BIOSINTESIS POLIHIDROKSIALKANOAT OLEH BAKTERI GAMMA PROTEOBACTERIUM WD-3 DARI ASAM LEMAK VOLATIL

KOLOKIUM

BIOSINTESIS POLIHIDROKSIALKANOAT OLEH BAKTERI GAMMA PROTEOBACTERIUM WD-3 DARI ASAM LEMAK VOLATIL DIMAS SETIYONO NRP 1408100028

DosenPembimbing Prof. Dr. Surya Rosa Putra, Msc JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2011

i

Ditulis kembali dari jurnal “Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate by gamma proteobacterium WD-3 from volatile fatty acids” oleh Zhiqiang Chen, Yunbei Li, Qinxue Wen, Huichao Zhang

KOLOKIUM

BIOSYNTHESIS OF POLYHYDROXYALKANOATE BY GAMMA PROTEOBACTERIUM WD-3 FROM VOLATILE FATTY ACIDS DIMAS SETIYONO NRP 1408100028

Supervisor Prof. Dr. Surya Rosa Putra, Msc

JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2011 ii


BIOSINTESIS POLIHIDROKSIALKANOAT OLEH BAKTERI GAMMA PROTEOBACTERIUM WD-3 DARI ASAM LEMAK VOLATIL KOLOKIUM Disusun sebagai syarat untuk menyelesaikan mata kuliah kolokium program S-1 di Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya

DIMAS SETIYONO NRP 1408100028 Dosen Pembimbing Prof. Dr. Surya Rosa Putra, Msc JURUSAN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2011

iii


BIOSINTESIS POLIHIDROKSIALKANOAT OLEH BAKTERI GAMMA PROTEOBACTERIUM WD-3 DARI ASAM LEMAK VOLATIL KOLOKIUM Disusun sebagai syarat untuk menyelesaikan mata kuliah kolokium program S-1 di Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Sepuluh Nopember, Surabaya

DIMAS SETIYONO NRP 1408100028

Surabaya, 20 April 2011 Dosen Pembimbing,

Prof. Dr. Surya Rosa Putra, Msc NIP. 196309 28198803 1 001 Mengetahui : KetuaJurusan Kimia,

LukmanAtmaja, Ph.D NIP. 196108 16198903 1 001 iv


SURAT PENGESAHAN

Dosen Penguji yang bertandatangan di bawahini, adalah dosen penguji pada ujian kolokium dari mahasiswa : Nama

: DIMAS SETIYONO

NRP

: 140810028

Judul tulisan : Biosintesis Polihidroksialkanoat oleh Bakteri Gamma Proteobakteria WD-3 dari Asam Lemak Volatil Dengan ini menyatakan bahwa naskah kolokium tersebut telah diperbaiki sesuai hasil sidang uji kolokium pada hari Selasa tanggal 26 April 2011.

DOSEN PENGUJI NO

NAMA

JABATAN

1

Herdayanto S. Putro, S. Si., M.Si.

Ketua

2

Prof. Dr. Surya Rosa Putra

Anggota

3

Prof. Dr.R. Y. Perry Burhan

Anggota

v

TANDA TANGAN


Karya ini kupersembahkan untuk Ibu, Bapak, dan keluargaku tercinta Adikku tersayang Serta seluruh teman-temanku

vi


ABSTRAK Produksi kopolimer dari poli-β-hidroksialkanoat (PHA) umumnya membutuhkan biaya produksi yang tinggi. Untuk mengurangi biaya produksi, dapat digunakan sumber karbon murah seperti asam lemak volatil (VFAs) dari asidifikasi air limbah. Oleh karena itu, isolasi jenis bakteri yang dapat menghasilkan kopolimer PHA menggunakan VFAs sebagai sumber karbon tunggal dapat menjadi alternatif yang bermanfaat. Dalam studi ini, suatu strain bakteri yang dapat mengumpulkan PHA, diisolasi dari pabrik pengolahan air limbah dari fasilitas pengolahan kedelai di Harbin. Strain ini diidentifikasi sebagai gammaproteobacterium menurut informasi 16S Rdna dan pada awal percobaan dinamakan sebagai strainWD-3. Strain ini dapat mengakumulasi PHA sampai dengan 45 % dari berat sel kering ketika dikultur pada kondisi fermentasi optimum dalam penelitian ini jika butirat digunakan sebagai sumber karbon. Selainitu, WD-3 bisa mensintesis kopolimer PHA yaitu poli-hidroksibutirat (PHB) dan poli-hidroksivalerat (PHV) baik dari substrat C-genap atau dari substrat C-ganjil, dan sepertiga dari kopolimer itu PHV. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa molekul kecil dari asam organik dapat digunakan oleh strain WD-3 sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan dan produksi PHA. Hasil maksimum PHA yang dihasilkan dalam studi ini adalah 0,45 g g -1sel kering. Kata kunci :

