VYSOKÉ UENÍ TECHNICKÉ V BRN FAKULTA CHEMICKÁ
DIPLOMOVÁ PRÁCE Eliminace akrylamidu v potravinách
BRNO 2008
Bc. KRISTNA MACHÁKOVÁ
2
ABSTRAKT Diplomová práce se zabvá vlivem enzymu L-asparaginázy a vlivem anorganickch solí (NaCl, CaCl2, NaHCO3 a NH4HCO3) na eliminaci obsahu akrylamidu v potravinách a modelovch cereálních smsích. Akrylamid se adí mezi pravdpodobn karcinogenní sloueniny vznikající bhem tepelné úpravy potravin bohatch na redukující sacharidy a aminokyseliny (L-asparagin). Jeliko je L-asparagin pirozenou slo kou cereálií a zárove je
dominantním
prekurzorem
vzniku
akrylamidu,
zpsob
eliminace
enzymem
L-asparaginázou, pípadn v kombinací se solí vede k znanému sní ení akrylamidu ve finálním produktu. L-asparagináza a soli byly aplikované na potravinové produkty a modelovou cereální sms. Bylo zji tno, e jednotlivé pidávané látky (mimo NH4HCO3) zpsobují pokles obsahu akrylamidu, a to a o 90 % beze zmny senzorickch vlastností finálního produktu. ABSTRACT The diploma thesis deals with the Influence of the Enzyme L-asparagine and the Inorganic salts (NaCl, CaCl2, NaHCO3 and NH4HCO3) on the elimination of the acrylamide in food-stuffs and a simulated model cereal matrix. The acrylamide belongs to the probable carcinogenic compounds which is incipient in the course of thermal processing of food, which are rich in the reducing sugars and amino acids as L-asparagine. Because of L-asparagine is the natural component of cereals and simultaneously is dominant antecedent incipient acrylamide, the way of the elimination by enzyme L-asparaginase (or the combination of L-asparaginase and salt) leads to the reduced level of acrylamide in a final product. The L- asparagine and salts were used on food-stuffs and a simulated model cereal matrix. It was found that individual used substances (except for NH4HCO3) cause the reduction of acrylamide production even about 90 % without change in the sensory properties of final product. KLÍOVÁ SLOVA Akrylamid, L-asparagin, L-asparagináza KEYWORDS Acrylamide, L-asparagine, L-asparaginase
3
Machá ková, K.: Eliminace akrylamidu v potravinách. Brno, 2008. Diplomová práce na Fakult chemické Vysokého u ení technického v Brn, ústav chemie potravin a biochemií. Vedoucí diplomové práce Ing. Zuzana Ciesarová, CSc.. PROHLÁENÍ Prohla uji, e jsem diplomovou práci vypracovala samostatn a e v echny pou ité literární zdroje jsem správn a pln citovala. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brn a m e b t vyu ita ke komer ním ú elm jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a dkana FCH VUT. ................................ podpis studenta
PODKOVÁNÍ Na tomto míst by sem cht la vyjád it svoje pod kování Ing. Zuzan Ciesarové, CSc. za odborné a trp livé vedení,
pomoc
p i
experimentech,
vypracování
diplomové
práce
a zp íjemn ní
mého
pobytu
na Vzkumném ústavu potraviná ském v Bratislav , dále pak Ing. Kristín Kukurové,
PhD.
a Ing. Alen
Bednárikové, PhD. z VÚP v Bratislav za
pomoc
p i
experimentech
a odbornch konzultacích, a paní Ildikó Juríkové za spolupráci v laborato i. V poslední ad bych cht la pod kovat prof.
Ing.
Peteru
za zprost edkování
imkovi,
DrSc.
pracovat
na diplomové práci ve VÚP v Bratislav .
4
OBSAH 1 ÚVOD.................................................................................................................................7 2 SOUASN STAV PROBLEMATIKY AKRYLAMIDU ..............................................8 2.1 Vlastnosti akrylamidu ...................................................................................................8 2.1.1 Fyzikální vlastnosti ................................................................................................8 2.1.2 Chemické vlastnosti ...............................................................................................8 2.2 Zdravotní rizika akrylamidu..........................................................................................9 2.3 V skyt akrylamidu v potravinách................................................................................10 2.4 Mechanismus vzniku akrylamidu v potravinách ..........................................................12 2.5 Zpsoby eliminace akrylamidu v potravinách .............................................................16 2.6 Enzym L-asparagináza................................................................................................16 2.6.1 Charakteristika enzymu L-asparagináza izolovaného z Escherichia coli...............17 2.7 Charakteristika surovin ...............................................................................................19 2.7.1 Odrdy ovse.........................................................................................................20 2.7.2 Odrdy p enice ....................................................................................................21 3 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE .........................................................................................22 4 MATERIÁL A METODY...............................................................................................23 4.1 Chemikálie..................................................................................................................23 4.2 Pou ité vzorky ............................................................................................................23 4.3 Pou ité pístroje..........................................................................................................26 4.4 Stanovení akrylamidu v reáln ch vzorcích - perníky, pi koty......................................27 4.4.1 Píprava vzork....................................................................................................27 4.4.2 LC-MS podmínky pro stanovení akrylamidu v reáln ch vzorcích........................27 4.5 Extrakce aminokyselin z mouky a obiln ch zrn...........................................................28 4.5.1 Píprava vzork....................................................................................................28 4.5.2 LC-MS podmínky pro stanovení aminokyselin....................................................28 4.6 Stanovení akrylamidu v modelov ch cereálních sm sích ............................................28 4.6.1 Píprava modelové cereální sm si ........................................................................29 4.6.2 LC-MS podmínky pro stanovení akrylamidu v modelov ch cereálních sm sích ...30 4.7 Eliminace akrylamidu v modelov ch cereálních sm sích ............................................30 4.7.1 Vliv enzymu L-asparaginázy................................................................................30 4.7.2 Vliv solí (NaCl, CaCl2, NaHCO3, NH4HCO3) a jejich vzájemná kombinace s enzymem....................................................................................................................31 5
4.7.3 LC-MS podmínky pro eliminaci akrylamidu v modelov ch cereálních sm sích ..32 4.8 Stanovení aminokyselin v pekárensk ch produktech...................................................32 4.9 Eliminace akrylamidu v pekárensk ch produktech......................................................32 4.9.1 Vliv enzymu L-asparaginázy................................................................................32 4.9.2 LC-MS podmínky pro eliminaci akrylamidu v pekárensk ch produktech ............33 4.9.3 Stanovení suiny v homogenizovaném vzorku perníku.........................................35 5 VSLEDKY A DISKUZE...............................................................................................36 5.1 Stanovení akrylamidu v reáln ch vzorcích - perníky, pikoty......................................36 5.2 Stanovení aminokyselin v mouce a obiln ch zrnech....................................................37 5.3 Stanovení aminokyselin v pekárensk ch produktech (perník)......................................43 5.4 Stanovení akrylamidu v modelov ch cereálních sm sích ............................................43 5.5 Eliminace akrylamidu v modelov ch cereálních sm sích ............................................45 5.5.1 Vliv enzymu L-asparaginázy................................................................................45 5.5.2 Vliv solí (NaCl, CaCl2, NaHCO3, NH4HCO3) a jejich vzájemná kombinace s enzymem....................................................................................................................46 5.6 Eliminace akrylamidu v pekárensk ch produktech......................................................48 5.6.1 Vliv enzymu L-asparaginázy................................................................................48 5.6.2 Senzorické hodnocení produkt ............................................................................52 6 ZÁV R ............................................................................................................................53 7 POUITÁ LITERATURA..............................................................................................54 8 SEZNAM POUITCH ZKRATEK .............................................................................58 9 SEZNAM P ÍLOH .........................................................................................................59
6
1 ÚVOD Problematika akrylamidu je v dnení dob velmi sledovanou záleitostí pedevím z hlediska zvyovaní kvality potravin a zdravotního bezpeí pro lovka, které sledují rzné evropské a svtové instituce, komise a vbory, ale i lovk sám. Akrylamid jako nebezpená látka, ohroující lidské zdraví, byla zjitna v potravinách teprve v roce 2002. védská Národní Potravináská Správa a vdci ze Stockholmské Královské Univerzity stanovily AA jako jeden z finálních produkt pi zahátí potravin bohatch na redukující sacharidy pi teplot 170 °C, piem je známo, e AA je pravdpodobn karcinogen ohroující lidské zdraví [1]. Na eliminaci tvorby AA bylo od té doby vynaloeno veliké úsilí, a to vdeckmi tmy z celého svta. AA byl zjitn v mnoha potravinovch produktech bohatch na redukující sacharidy, mezi které patí zejména potravinové produkty z brambor a cereálií. Problematika
AA
souvisí
i
s doporuením
Komise
Codex
Alimentarius
pro potravinová aditiva a kontaminanty z dubna 2006, která zdrazuje závanost zjitní a vyzvá na vvoj novch metod vedoucích k eliminaci AA. Do dnení doby bylo navrhnuto nkolik zpsob pro eliminaci tvorby AA v potravinovch produktech, ale pro velikou rznorodost jednotlivch proces, pi kterch AA vzniká, se stále hledají nové monosti sniování jeho obsahu. Jedním ze zpsob eliminace AA z potravinovch produkt je vyuití enzymatického psobení jednoho ze známch prekurzor tvorby AA v produktech. L-asparagin je pirozenou slokou surovch brambor a cereáliích, pi em je jedním z dominantních prekurzor tvorby AA. Zpsob eliminace L-asparaginázy vede k podstatnému sníení potenciálu tvorby AA ve finálních produktech [2]. Dalí zpsob eliminace AA je zaloen na vlivu anorganickch solí, které svm psobením jednak pedcházejí jeho tvorb, jednak vedou k eliminaci ji vzniklého AA. Tato diplomová práce se zabvá eliminací tvorby AA v modelovch cereálních smsích simulující sloení moukové matrice, a to psobením enzymu L-asparaginázy a na základ anorganickch solí (NaCl, CaCl2, NaHCO3 a NH4HCO3) a ovením navrhovanch postup v reálních cereálních vzorkách. Diplomová práce byla eena jako souást projektu podporovaného Agenturou pro podporu vdy a vzkumu APVV na základ kontraktu APVV-COST 0015-06 s Vzkumnm ústavem potravináskm v Bratislav.
