Donkerstress bij orchideeën (Phalaenopsis sp.)

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2011 – 2012

Donkerstress bij orchideeën (Phalaenopsis sp.)

Jarinda Viaene Promotoren: Prof. dr. ir. Kathy Steppe en dr. ir. Veerle De Schepper

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Bos- en Natuurbeheer

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2011 – 2012

Donkerstress bij orchideeën (Phalaenopsis sp.)

Jarinda Viaene Promotoren: Prof. dr. ir. Kathy Steppe en dr. ir. Veerle De Schepper

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Bos- en Natuurbeheer

De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.

The author and promotors give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright law, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.

Gent, 1 juni 2012

De promotor,

De promotor,

De auteur,

Prof. dr. ir. K. Steppe

dr. ir. V. De Schepper

Jarinda Viaene

WOORD VOORAF Toen Prof. Steppe vorig jaar het onderwerp van deze masterthesis op het laatste moment in de keuzelijst opnam, was ik zo gelukkig dat er toch nog een thesisonderwerp was waar ik vlinders van in mijn buik kreeg. ‘Donkerstress bij orchideeën’, het leek mij een heel boeiend onderzoek waarbij de praktische implicaties van groot belang waren. En dat was het ook. De uitvoering van de experimenten verliep echter niet altijd van een leien dakje, vooral de continue fotosynthese- en transpiratiemetingen met de bladcuvette en branchbags kostten mij letterlijk bloed, zweet en tranen. Gelukkig kon ik steeds op de steun van vele mensen rekenen, zonder hen had ik deze opdracht nooit kunnen volbrengen. Bij deze wil ik hen dan ook bedanken. Een eerste dankwoord gaat uit naar mijn promotor Prof. Kathy Steppe voor de vele hulp tijdens mijn eerste proeven en het eindeloze enthousiasme. Ik ken werkelijk niemand die zo motiverend is als jij Kathy, een bezoekje bij jou zorgde elke keer voor nieuwe energie. Ik wil ook mijn tweede promotor, dr. ir. Veerle Deschepper met heel mijn hart bedanken. Veerle, zonder jou had ik deze thesis nooit tot zo een goed einde kunnen brengen. Je hebt mij vele wetenschappelijke inzichten bijgebracht en ik kon steeds bij je terecht met al mijn vragen. Ook bedankt om mijn thesis zo grondig na te lezen. Een speciaal woord van dank gaat uit naar Veerle Lamote van Microflor voor het leveren van de orchideeën. Ook van harte bedankt om mijn literatuurstudie kritisch na te lezen. Ik mag hier ook zeker onze ‘manusjes-van-alles’ Philip, Geert, Erik en Thomas niet vergeten. Zonder hun technische hulp zou dit onderzoek nooit tot stand zijn gekomen. Ook de andere medewerkers van het labo wil ik bedanken voor hun motivatie, goede raad en de lekkere taartjes. Mijn mede-thesisstudenten ben ik zeer dankbaar voor de leuke en ontspannende momenten in ons ‘thesiskot’. Mijn broer verdient ook een speciaal dankwoordje om mij te helpen met de verwerking van de figuren. Mijn ouders, grootouders en vrienden wil ik bedanken om er altijd voor mij te zijn wanneer het nodig was. Hun luisterend oor, relativeringsvermogen en optimisme waren voor mij van onschatbare waarde om door de moeilijke momenten te raken. Last but not least, mijn allerliefste schat Jonas. Ik kan nooit verwoorden wat je voor mij betekent en hoe dankbaar ik je ben voor alles wat je al voor mij hebt gedaan.

Jarinda Viaene, juni 2012

i

SAMENVATTING De laatste decennia is de populariteit van Phalaenopsis orchideeën als kamperplanten sterk toegenomen. Door het grote economische belang willen orchideeëntelers voortdurend het productieproces optimaliseren. Tijdens dit productieproces wordt Phalaenopsis vaak (intercontinentaal) getransporteerd waarbij de planten continu in het donker worden gehouden. Deze transportomstandigheden veroorzaken bij bepaalde hybriden knopval na het transport. De knopval brengt een daling in de kwaliteit en de commerciële waarde van de orchideeën teweeg. Uit de literatuur blijkt dat ethyleen een sleutelrol speelt bij het afvallen van de knoppen aangezien ethyleeninhibitoren de knopval verhinderen. De precieze oorzaak is echter nog niet achterhaald. Vanwege de vele onduidelijkheden over de negatieve invloed van donkertransport bij Phalaenopsis, wordt in deze masterthesis de link tussen knopval en donkertransport bij Phalaenopsis onderzocht. Tijdens het onderzoek werd het donkertransport gesimuleerd bij vier verschillende Phalaenopsis hybriden. Ze werden aan een donkerperiode van vijf dagen blootgesteld, waarna ze 14 dagen een dag/nachtregime (12u licht/12u donker) kregen dat zes à zeven uur verschoven was ten opzichte van het oorspronkelijke regime. De knopval na de donkerperiode werd opgevolgd om de knopvalgevoeligheid van de hybriden in te schatten. De fotosynthese-, transpiratie- en chlorofyl fluorescentiemetingen op de bladeren en bloemstengels werden gelinkt aan de geobserveerde knopval. Uit de waargenomen knopval kwam naar voor dat alle hybriden knopvalgevoelig waren na een donkerperiode van vijf dagen. Enkel knoppen kleiner dan 2,0 cm vielen af. Aangezien geen uniforme methode beschikbaar is om de mate van knopvalgevoeligheid te bepalen, werden enkele suggesties gegeven. De knopval wordt best procentueel ten opzichte van het oorspronkelijk aantal knoppen uitgedrukt. Bovendien is het belangrijk dat de knopval gemiddeld per hybride wordt bepaald. Ook moet een keuze gemaakt worden tussen enkel grote knoppen (commercieel belangrijker) of alle knoppen in rekening brengen. Een bijkomend aspect van dit onderzoek was het voorstellen van een screeningmethode om de knopvalgevoeligheid van een hybride snel te kunnen inschatten. De maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in het licht-geadapteerde blad (Fv’/Fm’) en de nietfotochemische quenching (NPQ) in het donker tijdens de herstelperiode bleken hiervoor geschikte parameters. Een significant lagere Fv’/Fm’ en een hogere NPQ wezen namelijk op meer knopvalgevoeligere hybriden. Door het linken van de fluorescentie-, fotosynthese- en transpiratiemetingen met de knopval werd de oorzaak van de knopval beredeneerd. Een langdurige donkerperiode zorgt voor stress ter hoogte van PS II in de bladeren waardoor de planten stresshormonen zoals ethyleen willen produceren. 1-ACC, de precursor van ethyleen, kan echter niet worden omgezet in ethyleen door zuurstoftekort. De lichtreacties, die voor zuurstof zorgen, gaan namelijk niet door. Bovendien zijn de stomata van de bladeren gesloten waardoor geen exogeen zuurstof wordt opgenomen. Knopvalgevoelige hybriden ondervinden meer stress aan PS II en produceren dus meer 1-ACC. Via de transpiratie kan 1-ACC naar de bloemen en knoppen worden getransporteerd. De bladeren van de knopvalgevoelige hybriden transpireren minder in de iii

donkerperiode waardoor het transport van 1-ACC naar de bloemen en knoppen groter is. Wanneer de orchideeën terug licht krijgen, kan 1-ACC in de knoppen worden omgezet naar ethyleen, wat knopval induceert. Bij de gevoeligere hybriden zal de knopval dus groter zijn aangezien de concentratie 1-ACC in de knoppen hoger is.

iv

ABSTRACT Over the last few decades, the popularity of Phalaenopsis as an indoor plant has been strongly increasing. Because of the great economic importance, orchid growers want to continuously optimize its production process. During this process Phalaenopsis is often (intercontinentally) transported while the plants are constantly kept in the dark. Because of these transport conditions, certain hybrids show bud drop after the transport. The abortion of the buds makes the orchids less commercially valuable due to quality loss. The literature shows that ethylene plays a key role in the abortion of the buds because ethylene inhibitors prevent the bud drop. The exact cause however, is not yet clear. Because of the many ambiguities about the negative impact of dark transportation of Phalaenopsis, the link between bud drop and transportation of Phalaenopsis in the dark is investigated in this masterthesis. During the investigation the transportation in the dark was simulated with four different Phalaenopsis hybrids. They were exposed to a dark period of five days. Afterwards they got a day/night regime (12h light/12h dark) that was shifted six to seven hours relative to the original regime during 14 days. The bud drop after the dark period was followed to estimate the sensitivity to bud drop of the four hybrids. The photosynthesis, transpiration and chlorofyll fluorescence measurements on the leaves and flower stalks were linked to the observed bud drop. The observed bud drop proved that all hybrids were sensitive to bud drop after a dark period of five days. Only buds smaller than 2,0 cm fell off. Since there is no uniform method available to determine the degree of bud drop sensitivity, a few recommendations were proposed. The bud drop is best expressed as a percentage of the original amount of buds. Moreover, it is important that the bud drop is determined as an average per hybrid. Also the grower has to make a choice between only taking the great buds (commercially more important) or all buds into account to determine bud drop sensitivity. An additional aspect of this experiment was the proposal of a quick screening method to verify the sensitivity of a hybrid to bud drop. The maximum quantum efficiency of PS II photochemistry in the light adapted state (Fv’/Fm’) and the non-photochemical quenching (NPQ) in the dark during the recovery period seemed to be adequate parameters. A significantly lower Fv’/Fm’ and higher NPQ indicated more bud drop sensitive hybrids. The cause of bud abortion could be deduced by linking the fluorescence, photosynthesis and transpiration measurements with the bud drop. A prolonged dark period creates stress at the level of PS II in the leaves causing the plants to produce stress hormones such as ethylene. However, 1-ACC (the precursor of ethylene) can’t be converted in ethylene because the lack of oxygen. The light-dependent reactions, which provide oxygen, can’t take place. In addition, the stomata in the leaves are closed so no exogenous oxygen is taken in. Bud drop sensitive hybrids encounter more stress at the level of PS II and thus produce more 1-ACC. Through the transpiration 1-ACC can be transported to the flowers and buds. The leaves of the bud drop sensitive hybrids transpirate less during the dark period resulting in a greater transport of 1-ACC to the flowers and buds. When the orchids are exposed to light again, 1-ACC could be v

converted into ethylene in the buds which induces bud drop. The more bud drop sensitive hybrids will have a greater bud drop because of the larger concentration 1-ACC in the buds.

vi

INHOUDSOPGAVE Hoofdstuk 1 Probleemstelling en doel van het onderzoek 1.1. Probleemstelling ........................................................................................................... 1 1.2. Klimaatcondities als stressfactoren tijdens Phalaenopsis transport ............................. 1 1.3. Bloemeigenschappen van Phalaenopsis relevant voor knopval .................................. 2 1.4. Ethyleen induceert bloemen knopval ......................................................................... 3 1.5. Voorkomen van bloemen knopval met 1-MCP ......................................................... 4 1.6. Hypothese en doel van het onderzoek .......................................................................... 5 Hoofdstuk 2 Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus 2.1. Economisch belang van orchideeën en Phalaenopsis .................................................. 7 2.2. Het geslacht Phalaenopsis............................................................................................ 8 2.2.1 Historiek, herkomst en anatomie van orchideeën .................................................... 8 2.2.2 Teelt ....................................................................................................................... 10 2.3. Crassulacean Acid Metabolism .................................................................................. 12 2.3.1 Wat is CAM? ......................................................................................................... 13 2.3.2 Vier fasen ............................................................................................................... 13 2.3.3 Invloed van omgevingsfactoren op de CAM cyclus en bloemontwikkeling ......... 15 Hoofdstuk 3 Materiaal en methoden 3.1. Plantmateriaal ............................................................................................................. 19 3.2. Proefopzet ................................................................................................................... 19 3.3. Bloemen en knoppen .................................................................................................. 20 3.4. Microklimaat .............................................................................................................. 20 3.5. Continue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling .................................................. 20 3.5.1 Meetprincipe .......................................................................................................... 22 3.5.2 Kalibratie ............................................................................................................... 23 3.6. Discontinue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling ............................................. 24 3.7. Chlorofyl-a fluorescentieparameters .......................................................................... 25 3.7.1 Theoretische achtergrond ...................................................................................... 26 3.8. Statistische analyse ..................................................................................................... 30 Hoofdstuk 4 Resultaten 4.1. Microklimaat .............................................................................................................. 31 4.2. Knopval ...................................................................................................................... 32 4.3. Fluorescentieparameters ............................................................................................. 33 4.4. Fotosynthese en transpiratie ....................................................................................... 37 4.4.1 Bladeren ................................................................................................................. 37 4.4.2 Bloemstengels ........................................................................................................ 40 Hoofdstuk 5 Discussie 5.1. Definitie knopvalgevoeligheid ................................................................................... 43 5.2. Fluorescentieparameters als screeningparameters ...................................................... 44 5.2.1 Hogere efficiëntie van PS II en grote flexibiliteit als reactie op donkerstress ...... 44 5.2.2 Dalende efficiëntie van PS II wanneer de donkerperiode vorderde ...................... 46 5.2.3 Sommige fluorescentieparameters zijn gerelateerd aan de knopvalgevoeligheid . 46 5.3. De rol van fotosynthese en transpiratie bij verhoogde knopval na donkerstress ....... 47 5.3.1 Bladeren ................................................................................................................. 47 5.3.2 Bloemstengels ........................................................................................................ 48 5.3.3 Link met knopval ................................................................................................... 48 Hoofdstuk 6 Conclusies en perspectieven 6.1. Algemene besluiten .................................................................................................... 51 6.2. Suggesties voor verder onderzoek .............................................................................. 53 Hoofdstuk 7 Referenties vii

LIJST VAN AFKORTINGEN 1-ACC A AdoMet AOA ATP AVG CAM CITES D DACP DOY E ETR F F’ Fm Fm’ F0 F0’ Fv Fv’ Fv/Fm Fv’/Fm’ Fq’ Fq’/Fm’ IR LHC 1-MCP MM NADPH NUE NPQ P PAR PEP PEPC Pn PPFD PS I PS II

1-aminocyclopropaan-1-carbonzuur Bladoppervlakte S-adenosyl-L-methionine ACC synthase inhibitor aminooxy azijnzuur Adenosinetrifosfaat Aminoethoxyvinylglycine Crassulacean Acid Metabolism ‘The Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora’ Luchtdebiet Diazocyclopropeen ‘Day Of the Year’ Netto H20 uitwisselingssnelheid Elektronentransportsnelheid ‘Steady-state’ fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase ‘Steady-state’ fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase Maximaal fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase Maximaal fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase Minimaal fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase Minimaal fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase Variabel fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase Variabel fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de donkergeadapteerde fase Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de lichtgeadapteerde fase Verschil in fluorescentie tussen Fm’ en F’ Actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II Infraroodstraling ‘Light harvesting complex’ 1-methylcyclopropeen Molaire massa Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (gereduceerde vorm) ‘Nitrogen Use Efficiency’ Niet-fotochemische quenching Druk Fotosynthetisch actieve straling Fosfoenolpyruvaat Fosfoenolpyruvaat-carboxylase Netto CO2 uitwisselingssnelheid ‘Fotosynthetic Photon Flux Density’ Fotosysteem I Fotosysteem II ix

QA qP R RH Rubisco STS T VPD WUE

Primaire elektronenacceptor van PS II Fotochemische quenching Universele gasconstante Relatieve luchtvochtigheid Ribulose-1,5-bifosfaat carboxylase/oxygenase Zilverthiosulfaat Temperatuur Waterdampdrukdeficiet ‘Water use efficiency’

x

Hoofdstuk 1

Probleemstelling en doel van het onderzoek


In dit hoofdstuk wordt de probleemstelling en het doel van deze masterthesis beschreven, samen met de hieromtrent relevante literatuur. Voor lezers die niet gespecialiseerd zijn in orchideeën en hun fotosynthese mechanisme wordt verwezen naar het volgende hoofdstuk waar het Crassulacean Acid Metabolism (CAM) en de algemene eigenschappen van orchideeën worden beschreven.

1.1. Probleemstelling Phalaenopsis orchideeën zijn één van de belangrijkste sierplanten van deze eeuw. Daarom wordt er veel belangstelling gehecht aan de optimalisatie van het productieproces. Phalaenopsis orchideeën worden geïmporteerd in onze streken om het assortiment uit te breiden en om de hoge energiekosten, vereist voor de teelt, te drukken. Dit nationaal tot intercontinentaal transport gebeurt tijdens de verschillende stadia van de teelt. Bijvoorbeeld, de cultivarontwikkeling vindt plaats in de VS, de geselecteerde klonen worden vervolgens via weefselcultuur gekweekt in Japan, waarna massaproliferatie van de weefselculturen gebeurt in China. Ten slotte worden de niet-bloeiende planten opgegroeid in Europa (vb. Nederland en België) (Griesbach, 2002). Na opkweek worden ze getransporteerd naar binnen- en buitenlandse bedrijven voor verdere groei en verkoop. Tijdens het transport, dat vaak langer dan drie dagen duurt, bevinden de planten zich in suboptimale condities: ze worden continu in het donker gehouden, geschud en blootgesteld aan variërende temperaturen. Uit de praktijk blijkt dat deze transportcondities voor bepaalde hybriden knopval induceren. Het wordt geschat dat ongeveer vier à vijf procent van de verhandelde Phalaenopsis planten knopval vertoont (persoonlijke communicatie met veiling Aalsmeer). Deze knopval is een groot probleem voor de orchideeënkwekerijen omdat ze de kwaliteit en de commerciële waarde van de planten negatief beïnvloedt. De planten worden namelijk tweede keuze op de veiling vanals er één knop is afgevallen. Het verlies voor de sector wordt geraamd op 10 miljoen euro per jaar (persoonlijke communicatie met V. Lamote, Microflor). In de literatuur is echter weinig beschreven over de oorzaken van deze knopval.

1.2. Klimaatcondities als stressfactoren tijdens Phalaenopsis transport Zolang slechts één klimaatfactor limiterend is tijdens het transport van Phalaenopsis zal geen fotosynthetische stress worden geïnduceerd (Su et al., 2001). Een combinatie van verschillende limiterende factoren (dehydratatie en donkerbehandeling) leidt echter wel tot een sterke onderdrukking van de fotosynthetische activiteit. Hierdoor verloopt het donkertransport best bij een relatief lage temperatuur en een hoge relatieve luchtvochtigheid (RH). Zo kunnen de Phalaenopsis planten hun waterinhoud en fotosynthetische activiteit behouden. Meer specifiek wordt Phalaenopsis het best getransporteerd bij 25°C tijdens de zomerperiode en tussen de 25°C en 15°C vanaf de late herfst tot de vroege lente (Wang, 2007). Hogere temperaturen induceren namelijk gewichtsverlies (warmte stress), terwijl lagere temperaturen de kiltegevoeligheid (vlekken op het blad) vergroten. Het tijdstip van scheutvorming werd tijdens een donkertransport van 14 dagen niet beïnvloed wanneer Phalaenopsis planten werden opgeslagen bij een temperatuur tussen 15 en 25°C, maar bij 30°C werd de scheutgroei echter wel vijf tot acht dagen vertraagd (Wang, 2007). Het 1


transport gebeurt ook best met een potmedium, aangezien de opslag van Phalaenopsis zonder potmedium resulteert in meer vergeelde bladeren en een groter waterverlies (Hou et al., 2010). Na het transport wordt een acclimatisatieperiode van zes tot negen dagen aangeraden om de fotosynthetische activiteit te verhogen (Hou et al., 2010). Tijdens deze periode wordt aangeraden het lichtniveau gradueel te doen stijgen van 34 tot 200 μmol m-2 s-1 ‘Photosynthetic Photon Flux Density’ (PPFD) of een constant lichtniveau van 140 μmol m-2 s1 PPFD te behouden.