poli-Β-hidroksialkanoat (PHA), Asam lemak volatil (VFAs), fermentasi, sumber karbon, substrat, bakteri.

vii


ABSTRACT The production of copolymers of poly-b-hydroxyalkanoates (PHA) is generally a high cost process. To reduce the production costs, inexpensive carbon sources such as volatile fatty acids (VFAs) from acidified wastewater can be used. Therefore, isolation of bacterial strains that can produce PHA copolymers using VFAs as a sole carbon source would be a beneficial alternative. In this study, a strain of PHA accumulating bacterium was isolated from the wastewater treatment plant of a soybean processing facility in Harbin. The strain was identified as c-proteobacterium according to its 16S rDNA information and was originally named as strain WD-3. The strain accumulated a mass of PHA up to 45 % of its dry cell weight when it was cultured under the optimum fermentation condition in this study when butyrate was used as the carbon source. In addition, WD-3 could synthesize PHA copolymers of poly-hydroxybutyrate and poly-hydroxyvalerate (PHV) either from C-even substrates or from C-odd substrates, and one-third of the copolymer was PHV. Results from this study demonstrated that small molecule organic acids can be used by the strain of WD-3 as the carbon source for growth and PHA production. The maximum PHA yield in the study was 0.45 g g-1 dry cell.

Keywords : Poly-Β-hydroxyalkanoate (PHA), Volatile fatty acids (VFAs), Fermentation, Carbon source, Substrate, Bacteria.

viii


KATA PENGANTAR Segala puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, yang telah melimpahkan “BIOSINTESIS

rahmat

dan

hidayah-Nya

POLIHIDROKSIALKANOAT

sehingga

makalah

kolokium,

OLEH

BAKTERI

GAMMA

PROTEOBACTERIUM WD-3 DARI ASAM LEMAK VOLATIL” dapat diselesaikan oleh penulis dengan baik. Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Prof. Dr. Surya Rosa Putra sebagai dosen pembimbing atas semua bimbingan, pengarahan, masukan dan nasehat yang berharga dalam penyusunan makalah ini. 2. Dra. Zulfi Zetra, MS sebagai koordinator kolokium/Tugas Akhir yang membantu pengumpulan naskah makalah ini. 3. Lukman Atmadja, PhD selaku ketua jurusan kimia atas fasilitas yang telah diberikan hingga makalah ini dapat terselesaikan. 4. Ayah, ibu, seluruh keluarga, serta teman-teman mahasiswa kimia ITS atas doa yang selalu menyertai langkah penulis dalam penyusunan makalah ini. Penulis menyadari bahwa penulisan naskah ini masih sangat jauh dari sempurna. Oleh karena itu saran dan kritik sangat dibutuhkan penulis untuk dapat meningkatkan kualitas dan perbaikan lebih lanjut.

