12).

Figuur 2-1: Drie genklassen die een doorslaggevende rol spelen in de beginfase van het kankerproces

12


2.2.2

Klassieke hypothese versus alternatieve hypothesen

Volgens de klassieke hypothese bestaat een tumor uit een groepje cellen die allemaal in staat zijn om uit te groeien tot een nieuwe tumor. Met andere woorden elke kankercel is klonogeen en dus verantwoordelijk voor de groei en uitzaaiing van de tumor. Rond 1960 werd er geëxperimenteerd met tumorcellen via autologe subcutane injectie van tumorcellen ter hoogte van de dij van kankerpatiënten. Slechts wanneer meer dan 106 tumorcellen geïnjecteerd werden kon een tumor groeien. Wanneer een grote hoeveelheid aan humane tumorcellen geïnjecteerd werd in een muis gaf dit een gelijkaardig resultaat. Uit deze experimenten kon besloten worden dat niet elke cel aanwezig in een tumor aan tumorregeneratie kan doen. Hierdoor werden twee mogelijke modellen opgesteld die een verklaring kunnen geven aan de resultaten van de vorige experimenten (2,11). 2.2.3

Het stochastisch tumormodel

Het stochastisch tumormodel is volgens vele wetenschappers het meest aannemelijke model; dit omdat de klassieke hypothese de basis van het tumormodel vormt. Het model stelt dat elke cel in een tumor verantwoordelijk is voor de groei van de tumor en potentieël tumorigeen is, maar het binnentreden van de celcyclus wordt bepaald door een lage toevalskans. Elke tumorcel heeft dus een tumorigeen mechanisme, maar dit mechanisme is niet constant actief (2,11,12). 2.2.4

Het hiërarchisch tumormodel of de kankerstamcelhypothese

“Elke tuinman weet uit ervaring dat wanneer men de stengel en de bladeren van een paardenbloem verwijdert, er terug een nieuwe plant ontstaat vanuit de wortel”. Deze gedachte kan men toepassen bij de kankerstamcelhypothese. Wanneer een persoon hervalt kan dit dus betekenen dat de “wortel” niet geëlimineerd werd. Dit tumormodel zou een logische verklaring vormen voor het aantal gefaalde therapieën dat niet noemenswaardig gedaald is in vergelijking met dertig jaar geleden. De kankerstamcelhypothese was het begin van de zoektocht naar experimentele bewijzen van de “wortel” in de jaren 60 (7,8).

13


Het hiërarchisch model van een maligniteit is opgebouwd zoals een abnormaal orgaan dat een

grote

populatie

gedifferentieerde

cellen

bevat

en

een

kleine

populatie

kankerstamcellen (CSC). De groep CSC zijn zelfondersteunende cellen die de mogelijkheid hebben om zichzelf te hernieuwen en zo de CSC-pool te onderhouden, maar daarnaast ook de mogelijkheid hebben om te differentiëren naar heterogene niettumorigene kankerceltypes die vaak de bulk van de tumor vormen (Figuur 2-2) (9). Een vergelijking tussen kenmerken van CSC en normale stamcellen levert meerdere gelijkenissen op. Een eerste gelijkaardig kenmerk is dat beide soorten cellen in een gering aantal voorkomen in het lichaam. Een tweede gelijkaardig kenmerk is het onregelmatig binnentreden van de celcyclus. Deze redenering zou een logische verklaring zijn voor het niet slagen van antikankertherapieën die gebaseerd zijn op het doden van snel delende cellen (7,9). Wat onrustwekkend is, is dat deze antikankertherapieën net het omgekeerde effect kunnen veroorzaken. Door de antikankertherapie worden kankerstamcellen die toch gevoelig zijn geëlimineerd en blijven de resistente kankerstamcellen over. Deze zullen zich vernieuwen en prolifereren. Dit fenomeen veroorzaakt een progressieve ziekte (3). Een derde gemeenschappelijk kenmerk is de capaciteit om te migreren. Beide cellen zijn makkelijk vervormbaar en hebben de neiging te migreren naar een niche waar de microomgeving optimaler is. Dit zou een verklaring zijn voor het ontstaan van metastasen met een gelijkaardige samenstelling aan cellen zoals de primaire tumor (10).

Figuur 2-2: Schematische weergave van het stochastische en kankerstamcelmodel (30)

14


2.2.5

Het eerste experimenteel bewijs van het bestaan van kankerstamcellen

Een eerste vermoeden van kankerstamcellen was op het gebied van de hematologische maligniteiten. De normale hematopoëtische ontwikkeling is reeds uitgebreid bestudeerd in het verleden. Er werden functionele in vitro en in vivo testen geproduceerd waardoor er primitieve

pluripotente

stamcellen,

multipotente

progenitorcellen,

unipotente

progenitorcellen en functioneel gedifferentieerde cellen van elkaar gescheiden kunnen worden. De belangrijkste techniek is de flow cytometrie waarmee de cellen gescheiden worden op basis van hun celoppervlakte merkers, grootte en granulariteit. Hieruit werd geconcludeerd dat de normale hematopoëse hiërarchisch is. Via de flow cytometrie werd ontdekt hoe de normale differentiatie verstoord wordt in humane leukemieën (11). In 1994 vond er een doorbraak plaats op het gebied van CSC. Cellen met het fenotype CD34 positief CD38 negatief of CD34+CD38- in het bloed van patiënten met AML (acute myeloïde leukemie) zijn in staat om na transplantatie in immunodeficiënte muizen een leukemie met gedifferentieerde celtypen te veroorzaken. Door de cellen met fenotype CD34+CD38-

opnieuw te isoleren uit de muis en vervolgens over te brengen in een

andere muis, werd opnieuw hetzelfde resultaat bekomen. Dezelfde test werd uitgevoerd met de meer gedifferentieerde cellen met een combinatie van fenotype CD34- en/of CD38+. Er werd geen leukemie ontwikkeld in de muis maar de cellen konden wel nog prolifereren (10). AML kan gezien worden als een ziekte waarbij de myeloïde cellen een beschadigd differentiatieprogramma hebben. Dit resulteert in een overvloedige productie van leukemische blasten waarvan de meerderheid een gelimiteerde proliferatiecapaciteit heeft en een minderheid aan CSC die aan zelfhernieuwing doet (Figuur 2-3). Zowel de studies van de normale als de leukemische hematopoiese worden nu gebruikt als een soort landkaart voor het onderzoek bij vaste tumoren. Opmerkbaar is dat de celoppervlakte-proteïnen van zowel CSC als normale stamcellen bijna identiek zijn (2,11).

15


Figuur 2-3: Weergave van de normale hematopoiese en acute myeloïde leukemie (13) 2.2.6

Beperkingen bij de kankerstamcelhypothese

Alle aanwijzingen voor het bestaan van een hiërarchische organisatie van maligniteiten zijn verkregen via het transplanteren van een gering aantal CSC van humane maligniteiten naar een immuungecompromitteerde muis. Het is dus logisch dat men de vraag stelt of deze resultaten naar de patiënt te extrapoleren zijn (10,13). Een ander probleem zijn de identificatiemerkers van kankerstamcellen. Vaak zijn dit oppervlakte-proteïnen die een rol spelen in celadhesie zoals de merkers CD44 en CD24. Er wordt gedacht dat deze cellen met deze adhesie-proteïnen een rol spelen bij het faciliteren van de hechting van tumorcellen en dus niet zelf een CSC zijn. Om deze kritieke punten te kunnen weerleggen is er dus een technisch geavanceerd muismodel nodig (10). Naast deze beperkingen wordt er ook nog gespeculeerd over de oorsprong van een kankerstamcel. De grote vraag is: zijn CSC afkomstig van orgaanstamcellen die hun mogelijkheid

tot

zelfhernieuwing

behouden

maar

epigenetische

en

genetische

veranderingen verwerven om zo tumorigeen te worden of zijn CSC progenitoren die een zelfhernieuwend vermogen verwerven? (Figuur 2-4) Beide mechanismen zijn mogelijk en welk mechanisme gebruikt wordt is waarschijnlijk afhankelijk van het orgaantype waarvan CSC afkomstig zijn (9). 16


Het stochastische model is niet volledig verwerpbaar. Er zijn nog steeds kankertypes waarvan men nog steeds bewijs gevonden heeft van de aanwezigheid van CSC (2,11).

