Bioteknologi Farmasi

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Bioteknologi Farmasi FAR 40541 2 SKS

Penanggung jawab: Dr Amarila Malik Departemen Farmasi FMIPA-Universitas Indonesia


SASARAN PEMBELAJARAN: Mengetahui konsep-konsep dalam bioteknologi, keterkaitan beberapa disiplin ilmu dalam bioteknologi, teknologi rekayasa biologi organisme, teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika, pemanfaatan bioteknologi dalam bidang farmasi, dan penerapan bioteknologi dalam upaya pemeliharaan kesehatan masyarakat.


PUSTAKA : •Wink, M. (Ed). An introduction to Molecular Biotechnology, 2006 •Glick, B.R & Paternak, J.J, 1998. Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press. •Jognson & Manasse, 1993. Biotechnology in Pharmacy, John E. Smith, 1985. Biotechnology Principles, Van Nostrand Reinhold (UK) •Wulf Crueger and Annelies Crueger, 1984. Biotechnology A Text Book of Industrial Microbiology. Sinaeur Association Inc. Sunderland, MA, USA •J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989. Moleculer Cloning A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Pres, USA •James D. Watson, John Tooze, Davit T.Kurtz, 1983. Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, USA •Indra K. Vasil, 1990. Biotechnology, Science, Education, 2nd Commercialization (Editor), Elsevier Scientific Publish. Co.Inc.


Pokok-pokok Bahasan •Pendahuluan •Konsep-konsep dalam bioteknologi dan prospeknya dalam bidang farmasi, •Disiplin ilmu yang terkait dalam bioteknologi, •Teknologi bioproses •Pengembangan galur berpotensi dalam bidang farmasi: fermentasi dan kinetikanya, proses hilir •Materi genetik •Rekayasa genetika dan Teknologi DNA rekombinan •Terapi gen pada manusia, •Pemanfaatan organisme prokariot dan eukariot dalam bidang farmasi, •Keamanan hayati produk rekayasa genetika dan bioetik.


Overview • Pendahuluan - Bioteknologi Farmasi • Dampak bioteknologi terhadap bidang farmasi • Rekayasa genetika-rekombinasi DNA – kloning gen • Aplikasi teknik molekular • Produk komersial dari mikroorganisma • Terapi Gen


BIOTEKNOLOGI FARMASI Definisi:

Aplikasi dari bioteknologi dalam farmasi àDampak terhadap : obat-obatan diagnostik vaksin

BIOTEKNOLOGI: - Pemanfaatan mikroorganisme untuk memproduksi produk-produk yang penting dan Bermanfaat : protein dan enzim -Rekayasa genetika hewan dan tanaman agar menghasilkan protein asing tertentu, juga senyawa kimia lainnya, spt. Vitamin à Diperlukan “molecular basic knowledge”


PATOFISIOLOGI PENYAKIT DRUG ACTION IDENTIFIKASI DAN PRODUKSI TARGET OBAT: RESEPTOR, ENZIM

UNTUK DRUG DISCOVERY DAN DRUG DESIGN


TEKNIK DASAR BIOTEKNOLOGI BERBASIS BIOLOGI MOLEKULER ORGANISME REKOMBINAN

Human insulin (1978): produk farmasi pertama hasil rekayasa genetika Sepotong DNA penyandi hormon insulin manusia Transfer ke mikroorganisme : E. coli Kontrol ekspresi Human insulin di E. coli Gene cloning Teknik : Rekayasa Genetika Genetically modified/genetically engineered 1994: 21 produk farmasi turunan teknologi rekombinasi DNA 150 produk dalam taraf “clinical trial”


Dampak Bioteknologi terhadap Farmasi TUGAS: Cari apa saja dampak bioteknologi terhadap farmasi. Diskusikan per kelompok Cari protein-protein yang diproduksi secara teknologi DNA rekombinan Terhadap profesi farmasis: àisu-isu ke arah farmakoekonomi dan etika (sosial) àMenjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat-obat dan efek/akibat penanganan yang tidak tepat