Surabaya, 20 April 2011

Penulis

ix


DAFTAR ISI

SURAT PENGESAHAN

v

ABSTRAK

vii

ABSTRACT

viii

KATA PENGANTAR

ix

DAFTAR ISI

x

LAMPIRAN

xiii

DAFTAR GAMBAR

xiv

DAFTAR TABEL

xv

DAFTAR LAMBANG DAN SINGKATAN

xvi

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar belakang

1

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Plastik

5

2.1.1 Plastik Konvensional

5

2.1.2 Bioplastik (Biodegradabel)

6

2.2 Polihidroksialkanoat (PHA)

7

x


2.2.1 Penggolongan PHA

9

2.2.2 Biosintesis PHA

11

2.2.3 Sifat fisika dan kimia PHA

15

2.3 Proteobakteri

17

2.4 Filogenetik

17

2.5 Analisis Filogenetik

18

2.6 Analisis DNA

19

2.6.1 Teknik PCR-RAPD

21

2.6.2 Teknik PCR-RFLP

22

2.6.3 Teknik PCR-Analisis Sekuen

23

2.6.4 Teknik PCR-DGGE

24

2.6.5 Teknik MFLP

24

2.7 Sentrifugasi

26

BAB III METODOLOGI 3.1 Alat dan Bahan

28

3.2 Prosedur

28

3.2.1 Pembuatan medium

28

3.2.2 Isolasi dan identifikasi

29

xi


3.2.3 Kultur Flask

30

3.2.4 Kultur Fed-batch

30

3.2.5 Analisis

31

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi dan identifikasi

32

4.2 Karakteristik mikrobiologi

33

4.3 Pengaruh rasio C/N pada produksi PHA

34

4.4 Pengaruh sumber karbon pada produksi PHA

35

4.5 Kultur Fed-batch

37

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan

39

5.2 Saran

40

DAFTAR PUSTAKA

41

xii


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran A

Judul Lampiran Produksi

PHA

oleh

mikroorganisme

Halaman sesuai

kondisi

46

tumbuhnya.

B

Anggota kelas proteobakteri

xiii

48


DAFTAR GAMBAR Gambar

Judul Gambar Plastik

biodegradabel

dari

Halaman

golongan

poliester

2.1

9 alifatik

2.2

Struktur umum PHA

10

2.3

Metode-metode pemisahan PHB dari sel bakteri

12

2.4

Jalur Biosintesis PHA

15

Hasil elektroforesis gel mini hasil amplifikasi gen 2.5

21 16S rRNA

2.6

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

24

Profil MFLP genom total bakteri fotosintetik anoksigenik DS-1, DS-4, dan Cas-13 yang dipotong 2.7

26 dengan Asel. M = genom total Rhodobacter sphaeroiides 2.4.1

4.1

Filogenetik strain WD-3

26

Mikroskop electron dari bagian WD-3 strain (a) 4.2

27 perbesaran 125000x dan (b) perbesaran 50000x Akumulasi PHA dalam percobaan fermentasi Fed-

4.3

Batch

bakteri

strain

WD-3

dengan

referensi

30

PH,VFA,ammonia sulfat, dan pertumbuhan sel

xiv


DAFTAR TABEL Tabel 4.1

Judul Tabel Kandungan PHA dan berat sel kering dari 6 strain

Halaman 32

Kandungan PHA dan pertumbuhan sel WD-3 pada 4.2

34 subtract dengan rasio C/N berbeda Efek sumber karbon pada akumulasi PHA dari bakteri

4.3

36 WD-3 setelah inkubasi 48 jam

xv


DAFTAR LAMBANG DAN SINGKATAN Lambang

Arti lambang / singkatan

Halaman

PHA

Polihidroksialkanoat

2

COD

Chemical Oxygen Demand

3

VFAs

Volatile fatty acids

3

PHV

Polihidroksivalerat

8

PHB

Polihidroksibutirat

8

PCL

Poli (ε-kaprolakton)

8

PLA

Poly Lactic Acid

9

PBS

Poli (butilena suksinat)

9

DNA

Deoxorybo Nucleic Acid

17

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

19

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

19

DGGE

Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis

19

DCW

Dry cell weights

32

ST

Dari tanah

32

WD

dari pengolahan limbah kedelai

32

WZ

Dari pengolahan limbah pabrik bir

32

WS

Dari pengolahan air limbah perkotaan

32

xvi


BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Plastik telah dikenal luas dalam kehidupan manusia. Berbagai barang kebutuhan hidup mulai barang-barang sederhana hingga barang-barang berteknologi tinggi banyak dibuat dengan menggunakan bahan plastik. Penggunaan plastik yang terus meningkat menumbuhkan kekhawatiran mengenai dampak buruknya terhadap lingkungan. Awalnya sifat-sifat plastik yang ringan, praktis, ekonomis, dan tahan terhadap pengaruh lingkungan menjadi unggulan, sehingga plastik dapat digunakan untuk menggantikan bahan-bahan lain yang tidak tahan lama. Akan tetapi plastik juga banyak digunakan untuk barang sekali pakai sehingga sampah plastik semakin bertambah, sementara proses degradasi secara alamiah berlangsung sangat lama. Sebagai akibatnya sampah plastik menjadi masalah bagi lingkungan. Penanganan sampah plastik antara lain dilakukan dengan cara daur ulang, pembakaran (incineration), dan penguburan (landfill). Pembakaran sampah plastik menghasilkan zat-zat beracun yang berbahaya bagi makhluk hidup, sementar acara penguburan tidak efektif karena plastik sangat sulit terdegradasi. Cara daur ulang merupakan alternatif terbaik untuk menangani sampah plastik, tetapi cara ini memerlukan biaya yang tinggi dan hanya dapat