Figuur 2-4: Mogelijke theorieën rond de oorsprong van kankerstamcellen (30)

2.3

Borstkankerstamcellen

2.3.1

Ontdekking van CSC in borsttumoren

In

2003

werd

het

bestaan

van

een

CSC-populatie

in

gemetastaseerde

mammacarcinomen uitgetest door M. Al Hajj en zijn collega’s. Ze wilden bewijzen dat er CSC aanwezig zijn in soliede borsttumoren en dit door een experiment uit te voeren gelijkend op dat van het AML onderzoek. De testen werden uitgevoerd op primaire borsttumoren en pleurale effusies afkomstig van negen patiënten. De cellen werden zowel rechtstreeks gebruikt alsook gekweekt in een muis en eventueel nogmaals in een tweede muis. De selectie van cellen gebeurt aan de hand van de merkers voor CD24 en CD44. Dit zijn celadhesiemoleculen. Ook de merker CD 38.1 werd gebruikt. Dit is een specifieke merker voor borst - en ovariumkanker. Verschillende merkercombinaties werden geïmplanteerd in een borstvetkussentje van NOD/SCID muizen. De hoeveelheid geïmplanteerde cellen was gelijk aan 105 cellen. Enkel de cellen met fenotype CD44+CD24-/low CD38.1+ vormden merkbare tumoren. Omdat CD44+ cellen exclusief ook CD38.1+ cellen zijn, werd het onderzoek verder gefocust op de merkers CD44 en CD24.

17


Om normale celtypen uit te sluiten zoals leukocyten, fibroblasten, endotheliale- en mesotheliale cellen moeten de gebruikte cellen Lineage negatief

of Lin– zijn. Lin–-cellen

bevatten dus geen CD2, 3, 10, 16, 18, 31, 64 en 140b op hun celoppervlak. Uit eerdere studies werd er besloten dat deze Lineage merkers niet aanwezig zijn op tumorcellen. Voor het eerste deel van het experiment werden er Lin–-cellen in combinatie met CD24 en CD44 merkers op hun celoppervlak geïnjecteerd in de NOD/SCID muis. Om

de

tumorigene activiteit verder te verrijken werden de CD44+CD24-Lin- cellen nog eens verder gesorteerd volgens de merker epitheel specifiek antigeen (ESA). ESA werd vroeger gebruikt om epitheliale tumorcellen te onderscheiden van goedaardige reactieve mesotheliale cellen. In tabel 2-1 worden de resultaten van dit experiment weergegeven (14).

Aantal geïnjecteerde cellen

Ongesorteerd CD44+CD24+ +

-/low

CD44 CD24

5 x 105

105

5 x 104

8/8

8/8

10/10

2 x 104

104

5 x 103

3/12

103

200

100

0/12

0/10

0/10

0/14

0/10

10/10

10/10

14/14

10/10

CD44+CD24_/lowESA+

10/10

4/4

1/6

CD44+CD24-/lowESA-

0/10

0/4

0/6

Tabel 2-1: Tumorontwikkeling in NOD/SCID muizen na injectie met kankercellen (14)

Naast de ontwikkeling van merkbare tumoren werd er lichtmicroscopisch onderzoek uitgevoerd. Enkel bij CD44+CD24-/lowLin- kon men duidelijk tumorvorming zien in de weefsels (14). 2.3.2

Borsttumoren, hiërachisch of stochastisch model

Om te bepalen welk model toepasbaar is bij borstumoren moet er gekeken worden naar verschillen in de celcyclus van zowel de tumorigene als niet tumorigene borsttumorcellen. Dit kan aan de hand van een Hoechst 33342 kleuring die het DNA in de cel markeerd en flow cytometrie. Als resultaat zag men dat ESA+CD44+CD24-/lowLin- tumorigene cellen en 18


de resterende Lin- niet-tumorigene cellen een gelijkaardige verdeling over de celcyclus vertoonden (Figuur 2-5). Bij borstkanker kan dus het stochastisch model verworpen worden. Bij dit model zouden we verwachten dat de niet tumorigene cellen zich bijna volledig in de G0/G1 fase zouden bevinden (14).

Figuur 2-5: Vergelijking van de celcyclus tussen tumorigene en niet tumorigene borstkankercellen (14)

Om te kunnen bewijzen dat de tumorinitiërende cellen gelijkaardige kenmerken hebben als normale stamcellen, werden CD44+CD24-/lowLin- cellen geïsoleerd uit de tumor verkregen uit de eerste NOD/SCID muis. Deze cellen werden vervolgens geïnjecteerd in een tweede muis. De fenotypische heterogeniciteit van de tumor ontwikkelt in de tweede muis werd vergeleken met de tumor van de eerste muis. Opnieuw werd in de tweede muis een

tumor met een gelijkaardige heterogeniciteit aan tumorigene en niet tumorigene

cellen ontwikkeld. Na het doorgeven aan vier muizen kon er besloten worden dat de tumorgeniciteit van de ontwikkelde tumoren niet gedaald was. De zelfvernieuwing en de differentiatie bewijzen dat deze CSC gelijkaardige kenmerken hebben als een normale stamcel (14).

19


2.4

CD44

2.4.1

Normale functie

CD44 is een transmembranair glycoproteïne dat tot expressie komt op het celoppervlak van onder andere hepatocyten, tubulaire nierepitheelcellen, hematopoëtische cellen, testis - en huidcellen. CD44 wordt niet teruggevonden op trombocyten. CD44 is betrokken bij de celbeweeglijkheid, de activatie van overlevingsmechanismen en het promoten van celadhesie. Synoniemen voor CD44 zijn het huishoudceladhesie molecule (H-CAM), fagocyterend glycoproteïne-1, ECM-III, HUTCH-1 of Hermes-1. Na transcriptie van het gen dat codeert voor CD44 volgt een complexe splitsing die resulteert in vele isovormen die zowel structureel als functioneel verschillen (15,16). Een belangrijke functie van CD44 is het functioneren als receptor voor hyaluronzuur. Als receptor kan het ook interactie aangaan met

osteopontine, collageen en matrix

metalloproteïnases. Interactie tussen CD44 en hyaluronzuur verstevigt het vastklampen van

lymfocyten

aan

de

vasculaire endotheelcellen

en

is

belangrijk

voor de

ontstekingsgepromote uitstoting van de superantigen gestimuleerde T-cellen in de peritonale holte (15,16). 2.4.2

De rol van CD44 in de kankerontwikkeling

Hyaluron-CD44 interacties zijn verwikkeld in het promoten van de huishouding en transendotheliale invasie van myelomacellen door het beenmergendotheel (15). Isovormen van CD44 op colonkankercellen vertonen de HCELL glycovorm. Deze vorm medieert de binding aan het vasculaire E-selectine onder hemodynamische flow condities. Dit gebeuren is een kritieke stap in de metastase van colonkanker (17). Men vermoedt dat de rol van CD44 bij kanker belangrijk is op het gebied van metastasering (17). 2.4.3