1.3. Bloemeigenschappen van Phalaenopsis relevant voor knopval Fotosynthese kan plaatsvinden in de bloemen van Phalaenopsis planten. Hierdoor kunnen de bloemen groeien met zelf geproduceerde assimilaten (Aschan & Pfanz, 2003). De chlorofylinhoud van orchideeënbloemen bedraagt ongeveer 10% van de bladeren (Goh, 1983). De fotosynthesesnelheden van de bloemen zijn afhankelijk van het ontwikkelingsstadium en de bloemstructuur. Bijvoorbeeld, bij de Dendrobium soort daalt het gebruik van de fotosynthetische stralingsenergie met de leeftijd van de bloemen (Aschan & Pfanz, 2003) en bij Cymbidium orchideeën is de CO2 fixatie het hoogst in de kelkbladeren, lager in de kroonbladeren en het laagst in het vruchtbeginsel (Dueker & Arditti, 1968). Een groot voordeel van de bloemfotosynthese is de gunstige positie voor licht. Tijdens het knopstadium zijn de kelk- en kroonbladeren namelijk de buitenste, bedekkende delen van de reproductieve delen. Hierdoor wordt de efficiëntie van het gebruik van de stralingsenergie gemaximaliseerd waardoor een hogere koolstofassimilatie kan plaatsvinden (Dueker & Arditti, 1968). Bij Cymbidium bloemen wordt er in het licht meer CO2 gefixeerd dan in het donker, maar het fotosynthese mechanisme in de bloemen kan bij sommige orchideeënsoorten ook een zwak CAM metabolisme vertonen (Dueker & Arditti, 1968; Endo & Ikusima, 1989, 1992; Goh, 1983). De zuurfluctuaties die typisch zijn voor het CAM metabolisme werden in de bloemen van sommige orchideeënsoorten (Arachnis, Aranda, Dendrobium en Vanda hybriden) waargenomen (Goh, 1983). Deze fluctuaties waren kleiner maar vergelijkbaar met die in de bladeren. De epidermale laag van de kroonbladeren bevat stomata langswaar de CO2 uitwisseling, nodig voor fotosynthese, plaatsvindt. De stomatale densiteit in de bloemen is vaak kleiner dan in de bladeren (Aschan & Pfanz, 2003). De stomatale densiteit is het aantal stomata per oppervlakte-eenheid en geeft een indicatie van de fotosynthetische capaciteit. Een hoge densiteit geeft aanleiding tot efficiënte CO2 uitwisseling tussen de plant en de atmosfeer. De stomatale geleidbaarheid geeft aan in welke mate de stomata geopend zijn, bij een hoge geleidbaarheid zijn ze open. De bloemstomata van orchideeën blijken niet-functioneel, aangezien de stomatale geleidbaarheid en transpiratie niet wordt beïnvloed door veranderingen in CO2 concentratie, stralingsintensiteit, RH en abscissinezuur. Een continue CO2 uitwisseling tijdens de dag en nacht is waargenomen en vereist bijgevolg een permanente of op zijn minst partiële stomatale opening (Hew et al., 1980). Algemeen, zijn de bestaande studies over CO2 uitwisseling bij Phalaenopsis (Lin & Hsu, 2004; Guo & Lee, 2006; Ichihashi et al., 2008; Shin et al., 2009; Hou et al., 2010; Pollet et al., 2010, 2011) bijna altijd gericht op de bladeren en is bijgevolg de bestaande data over fotosynthese bij stengels, bloemen of knoppen zeldzaam. Ook de transpiratie van bladeren, bloemen, knoppen en stengels bij Phalaenopsis is nagenoeg onbeschreven in de literatuur. 2


Licht heeft een sterk effect op de bloei van Phalaenopsis. Hoge lichtintensiteiten (12% van het zonlicht, ongeveer 276 µmol m-2 s-1) leiden bij Phalaenopsis tot vroegere bloei en meer, grotere bloemen (Konow & Wang, 2001). Waarschijnlijk leidt een verhoogde fotosynthese tot hogere suikerconcentraties en grotere groeisnelheden. De blootstelling van Phalaenopsis hybriden (TAM Butterfly) aan lage lichtintensiteiten (zoals tijdens het transport) leidt tot bloeivertraging (Wang, 1998). De donkeropslag, onafhankelijk van de temperatuur en de tijd, resulteert steeds in minder bloemen, maar beïnvloedt de grootte van de bloemen niet (Wang, 2007). De donkerperiode kan ook het aantal zijtakken en het aantal bloemen op de primaire stengel doen dalen (Hou et al., 2010).

1.4. Ethyleen induceert bloemen knopval Ethyleen speelt een sleutelrol in het reguleren van de biochemische en anatomische veranderingen die het verouderen van de orchideebloemen induceren (Woltering & van Doorn, 1988; Nadeau et al., 1993; Ketsa & Thampitakorn, 1995). Het plantenhormoon ethyleen is een algemene groeiregulator die verschillende ontwikkelingsprocessen in de plant beïnvloedt, zoals het rijpen van vruchten, veroudering en reactie op stress. Onder normale omstandigheden produceren planten slechts zeer weinig ethyleen (Klee et al., 1991; Woltering & Westra, 2010). Ethyleenbiosynthese wordt gestimuleerd door verschillende factoren zoals ontwikkelingsstadium, omgevingscondities, andere planthormonen en fysische/chemische stress. Ethyleenbiosynthese varieert ook in een circadiaans patroon, hoger gedurende de dag en minimaal ’s nachts. De biosynthese van ethyleen in planten verloopt als volgt (Figuur 1.1). L-methionine wordt geactiveerd door adenosinetrifosfaat (ATP) tot S-adenosyl-L-methionine (AdoMet). AdoMet wordt vervolgens omgezet in 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuur (1ACC) via het enzym ACC-synthase. De concentratie van dit enzym wordt gecontroleerd door omgevings- en interne factoren zoals verwondingen, koudestress, droogtestress, overstromingen, vruchtrijping, bloemveroudering en auxine. Tot slot wordt 1-ACC met behulp van het enzym ACC-oxidase, dat zuurstof vereist, omgezet naar ethyleen. Niet al het 1-ACC wordt omgezet naar ethyleen, een deel kan ook omgezet worden naar een geconjugeerde vorm: N-malonyl ACC. De conjugatie van 1-ACC kan een belangrijke rol spelen in de controle van ethyleenbiosynthese. Methionine wordt gerecycleerd via de Yang cyclus (Taiz & Zeiger, 2006). Meer specifiek, wordt in orchideeën de veroudering van de bloem ingezet door een stijging in ethyleenproductie en 1-ACC oxidase activiteit, wat autokatalytische productie van ethyleen suggereert (Mapeli et al., 2009). Bloemknoppen blijken hogere ethyleenconcentraties te produceren dan open bloemen (Ketsa & Thampitakorn, 1995). De bloemen en knoppen van orchideeën blijken ook gevoelig te zijn aan exogeen ethyleen (Raffeiner, 2009; Sun et al., 2009). Wanneer exogeen ethyleen werd toegediend aan Oncidium en Odontoglossum planten, openden enkel de volledig ontwikkelde knoppen en stagneerde de ontwikkeling van onvolgroeide knoppen die vervolgens afvielen (Raffeiner et al., 2009). Bij mini Phalaenopsis planten induceert exogeen ethyleen knopval. De ethyleengevoeligheid verschilt echter wel volgens cultivar (Sun et al., 2009). De knopval zou te wijten zijn aan beschadiging en veroudering van de kroonbladeren, geïnduceerd door ethyleen. Zelfs zeer lage ethyleenconcentraties van 0,1 ppm kunnen binnen enkele dagen bloemen knopval veroorzaken (Runkle et al., 2005d). Het mechanisme dat de invloed van ethyleen op knoppen 3


en bloemen bij Phalaenopsis orchideeën drijft, is momenteel nog niet achterhaald. Eveneens wordt de link tussen donkertransport en knopval in de literatuur nagenoeg niet bestudeerd.

Figuur 1.1 - Ethyleenbiosynthese en Yang cyclus. Methionine is de precursor van ethyleen. De snelheidsbepalende stap is de omzetting van S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) naar 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuur (1-ACC) met behulp van het enzym ACC-synthase. De omzetting van 1-ACC naar ethyleen wordt gekatalyseerd door het enzym ACC-oxidase, dat zuurstof vereist. De CH3-S groep van methionine wordt gerecycleerd via de Yang cyclus zodat continue synthese wordt verzekerd. 1-ACC kan ook geconjugeerd worden tot N-malonyl ACC. AOA = ACC synthase inhibitor aminooxy azijnzuur; STS = zilverthiosulfaat; AVG = aminoethoxyvinylglycine; DACP = diazocyclopropeen (aangepast uit: Taiz & Zeiger, 2006).

1.5. Voorkomen van bloemen knopval met 1-MCP Het verwelken/afvallen van bloemen en knoppen bij orchideeën wordt momenteel verhinderd door gebruik te maken van de goed gekende ethyleenbiosynthese (Figuur 1.1) en van ethyleeninhibitoren zoals zilverthiosulfaat (STS), diazocyclopropeen (DACP), aminoethoxyvinylglycine (AVG) of ACC synthase inhibitor aminooxy azijnzuur (AOA) (Taiz & Zeiger, 2006; Raffeiner et al., 2009). DACP en AOA zijn minder efficiënte inhibitoren dan STS, maar STS brengt milieurisico’s met zich mee en is bijgevolg in vele landen verboden. Recent werd het niet-toxische gas 1-methylcyclopropeen (1-MCP) geïntroduceerd dat het effect van ethyleen kan tegengaan (Raffeiner et al., 2009). Behandelingen met 1-MCP vinden plaats in een afgesloten ruimte en duren een aantal uren (Woltering & Westra, 2010). 1-MCP zou binden met de ethyleenreceptor waardoor het reeds bij lage concentraties zeer specifiek en actief is. Het succes van de 1-MCP behandeling is afhankelijk van het genotype, de concentratie 1-MCP, de blootstellingstijd, de temperatuur en het ontwikkelingsstadium van de plant (Raffeiner et al., 2009). Fumigatie van Phalaenopsis met 1-MCP (0,2 ppm) voor 6 uur bij 25°C beschermt de bloemen voor ethyleenconcentraties tot 10 ppm. De periode van bescherming is echter kort (zeven dagen bij 25°C) en daalt bij hogere temperaturen (Runkle et 4


al., 2005d). De effecten van ethyleen en 1-MCP op veroudering van de bloemen van de genera Oncidium en Odontoglossum werden onderzocht door Raffeiner et al. (2009). 1-MCP verlengde de houdbaarheid van de bloemen en voorkwam knopval bij Oncidium en Odontoglossum. Drie tot zeven dagen na de behandeling met 1-MCP eindigde de bescherming. 1-MCP verminderde ook de ethyleengeïnduceerde knopval bij mini Phalaenopsis, cultivar Sogo ‘Yenlin’. Voorbehandeling met 1-MCP zou de ethyleengeïnduceerde stijging van abscissinezuur in de bloemknoppen verhinderen (Uthaichay et al., 2007) en zou de ACC-synthase activiteit in open bloemen en ACC-oxidase activiteit in de bloemknoppen verlagen.

1.6. Hypothese en doel van het onderzoek Vanwege de vele vragen omtrent de negatieve invloed van donkertransport bij Phalaenopsis, spitst deze masterthesis zich toe op de link tussen knopval en donkerstress bij Phalaenopsis. Er zal nagegaan worden of knopval na donkerstress, gepaard gaande met een tijdsverschuiving ten gevolge van transport, kan verklaard worden door de volgende hypothese. Tijdens een lange donkerperiode valt de fotosynthese stil in de bladeren. Door de afwezigheid van licht wordt er geen ATP geproduceerd waardoor CO2 niet kan worden ingebouwd in suikers tijdens de Calvincyclus. Deze geremde Calvincyclus doet de productie van fosfoenolpyruvaat (PEP) stilvallen. Aangezien PEP bindt met de opgenomen CO2 uit de lucht, doet een PEP tekort de interne CO2 concentratie stijgen waardoor de stomata sluiten en de CO2 opname wordt beperkt. Een lichtperiode is bijgevolg noodzakelijk om de stomata ’s nachts te openen (Klunge & Ting, 1978). Bij een langere donkerperiode vindt er dus geen fotosynthese plaats. Hierdoor treedt er een tekort op aan zuurstof en hoopt 1-ACC op in de bladeren en/of wortels omdat het niet kan worden omgezet naar ethyleen. Wanneer de planten vervolgens terug in het licht worden geplaatst, beginnen de bloemen meer te transpireren en vindt er een opwaartse beweging plaats van 1-ACC vanuit de bladeren naar de bloemknoppen. Aangezien er op dat ogenblik wel voldoende zuurstof is, wordt 1-ACC massaal omgezet naar ethyleen in de knoppen waardoor ze verkleuren en afvallen. Om deze hypothese te verifiëren, zal tijdens een donkerperiode van één week en een herstelperiode van 14 dagen de fotosynthese, chlorofylfluorescentie en transpiratie van bladeren en bloemstengels worden opgemeten. De verschillende variabelen zullen gerelateerd worden aan de geobserveerde knopval. De waargenomen relaties zullen besproken worden in het kader van de vooropgestelde hypothese.

5

Hoofdstuk 2

Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus


In dit hoofdstuk wordt het economisch belang, de algemene kenmerken en het fotosynthese mechanisme van Phalaenopsis besproken.

2.1. Economisch belang van orchideeën en Phalaenopsis Orchideeën behoren wereldwijd tot één van de grootste segmenten van de sierteelt. De meeste ochideeën worden gekweekt voor hun prachtige bloemen. Ze worden globaal vermarkt als potplanten, snijbloemen en zelfs als perkplanten in tropische regio’s. Grootschalige orchideeënproductie vindt plaats in China, Duitsland, Japan, Nederland, Taiwan, Thailand en de Verenigde Staten (Lopez & Runkle, 2005; Cha-um et al., 2010). De orchideeënteelt is de laatste 25 jaar sterk in opmars. In Nederland is van 1983 tot 2009 het aantal verkochte orchideeën op veilingen gestegen van 50000 naar 96,4 miljoen potten. De veilingopbrengst bedroeg in 2009 meer dan 331,5 miljoen euro, bijna het tiendubbele dan in 2000. In de VS is de productiewaarde van orchideeën van 1996 tot 2004 gestegen met 170%. In 2009 werd de groothandelswaarde geschat op 159,6 miljoen dollar. Dit cijfer berust enkel op de omzet van de grootste commerciële bedrijven en is dus zelfs een onderschatting. Vandaag zijn orchideeën (waarvan 70 tot 90% Phalaenopsis) de tweede meest waardevolle potplant in de VS (Griesbach, 2002; Lopez & Runkle, 2005; Ronse, 2008; Vakblad voor de Bloemisterij, 2005, 2010). Phalaenopsis domineert de orchideeënmarkt om verschillende redenen. De bloemen hebben een lange levensduur en een brede waaier aan kleuren. Ze zijn ook gemakkelijk te verzorgen en het is mogelijk om de bloei te plannen (Runkle et al., 2005a). Na een explosieve groei in de Phalaenopsis teelt, volgden er echter enkele moeilijke jaren. In 2008 was er een overschot op de aanbodmarkt waardoor de prijzen sterk daalden, hierdoor raakten vele kwekers in de problemen. In 2009 bereikte de prijs een dieptepunt. In 2010 zorgde vooral het positieve voorjaar voor een stijging van de gemiddelde jaarprijs. Om te kunnen overleven, trachten de bedrijven de kostprijs zo laag mogelijk te houden. Een groot deel van de kwekers teelt daarom Phalaenopsis in kragen en kokers. Deze zorgen ervoor dat het blad zich omhoog ontwikkelt in plaats van opzij waardoor er meer planten op een vierkante meter kunnen staan. Ook wordt gezocht naar rassen met een kortere teeltduur, beter gebruik van energie en verdergaande automatisering. Een ander gevolg van het instorten van de Phalaenopsis markt was een omslag in het assortiment. Er ontstond een spreiding van potmaten, een toename van meertakkers en een breder assortiment van bijzondere kleuren en vormen (Vakblad voor de Bloemisterij, 2011). Het grote economische belang van orchideeën en meer specifiek van Phalaenopsis ligt aan de basis van dit onderzoek. De orchideeënkwekers willen hun productieproces continu optimaliseren. De nodige kennis over de invloed van verschillende milieufactoren op de groei en ontwikkeling van Phalaenopsis halen ze uit wetenschappelijk onderzoek.

7


2.2. Het geslacht Phalaenopsis 2.2.1 Historiek, herkomst en anatomie van orchideeën Orchideeën werden in China al beschreven in meer dan drieduizend jaar oude boeken over kruidengeneeskunde. Naast hun medicinale eigenschappen stonden ze symbool voor elegantie, verfijning, nobelheid, zuiverheid en spirituele volmaaktheid. De eerste vermelding van orchideeën in de Westerse geschiedenis gebeurde door de Griekse filosoof Theophrastus (370 tot 285 voor Christus). Hij schreef over ‘Orkhis’, het Griekse woord voor teelbal. Deze benaming verwijst naar de twee olijfvormige knollen waarvan de ene glad en hard en de andere verschrompeld en zachter is. Ondertussen is geweten dat de harde knol overeenkomt met de knol die tijdens het lopende jaar gevormd is en de zachtere knol met die van het jaar ervoor. Deze knollen bevatten reservevoedsel voor de plant. Hoewel slechts een kleine minderheid binnen de orchideeënfamilie deze bolvormige wortels bezitten, hebben de soorten van het genus Orchis hun naam gegeven aan de volledige orchideeënfamilie, de Orchidaceae (Ronse, 2008). Vandaag vormen de orchideeën na de samengesteldbloemigen (Asteraceae) de tweede grootste plantenfamilie ter wereld (Runkle et al., 2005a; Ronse, 2008). De orchideeënfamilie bevat meer dan 25000 beschreven soorten, verdeeld in 859 genera en vijf subfamilies: Apostasioideae, Cypripedioideae, Vanilloideae, Orchidoideae en Epidendroideae (Pollet, 2010). Orchideeën zijn niet alleen bijzonder omdat er zo veel verschillende soorten bestaan, ze vallen ook op door hun grote variatie. In geen enkele andere plantenfamilie vind je zoveel diversiteit qua kleur, geur, vorm en afmetingen (Ronse, 2008). Ondanks de grote diversiteit aan orchideeën worden slechts een aantal genera in grote hoeveelheden commercieel geteeld. De belangrijkste zijn Cymbidium, Dendrobium, Oncidium en Phalaenopsis (Pollet, 2010). In deze thesis ligt de focus op het genus Phalaenopsis, de populairste kamerplant van Europa (Ronse, 2008). In Nederland bijvoorbeeld behoort 75-80% van alle geproduceerde orchideeën tot het genus Phalaenopsis (Oudshoorn, 2007). Sinds de jaren ’80 worden Phalaenopsisplanten in Europa te koop aangeboden als bloeiende potplanten (Ronse, 2008). Volgens Oudshoorn (2007) is de term Phalaenopsis-groep eigenlijk geschikter, want naast Phalaenopsis zelf hebben ook andere geslachten een rol gespeeld bij de talrijke kruisingen. Het succes van Phalaenopsis als kamerplant is te danken aan zijn bloemen die bijna het hele jaar door kunnen bloeien. De afzonderlijke bloemen blijven meerdere maanden goed en als een bloemstengel uitgebloeid is, kan deze aan de basis terug uitschieten en verder bloeien. De naam Phalaenopsis is samengesteld uit het Griekse phalaina, dat ‘nachtvlinder’ betekent, en opsis, wat ‘gelijkend op’ wil zeggen. De naam Phalaenopsis betekent dus letterlijk ‘gelijkend op een nachtvlinder’ en werd aan de plant gegeven door ontdekkingsreizigers toen ze de grote, witte bloemen van Phalaenopsis in het schemerduister van het oerwoud zagen bloeien (Oudshoorn, 2007). De orchideeënfamilie heeft een zeer groot verspreidingsgebied. Ongeveer overal waar plantengroei is, komen ze voor. De standplaatsen variëren van zeeniveau tot hooggebergten, vochtige gebieden en open, droge vegetaties (Ronse, 2008). Phalaenopsis is van oorsprong uit de tropische en subtropische gebieden van de Zuid Pacifische eilanden en Azië (Runkle et al., 2005c; Wang, 2007). Hun verspreidingsgebied omvat China, Japan, Nepal, Papoe-Nieuw8


Guinea, Taiwan, de Filippijnen en tropisch Australië. De Filippijnen herbergen de grootste concentraties aan soorten en veel daarvan hebben een zeer voorname rol gespeeld bij de talloze kruisingen die zijn ontstaan (Oudshoorn, 2007; Pinske, 2009). Orchideeën kunnen in drie groepen verdeeld worden naargelang hun manier van leven. Van alle orchideeënsoorten leven 72% epifytisch, het gaat hier voornamelijk over tropische orchideeën (Silvera et al., 2009). Epifyten gebruiken bomen als steun om meer licht op te vangen en leven van het vocht en de humus op de boomtakken. Het zijn echter geen parasieten, ze beschadigen de bomen niet. De meeste orchideeën uit de gematigde streken zijn terrestrisch en wortelen dus in de grond. Sommige orchideeën bezitten geen bladgroen, maar zijn saprofyten. Dit zijn planten die leven van dood organisch materiaal (Ronse, 2008). Phalaenopsis behoort tot de epifytische orchideeën. Ze groeien dus vaak op aanzienlijke hoogte. De RH is steeds hoger dan 80% en er valt ter plekke relatief veel neerslag, die regelmatig over het jaar verdeeld is. De lichtintensiteit op de groeiplaatsen is niet erg groot, enerzijds doordat de planten door de bladeren van de bomen tegen direct zonlicht worden beschermd en anderzijds door de vele dagen waarop het bewolkt is (Oudshoorn, 2007). Dit betekent dat orchideeën zuinig moeten zijn met water en voedingsstoffen. Het water dat ze krijgen is meestal afkomstig van regen en in sommige gebieden ook van dauw of mist. Hun voedingsstoffen halen ze uit afgevallen bladeren en stof of aarde die door de wind aangevoerd worden. Vandaar dat orchideeën zeer traag groeien (Ronse, 2008). De epifytische groeiwijze houdt ook in dat de wortels worden blootgesteld aan luchtbeweging. Met deze specifieke kenmerken moet rekenening worden gehouden bij de samenstelling van het potmengsel. Verluchting, capillaire krachten, water- en nutriëntenvasthoudende capaciteit, stabiliteit en gewicht van het potmengsel zijn hierbij belangrijke parameters (Runkle et al., 2005b). Phalaenopsis orchideeën behoren tot de monopodiale orchideeën. De stammen zijn meestal slechts 30 cm lang. De bladeren zijn min of meer vlezig, meestal eivormig ovaal en 10 tot 40 cm groot. Naargelang de soort kunnen ze naar beneden hangen of zijwaarts afstaan. Bij sommige soorten zijn ze bijna succulent. De bloeiwijzen ontspruiten telkens aan de onderste bladoksels. Vaak zijn ze vertakt en afhankelijk van de soort tussen enkele centimeters en één meter lang (Pinske, 2009). Orchideeën hebben specifieke kenmerken die niet bij andere plantenfamilies voorkomen. Ze hebben maar één vruchtbare meeldraad. Meeldraad en stempel zijn soms deels, maar meestal volledig vergroeid tot een orgaan, de zogenaamde zuil of gynostemium. Bovendien vormen orchideeën talloze extreem kleine zaadjes zonder reservevoedselorgaan. Naast deze specifieke kenmerken bezitten orchideeën ook nog kenmerken die bij andere families kunnen voorkomen (Pinske, 2009). De bloemen van orchideeën zijn vrijwel altijd tweeslachtig (Oudshoorn, 2007), ze bezitten drie kelkbladen (sepalen) en drie kroonbladen (petalen). Het middelste kroonblad is afwijkend in vorm, kleur en/of afmeting en wordt de lip of labellum genoemd (Figuur 2.1). Aangezien de lip meestal dienst doet als landingsplatform voor de bestuivende insecten speelt ze een niet te onderschatten rol in de voortplanting van de orchideeën. De meeste orchideeën hebben voor de bestuiving hulp nodig van dieren, voornamelijk insecten. Deze worden gelokt door de kleur en de geur van de bloemen (Ronse, 2008).