7
2 SOUASN STAV PROBLEMATIKY AKRYLAMIDU
2.1 Vlastnosti akrylamidu
2.1.1 Fyzikální vlastnosti AA je bezbarvá krystalická pevná látka o molekulové hmotnosti 71 g/mol. Teplota tání AA je 84,5 °C ± 0,3 °C a vysoko vroucí teplota je 136 °C pi tlaku 3,3 kPa. AA je velmi rozpustn ve vod , v ni ích alkoholech a v ostatních polárních organick ch rozpou t dlech. AA je prakticky nerozpustn v nepolárních organick ch rozpou t dlech jako je heptan a tetrachlormethan [3]. V tabulce 1 je uvedena rozpustnost AA pi teplot 30 °C [4]. Tab. 1 Rozpustnost akrylamidu pi teplot 30 °C
rozpou t dlo
[g/l] pi 30 °C
n-heptan
0,068
benzen
3,46
chloroform
26,6
ethylacetát
126
acetonitril
396
aceton
631
ethanol
862
methanol
1550
voda
2151
2.1.2 Chemické vlastnosti AA existuje ve dvou formách - AA jako monomer a polyakrylamid jako polymer. AA jako funk ní monomer obsahuje reaktivní elektronovou deficitní dvojnou vazbu a aminoskupinu (obr. 1).
8
Obr. 1 Akrylamid Pevn AA je pi laboratorních podmínkách dokonale stabilní a má dlouhou skladovací ivotnost. Kapaln AA (vznikající pi teplot vy í ne je teplota tání) polymerizuje rychleji a exotermicky.
2.2 Zdravotní rizika akrylamidu AA je organická slouenina nalezena v mnoha potravinov ch produktech na eho ka dodenního ivota. Tato slouenina se vyznauje více toxick mi vlastnostmi, co zvy uje její celkov toxick úinek, pedev ím z hlediska perorální (ústní) expozice. Pozitivn byly dokázány její neurotoxické, genotoxické a karcinogenní vlastnosti. Z hlediska karcinogenity se podle klasifikace Mezinárodní agentury pro v zkum rakoviny (IARC, 1994) AA adí do skupiny 2A mezi látky pravdpodobn karcinogenní pro lidi. Expozicí AA se zvy uje poet nádor v rzn ch orgánech zvíat. V skyt nádor byl prokázán u specifick ch orgánu jako je mléná láza, dloha, nadledvinky. Byl také prokázán skrotální mesothelium u potkan a my í (nádory plic a k e). AA nemá zjistiteln prahov úinek pi zvy ování rizika nádorového onemocnní a z hlediska stanovení karcinogenní potence AA existují odli né závry rzn ch institucí, a to v závislosti na pou itém matematickém modelu [5]. Poslední studie v ak prokázaly souvislost
mezi
v skytem
rakovinov ch
onemocnní
dlohy,
vajeník
a
prsu
u postmenopauzálních en a píjmem AA z potravin, co poukazuje na vysokou aktuálnost a dle itost v zkumu v této oblasti [2].
9
2.3 Vskyt akrylamidu v potravinách AA se v potravinách vyskytuje ve dvou zdrojích: 1. endogenní zdroj, pi kterém dochází ke vzniku AA v dsledku tepelného opracování 2. exogenní zdroj, pi kterém pechází AA do potravin z vn j ího prostedí První zdroj je dominantní a je dsledkem tzv. Maillardov ch reakcí mezi asparaginem a redukujícími sacharidy, probíhající v matricích b hem tepeln ch proces v roby potravinov ch produkt. Studie ukázaly, e ke vzniku AA v potravinách (tab. 2) dochází pi vy
ích teplotách jak 120 °C. Tab.2 Potraviny s nej ast jím vskytem akrylamidu
10
Koncentrace Potravinové produkty akrylamidu
Poet vzorek
[ g/kg] stední hodnota
Cereálie a cereální produkty
3304
343
Cereálie a tstoviny surové a vaené
113
15
Cereálie a tstoviny zpracované (opékané, sma ené, grilované)
200
123
Produkty na báze cereálie, v echny
2991
366
Chléb a rohlíky
1294
446
Peivo a keksy
1270
350
Snídaové cereálie
369
96
Pizza
58
33
Ryby a moské produkty
52
25
Maso a vnitnosti
138
19
Mléko a mléné produkty
62
5,8
Oechy a olejoviny
81
84
Bramborové pyré/bramborová ka e/vaené brambory
33
16
Peené brambory
22
169
Bramborové lupínky
874
752
Bramborové hranolky
1097
334
Bramborové krokety (mra ené)
42
110
Stimulanty a jejich analogy
469
509
Káva (v luh), hotová
93
13
Káva (mletá, instantní anebo pra ená, ne v luh)
205
288
Kávové extrakty
20
1100
Bezkofeinová kava
26
668
Kávoviny
73
845
Kakaové produkty
23
220
Zelen aj (“pra en ”)
29
306
Cukrovinky a med (hlavn okoláda)
58
24
Zelenina
84
17
Surová, vaená anebo konzervovaná
45
4,2
Tepelné zpracovaná (opékaná, peená, sma ená, grilovaná)
39
59
Ovoce erstvé
11
<1
Ovoce su ené, sma ené, tepeln zpracované
37
131
Alkoholické nápoje (pivo, gin, víno)
66
6,6
Chuové písady a omáky
19
71
Su ené mléko pro dtskou v ivu
82
<5
Dtská v iva (konzervovaná, zavaená)
96
22
Dtská v iva (su ená)
24
16
Dtská v iva (pi koty, suchary atd.)
32
181
Su ené potraviny
13
121
11
Druh zdroj je minoritní a je zpsoben pechodem AA z obalov ch materiál do potravinov ch produkt, pi em obsah volného AA v tchto materiálech nesmí pekroit 0,2 %. Dal ím zdrojem je pitná voda, pi úprav které se jako antiflokulant pou ívá polyakrylamid, piem tento netoxick polymer obsahuje zbytky toxického monomeru AA. Nakolik se tato voda pou ívá, nap. na oplachování zeleniny, resp. pi praní krobu, dochází v koneném dsledku k pechodu AA do potravinov ch produkt. Tento typ kontaminace vysvtluje pítomnost AA v koncentracích 15 – 350 µg/kg [2]. AA je také slo kou kouového d mu a kosmetiky.
2.4 Mechanismus vzniku akrylamidu v potravinách AA se u ívá ji nkolik desetiletí jako syntetická, prmyslov vyrábná chemikálie za úelem produkce polyakrylamidu a polyakrylamidov ch gel. Do potravin není v ádné form pidávána. AA se vytváí v potravinách bohat ch na redukující sacharidy a proteiny, a to úpravou pi vysok ch teplotách, nap. peením urit ch typ chleba, sma ením bramborov ch lupínk, ale i fritováním. AA nebyl nalezen v ohívan ch nebo vaen ch potravinov ch produktech. AA se tvoí z asparaginu a slouenin obsahující karbonylovou skupinu. Jde o tzv. Maillardovu reakci (neenzymatické hndnutí - obr. 2), která pedstavuje hlavní mechanismus tvorby AA, kdy dochází k reakci karbonylové skupiny pítomné v redukujícím sacharidu jako je glukosa, která reaguje s aminoskupinou, která je pítomná v aminokyselin asparaginu, a to bhem peení a sma ení. Studie teplotní závislosti tvorby AA ukázaly [4], e se AA tvoí i pi zvy ování teploty ze 120 °C na 170 °C i více. Ale u pi teplot 100 °C dochází k tvorb N-glykosidu, kter je pak roz tpen uprosted vazby C-N a následn dochází k pemn na AA. Pesto e 2-deoxyglukosa, glyoxal a glycerol nejsou souástí klasické Maillardovy reakce, i tyto látky v kombinaci asparaginem mohou tvoit AA [5].
12
asparagin
glukosa zah átí
N-(D-glukos-1-yl)-L-asparagin
n kolik mezi krok
akrylamid Obr. 2 Maillardova reakce [6] Jeden z dal ích mechanism , p i kterém dochází ke tvorb AA je reakce asparaginu v p ítomnosti
-hydroxykarbonylu
(obr.
3).
