20/12/2015
DNA REPAIR, MUTASI GEN dan POLIMORFISME oleh:
PERBAIKAN DNA DNA bukanlah substansi yang lemah, mampu menetralisasi “gangguan-gangguan” tidak membawa efek negatif.
dr.Syazili Mustofa Departemen Biokimia dan Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Lampung 2015
Pada fase G1 (Gap 1) terdapat check point Apabila ada kesalahan DNA, sel mempunyai dua pilihan : Pertama, kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA repair.
Mekanisme yang dimiliki DNA tersebut adalah mekanisme DNA repair (perbaikan DNA) yang terjadi pada fase tertentu dalam siklus sel.
MEKANISME PERBAIKAN DNA Ada 3 mekanisme utama: 1.Base excision, 2. Nucleotide excision 3. Mismatch repair.
kedua yaitu “dimatikan” berapoptosis Sel dengan DNA normal melengkapi siklus yang tersisa yaitu S (Sintesis), G2 (Gap 2) dan M (Mitosis).
1
20/12/2015
Base excision (Pemotongan Basa) Basa-basa DNA dapat dirusak melalui deamination atau alkylation. Tempat kerusakan basa tersebut disebut dengan "abasic site" atau "AP site". Pada E.coli, enzim DNA glycosylase dapat mengenal AP site dan membuang basanya. Kemudian AP endonuclease membuang AP site dan nucleotida sekitarnya. Kekosongan akan diisi dengan bantuan DNA polymerase I dan DNA ligase.
Nucleotide excision (Pemotongan nukleotida) Pada E. coli, protein UvrA, UvrB, dan UvrC berperan dalam membuang nukleotida ( dimer akibat UV light). Kemudian kekosongan akan diisi dengan bantuan enzim DNA polymerase I dan DNA ligase. Pada yeast, proteins Uvr's dikenal dengan nama RADxx ("RAD" kependekan dari "radiation"), seperti RAD3, RAD10 dll
2
20/12/2015
1. Reparasi dengan memotong (excission repair) Terdiri dari 3 tahap: a. Mengenali DNA yang ‘rusak’ kemudian memotong DNA tersebut oleh enzim DNA glycosilase b. Menginkorporasi nukleotida pada daerah yang terpotong/hilang tersebut oleh enzim DNA polymerase in the gap c. Menyambungkan nukleotida yang baru pada untaian DNA asal oleh enzim DNA ligase
2. Reparasi yang tergantung oleh sinar (light-dependent repair) Misalnya, untuk kerusakan karena terjadinya Timin dimer Tahap-tahapnya: a. Enzim Fotoliase mengenali adanya timin dimer dan mengikat timin dimer tsb b. Dengan bantuan sinar, enzim fotoliase memotong/menguraikan ikatan antar timin tsb
Beberapa penyakit disebabkan oleh rusaknya sistem reparasi DNA Nama
Fenotip
Enzim yang dipengaruhi
--------------------------------------------------------------------------------Xeroderma pigmentosum
Kanker kulit, sensititif thdp UV
nucleotide excission repair
Ataxia-telangecia (AT)
Leukemia, limfoma
ATM protei,
3
20/12/2015
Mismatch repair (Perbaikan yang tidak berpasangan) Untuk memperbaiki basa yang tidak berpasangan harus diketahui pasangan basa mana yang salah. Pada E. coli, ini dapat diketahui oleh methylase yang disebut dengan "Dam methylase", dimana dapat memetilasi adenines yang terdapat pada urutan (5')GATC . Segera sesudah replikasi DNA, template strand dimetilasi, tetapi strand yang baru disintesa belum dimetilasi. Jadi antara template strand dan new strand akan berbeda. .
Dimulai dengan berikatannya protein MutS pada mismatched base pairs. Kemudian MutL mengaktifkan MutH untuk bergabung bersama pada urutan GATC. MutH akan membelah strand yang tidak dimetilasi pada tempat GATC . Selanjutnya, segment dari tempat pembelahan akan dibuang oleh enzim exonuclease (dengan bantuan enzim helicase II dan SSB proteins).
Bila pembelahannya pada bagian 3' dari kerusakan, akan dipotong oleh enzim exonuclease I dan bila pada bagian 5' oleh enzim exonuclease VII atau RecJ untuk mendegradasi single tranded DNA. Kekosongannya akan diisi dengan bantuan enzim DNA polymerase III dan DNA ligase. Jarak antara tempat GATC dengan kerusakan bisa mencapai sepanjang 1,000 base pairs Bagaimanapun juga perbaikan sistem ini mahal dan tidak efisien.
4
20/12/2015
Mutasi gen - Perubahan pada materi genetik (DNA) yang dapat diturunkan - Disebabkan oleh 2mekanisme dasar: * kesalahan pada proses replikasi DNA * kegagalan dalam mereparasi DNA yang rusak - terjadi secara spontan atau diinduksi oleh agent fisik atau bahan kimia (mutagen) - organisma yg mengalami mutasi : mutan - berperan dlm evolusi mahluk hidup; pada bakteri utk resistensi thdp antibiotik
Contoh-contoh mutasi gen:
3 Faktor utama yang menyebabkan terjadinya mutasi spontan 1. Keakuratan komponen-komponen (“mesin”) dalam replikasi DNA 2. Efisiensi mekanisme proses perbaikan DNA yg rusak (DNA repair mechanism) 3. Tingkat pemaparan mutagenic agents yg ada di lingkungan
Proses mutasi dan ekspresinya pada individu normal dan mutannya
5
20/12/2015
“Point mutation” : mutasi yang melibatkan perubahan tempat spesifik dalam suatu gen, termasuk substitusi, delesi dan insersi pasangan basa.