1


mengatasi sebagian kecil sampah plastik sehingga masih menimbulkan pencemaran. Salah satu cara yang dikembangkan untuk mengatasi masalah sampah plastik adalah penggunaan plastik biodegradabel. Jenis plastik ini mudah diuraikan oleh mikroorganisme sehingga tidak mencemari lingkungan. Polihidroksialkanoat (PHA) merupakan salah satu jenis plastik biodegradabel yang memiliki potensi besar untuk menggantikan plastik hidrokarbon yang sekarang banyak digunakan. Lebih dari 40 jenis PHA dan kopolimernya telah ditemukan dan dinyatakan sebagai material yang ramah lingkungan. Polimerpolimer ini terbiodegradasi sempurna menjadi karbon dioksida dan air setelah beberapa bulan penguburan dalam tanah (Rahayu, 2007). Berbagai mikroorganisme seperti Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Nocardia, Pseudomonas, dan Rhizobium mengakumulasi PHA sebagai material cadangan energi. Masing-masing mikroorganisme menghasilkan komposisi polimer PHA yang berbeda. Jenis sumber karbon yang dikonsumsi oleh mikroorganisme juga menentukan jenis PHA yang dihasilkan. PHA telah diproduksi secara komersial dengan proses biosintesis menggunakan bahan baku glukosa. Tetapi produksi PHA ini mengalami kendala terutama dari segi biaya produksi yang tinggi yang disebabkan oleh biaya bahan baku, yaitu glukosa dan biaya pengolahan (pengambilan PHA dari sel mikroorganisme) (Rahayu, 2007). Upaya untuk mengurangi biaya produksi PHA antara lain dilakukan dengan mencari bahan baku pengganti glukosa yang harganya relatif lebih murah. Salah satu bahan baku yang dapat digunakan adalah air limbah industri yang 2


mempunyai kandungan organik yang relatif tinggi. Senyawa organik dalam limbah tersebut dapat dimanfaatkan oleh mikro organisme untuk membentuk PHA. Sebuah metode alternatif yang dapat mengurangi biaya produksi PHA adalah penggunaan sumber karbon murah sebagai sumber energi untuk bakteri, seperti asam lemak volatil (VFAs) dari asidifikasi air limbah dari sistem anaerob. Limbah organik yang pekat mengandung sejumlah besar bahan karbon organik. Material organik ini dapat dikonversi ke VFAs dalam kondisi anaerobik, yang kemudian dapat digunakan sebagai sumber karbon untuk biosintesis PHA oleh mikroorganisme khusus. Beberapa peneliti telah meneliti penggunaan VFAs, seperti asam asetat, propionat dan butirat pascafermentasi sebagai sumber karbon untuk memproduksi PHA (Rahayu, 2007). Produksi PHA yang telah banyak dilakukan menggunakan mikroorganisme kultur murni. Penggunaan kultur murni memerlukan biaya yang tinggi untuk pembiakan dan sterilisasi substrat sehingga mempertinggi biaya produksi. Penelitian Chua dkk. (1997) menunjukkan bahwa mikroorganisme dalam lumpur aktif dapat mengakumulasi PHA pada rasio C:N tertentu. Penggunaan kultur campuran lumpur aktif sebagai pengganti kultur murni untuk memproduksi PHA. Pada kondisi aerobik, mikroorganisme lumpur aktif menggunakan karbon dari air limbah untuk pembentukan sel baru. Hal ini ditandai dengan penurunan chemical oxygen demand (COD) dalam air limbah. Ketika kondisi lingkungan berubah menjadi anaerobik, mikroorganisme memulai mengakumulasi PHA sebagai cadangan karbon dalam selnya (Rahayu, 2007). 3


Isolasi strain bakteri yang dapat menghasilkan kopolimer PHA menggunakan VFAs sebagai sumber karbon tunggal akan menjadi alternatif untuk produksi kopolimer PHA lebih ekonomis. Dalam studi ini, suatu strain dari γproteobacterium yang dapat menghasilkan PHA dari VFAs diisolasi dari limbah pabrik kedelai. Jenis ini mampu mensintesis PHA berisi baik monomer 3hidroksibutirat (3HB) dan 3HV melalui sumber karbon tunggal.