Dále
pak
tvorba
AA
reakcí
3-aminopropionamidu s redukujícími sacharidy (obr. 4), vznik AA reakcí asparaginu s lipidami a vznik AA z aminokyselin samotn ch (obr. 5) [2]. 13
Obr. 3 Mechanismus tvorby akrylamidu z asparaginu v pítomnosti -hydroxykarbonylu
14
Obr. 4 Dekarboxylace asparaginu pes 3-aminopropanamid
Obr. 5 Termální degradace asparaginu
15
2.5 Zpsoby eliminace akrylamidu v potravinách Jak u bylo eeno, AA se pevá n vyskytuje v potravinovch produktech bohatch na redukující sacharidy a je tedy dle ité pedcházet vzniku AA, a to ji v poátku reakce, ne samotn AA vznikne. Takovému pístupu bylo vnováno mnoho studií. Jednou ze studií, která byla zamená na redukci tvorby AA bylo pidávání rznch potravinovch aditiv jako jsou antioxidanty (nap. lipolytick askorbát palmitov - LAP, hydrolytick askorbát sodn - HAS). Pídavkem antioxidant (LAP, HAS) bylo zji tno,
e vzniká o 25 % mén AA [7]. Bylo také zji tno, e koncentrace AA klesá pi ochlazování potravinovch produkt bohatch na redukující sacharidy, a to ze 190 °C na 150 °C nebo 120 °C [8]. Dal í ze studie popisuje dosa ení ni ího obsahu AA pídavkem chloridu sodného, kde poátení teplota byla 102 °C, která se zvy ovala o 2 °C/min a na konenou teplotu 180 °C. Pi tomto stanovení se sní il obsah AA o 13 % [9]. Lze také pedcházet vzniku AA v tepeln upravovanch potravinách, a to bu cestou sni ování obsahu asparaginu nebo redukcí obsahu sacharid, a to zásahem do mechanizmu eliminací prekurzor nebo úpravou technologického procesu zpracování potravin. Sumární pístup ke zpsobm sni ování koncentrace AA v potravinách podává pravideln aktualizována píruka „CIAA Acrylamide Toolbox“, kterou pipravila Konfederace producent potravináského a nápojového prmyslu CIAA na podnt Evropské komise. Tato píruka podává celistv obraz o vhodnch metodách vedoucích ke sní ení koncentrace AA v bramborovém, cereálním a kávovém sektoru. Jednou z mo ností je aplikace enzymu asparaginázy ped samotnm vznikem AA.
2.6 Enzym L-asparagináza Asparagináza byla „objevena“ pibli n ped 35 lety. Byla izolovaná z velkého mno ství zdroj: Proteus vulgaris, Erwina carotova , Acinetobacter, Serratia marcescens, Mycobacterium bovis, Streptomyces griseus, Achromobacteraceae a Pisum sativum. Bakteriální L-asparagináza je enzym s vysokou terapeutickou hodnotou. Je pou ívan pi léb rakoviny jako cytostatikum, mén pi akutní lymfatické leukémii a lymfosarkomu. Asparagináza je antineoplastick prostedek. Po jejímu podání se aminokyselina L-asparagin, která je esenciální pro tumorové buky, ve zv ené míe degraduje. Enzym
16
peru í dodávku asparaginu do rakovinovch bunk a ty odumírají, proto e nejsou dále schopné proteosyntézy. Maximum inhibiního úinku je v postmitotické G1 fázi. V echny buky potebují asparagin, aby pe ily. Zdravé buky si asparagin doká í syntetizovat sami, dokud si nádorové buky doká í syntetizovat L-asparagin jen velmi pomalu. Jsou tedy závislé na exogenních dávkách asparaginu potebného pro jejich proliferaci [10]. Neoplastické buky nedoká ou syntetizovat L-asparaginázu kvli absencii L-asparagin-syntetázy [11]. Enzym asparagináza je prmyslov produkovan bakterií Escherichia coli nebo Ervinia chrysanthemi, také Pseudomonas aeruginosa. Dal ími mo nmi producenty L-asparaginázy jsou koliformní bakterie a vláknité houby, jako jsou Aspergillus tamarii a Aspergillus terreus. Byly pozorovány i eukaryotické mikroorganismy jako jsou kvasinky (Saccharomyces cerevisiae) a vláknité houby rodu Penicillium a Fusarium a bylo zji tno,
e mají také potenciál pro produkci asparaginázy [12, 13, 14]. U.S. Úad pro potraviny a léiva (FDA) roku 2007 udlil na ádost producent L-asparaginázy tzv. GRAS Notice (Generally Recognized as Safe), ím umo nil pou ití tohoto enzymu v lidské v iv bez ohro ení zdraví lovka.
2.6.1 Charakteristika enzymu L-asparagináza izolovaného z Escherichia coli Název: L-asparagináza Synonymum: L-asparagine aminohydrolase, Crasnitin, Kidrolase, Elspar, asparaginase EC 2, Leunase, Leukogen, Colaspase Molekulová hmotnost: 141 g/mol EC No.: 3.5.1.1 CAS No: 9015-68-3 Strukt ra: enzym je tetrametrick Extinkní koeficient: = 7,1 Izoelektrick bod: pH 4,9 Konstanty: Km = 1,25 x 10-5 Inhibitory: 5-diazo-4-oxo-L-norvalín. Tato slouenina je také alternativní substrát pro enzym. Stabilita: Vysoko purifikovaná asparagináza se stabilizuje pidáním tlumivch roztok solí nebo extra proteinem. Poloas rozpadu: 8 - 30 hodin
17
L-asparagináza katalyzuje hydrol zu L-asparaginu na kyselinu L-asparagovou a amoniak (obr. 6). Enzym je pítomn v mnoha ivoi n ch tkání, bakterií, rostlinách a v krmném séru nkter ch hlodavc. Pirozen se v ak nenachází u lovka. Vysoké teploty poas tepelné úpravy inaktivují tento enzym v dsledku proteol zy. Glutamináza, enzym podobn asparagináze, katalyzuje deaminaci glutaminu na kyselinu glutamovou a amoniov ion. Oba enzymy (jak L-asparagináza tak i glutamináza) jsou homotetramery. Na jejich katalytické aktivit se podílejí dva treoninové zbytky v N-terminální ásti proteinu. Asparagináza je pomrn velk enzym slo en ze ty identick ch podjednotek (obr. 7, 8) [2].
+ H(2)O = L-asparagine
+ NH(3) L-aspartate
Obr. 6 Hydrolza L-asparaginu psobením L-asparaginázy
Obr. 7 Kvartérní struktra asparaginázy izolované z Erwinie chrysantemi
18
Obr. 8 Struktura L-asparaginázy se 4 podjednotkami
.
2.7 Charakteristika surovin AA je látka vznikající bhem tepleného zpracování potravin bohat ch na redukující sacharidy jako jsou pekárenské produkty a cereálie. Základní nejdle itj í surovinou tchto potravin je obilné zrno, které je zdrojem sacharid, plnohodnotn ch bílkovin, vitamín (pevá n sk. B), tuk, minerálních látek a vlákniny (tab. 3). Nejzdravj í zpsob pou ívání obilnin je pou ívat je v celozrnné form z hlediska vy ího obsahu vlákniny, která má pízniv vliv na za ívání. Nejznámj ími obilninami u nás jsou jemen, kukuice, oves, p enice a proso. Mezi základní obilná zrna, která byla v této diplomové práci pou ita, patí odrdy ovse (Zvolen, Vendelin, Atego, Valentin a Detvan) a odrdy p enice (PS-27/06, PS-11, PS-9/06, PS-51/06 a PS-3/05). Tab. 3 Prmrné hodnoty ivin ve 100 g suroviny Prmrné hodnoty ve 100 g suroviny bílkoviny: 7 - 15 g sacharidy: 70 - 80 g tuky: 0,5 - 7 g energie: 1300 - 1850 kJ
19
2.7.1 Odrdy ovse
2.7.1.1 Atego Jde o eskou odrdu ovse. Pochází z pracovi t Selgen Praha - S Krukanice. Je to velmi úrodná odrda s drobnj ím zrnem. Ale i pesto se eskm pracovníkm pro její vysokou úrodnost podailo materiál roz íit v mnohch krajinách EU. Jde o kontrolní odrdu.
2.7.1.2 Detvan
Odrda Detvan se vyznauje krátkm a pevnm stéblem. Je vhodná pro pstování ve vrobních epnch a bramborovch oblastí.
2.7.1.3 Valentin Odrda Valentin byla registrovaná na Slovensku v dubnu 2008. Jedná se o ito plevnatého ovse s nejvt ím zrnem ze sortimentu registrovanch odrd ovse na Slovensku, pekonal kontrolní odrdy p enice (Atego a Auron) v úrod zrna o 1%. Vyniká krat ím stéblem. Tato odrda je odolná proti chorobám a je na úrovni kontrolních odrd.
2.7.1.4 Vendelin Vendelin je plastickou odrdou, která poskytuje vysoké úrody v bramborové a horské vrobní oblast. Je stedn skorá. Vyniká velmi vysokou hmotností tisíce zrn (36 – 40 g) a vysokou objemovou hmotností.
2.7.1.5 Zvolen Jedná se o plastickou odrdu, která poskytuje vysoké úrody v bramborové a horské vrobní oblast. Vyniká vysokou hmotností tisíce zrn (36,5 g) a vysokou objemovou hmotností. Procentuální podíl pedního zrna se adí na první místo v sortimentu odrd (86 %).
20
2.7.2 Odrdy penice
2.7.2.1 PS 3/ 05 PS 3/05 je p enice stedn skorá. Je vhodná i do náronj ích podmínek podhorsk ch a horsk ch oblastí. Má velmi dobrou potravináskou kvalitu stupn 7 - 8. V úrod zrna pekonává kontrolní odrdy o 5 %.
2.7.2.2 PS 9/ 06 P enice skorá, osinatá. Je té vhodná i do náronj ích podmínek podhorsk ch a horsk ch oblastí. Má velmi dobrou potravináskou kvalitu stupn 7 - 8.
2.7.2.3 PS 11/ 02 P enice stedn brzká. Vhodná i do náronj ích podmínek podhorsk ch a horsk ch oblastí. Potravináská kvalita stupn 6. V úrod zrna pekonává kontrolní odrdy o 5 %.
2.7.2.4 PS 27/ 06
P enice velmi skorá. Má dobrou potravináskou kvalitu stupn 7 a zlep ené hospodáské a biologické vlastnosti. Je suchovzdorná.