De functie van CD44 in borstkanker

Uit de eerder besproken studie van M. Al Hajj en collega’s werd een duidelijk verband gelegd met de aanwezigheid van de merker CD44 en borstkankerstamcellen. Uit verder onderzoek uitgevoerd door Ling Li-Jun en collega’s werd geconcludeerd dat het CD44+CD24-/low fenotype van borstkankercellen een hoog botzoekend vermogen heeft. Dit kan resulteren in een verhoogde kans op botmetastase (15). 20


2.5

CD24

2.5.1

Normale functie

CD24 is een sialoglycoproteïne dat verbonden is met het celmembraan via een glycosylphosphatidylinositol (GPI) – anker. CD24 wordt geëxprimeerd tijdens de verschillende stadia in de B-cel ontwikkeling, behalve op plasmacellen. Daarnaast wordt het ook geëxprimeerd op granulocyten en een groot aantal epitheliale cellen. Een specifieke functie wordt nog niet toegekend aan CD24 maar waarschijnlijk speelt deze een rol in de regulatie van de B-cel proliferatie en maturatie. In andere studies werd CD24 beschreven als belangrijk bij de ontwikkeling van pancreas en hersencellen. Er wordt ook vermoed dat CD24 een rol speelt in de regeneratie van spiercellen, keratinocyten en niertubuli (18,19). 2.5.2


CD24 wordt beschreven in heel wat kankers zoals B-cel lymfoom, niercelcarcinoom, small cell en non small cell long carcinoom, glioom, ovariumcarcinoom en borstcarcinoom. Het antigen wordt geassocieerd met een ongunstige prognose bij ovariumkanker en prostaatkanker (18). Er wordt vermoed dat de rol van CD24 in het kankerproces zich situeert ter hoogte van de metastasering. CD24 werd geïdentificeerd als een alternatief ligand voor P-selectine, een adhesiereceptor die aanwezig is op geactiveerde endotheliale cellen en bloedplaatjes. Via deze binding tussen CD24 en P-selectine kunnen de CSC zich verspreiden via de bloedbaan (18,19). 2.5.3

De functie van CD24 in borstkanker

Er werd recent aangetoond dat de CD24 mRNA expressie laag is in invasieve borstkankercellijnen in vergelijking met niet invasieve cellijnen. Uit studies werd gezien dat een verlies van CD24 resulteert in een toename van CXCR4, een chemokine receptor die een belangrijke factor speelt in zowel de migratie, de invasiviteit en proliferatie van borstkankercellen. CD24 is waarschijnlijk een regulator van CXCR4 in borstkanker (19). 21


2.6

CD133

2.6.1

Normale functie

CD133 is een cholesterolbindend glycoproteïne dat behoort tot de famillie van pentatransmembranaire proteïnes. CD133 of prominin-1 wordt specifiek geassocieerd met plasmamembranaire uitpuilingen. In epitheliale cellen is CD133 geconcentreerd op de microvilli. Dit bevindt zich aan de apicale kant van het plasmamembraan waar het gebonden is aan het plasmamembranaire cholesterol. Aan CD133 werd nog geen exacte functie toegewezen (21). Oorspronkelijk is CD133 geïdentificeerd als een celoppervlakte-proteïne aanwezig op CD34+ hematopoëtische stamcellen. Het wordt ook geëxprimeerd door normale neurale stamcellen (20). Verder wordt CD133 teruggevonden op het volwassen epitheel van de pancreasgangen, in de proximale tubuli van de nieren en in de melkproducerende gangen van de borstklieren(21). In de immunohistochemie wordt het antilichaam AC133 gericht tegen CD133 gebruikt als merker voor somatische stamcellen (21). 2.6.2


Uit eerdere studies is gebleken dat de CSC bij colonkanker CD133+ zijn. CD133 is een onafhankelijke factor die correleert met een lage overlevingskans van de patiënt (17). De expressie van CD133 gebeurt in een subpopulatie van hersentumorcellen die de capaciteit voor tumorvorming significant doet stijgen in de muismodellen. Andere kankers die CD133 exprimeren zijn ependymoom, prostaatkanker, longkanker, hepatocellulair carcinoom, larynxcarcinoom, melanoom, ovariumkanker en pancreaskanker (20).

22


2.7

Oct4

2.7.1

Normale functie van Oct4

Oct4, een POU familie transcriptiefactor, werd opgemerkt door zijn specifieke expressie op ongedifferentieerde embryonale stam- en kiemcellen maar niet in gedifferentieerde cellen. Oct4 heeft een kritieke functie bij het zelfvernieuwen en onderhouden van embryonale stamcellen (25). Bij kiemcellen heeft Oct4 een regulerende functie bij de initiatie, het onderhoud en de differentiatie gedurende de normale ontwikkeling (26). De transcriptiefactor Oct4 bindt specifiek met het octameer motief ATGCAAAT dat op verschillende genen aanwezig is (22). 2.7.2

Rol van Oct4 in de kankerontwikkeling

De expressie van Oct4 is niet aanwezig in normaal somatisch weefsel maar wordt geëxprimeerd in verschillende tumoren zoals testiculaire en ovariële seminoma’s en in embryonaal carcinoom (25,26). De graad van Oct4 expressie correleert niet met de graad of metastase van de tumor (23).

2.8

ALDH

2.8.1

Normale functie

Aldehyde dehydrogenase is een enzym gelokaliseerd in bijna alle zoogdierweefsels. Het katalyseert de irreversibele oxidatie van een reeks intracellulaire alifatische en aromatische aldehyden tot hun corresponderende carbonzuur (24). Er zijn verschillende isovormen van ALDH die ingedeeld worden in drie subklassen. Klasse één bevat meerdere isovormen die in het cytosol voorkomen terwijl klasse twee de mitochondriale vormen bevat. Klasse drie bevat de microsomale, in het cytosol gelegen tumor specifieke en de dioxine inducerende vormen (24). Minstens twaalf humane ALDH isovormen werden tot op heden geïdentificeerd. Vele van deze proteïnen zoals ALDH1, ALDH2, ALDH4 en ALDH10 zijn via mutaties betrokken bij vele metabolische ziektes en klinische abnormaliteiten (24). De meeste isovormen worden geproduceerd in bijna alle weefsels. Het hoogste expressieniveau ligt in de lever en de

23


nier. De cellulaire distributie van ALDH is duidelijk aanwezig in het cytoplasma, de mitochondria en het endoplasmatisch reticulum van de cel (27). ALDH1 is een klasse één isovorm. Het is een enzym, aanwezig in het cytosol, dat verantwoordelijk is voor het katalyseren van de omzetting van retinol of vitamine A naar retinolzuur. Retinolzuren spelen een essentiële rol in de normale ontwikkeling en homeostase. Ze zijn dus belangrijk voor de fysiologie van vele organen en de ontwikkeling tijdens de embryogenese. ALDH1 wordt sterk geëxprimeerd in hematopoëtische progenitoren, in intestinale cryptecellen en ook in borsttumorcellen (27). ALDH speelt een kritische rol bij de humane hematopoëtische stamceldifferentiatie. De transcriptie van het ALDH gen zet de stamcellen aan om te prolifereren. De inhibitie van ALDH zorgt dat de proliferatie stopt en kan zelfvernieuwing induceren (28,29). 2.8.2

De functie van ALDH in borstkanker

In een experiment, uitgevoerd door Balicki en collega’s, bracht men 500 gezuiverde borstkankercellen die ALDH1 positief waren in een NOD/SCID muis. Binnen de 40 dagen ontstond er een tumor. De tumor vertoonde de fenotypische heterogeniciteit van ALDH negatieve en positieve cellen. Dit resultaat bewijst dat ALDH een goeie merker zou zijn voor CSC. Het gebruik van ALDH1 positieve cellen zou eenvoudiger zijn om de CSC theorie te bewijzen in vergelijking met de techniek van het experiment van Al Hadjj en collega’s. In het laatste experiment had men minstens 12 merkers nodig om tumor initiërende cellen te isoleren. De combinatie van de celoppervlakte merkers gebruikt in het eerste experiment en de ALDH1 merker zorgt voor een bewonderenswaardig resultaat. Slechts 20 cellen van het specifieke fenotype zijn nodig om een tumor op te wekken bij een NOD/SCID muis (28,29).