9


Figuur 2.1 - Delen van de bloem van een orchidee

2.2.2 Teelt Phalaenopsis is de laatste decennia enorm in opkomst. Door betere vermeerderings- en kweekmethoden is het een plant geworden die door iedereen kan worden aangeschaft. Van hoge prijzen is geen sprake meer en omdat de plant lang meegaat, is hij in feite goedkoop. De kwekers voeren ze het hele jaar aan, maar de natuurlijke bloeiperiode ligt in de maanden februari, maart en april (Runkle et al., 2005; Oudshoorn, 2007). Eén van de belangrijkste stappen in het teeltproces was de uitvinding van technieken om orchideeën op grote schaal te zaaien. In het begin van de 20e eeuw ontdekten de Fransman Noël Bernard (1909) en de Duitser Burgeff (1909) onafhankelijk dat orchideeënzaden kunnen kiemen in de nabijheid van een Rhizoctoniaschimmel. Deze schimmel werd toegevoegd aan een gesteriliseerd substraat van turf waarop orchideeënzaden waren gezaaid, wat resulteerde in een goede kieming. Deze techniek liet toe om orchideeën in grote hoeveelheden te vermeerderen, iets wat voordien onmogelijk was. Waarom en hoe deze schimmel de kieming van orchideeën bevorderde, werd ontdekt door Knudson (1922). Hij verklaarde dat orchideeënzaden in de natuur alleen kiemen nadat ze geïnfecteerd zijn door deze schimmel. De schimmel geeft namelijk suikers door, wat de zaden van de nodige energie voorziet om te kiemen. Uit zichzelf hebben de zaden immers onvoldoende kiemkracht aangezien ze stoffijn zijn. Ze wegen tussen 0,3 en 14 milligram en zijn te klein om endosperm te bevatten. Het voordeel van hun kleine afmetingen is wel dat ze verspreid kunnen worden door de wind, tot over tientallen kilometers afstand. De ontdekking van Knudson liet ook toe om een meer efficiënte zaaitechniek te ontwikkelen, namelijk de ‘asymbiotische methode’. Knudson (1922) ontwikkelde een volledig synthetische voedingsbodem met suikers, minerale zouten, vitamines en andere essentiële groeistoffen. Vanaf dan werden orchideeën gezaaid in kweekbuizen op een complexe voedingsbodem. Het zaaien van orchideeën versnelde de orchideeënteelt aanzienlijk, maar voor de meeste orchideeën bleef toch vier tot zeven jaar nodig om uit zaad bloeiende planten te verkrijgen. Dit werd verholpen met het ontwikkelen 10


van methoden om planten te kloneren. Rond 1960 ontwikkelde de Fransman Morel (1965) een meristeemcultuur van Cymbidiums waardoor het mogelijk werd om uit een slapende knop in glazen kolven of proefbuizen duizenden planten op te kweken die identiek zijn aan de ouderplant. Deze weefselcultuur kon echter niet worden toegepast bij Phalaenopsis omdat er te veel genetische variatie ontstond. In die tijd werd Phalaenopsis dus vooral uit zaad voortgeplant. Momenteel zijn er wel specifieke protocols opgesteld voor de weefselcultuur van Phalaenopsis. Deze methoden zijn over het algemeen succesvol, maar kunnen niet gebruikt worden voor alle cultivars omdat er soms toch te veel variatie ontstaat (Griesbach, 2002; Ronse, 2008). Meristeemcultuur, ook wel weefselkweek genoemd gaat als volgt te werk. Onder de microscoop wordt uit het groeipunt van de plant, meestal van een nieuwe scheut, een heel klein stukje weefsel gehaald. Dit klein stukje weefsel wordt in flesjes of buisjes gedaan met een voedingsoplossing. Om de celdeling te bevorderen worden de flesjes geschud of gedraaid. Hierdoor raken de delende cellen gedesoriënteerd en blijven ze zich delen. De cellen vormen klompjes ongedifferentieerd weefsel, het zogenaamde protocorm. De belichting is intensief en er wordt een dagen nachtritme aangehouden van telkens 12 uur. De temperatuur varieert van 20 tot 29°C, afhankelijk van de soort. Per protocorm worden er meestal een paar duizend plantjes gemaakt. Om scheut- en later ook wortelvorming te krijgen, worden de protocormen op een vaste voedingsbodem gezet. Er zijn na ongeveer anderhalf jaar jonge plantjes voorradig die in orchideeëngrond groeien en aan hun taak kunnen beginnen om bloemstengels te vormen (Oudshoorn, 2007). Sommige Phalaenopsis worden gekweekt vanuit zaad, maar door de stijgende vraag naar uniformiteit is de massamarkt van Phalaenopsis vooral gebaseerd op deze meristeemcultuur. Het kloneringsproces vermindert namelijk de variabiliteit tussen de planten, zodat populaties dezelfde groeien bloeikarakteristieken hebben (Runkle et al., 2005a). Vermeerdering via protocormen geeft echter meer risico op mutaties. Daarom wordt in de meeste laboratoria de ‘shoot-by-shoot methode’ gebruikt (persoonlijke communicatie met V. Lamote, Microflor). Hierbij wordt vertrokken van een scheut die op een vermeerderingsmedium één of meerdere zijscheuten vormt. Deze kunnen vervolgens worden afgesneden en terug zijscheuten vormen. De serreteelt van Phalaenopsis kan onderverdeeld worden in drie fasen: de vegetatieve groei, de koelingsfase en de afwerkingsfase. Elke fase vereist verschillende omgevingsomstandigheden, voornamelijk qua temperatuur en licht (Tabel 2.1). In hun natuurlijke habitat heersen er tropische condities gedurende het hele jaar met dagtemperaturen tussen de 28 en 35°C en nachttemperaturen tussen de 20 en 24°C. Aangezien epifytische orchideeën zoals Phalaenopsis groeien op boomstammen en –takken worden ze beschaduwd door het dense kruinendak. Daarom vereist succesvolle commerciële productie warme en beschaduwde omgevingen, zeker gedurende de vegetatieve groei (Runkle et al., 2005c). De vegetatieve groei vereist gemiddeld een dagelijkse temperatuur tussen 28 en 32°C om bladproductie te stimuleren en bloei initiatie te verhinderen. Warme dagen koude nachttemperaturen zijn bevorderlijk voor de reproductieve ontwikkeling. Fotosynthese verzadigt bij een PPFD van 180 µmol fotonen m-2 s-1, dus deze relatief lage lichtintensiteit volstaat. De vegetatieve groei duurt 22 tot 27 weken, afhankelijk van de gerealiseerde temperatuur, de initiële bladbreedte en de gewenste plantgrootte voor het induceren van de bloei (Lopez & Runkle, 2004; Runkle et al., 2005a). Wanneer de planten vier tot zes bladeren 11


hebben en een minimum bladbreedte van 25 cm, wordt de koelingsfase gestart om bloei te induceren. Gedurende vier tot zes weken worden de planten gekoeld bij temperaturen van 17 tot 25°C en de lichtintensiteit wordt gereduceerd tot 60 à 160 µmol m-2 s-1 PPFD. Deze relatief koude temperaturen en lage lichtintensiteiten vertragen de bladontwikkeling en kunnen bloei in jonge planten induceren. Lage temperaturen zijn noodzakelijk voor de accumulatie van cytokinine en gibberelline (plantenhormonen betrokken bij de celgroei) en de verbetering van fotosynthese dat leidt tot verzameling van suikers. Dit resulteert in de initiatie van bloemknoppen en de verlenging van de stengel (Lopez & Runkle, 2004; Runkle et al., 2005a; Cha-um et al., 2010). De periode van de verschijning van de scheut tot de scheutontwikkeling en bloei wordt de afwerkingsfase genoemd. De temperatuur varieert dan best van 17°C tot 26°C, terwijl de lichtintensiteit gelijkaardig is aan die van de vegetatieve groei. De gemiddelde dagelijkse temperatuur controleert de ontwikkelingssnelheid van de scheut, waardoor de temperatuur kan aangepast worden aan een specifieke verkoopdatum. Deze fase duurt acht tot twaalf weken. De planten zijn klaar voor verkoop wanneer ze minstens één of twee open bloemen hebben. Op dat ogenblik worden ze verpakt voor transport (Lopez & Runkle, 2004; Runkle et al., 2005a). Tabel 2.1 - Overzicht van de duur, temperatuur en lichtintensiteit tijdens de vegetatieve groei, koelingsfase en afwerkingsfase in het kweekproces van Phalaenopsis.

Vegetatieve groei Koelingsfase Afwerkingsfase 22-27 4-6 8-12

Duur (weken) Temperatuur (°C) -2

-1

Lichtintensiteit (µmol m s )

28-32

17-25

17-26

180-400

60-160

180-400

Transport van orchideeën wordt internationaal sterk gecontroleerd. ‘The Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora’ (CITES) verzekert dat de handel van wilde dieren en planten hun bestaan niet bedreigd. Wilde orchideeën mogen niet zonder toestemming verhandeld worden, enkel kunstmatig voortgeplante orchideeën. De leverancier moet een kopie van de CITES documenten bij zich hebben die aantonen dat de orchideeën kunstmatig voortgeplant zijn (Koninklijk besluit van 9 april 2003 inzake de bescherming van in het wild levende dieren plantensoorten door controle op het desbetreffende handelsverkeer). Het transport verloopt volledig in het donker. Als de planten na een aantal dagen hun bestemming bereiken, worden ze opnieuw aan licht blootgesteld. Deze blootstelling na donkerperiode veroorzaakt vaak knopabortie bij een aantal hybriden (persoonlijke communicatie met V. Lamote, Microflor).

2.3. Crassulacean Acid Metabolism Fotosynthese bij orchideeën kan volgens twee mechanismen verlopen: C3 fotosynthese of CAM. Neales & Hew (1975) vonden een sterke correlatie tussen het fotosynthesemechanisme en de bladdikte. De bladeren van orchideeën met dikke, succulente bladeren (> 1 mm) volgen meestal het CAM mechanisme, terwijl orchideeën met dunnere bladeren aan C3 fotosynthese doen. Phalaenopsis maakt gebruik van het CAM metabolisme. Omgevingsomstandigheden

12


zoals licht, CO2 en temperatuur hebben een belangrijk effect op dit fotosynthese mechanisme en worden vervolgens besproken.

2.3.1 Wat is CAM? CAM is een gespecialiseerde manier van fotosynthetische koolstofassimilatie die geëvolueerd is als respons op uitzonderlijke omgevingsomstandigheden (Borland & Taybi, 2004). CAM is namelijk een complexe adaptatie waardoor fotosynthese in de tijd gescheiden verloopt van water- en CO2 uitwisseling (Black & Osmond, 2003). Deze adapatie is mogelijk opgetreden in het Mioceen (23 tot 5 miljoen jaar geleden) als een gevolg van verminderde CO2 concentratie in de atmosfeer (Dodd et al., 2002).

2.3.2 Vier fasen Eenvoudig gesteld is CAM een fotosynthetisch systeem waarbij de enzymactiviteit van C3 en C4 carboxylases in de tijd gescheiden is. CAM wordt beschouwd als een proces bestaande uit vier fasen (Figuur 2.2). Deze fasen onderscheiden zich door de netto CO2 opname en de concentratie sleutelmetabolieten, die verantwoordelijk zijn voor koolstofvoorziening en -vraag (Dodd et al., 2002; Ceusters et al., 2011).

Figuur 2.2 - Dag/nachtpatroon van de CO2 fixatie, malaatzuur- en suikerconcentraties in een CAM plant. PEPC = Fosfoenolpyruvaat-carboxylase; RUBISCO = Ribulose-1,5-bifosfaat carboxylase/oxygenase. De donkerperiode is aangeduid door de zwarte balk (aangepast uit: Black & Osmond, 2003).

Enkel ’s nachts (Fase I), wanneer evapotranspiratiesnelheden laag zijn, zijn de stomata open en wordt bijgevolg atmosferische CO2 opgenomen. Atmosferische en eventueel gerespireerd CO2 worden enzymatisch omgezet in bicarbonaat (HCO3-), zoals te zien in Figuur 2.3. Dit HCO3- wordt vervolgens gefixeerd aan fosfoenolpyruvaat (PEP) door het C4 enzym fosfoenolpyruvaat-carboxylase (PEPC), wat resulteert in de vorming van malaat. Het enzym PEPC wordt namelijk geactiveerd tijdens de nacht door fosforylatie. PEP wordt gevormd uit suikers die geproduceerd werden tijdens de vorige dag. Het gevormde malaat (4C product) 13


wordt dan getransporteerd naar de vacuole waar het opgeslagen wordt als malaatzuur. De vacuoles van succulente weefsels kunnen meer dan 90% van het celvolume innemen. De opslagcapaciteit van de vacuole en de beschikbaarheid van suikers zijn bepalende factoren voor de capaciteit van de nachtelijke CO2 opname in CAM planten. In Figuur 2.2 wordt de toename in CO2 fixatie en malaatzuur en de afname in suikers weergegeven tijdens fase I. Bij het aanbreken van de dag (Fase II) neemt de activiteit van PEPC geleidelijk af. Dit feedbackmechanisme verhindert nutteloze cycling van CO2 tussen PEP en malaat gedurende de dag en wordt als essentieel beschouwd voor de efficiënte functionering van de CAM cyclus. Tegelijkertijd neemt de activiteit van het C3 enzym ribulose-1,5-bifosfaat carboxylase/oxygenase (Rubisco) toe. Fase II wordt dus gekarakteriseerd door PEPC gedomineerde CO2 opname, terwijl de Rubisco activiteit gelijdelijk aan stijgt. Tijdens fase II wordt vaak een piek (Figuur 2.2) in de CO2 opname waargenomen door de fixatie van CO2 door PEPC en de directe assimilatie door Rubisco. Tijdens de dag (Fase III) verlaat malaat de vacuole waarna het gedecarboxyleerd wordt in pyruvaat en CO2 (Figuur 2.3). Dit veroorzaakt een hoge interne partiële CO2 druk waardoor de stomata sluiten en fotorespiratie wordt gelimiteerd. In de chloroplast wordt CO2 vrijgesteld, geherfixeerd via Rubisco en geïncorporeerd in de Calvincyclus (sterke toename in suikers in Figuur 2.2). Op het einde van de lichtperiode (Fase IV) raakt malaatzuur uitgeput (Figuur 2.2) waardoor de interne CO2 druk daalt en de stomata heropenen. CO2 wordt opnieuw opgenomen uit de atmosfeer en wordt voornamelijk gefixeerd door Rubisco, de activiteit van PEPC stijgt opnieuw geleidelijk.

Figuur 2.3 - CAM: temporele scheiding van CO2 opname en fotosynthetische reacties (aangepast uit: Taiz & Zeiger, 2006).

Energetisch gezien verhoogt CAM de metabolische kost met 10% in vergelijking met de standaard C3 fotosynthese. Deze hogere kosten zijn te wijten aan de stockage van malaat in de vacuole en aan de dynamische suikeropslag die noodzakelijk is voor de PEP-regeneratie (Lawlor, 1993; Dodd et al., 2002; Borland & Taybi, 2004; Ogburn & Edwards, 2010; Borland 14


et al., 2011; Ceusters et al., 2011). Het competitievermogen of de trade-off tussen stresstolerantie en groei zorgt ervoor dat CAM planten een lage groeisnelheid en productiviteit hebben. Nobel et al. (1992) argumenteren echter dat de lage groeisnelheden en productiviteit niet intrinsiek zijn voor CAM planten, maar eerder het gevolg zijn van de stressvolle situaties waarin ze groeien (Ogburn & Edwards, 2010).

2.3.3 Invloed van omgevingsfactoren bloemontwikkeling

op

de

CAM

cyclus

en

De CAM fasen zijn geen vaste compartimentering, maar laten plasticiteit toe in respons op omgevingsfactoren (Dodd et al., 2002). Volgens Lüttge (2004) zijn de zes belangrijkste omgevingsfactoren die CAM beïnvloeden CO2, water, licht, temperatuur, zoutgehalte en nutriënten. Deze factoren zijn direct of indirect met elkaar verbonden waardoor een complex netwerk van interacties van omgevingsfactoren op CAM ontstaat (Figuur 2.4). De individuele impact van deze factoren op de CAM cyclus wordt hieronder kort toegelicht.

Figuur 2.4 - Netwerk van de belangrijkste omgevingsfactoren en hun effecten op CAM. T = temperatuur; hν = de energie van een foton (h = constante van Planck; ν = frequentie) (aangepast uit: Lüttge, 2004).

Licht Fotosynthetisch actieve straling (PAR) is de energiebron voor fotosynthese. Met toenemende lichtintensiteiten overdag, verhoogt de netto CO2 fixatie gedurende de volgende nacht (Kluge & Ting, 1978; Konow & Wang, 2001). Dit is te wijten aan de verhoogde suikerbiosynthese in het licht en dus een grotere beschikbaarheid aan PEP, maar ook de grotere opslagcapaciteit van de vacuole na de uitputting aan malaatzuur overdag. Een hogere lichtintensiteit resulteerde in dikkere bladeren, grotere bladoppervlaktes, vroegere bloei en meer, grotere bloemen. Waarschijnlijk leidde een verhoogde fotosynthese tot hogere suikerconcentraties en grotere groeisnelheden (Konow & Wang, 2001).

15


Volgens Kluge & Ting (1978) is er ook een lichtperiode nodig om de stomata ’s nachts te kunnen openen. De duur en maximale graad van opening zijn fluctuaties van de lengte van de lichtperiode van de vorige dag. Tijdens het transport van Phalaenopsis is er geen lichtperiode en kunnen de stomata waarschijnlijk ’s nachts niet openen. Een overmaat aan licht daarentegen, zorgt voor een overmaat aan energie en kan het fotosynthese apparaat beschadigen. Dit leidt tot foto-inhibitie, waarbij de fotosynthesesnelheid afneemt. De netto-fotosynthesesnelheid van Phalaenopsis bij 20°C satureert bij 130-180 µmol m-2 s-1 (Hou et al., 2010). Lage lichtintensiteiten hebben ook nadelige effecten op epifyten. Haslam et al. (2003) onderzochten de lange termijn effecten van acclimatisatie aan verschillende lichtregimes in de CAM epifyt Tillandsia usneoides (Bromeliaceae). De chlorofylinhoud was groter in planten geacclimatiseerd aan lagere lichtintensiteiten (PPFD van 50 µmol m-1 s-1). De actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II werd behouden bij planten geacclimatiseerd aan hoge lichtintensiteiten. De netto-fotosynthese nam toe bij acclimatisatie aan hogere lichtintensiteit, doordat de carboxylatiecapaciteit van PEPC en Rubisco toenam. Lin & Hsu (2004) bestudeerden bij Phalaenopsis amabilis de invloed van lage lichtintensiteit op de fotosynthetische capaciteit van de onderste, beschaduwde bladeren aan de hand van chlorofylfluorescentie. In dit onderzoek daalde de fotosynthetische capaciteit van de bladeren wanneer ze geacclimatiseerd zijn aan lagere lichtintensiteiten. Phalaenopsis is echter in staat om terug te reacclimatisateren aan hogere lichtintensiteiten wanneer de onderste bladeren aan meer licht worden blootgesteld. Ceusters et al. (2011) onderzochten de impact van lichtlimitatie op Aechmea ‘Maya’ (Bromeliaceae). Op korte termijn waren de planten niet tolerant aan sterke lichtlimitatie (gemiddeld 0,46 mol fotonen m-2 d-1). De afwezigheid van CO2 opname en veranderingen in de sleutelmetabolieten zoals malaat, zetmeel of opgeloste suikers, wezen op een afgezwakt metabolisme in de schaduw. Door verzuring van het cytoplasma stierven cellen af in de fotosynthetisch actieve bladeren (bruine plekken). Na een drietal maand waren de Aechmea planten geacclimatiseerd aan de extreem lage lichtniveaus. Dit was te wijten aan drie verschillende processen. Ten eerste vond er een omschakeling plaats van zetmeel naar sucrose als de belangrijkste suikerbron voor PEP-synthese. Deze verandering zorgt voor het onderhoud van het metabolisme met zo weinig mogelijk energievereisten. Ten tweede werd een relatieve toename in de ‘light harvesting complexen’ (LHC) waargenomen. Eveneens trad er een verandering op in de verschillende gasuitwisselingsfasen. In fase I was de netto CO2 opname voornamelijk te wijten aan PEPC, fase II werd ingekort en fase IV werd vertraagd met vier uur. De directe CO2 fixatie via Rubisco werd zo verwaarloosbaar klein. Skillman en Winter (1997) suggereerden dat de hoge interne partieeldruk van CO2, typisch voor fase III, resulteert in een relatief hoge activatiegraad van Rubisco, zelfs bij weinig licht. Voor de lichtgelimiteerde Aechmea planten werd dan ook een maximum quantumefficiëntie van fotosynthese waargenomen die dubbel zo hoog was als bij de controleplanten. Dus de verlenging van fase III ten koste van de overgangsfasen II en IV lijkt belangrijk te zijn voor de lange termijn acclimatisatie aan lage lichtintensiteiten.