2.7.2.5 PS 51/ 06 P enice neskorá. Nemá potravináskou kvalitu, ale má zlep ené hospodáské a biologické vlastnosti. V úrod zrna pekonává kontrolní odrdy o 5 %.
21
3 CÍLE DIPLOMOVÉ PRÁCE Cílem
této
diplomové
práce
je
získání
poznatk,
definování
podmínek
a charakterizování mo n ch dsledk aplikace enzymu L-asparaginázy a anorganick ch solí v modelovém a reálném systému za úelem minimalizace obsahu toxického akrylamidu. Tento cíl je mo né dosáhnout parciálními úlohami v následujících etapách: 1. studování zmn vyvolan ch aplikací enzymu L-asparaginázy v modelovém systému simulujícím slo ení cereálních v robk: stanovení aminokyselin a akrylamidu 2. stanovení optimálních podmínek aplikace enzymu L-asparaginázy a anorganick ch solí vzhledem na minimalizaci tvorby akrylamidu v modelovém systému (koncentrace enzymu a anorganick ch solí, teplota a as enzymového psobení) 3. ovení aplikovatelnosti zji tn ch podmínek v reálném systému 4. stanovení vlivu aplikace enzymu L-asparaginázy na senzorické a kvalitativní vlastnosti finálního produktu.
22
4 MATERIÁL A METODY
4.1 Chemikálie (S)-(+)-asparagin (MERCK, Schuchardt, Nmecko) (S)-(+)-glutamin (MERCK, Schuchardt, Nmecko) 2,3,3-D3 znaen akrylamid (Cambridge Isotope Laboratories Inc., Andover, USA) bramborov krob (MERCK, Schuchardt, Nmecko) D(-)fruktóza pro biochemii (MERCK, Darmstadt, Nmecko) D(+)glukóza monohydrát pro biochemii (MERCK, Darmstadt, Nmecko) d3-kyselina glutamová pro stanovení aminokyselin LC-MS jako vnitní standard (Cambridge Isotope Laboratories, USA) destilovaná voda (Deioniser HP340, Purite Ltd, England) ethytacetát pro kapalinovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií (Riedel-de Haen, Nmecko) hexakyano eleznatan draseln trihydrát, p.a. (Slavus, Slovenská republika) chlorid sodn (MERCK, Schuchardt, Nmecko) chlorid vápenat (Lachema, Brno, eská Republika) kyselina (S)-(+)-asparagová (MERCK, Schuchardt, Nmecko) kyselina (S)-(+)-glutamová (MERCK, Schuchardt, Nmecko) kyselina octová p. a. (Lachema, Brno, eská Republika) kyselina pentadekafluorooktanové pro stanovení aminokyselin LC-MS (Aldrich, Nmecko) L-asparagináza (Novozymes, Dánsko) methanol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nmecko) p enin krob (MERCK, Schuchardt, Nmecko) síran zinenat heptahydrát, p.a. (Lachema, Brno, eská republika)
4.2 Pouité vzorky Pro stanovení akrylamidu v reálnch cereálních smsích byly pou ity vzorky perník, a to Perníky Familia s cukrovou polevou (o.z. Pekárna Sere, Slovenská Republika) a se lehanou cukrovou polevou (o.z. Pekárna Sere, Slovenská Republika (obr. 9)) a pi kot, 23
a to Slatinské pikoty dtské (Slatinská pekárna s.r.o., Krivá, Slovenská Republika (obr. 10)). Ke stanovení aminokyselin byly pouity jednotlivé druhy mouk zakoupench v obchodních sítích, a to peninou mouku hladkou svtlou 00 extra (Lidl, Slovenská Republika), peninou mouka hladkou speciál 00 Extra (PMD UNION a.s. Bratislava, Slovenská Republika), peninou mouku hladkou speciál 00 Extra (Gútai Búza Finomliszt BL55, Kolárovo, Slovenská Republika), peninou mouku hladkou speciál 00 Extra, Clever (Sládkoviovo, Slovenská Republika), peninou mouku hladkou speciál 00 Extra, Noe (Trnavská cesta, Slovenská Republika) a peninou mouku hladkou speciál 00 Extra (urany, Slovenská Republika). Dále byly pouity vzorky obilnch zrn, a to 5 registrovanch odrd ovse: Vendelin, Valentin, Zvolen, Atego (pleveln oves) a Detvan (nah oves) a 5 materiál ozimé
penice
(ped
registrací):
PS-3/05,
PS-11,
PS-9/06,
PS-27/06,
PS-51/06
(Vzkumní-lechtitelská stanice Víga – Pstruha, Detva, Slovenská republika). Ke stanovení AA v pekárenskch produktech byla pouita komerní suená sms na pípravu perníku (Dr. Oetker s.r.o., eská Republika (obr. 11)).
Obr. 9 Vzorky perník
24
Obr. 10 Vzorky pikot
Obr. 11 Sms na p ípravu perníku
25
4.3 Pouité pístroje analytické váhy (Mettler AE 163, v carsko) laboratorní centrifuga s mo ností chlazení do -10 °C SORVALL RT 6000D (Du Pont Instruments, Newtown, CT, USA) LC-MS kapalinov chromatograf (Agilent Technologies 1200 Series, USA) slo en z binární pumpy, degustéru, autosamplera HiP-ALS SL, termostatu, kolony TCC SL s hmotnostním detektorem TRIPLE QUAD LC/MS 6410 (obr. 12) SPE kolona (WATERS - OASIS, USA) termoblok (Liebisch Labortechnik, Bielefeld, Nmecko) ultrazvuková vana TESON 1 (Tesla, eskoslovensko) vakuová rota ní odparka (Heidolph, Nmecko) vortex mixér VM-300 (Gemmy Industrial Corp., Taiwan)
Obr. 12 LC-MS kapalinov chromatograf Agilent Technologies 1200 Series s hmotnostním detektorem TRIPLE QUAD LC/MS 6410
26
4.4 Stanovení akrylamidu v reáln ch vzorcích - perníky, pikoty
4.4.1 P íprava vzork
4.4.1.1 Postup A K 1 g vzorku bylo pidáno 9 ml roztoku kyseliny octové, 50 µl roztoku D3 AA o koncentraci 2 mg/100 ml, 0,5 ml Carrezova rozotoku I a 0,5 ml Carrezova rozotoku II. Poté byla tato sm s protepána a podrobena centrifugaci (0 °C, 5000 ot./min, 10 min). Následn bylo do 6 ependorfek u perník a do 4 ependorfek u pi kot odebráno po 1,5 ml. Op t byla provedena centrifugace (10 °C, 10000 ot./min, 15 min) a vzorek odebrán k anal ze. Tento postup byl modifikován z publikace [16].
4.4.1.2 Postup B K 1 g vzorku bylo pidáno 50 µl roztoku D3 AA o koncentraci 2 mg/10 ml a 9 ml ethylacetátu. Poté se v e dobe promíchalo a 5 min podrobeno ultrazvuku. Následn bylo pidáno 500 µl Carrezova roztoku I a 500 µl Carrezova roztoku II, v e protepáno a centrifugováno. Poté byl vzorek op t odebrán ke stanovení.
4.4.2 LC-MS podmínky pro stanovení akrylamidu v reáln ch vzorcích Byla pou ita kolona typu Atlantis dC18 (délka: 100 mm, prm r: 3 µm). Jako mobilní fáze se pou ila sm s z 500 ml destilované vody, 5 ml methanolu a 1 ml kyseliny octové. Dávkoval se objem 20 µl a doba anal zy byla 10 min. Podmínky pro detekci byly následující: MS-mod ESI+ (nastavení parametr iontového zdroje: fragmentor 80, collision energy 5, gas temperature 350 °C, gas flow 11 l/min., nebulizer 50 psi, capillary voltage 2500 V, MRM: pro akrylamid 72 55, pro D3-akrylamid 75 58).
27
4.5 Extrakce aminokyselin z mouky a obilnch zrn
4.5.1 P íprava vzork V mouce a ve zrnech byla udlána analza v ech aminokyselin, které byly stanovovány (asparagin – Asn, kyselina asparagová – Asp, glutamin – Gln, kyselina glutamová – Glu). Extrakce aminokyselin z mouky byla provedena podle metody uvedené v publikaci [15]. K 1 g vzorku mouky se pidalo 10 ml 2 mmol/l kyseliny octové. Následn se tato sms 2 min protepávala a centrifugovala pi -5 °C (5000 ot./min, 10 min). Ped samotnou analzou aminokyselin byl vzorek pefiltrován pes membránov nylonov filtr o velikosti pór 0,2 µm.
4.5.2 LC-MS podmínky pro stanovení aminokyselin LC kapalinov chromatograf Agilent Technologies 1200 Series s hmotnostním detektorem TRIPLE QUAD LC/MS 6410 byl pou it na stanovení aminokyselin s kolonou Luna (2) C18 (délka 50 mm x prmr 2,1 mm x zrnitost sorbentu 3 m, Phenomenex, Torrance, USA) bez termostatování kolony. Mobilní fáze 0,5 mmol/l roztok kyseliny pentadekafluorooktanové v destilované vod, prtok 0,35 ml/min. Dávkovaní vzorku 5 l, vnitní standard d3-kyselina glutamová (pechod iont m/z: 151 87 a 151 105). Pracovalo se v klimatizované místnosti pi teplot 25 °C. Hmotnostní detektor pou íval na ionizaci elektrosprej v pozitivním modu. Podmínky pro nastavení zdroje elektrospreje byly následující: capillary voltage 3000 V, nebulizer pressure 50 psi, collision gas - nitrogen, gas temperature 320 °C, gas flow 8 l/min, fragmentor energy 40 V, collision energy 12 V, dwell time 50 ms. Pracovalo se v tzv. MRM modu (MRM - multiple reaction monitoring), kter dovoluje sledovat pechody z tzv. prekurzor na produktové ionty, piem pro ka dou sledovanou aminokyselinu se sledovali dva pechody (intenzivnj í se pou il na kvantifikaci a slab í na potvrzení pítomnosti v reálném vzorku). Sledované pechody iont m/z pro jednotlivé aminokyseliny jsou: Asn 133 74 a 13387, Asp 134 74 a 13488, Glu 148 84 a 148102, Gln 147 84 a 147130.