24


2.9

De avidine-biotinecomplex methode

De avidine-biotinecomplex of ABC methode wordt toegepast bij immunohistochemische kleuringen. Een immunohistochemische kleuring zorgt voor het zichtbaar maken van bepaalde biomoleculen in weefsels onder een lichtmicroscoop. Vaak wordt een immunohistochemische kleuring toegepast op biomoleculen zoals celoppervlakteproteïnen. Deze kleuring is gebaseerd op de binding tussen een antigeen en zijn antilichaam (31). De ABC-methode is verantwoordelijk voor het zichtbaar maken van het antigeenantilichaam complex. De methode is gebaseerd op de sterke affiniteit van het proteïne avidine voor het vitamine biotine (31). Als eerste wordt een monoclonaal muizen antilichaam aan het weefsel toegevoegd zodat deze kan binden met het overeenkomstig antigeen (31). Vervolgens worden konijn - anti – muis (RAM) antilichamen (Al) toegevoegd bij de gebonden muizen antilichamen. De RAM Al zijn gemarkeerd met biotine. Daarnaast wordt er biotine toegevoegd gebonden aan peroxidase (HRP) (31). Door het toevoegen van avidine met zijn vier bindingsplaatsen wordt biotine gebonden en ontstaat er een netwerk van avidine, biotine en peroxidase (31). Als laatste stap wordt diaminobenzidine (DAB) chromogeen toegevoegd samen met gebufferd DAB substraat. De reactie tussen DAB en DAB substraat wordt gekatalyseerd door het HRP. DAB wordt een onoplosbare bruine neerslag, zowel in water als in alcohol. Door deze eigenschappen kan indien gewenst nog een hematoxyline tegenkleuring plaastvinden. De coupes worden beoordeeld door de patholoog door middel van een lichtmicroscoop (31).

25


Figuur 2-6: Principe ABC methode (31)

Om eventuele vals positieve aankleuring door endogene peroxidasen tegen te gaan, is het

beter

het

weefsel

te

incuberen

met

H2O2.

Deze

stap

wordt

voor

de

immunohistochemische kleuring uitgevoerd (31).

26

Immunohistochemische benadering van borstkankerstamcellen Materiaal en methode

3

Materiaal en methode

3.1

Inleiding

3.1.1

Situering

Om kankerstamcellen (CSC) aan te kunnen tonen in weefsel worden bepaalde proteïnen aanwezig op of in CSC aangekleurd. Dit gebeurt door gebruik te maken van antilichamen gericht

tegen

deze

proteïnen.

Het

zichtbaar

maken

van

de

antilichaam-

antigeencomplexen verloopt via de avidine-biotine methode of ABC methode. De gekozen antilichamen voor het experiment zijn gericht tegen ALDH, CD24, CD44, CD133 en Oct4. Alle immunohistochemische kleuringen zijn uitgevoerd op formaldehyde gefixeerde, in paraffine ingebedde humane weefsels. Vooraleer een immunohistochemische kleuring op patiëntenmateriaal uit te voeren moet elke kleuring op punt gesteld worden. De optimalisatie gebeurd via een titrimetrische immunohistochemische kleuring op niet-tumoraal weefsel dat als positieve controle dient (Tabel 3-1). Tabel 3-1: Merker met bijhorende positieve controle

De

Merker

Positieve controle

ALDH

Lever

CD24

Tuba (eileider)

CD44

Adenoïden

CD133

Caco-2 cellijn (negatieve controle: HeLa cellijn)

aankleuring

van

Oct4

werd

eerder op

punt gesteld

door de

medische

laboratoriumtechnologen van de dienst pathologie en wordt in de routinediagnostiek toegepast. Nadat elke kleuring op punt gesteld is kan verder gewerkt worden op patiëntenmateriaal. De stalen zijn afkomstig van 40 vrouwelijke patiënten met gemetastaseerde ductaal borstcarcinoom. Per patiënt worden twee weefselcoupes gekleurd; één afkomstig van de primaire borsttumor en één afkomstig van een gemetastaseerd weefsel. De metastasen worden gelokaliseerd in onder andere het bot, de hersenen, de lever, de lymfeklieren, de huid, het peritoneum en in de dura mater afhankelijk van de patiënte. 27


3.2

Immunohistochemische verwerking van formaldehyde gefixeerde in paraffine ingebed weefsel.

Voor een volledige lijst met gebruikte reagentia en materiaal zie bijlage 1. 3.2.1

Coupes snijden

Het paraffineblokje met weefsel wordt op een vriesplaat met temperatuur -20°C afgekoeld. Met een glijmicrotoom worden coupes gesneden van ongeveer 1-2 µm. Deze worden gefixeerd op een draagglaasje en overnacht in een oven van 50°C geplaatst. 3.2.2

Deparaffineren en rehydrateren van het weefsel

Dit proces gebeurd volledig automatisch op de TissueTek® Prisma. Om de paraffine volledig uit het weefsel te verwijderen en het te rehydrateren worden volgende stappen gevolgd: 1) 2) 3) 4) 5) 3.2.3

Xyleen 3 x 4 minuten Alcohol 95% 2 x 5 minuten Alcohol 70% 2 x 5 minuten Spoelen met aqua destillata In verse aqua destillata brengen, zeker nooit droog laten worden.

Antigen retrieval

Principe Via ‘antigen retrieval’ reagentia worden cross-link proteïnes gebroken die de antigenen maskeren. Dit gebeurd tijdens de formaldehyde fixatie en het inbedden van weefsel in paraffine. Na bewerking met ‘antigen retrieval’ reagentia liggen de verborgen antigenen terug vrij zodat de binding met het antilichaam (Al) mogelijk is. Het principe van deze techniek is het verwarmen gedurende verschillende periodes van de formaldehyde gefixeerde paraffine weefsels in een waterige oplossing. Deze waterige oplossing wordt de antigen retrieval reagentia genoemd. Dit volledige proces wordt warmte geïnduceerde epitoop retrieval genoemd (32). Als verwarmingstoestellen wordt een warmwaterbad of een microgolfoven gebruikt. De antigen retrieval oplossing is vaak een citraatbuffer 10 mM met pH 6.0 of een EDTA-buffer 1 mM met pH 8.0 (32). 28


Werkwijze De coupes worden in een ijzeren beker gebracht met EDTA - buffer 1 mM pH 8.0 of citraatbuffer 10 mM pH 6.0 gebracht. De gekozen buffer is afhankelijk van de merker en is experimenteel bepaald. Op het moment dat de temperatuur van het water in het warmwaterbad (WWB) 98°C bedraagt, wordt de metalen beker gedurende 15 minuten in het WWB gebracht. Vervolgens wordt de beker met de coupes uit het WWB gehaald en op kamertemperatuur gebracht gedurende 15 minuten. Als laatste stap wordt de metalen beker met coupes in een koudwaterbad gebracht gedurende 15 minuten. Hierna worden de coupes in APK buffer bewaard. Voor de antigen retrieval van de CD133 aankleuring worden tijden van 30 minuten in plaats van 15 minuten aangewezen. 3.2.4