DAMPAK BIOTEKNOLOGI TERHADAP BIDANG FARMASI I. Obat – obatan berupa protein dan peptide • stabilitas, formulasi, penyimpanan, efek samping berbeda dengan obat – obat yang berupa molekul, kecil Contoh : suhu refrigerator ; tidak boleh terkocok

II. Pilihan produk biotek ( protein & peptida). • Pertimbangan sistem ekspresi • Sistem ekspresi berbeda, maka produk sedikit berbeda


III. Obat – obat kelas baru yang beredar di pasaran • Pemahaman patofisiologi penyakit yang sebelumnya tidak dapat diatasi . Contoh : human insulin ( HumulinR Lilly ) ; Hep B-vaccine (Engerix – BR Smith Kline Beecham)

IV. Agents diagnostik model baru • Contoh : ELISA à monoclonal antibody (Enzyme – Linked immunosorbant Assay) àreaksi warna • probe untuk Plasmodium falciparum, berupa potongan DNA spesifik

Profesi FARMASIS “ • Isu – isu ke arah farmakoekonomi & etika (ethical ) • Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat – obat dan efek /akibat penanganan yang tidak tepat.


RAKAYASA GENETIKA Definisi Adalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetik dengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing ( yang dihasilkan di luar sel ) ke dalam suatu vektor, sehingga memungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang / diperbanyak di dalam sel inang yang baru. KLON adalah organisme identik yang terbentuk secara genetik dan membawa seluruh potongan DNA yang telah disisipkan, dan memperbanyak molekul yang baru. Kloning gen à rekayasa genetika, teknologi DNA rekombinan Contoh : domba Dolly


RAKAYASA GENETIKA Material genetik : adalah material yang membawa informasi genetik yang diturunkan dari tetua ke turunannya, yaitu asam nukleat DNA : deoksi ribonucleic acid RNA : ribonucleic acid Vektor Kloning : adalah wahana pembawa gen target untuk mengintroduksi gen ke inang tertentu.

Gen : adalah sekuens DNA yang menyandikan protein.


ASPEK KLONING - Menerobos barier alamiah suatu spesies àInsulin manusia diproduksi oleh E. coli à E. coli sebagai pabrik biologis -Memungkinkan memperoleh dan memanipulasi secara relatif potongan – potongan DNA yang menyandikan fungsi spesifik terapi gen penyebab penyakit keturunan Co : Sindrom Hurler ( KOMPAS, 02/08’97) sel sumsum tulang belakang diekrtraksi, dimanipulasi dengan sel – sel normal, diintroduksi kembali melalui pembuluh darah.


ASPEK KLONING Adanya rekayasa genetika memungkinkan kita tidak hanya mengisolasi dan menskrining, tapi juga dapat mengkonstruksi organisme, dalam hal ini galur – galur yang produktif. Mikroorganisme Tanaman Hewan

BIOREAKTOR

Dua dasar penerapan kloning gen 1. Isolasi dan studi gen – gen tertentu àDiperoleh pengertian yang mendalam mengenai fungsi dan mekanisme regulasi gen 2. Peningkatan produksi oleh suatu gen spesifik


TEKNIK – TEKNIK DASAR YANG BERKAITAN DENGAN KLONING GEN •Metode isolasi DNA •Metode memotong dan menyambung molekul – molekul asam nukleat •Metode transformasi pada sel host/ inang ; sebagai dasar : Escherichia coli ( E. coli ) à why ?

Hampir semua pengembangan pertama teknik rekayasa genetika digunakan E. coli sebagai organisme inang : • Paling banyak dipelajari • Paling lengkap informasi material genetiknya : - sudah lengkap peta genomnya.