4.6 Stanovení akrylamidu v modelovch cereálních sm sích
28
Pro zabezpeení konstantního definovaného slo ení jednotliv ch parametr byly pou ity v experimentální ásti dva zjednodu ené modelové systémy simulující prmrné slo ení moukové matrice.
4.6.1 Píprava modelové cereální smsi Modelová cereální sms I: p enin krob (45,5 g) s pvodní vlhkostí kolem 10 % se su il 2 hodiny pi 110 °C. Poté bylo navá eno 7,5 g glukózy a 6,8 g fruktózy (Glc a Fru byly zvlá zhomogenizovány v tecí misce). Do vypékacích ampulek byl zvlá navá en bramborov krob (0,76 g) a sms Glc + Fru (0,24 g). K 1 g této smsi bylo pidáno 760 µl roztoku Asn o koncentraci 0,0333 mol/l, protepáno a vypékáno pi 190 °C po as 2, 5, 7, 10, 15, 20, 30 a 45 min (obr. 13). Vypeené ampulky byly zchlazeny. Do vypeen ch ampulek bylo pidáno 20 ml roztoku kyseliny octové a 100 µl zedného roztoku D3 AA (VS). Ampulky byly následn vlo eny do ultrazvuku po dobu 5 min, poté protepány a znovu vlo eny do ultrazvuku po dobu 5 min. Ped samotnou anal zou aminokyselin byl vzorek pefiltrován pes membránov nylonov filtr o velikosti pór 0,2 µm.
29
Obr. 13 Vype ené ampulky p i 190 °C po as 2, 5, 7 10, 15, 20, 30 a 45 min Modelová cereální sm s II: p ipravena jako v p edcházejícím p ípad . Poté bylo do ampulek p idáno 760 µl roztoku aminokyselin (0,0333 a 0,0066 mol/l roztoku Asn). Následn bylo ve dob e prot epáno, vypékáno p i 200 °C/15 min (obr. 14). Po chlazení následovala extrakce. K vzorku, kter obsahoval 0,0333 mol/l roztok Asn bylo p idáno 100 µl z ed ného roztoku D3 AA a k vzorku, kter obsahoval 0,0066 mol/l roztok Asn bylo p idáno 200 µl z ed ného roztoku D3 AA a 20 ml roztoku kyseliny octové. Následoval stejn postup jako v p edcházejícím p ípad .
Obr. 14 Vypékání jednotliv ch vzork v termobloku
4.6.2 LC-MS podmínky pro stanovení akrylamidu v modelovch cereálních smsích Viz. 4.4.2.
4.7 Eliminace akrylamidu v modelovch cereálních smsích
4.7.1 Vliv enzymu L-asparaginázy
30
4.7.1.1 Píprava zásobních roztok enzymu L-asparaginázy Zásobní roztok L-asparaginázy se pipravil tak, aby v sledné koncentrace enzymu byly 0,1; 0,5 a 1 U/g vzorku. Roztok L-asparaginázy byl pipraven zed ním 0,570 ml enzymu L-asparaginázy s 99,43 ml destilované vody (1 U/g). Z takto pipraveného roztoku bylo odebráno 5 ml a pidáno 5 ml destilované vody (0,5 U/g) a 1 ml a pidáno 9 ml destilované vody (0,5 U/g).
4.7.1.2 Píprava vzork K 1 g vzorku (viz. pedcházející modelové sm si) bylo pidáno 380 µl 0,0333 mol/l roztoku Asn, 50 µl roztoku enzymu o koncentracích 0,1; 0,5 a 1 U/g a 330 µl destilované vody. Sm s byla protepána, temperována (37 °C/15 min) a vypékána (190 °C/15 min). Poté následovala extrakce 50 µl roztoku D3 AA (10x zed ného) a 10 ml roztoku kyseliny octové. Následn byly ampulky vlo eny do ultrazvuku po dobu 5 min, poté protepány a znovu vlo eny do ultrazvuku po dobu 5 min. Ped samotnou anal zou byl vzorek pefiltrován pes nylonov membránov filtr o velikosti pór 0,2 µm.
4.7.2 Vliv solí (NaCl, CaCl2, NaHCO3, NH4HCO3) a jejich vzájemná kombinace s enzymem
4.7.2.1 Píprava vzork K 1 g vzorku (viz. pedcházející modelové sm si) bylo pidáno 380 µl 0,0333 mol/l roztoku Asn, 190 µl soli (NaCl a CaCl2 o koncentracích 1 a 5 mg/g a 0,01 mmol/g; NaHCO3, NH4HCO3 o koncentracích 0,1 a 0,01 mmol/g), 50 µl roztoku enzymu o koncentraci 0,1 U/g a destilovaná voda, aby v sledn objem byl 760 µl. Následující postup byl toto n z pedcházejícím s tím rozdílem, e bylo na extrakci pou ito 25 µl D3 AA (10x zed ného) a 5 ml ethylacetátu (obr. 15). V e bylo dobe protepáno. Po odd lení jednotliv ch vrstev byla 31
vrstva ethylacetátu odebrána. Poté bylo pidáno 5 ml ethylacetátu a v e se zopakovalo 2x. Jednotlivé podíly ethylacetátu byly odpaeny na vakuové rota ní odparce do sucha a následn rozpu t ny 1 ml roztoku kyseliny octové. Ped samotnou anal zou byl vzorek pefiltrován pes nylonov membránov filtr o velikosti pór 0,2 µm.
Obr. 15 Extrakce akrylamidu
4.7.3 LC-MS podmínky pro eliminaci akrylamidu v modelovch cereálních smsích Viz. 4.4.2.
4.8 Stanovení aminokyselin v pekárenskch produktech Viz. 4.5.
4.9 Eliminace akrylamidu v pekárenskch produktech
4.9.1 Vliv enzymu L-asparaginázy
4.9.1.1 Postup 1
32
Z celkového mno ství smsi (540 g) bylo odvá eno 4x po 135 g, pidáno 42 ml oleje a 100 ml roztoku enzymu (o koncentracích 0,1; 0,5 a 1 U/g) a temperováno pi 24 °C/30 min. Z takto pipraven ch smsích bylo v dy navá eno 35 g a peeno 20 min. Poté byla sms homogenizována (obr. 16). Zhomogenizovaného vzorku bylo navá eno po 2 g, pidáno 18 ml roztoku kyseliny octové, 100 µl D3 AA (10x zedného) a 100 µl AA (100x zedného). Následn byly ampulky vlo eny do ultrazvuku po dobu 5 min, poté protepány a znovu vlo eny do ultrazvuku po dobu 5 min. Poté bylo pidáno 0,5 ml Carrezova roztoku I (protepáno), 0,5 ml Carrezova roztoku II a v e dobe protepáno (obr. 17). Takto pipravené vzorky byly dány do chladniky a následn byly podrobeny centrifugaci (10 min pi 10 000 ot./min (-5 °C)). Po centrifugaci bylo odebráno 5 ml iré vrstvy a 3x extrahováno ethylacetátem (obr. 18). Odebrané vrstvy ethylacetátu byly odpaeny na vakuové rotaní odparce a zbytek rozpu tn 1 ml roztokem kyseliny octové. Ped samotnou anal zou byl vzorek pefitrován pes membránov nylonov filtr.
4.9.1.2 Postup 2 Toto n s postupem 1 s následujícími rozdíly: Do smsi ped peením byl pidán med (22 g) a roztoky enzym byly o koncentracích 0,1 a 0,01 U/g.
4.9.2 LC-MS podmínky pro eliminaci akrylamidu v pekárenskch produktech Viz. 4.4.2.
33
Obr. 16 Vypeené a zhomogenizované vzorky perníku
Obr. 17 Píprava vzorku k centrifugaci
34
Obr. 18 Extrakce ethylacetátem
4.9.3 Stanovení suiny v homogenizovaném vzorku perníku Bylo naváeno 5 g zhomogenizovaného vzorku perníku a sueno 5 h pi 105 °C.
