BAB I. PENDAHULUAN
DNA (Deoxyribo Nukleid Acid) adalah macam asam nukleat yang berhubungan dengan hereditas. Penemu DNA adalah seorang ahli kimia asal Jerman Friederich Mieschier (1869), yang menyelidiki susunan kimia dari nucleus. Berdasarkan hasil penelitian Rosalind Frank lin dan Maurice Wilkins pada DNA dengan menggunakan sinar – X, James Watson dan Francis Crick (1953). mengemukakan suatu model gen yang terkenal dengan nama double helix (tangga tali berpilin ganda). Watson dan Crick mendapatkan hadiah nobel pada tahun 1962 atas penemuan tersebut. Deoxyribo Nukleid Acid mengandung informasi genetik dari mkhluk hidup, dan kebanyakan terdapat di dalam kromosom. Beberapa kejadian memberi petunjuk secara tidak langsung bahwa DNA itu mengandung informasi genetik dari makhluk hidup, misalnya; 1. Hasil percobaan menyatakan DNA itu terdapat di dalam kromosom, sedangkan RNA dan protein banyak terdapat di sitolplasma. Adanya korelasi yang tepat antara banyaknya DNA tiap sel dengan jumlah sel kromosom dalam tiap sel. Yaitu bahwa kebanyakan sel soatis dari organisme diploid,misalnya mengandung tepat 2x jumlah DNA dari pada jumlah DNA yang terdapat di dalam gamet haploid dri spesies yang sama. 2. Susunan molekuler dari DNA dalam semua sel yang berbeda beda dari suatu organisme adalah sama (ada beberapa perkeualian, sedangkan susunan RNAdan protein bervariasi dari satu tipe se ke tpe sel lainnya, baik kwalitas maupun kuantitasnya. 3. DNA memiliki struktur yang terdiri dari 2 utas polinukleotida yang saling melingkari satu sama lain, dan membentuk heliks ganda dengan arah puar ke kanan. Secara struktural DNA terbagi atas 3 tampilan yang berbeda,yaitu A-DNA , B-DNA, Z-DNA. Dimana pada ketiga bentuk tampilan DNA tersebut kedua untai polinukeotida anti paralel tersebut diubungkan berdasarkan prinsip pasangan basa Watson Crick . Dengan mengacu kepada proses interaksi antar basa pada untai yang sama dengan kerangka gula fospat terdapat pada sisi luar, sementara basa bisa berada pada bagian daam utas heiks ganda. Struktur asam nukleat tersusun atas nukleotida, yang bila terurai terdiri dari gula, pospat dan basa, yang
mengandung nitrogen. Karena banyaknya nukleotida yang menyusun molekul DNA , maka molekul DNA merupakan suatu polinukleotida. a. Gula, molekul gula yang menyusun DNA adalah sebuah pentosa, yaitu deoxiribosa, b. Pospat, molekul pospatnya berupa PO4. c. Basa, Basa nitrogen yang menyusun molekul DNA, dibedakan atas kelompok pirimidin, yaitu sitosin dan timin, dan kelompok purin, yaitu adenin dan guanin. Kemampuan DNA untuk membentuk DNA baru yang sama persis dengan DNA asal (replikasi) disebut kemampuan autokatalitik. Sedangkan kemampuan DNA membentuk molekul kimia lain dari salah satu atau sebagian rantainya disebut kemampuan heterokatalitik . Ada 3 hipotesis tentang terjadinya replikasi DNA, yaitu : 1. Teori Konservatif menyatakan bahwa double helix yang lama tetap (tidak berubah), dan langsung terbentuk double helix yang baru. 2. Teori Dispersif menyatakan bahwa double helix yang lama terputus-putus. Lalu potongan –potongan tersebut memisah dan membentuk potongan-potongan baru yang akan bersambungan dengan potongan-potongan yang lama; sehingga kembali menjadi dua DNA baru yang sama persis. 3. Teori Semikonservatif menyatakan bahwa dua pita dari double helix memisahkan diri dan masing-masing pita yang lama mendapatkan pasangan pita baru seperti pasangannya yang lama, sehingga terbentuklah dua DNA baru yang sama persis. Replikasi DNA berlangsung pada sel-sel muda saat interfase pada pembelahan mitosis. DNA ini melibatkan beberapa enzim, antara lain : 1. Helikase, untuk mempermudah membuka rantai ganda DNA menjadi dua buah rantai tunggal 2. Polimerase, untuk menggabungkan deoksiribosanukleosida trifosfat 3. Ligase, untuk menyambung bagian-bagian rantai tunggal DNA yang baru terbentuk . TRANSKRIPSI DNA Transkripsi adalah pembentukan mRNA (messenger RNA/RNA duta) dari salah satu pita DNA dengan bantuan enzim RNA polymerase. mRNA membawa pesan DNA untuk memilih
