ls,nn'r@k d ar, te8el. Filnr h,5il lists ft
40
Gambar 4.1. Dokumentasi keseluruhanindividu sampel. Fragmen Hasil PCR Proses PCR dilakukan untuk mengarrplifrkasi 0,4 kb gen Dloop dengan menggunakan sepasangprimer M1 dan M2. Hasil PCR dianalisis dengan elektoforesis gel agarosa1,2%o(b/v), sebagai standar digunakan plasmid pUCl9lHinfl
Semua sanpel memberikan hasil
amplifrkasi fragmen berukuran sekitar 0,4 kb yang terletak diantara pita 517 pb dan pita 396 pb standar pUCl9/Hinfl (Garnbar 4.2). KonEol positif proses PCR digunakan sanpel sel darah yang sudah berhasil diamplifikasi pada kondisi PCR yang sama dan menggunakan sepasang primer M1 dan M2. Kontol
positif memberikan hasil arrptfikasi
fragmen berukuran sekitar 0,4 kb. Sedangkankontrol negat'rfdigunakan ddH2O steril
sebagai pengganti templat. Kontol
memberikan hasil arnplifikasi.
negatif
tidak
4l
l4l9 pb 5 1 7p b 396pb 0,4kb
2l4pb 75 pb
Gambar 4.2. Fragmen hasil PCR. Fragmen 0,4 kb mtDNA yang diamplifikasi dengan menggunakan primer Mr dan M2 ditunjukftan pada lajur 2,3,4 dzn 5. Penanpakan hasil analisis dengan cara elekfroforesis gel agarosa L,2 yo, sebagai standar ukuran DNA digunakan pUCl9/Hinfl (pada lajur I dan 7) yang menghasilkan5 fragmen dengan ukuran masing-masing1419 pb, 517 pb, 397 pb, 214 pb, dan 75 pb. Kontol positif dan negatif proses PCR ditunjukl,ranpada lajur 5 dan lajur 6. Kloning Hasil kansformasi sel inang E coli IM 109 berupa kolonikoloni dalam dua warna yang berbeda, yaitu koloni-koloni
yang
berwarna putih dan koloni-koloni yang berwarna biru yang ditunjuktan padaTabel 4.2. Tabel 4.2. Koloni putih dan koloni biru hasil prosestransformasi. Sampel
No. Plate l.
SI
2.
S2
a J.
Konhol ligasi Konhol Transformasi Kontrol selkompeten
4. 5.
Hasil 60 koloni putih dan 20 kolonibim 60 koloni putih dan 20 koloni biru positif positif oositif
Data di atas menunjukkanbahwa proses ligasi
42 dan transformasi
berhasil dan sel E. coli JMl09 yang digunakan benar_benarkonpeten untuk diftansformasi. Isolasi DNA plasmid Hasil isolasi DNA
plasmid
dapat dlkankterisasi dengan menggunakan enzim psll. Hasil pemotongan terhadap DNA plasmid selanjuhrya dianalisis meralui eleknoforesis gel agi'osa dengan menggnnakanmarker DNA MHindIII sebagaimanayang ditunjukkan padaGambar 4.3.
I
t 2 3 4 5 23.130 pb + l 9.416 pb <-,i 6 . 5 5 7p b < r
4.364pb <, 2 . 3 2 2 p+b, 2.027pb + '
|' 3.4kb > 3,0kb
Koloni biru dan putih yang tidak terpotongrnenghasilkan tiga fragmen, hal ini menunjukkanbahwa DNA plasmid masih dalam keadaansirkuler. Sedangkan koloni biru danputih yangsudahterpotong
43 menghasilkan satu pita pada posisi sekitar 3,0 kb dan 3,4 kb, sehingga diperkirakan koloni putih membawaDNA sisipandenganukuran 0,4 kb. Sekuensing Sekuensingsisipan 0,4 kb DNA dan sebagianfragmen PCR 0,4 kb daerah D-loop mtDNA manusia dilakukan dengan metode Dideoksi Sanger menggunakanAutomatic DNA Sequenceryang berdasarkanpada metode Dye Terntinator Labeling. Sekuensingsisipan 0,4 kb dilakukan menggunakan plasmid rekombinan secara langsung karena vektor pGEM-T sudah dilengkapi dengan primer universal T7 dengan urutan (5'CAGGAAACAGCTATGACC3')