DEFINISI §Isolasi DNA mengekstraksi molekul DNA dari sel §Memotong DNA ( digestion ) memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi §Menyambung DNA ( Ligation ) Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase §Transformasi §Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang


ISOLASI DNA 1.Penghancuran dinding sel : - mekanik - enzimatis 2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat - Triton X – 100 3. Membersihkan debris sel - sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven organik Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ; atau proteinase-K 4. Presipitasi - + alkohol à sentrifugasi gradien CsCl ; elektro- + alcohol + NH4 asetat


Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom 1. Beda struktur tersier : DNA plasmid : supercoiled à Covalently Closed Circular ( CCC ) DNA kromosom/genom : linier 2. Sifat denaturasi - dengan alkali, pemanasan - DNA plasmid lebih mudah renaturasi 3. Ultrasentrifugasi : CsCl gradien à DNA plasmid berada di bawah 4. Mobilitas di elektroforesis gel agarose àDNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom) DNA Supercoiled (plasmid)


Agarose gel electrophoresis lamda

lamda +RE

DNA size

plasmid

plasmid +RE


ANALISIS KUALITAS DAN KUANTITAS DNA •Elektroforesis - DNA diwarnai dengan Etidium bromida - dilarikan pada gel agarose dari kutub (–) ke (+) - dapat diketahui adanya degradasi Degradasi : Ik. Fosfodiester putus Penyimpanan : > - 200C - DNAse tidak aktif - mencegah degradasi oleh DNAse > TE buffer : mencegah degradasi oleh DNAse


METODE – METODE ISOLASI PLASMID §skala besar : sentrifugasi gradien CsCl §skala kecil ~ mini prep, midiprep •sentrifugasi gradien •alkalin lisis •metode ammonium asetat •metode partikel gelas ( glass milk ) •metode partikel magnetic ( magnetic beads ) •kromatografi ( exclusion chromatography)


VEKTOR KLONING PLASMID bereplikasi diri ( self replicating ) utas ganda : d s molekul DNA sirkulator di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal copy number ( Jumlah kopi per sel ): high copy number 10 – 100 kopi / sel low copy number 1 – 4 kopi / sel medium copy number diantaranya Ukuran : 1 s/d 500 kb


VEKTOR KLONING Spektrum inang : broad hostrange à dapat bereplikasi pada sejumlah spesies bakteri narrow hostrange à hanya dapat bereplikasi pada spesies khusus Beberapa ciri khas plasmid untuk vektor cloning : §Ukuran kecil §Mempunyai situs – situs pengenalan ER yang unik ( tunggal ), tempat insert disisipkan / diklon. §Satu atau lebih penanda seleksi genetic, untuk mengindentifikasi sel resipien yang membawa kontruksi DNA vektor - insert. §Plasmid cloning vector harus di-genetically engineered Contoh : pBR 322, pUC 19


PLASMID -Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri, berbentuk sirkular, utas ganda. - Terutama ditemukan pada bakteria, juga : Kapang Eukariotik ( beberapa ) - Plasmid alami menyandikan : 1. Resistensi AB 2. Colicin = Bakteriosin 3. Virulensi 4. Aktivitas metabolit


STABILITAS PLASMID kondisi optimum, stabil medium tumbuh - Mandiri à tidak tergantung kromosom ada gen ORI : untuk replikasi mandiri - Plasmid rekayasa Untuk teknologi DNA rekombinan


PEMOTONGAN DNA (digesti )

Restriction Enzymes = enzim restriksi •

Diperoleh dari bakteri sbg mekanisme pertahanan terhadap infeksi virus DNA

•

Endonucleases = memotong (cleave) di dalam utasan DNA

•

Telah diketahui ada 3,139 enzyme


Enzyme Site Recognition = situs pengenalan enzim restriksi •

Setiap enzim mendigesti (memotong) DNA pada sekuens spesifik = situs restriksi (restriction site)

•

Enzim mengenali 4- atau 6- pasangan basa , dengan sekuens palindromik (eg GAATTC)


5’ versus 3’ overhang • Enzyme cuts à

3’ G GAATTC 3’ CTTAAG G 5’ 5’