4


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Plastik Plastik adalah polimer rantai-panjang dari atom yang mengikat satu sama lain. Rantai ini membentuk banyak unit molekul berulang, atau "monomer". Istilah plastik mencakup produk polimerisasi sintetik atau semi-sintetik, namun ada beberapa polimer alami yang termasuk plastik. Plastik terbentuk dari kondensasi organik atau penambahan polimer dan bisa juga terdiri dari zat lain untuk meningkatkan performa atau ekonomi (Azizah, 2009).

2.1.1 Plastik Konvensional (non-biodegradabel) Ratusan juta ton plastik yang digunakan di bumi ini, maka ratusan juta ton juga sampah plastik yang dihasilkan dan menjadi polutan utama dunia. Karena bahan dasar plastik adalah phthalate ester, di(ethylhexyl) phthalate (DEHP) yang bersifat stabil, sukar diuraikan oleh mikroorganisme sehingga kita terusmenerus memerlukan area untuk pembuangan sampah. Pada makanan yang dikemas dalam bungkus plastik, adanya migrasi zat-zat monomer dari bahan plastik ke dalam makanan, terutama jika makanan tersebut tak cocok dengan kemasan atau wadah penyimpannya yang tidak mungkin dapat dicegah 100 % (terutama jika plastik yang digunakan tak cocok dengan jenis makanannya). Migrasi monomer terjadi karena dipengaruhi oleh suhu makanan atau penyimpanan dan (Koswara S, 2006)

5


Plastik mudah terbakar, ancaman terjadinya kebakaran pun semakin meningkat. Asap hasil pembakaran bahan plastik sangat berbahaya karena mengandung gas-gas beracun seperti hidrogen sianida (HCN) dan karbon monoksida (CO). Hidrogen sianida berasal dari polimer berbahan dasar akrilonitril, sedangkan karbon monoksida sebagai hasil pembakaran tidak sempurna. Hal inilah yang menyebabkan sampah plastik sebagai salah satu penyebab pencemaran udara dan mengakibatkan efek jangka panjang berupa pemanasan secara global pada atmosfer bumi. Sampah plastik yang berada dalam tanah yang tidak dapat diuraikan oleh mikroorganisme menyebabkan mineral-mineral dalam tanah baik organik maupun anorganik semakin berkurang, hal ini menyebabkan jarangnya fauna tanah, seperti cacing dan mikorganisme tanah, yang hidup pada area tanah tersebut, dikarenakan sulitnya untuk memperoleh makanan dan berlindung. Selain itu kadar O2 dalam tanah semakin sedikit, sehingga fauna tanah sulit untuk bernafas dan akhirnya mati. Ini berdampak langsung pada tumbuhan yang hidup pada area tersebut. Tumbuhan membutuhkan mikroorganisme tanah sebagai perantara dalam kelangsungan hidupnya (Ahmann D dan Dorgan J R, 2007).

2.1.2 Bioplastik (Biodegradabel) Seiring dengan meningkatnya kesadaran untuk pelestarian lingkungan, kebutuhan bahan plastik biodegradabel mengalami peningkatan dari tahun ke tahun. Pada tahun 2010, diproyeksikan produksi plastik biodegradabel akan mencapai 1.200.000 ton atau menjadi 1/10 dari total produksi bahan plastik. Industri plastik biodegradabel akan berkembang menjadi industri besar di masa yang akan datang (Pranamuda H, 2009) 6


Bioplastik adalah plastik yang dapat digunakan layaknya seperti plastik konvensional, namun akan hancur terurai oleh aktivitas mikroorganisme menjadi hasil akhir berupa air dan gas karbondioksida setelah habis terpakai dan dibuang ke lingkungan tanpa meninggalkan sisa yang beracun. Karena sifatnya yang dapat kembali ke alam, plastik biodegradabel merupakan bahan plastik yang ramah terhadap lingkungan (Pranamuda H, 2009). Berdasarkan

bahan

baku

yang

dipakai,

plastik

biodegradabel

dikelompokkan menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok dengan bahan baku petrokimia (non-renewable resources) dengan bahan aditif dari senyawa bioaktif yang bersifat biodegradabel, dan kelompok kedua adalah dengan keseluruhan bahan baku dari sumber daya alam terbarukan (renewable resources) seperti dari bahan tanaman pati dan selulosa serta hewan seperti cangkang atau dari mikroorganisme yang dimanfaatkan untuk mengakumulasi plastik yang berasal dari sumber tertentu seperti lumpur aktif atau limbah cair yang kaya akan bahan-bahan organik sebagai sumber makanan bagi mikroorganisme tersebut ( Adam S dan Clark D, 2009).