Aankleuren van de antigenen

De aankleuring gebeurt via de ABC methode. Dit kan zowel semi-automatisch als manueel. De semi-automatische techniek Deze techniek werd gekozen voor de antigenen CD24, CD44, ALDH en Oct4. Voor deze techniek wordt het toestel NexES® IHC Ventana gebruikt. De coupes worden in het toestel gebracht. Via spuiten worden de nodige oplossingen op de draagglaasjes aangebracht. ®

Figuur 3-1: NexES IHC Ventana

29


Reagentia: ◊

Ventana iVIEW TM DAB Detection Kit o

(1) 25 mL iVIEW inhibitor – H2O2 (3%)

o

(1) 25 mL iVIEW Biotinylated Ig – (<200 µg/ml)

o

(1) 25 mL iVIEW SA-HRP – (< 300 µg/mL)

o

(1) 25 mL iVIEW DAB – DAB (0,2%)

o

(1) 25 mL iVIEW H2O2 - H2O2 (< 0,08%)

o

(1) 25 mL iVIEW Copper – CuSO4 (5g/L)

◊

APK- buffer

◊

Ventana Coverslip

Werkwijze: ◊

Het toestel voegt op elke coupe een laagje Coverslip toe. Coverslip is een olieachtige vloeistof die het uitdrogen van de coupes tegengaat. Het toestel warmt de coupes op tot 37°C.

◊

iVIEW inhibitor is een oplossing van 3% H2O2. Een druppel wordt toegevoegd en er volgt een incubatie van vier minuten. Dit wordt als eerste toegevoegd om het endogene peroxidase te elimineren uit het weefsel, zodat deze niet voor interferenties kan zorgen.

◊

Hierna volgt de manuele stap waarbij het primaire antilichaam bij het weefsel wordt toegevoegd. Als eerste wordt het antilichaam verdund met Ventana Antibody Diluent. De verdunningen zijn experimenteel bepaald. Wanneer het toestel aangeeft dat het primair antilichaam aangebracht mag worden, wordt het toestel geopend en op elk draagglaasje 100 µL antilichaam aangebracht. De incubatiestap duurt 32 minuten.

◊

Het toestel vervolledigt de resterende stappen. Na de incubatieperiode van het primaire antilichaam volgt er een wasstap. Daarna wordt er gebiotinyleerd secundair antilichaam of I -VIEW BIOTIN Ig met het weefsel samengebracht en geïncubeerd gedurende acht minuten.

◊

Na een wasstap wordt er I-VIEW SA-HRP of streptavidine-HRP toegevoegd en geïncubeerd gedurende acht minuten. 30


◊

Vervolgens wordt één druppel I-VIEW DAB samen met één druppel I-VIEW H2O2 toegevoegd. De incubatiestap duurt acht minuten.

◊

Om de kleurreactie te stabiliseren wordt er I-VIEW Copper of CuSO4 toegevoegd.

◊

Als tegenkleuring wordt het weefsel aangekleurd met hematoxyline.

Wanneer de run is afgelopen worden de coupes met detergent gespoeld om de Coverslip te verwijderen. Vervolgens wordt er gespoeld met warm water, daarna met koud. De coupes worden in gedestilleerd water gebracht. Manuele techniek Deze techniek wordt verkozen bij het aankleuren van CD133. Werkwijze ◊ 2 * 5 min PBS 0,01M ◊ H2O2 20 min 0,3% (1 mL 30% stock H2O2 in 99 mL PBS 1%) ◊ 2 * 5 min PBS 0,01M ◊ AC133 (verdunning 1/50) overnacht incuberen bij 4°C in een vochtige kamer ◊ 2* 5 min PBS 0,01M ◊

Sec Al gebiotinyleerd anti-rabbit 1/400 (in PBS verdunnen) 30 min

◊

2* 5min PBS 0,01M

◊

Streptavidine-HRP DaKo cytomation 1/300 (in PBS 1x verdunnen) 30 min

◊

2* 5 min PBS 0,01M

◊

DAB chromogeen substraat (één druppel chromogeen in 1 mL substraat buffer) +/- 30 seconden

◊

Direct spoelen met PBS 0,01M

◊

Hematoxyline 2 min

31


3.2.5

Dehydrateren

De dehydratatie gebeurt volledig automatisch op de TissueTek® Prisma. Hiervoor wordt het programma DehydraIMMUNO gekozen. Om gedehydrateerd weefsel te verkrijgen worden volgende stappen gevolgd: 1) Alcohol 70% 2 x 5 minuten 2) Alcohol 95% 2 x 5 minuten 3) 3 maal xyleen gedurende 4 minuten Via de TissueTeck Film wordt een laagje kunststof film op de coupe gebracht. Laat de coupes nog een 5-tal minuten in de trekkast verblijven zodat de xyleen dampen volledig weg zijn.

3.3

Op punt stellen van merker CD 44

3.3.1

Reagentia

◊ CD44 Std. / HCAM Ab-4 mouse monoclonal antibody Cat. ＃MS -668-P0 (Purified Ab met BSA en natriumazide) ◊ Ventana Antibody Diluent 3.3.2

Werkwijze

Testmateriaal Als positief testmateriaal wordt er gekozen voor weefsel afkomstig van adenoïden. Antigen retrieval Volgens de datasheet geleverd bij de CD44 merker wordt aangeraden een voorbehandeling met citraatbuffer 10mM pH6.0 te gebruiken. Om hierover zeker te zijn wordt ook de voorbehandeling met EDTA buffer 1mM pH 8.0 toegepast. Maken van verdunning CD44 De datasheet raadt een verdunning van 1/100 aan. De verdunningen 1/50, 1/100 en 1/200 worden aangemaakt met Ventana Antibody Diluent in epjes van 1,5 mL. Vervolgens worden deze gevortext. Titremetrische immunohistochemische kleuring

32


3.4

Op punt stellen van merker CD24

3.4.1

Reagentia

◊ CD24 (GPI-linked surface mucin) Ab-2 (Clone SN3b), mouse monoclonal antibody, Cat＃MS -1279-P0, 200 µg/mL (Purified Ab met BSA en Azide) ◊ Ventana Antibody Diluent 3.4.2

Werkwijze

Testmateriaal Als positief testmateriaal wordt er gekozen voor weefsel afkomstig van adenoïden en tuba (eileider). Antigen retrieval Volgens de datasheet geleverd bij de CD24 merker wordt aangeraden een voorbehandeling met citraatbuffer 10mM pH6.0 uit te voeren. Zekerheidshalve wordt ook de voorbehandeling met EDTA 1mM pH8.0 toegepast. Maken van verdunning CD24 De datasheet raadt een verdunning van 1/50 aan, daarnaast vermeldt men dat voor specifieke kleuringen de verdunningen zelf gedetermineerd moeten worden. De verdunningen 1/25, 1/50 en 1/100 worden aangemaakt met Antibody Diluent in epjes van 1,5 mL. Vervolgens worden deze gevortext. Titremetrische immunohistochemische kleuring

3.5

Op punt stellen van merker ALDH

3.5.1

Reagentia

Purified Mouse Anti-ALDH , BD Transduction LaboratoriesTM, 250µL/mL, muizen IgG1 gebufferd in BSA, glycerol en ≤ 0,09% natriumazide. ◊ Ventana Antibody Diluent

◊

3.5.2

Werkwijze

Testmateriaal Als positief testmateriaal wordt er gekozen voor weefsel afkomstig van de lever. Antigen Retrieval Op de datasheet staat weinig informatie over de voorbehandeling. Daarom wordt er gekozen voor zowel de citraatbuffer 10mM pH6.0 en de EDTA-buffer 1mM pH8.0.