polipeptidsa yang sesuai dalam sintesis protein. Informasi genetic dicetak dalam bentuk kode oleh DNA di dalam inti sel. Pembawa informasi / kode ini adalah mRNA. Kode-kode tercermin pada urutan pengulangan basa nitrogen yang teratur dalam mRNA. Ini berarti kode/informasi adalah mRNA itu sendiri. Tahapan transkripsi sebagai berikut : 1. RNA polymerase melekat pada molekul DNA sehingga menyebabkan sebagian dari double helix membuka. 2. Akibat terbukanya pita DNA, basa-basa pada salah satu pita menjadi bebas, sehingga memberi kesempatan basa-basa pasangannya menyusun mRNA. Misalnya : timin (T) dari DNA akan membentuk adenine (A) pada mRNA; sitosin dari DNA akan membentuk guanine (G) pada mRNA, dan seterusnya. Oleh karena enzim polymerase bergerak disepanjang pita DNA yang menjadi model, maka jumlah mRNA yang dihasilkan dari transkripsi dapat melebihi DNA. DNA yang melakukan transkripsi adalah DNA sense/template. 3. mRNA yang sudah selesai dicetak akan meninggalkan inti sel menuju sitoplasma dan melekat pada ribosom. Ribosom adalah granula-granula dalam sitoplasma yang berperan dalam sintesis protein, biasanya berderet empat atau lima dan disebut polisom. TRANSLASI DNA Ribosom akan membaca kode yang ada pada mRNA dengan bantuan RNA transfer (tRNA). Di dalam sitoplasma banyak terdapat tRNA, asam-asam amino, dan lebih dari 20 enzim amino asil sintetase. Tahapan translasi : 1. Pemindahan asam amino dari sitoplasma ke ribosom dilakukan oleh tRNA. Asam amino terlebih dahulu diaktifkan dengan ATP (adenosine tripospat), proses ini dipengaruhi oleh enzim amino asil sintetase. Hasilnya berupa aminoasil adenosine monofosfat (AA-AMP) dan fosfat organic. 2. AA-AMP diikat oleh tRNA untuk dibawa ke ribosom. 3. Ujung bebas tRNA memiliki tiga basa nitrogen pada salah satu sisi yang dapat mengikat asam amino tertentu yang telah diaktifkan. Bagian itu disebut antikodon, yang nantinya
berhubungan dengan tiga basa yang disebut kodon pada pita mRNA. 4. mRNA telah melekat di ribosom. Anti-kodon harus sesuai dengan pasangan basa dari kodon. Jika suatu unit tRNA melepaskan asam amino, ribosom akan bergerak di sepanjang mRNA ketiga basa berikutnya, dimana tRNA lainnya dengan asam amino telah melekat. 5. tRNA yang telah melepaskan asam amino kemudian meninggalkan ribosom. tRNA bebas dalam sitoplasma untuk selanjutnya mengikat asam amino lain semacam yang telah diaktifkan oleh ATP. tRNA dengan asam amino ini dating ke ribosom, melepas asam amino ke mRNA. Demikian seterusnya sehingga dalam polisom terangkai bermacam-macam asam amino dan tersusun menjadi protein. Translasi meliputi tiga tahapan, yaitu inisiasi, elongasi, dan terminasi. Dalam ribosom berlangsung penerjemahan urutan nukleotida DNA ke dalam bentuk protein. Urutan sintesis protein adalah : 1. DNA membentuk mRNA untuk membawa kode sesuai urutan basa N-nya. 2. mRNA meninggalkan inti, pergi ke ribosom dalam sitoplasma. 3. tRNA dating membawa asam amino yang sesuai dengan kode yang dibawa oleh mRNA. tRNA ini bergabung dengan mRNA sesuai dengan kode pasangan basa N-nya yang seharusnya. 4. Asam-asam amino akan berjajar-jajar dalam urutan yang sesuai dengan kode sehingga terbentuklah protein yang diharapkan. 5. Protein yang terbentuk merupakan enzim yang mengatur metabolism sel dan reproduksi. Aplikasi PCR PCR telah digunakan di berbagai tempat penelitian genetika molekuler : PCR dapat memproduksi DNA secara cepat,bahkan ketika tidak ada lagi duplikat dari DNA itu yang diketahui. PCR memiliki banyak metode untuk memperbanyak, seperti menghasilkan duplikat DNA. Tugas merangkai DNA dapat dilakukan juga oleh PCR. Misalnya untuk mengetahui segmen DNA dari pasien yang menderita penyakit mutasi genetik. Teknik ini dapat dilakukan dengan segmen dari DNA genom yang tidak diketahui secara lengkap atau hanya untaian tunggal dari genom tersebut.