35
5 VSLEDKY A DISKUZE
5.1 Stanovení akrylamidu v reálnch vzorcích - perníky, pikoty Problematika AA je v dne ní dob velmi aktuální. Jeho píjem do organizmu pes potravu pochází ze tí hlavních zdroj: z bramborov ch produkt, z cereálních produkt a z kávy. Z nynj ích poznatk je známo, e píjem AA pes cereálie pedstavuje 27 - 49 % z celkového píjmu. Podíl jednotliv ch pekárensk ch produkt na celkovém píjmu je následující: chléb 10 - 34 %, su enky 6 - 17 %, cereálie na snídani 3 - 8 %, perníky 6 - 8 %, jiné 10 - 15 %. Obecn cereální produkty a na v jimky (perníky) obsahují podstatn mén AA v porovnání s bramborov mi produkty (bramborové lupínky, hranolky, peené brambory), jejich vysoká spoteba jako základních potravin v ak zpsobuje uveden vysok píjem AA pes tyto potraviny. Cílem této diplomové práce bylo eliminovat AA v cereálních produktech na základ experiment v modelovém systému simulujícím cereální matrici. Bylo proto dle ité nejprve zjistit, zda a v jakém rozsahu se AA vyskytuje v nkter ch pekárensk ch produktech. Z toho hlediska byl analyzován obsah AA v perníkách s pedpokládan m vysok m obsahem AA a v pi kotech s pedpokládan m nízk m obsahem AA (tab. 4, 5). Tab. 4 Obsah akrylamidu v perníkách
Perník 1 2
S cukrovou polevou Se lehanou cukrovou polevou
AA [ng/g] 313,73 485,17
Tab. 5 Obsah akrylamidu v pikotech
vzorek .1 vzorek .2
AA [ng/g] 8,62 9,63
RSD [%] 14,17 9,02
vzorek .3
7,77
22,73
Pi koty
36
RSD [%] 2,40 2,65
5.2 Stanovení aminokyselin v mouce a obilnch zrnech Jedním z prekurzor vzniku AA v mouce a obiln ch zrnech je mimo redukujících sacharid volná neesenciální aminokyselina (AMK) L-asparagin (Asn). Její obsah má dominantní vliv na potenciál tvorby AA v cereálních produktech [17]. Dal ími AMK, ze kter ch dochází k omezené tvorb AA, jsou kyselina asparagová (Asp), glutamin (Glu) a kyselina glutamová (Gln), ov em podíl AA pocházející z t chto AMK je v porovnání s Asn minoritní. Pi stanovení obsahu zmín n ch AMK v p eni né mouce (obr. 19) byl zji t n nejv t í podíl Asp (0,13 - 0,16 ng/g) a Asn (0,05 - 0,12 ng/g) mimo vzorek E, kde dominantní AMK je glutamin.
Vzorek A AMK [ng/g]
0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00
Asp
Asn
Glu
Gln
Glu
Gln
Vzorek B AMK [ng/g]
0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00
Asp
Asn
37
Vzorek C AMK [ng/g]
0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00
Asp
Asn
Glu
Gln
Glu
Gln
Glu
Gln
Vzorek D AMK [ng/g]
0,20 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00
Asp
Asn
Vzorek E 0,20
AMK [ng/g] 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00
Asp
38
Asn
Vzorek F 0,20
AMK [ng/g] 0,16 0,12 0,08 0,04 0,00
Asp
Asn
Glu
Gln
Obr. 19 Obsah aminokyselin v jednotlivch typech peniné mouky Pi stanovení obsahu AMK v obiln ch zrnech (obr. 20, 21) bylo zji tno, e nejvy í zastoupení má aminokyselina Asn. V obiln ch zrnech odrd ovse (Detvan, Zvolen, Vendelin, Valentin, Atego) je více Asn ne u odrd p enice (PS-27/06, PS-11, PS-9/06, PS-51/06, PS-3/05). Obsah Asn a Asp v zrnách p enice je v souladu s podobn m zastoupením tchto AMK v p eniné mouce.
DETVAN 4500
AMK [ng/g] 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
Glu
Gln
Asp
39
ZVOLEN 4500
AMK 4000 [ng/g] 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
Glu
Gln
Asp
Gln
Asp
VENDELIN 4500
AMK 4000 [ng/g] 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
Glu
VALENTIN AMK 4500 [ng/g] 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
40
Glu
Gln
Asp
ATEGO 4500
AMK [ng/g] 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
Glu
Gln
Asp
Obr. 20 Obsah aminokyselin v obilnch zrnech odrd ovse
PS-27/06 4500
AMK 4000 [ng/g] 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
Glu
Asp
Gln
Asp
Gln
PS-11 4500
AMK [ng/g] 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
Glu
41
PS-9/06 4500
AMK [ng/g] 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
Glu
Asp
Gln
Asp
Gln
Asp
Gln
PS-51/06 4500
AMK [ng/g] 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
Glu
PS-3/05 4500
AMK [ng/g] 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
Asn
Glu
Obr. 21 Obsah aminokyselin v obilnch zrnech odr d penice
42
Na jednotlivé rozdíly v zastoupení obsahu aminokyselin m e mít vliv pstování odrd v rzn ch oblastech, klimatické podmínky, jednotlivé technologické postupy pi zpracování a dal í.
5.3 Stanovení aminokyselin v pekárenskch produktech (perník) Zastoupení zmínn ch AMK bylo stanoveno také v suchém potravináském produktu ureného na domácí pípravu perníku. Z obr. 22 je zejmé, e ve stanovovaném vzorku suché smsi na pípravu perníku má hlavní zastoupení aminokyselina Asp (140 µg/g). Dominantní prekurzor vzniku AA aminokyselina Asn je zastoupena v koncentraci pibli n 60 µg/g suché smsi.
AMK [µ g/g]
160 140 120 100 80 60 40 20 0
Asp
Glu
Asn
Gln
Obr. 22 Obsah aminokyselin v suchém vzorku smsi
5.4 Stanovení akrylamidu v modelovch cereálních smsích Jak u bylo eeno, modelová cereální sms byla zmodelována tak, aby odpovídala definovanému slo ení moukové matrice. V hodou takového postupu je odstranní variability
43
matrice poas trvání experiment a zjednodu ení analytickch postup pi zachování dominantních slo ek ovlivujících tvorbu AA. AA v modelové matrici byl nejprve stanovován v rznch asovch intervalech pi 190 °C, aby bylo zji tno, ve kterém ase tepelného zpracování vzniká nejvíce AA. Z obr. 23 je zejmé, e nejvíce AA vzniká v 15 min/190 °C. Z tohoto faktu bylo vycházeno, a pro dal í stanovení obsahu AA v modelovch cereálních smsích bylo vypékáno pi 190 °C/15 min.
4500
AA [ng/g] 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0
10
20
30
40
50
_as [min]
Obr. 23 Obsah akrylamidu v modelové cereální smsi v prbhu tepelného záhevu pi 190 °C Pro dal í stanovení AA byl pou it pídavek roztoku Asn o rznch koncentracích (0,0333 a 0,0066 mol/l). Z obr. 24 je zejmé, e pi ni ím obsahu Asn vzniká mén AA, co souvisí s pozicí Asn jako dominantního prekurzoru vzniku AA. Pro dal í stanovení byla pou ita zmínná ni í koncentrace Asn, co souvisí s ni ím obsahem Asn, kter byl pozorován v analyzovanch vzorcích mouky.
44
2500
AA [ng/g] 2000
1500
1000
500
0
0,0333
0,0066 Asn [mol/l]
Obr. 24 Obsah akrylamidu v modelové cereální smsi s pídavkem 0,0333 a 0,0066 mol/l roztoku asparaginu
5.5 Eliminace akrylamidu v modelovch cereálních smsích
5.5.1 Vliv enzymu L-asparaginázy Je známo, e ka d zásah do technologie zpracování potravinásk ch v robk má za následek vliv na kvalitativní i senzorické vlastnosti dané potraviny. Podobn dopad lze o ekávat pi jakémkoli zpsobu eliminace AA v potravinách. Pitom je teba poznamenat, e neexistuje jednotn a jednoduch zpsob eliminace AA práv kvli vysoké variabilit surovin, produkt a proces zpracování. Proto je oprávnn diferencovan pístup zohledující specifické vlastnosti ka dého produktu. Kone n m posuzovatelem vhodnosti aplikovaného pístupu je v kone ném dsledku akceptabilita spotebitelem. V znamnost aplikace pístupu bez zjevného dopadu na kvalitativní a senzorické vlastnosti produktu je z tohoto hlediska zejmá. Zmínn m po adavkm na stávající kvalitativní a senzorické vlastnosti finálního produktu pln vyhovuje aplikace enzymu L-asparaginázy. K redukci obsahu AA dochází psobením tohoto enzymu na surovinu ped samotn m tepeln m zpracováním, kdy enzym katalyzuje hydrol zu Asn na Asp a amonn zbytek [2].
45
Pi eliminaci AA psobením L-asparaginázy byly pou ity ti rzné koncentrace enzymu (0,1; 0,5 a 1 U/g). Bylo zji tno , e nejmen í obsah AA vzniká po pídavku enzymu o nejvy í koncentraci (1 U/g) a zárove také, e po pídavku enzymu o nejni í koncentraci (0,1 U/g) je mo né AA je t zredukovat (obr. 25). Z tohoto pedpokladu jsme vycházeli a k následujícím mením byl pou it roztok enzymu o koncentraci 0,1 U/g, a to z toho dvodu, e samotn enzym L-asparagináza není levnou zále itostí a i tak pi nízké koncentraci enzymu lze sní it obsah AA.
AA [%]
120 100 80 60 40 20 0
bez enzymu
0,1
0,5
1 Enzym [U/g]
Obr. 25 Obsah akrylamidu bez a s pídavkem enzymu o koncentracích 0,1; 0,5 a 1 U/g
5.5.2 Vliv solí (NaCl, CaCl2, NaHCO3, NH4HCO3) a jejich vzájemná kombinace s enzymem V literatue je popsán úinek pídavku nkterch anorganickch solí na eliminaci AA [9]. V prbhu experiment byl testován pídavek chloridu sodného, chloridu vápenatého, hydrogenuhliitanu sodného a hydrogenuhliitanu amonného s cílem dodateného pou ití tchto solí k nízké koncentraci asparaginázy. Pi eliminaci obsahu AA vlivem solí bylo zji tno, e ve srovnání NaCl a CaCl2 se redukuje více AA po pídavku CaCl2 a také, e ím vy í je koncentrace jednotlivch solí, tím je ni í obsah AA. Dále pak byl stanoven je t ni í úbytek AA, a to kombinací pídavku solí a enzymu (obr. 26, 27).