2.2 Polihidroksialkanoat PHA telah diteliti oleh Beijerinck pada tahun 1888 di bawah mikroskop sebagai granula-granula yang berada di dalam sel-sel. Dan komposisi PHA ditemukan oleh Lemoigne pada tahun 1927 diidentifikasi sebagai asam 3hidroksibutirat yang diakumulasikan oleh Bacillus megaterium. Pengembangan penelitian saat ini ditujukan pada aspek yang berbeda dari mikroorganisme untuk beberapa sifat polimer yang diproduksi (Purwadi R, 2006).

7


Berbagai mikroorganisme seperti Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Nocardia, Pseudomonas, dan Rhizobium mengakumulasi polihidroksialkanoat sebagai

material

cadangan

energi.

Masing-masing

mikroorganisme

menghasilkan komposisi polimer PHA yang berbeda. Jenis sumber karbon yang dikonsumsi oleh mikroorganisme juga menentukan jenis PHA yang dihasilkan. PHA sendiri adalah material cadangan mikroba, sehingga diharapkan mudah termetabolisasi oleh mikroorganisme denitrifikasi. Salah satu faktor yang mempengaruhi proses denitrifikasi jenis ini adalah kristalinitas polimer. PHA yang bersifat amorf lebih mudah terdegradasi daripada PHA yang bersifat kristalin. PHA bentuk amorf berada dalam tubuh bakteri (intraseluler), sedangkan produk PHA yang telah diekstraksi (ekstraseluler) berbentuk kristalin (Yan dkk, 2009; Coats dkk, 2007; Rahayu D, 2007). Menurut laporan Pranamuda H (2009) dalam penelitiannya, menyatakan bahwa saat ini polimer plastik biodegradabel yang telah diproduksi adalah kebanyakan dari polimer jenis poliester alifatik. Plastik biodegradabel yang sudah diproduksi skala industri, antara lain: a. Poli (ε-kaprolakton) (PCL) : PCL adalah polimer hasil sintesa kimia menggunakan bahan baku minyak bumi. PCL mempunyai sifat biodegradabilitas yang tinggi, dapat dihidrolisa oleh enzim lipase dan esterase

yang

tersebar

luas

pada

tanaman,

hewan

dan

mikroorganisme. Namun titik lelehnya yang rendah, Tm =60oC, menyebabkan bidang aplikasi PCL menjadi terbatas (Awaliyyah RF, 2008; Pranamuda H, 2009).

8


b. Poli (ß-hidroksi butirat) (PHB) : PHB adalah poliester yang diproduksi sebagai cadangan makanan oleh mikroorganisme seperti Alcaligenes (Ralstonia) eutrophus, Bacillus megaterium dsb. PHB mempunyai titik leleh yang tinggi (Tm = 180 °C), tetapi karena kristalinitasnya yang tinggi menyebabkan sifat mekanik dari PHB kurang baik (Ping KC, 2006). c. Poli (butilena suksinat) (PBS): PBS mempunyai titik leleh yang setara dengan plastik konvensional polietilen, yaitu Tm =113 °C. d. Poli asam laktat (PLA) : PLA merupakan poliester yang dapat diproduksi menggunakan bahan baku sumberdaya alam terbarui seperti pati dan selulosa melaui fermentasi asam laktat. PLA mempunyai titik leleh yang tinggi sekitar 175 oC, dan dapat dibuat menjadi lembaran film yang transparan (Pranamuda H, 2009).