16


Atmosferische CO2 Het is belangrijk onderscheid te maken tussen de atmosferische partieeldruk van CO2, de milieufactor sensu stricto, en de interne partieeldruk aan CO2, die sterk gerelateerd zijn met elkaar via het openen en sluiten van de stomata. De CO2 opname gebeurt via stomatale openingen in de cuticula van het blad. Speciale sluitcellen begrenzen de opening en zijn in staat om te bewegen waardoor de grootte van de porie aangepast kan worden aan de omgevingsomstandigheden (Lawlor, 1993). Bij Phalaenopsis komen er enkel stomata voor aan de abaxiale (onderzijde) van het blad en de bladeren worden daarom amfistomatisch genoemd (Steppe, 2011). Dit draagt bij tot het waterbehoud in de plant (Goh et al., 1977). Stomataal gedrag wordt gecontroleerd door de interne CO2 concentratie in de substomatale ruimten. Bij C3 planten openen de stomata overdag als respons op een verlaagde CO2 concentratie door fotosynthese. Bij CAM planten is het openen van de stomata ’s nachts te wijten aan verlaagde CO2 concentratie door de donkerfixatie. In het licht wordt de CO2 concentratie hoog gehouden door malaatdecarboxylatie en blijven de stomata dus gesloten (Kluge & Ting, 1978). Indien exogeen CO2, met dezelfde concentratie als tijdens het licht, wordt toegediend in het donker, verhoogt de stomatale weerstand (Cockburn et al., 1979). De stomatale opening verkleint dus bij hogere CO2 concentraties. Water De grootste drijvende factor voor CAM is de watervoorraad (Lüttge, 2002). Het grootste voordeel voor CAM planten is namelijk een verhoogde ‘water use efficiency’ (WUE). De WUE is de ratio van de hoeveelheid opgenomen CO2 tot de hoeveelheid waterverlies door transpiratie. Deze is hoog voor CAM planten aangezien ze in staat zijn om ’s nachts hun stomata te openen en overdag te sluiten. Hierdoor wordt veel minder water getranspireerd (Kluge & Ting, 1978). Overdag zijn de stomata van orchideeën namelijk bijna gesloten waardoor ze weinig warmte kunnen dissiperen via transpiratie. Zelfs wanneer de stomata overdag deels open zijn, hebben ze de neiging om minder te transpireren dan andere planten (Ogburn & Edwards, 2010). De WUE in CAM planten wordt ’s nachts geschat op 6-30.10-3 mol gefixeerd CO2 op mol getranspireerd H2O. Voor C3 planten is dit slechts 0,6-1,3.10-3 en voor C4 planten 1,7-2,4.10-3. De WUE varieert tijdens de verschillende CAM fasen. Zo is de WUE slechts 1-4.10-3 tijdens fase IV. Fasen II en IV zijn het meest gevoelig aan waterstress. Bij watertekort sluiten de stomata ’s morgens sneller en ’s avonds openen ze later zodat de transpiratie verminderd, maar ook de CO2 opname (Lüttge, 2002; Ceusters et al., 2009). Daarnaast beperken de dikke cuticula en lage stomatale densiteiten in het blad het waterverlies (Woerner & Martin, 1999; Ogburn & Edwards, 2010). Aangezien orchideeën slechts één keer per week water nodig hebben, treedt er normaal geen watertekort op tijdens het transport en is deze factor van minder belang. Temperatuur De temperatuur zorgt zowel voor een biochemisch als een fysisch effect bij orchideeën. Het biochemisch effect heeft te maken met de invloed van temperatuur op de verschillende enzymen. Optimale groeien bloeicondities van CAM planten vereisen relatief lage 17


nachttemperaturen en hoge dagtemperaturen. Carboxylatie enzymen voor nachtelijke malaatsynthese en het decarboxylatie enzyme bereiken in vitro respectievelijk een optimum bij 35°C en 53°C. De lage nachttemperatuur zorgt voor een stabiele actieve gefosforyleerde vorm van PEPC, waardoor minder malaatinhibitie voorkomt en de nachtelijke CO2 assimilatie toeneemt. Hogere dagtemperaturen activeren de decarboxylatie enzymen en promoten de defosforylatie van PEPC, waardoor de gevoeligheid voor malaatinhibitie toeneemt. Toch is er ook veel bewijs dat CAM planten goed functioneren bij constante temperaturen (Kluge & Ting, 1978; Lüttge, 2004). De temperatuur heeft naast de impact op enzymen ook een impact ter hoogte van de vacuole. Hoge temperaturen zorgen namelijk voor een betere fluïdisatie van de tonoplast waardoor de membraanpermeabiliteit voor malaat verhoogt en een grotere efflux plaatsvindt. Dit heeft tot gevolg dat PEPC en nachtelijke CO2 opname worden geïnhibeerd. De stomata zullen bovendien minder lang gesloten blijven door de verhoogde interne CO2 concentraties, waardoor ook minder CO2 wordt opgenomen (Lüttge, 2004). Tot slot heeft de temperatuur ook een fysisch effect, namelijk de luchtvochtigheid beïnvloedt de relaties tussen temperatuur en stomatale opening. Bij hogere temperaturen daalt de RH en stijgt het waterdampdrukdeficiet (VPD). Het VPD is het verschil tussen de hoeveelheid waterdamp in de lucht en de hoeveelheid vocht die de lucht kan bevatten in verzadigde toestand. Door het toenemende VPD daalt de stomatale geleidbaarheid waardoor de CO2 opname daalt (Lüttge, 2004). Nutriënten In vele CAM planten worden verhoogde concentraties calcium (Ca2+) aangetroffen. Samen met kalium (K+), natrium (Na+) en magnesium (Mg2+) dient Ca2+ als tegenion voor de carboxylaten en draagt dus bij tot de osmotische stabilisatie. Ca2+ bindt bovendien met negatief geladen eiwitten en vetten, zo zorgt het voor een daling in de membraanpermeabiliteit (Lüttge, 2004). In C3 planten maakt Rubisco 50% uit van de totale bladeiwitten, voor de synthese ervan wordt veel stikstof vereist. CAM planten worden verwacht minder stikstof nodig te hebben dan C3 planten en dus een hogere ‘nitrogen use efficiency’ (NUE) te hebben. De NUE is een maat voor de geproduceerde hoeveelheid biomassa per eenheid stikstof (Dawson et al., 2008). CAM soorten hebben namelijk minder Rubisco nodig en zouden dus minder stikstof moeten binden. Uit studies bleek echter dat de NUE in CAM planten zeer soortspecifiek is en varieert met leeftijd en milieuomstandigheden. Het toedienen van stikstof zorgde altijd voor positieve gevolgen (Lüttge et al., 1991a, b). Zoutgehalte Zout brengt voornamelijk osmotische stress met zich mee en is dus sterk gerelateerd aan droogtestress. Aangezien CAM wordt gezien als een waterbesparend mechanisme, kan verwacht worden dat CAM een eigenschap is van halofyten. Nochtans, uit observaties blijkt dat halofyten niet altijd CAM planten zijn. Algemeen gesteld zijn CAM planten zelfs zeer gevoelig aan zoutstress (Lüttge, 2004).

18

Hoofdstuk 3

Materiaal en methoden


3.1. Plantmateriaal Tijdens dit onderzoek werd gebruik gemaakt van Phalaenopsis orchideeën. Zes hybriden werden verkregen via Microflor te Lochristi. Deze onderneming omvat een weefselteeltlaboratorium voor de vermeerdering van plantmateriaal, acclimatieserres voor de productie van jonge planten en serres voor de veredeling en het testen van nieuwe soorten. De orchideeën werden opgekweekt bij een natuurlijk dag/nachtregime, een temperatuur van 21°C en een gemiddelde PPFD van 110 µmol m-2 s-1. De RH werd gestuurd naar 65%. Alle hybriden waren tweetakkig.

3.2. Proefopzet De experimenten werden uitgevoerd aan het Laboratorium voor Plantecologie op de Faculteit Bio-Ingenieurswetenschappen van de Universiteit Gent. Het onderzoek kan opgedeeld worden in een preliminaire fase en twee proeven. Tijdens de preliminaire fase werden bij twee hybriden ‘Blue Sensitive 1’ (BS1) en ‘Red Lip NonSensitive 1’ (RLN1) de fluorescentieparameters en discontinue fotosynthese- en transpiratiesnelheid opgemeten tijdens een donkerperiode van zeven dagen en een herstelperiode van vijf dagen. Hierdoor werd een beter inzicht verkregen in de fotosyntheseeigenschappen van Phalaenopsis en kon de proefopzet worden geoptimaliseerd. Tijdens proef 1 werden tien Phalaenopsis hybriden ‘White Sensitive 1’ (WS1) en tien hybriden ‘White Non-Sensitive 1’ (WN1) vijf dagen in het donker gehouden (= donkerperiode) in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden. Vervolgens werden de planten 14 dagen opgevolgd bij een dag/nachtregime van 12u (= herstelperiode). Twaalf uur donker werd afgewisseld met een lichtperiode van 1u tot 13u. Daardoor werd het oorspronkelijk dag/nachtregime vervroegd met 6 uur en 51 minuten. WN1 en WS1 worden verder aangeduid als hybride 1 en hybride 2. Hybride 1 werd als knopvalongevoelig beschouwd, terwijl hybride 2 als knopvalgevoelig werd aangegeven door de kweker. De knopval na de donkerperiode werd elke dag opgevolgd. Naast de fluorescentieparameters en discontinue fotosynthese- en transpiratiemetingen werden ook continue fotosynthese- en transpiratiemetingen uitgevoerd. De planten kregen één keer per week water, zodat droogtestress zeker geen invloed had op de resultaten. Tijdens proef 2 werden tien Phalaenopsis hybriden ‘Purple Sensitive 1’ (PS1) en tien hybriden ‘Red Lip Non-Sensitive 1’ (RLN1) aan dezelfde donker- en herstelperiode onderworpen als tijdens proef 1. Het oorspronkelijk dag/nachtregime werd tijdens deze proef met 5 uur en 54 minuten vervroegd. De volledige donkerperiode duurde 8u langer in vergelijking met proef 1. PS1 en RLN1 worden verder aangeduid als hybride 3 en hybride 4. Hybride 3 werd als knopvalgevoelig beschouwd, terwijl hybride 4 als knopvalongevoelig werd aangegeven door de kweker.

19


3.3. Bloemen en knoppen De evolutie van de bloemen en knoppen werd in kaart gebracht door ongeveer om de vijf dagen het aantal bloemen, het aantal knoppen en hun knoplengte op te meten per bloemstengel. De knoplengtes werden opgedeeld in negen klassen met gelijke intervallen (Tabel 3.1). Tijdens de herstelperiode werd elke dag het aantal afgevallen knoppen geteld en en werd de knoplengte ervan opgemeten, dit voor alle tien planten per hybride. In de praktijk blijkt vooral de knopval in de grotere lengteklassen van commercieel belang te zijn. Microflor deelt vandaar de knoppen in volgens subjectieve lengteklassen: grote knoppen, midden knoppen en eindknoppen. De grote knoppen bevinden zich onderaan de stengel, volgend op de eerste bloem. De eindknoppen zijn de laatste knoppen op de stengel en de midden knoppen bevinden zich hiertussen. De subjectieve indeling werd in deze experimenten ook meegenomen. Tabel 3.1 - Verdeling van knoplengte in klassen.

Klasse Interval (cm) 1

[0,0-0,4]

2

]0,4-0,8]

3

]0,8-1,2]

4

]1,2-1,6]

5

]1,6-2,0]

6

]2,0-2,4]

7

]2,4-2,8]

8

]2,8-3,2]

9

]3,2-3,6]

3.4. Microklimaat Tijdens de experimenten werd het microklimaat in de groeikamer continu opgemeten. De PPFD werd opgemeten met een PAR sensor (LI-190 S, LI-COR Biosciences, Nebraska, VS), de temperatuur door middel van een thermokoppel (T, Omega Engineering, Stamford, VS) en de RH met een relatieve vochtigheidssensor (EE08, E+E Elektronik, Engerwitzdorf, Oostenrijk). De sensoren waren gekoppeld aan een datalogger (34970A + 34901A, Agilent Technologies, Diegem, België) die de data om de 20 seconden registreerde en wegschreef.

3.5. Continue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling In proef 1 en 2 werd gebruik gemaakt van de LI-840 niet-dispersieve infrarood (IR) gas analysator (LI-840 CO2/H2O Gas Analyzer, LI-COR Biosciences, Nebraska, VS) om de CO2 en H2O uitwisseling van de bladeren en bloemstengels continu op te volgen. De LI-840 IR gas analysator is een open differentieel gasuitwisselingssysteem. Het systeem wordt ‘open’ genoemd omdat er continu verse lucht wordt aangezogen vanuit de omgeving en er dus geen hergebruik van lucht plaatsvindt. De IR gas analysator bestaat uit een referentie- en meetkamer. De concentratiemetingen zijn gebaseerd op de verschilratio in de IR absorptie 20


tussen het referentie- en meetsignaal, daarom wordt het een differentieel systeem genoemd. De LI-840 IR gasanalysator heeft een meetbereik voor CO2 concentraties tussen 0 en 1000 ppm (µmol mol-1) en voor H2O concentraties tussen 0 en 80 ppt (mmol mol-1). Vooraf werd bij een knopvalgevoelige en een knopvalongevoelige plant bepaald welke stengel per plant het meest transpireerde. Voor beide hybriden werd de stengel die de meeste transpiratie vertoonde, geselecteerd als meetstengel tijdens de donker- en herstelperiode. Per hybride werd dus één bloemstengel opgemeten (Figuur 3.1A). Tijdens de proeven werd ook telkens het tweede blad van de door de kweker aangegeven knopvalgevoelige hybride opgemeten (Figuur 3.1B).

A

B

Figuur 3.1 – (A) Branchbag met een bloemstengel en (B) bladcuvette met een blad.

21


3.5.1 Meetprincipe Lucht werd vanuit de omgeving aangezogen met behulp van een pompsysteem (N 035.1.2 AN.18, KNF Neuberger, Freiburg, Duitsland). De lucht kwam eerst terecht in een buffervat (50 liter) om eventuele debietfluctuaties te minimaliseren. De luchtstroom werd opgesplitst en gestuurd naar één bladcuvette (Figuur 3.1B), twee meetbranchbags en één referentiebranchbag (Figuur 3.2). Het debiet van alle ingaande luchtstromen (behalve van de referentiebranchbag) werd opgemeten met debietmeters (58605, Brooks Instrument, Hatfield, VS). De branchbags werden gemaakt van plastiek zakken en werden rond een bloemstengel vastgebonden en goed afgesloten met spanbandjes (Figuur 3.1A). Eén branchbag omsloot dus de knoppen en bloemen van één stengel. Ventilatoren in de bladcuvette en branchbags zorgden voor een homogeen luchtmengsel. De bladcuvette en branchbags werden verbonden met een gasmultiplexer (Universiteit Gent, België). De luchtstroom die door de lege branchbag (referentiebranchbag) ging, werd daarentegen verbonden met de gasmultiplexer en met de referentiekamer van de IR gasanalysator (lijn 5 op Figuur 3.2). Door de werking van de gasmultiplexer ontving de meetkamer van de IR gasanalysator achtereenvolgens lucht van de bladcuvette van de gesuggereerde knopvalgevoelige soort (lijn 1 op Figuur 3.2), branchbag 1 met de meest transpirerende stengel van de gesuggereerde knopvalgevoelige soort (lijn 2 op Figuur 3.2), branchbag 2 met de meest transpirerende stengel van de gesuggereerde knopvalongevoelige soort (lijn 3 op Figuur 3.2) en de referentiebranchbag (lijn 4 op Figuur 3.2). Wanneer de referentielucht werd geanalyseerd door de meetkamer, kon deze vergeleken worden met de referentielucht die door de referentiekamer werd opgemeten. Dit zorgde voor een nulmeting waardoor eventuele afwijkingen konden gecorrigeerd worden. Om de 20 minuten werd er omgeschakeld tussen de verschillende metingen met behulp van de gasmultiplexer. De meetresultaten werden om de 20 seconden opgeslagen op de datalogger (34970A + 34901A, Agilent Technologies, Diegem, België). Bij de opstelling werd ervoor gezorgd dat de lengte van de leidingen even lang waren, zodat de afstand die de lucht moest afleggen geen invloed had op de meetresultaten.

Figuur 3.2 - Schematische voorstelling van het gasuitwisselingssysteem. De weg die het gas aflegt wordt weergegeven: lucht wordt aangezogen door een pomp en homogeen gemengd in een buffervat. De lucht gaat vervolgens naar een bladcuvette, twee meetbranchbags en een referentiebranchbag. Het debiet van de lucht wordt opgemeten met debietmeters. De bladcuvette en branchbags worden verbonden met een gasmultiplexer. De luchtstroom die door de referentiebranchbag gaat, wordt verbonden met de gasmultiplexer en ook rechtstreeks met de referentiekamer van de infrarood gasanalysator (IRGA). Met behulp van het concentratieverschil tussen de meet- en referentiekamer worden de netto CO2 en netto H2O uitwisseling bepaald.

22


Omdat de multiplexer steeds wisselde tussen de bladcuvette en branchbags diende er zich telkens een nieuw evenwicht in te stellen. Daarom werd voor de verdere dataverwerking steeds gewerkt met het gemiddelde van de laatste drie metingen. De netto CO2 en H2O uitwisselingssnelheid van het blad en de bloemstengels kunnen dan als volgt worden bepaald: 𝑃𝑛 =

∆𝐶𝑂2 . 𝐷 𝑃 103 . . 𝐴 𝑅. 𝑇 60

𝐸=

∆𝐻2 𝑂. 𝐷 𝑃 𝑀𝑀𝐻2 𝑂 . 103 . . 𝐴 𝑅. 𝑇 60

met Pn: de netto CO2 uitwisselingssnelheid (µmol CO2 m-2 s-1) ∆CO2 : het CO2 concentratieverschil tussen de inkomende en uitgaande lucht in de cuvette/branchbag (ppm) D: het luchtdebiet doorheen de cuvette/branchbag (L min-1) A: de oppervlakte ingesloten in de cuvette/branchbag (m2) P: de druk (atm) R: de universele gasconstante (82,06 atm ml mol-1 K-1) T: luchttemperatuur (K) 10 3 60

: eenheidsconversiefactor

E: de netto H2O uitwisselingssnelheid (mg H2O m-2 s-1) ∆H2 O: het H2O concentratieverschil tussen de inkomende en uitgaande lucht in de cuvette/branchbag (ppt) MMH 2 O : de molaire massa van H2O (18 g mol-1) De bladoppervlakte A in de bladcuvette werd bepaald door het blad over te tekenen op papier en op te meten met een bladoppervlaktemeter (LI‐3000 + LI‐3050, LI‐COR Biosciences, Nebraska, VS). Voor de oppervlakte van de bloemblaadjes werd een bloem van gemiddelde grootte gekozen en werd analoog tewerk gegaan. Om de oppervlakte van een bloemknop en bloemstengel te berekenen werden deze benaderd door respectievelijk een bol en een cilinder.

3.5.2 Kalibratie Debietmeters Voor de kalibratie van de debietmeters werden met behulp van een gasfles en een draagbare laboratorium debietmeter (GTLK, Platon, Wemmel, België) luchtstromen met een verschillend debiet (4 L min-1, 6,1 L min-1, 8,2 L min-1 en 10 L min-1) doorheen de debietmeters gestuurd. Na evenwicht werden de overeenkomstige spanningen afgelezen op de datalogger. Om de kalibratievergelijking op te stellen, werden de afgelezen spanningssignalen uitgezet ten opzichte van de overeenkomstige debieten (Tabel 3.2). Door een stroompanne op DOY 318 (proef 1), werkten de debietmeters niet meer. Daarom werd in de dataverwerking gewerkt met de gemiddelde debieten van DOY 315 tot 318.

23

Materiaal en methoden -1

Tabel 3.2 - De kalibratievergelijkingen van de debietmeters in het gasuitwisselingssysteem met het debiet (y, L min ) in functie van de afgelezen spanning (x, V).

Debietmeter

Kalibratievergelijking

Correlatiecoëfficiënt

1

y = 18,141x - 7,2601

0,9998

2

y = 17,626x - 7,0282

0,9997

3

y = 17,251x - 7,0137

0,9997

IR gas analysator Ook de referentie- en meetkamer van de IR gas analysator werden op een dergelijke manier gekalibreerd voor gebruik. Achtereenvolgens werd een gas (N2) met 0 ppm CO2 (zero) en 489 ppm CO2 (span) door de beide kamers gestuurd. Een kalibratie werd uitgevoerd door de interne software. De CO2 concentratie kan uit het spanningssignaal van de output berekend worden via volgende formule: 𝐶𝑂2 = 𝑉

𝐶𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒 𝑉𝑟𝑎 𝑛𝑔𝑒

met V de geregistreerde spanning, Crange het maximum bereik voor CO2 en Vrange de maximum output voor het geselecteerde bereik. In dit geval moet het gemeten spanningssignaal dus vermenigvuldigd worden met 400. De H2O concentratie wordt analoog bepaald met onderstaande formule: 𝐻2 𝑂 = 𝑉

𝐻𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒 𝑉𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒

met Hrange het maximum bereik voor H2O. Het afgelezen spanningssignaal moet aldus vermenigvuldigd worden met factor 32.

3.6. Discontinue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling Met behulp van de LI-6400XT (LI-COR Biosciences, Nebraska, VS), afgebeeld in Figuur 3.3A, werden discontinu fotosynthesemetingen uitgevoerd. De principes zijn analoog aan het gasuitwisselingssysteem met IR gasanalysator (sectie 3.5.1.), aangezien de LI-COR 6400XT ook een open differentieel gasuitwisselingssysteem is. Het grote voordeel is echter de automatisatie en compactheid bij de LI-6400. De gas analysators bevinden zich in het sensorhoofdje, waardoor tijdsvertragingen door leidingen worden geëlimineerd en een snelle respons van de bladeren kan worden waargenomen (LI-COR, 2004; Steppe, 2011). Alle metingen werden uitgevoerd op het tweede blad geteld vanaf de apex, dit is het jongste volledig ontwikkeld blad (Figuur 3.3B). Er werd gemeten in het midden van het blad op voldoende afstand van de hoofdnerf. De bladeren van zes gesuggereerde gevoelige en zes gesuggereerde niet-gevoelige planten per hybride werden opgemeten om vervolgens een gemiddelde te nemen van zes waarden. Tijdens de donkerperiode werden de planten elke dag opgemeten, achtereenvolgens een gevoelige en een niet-gevoelige hybride. Tijdens de herstelperiode werden de planten zowel in het licht als in het donker opgemeten. De 12 24


planten werden over twee dagen opgemeten, waardoor de parameters van twee dagen werden samengenomen voor de berekeningen. De ingestelde parameters tijdens de metingen worden weergegeven in Tabel 3.3. De instroomsnelheid van verse lucht werd vrij laag gehouden omdat de CO2 uitwisselingssnelheid van orchideeën gering is (Pollet, 2010). Voor elke meting werd ‘gematcht’ om afwijkingen tussen de meet- en referentieanalysators te vermijden. Tijdens het ‘matchen’ wordt hetzelfde gas door de meet- en referentiekamer gestuurd en worden de gemeten CO2 en H2O waarden van beide cellen aan elkaar gelijkgesteld. Dit verhoogt de accuraatheid van de metingen, zeker bij lage fotosynthesesnelheden. Tabel 3.3 - Instelling van de parameters in de LI-COR 6400XT.