G 3’ CTTAA 5’

3’ 5’

5’ 3’

AATTC 3’ G 5’

§ Generates 5’ overhang


Common Restriction Enzymes •

EcoRI – Escherichia coli – 5’ overhang

•

PstI – Providencia stuartii – 3’ overhang

GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 5’

CTGCAG 3’ 3’ CACGTC 5’

5’


The DNA Digestion Restriction Buffer provides optimal conditions –

NaCl provides the correct ionic strength

–

Tris-HCl provides the proper pH Mg2+ is an enzyme co-factor

–


DNA Digestion Temperature •

Why incubate at 37°C? Body temperature is optimal for these and most other enzymes

•

What happens if temperature is too hot or cool? Too hot = enzyme may be denatured, killed J Too cool= enzyme activity lowered, requiring longer digestion time G




Agarose Electrophoresis •

Arus listrik yang membawa DNA bermuatan negatif ke elektroda muatan (warna merah)positif melalui suatu gel agaros

•

Gel agarose memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran –

Fragmen kecil bergerak lebih di depan (front) di dibandingkan fragmen besar


PENYAMBUNGAN DNA ( Ligasi ) - Penyambungan gugus 3’OH dan DNA insert. ( Gb. ) - Ligasi lebih mudah pada ujung – ujung sticky ( dengan ER sama / isoschizomer / isocaudomer). - Reaksi Ligasi DNA vektor DNA insert Buter T4 DNA ligase 5x T4 DNA ligase dH2O ( destilata bebas ion ) Total

3 6 4 1 6 20

1 : 2 ( s/d 1: 10 )

•Inkubasi : 40 – 150 C semalam ( 18 – 24 jam ) - Ujung blunt end : dapat diligasi, walaupun didigesti dengan ER berbeda. Pada reaksi Ligasi, selalu sertakan pula control – control : k. Transformasi : vector utuh k. ligasi : vector linier / terpotong + enz – ligase



TRANSFORMASI à Pengambilan DNA rekombinan oleh E.coli dengan cara mengintroduksi DNA murni (purified) ke dalam sel yang sudah kompeten.

GFP


TRANSFORMASI E.coli sebagai sel inang : > sudah dimodifikasi genetik, antara lain : > Rec A- : tidak mempunyai gen untuk endonuklease restriksi sehingga DNA rekombinan yang diintroduksi tidak didegradasi contoh : E.coli DH5α, E.coli HB101


TRANSFORMASI

• Electroporation – Electrical shock yang menyebabkan membran menjadi permeabel terhadap DNA • Calcium Chloride/Heat Shock – Chemically-competent cells mengambil DNA setelah heat shock

E.coli dibuat kompeten dengan cara kimia: -Peningkatan suhu dan CaCl2 à heat shock pada 370 C – 420 C, dalam larutan CaCl2 - Setelah ditransformasi, disebar pada medium seleksi


Electroporation Electric shock

Membuat pori-pori kecil pada membran sel


SELEKSI E.coli ( plasmid DNA rekombinan ) di seleksi terhadap E.coli yang tidak membawa rekombinan

Macam seleksi : ( 4 ) 1.Seleksi langsung : contoh: ABR = ABS (inaktivasi penyisipan ) à perlu teknik cawan replika (replica plating) 2. seleksi warna koloni : X – gal ®, memanfaatkan gen lacZ yang menghasilkan enz. β – galactosidase. Enzim tsb mengubah substrat X- gal menjadi β-gal biru 3.Komplementasi = gen Lacz pada vector vs pada E. coli DHS α ( inang ) 4. Analisa hibridisasi : - dot blot; colony hybridization


REPLICA PLATING • Pertama sebar sel pada cawan agar mengandung AMPICILLIN – Semua TRANSFORMAN menghasilkan koloni (tumbuh)

• Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin – Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh Kain Beludru