33


Naast de klassieke voorbehandelingen wordt er nog een andere voorbehandeling toegepast namelijk door toevoeging van proteasen. Deze voorbehandeling vindt plaats op het toestel. Een vierde coupe wordt niet voorbehandelt om te controleren of er antigen retrieval nodig is. Maken van verdunning ALDH Opnieuw is er op de datasheet geen informatie beschikbaar over een gepaste verdunning. Er wordt gestart met een verdunning 1/100. Titremetrische immunohistochemische kleuring

3.6


Na meerdere mislukte pogingen om de immunohistochemische kleuring van CD133 semiautomatisch te laten verlopen wordt er gekozen voor een manuele kleuring. 3.6.1

Reagentia

◊

0,3% H2O2

◊

PBS Rabbit monoclonal antibody AC133, Cell Signaling, bewaard in 10 mM sodium HEPES, 150 mM NaCl, 100µg/mL BSA, 50% glycerol en 0,02% natriumazide.

◊

Ventana Antibody Diluent

◊

Secundair Al Polyclonal goat anti-rabbit Ig’s biotinylated

◊

Streptavidine-HRP DaKo cytomation

3.6.2

Werkwijze

Gebruikt testweefsel Na meerdere pogingen op verschillende humane weefsels zoals lever en adenoïden werden er positieve en negatieve controles aangevraagd bij de firma. De positieve cellijn is de Caco-2 cellijn, de negatieve cellijn is een HeLa cellijn.

34


Antigen retrieval Als antigen retrieval reagens wordt er citraatbuffer 10 mM pH 6.0 gebruikt. De coupes ondergaan volgende stappen: ◊

30 minuten in kokend WWB

◊

30 minuten op kamertemperatuur

◊

30 minuten in koudwaterbad

Maken van verdunning CD133 merker Na meerdere pogingen met de aangeraden verdunning 1/100, wordt er gekozen voor een minder verdunde oplossing namelijk 1/50. Handmatige immunohistochemische kleuring

3.7

Immunohistochemische kleuring van Oct4

Deze kleuring werd eerder op punt gesteld door de medisch laboratorium technologen van de dienst pathologie 3.7.1

Reagentia

◊ Rabbit polyclonal to Oct4 – Embryonic Stem Cell Marker. (ab19857), abcam, 0,02% natriumazide, 1%BSA, PBS, pH 7.4, concentratie 0,50 mg/mL ◊ Ventana Antibody Diluent 3.7.2

Werkwijze

Antigen retrieval Door de antigen retrieval wordt er gekozen voor een voorbehandeling met EDTA-buffer 1mM pH 8.0. Maken van de verdunning van de Oct4 merker Een verdunning van 1/100 met Ventana antibody diluent wordt aangeraden. Titremetrische immunohistochemische kleuring

35

Immunohistochemische benadering van borstkankerstamcellen Discussie

4

Resultaten

4.1


4.1.1

Testen op adenoïden

Antigen retrieval

Verdunning

Resultaat

Citraat

1/50

Te sterke kleuring

Citraat

1/100

Sterke kleuring

Citraat

1/200

Goede kleuring

EDTA

1/100

Geen bruikbaar resultaat

Door als voorbehandeling citraatbuffer 10mM pH 6.0 te gebruiken en het antilichaam 1/200 te verdunnen wordt er een optimale membranaire kleuring verkregen.

Figuur 4-1: Membranaire kleuring CD44 in een borsttumor

36


4.2


4.2.1

Testen op adenoïden

Antigen retrieval

Verdunning

Resultaat

Citraat

1/10

Te weinig signaal.

Citraat

1/25

Te weinig signaal

Citraat

1/40

Te weinig signaal.

EDTA

1/40

Te weinig signaal.

Dit type weefsel is niet toepasbaar bij CD24. 4.2.2

Testen op tuba

Voorbehandeling

Verdunning

Resultaat

EDTA

1/25

Te sterk signaal.

EDTA

1/50

Optimaal signaal

EDTA

1/100

Te weinig signaal.

Door als voorbehandeling citraatbuffer 10mM pH 6.0 te gebruiken en het antilichaam 1/200 te verdunnen wordt er een optimale membranaire kleuring verkregen.

Figuur 4-2: Membranaire kleuring CD24 borstumor

37


4.3

Op punt stellen van ALDH

4.3.1

Testen op lever

Voorbehandeling

Verdunning

Resultaat

EDTA

1/100

Zeer sterk signaal

Citraat

1/100

Geen optimale kleuring

Protease

1/100


Geen voorbehandeling

1/100


Opnieuw testen met als voorbehandeling EDTA maar het antilichaam meer verdunnen Voorbehandeling

Verdunning

Resultaat

EDTA

1/125

Zeer sterk signaal

EDTA

1/150

Zeer sterk signaal

EDTA

1/20

Zeer sterk signaal

Opnieuw testen met als voorbehandeling EDTA maar het antilichaam meer verdunnen Voorbehandeling

Verdunning

Resultaat

EDTA

1/500

sterk signaal

EDTA

1/750

Optimaal signaal

EDTA

1/1000

Zwakker signaal

38


Door als voorbehandeling EDTA-buffer 1mM pH 8.0 te gebruiken en het antilichaam 1/750 te verdunnen wordt er een optimale cytoplasmatische kleuring verkregen. Figuur 4-3: Cytoplasmatische kleuring ALDH in een levermetastase van borstkanker

4.4


Van de verschillende voorbehandelingen was de voorbehandeling met WWB beter dan met de magnetron. Een langere voorbehandelingstijd is aangeraden. De manuele immunohistochemische kleuring op de positieve en negatieve cellijn gaf een gaf een licht signaal. Om een optimale kleuring te verkrijgen zou een kleinere verdunning van 1/25 gunstiger zijn.

39


4.5

Immunohistochemische kleuring van Oct4

Door als voorbehandeling EDTA-buffer 1mM pH 8.0 te gebruiken en het antilichaam 1/100 te verdunnen wordt er een optimale kernkleuring verkregen. Figuur 4-4: Kernkleuring Oct4 in levermetastase van borstkanker

4.6

Scoren van het patiënten materiaal

4.6.1

Principe

Na het kleuren van alle coupes worden deze gescoord per patiënt. Het scoren wordt uitgevoerd samen met Dr. K. Lambein. In de coupe wordt er gezocht naar het tumorgedeelte in het weefsel. Daar wordt de uitgebreidheid (U) en intensiteit (I) van de merkers gescoord. Voor de alle scores wordt verwezen naar Tabel 4-1 . De muntgroene kleur staat voor patiëntenmateriaal die niet aanwezig was in het archief. De blauwe kleur staat voor patiëntenmateriaal waar de tumor niet meer in aanwezig was.