Parameter

Instelling

Oppervlakte bladcuvette

2 cm² 200 µmol s-1

Instroomsnelheid van verse lucht Referentieconcentratie CO2

400 ppm

Bloktemperatuur

25 °C

Stomatale ratio

0 (stomata slechts aan één zijde)

Optimum measurement intensity

1,5

Optimum flash intensity

10

A

B

Figuur 3.3 - (A) De LI-6400XT en (B) het sensorhoofdje op het tweede blad geteld vanaf de apex.

3.7. Chlorofyl-a fluorescentieparameters Met de LI-6400XT kunnen naast fotosynthese- ook fluorescentiemetingen worden uitgevoerd. De Leaf Chamber Fluorometer van de LI-6400XT bevat een LED gebaseerde lichtbron en twee detectoren om fluorescentie te meten. De metingen werden simultaan met de fotosynthesemetingen uitgevoerd op dezelfde planten en bladeren. Het gebruik van chlorofyl-a fluorescentiemetingen is momenteel een veel gebruikte nietdestructieve methode om de fotosynthetische status en stress in planten te onderzoeken. Dit is te wijten aan de ontwikkeling van relaties tussen fluorescentieparameters en fotosynthetisch elektronentransport en aan de beschikbaarheid van een reeks draagbare en betaalbare fluorometers (Baker, 2008). 25


3.7.1 Theoretische achtergrond 3.7.1.1 Principe van fluorescentie De lichtreacties van de fotosynthese vinden plaats in de thylakoidmembranen van de chloroplasten. Tijdens de lichtreacties wordt via de elektronentransportketen lichtenergie omgezet in chemische energie die gebruikt wordt tijdens de donkerreacties om CO2 vast te leggen in suikers. In de thylakoidmembranen bevinden zich fotosystemen (PS) die bestaan uit een kerncomplex met een reactiecentrum en een LHC. Het LHC bestaat uit verschillende pigmenten die lichtenergie absorberen en doorgeven aan een doelwitpigment in het reactiecentrum (Figuur 3.4). In dit reactiecentrum vindt de uiteindelijke omzetting van lichtenergie naar chemische energie plaats. Er wordt onderscheidt gemaakt tussen fotosysteem II (PS II) dat voornamelijk licht absorbeert bij 700 nm en fotosysteem I (PS I) dat voornamelijk licht absorbeert bij 680 nm. Via elektronentransport van PS II naar PS I worden ATP en de gereduceerde vorm van nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH) gevormd die dan aangewend worden in de donkerreacties.

-

+

Figuur 3.4 - De transfer van elektronen (e ) en protonen (H ) in het thylakoidmembraan. Water (H20) wordt geoxideerd en protonen worden vrijgesteld in het lumen door PS II. PS I reduceert nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat + (NADP ) tot NADPH in het stroma via ferredoxine (Fd) en het flavoproteïne ferredoxine-NADP reductase (FNR). Protonen worden ook getransporteerd in het lumen door de actie van het cytochroom b6f complex. Deze protonen dragen bij tot de opbouw van de elektrochemische protongradiënt. De protonen moeten dan diffuseren door het adenosinetrifosfaat (ATP) synthase enzyme waarbij ATP in het stroma wordt gevormd. Gereduceerd plastoquinon (PQH 2) en plastocyanine (PC) zorgen respectievelijk voor de transfer van elektronen naar cytochroom b6f en PS I. Gestippelde lijnen verwijzen naar de transfer van elektronen, volle lijnen naar de beweging van protonen (aangepast uit: Taiz & Zeiger, 2006).

Lichtenergie dat geabsorbeerd wordt door chlorofylmoleculen kan drie reacties ondergaan: (1) het kan gebruikt worden om fotosynthese aan te drijven via de elektronentransportketen (fotochemie), (2) overmatige energie kan gedissipeerd worden als warmte of (3) de overmatige energie kan heruitgezonden worden als licht (chlorofyl fluorescentie). Deze drie processen (Figuur 3.5) staan in competitie met elkaar, zodanig dat een stijging in de efficiëntie van het ene, resulteert in een daling in de efficiënte van de andere twee processen. Dus door het meten van de chlorofyl fluorescentie kan informatie gewonnen worden over de efficiëntie van fotochemie en warmteverlies. Ondanks dat de totale hoeveelheid chlorofyl fluorescentie klein is (slechts 1 tot 2% van de geabsorbeerde straling) zijn de metingen vrij eenvoudig. Het spectrum van de fluorescentie is verschillend dan dat van het geabsorbeerde 26


licht. Fluorescentie straling heeft namelijk een langere golflengte dan die van de geabsorbeerde straling. Bijgevolg kan fluorescentie gekwantificeerd worden door een blad bloot te stellen aan licht met een gekende golflengte en de hoeveelheid terug uitgestraald licht met een langere golflengte op te meten (Maxwell & Johnson, 2000; Steppe, 2011).

Figuur 3.5 - De verschillende energetische pathways die een geabsorbeerd foton kan volgen: elektronentransportketen, warmte en fluorescentie (aangepast uit: LI-COR, 2004).

3.7.1.2 Chlorofyl-a fluorescentie quenching Chlorofyl-a fluorescentie quenching betekent onderdrukking van de uitgezonden fluorescentie straling, de excitatie-energie wordt dus onbeschikbaar voor fluorescentie. Bij fysiologische temperaturen wordt 90% van de fluorescentie uitgezonden door chlorofylmoleculen in PS II. Daarom wordt quenching gelinkt aan de status en de efficiëntie van de reactiecentra van PS II. Een reactiecentrum wordt geöxideerd of ‘open’ genoemd wanneer de primaire elektronenacceptor nieuwe elektronen kan accepteren voor gebruik in de elektronentransportketen. Wanneer een reactiecentrum gereduceerd of ‘gesloten’ is, kan het geen elektronen accepteren en moet de ongebruikte excitatie-energie op een andere manier verwijderd worden. Quenching wordt opgesplitst in fotochemische (qP) en nietfotochemische quenching (NPQ). Zolang het reactiecentrum van PS II open is en elektronen kan doorgeven naar PS I, wordt er van qP gesproken. qP zal maximaal zijn wanneer het blad enkele minuten in het donker wordt gehouden. Deze donkerperiode zorgt voor volledige oxidatie van alle elektronenacceptors waardoor alle reactiecentra van PS II open zullen zijn. qP daalt wanneer planten stress hebben (hitte, koude, droogte, herbiciden). Het elektronentransport wordt door deze stressfactoren geblokkeerd en de fluorescentie straling neemt toe (Maxwell and Johnson, 2000; LI-COR, 2004; Baker, 2008; Steppe, 2011). Efficiënte quenching van geëxciteerde energie is noodzakelijk om het fotosynthese apparaat te beschermen. Indien fotosynthese om een bepaalde reden niet doorgaat, verlengt de levensduur van de excitatie en kan er schade aan het fotosynthese apparaat ontstaan (Laisk & Oja, 1998). 3.7.1.3 ‘Saturation Pulse Method’ Door gebruik te maken van verzadigde lichtpulsen kan een scheiding van de twee quenching mechanismen qP en NPQ mogelijk worden gemaakt. De ‘saturation pulse method’ maakt gebruik van vier lichtbronnen die elk een kwantitatief en kwalitatief verschillende lichtstraling uitzenden. 27


De eerste lichtbron produceert een meetlicht met een zeer lage intensiteit zodat geen fotosynthese plaatsvindt, maar wel fluorescentie wordt opgewekt. De tweede lichtbron zendt actinische straling uit voor het aandrijven van de fotosynthese. De derde lichtbron sluit alle reactiecentra van PS II door verzadigde lichtpulsen met zeer hoge intensiteit te produceren. Door de vierde lichtbron wordt PS I geactiveerd met verrood licht zodat de reactiecentra van PS II snel kunnen openen. De fluorescentieparameters tijdens de experimenten worden opgemeten wanneer het blad gedurende 20 minuten is geadapteerd aan het donker. Dit gebeurt door de bladcuvette op het blad te plaatsen terwijl alle lichtbronnen uitgeschakeld zijn. De primaire electronenacceptor (QA) is dan maximaal geoxideerd en de reactiecentra van PS II zijn open. Vervolgens wordt het donkergeadapteerd blad blootgesteld aan een zwak gemoduleerd meetlicht (ongeveer 0,1 μmol m-2 s-1). Door de zeer lage intensiteit van het meetlicht vinden geen fotochemische reacties plaats. Alle reactiecentra zijn dus open en qP is maximaal (qP=1). Dit resulteert in het minimaal fluorescentieniveau F0. Daarna wordt het blad blootgesteld aan een korte actinische puls met een hoge lichtintensiteit (> 1500 µmol m-2 s-1). QA zal nu volledig gereduceerd zijn en er vindt geen fotochemie plaats (qP=0). Het maximaal fluorescentieniveau Fm wordt bereikt. Het verschil tussen Fm en F0 wordt het variabel fluorescentieniveau Fv genoemd. Vervolgens wordt bovenop het meetlicht ook het actinisch licht aangeschakeld zodat de fotosynthese kan doorgaan, samen met herhaaldelijke korte verzadigingspulsen. Hierdoor kan het ‘steady-state’ fluorescentieniveau F en het maximaal fluorescentieniveau in de lichtgeadapteerde fase Fm’ worden opgemeten. Wanneer het actinisch licht wordt uitgeschakeld en het verrood licht wordt aangezet, worden de reactiecentra van PS II geforceerd om te openen, hierdoor kan het minimaal fluorescentieniveau in het licht-geadapteerde blad worden berekend F0’. In Figuur 3.6 worden de ‘saturation pulse method’ en de fluorescentieparameters schematisch voorgesteld.

Figuur 3.6 - Verloop van de fluorescentiemeting. Op donker-geadapteerde bladeren wordt het minimaal en maximaal fluorescentieniveau F0 en Fm gemeten. Op licht-geadapteerde bladeren wordt het ‘steady-state’ fluorescentieniveau F, het ’ maximaal fluorescentieniveau Fm en het minimaal fluorescentieniveau F0’ opgemeten. Een naar boven gerichte, rechte pijl staat voor het gemoduleerd meetlicht en een naar boven gerichte, kronkelende pijl staat voor een verzadigingspuls. De naar beneden gerichte pijl staat voor het uitschakelen van het actinisch licht (aangepast uit: LI-COR, 2004).

28


Uit deze basisparameters kunnen verschillende fluorescentieparameters berekend worden, elk met een specifieke fysiologische betekenis. Hieronder worden de relevante fluorescentieparameters voor dit onderzoek opgesomd (Maxwell and Johnson, 2000; LI-COR, 2004; Roháček, 2002; Baker 2008; Steppe, 2011). Fv/Fm wordt gebruikt om de maximale efficiëntie van de fotochemische reacties in PS II te schatten. Wanneer planten abiotische of biotische stress ondervinden wordt vaak een daling in Fv/Fm waargenomen. Vandaar wordt deze parameter gebruikt als een simpele en snelle manier om stress te monitoren (Baker, 2008). Waarden voor Fv/Fm tussen 0,74 en 0,85 wijzen op nietgestresseerde planten (Lichtenthaler et al., 2005). 𝐹𝑣 𝐹𝑚 − 𝐹0 = 𝐹𝑚 𝐹𝑚 NPQ varieert tussen 0 en 1 en geeft de mate van onderdrukking van fluorescentie door warmteverlies weer. 𝑁𝑃𝑄 =

𝐹𝑚 − 𝐹𝑚′ 𝐹𝑚′

qP is een maat voor de onderdrukking van fluorescentie door fotosynthese en varieert eveneens tussen 0 en 1. qP geeft een indicatie voor de hoeveelheid open reactiecentra in PS II. 𝑞𝑃 =

𝐹𝑚′ − 𝐹 ′ 𝐹𝑚′ − 𝐹0

De maximale efficiëntie van PS II in het lichtgeadapteerde blad (Fv’/Fm’) is de efficiëntie wanneer alle reactiecentra van PS II open zijn. De factor geeft een schatting van de fractie van de PS II maximum efficiëntie die gerealiseerd is. 𝐹𝑣′ 𝐹𝑚′ − 𝐹0 = 𝐹𝑚′ 𝐹𝑚′ De actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fq’/Fm’) is een maat voor de proportie van het licht geabsorbeerd door chlorofylmoleculen in PS II die gebruikt wordt voor fotochemie. Fq’ is het verschil tussen Fm’ en F’. 𝐹𝑞′ 𝐹𝑣′ 𝐹𝑚′ − 𝐹 = . 𝑞𝑃 = 𝐹𝑚′ 𝐹𝑚′ 𝐹𝑚′ De elektronen transportsnelheid (ETR) is de actuele flux aan fotonen die PS II aandrijven, met Ablad het aandeel van het invallende licht (PPFD) dat geabsorbeerd wordt door de bladeren en 0,5 de fractie aan PS II. 𝐸𝑇𝑅 =

𝐹𝑞′ .𝐴 . 𝑃𝐴𝑅. 0,5 𝐹𝑚′ 𝑏𝑙𝑎𝑑

29


3.8. Statistische analyse De statistische verwerking werd uitgevoerd in S-PLUS (v8.2, Insightful Corporation, California, USA) via een ANOVA-analyse (Fixed Effects). Er werd geopteerd voor een Tuckey aanpassing met een 5% significantieniveau (p < 0,05) om te zien welke opgemeten parameters significant verschillend waren tussen de vier hybriden.

30

Hoofdstuk 4

Resultaten

Resultaten

4.1. Microklimaat Alle metingen werden uitgevoerd in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden (Tabel 4.1). In Figuur 4.1 wordt het verloop van de luchttemperatuur, de RH, het lichtregime en het VPD voor beide proeven weergegeven. De herhaalde pieken in de temperatuur (Figuur 4.1A, C) zijn te wijten aan een probleem met de koelinstallatie in de groeikamer. Uit deze gegevens wordt geconcludeerd dat het microklimaat tijdens beide proeven gelijkaardig was en dat variaties in lichtintensiteit, temperatuur en RH van minimale invloed waren op de metingen. Hierdoor kunnen dus de resultaten van de vier hybriden met elkaar worden vergeleken. Tabel 4.1 – Microklimaat: photosynthetic photon flux density (PPFD), temperatuur (T), relatieve vochtigheid (RH) en waterdampdrukdeficiet (VPD) in de groeikamer tijdens proef 1 en 2.

Proef 1 Proef 2

PPFD

T

RH

VPD

(µmol m-2 s-1)

(°C)

(%)

(kPa)

Donkerperiode

0

21.11

48.50

1.30

Herstelperiode

84.01 (licht)

22.33

45.71

1.46

Donkerperiode

0

19.11

44.12

1.06

Herstelperiode

93.49 (licht)

20.03

41.44

1.17

Figuur 4.1 – Verloop van de temperatuur (T) (zwarte lijn) en de relatieve vochtigheid (RH) (grijze lijn) tijdens proef 1 (A) en proef 2 (C) en het waterdampdrukdeficiet (VPD) tijdens proef 1 (B) en proef 2 (D). De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).

31

Resultaten

4.2. Knopval In Figuur 4.2A worden voor de vier hybriden het gemiddeld aantal knoppen per lengteklasse getoond. Hieruit blijkt dat hybride 2 het minst aantal knoppen bezat en hybride 3 het meest. In Figuur 4.2B wordt voor elke hybride het relatief gemiddeld aantal afgevallen knoppen per lengteklasse weergegeven relatief ten opzichte van het aantal oorspronkelijke knoppen. Enkel knoppen kleiner dan 2,0 cm verkleurden en vielen af, de grotere knoppen konden zich verder ontwikkelen. Voor hybride 3 viel ook 50% van de knoppen af in de klasse ]2,0 – 2,4] cm. Dit was echter slechts één knop van 2,1 cm groot, waardoor algemeen kan gesteld worden dat er geen knopval boven de 2,0 cm plaatsvond. De meeste knopval vond bij de vier hybriden plaats in de lengteklasse ]0,4 – 0,8] cm. Uit observaties (data niet getoond) bleek er geen trend te zijn in de knopval van eerst grotere knoppen en dan kleinere of omgekeerd. In Figuur 4.2C wordt het relatief gemiddeld aantal afgevallen knoppen per subjectieve lengteklasse getoond, zoals in de praktijk bij het bedrijf Microflor wordt toegepast. Hieruit blijkt dat hybride 2 en 4 procentueel meer eindknoppen ten opzichte van de andere knoppen verloren. Hybride 3 verloor de meeste grotere knoppen. Indien deze classificatie wordt toegepast om de knopvalgevoeligheid te bepalen, zal hybride 3 dus als de meest gevoelige soort naar voor komen. In Figuur 4.2D wordt per dag na de donkerperiode getoond hoeveel knoppen er gemiddeld cummulatief afvielen van het totaal aantal knoppen per plant. Het procentueel aandeel knoppen dat afviel na de donkerperiode lag bij alle hybriden rond dezelfde grootteorde (gemiddeld 47,60%). Hybride 4 was het meest gevoelig aan knopval na een donkerperiode van vijf dagen (57,31%), gevolgd door hybride 3 (47,51%). Hybride 2 (42,86%) en hybride 1 (42,54%) waren het minst gevoelig. De knopval bij hybride 1 verliep sigmoïdaal, met een plotse knopval tussen dag zeven en dag tien. De knopval bij de andere hybriden verliep geleidelijker aan. De knoppen van hybriden 2, 3 en 4 vielen geleidelijk af na één of twee dagen na de donkerperiode. De knopval stagneerde bij alle hybriden tussen 10 en 12 dagen na de donkerperiode. De tamelijk grote standaardafwijkingen wijzen op een grote variabiliteit tussen de planten van één hybride. Sommige planten verloren helemaal geen knoppen, terwijl andere planten van dezelfde hybride bijna al hun knoppen verloren.

32

Resultaten

Figuur 4.2 - (A) Het gemiddeld aantal knoppen per lengteklasse na de donkerperiode voor 10 planten per hybride (n=10), (B) Het gemiddeld (n=10) aantal afgevallen knoppen t.o.v. het oorspronkelijk aantal knoppen per lengteklasse, (C) Het gemiddeld (n=10) aantal afgevallen knoppen t.o.v. het oorspronkelijk aantal knoppen per subjectieve lengteklasse en (D) Het cummulatief gemiddeld aantal afgevallen knoppen relatief t.o.v. het oorspronkelijk aantal knoppen in de tijd. Op het einde van de herstelperiode wordt voor hybride 1 (H1), hybride 2 (H2), hybride 3 (H3) en hybride 4 (H4) de gemiddelde procentuele knopval t.o.v. het totaal aantal knoppen weergegeven.

4.3. Fluorescentieparameters Figuur 4.3 toont per dag de gemiddelde fluorescentieparameters voor zes opgemeten planten per hybride. Dag 0 stelt de controledag voor, dag 1 tot 5 de donkerperiode en dag 6 tot 19 de herstelperiode. In Figuur 4.4 wordt de gemiddelde waarde en standaardafwijking van de fluorescentieparameters voor de donker- en herstelperiode per hybride weergegeven. Wanneer de letters boven de balken verschillend zijn voor de verschillende hybriden duidt dit op een significant verschil (p < 0,05). Algemeen wordt uit de resultaten afgeleid dat voor alle hybriden Fv/Fm, Fv’/Fm’, Fq’/Fm’, qP en ETR toenamen en dat NPQ daalde in de donkerperiode. Echter, naarmate de donkerperiode vorderde, daalden Fv’/Fm’, Fq’/Fm’, qP en steeg ETR. Wanneer de planten opnieuw werden blootgesteld aan een normaal dag/nachtregime namen de fluorescentieparameters onmiddellijk ongeveer dezelfde waarde aan als op de controledag. Het aanpassingsvermogen van de vier hybriden was dus groot.

33

Resultaten

Figuur 4.3 - Tijdsverloop van de gemiddelde fluorescentieparameters berekend voor zes planten (n=6) per hybride in de donker- en herstelperiode (enkel ’s nachts): (A) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de donker-geadapteerde fase (Fv/Fm), (B) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de licht’ ’ ’ ’ geadapteerde fase (Fv /Fm ), (C) Actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fq /Fm ), (D) Fotochemische quenching (qP), (E) Niet-fotochemische quenching (NPQ) en (F) Elektronentransportsnelheid (ETR). De zwarte blokken geven de donkerperiode weer.

34

Resultaten

Figuur 4.4 - De gemiddelde waarde en standaardafwijking van de fluorescentieparameters tijdens de donker- (zwarte balk) en herstelperiode (grijze balk) voor zes planten (n=6) per hybride: (A) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de donker-geadapteerde fase (Fv/Fm), (B) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de licht’ ’ ’ ’ geadapteerde fase (Fv /Fm ), (C) Actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fq /Fm ), (D) Fotochemische quenching (qP), (E) Niet-fotochemische quenching (NPQ) en (F) Elektronentransportsnelheid (ETR). Wanneer twee parameters significant verschillend zijn, worden ze aangeduid met een verschillende letter (Tuckey, p < 0,05); kleine letters worden gebruikt voor de donkerperiode en hoofdletters voor de herstelperiode.