PCR memiliki banyak cara untuk mengkloning DNA secara tradisional. PCR dapat mengekstrak segmen untuk menyisipkan sebuah vektor dari genom yang memiliki ukuran besar, yang hanya tersedia dalam jumlah yang sedikit. Dengan menggunakan vektor primer tunggal, dapat juga menganalisis atau mengekstrak fragmen yang sudah dimasukkan kedalam vektor. Beberapa perubahan protokol PCR dapat menghasilkan mutasi dari penyisipan fragmen. Squence-tagged site adalah proses dimana PCR digunakan sebagai indikator segmen khusus dari genom di tunjukkan pada saat kloning. Sebuah penelitian menemukan bahwa aplikasi penting ini digunakan untuk memetakan kloning alam, dimana mereka terbentuk dan untuk mengkoordinasikan hasil penelitian dari labolatorium yang berbeda. Aplikasi yang menarik dari PCR adalah analisis DNA dari fosil, seperti penemuan fosil Gajah purba di belanda. Aplikasi PCR biasa digunakan dalam mempelajari susunan dari ekspresi gen. Jaringan (sel tunggal) dapat di analisa pada tahap berbeda untuk melihat gen mana yang telah aktif atau yang telah dimatikan. Aplikasi ini dapat juga menggunakan Q-PCR untuk mengetahui tingkat ekspresi gen yang sebenarnya. Kemampuan PCR dalam pembentukan berbagai macam locus sperma seseorang telah meningkatkan pemetaan gen dengan mempelajari perubahan kromosom dari meiosis. Peristiwa perubahan jarang terjadi antara locus yang sangat tertutup, yang telah diteliti secara langsung dengan menganalisa ribuan sperma dari seseorang. Kemiripan dari delesi yang tidak biasa, translokasi, atau inversi dapat dianalisa. Tanpa perlu menunggu lama proses pembuahan, embriologi, dan lain lain.
II. ISI
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi. Metode ini dikembangkan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap berurutan yaitu denaturasi templat, annealing (penempelan) pasangan primer pada untai DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 108 – 109 kali (Retnoningrum, 1997). PCR dibedakan menjadi 2 ; PCR konvensional, dan Real Time PCR PCR konvensional PCR konvensional adalah PCR dimana tahap perbanyakan materi genetik dan tahap deteksi produk PCR dilakukan secara berturut-turut, yaitu tahap deteksi dilakukan bila tahap
perbanyakan materi genetik telah selesai. Tahap deteksi dapat dilakukan dengan beberapa cara (format), salah satunya menggunakan elektroforesis gel kemudian dilanjutkan dengan hibridisasi pada membran menggunakan reagen pelacak atau hibridisasi dalam tabung reaksi. Jika yang diekstraksi adalah materi genetik berupa DNA maka DNA dapat langsung diperbanyak, tetapi jika yang diisolasi berupa RNA, maka diperlukan tahap tambahan untuk mengubah RNA menjadi DNA yaitu tahap transkripsi balik. Dalam hal ini, metode yang digunakan disebut RT-PCR (reverse-transcription PCR). Tahapan dalam PCR dan RT-PCR konvensional dengan format deteksinya dapat dilihat pada gambar di atas. Real-time PCR Berbeda dengan PCR konvensioal, pada real-time PCR tahap deteksi dan tahap penggandaan materi genetik dilakukan secara bersamaan (simultan). Hal ini menawarkan beberapa keunggulan yaitu: deteksi produk PCR dilakukan pada fase eksponensial sehingga hasil yang diperoleh berada pada rentang daerah dengan presisi hasil tinggi. Selain itu, deteksi dilakukan