46
AA [% ]
100 80 60 40 20
]
]
/g U
U
,1
,1 [1
m
m
g/
g/
g]
g[
+
+
E
E
[0
[0
[5 1 C
aC
l2
l[ aC N
/g
g] m
g/ l2 aC C
C
aC
l2
l[
[1
5
m
m
g/
g]
g] g/
g] g/ aC N
aC N
be
z
l[
p_
1
íd
m
av
ku
0
Obr. 26 Obsah akrylamidu s pídavkem NaCl (1 a 5 mg/g), CaCl2 (1 a 5 mg/g) a jejich kombinace s enzymem (0,1 U/g)
100
AA [% ] 80 60 40 20
E
Ca Cl 2+
E Na Cl +
be zp _í N da aC vk l[ u 0, 01 C m aC m ol l2 /g [0 ] ,0 1 m m ol /g Na ] Cl + Ca Cl 2 E [0 ,1 U/ g]
0
Obr. 27 Obsah akrylamidu s pídavkem NaCl (0,01 mmol/g), CaCl2 (0,01 mmol/g) a jejich kombinace navzájem a s enzymem (0,1 U/g) K zaujímavé situaci dolo po p ídavku NH4HCO3, kde byl zjit n vyí obsah AA ve srovnání se vzorkem bez p ídavku jakékoli soli (obr. 28). Toto zvení obsahu AA je
47
pravdpodobn dsledkem pítomnosti NH4 skupiny v NH4HCO3, co m e b t zdrojem dusíku pro tvorbu AA.
250 AA [%]
200 150 100 50
/g [U
U E
+
[0
E
,1
m m
]
1
/g
,0
ol
[0
[0
3
m
3
N
aH
C
O
3
N
[0
,0
aH
1
C
m
O
O C aH N
]
] /g
] /g ol
/g ol m m
,1
,1 [0 3 O C
4H H N
]
] m m
m m 1 ,0 [0
3 O C
ol
/g ol
av íd p_ z be 4H H N
/g
]
ku
0
Obr. 28 Obsah akrylamidu s pídavkem NaHCO3 (0,1 a 0,01 mmol/g), NH4HCO3 (0,1 a 0,01mmol/g) a jejich kombinace s enzymem (0,1 U/g)
5.6 Eliminace akrylamidu v pekárenskch produktech
5.6.1 Vliv enzymu L-asparaginázy
5.6.1.1 Sms bez pídavku medu Na ovení zji tného vlivu pídavku enzymu na eliminaci AA z modelov ch experiment byla pou ita suchá sms na domácí pípravu perníku. Perník byl pipraven podle návodu v robce, piem do jednotliv ch podíl byl pidán enzym o rzné koncentraci (0,1; 0,5 a 1 U/g) ve form vodného roztoku, kter pedstavoval adekvátní pídavek vody na pípravu tsta. Po 30 minutové inkubaci enzymu pi laboratorní teplot bylo tsto upeeno pi 200 °C po dobu 20 min. Za tchto podmínek byla dosa ena po adovaná kvalita hotového v robku. Z obr. 29 je zejmé, e pídavky roztok enzym o zmínn ch koncentracích zpsobují sní ení obsahu AA pod hodnotu LOQ (limit kvantifikace), která je stanovena
48
na 10 µg/kg. To znamená, e i nejni í pou itá koncentrace enzymu zpsobuje více ne 90 %-ní úbytek AA. Je to pravdpodobn zpsobeno pítomností dal ích slouenin podporujících eliminaci AA, jako jsou zmínné anorganické soli (NaCl a NaHCO3), které jsou ji souástí komerní smsi na pípravu perníku. Z tohoto dvodu bylo mo né pistoupit k dal ímu sní ení pidávaného enzymu do suché smsi poas pípravy tsta.
AA [ng/g]
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20
pe rn ík
sE
[1
U/ g]
U /g ] [0 ,5 sE pe rn ík
pe rn ík
sE
[0 ,1
pe
rn
U /g ]
ík
0
Obr. 29 Obsah akrylamidu bez a s pídavkem enzymu o koncentracích 0,1; 0,5 a 1 U/g 5.6.1.1.1 Stanovení suiny v homogenizovaném vzorku perníku bez pídavku medu Pi stanovování obsahu AA vlivem enzymu L-asparaginázy byl dále zji ován obsah su iny v homogenizovaném vzorku upeeného perníku. Bylo zji tno, e v prbhu peení do lo ke 25 %-nímu úbytku hmotnosti v dsledku ztráty vody. Relativní vlhkost upeeného perníku byla cca 28 %, z eho vypl vá, e obsah su iny ve vzorku perníku iní 72 % (tab. 6).
49
Tab. 6 Stanovení obsahu suiny ve vzorku perníku bez pídavku medu
Vzorek [U/g] bez enzymu 0,1 0,5 1 Prmr
Relativní vlhkost [%] 27,50 28,60 29,36 27,43 28,22
Su ina
SD
72,50 71,40 70,64 72,57 71,78
[±] 0,2128 0,1120 0,0767 0,1005 0,1255
5.6.1.2 Sms s pídavkem medu Podle doporuení v robce je mo né pro zlep ení chuti pidat do tsta také med. Z chemického hlediska se jedná o pídavek redukujících sacharid Glc a Fru, které m ou zpsobit nárust potenciálu tvorby AA v pípad pebytku Asn ve smsi. Na obr. 30 je vidt, e po pidání medu nedo lo ke zv ení obsahu akrylamidu, co znamená, e limitujícím faktorem je Asn a ne sacharidy (pi vy ím obsahu sacharid u nedochází k zv enému potenciálu tvorby AA) a jednak, e suchá sms obsahuje ji dostatek glukózy, jak je uvedeno v informaci o slo ení produktu. Dále, e po pidání medu je koncentrace AA o nco ni í, co zpsobila ni í hustota pipraveného tsta v dsledku pídavku sacharid. Obsah AA po pidání vy í koncentrace enzymu (0,1 U/g) klesl pod limit kvantifikace (10 µg/kg). Pi ni í pou ité koncentraci enzymu do lo po 30 minutové inkubaci enzymu v tstu pi laboratorní teplot k pibli n 40 %-nímu poklesu obsahu AA. Del í inkubace (60 min) mla za následek pokles obsahu AA pod limit kvantifikace.
50
200
AA [ng/g] 180 160 140 120 100 80 60 40 20
U/ g] po
60 pe rn ík
sm ed em
a
E
[0 ,1
U/ g] po [0 ,0 1
in ku ba ci 30
in ku ba ci m in
in ku ba ci E a sm ed em
pe rn ík
pe rn ík
sm ed em
a
E
[0 ,0 1
U/ g] po
30
m in
pe rn ík
pe
rn
sm ed em
ík
0
Obr. 30 Obsah akrylamidu bez a s pídavkem medu, bez a s enzymem o koncentracích 0,1 a 0,01 U/g 5.6.1.2.1 Stanovení suiny v homogenizovaném vzorku perníku s pídavkem medu Také pi aplikaci medu pi píprav perník ze suché smsi, byla po upeení stanovena su ina finálního v robku. Bylo zji tno, e také v tomto pípad do lo v prbhu peení ke 25 %-nímu úbytku hmotnosti v dsledku ztráty vody. Relativní vlhkost upeeného perníku byla cca 29 %, z eho vypl vá, e obsah su iny ve vzorku perníku iní 71 % (tab. 7). V porovnání s obsahem su iny ve vzorcích bez pídavku medu do lo jenom k nepatrnému zv ení vlhkosti v rámci chyby stanovení a tedy men í hustota není zpsobena vy ím obsahem vody.
51
Tab. 7 Stanovení obsahu suiny ve vzorku perníku s pídavkem medu
Vzorek [U/g]
Relativní vlhkost
Su ina
SD
70,34 70,92 71,43 72,29 71,24
[±] 0,0135 0,0067 0,0078 0,0113 0,0098
[%] bez enzymu a medu bez enzymu s medem 0,1 0,01 Prmr
29,66 29,08 28,57 27,71 28,76
5.6.2 Senzorické hodnocení produkt Jak ji bylo zmínno, vhodnost jakéhokoli postupu pro eliminaci AA je dána stávajícími vlastnostmi finálního produktu a jeho akceptabilita spotebitelem. Z tohoto dvodu bylo udláno pedb né senzorické hodnocení produkt perníku bez aplikace enzymu a po aplikaci asparaginázy. Panel hodnotitel se skládal ze tí trénovan ch posuzovatel, piem bylo pozorováno následující hodnocení: 1) vzorky bez medu byly hutnj í, textura pórovitá, na dotyk pru ná, flexibilní 2) vzorky s medem mly poréznj í strukturu, karamelovou píchu, celkov více vyhovující chu 3) vzorky s enzymem se senzoricky neli ily od vzork po aplikaci enzymu, a to v jakékoli koncentraci. Zmínn závr senzorického pozorování ve spojitosti s dosa enou eliminaci AA ve finálním v robku poskytuje jednoznaní v hodu aplikaci enzymu L-asparaginázy na tento druh v robk. V dal í práci je mo né dosáhnout optimálních pomr eliminaních faktor s ohledem na rentabilitu zmínného postupu a jednak roz íení aplikace enzymu na dal í v robky s vysok m obsahem AA.