BLOCK PRESS

= Transforman AMPR

AMP LATE


REPLICA PLATING • Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin – Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh

Kain Beludru

BLOCK PRESS

BLOCK

AMP LATE

AMP LATE

BLOCK

BLOCK

TET PLATE

AMP LATE


REPLICA PLATING • Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin – Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh

TETRES NONRECOMBINANTS

GROW TET PLATE

• Cawan TET dan cawan AMP dibandingkan – Ambil REKOMBINAN dari TETSENS AMPRES dari cawan AMP

TETRES NONRECOMBINANTS

AMP LATE

TET PLATE


VERIFIKASI DAN PEMETAAN DNA REKOMBINAN Dilakukan menggunakan Enzim endonuklease restriksi (ER). Vertifikasi : àMemastikan adanya DNA insert / asing yang di klon pada vektor, menggunakan satu dan dua (ganda) ER (single digest dan double digest), berdasarkan ukuran DNA dengan di larikan (running) di elektroforesis gel agarose.

Pemetaan : Manfaat ER dalam biologi molekuler. Untuk mengetahui ukuran DNA rekombinan berdasarkan situs – situs Enzim restriksi. à Disebut Physical mapping ( pemetaan fisik ): pemetaan fisik yang lengkap memerlukan berbagai ER.


KLONING SEKUENS DNA PENYANDI PROTEIN EUKARIOT Perlu teknik khusus àProkariot tidak dapat melakukan intron splicing àDNA eukariot besar karena mengandung banyak intron àEkspresi akan kacau oleh prokariot

Oleh karena itu : -menggunakan MRNA mature - Enzim Reverse transcriptase yang mensintesis satu utas DNA dari RNA kmd dilanjutkan dengan kerja Klenow fragment yang mensintesis utas kedua DNA dari template DNA Sehingga akan diperoleh dua macam c DNA ( complementary DNA ) : yang utuh & parsial


PRODUK BIOTEKNOLOGI MOLEKULER SEKTOR : Medicinal : -Human Therapeutic -Human Diagnostic

Non medical : -Agriculture -Specialities -Non-medical Diagnostic Contoh : INDIGO à pewarna jeans


INDIGO -diekstraksi dari tanaman -batubara -rekombinan DNA Lintasan Indigo : banyak dipakai untuk industri Blue Jeans

Genencor International : green route to blue dye Indol diubah menjadi cis – indole 2,3 – dehydrodiol dengan gen dari Pseudomonas putida yang disisipkan pada E. coli


DIAGNOSTIK MOLEKULER Kemajuan bidang pengobatan karena berhasil didapatkannya virus – virus spesifik, bakteri, fungi dll, juga molekul – molekul kecil.

Untuk kepentingan pencegahan, control, pengobatan dari penyakit – penyakit infeksi maka perlu identifikasi dini dan akurat terhadap organisme pathogen penyebab penyakit à ditumbuhkan/dikultur à amati sifat – sifat fisiologis KENDALA : lama mahal à ada yang tidak dapat ditumbuhkan/dikulturkan à sulit mendeteksi organisme penyebab penyakit


Untuk mengatasi kendala – kendala tersebut maka dikembangkan prosedur – prosedur diagnostik molekular: 1. Metode immunologi detection Co : ELISA monoclonal antibody yang diproduksi di E. coli ( Enzyme – linked immunosorbent assay )

2. Metode deteksi DNA yaitu deteksi menggunakan pelacak DNA Prinsip hibridisasi asam. Nukleat Essei ini : cepat reliable spesifisitas tinggi : hanya berhibridisasi dengan sekuens nukleotida target


PRODUK KOMERSIAL REKAYASA MIKROBA

HUMAN PROTEIN PHARMACEUTICALS

- jumlah sangat terbatas - produksinya mahal -biological mode of action belum dikarakterisasi jelas

+ 300 macam protein terapeutis manusia yang potensial telah diklon, dan telah melalui berbagai uji selama bertahun–tahun sebelum tersedia secara komersial. (Tabel 7.1)