35

Resultaten

Uit Figuur 4.3A wordt afgeleid dat Fv/Fm voor alle hybriden relatief constant bleef gedurende de hele proef, de waarde lag tussen de 0,81 en 0,82. Er werd een lichte stijging waargenomen op het einde van de donkerperiode. Figuur 4.4A toont dat Fv/Fm significant verschillend was tussen hybride 3 en de andere hybriden in de donkerperiode. Dit was de tweede meest gevoelige hybride. Tijdens de herstelperiode was Fv/Fm van hybride 3 significant verschillend met hybride 4. Dit waren de hybriden met de meeste waargenomen knopval. Uit het verloop van Fv’/Fm’ blijkt dat hybride 1 en 2 (minst knopval) een hogere waarde voor Fv’/Fm’ bezaten tijdens de donker- en herstelperiode (Figuur 4.3B). Dit wordt bevestigd in Figuur 4.4B. Fv’/Fm’ was namelijk zowel in de donker- als de herstelperiode gemiddeld het hoogst voor de minst knopvalgevoelige hybriden (hybride 1 en 2) en het laagst voor de meest knopvalgevoelige hybriden (hybride 3 en 4). Fv’/Fm’ nam tijdens de donkerperiode geleidelijk aan af (Figuur 4.3B), wat wil zeggen dat de maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II daalde wanneer de donkerperiode langer aanhield. Voor hybride 4 (meest gevoelig) was deze daling meer uitgesproken. Fv’/Fm’ van hybride 2 was significant verschillend met de andere hybriden in de donkerperiode (Figuur 4.4B). Dit was de hybride met het tweede minst knopval. Fv’/Fm’ van hybride 3 (tweede meest knopval) was ook significant verschillend met hybride 1 (minst knopval) in de donkerperiode. In de herstelperiode was Fv’/Fm’ van hybride 1 en 2 (minst knopval) significant verschillend met hybride 3 en 4 (meest knopval). Het verloop van Fq’/Fm’ van hybride 1 en 2 (minst gevoelig) was hoger dan van hybride 3 en 4, zowel tijdens de donker- als herstelperiode (Figuur 4.3C). Fq’/Fm’ was ook gemiddeld hoger voor hybride 1 en 2, zowel in de donker- als herstelperiode (Figuur 4.4C). Fq’/Fm’ daalde naarmate de donkerperiode langer duurde (Figuur 4.3C), wat wijst op een daling van de actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II. Net zoals bij Fv’/Fm’ was deze daling meer uitgesproken voor hybride 4 (meest gevoelig). Fq’/Fm’ van alle hybriden waren significant verschillend in de donker- en herstelperiode, met uitzondering van hybride 3 en 4 die onderling niet significant verschilden (Figuur 4.4C). In de donkerperiode was Fq’/Fm’ van hybride 4 (meest knopval) ook significant verschillend met hybride 1 (minst knopval). Het verloop van qP van hybride 1 en 2 (minst knopval) was tijdens de donkerperiode hoger, met andere woorden het aandeel open reactiecentra was bij deze hybriden dus groter (Figuur 4.3D). Dit wordt bevestigd in Figuur 4.4D, de gemiddelde qP van hybride 1 en 2 was in de donkerperiode hoger dan qP van hybride 3 en 4. Bovendien had hybride 4 (meest knopval) gemiddeld de laagste qP, zowel in de donker- als de herstelperiode. Ook hier wordt waargenomen dat qP daalde naarmate de donkerperiode vorderde en dat deze daling meer uitgesproken was voor hybride 4 (meest gevoelig) (Figuur 4.3D). qP van hybride 4 (meest knopval) was significant verschillend met de andere hybriden in de donkerperiode. qP van hybride 2 (tweede minst knopval) was significant verschillend met de andere hybriden in de herstelperiode (Figuur 4.4D). Het verloop van NPQ (Figuur 4.3E) en de gemiddelde NPQ (Figuur 4.4E) waren beide lager voor hybride 1 en 2 (minst knopval) in vergelijking met hybride 3 en 4 (meest knopval), zowel tijdens de donker- als herstelperiode. De minder gevoelige hybriden onderdrukten de fluorescente straling dus minder via warmteverlies. NPQ nam toe naarmate de donkerperiode langer duurde, het aandeel fluorescente straling dat onderdrukt werd via warmteverlies steeg 36

Resultaten

dus. Deze stijging was het grootst bij hybride 4 (meest gevoelig) (Figuur 4.3E). Uit Figuur 4.4E wordt afgeleid dat NPQ van hybride 2 (tweede minst knopval) in de donkerperiode significant verschillend was met NPQ van de andere hybriden. NPQ in de herstelperiode was gemiddeld het hoogst voor de meest knopvalgevoelige hybride (hybride 4) en het laagst voor de minst knopvalgevoelige hybride (hybride 1). NPQ was significant verschillend in de herstelperiode tussen hybride 1 (minst knopval) en de andere hybriden. NPQ van hybride 4 (meest knopval) was ook significant verschillend met NPQ van hybride 2 (tweede minst knopval) en 3 (tweede meest knopval) (Figuur 4.3E). Uit Figuur 4.3F en 4.4F wordt afgeleid dat zowel het verloop als het gemiddelde van ETR in de donker- en herstelperiode hoger was voor hybride 1 en 2 (minst gevoelig). Deze hybriden hadden dus een grotere actuele fotonenflux die PS II aandreef. ETR van hybride 2 (tweede minst knopval) was zowel in de donker- als herstelperiode significant verschillend met ETR van de andere hybriden (Figuur 4.4F).

4.4. Fotosynthese en transpiratie 4.4.1 Bladeren 4.4.1.1 Discontinue metingen van fotosynthese, transpiratie en stomatale geleidbaarheid Figuur 4.5 toont de gemiddelde (n=6) netto-fotosynthesesnelheid, transpiratiesnelheid en stomatale geleidbaarheid voor het blad van de vier hybriden. Dag 0 stelt de controledag voor, dag 1 tot 5 de donkerperiode en dag 6 tot 19 de herstelperiode. De netto-fotosynthesesnelheid werd negatief gedurende de hele donkerperiode in tegenstelling tot wat verwacht wordt van CAM planten. De bladeren respireerden dus continu gedurende de donkerperiode, wat duidt op stress. Ook de transpiratiesnelheid daalde tijdens de donkerperiode, de stomata waren dus meer gesloten. Wanneer de planten opnieuw blootgesteld werden aan een dag/nachtregime, herstelden ze zich. Er werd opnieuw een CAM patroon waargenomen: CO2 fixatie in het donker (stomata open) en respiratie tijdens het licht (stomata dicht). De transpiratiesnelheid was eveneens hoger gedurende de nachten in de herstelperiode, maar werd niet 0 tijdens het licht. De stomata waren dus niet volledig gesloten (ook te zien in de stomatale geleidbaarheid). Hybriden 3 en 4 (Figuur 4.5C, D) herstelden het traagst na de donkerperiode (meest gevoelige hybriden) en hybride 1 en 2 herstelden het snelst (minst gevoelige). De CO2 fixatie, transpiratiesnelheid en stomatale geleidbaarheid daalden in het donker tijdens de herstelperiode voor alle hybriden rond dag 10. Dit valt samen met de meeste knopval. De respiratie bij hybride 1 (Figuur 4.5A) steeg op dag 5 van de donkerperiode (meer stress), de stomatale geleidbaarheid was dan ook 0. Uit Figuur 4.5B wordt geconcludeerd dat de respiratie van hybride 2 tijdens de donkerperiode afnam tot dag 3 en daarna toenam van dag 4 tot 5. Vanaf dag 4 werd de stomatale geleidbaarheid bovendien 0, de stomata waren dus volledig gesloten. Bij hybride 3 (Figuur 4.5C) steeg de respiratie vanaf dag 3 en was de stomatale geleidbaarheid reeds van dag 1 min of meer nul. Uit Figuur 4.5D wordt afgeleid dat hybride 4 verschillend reageerde dan de andere hybriden. De respiratie tijdens de donkerperiode vertoonde een zigzagpatroon, waarbij de stomatale geleidbaarheid rond nul fluctueerde. Hybride 1, 2 en 3 vertoonden de eerste drie dagen in de donkerperiode een toename in de transpiratiesnelheid (Figuur 4.5A-C). Op dag 4 of 5 van de donkerperiode 37

Resultaten

daalde de transpiratiesnelheid weer (stomata sloten volledig). Hybride 4 vertoonde opnieuw een zigzagpatroon in de transpiratiesnelheid tijdens de donkerperiode (Figuur 4.5D). Uit alle grafieken blijkt dat de stomatale geleidbaarheid het transpiratiepatroon verklaarde. Dit blijkt ook uit Figuur 4.6. De transpiratiesnelheid volgde zowel tijdens proef 1 (4.6A) als tijdens proef 2 (4.6B) het VPD patroon niet en werd dus stomataal geregeld. Figuur 4.7A toont de gemiddelde (n=6) netto-fotosynthesesnelheid in de donker- en herstelperiode voor de vier hybriden en Figuur 4.7B de gemiddelde transpiratiesnelheid. De netto-fotosynthesesnelheid was niet significant verschillend tussen de vier hybriden. In de donkerperiode was de transpiratiesnelheid van hybride 1 (minst knopval) significant verschillend met de andere hybriden. De transpiratiesnelheid van hybride 1 was bovendien het hoogst tijdens de donkerperiode en was lager voor de knopvalgevoelige soorten (hybride 3 en 4). De transpiratiesnelheid in de herstelperiode was enkel significant verschillend tussen hybride 2 (tweede minst knopval) en 4 (meest knopval).

Figuur 4.5 – Gemiddelde netto-fotosynthesesnelheid, transpiratiesnelheid en stomatale geleidbaarheid (n=6) voor de bladeren van hybride 1 (A), hybride 2 (B), hybride 3 (C) en hybride 4 (D) tijdens de donker- en herstelperiode. De zwarte blokken tonen de donkerperiode aan en de grijze blokken de periode met de meeste knopval.

38

Resultaten

Figuur 4.6 – Gemiddelde transpiratiesnelheid (n=6) van de bladeren tijdens de donker- en herstelperiode en het waterdampdrukdeficiet (VPD) voor proef 1 (A) en proef 2 (B).

Figuur 4.7 – Gemiddelde netto-fotosynthesesnelheid (n=6) in de donker- en herstelperiode voor de bladeren van de vier hybriden en (B) gemiddelde (n=6) transpiratiesnelheid in de donker- en herstelperiode voor de vier hybriden. Wanneer twee parameters significant verschillend zijn, worden ze aangeduid met een verschillende letter (Tuckey, p < 0,05); kleine letters worden gebruikt voor de donkerperiode en hoofdletters voor de herstelperiode.

4.4.1.2 Continue metingen van fotosynthese en transpiratie Figuur 4.8 toont de netto-fotosynthesesnelheid, transpiratiesnelheid en het VPD voor het blad van hybride 2 (Figuur 4.8A) en hybride 3 (Figuur 4.8C). Figuur 4.8B en D tonen een detail van de overgang van de donkerperiode naar de herstelperiode voor hybride 2 en 3. Tijdens het uitvoeren van de discontinue metingen steeg de CO2 concentratie telkens wanneer een persoon in de groeikamer ging vanwege zijn ademhaling. Hierdoor waren de omgevingscondities niet meer stabiel voor de continue fotosynthese- en transpiratiemetingen. De ruis op de data werd beperkt door alle waarden bij verhoogde CO2 concentraties weg te filteren (referentie CO2 concentratie hoger dan 600 ppm). Uit Figuur 4.8B en D is duidelijk af te leiden dat het blad continu respireerde en in beperkte mate transpireerde in de donkerperiode. Tijdens de herstelperiode is de netto-fotosynthesesnelheid en transpiratiesnelheid ’s nachts hoger dan overdag. Dit wijst erop dat de stomata in de bladeren ’s nachts open staan en dat ze terug aan CO2 fixatie doen in het donker (CAM). Net zoals bij de discontinue metingen (Figuur 4.5C) werd waargenomen dat de fotosynthese en transpiratie zich minder snel herstelden na de donkerperiode bij hybride 3.

39

Resultaten

Figuur 4.8 - (A) Netto-fotosynthesesnelheid en transpiratiesnelheid van het blad en het waterdampdrukdeficiet (VPD) in de donker- en herstelperiode voor hybride 2 en (C) voor hybride 3. (B) Detail van de overgang van donker- naar herstelperiode voor hybride 2 en (D) voor hybride 3. De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).

4.4.2 Bloemstengels De bloemstengels respireerden continu tijdens de hele meetperiode (Figuur 4.9A-D). Tijdens de donkerperiode was er geen dag/nachtpatroon waar te nemen. Uit de detailfiguren (Figuur 4.9E-H) blijkt dat in de herstelperiode de respiratie ’s nachts toenam en overdag afnam. Dit kan verklaard worden doordat de bloemen en stengels in het licht een beetje aan fotosynthese deden, waardoor de totale respiratie kleiner werd overdag. Figuur 4.10A-D tonen respectievelijk het continu verloop van de transpiratiesnelheid en het VPD van hybride 1, 2, 3 en 4. In Figuur 4.10E-H wordt een detail weergegeven van de donkerperiode. De daling in de transpiratiesnelheid bij hybride 1 en 2 (Figuur 4.10A, B) op DOY 326 wordt verklaard doordat de bladcuvette werd aangespannen om ze meer luchtdicht te maken. De transpiratiesnelheid was continu positief en volgde het VPD, wat erop wijst dat de stomata van de bloemen altijd open waren, zowel in de donker- als herstelperiode. De pieken in de transpiratiesnelheid worden verklaard door de pieken in het VPD voor de vier hybriden. De stomata van de bloemen van deze hybriden zijn dus niet-functioneel aangezien de stomata niet openen en sluiten. Uit de detailfiguren (Figuur 4.10E-H) blijkt dat hybride 3 en 4 (meest gevoelige) tijdens de donkerperiode oscillaties in de transpiratie vertoonden. Hybride 1 en 2 hadden deze oscillaties minder. Er moet echter voorzichtigheid geboden worden met de interpretatie van deze oscillaties. Deze kunnen namelijk ook het gevolg zijn van de niet opgemeten en dus ingeschatte luchtdebieten. Er werd tijdens proef 2 namelijk een gemiddelde waarde van de debieten van proef 1 genomen. 40

Resultaten

Figuur 4.9 - Netto-fotosynthesesnelheid (zwarte cirkels) en waterdampdrukdeficiet (VPD) (zwarte lijn) voor de meest transpirerende bloemstengel van hybride 1, 2, 3 en 4 (A-D) en detail van de overgang van donker- naar herstelperiode van hybride 1, 2, 3 en 4 (E-F). De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).

41

Resultaten

Figuur 4.10 - Transpiratiesnelheid (witte cirkels) en waterdampdrukdeficiet (VPD) (zwarte lijn) voor de meest transpirerende bloemstengel van hybride 1, 2, 3 en 4 (A-D) en detail van de donkerperiode van hybride 1, 2, 3 en 4 (E-F). De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).

42

Hoofdstuk 5

Discussie

Discussie

5.1. Definitie knopvalgevoeligheid Het is van belang voor de orchideeënindustrie om (snel) te kunnen achterhalen welke hybriden knopvalgevoelig zijn en welke niet. Knopvalgevoelige hybriden kunnen namelijk minder lang in het donker getransporteerd worden waardoor ze soms niet meer gebruikt worden bij verdere veredeling. Om de gevoeligheid te definiëren is het van groot belang dat er een eenduidige methode wordt opgesteld. Tijdens dit onderzoek werden vier verschillende hybriden getest op hun gevoeligheid aan knopval. Het oorspronkelijk aantal knoppen verschilde sterk tussen de verschillende hybriden en was bij hybride 2 het laagst (Figuur 4.2A). Dit is mogelijk te wijten aan het minder groeikrachtig zijn van hybride 2. Hieruit kan worden besloten dat het oorspronkelijk aantal knoppen in rekening moet worden gebracht om de knopvalgevoeligheid van de hybriden te bepalen. Daarom wordt de knopval verder procentueel ten opzichte van het oorspronkelijk aantal knoppen bepaald (Figuur 4.2B-D). Uit deze resultaten blijkt dat alle vier de hybriden gevoelig zijn aan knopval na een donkerperiode van vijf dagen en dat de knopvalgevoeligheid toeneemt van hybride 1 naar hybride 4. Uit de standaardafwijkingen blijkt bovendien dat er een grote variabiliteit is tussen de planten van één hybride. Vandaar is het aangewezen om de knopval op basis van gemiddelde waarden te definiëren. Verder is het voor de kweker van belang dat de planten gemiddeld weinig knopval hebben. Het is niet zo erg als er één plant op een volledige batch knopval vertoont. Knoppen groter dan 2,0 cm waren blijkbaar groeikrachtig genoeg om zich verder te ontwikkelen na een donkerperiode aangezien deze zelden afvielen (Figuur 4.2B). De donkerperiode van vijf dagen heeft dus enkel een invloed op knoppen met een lengte onder de 2,0 cm. De knopval in de kleinere klassen (< 0,8 cm) zijn van geringer economisch belang voor de kweker. Vooral de knopval van grote knoppen is schadelijk voor de inkomsten van de kwekerijen. Tijdens deze studie werd ook dit economisch belang meegenomen. Wanneer voor de bepaling van de knopvalgevoeligheid van de hybriden enkel rekening wordt gehouden met de knopval van grote knoppen, wordt echter een andere volgorde van gevoeligheid bekomen dan wanneer met alle knoppen werd rekening gehouden (Figuur 4.2C). Hybride 3 blijkt dan de meest gevoelige hybride te zijn, gevolgd door hybride 4, 1 en 2. Net zoals wanneer alle knoppen in rekening worden gebracht, komen hybride 1 en 2 naar voor als de minder gevoelige, terwijl hybride 3 en 4 gevoeliger zijn. Er is echter wel een verschil in de volgorde. Aangezien de indeling in lengteklassen bij deze methode subjectief gebeurd, is deze wetenschappelijk minder aangewezen. De waargenomen gevoeligheid van de hybriden tijdens deze proef verschilt met de gevoeligheid die Microflor suggereerde. Microflor stelde de planten echter twee dagen langer bloot aan een donkerperiode om de gevoeligheid te testen. De knopvalgevoeligheid blijkt bovendien soms afhankelijk te zijn van de omgevingsomstandigheden tijdens de opgroei van de verschillende hybriden. Het verschil in gevoeligheid kan ook te wijten zijn aan een extra stressfactor tijdens deze proef. Het dag/nachtregime werd namelijk verschoven om de metingen in het donker te kunnen realiseren. In de groeikamer was het licht van 1u tot 13u waardoor de lichtperiode ongeveer zes tot zeven uur werd vervroegd in tegenstelling tot de normale lichtperiode. Deze verschuiving van het dag/nachtregime heeft een invloed op het 43

Discussie

circadiaans ritme. Organismen worden normaal blootgesteld aan dagelijkse cycli van licht en donker waardoor ze een ritmisch gedrag vertonen in associatie met deze cycli. Wanneer planten getransporteerd worden, gaat de dagelijkse dag/nacht cycli over in continu donker. Tijdens de donkerperiode blijven vele planten het oorspronkelijk ritme behouden, toch op zijn minst voor enkele dagen. Onder uniforme omstandigheden is de periode van het ritme ongeveer 24 uur waardoor de term ‘circadiaans ritme’ wordt gebruikt. Omdat de planten continu in het donker zitten, zijn deze circadiaanse ritmes geen directe respons op de aan- of afwezigheid van licht. Ze moeten gebaseerd zijn op een interne klok, een endogene oscillator. De ritmes worden intern gegenereerd, maar ze vereisen een signaal uit de omgeving om hun expressie te initiëren (bv. blootstelling aan licht of verandering in temperatuur). Vandaar vermindert de amplitude van het ritme vaak wanneer de plant gedurende een paar cycli aan constante omstandigheden wordt blootgesteld. Deze endogene oscillator is gekoppeld aan verschillende fysiologische processen zoals fotosynthese (Taiz & Zeiger, 2006). Groeiend bewijs suggereert dat er twee fundamentele niveaus van controle verantwoordelijk zijn voor het koppelen van de vier CAM-fasen. De circadiaanse controle van de koolstofflux door PEPC wordt algemeen gezien als de sleutelcomponent in de dag/nachtscheiding van de carboxylatieprocessen. Een tweede, metabolische controle moduleert de output van de circadiaanse oscillator op fluctuaties in interne en externe CO2 voorraad (Dodd et al., 2002). De opgelegde verschuiving van het dag/nachtregime in de twee proeven is echter analoog aan het intercontinentaal transport over zes tot zeven tijdzones, bijvoorbeeld plantentransport van Europa naar Azië of van de VS naar Europa. Wanneer de orchideeën na het donkertransport terug in het licht komen in de serres, is hun dagritme namelijk ook met zes tot zeven uur verschoven. Algemeen kan geconcludeerd worden dat het voor de kwekerijen van belang is om een gestandaardiseerde methode op te stellen om de gevoeligheid voor knopval te bepalen. Hierbij moet voldoende aandacht besteed worden aan gelijke omgevingscondities, aandeel knopval op het totaal aantal knoppen, gemiddelde knopval per hybride en een consistente manier om de lengte van de knoppen in rekening te brengen. Wanneer voor het bepalen van de knopvalgevoeligheid enkel rekening wordt gehouden met een donkerperiode, kan de selectiemethode tekorten vertonen bij intercontinentaal transport waarbij verschillende tijdzones worden doorkruist. In dit geval zou ook het verschuiven van het dag/nachtregime in rekening moeten worden gebracht.