40


Tabel 4-1: Score patiëntencoupes Patiënt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Invasief In situ 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Invasief In situ 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

ALDH CD24 CD44 Oct4 Metastase U I U I U I U I 0 0 2 2 0 0 Lever 1 2 1 2 3 2 0 0 Lever 0 0 3 2 1 2 0 0 Lever 3 3 2 1 1 3 0 0 Lever 2 2 3 3 1 2 0 0 Lever 2 1 2 1 1 3 0 0 Lever Lever Lever 1 2 2 2 3 3 3 3 Lever 1 2 1 2 2 3 0 0 Lever 0 0 1 1 2 2 0 0 Lever 1 2 3 2 3 3 0 0 Lever Lever 0 0 2 3 1 2 0 0 Lever 0 0 1 2 1 2 0 0 Lever 1 2 1 2 1 2 0 0 Lever 0 2 1 0 2 1 0 0 1 2 1 0

0 2 2 0 1 1 0 0 2 1 2 0

1 2 1

1 2 3

2 3 3 3 1 3

2 3 2 3 3 3

0 1 0

0 2 0

2 3 2 2

1 3 2 3 2 3

1

1

1 3

2 2

2 1 1

2 1 1

3 3 1 2

3 3 3 3 1 2

2 3 3 2 2 1 3

2 3 2 1 2 2 3

1 1

3 3 1 1 1 2 1 0 3 1 1 0

3 3 3 3 3 3 3 0 3 2 3 0

ALDH U I

CD24 CD44 Oct4 U I U I U I

1 1

3 2

2

1

2 2 1 3

2 3 0 0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

2

3

2 3 1

1 2 2

1 1 1 0 3

2 0 0 0 3

1 1

1 2

2 0

3 0

3 3 1 3

0 0 1 2

0 3

0 2

0 0

0 0

0 0 3 3

0 0 0 0

Lever

1

2

0

0

2 3

0 0

Lever Lever Lever Lever Bot Bot Bot Bot 0 0 Bot 0 0 Bot Bot

2 1 2 0 0 1 0 0 0 1

2 1 2 0 0 1 0 0 0 2

2 1

2 1

2 2 1 2 0 2

1 2 3 2 0 2

2 1 1 0 1 3 3 0 0 2

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 Bot

0

0

2

2

2 3

0 0

0 0 Huid Lymfeklier 0 0 Bot 0 0 Bot 0 0 Hersenen Hersenen 0 0 Hersenen Hersenen 0 0 Dura mater 0 0 Lever 0 0 Peritoneum

1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2

1 2 1 2 2 2 2 2 1 2 1

2 2 1 2 2 2 0 3 2 0 1

3 3 1 1 3 2 0 3 3 0 2

2 3 0 2 3 3 3 1 3 3 1

0 0 0 0 0 2 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0

3 2 3 0 3

2 3 3 0 1 3 3 0 0 2

3 3 0 3 3 3 3 3 3 3 2

3 0 0 0 2

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 3 0 0 0 0

41


5

Discussie

5.1

Immunohistochemische kleuringen

De membranaire immunohistochemische kleuring van CD24 en CD44 is volledig op punt gesteld. Deze kleuring kan semi-automatische uitgevoerd worden op de NexES® IHC Ventana. De immunohistochemische cytoplasmatische kleuring van ALDH is volledig op punt gesteld. Deze kleuring kan semi-automatisch uitgevoerd worden op de NexES® IHC Ventana. De membranaire immunohistochemische kleuring van CD133 is nog niet op punt gesteld. Als eerste werd er geprobeerd om deze kleuring semi-automatisch uit te voeren op de NexES® IHC Ventana. Na meerdere mislukte pogingen op verschillende soorten weefsels werd er besloten om over te gaan op een handmatige immunohistochemische kleuring. Na meerdere pogingen op verschillende weefsels werd er besloten om positieve coupes aan te vragen bij de firma. De handmatige kleuring en een voorbehandeling in een WWB gaf een gunstig resultaat maar nog niet het gewenste resultaat. Als oplossing zou er gebruik kunnen gemaakt worden van een kleinere verdunning dan 1/50, zodat een sterker signaal verkregen wordt. De immunohistochemische kleuringen van ALDH, CD24, CD44 en Oct4 zijn op punt gesteld en bruikbaar voor de experimentele kleuringen op patiëntenmateriaal.

5.2

Scores van het patiënten materiaal

De resultaten van alle 39 patiënten zijn terug te vinden in bijlage 2. Een interessante bemerking is dat slechts 5 patiënten van de 39 een borsttumor hadden waarin Oct4 aan te tonen is. Een belangrijke opmerking is dat Oct4 nog niet beschreven is in borstkanker. De patiënten 2, 5, 13 en 35 tonen enkel Oct4 positiviteit in de metastase, niet in de primaire tumor.

42


Patiënt 9 toont Oct4 positiviteit zowel in de primaire tumor als in de metastase. Bij deze patiënte werden ongunstige prognostische factoren vastgesteld. De primaire tumor is weinig gedifferentieerd en is tripel negatief (Oestrogeen en progesteron receptor negatief en geen amplificatie van het Her2 gen). Een verdere studie op dit type borsttumoren zou meer duidelijkheid kunnen geven. Bij patiënten 17 en 29 kon een duidelijk onderscheid gemaakt worden tussen ductaal carcinoma in situ (DCIS) en invasieve gebieden op de coupe. Wat opgemerkt werd is dat ALDH sterker positief is in de in situ gebieden dan in de invasieve gedeeltes van de coupe. Een duidelijk verband wat betreft de immunohistochemische kleuring van CD24 en CD44 is er niet. Ook in een eerder uitgegeven artikel van B. Abraham en collega’s werd deze conclusie getrokken (17).

43

Immunohistochemische benadering van borstkankerstamcellen Conclusie

6

Conclusie

Een eerste conclusie uit dit gehele eindwerk is dat de immunohistochemische kleuring van ALDH, CD24 en CD44 volledig op punt gesteld is. Deze zijn bruikbaar voor verder onderzoek. Het immunohistochemisch benaderen van de kankerstamcelhypothese is niet evident. Er bestaat voorlopig nog geen specifieke kankerstamcelmerker. Daarom moet er gebruik gemaakt worden van meerdere potentiële merkers. Het gebruik van de merkers ALDH, CD24,

CD44

en

Oct4

is

momenteel

nog

niet

voldoende

sluitend

om

borstkankerstamcellen met zekerheid aan te tonen. De immunohistochemische kleuring van CD133 is nog niet volledig op punt gesteld. Deze kleuring zal in de toekomst op punt moeten gesteld worden en zou eventueel kunnen zorgen voor meer duidelijkheid rond de kankerstamcelhypothese. Uit alle patiëntenscores kan er besloten worden dat er nog extra onderzoek nodig is om de hypothese volledig te kunnen ondersteunen. De studie kan zich specificeren op bepaalde patiënten, bijvoorbeeld patiënten met een tripel negatieve borstkanker. Daarnaast kan verder geëxperimenteerd worden met Oct4, wat momenteel nog onbekend is op het vlak van borsttumoren en zo eventueel de functie van Oct4 in borsttumoren vaststellen. Een extra onderzoek kan gericht zijn op de verschillen van merkers in invasieve en in situ gedeelten van borstkanker. Voorlopig werd ook maar één histologisch type van borstkanker, namelijk het ductaal borstcarcinoom, onderzocht. Het onderzoeken van andere types, zoals het lobulair borstcarcinoom, is een andere mogelijke piste. Het vertalen van merkers gebruikt bij dierexperimenten en experimenten op kanker cellijnen naar menselijk weefsel is niet altijd eenvoudig. De merkers die in de literatuur worden toegeschreven aan (borst)kankerstamcellen werden meestal met behulp van flow cytometrie bepaald. Om deze merkers ook immunohistochemisch aan te tonen, vormt een bijkomende uitdaging. Een eerste belangrijke stap is gezet, maar er is nog veel bijkomend onderzoek nodig. 44