Pharmaceutical biotechnology

• • • • • •

Diabetes Haemophilia Stroke Growth failure Anaemia Viral infection

Insulin Factor VIII Tissue plasminogen activator Human growth hormone Erythropoietin Interferon


Strategi teknologi rekombinan DNA human protein pharmaceutical

Isolasi cDNA

Engineering (Rekayasa)

Optimizing Gene Expression


§Isolasi cDNA Strategi I: Isolasi protein target

Determinasi sekuens asam amino

Deduksi menjadi sekuens DNA penyandi

Sintesis oligonukleotida Gunakan sebagai probe utk mengisolasi gen atau cDNA dari pustaka genom atau pustaka cDNA


Strategi II: Jika suatu protein khusus disintesis di suatu jaringan khusus à Pustaka cDNA dapat dibuat dari mRNA ; tidak perlu dari protein. mRNA berfungsi sebagai probe untuk sekuens DNA target. Contoh : Insulin à disintesis hanya dijaringan khusus di pancreas yaitu di pulau Langerhans. Oleh karena itu fraksi mRNA yang diisolasi dari jaringan tersebut 70 % menyandikan insulin. MRNA (mature) Reverse transcribed cDNA


§Engineering Strategi untuk mendesain protein – protein, dengan cara mengatur kombinasi domain – domain fungsional suatu protein, atau dengan cara mutagenesisis terarah, agar dapat mempelajari mode of action suatu protein.

§Optimizing Gene Expression -sistem ekspresi prokariot dan eukariot beda -jika menggunakan prokariot sebagai sel inang akan menurunkan biaya -namun dipertanyakan apakah efektifitas sintesis bentuk fungsional protein heterogous masih tetap??


§Optimizing Gene Expression Harus dipilih berdasarkan kriteria : -memproduksi protein heterologus yang mirip dengan mature authentic protein, selain -mampu tumbuh dengan densitas sel tinggi -mudah dipurifikasi

Contoh : human interleukin – 3 Produksi paling baik di Bacillus licheniformis meskipun produksi banyak di E. coli, tapi menghasilkan protein interleukin-3 yang salah.


Sintesis L-Ascorbic Acid ( Vit. C) D-glucose

D-Sorbitol

L-sorbose

2 KLG (2-keto-L-gluconic acid)

L- ascorbic Acid à Satu tahap fermentasi mikroba à sejumlah tahap – tahap kimia Dari penelitian – penelitian biokimia mengenai lintasan – lintasan metabolit diketahui bahwa beberapa mikroorganisme menunjukkan kemungkinan untuk mensintesis 2 - KLG


Acetobacter Gluconobacter Erwinia

D. glucose

2,5 – diketo- D- glukonic acid (2,5 – DKG)

melalui beberapa lintas metabolisme

Corynebacterium Brevibacterium Arthrobacter

2,5-DKG reduktase 2,5 – DKG

2 – KLG

1 lintas metabolisme

Gen penyandi enzim 2.5 – DKG reduktase dari Corynebacterium di klon di Erwinia


•MENINGKATKAN PRODUKSI ANTIBOTIK

Produksi antibiotik dari Streptomyces spp dengan Fermentasi à lama – lama konsentrasi oksigen dalam media cair berkurang Pertumbuhan Streptomyces spp menurun dan produksi antibiotik menurun Vitreoscilla sp adalah bakteri aerob yang dapat hidup dalam kondisi miskin O2 Bakteri ini dapat memproduksi suatu protein hem homodimerik yang berfungsi mirip dengan hemoglobin eukariot, yaitu dapat mengikat O2 dari medium kemudian menyalurkannya ke dalam sel. Gen yang menyandikan protein heme tersebut di klon di Streptomyces