5.2. Fluorescentieparameters als screeningparameters 5.2.1 Hogere efficiëntie van PS II en grote flexibiliteit als reactie op donkerstress Tijdens de donkerperiode namen alle fluorescentieparameters, behalve NPQ, toe (Figuur 4.3). Dit wijst er algemeen op dat de hybriden veel efficiënter omgingen met het beperkte licht dat ze kregen in de donkerperiode (afkomstig van de lichtpulsen van de LI-COR). De maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fv/Fm) bleef voor alle hybriden relatief constant gedurende de hele proef (Figuur 4.3A) rond een waarde van 0,8 die erop wijst dat de planten geen stress ondervonden aan PS II (Lichtenthaler et al., 2005). Fv/Fm 44

Discussie

wordt namelijk vaak gebruikt als indicator voor schade aan PS II door foto-inhibitie, omdat deze ratio sterk daalt bij gestresseerde planten (Roháček, 2002). Dit stemt overeen met het onderzoek van Lin & Hsu (2004) op Phalaenopsis amabilis waaruit bleek dat Fv/Fm (gemiddeld 0,8) niet werd beïnvloed door lage lichtintensiteiten. Na donkertransport was Fv/Fm ook niet verschillend bij Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’ (Hou et al., 2010) en Phalaenopsis equestris (Su et al., 2001). Pollet et al. (2010) nam bij Phalaenopsis ’s nachts ook een constante Fv/Fm waar met een gemiddelde waarde van 0,82. Er kan geconcludeerd worden dat een donkerperiode van vijf dagen geen effect had op Fv/Fm en dat deze fluorescentieparameter dus niet geschikt is om het effect van donkerstress na te gaan. Dit bevestigt het onderzoek van Hou et al. (2010). Waarschijnlijk is dit te wijten aan het feit dat Fv/Fm voornamelijk gelinkt wordt aan stress door foto-inhibitie (overmaat aan licht), wat hier niet het geval is. De toename van de overige fluorescentieparameters (met uitzondering van NPQ) tijdens de donkerperiode duidt op een grotere gebruikte fractie van de maximale efficiëntie van PS II (Fv’/Fm’), een grotere proportie van het geabsorbeerde licht dat werd gebruikt voor fotochemie (Fq’/Fm’), een grotere hoeveelheid open reactiecentra (qP) en een grotere actuele fotonenflux die PS II aandreven (ETR). Tijdens de donkerperiode onderdrukten de planten de fluorescentie minder via warmteverlies (lagere NPQ). Bovendien bleek er een inverse relatie te zijn tussen NPQ en Fq’/Fm’, wat het onderzoek van Pollet et al. (2010) bevestigt. De verandering van deze fluorescentieparameters wijzen dus met andere woorden op een grotere efficiëntie van PS II tijdens de donkerperiode. De toename van de fluorescentieparameters (en de afname van NPQ) tijdens de aanhoudende donkerperiode zijn in tegenstelling tot lagere fluorescentieparameters (en een hogere NPQ) in het donker tijdens een normale dag/nachtcyclus (data niet getoond). ’s Nachts werd ook een lagere Fq’/Fm’ en qP en een hogere NPQ waargenomen door Pollet et al. (2010). Een lagere waarde voor de fluorescentieparameters (en een hogere waarde voor NPQ) tijdens het donker bij een normale dag/nachtcyclus wordt als volgt verklaard (Figuur 3.5). Overdag draait de elektronentransportketen op volle toeren, er wordt NADPH en ATP aangemaakt en verbruikt om CO2 om te zetten in suikers via de Calvincyclus. Er is dus geen ophoping van NADPH en ATP in het stroma en de efficiëntie van PS II is hoog. Wanneer de planten ’s nachts een lichtpuls krijgen, raakt de elektronentransportketen verzadigd. De Calvincyclus gaat namelijk niet door in het donker waardoor geen NADPH en ATP wordt verbruikt. Door de ophoping van NADPH en ATP in het stroma, wordt de synthese ervan geïnhibeerd. Hierdoor hopen de elektronen in de elektronentransportketen en de protonen in het thylakoïdlumen op waardoor de efficiëntie van PS II daalt (lagere waarde voor de fluorescentieparameters). Een grote transmembrane protongradiënt zorgt bovendien voor de reversibele omzetting van violaxanthine naar zeaxanthine (pigmenten die een rol spelen bij de dissipatie van een overmaat aan energie). De binding van protonen en zeaxanthine aan het LHC zorgt voor veranderingen in de ruimtelijke schikking die leiden tot warmteverlies, hierdoor neemt NPQ dus toe (Steppe, 2011). Wanneer de planten worden blootgesteld aan een langere donkerperiode vindt er echter geen CO2 fixatie meer plaats en wordt ook geen NADPH en ATP gevormd in de lichtreacties. De Calvincyclus valt dus stil. Wanneer de elektronentransportketen nu elektronen krijgt (van een lichtpuls), zou deze dus weer verzadigd moeten raken om bovenvermelde redenen. Het is mogelijk dat de planten ‘weten’ dat ze al lang geen licht hebben gekregen (bv. door het circadiaans ritme/de endogene oscillator). Door de lichtpuls van de LI-COR kunnen ze het idee krijgen dat er een nieuwe 45

Discussie

lichtperiode zal aanbreken waardoor ze zo snel mogelijk NADPH en ATP willen aanmaken om de CO2 (die nog eventueel aanwezig is in de vacuole in het begin van de donkerperiode) te kunnen omzetten in suikers. Dit kan de verhoogde efficiëntie van PS II verklaren tijdens de donkerperiode. Wanneer de hybriden terug blootgesteld werden aan een dag/nachtregime namen de fluorescentieparameters onmiddelijk ongeveer dezelfde waarde aan als op de controledag (Figuur 4.3). De geteste Phalaenopsis hybriden reageerden dus veerkrachtig op de donkerstress van vijf dagen. Hieruit wordt eveneens besloten dat PS II niet beschadigd werd door de donkerperiode van vijf dagen. De waarden voor en na de donkerperiode zijn gelijkaardig. Dit bevestigt het onderzoek van Hou et al. (2010) op Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’. Uit de belichtingsstudies van Lin & Hsu (2004) en He & Teo (2007) bleek dat qP en ETR daalden en NPQ steeg met dalende belichting. De Phalaenopsis planten werden niet continu in het donker gehouden zoals tijdens ons onderzoek, wat de verschillende resultaten kan verklaren. Hou et al. (2010) vonden geen significant verschil tussen de qP van Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’ na 21 dagen donkertransport en de qP van controleplanten die geen donkertransport ondergingen. Dit komt overeen met ons onderzoek. Er werd echter geen vergelijking met controleplanten gemaakt, maar de qP nam na de donkerperiode wel ongeveer eenzelfde waarde aan als ervoor (Figuur 4.3D). Su et al. (2001) stelden daarentegen een daling van qP vast, maar geen invloed op NPQ na 10, 20 en 30 dagen donkertransport. Dit lijkt op het eerste zicht tegenstrijding met onze resultaten, maar in dit onderzoek werd geen vijf dagen donkertransport gesimuleerd waardoor een vergelijking met onze proef niet eenduidig is.

5.2.2 Dalende efficiëntie van PS II wanneer de donkerperiode vorderde Naarmate de donkerperiode vorderde, daalden alle gestegen fluorescentieparameters opnieuw, met uitzonder van de gedaalde NPQ die opnieuw steeg (Figuur 4.3). Dit wijst erop dat de verhoogde efficiëntie om met het licht om te springen, afnam naarmate de donkerperiode langer duurde. PS II werkte dus minder efficiënt naarmate de donkerperiode vorderde. Het is mogelijk dat de amplitude van de circadiaanse ritmes afzwakten omdat er geen extern signaal meer was om de expressie van de ritmes te initiëren. De afname van de fluorescentieparameters (en toename van NPQ) tijdens de laatste dagen van de donkerperiode was het grootst voor de meest knopvalgevoelige hybride. Het PS II van de knopvalgevoeligere planten werkte dus minder efficiënt wanneer de planten langdurig aan donker werden blootgesteld. Het kan gesuggereerd worden dat de productie van stresshormonen en dus 1-ACC toeneemt wanneer PS II minder efficiënt werkt.

5.2.3 Sommige fluorescentieparameters knopvalgevoeligheid

zijn

gerelateerd

aan

de

Fv’/Fm’ (Figuur 4.4B) en NPQ (Figuur 4.4E) konden tijdens het donker in de herstelperiode gerelateerd worden aan de volgorde van de knopvalgevoeligheid. Fv’/Fm’ was gemiddeld het hoogst voor de minst knopvalgevoelige hybride (hybride 1) en nam af naarmate de hybriden meer knopvalgevoelig waren, terwijl NPQ het laagst was voor de minst knopvalgevoelige 46

Discussie

hybride (hybride 1) en steeg naarmate de hybriden meer knopvalgevoelig waren. Fv’/Fm’ van de gevoelige hybriden (hybride 3 en 4) was in de herstelperiode bovendien significant verschillend met deze van de minder gevoeligere hybriden (hybride 1 en 2). Fv’/Fm’ en NPQ kunnen dus als screeningparameters worden voorgesteld: hoe hoger en lager deze waarden in het donker tijdens de herstelperiode, hoe minder knopvalgevoelig de hybride zal zijn. Een combinatie van Fv’/Fm’ en NPQ lijkt het meest aangewezen om de hybriden te selecteren op hun knopvalgevoeligheid. Ook de andere fluorescentieparameters kunnen gerelateerd worden aan de knopvalgevoeligheid ondanks het feit dat de significanties niet helemaal overeenstemmen. Aangezien Fq’/Fm’ en ETR zowel tijdens de donker- als de herstelperiode gemiddeld lager waren voor de knopvalgevoelige hybriden (Figuur 4.4C en F), zullen de meer gevoeligere soorten een lagere efficiëntie van PS II hebben en een kleinere actuele fotonenflux die PS II aandrijft. Deze redenering gaat ook op voor qP in de donkerperiode: een lagere waarde tijdens de donkerperiode wijst op meer knopvalgevoelige soorten (Figuur 4.4D). Ze bezitten dus een kleiner aandeel open reactiecentra in de donkerperiode. Uit de lagere Fv’/Fm’, Fq’/Fm’, qP en ETR en de hogere NPQ van de meer knopvalgevoelige soorten wordt afgeleid dat de efficiëntie van PS II lager was bij de gevoeligere soorten. De werking van PS II was dus meer gelimiteerd bij de knopvalgevoeligere hybriden door de vijf dagen donker. Als reactie op deze grotere donkerstress kan de aanmaak van het stresshormoon ethyleen worden bevorderd. Het is dus mogelijk dat er meer 1-ACC geproduceerd werd bij de meer gevoelige hybriden omdat ze meer stress ondervonden van de donkerperiode.

5.3. De rol van fotosynthese en transpiratie bij verhoogde knopval na donkerstress 5.3.1 Bladeren Na één dag donkerstress vond er in de bladeren geen dagelijkse CAM-cyclus meer plaats en respireerden de bladeren continu (Figuur 4.5). Door de afwezigheid van licht konden geen lichtreacties doorgaan en werd er geen NADPH en ATP aangemaakt via de elektronentransportketen. Door dit tekort aan NADPH en ATP kon CO2 via de Calvincyclus niet worden omgezet naar suikers, waardoor ook geen PEPC kon worden gevormd uit de afbraak van suikers. Aangezien PEPC het basissubstraat is om CO2 te binden, steeg de interne CO2 concentratie. Waarschijnlijk sloten de stomata hierdoor (Figuur 4.5) en werd er geen atmosferische CO2 en zuurstof meer opgenomen. Ceusters et al. (2011) stelden eveneens een negatieve totale CO2 balans over de volledige CAM-cyclus vast in beschaduwde Aechmea planten (zes dagen schaduw). Ook in het onderzoek van Hou et al. (2010) was de netto CO2 opnamesnelheid en stomatale geleidbaarheid nul na een donkerperiode van 21 dagen. Ze herstelden tot een normaal niveau zes tot acht dagen na het donkertransport. Door het sluiten van de stomata tijdens de donkerperiode is er een gebrek aan exogene CO2 opname. Hierdoor kan het hergebruik van CO2 uit respiratie optreden, wat ‘CAM-idling mode’ wordt genoemd. Dit effect is reeds beschreven bij droogtestress (Su et al., 2001; Ceusters et al., 2009) en kan mogelijks ook optreden wanneer de stomata sluiten bij donkerstress. De transpiratie in de 47

Discussie

donkerperiode was lager voor de knopvalgevoelige hybriden (Figuur 4.7). De stomata waren dus meer gesloten. Het sluiten van de stomata lijkt gerelateerd te zijn aan de hogere fotosynthetische stress veroorzaakt door de donkerperiode bij de gevoeligere hybriden. De respiratie nam toe en de transpiratie daalde, met uitzondering van hybride 4, naarmate de donkerperiode langer aanhield. De stomata sloten dus meer. Bij hybride 4 was vanaf de eerste dag donkerstress de respiratie al groot en de transpiratie al praktisch nul. Hieruit wordt besloten dat de bladeren meer stress ondervonden bij een langere donkerperiode. Deze resultaten zijn analoog aan het verloop van de fluorescentieparameters (Figuur 4.3). Wanneer de planten terug werden blootgesteld aan een normaal dag/nachtregime herstelde de CAM-cyclus zich in de bladeren (Figuren 4.5 en 4.8). Dit wijst er opnieuw op dat de planten zeer flexibel konden omgaan met donkerstress en dat het fotosynthese-apparaat niet beschadigd werd tijdens de donkerperiode en bevestigt de bevindingen die uit de fluorescentieparameters werden geconcludeerd. Hybride 4, die het meest gevoelig was aan knopval, herstelde echter trager dan de andere hybriden (Figuur 4.5). Dit blijkt ook uit het verloop van de fluorescentieparameters (Figuur 4.3). Het kan dus gesuggereerd worden dat de knopvalgevoeligere hybriden meer fotosynthetische stress ondervonden van de donkerperiode en minder flexibel reageerden bij de overgang naar een normaal dag/nachtregime. Aangezien ze meer stress ondervonden, nam mogelijks de 1-ACC productie toe.

5.3.2 Bloemstengels De bloemen en bloemstengels respireerden tijdens de donkerperiode continu (Figuur 4.9). Dit was ook zo in de herstelperiode waarbij bovendien een dag/nachtpatroon werd waargenomen met overdag een kleinere respiratie dan ‘s nachts. De lagere respiratie overdag kan verklaard worden doordat de bloemen en stengels in het licht een beetje aan fotosynthese deden, waardoor de totale respiratie kleiner werd overdag in vergelijking met ‘s nachts. De bloemen en stengels vertoonden dus (samen) een C3 fotosynthesemechanisme. Dit komt overeen met het onderzoek van Hew & Yong (1997) waarbij de bloemen van Phalaenopsis geen CAM metabolisme vertoonden. In hun onderzoek lieten de bloemstengels daarentegen wel een zwak CAM metabolisme zien. Aangezien in onze proef de bloemen en stengels in één branchbag werden opgemeten, kan het zijn dat de C3 fotosynthese van de bloemen het zwakke CAM metabolisme van de stengels overheerste. De studies van Endo & Ikusima (1989, 1992) en Goh (1983) namen echter wel een zwak CAM metabolisme waar in de bloemen van Phalaenopsis, Arachnis, Aranda, Dendrobium en Vanda hybriden. In onze proef was de transpiratiesnelheid continu positief en volgde het VPD, wat erop wijst dat de stomata van de bloemen altijd open waren, zowel in de donker- als de herstelperiode (Figuur 4.10). De stomata van de bloemen van deze hybriden zijn dus niet-functioneel aangezien de stomata niet openen en sluiten. Dit stemt overeen met het onderzoek van Hew et al. (1980).

5.3.3 Link met knopval Op basis van de resultaten waargenomen tijdens dit onderzoek, wordt onze hypothese (Hoofdstuk 1) voor knopval genuanceerd. Wanneer er geen lichtreacties plaatsvinden in de bladeren tijdens de donkerperiode, wordt er geen zuurstof gevormd en aangezien de stomata gesloten zijn, wordt er ook geen atmosferische zuurstof opgenomen. Hierdoor kan 1-ACC niet 48

Discussie

geconverteerd worden in ethyleen, omdat het ACC-oxidase zuurstof vereist, en hoopt het op in de bladeren. Aangezien de gevoeligere hybriden meer stress ondervinden ter hoogte van PS II, wordt er mogelijks een grotere hoeveelheid 1-ACC geproduceerd dat niet kan worden omgezet naar ethyleen. De bloemstengels blijven continu transpireren tijdens de donkerperiode waardoor 1-ACC vanuit de bladeren naar de bloemen en knoppen kan worden getransporteerd met de xyleem sapstroom. Dit deel van de hypothese sluit aan bij het onderzoek van Bradford & Yang (1980) die aantoonden dat 1-ACC transport plaatsvond via de xyleem sapstroom in tomaat. In hun onderzoek zorgden anaërobe condities rond de wortels ervoor dat 1-ACC niet kon geconverteerd worden naar ethyleen. Het 1-ACC hoopte hierdoor op in de wortels en werd via de transpiratiestroom naar de scheut getransporteerd, waar het wel werd omgezet naar ethyleen. Dit veroorzaakte in het geval van tomaat epinastie (ombuigen) van de bladeren. Bij de gevoeligere hybriden wordt waarschijnlijk meer 1-ACC naar de knoppen en bloemen getransporteerd doordat de bladeren minder transpireren (stomata meer gesloten) en het aandeel van de bloemtranspiratie tijdens de donkerperiode dus groter is. De fractie van de bloemtranspiratie op de totale transpiratie (blad + bloem) nam namelijk toe tijdens donkerperiode naarmate de hybriden meer knopvalgevoelig waren (deze fracties waren voor hybride 1, 2, 3 en 4 respectievelijk 0,85, 0,93, 0,97 en 0,97). Naast het transport van 1-ACC naar de bloemen kan 1-ACC eventueel ook naar de wortels worden getransporteerd waar het wordt gedetoxificeerd tot N-malonyl ACC. Wanneer de planten terug licht krijgen tijdens de herstelperiode, komen de lichtreacties terug op gang en wordt er weer zuurstof gevormd. Daardoor kan de omzetting van 1-ACC naar ethyleen plots terug plaatsvinden. Aangezien het aannemelijk is dat er meer 1-ACC accumuleert tijdens de donkerperiode in de bloemstengels van de gevoeligere soorten (door meer fotosynthetische stress en minder bladtranspiratie), is er dus meer ethyleenproductie in hun knoppen tijdens de herstelperiode waardoor een grotere knopval wordt geïnduceerd.

49

Hoofdstuk 6

Conclusies en perspectieven


Vanwege het grote economische belang van Phalaenopsis voor de sierteelt, was het doel van deze masterthesis om de link tussen knopval en donkertransport te achterhalen. In dit laatste hoofdstuk worden de voornaamste besluiten van dit onderzoek samengevat en worden suggesties gegeven voor toekomstig onderzoek.

6.1. Algemene besluiten Uit de praktijk blijkt dat het donkertransport van sommige Phalaenopsis hybriden knopval induceert: de knoppen vallen af wanneer ze terug in het licht worden geplaatst. In de literatuur (Hoofdstuk 1) is echter weinig beschreven over de oorzaken van deze knopval. Het wordt algemeen aanvaard dat ethyleen knopval induceert en dat de knopval verhinderd wordt door ethyleeninhibitoren. Ethyleen heeft dus een sleutelrol in het proces dat knopval veroorzaakt. Om de vooropgestelde hypothese te verifiëren (Hoofdstuk 1), werden vier Phalaenopsis hybriden getest op hun gevoeligheid aan knopval na vijf dagen donker. Hieronder worden de belangrijkste resultaten samengevat. Aangezien er geen gestandaardiseerde methode bestaat om de knopvalgevoeligheid van een hybride te definiëren, werden tijdens dit onderzoek verschillende mogelijkheden getest. Uit de resultaten bleek dat rekening moet worden gehouden met het aantal oorspronkelijke knoppen die de planten bezitten. De knopval na de donkerperiode wordt best procentueel ten opzichte van dit oorspronkelijk aantal knoppen uitgedrukt. Bovendien is het belangrijk dat de knopval gemiddeld per hybride wordt bepaald aangezien er een grote variabiliteit is tussen de planten van één hybride. Ook moet een keuze gemaakt worden tussen enkel grote knoppen (commercieel belangrijker) of alle knoppen in rekening brengen. Indien de knopvalgevoeligheid enkel op de grotere knoppen gebaseerd wordt, is het noodzakelijk om een consistente ondergrens voor de knopgrootte vast te leggen. Uit de resultaten bleek dat de vier Phalaenopsis hybriden allemaal gevoelig waren aan knopval na een donkerperiode van vijf dagen. De donkerperiode had enkel een invloed op knoppen kleiner dan 2,0 cm, terwijl de grotere knoppen zich verder ontwikkelden. Het is echter tijdrovend voor de orchideeënkwekers indien na een donkerperiode elke dag de knopval van de verschillende hybriden moet worden opgevolgd om te bepalen welke hybriden knopvalgevoelig zijn. Vandaar werd in dit onderzoek ook gefocust op de ontwikkeling van een snelle screeningmethode. Via het opmeten van fluorescentieparameters met behulp van de LI-6400XT wordt zo een screening mogelijk. Uit dit onderzoek kwamen namelijk twee fluorescentieparameters naar voor die samen kunnen gebruikt worden om snel te screenen op knopvalgevoeligheid, namelijk Fv’/Fm’ en NPQ. Hoe hoger Fv’/Fm’ en hoe lager NPQ in het donker tijdens de herstelperiode, hoe minder knopvalgevoelig de hybride zal zijn. Door een combinatie van fluorescentie-, fotosynthese- en transpiratiemetingen op de bladeren tijdens de donker- en herstelperiode werd getracht de oorzaak van de knopval te achterhalen. Na één dag donker vond er geen dagelijkse CAM-cyclus meer plaats en respireerden de bladeren continu. Door de afwezigheid van licht konden namelijk geen lichtreacties doorgaan en werd er geen NADPH en ATP aangemaakt via de elektronentransportketen. Door dit tekort aan NADPH en ATP kon CO2 via de Calvincyclus niet worden omgezet naar suikers, waardoor ook geen PEPC kon worden gevormd uit de afbraak van suikers. Aangezien PEPC 51