dan M13 Riverse dengan urutan
(5'TGTAAAACGACGGCCAGT3')
yang mengapit daerah polikloning
gen lac-Z, sehingga dapat menentukan urutan nukleotida dari daerah hulu maupun hilir. Sedangkan sekuensing 0,4 kb fragmen hasil PCR dilakukan dengan menggunakanfragmen hasil amplihkasi secara langsung tanpa melalui proses kloning. Proses tersebut disebut direct sequencing. Primer yang digunakan untuk proses sekuensingsama dengan primer untrk prosesPCR yaitu menggunakansepasangprimer M1 dan M2. Contoh hasil reaksi sekuensing sampel delapan individu pada tujuh generasi segaris keturunan ibu dihrqjukkan oleh elektoforegram seperti terlihat pada Lampiran I
dan 2. Data elekhoforegram
dinrnjukkan dalam benhrk puncak-puncak karakteristik untuk masingmasing nukleotida
yang merupakan hasil fluoresensi masing-masing
pewarna (dye) yang dibawa oleh ddNTP. Nukleotida A memberikan puncak yang berwarna hijau, G wama hitarq C wama biru, dan T warna merah. Hasil pembacaanelektroforegram menunjukkan sisipan fragmen 0,4 kb D-loop mtDNA mempunyai panjang 442 pb (15.978-16.419)
Fryd,edd+mkmubr4d$
Fagtri0.4rbdDxAy,ngd6ekE dd drdah D rqoP moNA. F63m
d€n ryr6133'r rr,uFo\,
Gro/r\{
(tu rdg.
@, qto
lDquiuktran
hb)A \lJrtutrtu
'ndca1radel
d,lLlrra'
)".n rLh e?np
' hsh
14_ pb d!.,a[ D tdl,
15.e73164re lAqud@ind Clqbds, re3rl. 'di'ujullo r3ber4l
UM
ELT
$EM T dcigM DNA DNA rspan rd.lih r.3
FGN-Td{
In
rumbuhyz
koroni-kordi barrn F&
ftdn
c6.bu
ftlujur}jn
dcArceq 14e
(dot.4
cccclgcccc ABcrrAor
cMtM€ r .A4.cAcrAc cAracc*d
i0 sl iDic,
.., JM 109y"!€
n
crmbt4-5'FdlpGIM-Tsnkdq
klngcnl@zPa&*korPaN
l B a s il i ? g n . nD N A l r A a m r b yhg dildBlisis oLh eDm DNA lua
fdol
D sslartp'anGda (x.sal) Eljadi gabrb$ dd5eodg
klooindiso, krcD eM'n 0 g?rekd
d,rd ill n koro! dmjadi b.Mm niad'sihksa dd thrur' rbtujldigo y:ds mruFabr srvrM p' E@r+yrdifp D Fbh6rd. oPrc) &' d,hbktr ord r@n ali cn locz )$s m$n' DNA IB6*n, lrrs i bn6, r rcs , Raclm)znq 20001 F.g hnhuh Prd: nedtr LB Padi Ya DNA ylq dilss'lan padavekbr P
ed nu t ridaT P
nlng r
PvlLullo!.or
Flong.n'.,Rvp'dapcEMb lltop:ru seD *od! dim p g.r.lddd&
trmd. M! i,ri! rmdnku b3.il.tsro6Lg|'gmq
l\d
thftg"
4 'r' lsli
reesl
Ph:nid_p''e d
l,cms
z,ldzh kren. eun
b. hii f'ubred q
r6uiks enloo ru l.'' $rr fPmcc4 eosl
di DNA
sil P.mu€an idl phmrd rng $dura snrald tuddi ri'i{
nxn
milisis h.mloci lu
u€dd
dengan tudgsMh
n Mjulrm tulnn s@si
hdt
ffimr
$l d.n kelu4a }?ns DoeuYa'
bnbugm
kenlpn (slo). sedz lnp.Rss bzh*ak hu sl homlDe 100% d.oEh
sto nnk2 dlpi dirle.sp bloh Bsdi
lDmlos r00 % Dd bdn I lhunll*rm bobu h+o'dn
dlad3]sznundD(4b&gn
"a
.a r !