TERAPI GEN • Beberapa penyakit genetik manusia dapat dikaitkan terhadap suatu mutasi di suatu gen tunggal, atau mungkin juga lebih kompleks, yaitu terhadap sejumlah gen-gen berbeda yang bermutasi. • TUJUAN utama riset dalam genetika molekuler manusia à menentukan kecacatan pada level gen, dan bagaimana keadaan tersebut menyebabkan simtom penyakit genetik yang spesifik


PENDEKATAN Protein yang terlibat Isolasi dan karakterisasi Sekuensing asam amino Investigasi sekuen penyandi Buat pelacak spesifik Isolasi gen target dari pustaka genom


• Dasar pemikiran terapi gen: – Jika versi normal dari gen untuk penyakit manusia telah berhasil diklon, maka sangat berbuna untuk memperbaiki kecacatan/mutasi gen tersebut


Ex vivo gene therapy Sel diambil dari orang penderita penyakit (pasien) Perbaiki cacat genetik dengan cara transfer gen Seleksi dan tumbuhkan sel-sel yang telah dikoreksi secara genetik (remedial cell) Infuskan atau transplantasikan kembali ke pasien Gen remedial diintroduksi ke sel oleh suatu retrovirus mencit yang seudah direkayasa sehingga tidak mampu mengkonversi sel normal menjadi sel kanker. Retrovirus (rekombinan) menginfeksi sel manusia sehingga gen remedial masuk


In vivo gene therapy Menggunakan adenovirus : ds DNA low pathogenicity in human

Gen remedial Konstruksi pada vektor virus di bawah promotor khusus yang spesifik menginfeksi sel khusus (sel target)


Antisense therapy Dirancang untuk pencegahan; - penurunan ekspresi gen tertentu, - bekerja pada tahap translasi (mRNA) Ada 2 cara: A.Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas) B.Menggunakan gen antisense yang diklon Antisense adalah utas asam nukleat DNA yang tidak ditranskripsikan, merupakan utas pasangan dari utas yang ditranskripsikan (utas sense).


A. Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas): DNA ------ A G C T G A T ----------------T C G A C T A ---------transcription

antisense oligonukleotida TCGACTA

mRNA AGCUGAU

Base pairing AGCUGAU TCGACTA No translation


B. Menggunakan gen antisense yang diklon DNA ------ A G C T G A T ----------------T C G A C T A ----------

-------T G C G A C T A-------------A C G C T G A T-------

transcription

mRNA AGCUGAU

mRNA sense mRNA antisense

UCGACUA

Base pairing AGCUGAU TCGACTA No translation


PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER I. DNA sequencing techniques 1. prosedur Dideoxynucleotide : - Maxam – Gilbert : chemical based - Sanger : enzymatic based 2. Penggunaan Bacteriophage M13 Untuk memperoleh ss.DNA Target DNA + 500 bp < 2000 bp : harus dipotong – potong menjadi beberapa fragmen overlap dengan ER • Primer Walking : • Uk. DNA > 5000 BP


PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER II. Polymerase Chain Reaction ( PCR ) - Amplifikasi molekul DNA - Esensial : 1. Dua buah primer sintesis oligonukleotida (masing – masing ~ 20 nt ) 2. sekuens target pada sampel DNA 3. DNA polymerase yang thermostabil à mencapai suhu 950 C atau lebih 4. Empat macam deoxynucleotidatriphosphat (dNTP) : dATP, dCTP, dGTP, dTTP


PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER II. Polymerase Chain Reaction ( PCR ) Tahap – tahap : -denaturasi : - suhu 950 C : ds-DNA menjadi ss-DNA - enzim Taq DNA polymerase - primer -renaturasi /annealing : suhu diturunkan perlahan sampai 550C primer berikatan dengan template DNA -sintesis : - suhu dinaikkan sampai 750C, suhu optimum untuk fungsi katalisis enzim Taq DNA polymerase untuk mensintesis DNA. Ketiga tahap diulangi beberapa siklus sampai diperoleh molekul DNA dalam jumlah besar.

Bioteknologi Farmasi

Recommend Documents