het basissubstraat is om CO2 te binden, steeg de interne CO2 concentratie. Hierdoor sloten de stomata en kon er geen atmosferische CO2 meer worden opgenomen. Wanneer de planten terug werden blootgesteld aan een normaal dag/nachtregime herstelde de CAM-cyclus in de bladeren zich en namen de fluorescentieparameters ongeveer dezelfde waarde aan als voor de donkerperiode. Dit wijst erop dat de planten zeer flexibel konden omgaan met donkerstress en dat het fotosynthese-apparaat niet werd beschadigd tijdens de donkerperiode. De hybriden gingen tijdens de donkerperiode ook veel efficiënter om met licht waarbij de gevoeligere hybriden een lagere efficiëntie van PS II hadden in vergelijking met de minder gevoelige hybriden. De bladeren ondervonden meer stress naarmate de donkerperiode vorderde aangezien de respiratie toenam, de stomata meer sloten en de verhoogde efficiëntie van PS II geleidelijk afnam. Deze daling van de fotosynthetische efficiëntie tijdens de laatste dagen van de donkerperiode was het grootst voor de meest knopvalgevoelige hybride. Het PS II van de knopvalgevoeligere hybriden werkte dus minder efficiënt wanneer de planten langdurig aan donker werden blootgesteld. Knopvalgevoelige hybriden ondervonden bijgevolg meer stress ter hoogte van PS II tijdens de donkerperiode en naarmate de donkerperiode vorderde. Ze bezaten bovendien een kleiner aanpassingsvermogen bij de overgang naar een normaal dag/nachtregime. Aangezien deze hybriden meer stress ondervonden, is het waarschijnlijk dat meer stresshormonen (1-ACC) werden geproduceerd. Uit de fotosynthese- en transpiratiemetingen uitgevoerd op de bloemstengels bleek dat de bloemen en stengels een C3 fotosynthesemechanisme vertoonden. De stomata waren bovendien niet-functioneel aangezien er continu transpiratie plaatsvond en het transpiratiepatroon het VPD volgde. Aangezien er geen lichtreacties plaatsvonden in de bladeren tijdens de donkerperiode en er geen exogeen zuurstof kon worden opgenomen door de gesloten stomata, was er geen zuurstof aanwezig in de bladeren. Hierdoor kon 1-ACC niet geconverteerd worden in ethyleen, aangezien het ACC-oxidase zuurstof vereist, en werd het opgehoopt in de bladeren. Doordat de bloemen continu transpireerden, zowel tijdens de donker- als de herstelperiode, kon 1-ACC vanuit het blad via de xyleem sapstroom naar de bloemen en knoppen worden getransporteerd. Aangezien de gevoeligere hybriden meer stress ondervonden ter hoogte van PS II, werd er hoogstwaarschijnlijk meer 1-ACC geproduceerd dat niet kon worden omgezet naar ethyleen. Bovendien was de bladtranspiratie van deze hybriden tijdens de donkerperiode lager. Hierdoor was het aandeel van de transpiratiestroom die naar de bloemen en knoppen ging groter en is het dus mogelijk dat er meer 1-ACC met de xyleem sapstroom naar de knoppen ging. Het is bijgevolg plausibel dat bij de gevoeligere hybriden meer 1-ACC naar de knoppen en bloemen werd getransporteerd. Wanneer de planten terug licht kregen tijdens de herstelperiode, kwamen de lichtreacties terug op gang en werd er weer zuurstof gevormd. Daardoor kon de omzetting van 1-ACC naar ethyleen terug plaatsvinden. Aangezien er vermoedelijk meer 1-ACC accumuleerde tijdens de donkerperiode in de bloemstengels van de gevoeligere soorten, was er dus ook meer ethyleenproductie in de knoppen waardoor een grotere knopval werd geïnduceerd.

52


6.2. Suggesties voor verder onderzoek De link tussen knopval bij Phalaenopsis na donkertransport, fotosynthese en ethyleen werd nog nooit eerder gemaakt. Vandaar is verder onderzoek aangewezen waarbij zeker rekening moet worden gehouden met onderstaande aandachtspunten. Aangezien Phalaenopsis vaak intercontinentaal wordt getransporteerd, zou moeten getest worden of er een bijkomend effect is van het verschuiven van het dag/nachtregime bij intercontinentaal transport op de knopval. Hierbij kan de knopval na een donkerperiode op controleplanten zonder verschuiving van het dag/nachtregime worden vergeleken met de knopval bij hybriden die na de donkerperiode wel worden blootgesteld aan deze verschuiving. Indien het verschuiven van het dag/nachtregime een significante extra stressfactor blijkt te zijn voor de knopval, zal dit moeten worden meegenomen in de selectie van de knopvalongevoelige hybriden. Aan de hand van chlorofyl fluorescentiemetingen op vier Phalaenopis hybriden konden Fv’/Fm’ en NPQ tijdens de herstelperiode als screeningparameters worden voorgesteld. Het is echter wenselijk om de proefopzet uit te breiden met een hoger aantal hybriden om in te schatten of deze screeningparameters algemeen bij Phalaenopsis kunnen worden gebruikt. Bovendien kan getest worden of deze parameters significant verschillen tussen gevoelige en niet-gevoelige soorten zonder dat eerst een donkerperiode moet worden opgelegd. Indien dit het geval is, kan de screening nog sneller verlopen omdat de planten dan niet eerst een donkerperiode moeten ondergaan. Om de oorzaak van de knopval met zekerheid te bevestigen, zouden enkele bijkomende metingen kunnen worden uitgevoerd. Het opmeten van het verloop van de 1-ACC concentratie in de knoppen tijdens de donkerperiode kan de hypothese bevestigen dat knopvalgevoeligere hybriden meer 1-ACC accumuleren in de knoppen in vergelijking met minder gevoelige hybriden. Door de ethyleenproductie in de bloemen tijdens de donkerperiode en de herstelperiode op te meten, kan met zekerheid geconcludeerd worden dat deze verwaarloosbaar is tijdens de donkerperiode door gebrek aan zuurstof. Hierdoor kan 1ACC niet omgezet worden in ethyleen omdat het ACC-oxidase zuurstof vereist. In het begin van de herstelperiode zou dan een plotse piek in de ethyleenproductie moeten worden waargenomen omdat er dan wel terug lichtreacties doorgaan die zuurstof leveren. De ethyleenconcentratie kan worden opgemeten via gaschromatografie met een vlamionisatiedetector. Het gebrek aan zuurstof tijdens de donkerperiode zou ook kunnen bevestigd worden door de interne zuurstofconcentratie in de bladeren op te meten. Dit kan aan de hand van een infrarood gas analysator met een absorptieband voor zuurstof of een ‘leaf disc electrode’ (Hansatech-instruments, Norfolk, England). Om de knopval te voorkomen zouden, naast ethyleeninhibitoren, ook andere alternatieven kunnen worden onderzocht. Een eerste mogelijkheid is het verhinderen van de transpiratie. Wanneer een afgesloten plastieken zak rond de bloemstengels wordt gedaan tijdens het donkertransport, zal de transpiratie stilvallen (door de hoge RH). Hierdoor kan 1-ACC niet naar de knoppen worden getransporteerd. Als de planten na het transport terug in het licht komen te staan, is het waarschijnlijk dat de omzetting van 1-ACC naar ethyleen voornamelijk 53


in de bladeren plaatsvindt. Het gasvormige ethyleen kan dan via de bladeren ontsnappen. Na enkele dagen bij een normaal dag/nachtregime, als het opgehoopte 1-ACC verdwenen is, zou de plastieken zak dan kunnen worden verwijderd. Een tweede toekomstmogelijkheid is de donkerstress voorkomen door een lichtbron in de vrachtwagen te plaatsen. Dit zorgt ervoor dat de planten een hogere economische waarde hebben aangezien geen knopval plaatsvindt. De meerkost van het extra energiegebruik van de lichtbron kan mogelijks gecompenseerd worden door de hogere verkoopwaarde van de orchideeën. Bovendien kunnen de energiekosten gereduceerd worden via het gebruik van alternatieve energiebronnen zoals zonne-energie. Hiervoor is verder onderzoek aangewezen.

54

Hoofdstuk 7

Referenties

Referenties

Aschan G. & Pfanz H. (2003). Non‐foliar photosynthesis ‐ a strategy of additional carbon acquisition. Flora, 198, 81‐97. Baker N.R. (2008). Chlorophyll fluorescence: A probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology, 59, 89-113. Bernard N. (1909). L’évolution dans la symbiose. Les orchidées et leurs champignons commensaux. Annales Des Sciences Naturelles Botanique, 9, 1-196. Black C.C. & Osmond C.B. (2003). Crassulacean acid metabolism photosynthesis: 'working the night shift'. Photosynthesis Research, 76, 329-341. Borland A.M. & Taybi T. (2004). Synchronization of metabolic processes in plants with Crassulacean acid metabolism. Journal of Experimental Botany, 55, 1255-1265. Borland A.M., Zambrano V.A.B., Ceusters J. & Shorrock K. (2011). The photosynthetic plasticity of crassulacean acid metabolism: an evolutionary innovation for sustainable productivity in a changing world. New Phytologist, 191, 619-633. Bradford K.J. & Yang S.F. (1980). Stress-induced ethylene production in the ethylenerequiring tomato mutant diageotropica. Plant Physiology, 65, 327-330. Burgeff H. (1909). Die Wurzelpilze der Orchideen, ihre Kultur und ihr Leben in der Pflanze. Jena: Gustav Fischer Verlag. Ceusters J., Borland A.M., Londers E., Verdoodt V., Godts C. & De Proft M.P. (2009). Differential usage of storage carbohydrates in the CAM bromeliad Aechmea 'Maya' during acclimation to drought and recovery from dehydration. Physiologia Plantarum, 135, 174‐184. Ceusters J., Borland A.M., Godts C., Londers E., Croonenborghs S., Van Goethem D. & De Proft M.P. (2011). Crassulacean acid metabolism under severe light limitation: a matter of plasticity in the shadows? Journal of Experimental Botany, 62, 283-291. Cha-um S., Ulziibat B. & Kirdmanee C. (2010). Effects of temperature and relative humidity during in vitro acclimatization, on physiological changes and growth characters of Phalaenopsis adapted to in vivo. Australian Journal of Crop Science, 4, 750-756. Cockburn W., Ting I.P. & Sternberg L.O. (1979). Relationships between stomatal behavior and internal carbon dioxide concentration in crassulacean acid metabolism plants. Plant Physiology, 63, 1029‐1032. Dawson J.C., Huggins D.R. & Jones S.S. (2008). Characterizing nitrogen use efficiency in natural and agricultural ecosystems to improve the performance of cereal crops in low-input and organic agricultural systems. Field Crops Research, 107, 89-101. Dodd A.N., Borland A.M., Haslam R.P., Griffiths H. & Maxwell K. (2002). Crassulacean acid metabolism: plastic, fantastic. Journal of Experimental Botany, 53, 569-580.

55

Referenties

Dueker J. & Arditti J. (1968). Photosynthetic 14CO2 fixation by green Cymbidium (Orchidaceae) flowers. Plant Physiology, 43, 130-132. Endo M. & Ikusima I. (1989). Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant and Cell Physiology, 30, 43-47. Endo M. & Ikusima I. (1992). Changes in concentrations of sugars and organic acids in the long-lasting flower clusters of Phalaenopsis. Plant Cell Physiology, 33, 7-12. Goh C.J. (1983). Rhythms of acidity and CO2 production in orchid flowers. New Phytologist, 93, 25-32. Goh C.J., Avadhani P.N., Loh C.S., Hanegraaf C. & Arditti J. (1977). Diurnal stomatal and acidity rhythms in orchid leaves. New Phytologist, 78, 365‐372. Griesbach R.J. (2002). Development of Phalaenopsis orchids for the mass-market. In: Janick J. & Whipkey A. (eds.), Trends in new crops and new uses. Alexandria: ASHS Press, 458465. Guo W.J. & Lee N. (2006). Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. Journal of the American Society for Horticultural Science, 131, 320-326. Haslam R., Borland A., Maxwell K. & Griffiths H. (2003). Physiological responses of the CAM epiphyte Tillandsia usneoides L. (Bromeliaceae) to variations in light and water supply. Journal of Plant Physiology, 160, 627-634. He J. & Teo L.C.D. (2007). Susceptibility of green leaves and green flower petals of CAM orchid Dendrobium cv. Burana Jade to high irradiance under natural tropical conditions. Photosynthetica, 45, 214-221. Hew C.S., Lee G.L. & Wong S.C. (1980). Occurance of non-functional stomata in the flowers of tropical orchids. Annals of Botany, 46, 195-201. Hew C.S. & Yong J.W.H. (1997). The physiology of tropical orchids in relation to the industry. Singapore: World Scientific. Hou J.-Y., Setter T.L. & Chang Y.-C.A. (2010). Effects of simulated dark-shipping on photosynthetic status and post-shipping performance in Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’. Journal of the American Society of Horticultural Science, 135, 183-190. Ichihashi S., Higuchi T., Shibayama H., Tesima Y., Nishiwaki Y. & Ota K. (2008). Aspects of CO2 uptake in the crassulacean acid metabolism orchid Phalaenopsis. Acta Horticulturae, 766, 245-256. K.B. inzake de bescherming van in het wild levende dieren plantensoorten door controle op het desbetreffende handelsverkeer (9 april 2003), Belgisch Staatsblad, 31045-31061.

56

Referenties

Ketsa S. & Thampitakorn F. (1995). Characteristics of ethylene production of Dendrobium orchid flowers. Acta Horticulturae, 405, 253-263. Klee H.J., Hayford M.B., Kretzmer K.A., Barry G.F. & Kishore G.M. (1991). Control of ethylene synthesis by expression of a bacterial enzyme in transgenic tomata plants. The Plant Cell, 3, 1187-1193. Kluge M. & Ting I.P. (1978). Crassulacean Acid Metabolism: Analysis of an ecological adaptation. Berlin: Springer Verlag. Knudson L. (1922). Nonsymbiotic germination of orchid seeds. Botanical gazette, 73, 1-25. Konow E.A. & Wang Y.-T. (2001). Irradiance levels affect in vitro and greenhouse growth, flowering and photosynthetic behavior of a hybrid Phalaenopsis orchid. Journal of the American Society of Horticultural Science, 126, 531-536. Laisk A. & Oja V. (1998). Dynamic gas exchange of leaf photosynthesis. Measurement and interpretation. Canberra: CSIRO Publishing. Lawlor D.W. (1993). Photosynthesis: Molecular, physiological and environmental processes. 2nd ed. Essex, UK: Longman Scientific & Technical. Lichtenthaler H.K., Buschmann C. & Knapp M. (2005). How to correctly determine the different chlorophyll fluorescence parameters and the chlorophyll fluorescence decrease ratio R-Fd of leaves with the PAM fluorometer. Photosynthetica, 43, 379-393. LI-COR (2004). Using the LI-6400/LI-6400XT Portable Photosynthesis System. 5th ed. LICOR Biosciences, Inc, Lincoln Nebraska. Lin M.-J. & Hsu B.-D. (2004). Photosynthetic plasticity of Phalaenopsis in response to different light environments. Journal of Plant Physiology, 161, 1259-1268. Lopez R. & Runkle E. (2004). The flowering of orchids. A reality check. Orchids, 196-203. www.aos.org. Lopez R.G. & Runkle E.S. (2005). Environmental physiology of growth and flowering of orchids. Hortscience, 40, 1969-1973. Lüttge U. (2002). CO2-concentrating: consequences in Crassulacean acid metabolism. Journal of Experimental Botany, 53, 2131-2142. Lüttge U. (2004). Ecophysiology of Crassulacean Acid Metabolism (CAM). Annals of Botany, 93, 629-652. Lüttge U., Ball E., Fetene M. & Medina E. (1991a). Flexibility of crassulacean acid metabolism in Kalanchoë pinnata (Lam.) Pers. I. Response to irradiance and supply of nitrogen and water. Journal of Plant Physiology, 137, 259-267.

57

Referenties

Lüttge U., Ball E. & Fetene M. (1991b). Flexibility of crassulacean acid metabolism in Kalanchoë pinnata (Lam.) Pers. II. Light-use characteristics of plants grown in low or high light. Journal of Plant Physiology, 137, 268-272. Mapeli A.M., de Oliveira L.S., Megguer C.A., Barbosa J.G., Barros R.S. & Finger F.L. (2009). Characterisation of respiration, ethylene production, and carbohydrate contents during flower opening in Epidendrum ibaguense. Journal of Horticultural Science & Biotechnology, 84, 609-612. Maxwell K. & Johnson G.N. (2000). Chlorophyll fluorescence - a practical guide. Journal of Experimental Botany, 51, 659-668. Morel G.M. (1965). Clonal propagation of orchids by meristem culture. Cymbidium Society News, 20, 3-11. Nadeau J.A., Zhang X.S., Nair H. & O'Neill S.D. (1993). Temporal and spatial regulation of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase in the pollination-induced senescence of orchid flowers. Plant Physiology, 103, 31-39. Neales T.F. & Hew C.S. (1975). 2 types of carbon fixation in tropical orchids. Planta, 123, 303-306. Nobel, P. S., García-Moya E. & Quero E. (1992). High annual productivity of certain agaves and cacti under cultivation. Plant, Cell and Environment, 15, 329-335. Ogburn R.M. & Edwards E.J. (2010). The ecological water-use strategies of succulent plants. In: Kader J.-C. & Delseny M. (eds.), Advances in Botanical Research, Vol. 55. Burlington: Academic Press, 179-255. Oudshoorn W. (2007). Orchideeën. Utrecht: Kosmos Uitgevers. Pinske J. (2009). Phalaenopsis. De lievelingsorchidee. Aartselaar: Deltas. Pollet B. (2010). Impact of cool night temperatures on Phalaenopsis photosynthetic activity and psysiology to support an energy conscious greenhouse heating. PhD thesis, Ghent University, Belgium. Pollet B., Steppe K., Dambre P., Van Labeke M.-C. & Lemeur R. (2010). Seasonal variation of photosynthesis and photosynthetic efficiency in Phalaenopsis. Photosynthetica, 48, 580588. Pollet B., Vanhaecke L., Dambre P., Lootens P. & Steppe K. (2011). Low night temperature acclimation of Phalaenopsis. Plant Cell Reports, 30, 1125-1134. Raffeiner B., Serek M. & Winkelmann T. (2009). 1-Methylcyclopropene inhibits ethylene effects in cut inflorescences and potted plants of Oncidium and Odontoglossum orchid species. European Journal of Horticultural Science, 74, 10-15.

58

Referenties

Roháček, K. (2002). Chlorophyll fluorescence parameters: the definitions, photosynthetic meaning, and mutual relationships. Photosynthetica, 40, 13-29. Ronse A. (2008). Orchideeën. Sublieme Verleiders. Oostkamp: Stichting Kunstboek bvba. Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005a). The Orchid Grower, part 1. Greenhouse Grower, 1, 64‐67. Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005b). The Orchid Grower, part 2. Greenhouse Grower, 2, 70‐72. Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005c). The Orchid Grower, part 3. Greenhouse Grower, 3, 96‐100. Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005d). The Orchid Grower, part 4. Greenhouse Grower, 4, 86‐89. Shin Y.-K., Yoon Y.-J., Hahn E.-J. & Paek K.-Y. (2009). Photosynthetic Photon Flux (PPF) affects growth, photosynthesis and acclimatization of Phalaenopsis 'Amaglade' plantlets. Korean Journal of Horticultural Science & Technology, 27, 476-481. Silvera K., Santiago L.S., Cushman J.C. & Winter K. (2009). Crassulacean acid metabolism and epiphytism linked to adaptive radiations in the Orchidaceae. Plant Physiology, 149, 18381847. Skillman J.B. & Winter K. (1997). High photosynthetic capacity in a shade-tolerant crassulacean acid metabolism plant. Plant Physiology, 113, 441-450. Steppe K. (2011). Ecofysiologie. Bio‐Ingenieurswetenschappen.

Cursus,

Universiteit

Gent,

Faculteit

Su V., Hsu B.-D. & Chen W.-H. (2001). The photosynthetic activities of bare rooted Phalaenopsis during storage. Scientia Horticulturae, 87, 311-318. Sun Y., Christensen B., Liu F., Wang H. & Müller R. (2009). Effects of ethylene and 1-MCP (1-methylcyclopropene) on bud and flower drop in mini Phalaenopsis cultivars. Plant Growth Regulation, 59, 83-91. Taiz L. & Zeiger E. (2006). Plant physiology. 4th ed. Massachusetts: Sinauer. Uthaichay N., Ketsa S. & van Doorn W.G. (2007). 1-MCP pretreatment prevents bud and flower abscission in Dendrobium orchids. Postharvest Biology and Technology, 43, 374-380. Vakblad voor de Bloemisterij. (2005). 27, 46-48. Vakblad voor de Bloemisterij. (2010). 23a, 92-94. Vakblad voor de Bloemisterij. (2011). 22, 44-45.

59

Referenties

Wang Y.-T. (1998). Deferring flowering of greenhouse-grown Phalaenopsis orchids by alternating dark and light. Journal of the American Society of Horticultural Science, 123, 5660. Wang Y.-T. (2007). Temperature, duration in simulated shipping, and thermal acclimatization on the development of chilling injury and subsequent flowering of Phalaenopsis. Journal of the American Society of Horticultural Science, 132, 202-207. Woltering E.J. & van Doorn W.G. (1988). Role of ethylene in senescence of petals Morphological and taxonomical relationships. Journal of Experimental Botany, 39, 16051616. Woltering E.J. & Westra E.H. (2010). Ethyleenvisie GreenRail: ethyleen bij treintransport van potplanten. Food & Biobased Research N° 1158, 1-19. Woerner A.C. & Martin C.E. (1999). Mechanistic basis of differences in water-use efficiency between a CAM and a C3 species of Peperomia (Piperaceae). New Phytologist, 144, 307-312.

60

Donkerstress bij orchideeën (Phalaenopsis sp.)

Recommend Documents