Literatuurlijst 1. Tai, M.-H. (2004). Oct4 Expression in adult human cells:Evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis. Carcinogenesis, 1-17. 2. Hwang-Verslues, W. (2008). Breast cancer stem cells and tumor supressor genes. J. Foromos Medical Association, 10, 751-757. 3. Klonisch, T. (2008). Cancer stem cell merkers in common cancers – therapeutic implications. Cell press, 10, 450-460. 4. Stem Cell Information [WWW], 1 april 2009,Bethesda, MD: National Institutes of Health, U.S. Department of Health and Human Services. URL: http://stemcells.nih.gov/info/basics/basics4 Gezien d.d. 9 april 2009. 5. Ouwerkerk, J. (2008). Targeted therapies, Leids universitair medisch centrum. (ppt) 6. Vanoostveldt, K. (2008). Hemato-oncologie, Brugge, Hogeschool West-Vlaanderen. 7. Nancy, T. , The real problem in breast tumors: cancer stem cells [WWW] , 7 maart 2003, genome news network. URL: http://www.genomenewsnetwork.org/articles/03_03/stem_c.shtml Gezien d.d. 30 januari 2009 8. SoRelle, R. (2008). Erasing the roots of breast cancer, From the labs, 5,. 9. Clarck, F. (2006). Cancer Stem Cells - Perspectives on current status and future directions. Cancer Research, 19, 9339-9343. 10. Vermeulen, L. (2009). Kankerstamcellen. Nederlands tijdschrift voor geneeskunde, 153, 144. 11. Dick,E.(2003), Breast cancer stem cells revealed, PNAS, 7, 3547-3549. 12. Medema, J.P. (2008). Zoeken naar de motoren van tumoren. AMC magazine, 3. 13. Tan, B. (2006), The cancer stem cell hypothesis: a work in progress. Laboratory investigation, 86, 1203-1207. 45

14. Al-Hajj, M. (2003), Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. PNAS, 7, 3983-3988. 15. Ling, L.-J. (2008), A novel Mouse model of human breast cancer stem-like cells with high CD44+CD24-/low phenotype metastasis to human bone. Chinese Medical Journal, 20, 1980-1986. 16. Datasheet CD44 Std. / HCAM Ab-4 (Clone 156-3C11), Thermo Scientific. 17. Abraham, B.K. (2005), Prevalence of CD44+/CD24-/low cells in breast cancer may not be associated with clinical outcome but may favour distant metastasis. Amarican association for Cancer research, 11, 1154-1159. 18. Datasheet CD24 (GPI-linked surface mucin) Ab-2 (Clone SN3b), Thermo Scientific. 19. Schabath, H. (2006), CD24 affects CXCR4 function in pre-B lymphocytes and breast carcinoma cells. Journal of cell science, 119, 314-325. 20. Horst, D. (2008), CD133 expression is an dependent prognostic marker for low survival in colorectal cancer, British Journal of Cancer, 99, 1285-1289. 21. Bidlingmaier, S. (2008), The utility and limitations of glycosylated human CD133 epitopes in defining cancer stem cells, Journal of molecular medicine, 86, 10241032. 22. Datasheet Rabbit polyclonal to Oct4 – Embryonic Stem Cell Marker, abcam. 23. Xu, K. (2007), Expression and significance of Oct4 in bladder cancer, Journal of Huanhong university of science and technology, 6, 675 -677. 24. Datasheet purified mouse anti-ALDH, BD Transduction Laboratories TM. 25. Trosko, J. (2004), Oct4 expression in adult human stem cells: Evidence in support of the stem cell therapie of carcinogenesis, Carcinogenesis, 2, 495 – 502. 26. Chen, Y-C. (2008), Oct4 expression maintained cancer stem-like properties in lung cancer derived CD133 positive cells, PLos ONE, 3, 1-14. 27. Douville, J. (2009), ALDH1 as a functional marker of cancer stem and progenitor cells, Stem cells and development, 1, 17-25. 46

28. Balicki, D. (2007), Moving forward in human mammary stem cell biology and breast cancer prognostication using ALDH1, Cell Stem Cell, 1, 485-487. 29. Ginestier, C. (2007), ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of pool clinical outcome, Cell stem CellI, 1, 555587. 30. Powerpoint, Pena, M. (2001), Cancer stem cells, University of South Carolina. 31. Kellner, N. (2009), Immunohistochemie / pathologische anatomie, Brugge, Hogeschool West-Vlaanderen. 32. IHC World, Introduction to immunochemistry cells [WWW], 2007, IHC World IHC. URL: http://www.ihcworld.com/_intro/antigen-retrieval.htm Gezien d.d. 1 mei 2009

47

Bijlagen Bijlage 1 – Gebruikte materialen Reagentia:

◊ Ethylenediaminetetraacetic acid 101.0%,SIGMA-ALDRICH ,500g

disodium salt

dihydrate

(EDTA), 99,0

–

◊ Xyleen J.T Baker 4055.9005 Klinipath ◊ Alcohol 96° ontaarde ethanol 95% u2CL 00-00112.500 ChemLab ◊ Gedestilleerd water ◊ Citrate Buffer 10x geconcentreerd, pH 6.0. REF CBB999 ScyTek Laboratories ◊

Ventana iVIEW TM DAB Detection Kit o

(1) 25 mL iVIEW inhibitor – H2O2 (3%)

o

(1) 25 mL iVIEW Biotinylated Ig – (<200 µg/ml)

o

(1) 25 mL iVIEW SA-HRP – (< 300 µg/mL)

o

(1) 25 mL iVIEW DAB – DAB (0,2%)

o

(1) 25 mL iVIEW H2O2 - H2O2 (< 0,08%)

o

(1) 25 mL iVIEW Copper – CuSO4 (5g/L)

◊ Ventana Antibody Diluent ◊ Hematoxylin Ventana ◊ Bluing Reagent Ventana, Bijsluiter Ventana Online Interactive Literature Archive CD ◊ APK WASH SOLUTION Ventana 10 maal geconcentreerd Liquid Coverslip Ventana ◊ Ventana Coverslip ◊ 0,3% H2O2 ◊ Streptavidine-HRP DaKo cytomation Bereiding van reagentia:

◊ EDTA stockoplossing 100mM: 37,22g EDTA in maatkolf 1L, aanlengen met aqua destilata. ◊ EDTA werkoplossing 1mM: 10 mL stockoplossing in maatkolf van 1L en aanlengen met aqua desilata. 48

◊ Citraat stockoplossing 100mM: Aangekocht ◊ Citraat werkoplossing 10mM: 10 maal verdunnen volgens nodige hoeveelheid. Antilichamen:

◊ CD44 Std. / HCAM Ab-4 mouse monoclonal antibody Cat. ＃MS -668-P0 (Purified Ab met BSA en natriumazide) ◊ CD24 (GPI-linked surface mucin) Ab-2 (Clone SN3b), mouse monoclonal antibody, Cat＃MS -1279-P0, 200 µg/mL (Purified Ab met BSA en Azide) ◊ PBS Rabbit monoclonal antibody AC133, Cell Signaling, bewaard in 10 mM sodium HEPES, 150 mM NaCl, 100µg/mL BSA, 50% glycerol en 0,02% natriumazide ◊ Secundair Al Polyclonal goat anti-rabbit Ig’s biotinylated ◊ Purified Mouse Anti-ALDH , BD Transduction LaboratoriesTM, 250µL/mL, muizen IgG1 gebufferd in BSA, glycerol en ≤ 0,09% natriumazide. ◊ Rabbit polyclonal to Oct4 – Embryonic Stem Cell Marker. (ab19857), abcam, 0,02% natriumazide, 1%BSA, PBS, pH 7.4, concentratie 0,50 mg/mL Materiaal:

◊ Warm water bad ◊ TissueTek® PrismaTM ◊ Objectglaasjes SUPERFROST® PLUS Thermo SIENTIFIC ◊ Droogoven 50°C ◊ Microtoom Leica SM 2000 R ◊ NexES® IHC Ventana

49

Voor akkoord verklaring Dit eindwerk is een examen; eventuele fouten die worden vastgesteld tijdens de eindwerkverdediging of erna werden niet gecorrigeerd. Het gebruik als referentie in publicaties is toegelaten na goedkeuring van de stagebegeleider.

Kathleen Lambein

Nicole Kellner

Stagementor

Stagebegeleider

50

Dr. E. Vandermarliere wil ik bedanken voor het controleren van de context en opmaak

Recommend Documents