menggunakan pelacak bertanda fluoresense. Pelacak adalah reagen yang menentukan kespesifikan hasil. Penggunaan fluoresense dalam tahap deteksi menawarkan sensitivitas yang tinggi. Dengan demikian, real time PCR menawarkan sensitivitas yang tinggi dan rentang linearitas yang cukup luas sehingga hasil penentuan kandungan DNA atau RNA di dalam spesimen menjadi sangat akurat. Contoh produk komersial yang menggunakan real time PCR yaitu Cobas Taqman. B. Proses Kerja PCR Dalam Polymerase Chain Reaction (PCR) terdiri dari tiga proses, yaitu: 1. Denaturasi Newton and Graham (1997) dalam Rohmy (2001), menyatakan bahwa denaturasi merupakan proses memisahkan DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu 92 – 95 oC. Denaturasi awal dilakukan selama 1 – 3 menit diperlukan untuk meyakinkan hasil uji PCR selanjutnya digunakan pada tahap ketiga, yaitu proses elektroforesis. Dengan bantuan buffer TAE bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. Denaturasi yang tidak berlangsung secara sempurna dapat menyebabkan utas DNA
terputus. Tahap denaturasi yang terlalu lama dapat mengakibatkan hilangnya aktivitas enzim polimerase (Lisdiyanti, 1997 dalam Rohmy 2001). 2. Annealing Merupakan proses penempelan primer. Tahap annealing primer merupakan tahap terpenting dalam PCR, karena jika ada sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka akan mempengaruhi kemurnian dan hasil akhir produk DNA yang diinginkan. Faktor yang mempengaruhi tahap ini antara lain suhu annealing dan primer. Suhu annealing yang terlalu rendah dapat mengakibatkan timbulnya pita elektroforesis yang tidak spesifik, sedangkan suhu yang tinggi dapat meningkatkan kespesifikan amplifikasi (Saiki et al., 1988 dalam Rohmy, 2001) Kenaikan suhu setelah tahap annealing hingga mencapai 70–74 oC bertujuan untuk mengaktifkan enzim TaqDNA polimerase. Proses pemanjangan primer (tahap extension) biasanya dilakukan pada suhu 72 oC, yaitu suhu optimal untuk TaqDNA polimerase. Selain itu, pada masa peralihan suhu dari suhu annealing ke suhu extension sampai 70 oC juga menyebabkan terputusnya ikatan-ikatan tidak spesifik antara DNA cetakan dengan primer karena ikatan ini bersifat lemah. Selain suhu, semakin lama waktu extension maka jumlah DNA yang tidak spesifik semakin banyak (Saiki et al., 1988 dalam Rohmy, 2001). 3. Extension Merupakan proses pemanjangan DNA. Dalam tahap extension atau sintesis DNA, enzim polimerase bergabung bersama dengan nukleotida dan pemanjangan primer lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu siklus ke siklus selanjutnya mengikuti perubahan konsentrasi DNA (Hsu et al., 1996 dalam Wahyudi, 2001) . Hasil sintesa DNA dalam satu siklus dapat berperan sebagai cetakan (template) pada siklus berikutnya sehingga jumlah DNA target menjadi berlipat dua pada setiap akhir siklus. Dengan kata lain DNA target meningkat secara eksponensial, sehingga setelah 30 siklus akan menjadi milyaran amplifikasi DNA target. Selanjutnya, DNA virus yang telah berlipat ganda jumlahnya dapat dideteksi dengan elektoforesis sel agarosa. Setelah diwarnai dengan Ethidium Bromida (ETBr), hasil elektroforesis yang berupa band RNA dapat dilihat dengan UV transluminator dan diabadikan dengan kamera polaroid (Sunarto dkk, 2004).