t "t
T(16 134}r' lBql nas we!, mb, tatuit )"m r(16 1{0P, c(l5 c(1626d)A c(l62rr)A datrdB ru6d t'n$o$ Fb Al16l3r)c
D roop d'DNA i;
daFd dl'dikan tznlrosik
uu
b'Dy.jrnNu'FfunsuIndd6E'Fifud'homlogiludeog,o
6n r,n
[Di\!ro,
dfionologirfl
4o3 . tulpeidn rocs:adnu
densz! irI{du
pzd, lrh
rc$l.sd!trN)i
Fns si@ Fitu tu
sunda
brur gpeE, 'eebd tYad,, ,0001
rtun
drplml.b dm dd?pan indtqdu pada tuIh sffii
ftrupzkd
mb& brd uht
esen
ibq
mmia
v4dL(|b|33i1!iIq,Il'A'&oc11616l^ r,ro..o).d,irurs
iugsP.dr Ddiv
kdu4z Y (Yu) &d r sun&. M@u a(r6ra)c tdp,' juri P3d!bap,! kelu:aax GB) dTi suld luodadd mbsi 106l8e)c d'cdu}!
|
ndrdu ehJ Bb-rob
(1D03),coudo
(rD0o)
:
s
3:"
53 Pada Gambar 4.7 terlihat puncak nukleotida T pada posisi 16.188sampelindividu tujuh generasisegarisibu, sedangkanpada 24 manusia Indonesia s;amadengan Cambridge terlihat jelas puncak nukleotidaC.
16.188
I
i a e ref:atnt " t-i
16.r 88
V :lf:q0-e$-T
A:f rAisf,cct€FECCC&r
Gambar 4.7. Mutasi C(16.1SS)T.(A) Sampelsetiapindividu pada tujuh generasi, terlihat puncak T pada 16.188; (B) Sampel pada24 manusiaIndonesiayang diwakili oleh generasi segaris ibu pada tiga individu yang sama dengan Cambridge' [Rachmayanti,2000] terlihat PuncakC Pada16.188. Nukleotida pada posisi 16.213 sampel individu pada tujuh geneft$i juga berbedadengan Cambridge dan 24 manusia Indonesi4 yaifir G pada Cambridge dan A pada sampel setiap individu' Bentuk elektroforegramnukleotidake-I6.2I3 ini dapatdilihat padaGambar4.8.
54
16.213
t 6 .2 1 3 I
I
Y
Y
,f 4aA*eA nlc,!
r &riAei
AT+,
Gambar 4.E Mutasi G(16.213)A" (A) Sampel setiap individu pada tujuh generasi,terlihat puncak A pada 16.213; (B) Sampelpada24 manusiaIndonesiayang diwakili oleh generasi segaris ibu pada tiga individu [Rachmayanti,2000]yang sama dengan Cambridge, terlihat puncakG pada 16.213. Selanjutnya nukleotida pada posisi 16.266 sampel individu pada tujuh generasijuga befteda dengan Cambridgedn 24 manusia Indonesi4 yaitu C pda Cambridgedan A pada sampelsetiapindividu tujuh generasisegarisibu. Bentuk elekEoforegamnukleotidake-I6.266 dapatdilihat padaGambar4.9. Berdasarkan hasil
analisis
dengan
Mta
mitomap
(www.gen.emory.edu/mitomao.hunl) menunjukkanbahwa tiga mutasi baru tersebut bukan merupakan mutasi spesifik untuk manusia Indonesi4 larena mutasi C(16.188) terdapil. pada manusia Pasifil! Eropa, dan Amerika Utarq mutasi G(16.213)Aterdapatpada manusia India dan Senegal,dan mutasi C(16.266)A tedapar pada manusia Polinesia Walaupun bukan menrpakanmutasibaru untukmanusiadi
55 luar Indonesia tetapi tiga mutasi tersebut dapat dijadikan sebagai karakteristikindividu manusiadi Indonesiamenurutgarisketurunanibu.
t6.266
t
rCi!,r CCTCT,.GG *
16.266 I
Y
:t jqEf
a{, i &6 a-iJ
Gambar 4.9. Mutasi C(16.266)L (A) Sampel setiap individu pada tujuh generasi, terlihat pmcak A pada 16'26'6; (B) Sampel pada24 manusiaIndonesiayang diwakili oleh gcnerasi segaris ibu pedra tiga individu yang dengan Cambridge, sama [Rachmayanti,200Ol terhhatPuncakC Pfu 16.266. Hasil penelitian ini dapat disimpulkanbahwa analisis urutan nukleotidaDJoop mtDNA adalahsigrrifikanuntrk menentukanidentitas seseorangsampai pada tujuh generasi yang didasarkan pada satu kelompok belum mengalami mutasi. Tiga mutasi spesifik tersebut diharapkandapatmelengkapidata bqsevarian normal mtDNA manusia Indonesia.