Mekanisme terjadinya mutasi 1. Tautomerisasi pada replikasi DNA
“Missense mutation” : mutasi yang menyebabkan perubahan kodon spesifik suatu asam amino ke asam amino yang lain “Nonsense mutation” : mutasi yang menyebabkan perubahan kodon spesifik suatu asam amino ke kodon terminasi “Frameshift mutation” : mutasi yang merubah “pembacaan” dari mRNA, disebabkan oleh adanya delesi atau insersi pasangan basa
Tautomerisasi: proses berpindahnya atom hidrogen dari basa nitrogen yg satu ke yang lain. Mutasi yang ditimbulkan: - Mutasi transisi: perubahan basa nitrogen dari purin ke purin atau pirimidin ke pirimidin - Mutasi tranversi: perubahan basa nitrogen dari purin ke pirimidin atau sebaliknya
2. Kegagalan dalam mereparasi DNA yang rusak Reparasi DNA yang rusak dapat dilakukan dengan cara, antara lain: - Pengguntingan DNA yang rusak dengan menggunakan enzim DNA glikosilase
6
20/12/2015
- Reparasi DNA dengan menggunakan cahaya/sinar (fotoreaktivasi), dengan menggunakan enzim DNA fotoliase
“Mutagenic agent” • Bahan Kimia - “alkylating agent”: bahan kimia yang dapat memindahkan gugus alkyl ke basa nitrogen pada DNA. Contoh: Gas mustard [Di-(2-chloroethyl) sulfide] EMS (Ethyl methane sulfonate) - Basa analog: bahan kimia yg strukturnya mirip dengan basa nitrogen normal, yang dapat terinkoporasi ke dalam DNA Contoh: 5-Bromouracil (BU) 2-Aminopurin (2-AP)
- “Deaminating agent”: dapat mendeaminasi gugus amino pada basanitrogen Contoh: Asam nitrous (HNO2) - “Hydroxylating agent”: menghidroksilasi gugus amino pada pada basa nitrogen, sehingga terjadi mutasi transisi. Contoh: Hydroxylamine - Zat warna akridin (proflavin): mengikat molekul DNA -Sinar Radiasi: Radiasi ion (sinar X, sinar gamma, sinar kosmik dan Radiasi non ion (sinar ultra violet)
Kelainan-kelainan akibat mutasi gen - “Sickle cell anemia”: mutasi substitusi pada gen beta globin sehingga terjadi perubahan dalam alel hemoglobin S dari hemoglobin A yang normal, menyebabkan bentuk sel darah merah abnormal (“sickle”) - “Tay-Sachs disease”: mutasi pada gen HEXA yang mengkode enzym Hexosamidase A meyebabkan enzim tidak dapat mengkatalisis perubahan ganglioside GM2 menjadi GM3 yang diperlukan untuk menyelubungi sel saraf, sehingga fungsi sel saraf terganggu
7
20/12/2015
- Penyakit/kelainan yang disebabkan oleh adanya defek dalam metabolisme fenilalanin-tirosin, yang merupakan asam amino penting dalam sintesis protein
Mutation in exon 6 of VDAC3 gene in sperm with low motility
Polimorfisme
174 Sequence of PCR product from sperm with normal motility Posisition 174 : AAG (Lysine)
Sequence of PCR product from sperm with low motility
• Variasi biologis merupakan fenomena alami • Dapat diamati pada semua mahluk hidup organisma unisel sampai multisel • Ada dalam populasi maupun antar populasi • Dapat bersifat kontinyu dan tak-kontinyu
Posisition 174 : GAG (glutamic acid)
8
20/12/2015
• Merupakan hasil antaraksi faktor genetik dan nir-genetik • Dapat dilihat pada aras fenotipik bahkan genotipik • Mudah diamati pada aras fenotipik lewat indera dan/atau alat bantu • Dapat menghasilkan polimorfisma
Polimorfisma genetik?
Keberadaan lebih dari satu alel dalam suatu lokus genetik dengan frekuensi alel-jarang ≥1% di dalam suatu populasi
Mutasi
Definisi lain • “The occurrence in a population (or among populations) of several phenotypic forms associated with alleles of one gene or homologs of one chromosome” • “Difference in DNA sequence among individuals, groups, or populations (e.g., genes for blue eyes versus brown eyes)”
Variasi biologis & polimorfisma “Genetic Drift”
Migrasi (“gene flow”) Isolasi genetik
Seleksi
9
20/12/2015
Forms of polymorphism • Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) • Variable number of tandem repeats (VNTR) • Microsatellites
10
20/12/2015
POLY MORPHISM SNPs MU Sequence repeats TA Insertions TI Deletions ON Recombination
Chance procesess
Induced by external agents e.g. viruses or radiation
Polymorphism throughout human genome • 1.42 million SNPs estimated (other estimation: 1 in 1000 DNA bp in human genome over 3 million SNPs in the entire human genome) • 60,000 SNPs fall within coding regions • Approx. 25% non-synonymous SNP could affect the function of corresponding gene product
Efek polimorfisme • Is reflected in the diversity of the gene products – structural proteins, enzymes, channel proteins, transporters & binding proteins, receptors & post receptor signaling cascades • Immune biology is characterized by extensive polymorphism • Adanya variasi genetik menyebabkan perbedaan aktivitas dan kapasitas suatu enzim dalam menjalankan fungsinya misalnya respon individual terhadap obat, stress oksidatif dll
• Contoh lokus HLA – Sangat polimorfik – > 1300 alel dari 12 lokus klas I & II yang diekspresikan di seluruh dunia – Paling bervariasi untuk klas I: HLA B & C, untuk klas II: HLA DPB, DQ, DRB
11