Menurut Haliman dan Adijaya (2005), secara umum uji PCR di laboratorium dilakukan dengan tahapan-tahapan diantaranya: 1. DNA dari sel-sel sampel diekstraksi dengan larutan lysis buffer (IQ2000TM). Lysis buffer (IQ2000TM) juga berfungsi untuk mengamankan hasil ekstraksi dari kerusakan akibat kerja enzim dNase. Hasil ekstraksi DNA di-sentrifus hingga diperoleh butiran atau pelet DNA. Sementara untuk mengekstraksi RNA digunakan RNA ekstraction solution (IQ2000TM). RNA ekstraction solution (IQ2000TM) juga berfungsi mengamankan RNA dari kerusakan akibat kerja enzim rNase. 2. Hasil ekstraksi DNA pada tahap pertama digandakan dengan bantuan enzim-enzim yang dikenal sebagai primer. Satu jenis primer bertanggung jawab atas penggandaan satu jenis DNA tertentu sehingga primer satu jenis virus hanya dapat digunakan untuk deteksi virus tersebut saja. Proses penggandaan ini dikenal sebagai proses amplifikasi. Proses tersebut dilakukan pada kondisi suhu dan siklus penggandaan tertentu, yang dapat diatur pada mesin PCR (thermocycle). Proses ini disebut dengan reaksi rantai polimerase (polymerase chain reaction, PCR) karena merupakan siklus penggandaan yang berulang sehingga kegiatan ini seolah-olah merupakan suatu proses reaksi berantai, atau TBE, DNA yang telah diklon pada tahap kedua dimasukkan ke dalam lubang-lubang kecil yang terdapat pada lempengan agar agarose 2%. Hasil proses elektroforesis akan menampilkan pita-pita DNA yang letaknya tersebar, tergantung pada berat molekulnya. Pita-pita DNA kemudian dibandingkan dengan posisi pita-pita pada lajur penanda DNA (DNA marker). Dari hasil proses elektroforesis ini dapat disimpulkan status sampel, terinfeksi virus atau bebas dari virus. Keberhasilan pengujian sampel dengan metode PCR dipengaruhi oleh beberapa hal, seperti faktor kontaminasi silang, umur reagen atau enzim yang dipakai, jumlah enzim yang dipakai, ketelitian saat poses ekstraksi, serta kondisi larutan buffer dan larutan etidium bromida yang dipakai. Agar kontaminasi silang dapat dihindarkan, sebaiknya operator pengujian PCR harus benar-benar terlatih dan teliti (Haliman dan Adijaya, 2005). Kegunaan PCR
PCR banyak digunakan untuk berbagai tujuan, misalnya mendiagnosis penyakit keturunan (penyakit genetik), mendeteksi keberadaan penyebab penyakit infeksi seperti bakteri dan virus, mempelajari evolusi manusia, forensik dan lain sebagainya. Polymerase Chain Reaction atau sering disingkat sebagai PCR adalah suatu teknik perbanyakan materi genetik baik DNA yang terdapat pada kebanyakan mikroorganisme penyebab penyak it maupun RNA yang terdapat pada virus tertentu seperti virus imunodefisiensi manusia (HIV, penyebab AIDS) dan virus hepatitis C (HCV, penyebab hepatitis C). Karena kemampuan PCR untuk memperbanyak jumlah materi genetik sangat tinggi, maka PCR dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan materi genetik dengan jumlah sangat rendah dalam suatu spesimen atau sampel. PCR terdiri atas beberapa siklus dimana pada setiap siklus terjadi penggandaan materi genetik dan jika siklus ini dilakukan berulang-ulang, maka materi genetik yang diperoleh akan menjadi banyak sehingga mempermudah deteksi keberadaannya. Secara umum, PCR dilakukan sebanyak 25 – 35 siklus
III. PENUTUP Hasil Diskusi Kelompok Penggunan PCR Dalam Ekspresi Genetik adalah : Pada dasar dan teorinya, PCR melakukan penggandaan atau replikasi DNA secara cepat tanpa mikroorganisme. Sehingga, yang di hasilkan oleh PCR adalah DNA yang sama dalam jumlah yang banyak. DNA hasil replikasi PCR persis sama dengan DNA awal yang di masukkan ke dalam PCR tersebut. Karena DNA yang di hasilkan persis sama. Tentu saja, sifat yang di bawanya juga persis sama ketika DNA tersebut diterjemahkan dalam proses selanjutnya. Sifat yang di ekspresikan bisa jadi berbeda apabila terjadi kesalahan dalam proses penggandaan dalam PCR. Perbedaan ekspresi tersebut dapat di sebut sebagai mutasi. Pada step PCR yang di sebut melting, DNA di panaskan untuk memutus rantai-rantai yang ada. Pada saat tersebut, suhu yang tidak tepat dapat meleburpermanenkan rantai DNA tersebut sehingga hilang, atau rusak total. Apabila ada bagian yang hilang. Maka, tentu saja, susunan basa DNA dapat berubah pada saat proses penempelan. Sehingga menghasilkan DNA yang berbeda dari DNA asal. Pada PCR konvensional, deteksi produk PCR dilakukan hanya pada tahap akhir. Seperti terlihat pada gambar di samping ini, deteksi tahap akhir menunjukkan hasil yang bervariasi sehingga dapat memberikan pembacaan yang kurang akurat. PCR hibridisasi merupakan salah satu contoh PCR konvensional dengan produk komersialnya yaitu Cobas Amplicor. Pada Cobas Amplicor, deteksi dilakukan secara kolorimetri setelah perbanyakan materi genetik selesai. Keterbatasan lain untuk PCR hibridisasi adalah batas deteksi atau batas kuantitasi kandungan DNA atau RNA dalam sampel tidak cukup rendah dan rentang linearitas yang tidak cukup luas.