52
6 ZÁVR Stanovené cíle diplomové práce byly naplnny následujícím zpsobem: Byl stanoven obsah AA v komerních cereálních produktech (perníky, pi koty), piem bylo zji tno, e perníky s cukrovou polevou obsahují 313,73 ng/g AA a perníky se lehanou cukrovou polevou obsahují 485,17 ng/g AA. V pi kotech byl obsah AA 8,62; 9,63 a 7,77 ng/g (pod LOQ). Redukce AA byla proto zamena na druh v robku s vysok m obsahem AA. Dominantním prekurzorem vzniku AA je aminokyselina asparagin [17]. Z tohoto dvodu byl stanoven obsah AMK pítomn ch v mouce a v obiln ch zrnech p enice a ovse. Bylo zji tno, e hlavní AMK v mouce je kyselina asparagová, a v obiln ch zrnech aminokyselina Asn. Dále byl zji tn vy í obsah Asn v obiln ch zrnech odrd ovse ne u odrd p enice. Obsah Asn v suché smsi na pípravu perníku byl stanoven na 60 µg/g. Stanovení obsahu AA v modelové cereální smsi simulující slo ení analyzované mouky s ni ím obsahem Asn prokázalo maximum tvorby AA v 15 min pi 190 °C. K redukci obsahu AA byl pou it enzym L-aspragináza a anorganické soli (NaCl, CaCl2, NaHCO3, NH4HCO3). Pídavkem enzymu, solí a jejich vzájemnou kombinací bylo zji tno následující: k nejvt í redukci obsahu AA do lo pidáním enzymu o koncentraci 1 a 0,5 U/g, CaCl2 (5 mg/g) a kombinací soli (CaCl2 a NaCl) s enzymem, a to o 90 %. Nejmen í pokles AA byl zaznamenán u enzymu (0,1 U/g), NaCl (0,01 mmol/g), a to o 18 %. U pekárensk ch produkt do lo k poklesu AA o 90 %, a to u v ech ji zmínn ch koncentracích enzym (0,01; 0,1, 0,5 a 1 U/g). Bylo také zji tno, e po pidání NH4HCO3 byl zaznamenám zv en obsah AA v prmru o 90 %. Pedb né senzorické hodnocení v robk o eten ch enzymem prokázalo, e nedo lo k ne ádoucí zmn kvalitativních a senzorick ch vlastností finálního produktu. Závrem je mo né konstatovat, e testované zpsoby eliminace AA se osvdily, piem v dal í práci je mo né optimalizovat pídavek jednotliv ch komponent vzhledem na specifitu potravinásk ch produkt a roz íit aplikace na dal í druhy v robk s vysok m obsahem AA.
53
7 POUITÁ LITERATURA 1) J. S. Ahn, L., Kastle, D. B. Clarke, A. S. Lloyd, M. R. Philo and D. R. Speck: Verification of the findings of acrylamide in heated foods, Tailor and Francis, 2002, vol. 12, pp. 1116-1124 2) C. Bene ová: Karcinogenní akrylamid v potravinách - enzymatick zpsob jeho eliminace (Diplomová práce), 2007 3) L.M. Owen et al.: Analytical methods used to measure acrylamide concentrations in foods, Journal of AOAC International, 2005, vol. 88(1), pp. 274-84 4) Kirk: Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 2nd Ed., vol. 1, pp. 274-284 5) K. Macháková: Akrylamid v potravinách a mo nosti jeho stanovení (Bakaláská práce), 2006 6) M. Friedmann: Chemistry, biochemistry, and safety of acrylamide, A review, J. Agricultural Food Chemistry, 2003, vol. 51(16), pp. 4504-4526 7) R. V. Hedegaard, K. Granby, H. Frandsen, J. Thygesen, L. H. Skibsted: Acrylamide in bread. Efect of prooxidants and antioxidants, Eur Food Res Technol, 2007 8) S. Romani, M. Bacchiocca, P. Rocculi, M. D. Rosa: Effect of frying time on acrylamide content and quality aspects of French Fries, Eur Food Res Technik, 2007 9) E. Kolek, P. imko, A. Gatial: Confirmation of polymerisation effects of sodium chloride and its additives on acrylamide by infrared spektrometry, Journal of Food and Nutrition Research, 2007, vol. 46, pp. 39-44 10) S. M. Lee, M. H. Wroble, J. T. Ross: L-asparaginase from Erwinia carotovora. An improved recovery and purification process using affinity chromatography, Applied Biochemical Biotechnology, 1989, vol. 22, pp. 1-11
54
11) M. J. Keating, S. O'Brien, L. E. Robertson, H. Kantarjian: Fludarabine a major new drug in chronic lymphocytic leukemia, European Journal of Cancer, 1993, vol. 29, pp. 149 12) H. E. Wade, H. K. Robinson, B. W. Philips: Asparaginase and glutaminase activities of bakteria, Journal of General and Applied Mikrobiology, 1971, vol. 69, pp. 299-312 13) C. De-Angeli, F. Pocciari, S. Russi, A. Tonolo, V. E. Zurita, E. Ciaranf, A. Perin: Effect of L-asparaginase from Aspergillus terreus on ascites sarcoma in the rat, Nature, 1970, vol. 225, pp. 549-550 14) K. Arima, T. Sakamoto, C. Araki, G. Tamura.: Production of extracellular L-asparaginases by microorganisms, Agric Biol Chem, 1972, vol. 36, pp. 356-361 15) Süreyya
Özcan,
A.
Z.
enyuva:
Improved
and
simplified
liguid
chromatography/atmospheric pressure chemical ionization mass spektrometry Metod for the analysis of underivatized free amino acods in various foods, Journal of Chromatography A, 2006, vol. 1135, pp. 179-185 16) A. Z. enyuva, Vural Gkmen: Interference-free determination of acrylamide in potato and cereal-based foods by a laboratory validated liquid chromatography-mass spectrometry method, Food Chemistry, 2006, vol. 97, pp. 539 – 545 17) E. Finotti, A. Bertone, V. Vivanti: Balance between nutrients and anti-nutrients in nine Italian potato cultivars, Food Chemistry, 2006, vol. 99, pp. 698-701 18) K. L. Dearfield, Ch. O. Abernathy, M. S. Ottley, J. H. Brantner, P. F. Hayes: Acrylamide: its metabolism, developmental and reproductive effects, genotoxicity, and carcinogenicity, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxikology, 1988, vol. 195, pp. 45-77 19) Z. Ciesarová: Minimalizácia obsahu akrylamidu v potravinách, Chemické Listy, 2005, vol. 99, pp. 483-491
55
20) C. J. Smith, T. A. Perfetti, M. A. Rumple, A. Rodgman, D. J. Doolitle.: Food Chem. Toxicko, 2000, vol. 38, pp. 371 21) D. S. Mottram, B. I. Wedzicha, A. T. Dodson: Acrylamide is formed in the Maillard reaction, Nature, 2002, vol. 419, pp. 448 22) A. Becalski, B. P. Y. Lau, D. Lewis, S. W. Seaman: Acrylamide in foods: Occurence, sources, and modeling. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2003, vol. 51, pp. 802-808 23) R. H. Stadler, I. Blank, N. Varga, F. Robert, J. Hau, P. A. Guy, M. C. Robert, S. Riediker: Acrylamide from Maillard reaction products, Nature, 2002, vol. 419, pp. 449 24) R. H. Stadler, L. Verzegnassi, N. Varga, M. Grigorov, A. Studer, S. Riediker, B. Schilter: Formation of vinylogous compounds in model Maillard reaction systéme, Chemical research in Toxicology, 2003, vol. 16, pp. 1242-1250 25) V. A. Yaylayan, R. H. Stadler: Acrylamide Formation in Food, A Mechanistic Perspective. An International Journal of Analytical Science, 2005, vol. 88, pp. 262-267 26) D. V. Zyzak, R. A. Sanders, M. Stojanovic, B. L. Eberhart, D. K. Ewald, D. C. Gruber, T. R. Morsch, M. A. Strothers, G. P. Rizzi, M. D. Villagran, Acrylamide formation mechanismus in heated foods, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 20003, vol. 51, pp. 4782-4787 27) L. Castle, S. Ericsson: Analytical Methods Used to Measure Acrylamide Concentrations in Food, An International Journal of Analytical Science, 2005, vol. 88, pp. 274-278 28) J. Wood et al., A Review of Acrylamide: An Industry Perspective on Research, Analysis, Formation, and Control, Critical Reviews in food Science and Nutrition, 2004, vol. 44, pp. 323 – 347 56
29) O. Núñez, E. Moyano, M. T. Galceran: LC-MS/MS analysis of organic toxics in food, Trends in Analytical Chemistry, 2005, vol. 24, pp. 683 – 703 30) L. M. Owen.: Analytical methods used to measure acrylamide concentrations in foods, Journal of AOAC International, 2005, vol. 88, pp. 274-84 31) Miroslav
Grznár:
Mlyn
zrno,
poslední
verze
1. 1.2007
[cit.
16.4.2008],
http://www.mlyn-zrno.sk/page6.htm
57
8 SEZNAM POUITCH ZKRATEK 3-APA - 3-aminopropanamid AA - akrylamid AMK - aminokyselina (y) Asn - asparagin Asp - kyselina asparagová CaCl2 - chlorid vápenat E - enzym Fru - fruktóza Gln - glutamin Glc - glukóza Glu - kyselina glutamová HAS - hydrolytick askorbát sodn LAP - lipolytick askorbát palmitov LC - kapalinová chromatografie LC-MS - kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií LOQ - limit kvantifikace NaCl - chlorid sodn NaHCO3 - hydrogenuhliitan sodn NH4HCO3 - hydrogenuhliitan amonn Obr. - obrázek RSD - relativní sm rodatná odchylka SD - sm rodatná odchylka Tab. - tabulka VS - vnit ní standard
58
9 SEZNAM PÍLOH 1) Z. Ciesarová, K. Kukurová, A. Bednáriková, K. Macháková: Píspvek na konferenci (BOSPHORUS 2008 ICC International Conference, 24 - 26 April 2008, Istanbul, Turkey
59
Píloha 1 Píspvek na konferenci v Istanbulu
60