Gambar 2.1 Plastik biodegradabel dari golongan poliester alifatik

2.2.1 Penggolongan PHA PHA

merupakan

poliester

yang

tersusun

atas

monomer-monomer

hidroksikarboksilat. Monomer-monomernya terdiri atas rantai karbon, 3-18 atom karbon. Struktur dari PHA termasuk homo dan heteropolimer. Lebih dari 9


91 kemungkinan konstituen biosintesis PHA (Ojumu dkk, 2004; Purwadi R, 2006). Lebih dari 250 bakteri yang berbeda, termasuk spesies gram negatif dan gram positif mampu mengakumulasikan PHA. PHA dapat dibagi atas dua gugus besar berdasarkan jumlah rantai atom karbon pada unit monomernya: 1. Panjang rantai pendek (short chain length/SCL): PHA yang mengandung atom C3-C5. 2. Panjang rantai sedang (medium chain length/MCL): PHA yang mengandung atom C6-C14 3. Panjang rantai panjang (long chain length/LCL) ): PHA yang mengandung atom lebih banyak dari C14(Kadouri dkk, 2005; Ojumu dkk, 2004).

Gambar 2.2 Struktur umum PHA n=1R

= hidrogen poli(-3-hidroksipropionat/3HP) = metil poli(-3-hidroksibutirat/3HB) = etil poli(-3-hidroksivalerat/3HV) = propil poli(-3-hidroksiheksanoat/3HH) = pentil poli(-3-hidroksioktanoat/3HO) = nonil poli(-3-hidroksidodekanoat/3HDD)

n=2R

= hidrogen poli(-4-hidroksibutirat/4HB)

R

= metil poli(-4-hidroksivalerat/4HV)

n=3R

= metil poli(-5-hidroksivalerat/5HV)

R n=4R

= etil poli(-5-hidroksiheksanoat/5HH) = heksil poli(-6-hidroksidodekanoat/6HDD) 10


2.2.2 Biosintesis PHA PHA

dapat

diperoleh

dengan

tiga

cara

:

biosintesis

dengan

mikroorganisme, transgenik tumbuhan, dan biosintesis in vitro menggunakan enzim. Pada kebanyakan bakteri, sel-sel mensintesis PHA di bawah kondisi substrat yang terbatas selain karbon, seperti nitrogen, posfor atau oksigen. Pengakumulasian PHA terjadi pada saat karbon dan sumber energi lainnya dalam kondisi kekurangan (Kadouri dkk, 2005; Purwadi R, 2006). Berikut adalah beberapa sumber karbon dan bakteri yang digunakan dalam proses biosintesis PHA : Tabel 2.1 Beberapa jenis bakteri dan sumber Alcaligenes Alcaligenes Bakteri Eutrophus Lactus Sumber Glukosa Sukrosa Karbon Nutrisi Nitrogen Pembatas Kontrol Moetode Konsentrasi PH-stat Fermentasi Glukosa Waktu 50 jam 28.45 jam Fermentasi Konsentrasi 164 143 Sel (g/l) Konsentrasi 121 71.4 PHB (g/l) Kandungan 76 50 PHB (%) Yield PHB (g 0.3 0.17 PHB / g Substrat) Yamane,dkk Referensi Kim, dkk 1994 1996

karbon pada pembuatan PHB Recombinant M. E. Coli Organophilum Glukosa Metanol Potassium

-

39 jam

Kontrol Konsentrasi Methanol 70 jam

110

250

85

130

77.3

52

0.19

0.19

Unpublished Result

Kim, dkk 1996

PH-stat

Biosintesis PHA secara umum ialah dengan proses fermentasi untuk memperoleh kandungan PHA pada sel bakteri dan dilanjutkan dengan proses pemisahan PHA dari sel Ekstraksi. Pada proses fermentasi terjadi sintesa 11


substrat menjadi PHA. Jenis PHA yang dihasilkan dipengaruhi oleh jenis mikroba, sumber karbon dan substrat pembatas. PHA diperoleh dari hasil akumulasi karbon dengan kondisi pembatas N, P, Mg atau O 2 (Anderson dkk, 1990). Saat ini telah diketahui banyak bakteri yang dapat mengakumulasi sumber karbon menjadi PHA. Terdapat 2 alternatif fermentasi yang umum digunakan untuk memproduksi PHA yaitu : 1.

Fed-Batch Fermentor di isi dengan nutrisi secukupnya untuk pertumbuhan sel.

2.

Multi-stage Continuous Cultivation Pada proses fermentasi ini, nutrisi dimasukkan secara kontiniu pada masing - masing fermentor. Fermentor yang pertama merupakan tempat pertumbuhan sel. Sedangkan fermentor yang kedua digunakan untuk proses akumulasi PHA.

Pada proses pemisahan PHA dari sel bakteri diketahui beberapa metode yang intinya adalah untuk memecahkan dinding sel bakteri dan memisahkan kandungan PHA yang terdapat pada bakteri tersebut. Beberapa metode yang dapat digunakan dalam proses pemisahan ialah sebagai berikut :

Gambar 2.3 Metode-metode pemisahan PHB dari sel bakteri 12


Untuk memperoleh jenis PHA yang diinginkan perlu diperhatikan mikroba yang dipergunakan, sumber karbon, nutrient pembatas dan metode pemisahan sel yang digunakan. Dalam beberapa penelitian telah diklasifikasikan beberapa mikroba yang dapat mensintesa berbagai macam sumber karbon pada proses sintesa PHA. Pada table 2.3 telah diberikan beberapa contoh bakteri yang dapat menghasilkan PHA. PHA yang dihasilkan ini tergantung dari bakteri yang mensintesa dan sumber karbon yang dipergunakan dengan lama waktu fermentasi yang sesuai untuk memperoleh yield optimum. Sedangkan proses pemisahan bakteri dari PHB yang sudah tersintesa didalam sel bakteri terdapat beberapa metode pemisahan. Berikut ini adalah beberapa metode yang pada umumnya dipergunakan oleh industri maupun riset : a) Solvent Extraction Metode ini adalah salah satu metode tertua dalam pemisahan PHA. Biasanya menggunakan pelarut seperti: kloroform, 1,2 - dikloroetana dan

metilene

klorida.

menggunakan pelarut,

Dalam

beberapa

percobaan

ekstraksi

diketahui dapat menghancurkan dinding sel.

Kemurnian PHA dengan menggunakan pelarut ini dapat mencapai 98%. Salah satu yang menjadi masalah pengunaan method ini ialah limbah cair yang dihasilkan. Sehingga diperlukan solvent recovery untuk mengurangi pencemaran lingkungan. b) Digestion Method Metode ini memiliki prinsip yang sama dengan metode solvent extraction. Namun pada metode ini menggunakan pelarut seperti: surfaktan, chelate dan enzim. 13


c) Mechanical Treatment Metode ini sering digunkan untuk memisahkan intraseluler protein (Timer, dkk. 1998). Contoh metode ini antara lain: Bead Mill Disruption dan High Pressure Homogenization. d) Supercritical CO2 Sedangkan pada metode pemisahan dengan Supercritical CO2 memerlukan tekanan yang tinggi untuk proses ekstraksi dan kemurnian hanya mencapai 89% e) Using cells fragility Pada metode Using cells fragility tidak bisa digunakan untuk setiap mikroba. Pada metode ini bakteri yang digunakan ialah E. Coli dan A. Vineandi sehingga jarang dipergunakan pada saat extraksi ( Choi, 2009).

Jalur biosintesis PHA dalam merombak karbon sebagai sumber makanan melibatkan 3 enzim sekaligus, yaitu β-ketothiolase (PhbA), suatu NADPHbersinergi dengan acetoacetyl coenzyme A (acetoacetyl-CoA) reduktase (PhbB) dan PHB sintase (PhbC). Jika PHA yang diproduksi dalam bentuk kopolimer seperti PHBV, maka langkah pertama yang diproduksi adalah PHB yang dikatalisasi oleh β-ketothiolase yang mengkondensassi dua molekul acetyl-CoA untuk membentuk acetoacetyl-CoA. Pembentukan kopolimer PHBV melibatkan reaksi kondensasi membentuk

β-ketovaleryl-CoA.

acetyl-CoA dengan propionyl-CoA untuk Selanjutnya,

acetoacetyl-CoA

dan

β-

ketovaleryl-CoA menjadi polimer PHBV dengan aktivitas reduktase dan sintase (Slater dkk, 1998).

14


Gambar 2.4 Jalur Biosintesis PHA

2.2.4 Sifat Kimia dan Fisika PHA PHA tidak beracun, biokompatibel, termoplastik biodegradabel yang dapat diproduksi dari sumber terbarukan, PHA memiliki derajat polimerisasi yang tinggi, kristalinitas yang tinggi, optis aktif dan isotaktik (sifat stereokimia dalam pengulangan unitnya), piezoelektrik dan tidak larut dalam air. Sifatsifat ini membuatnya mampu menyaingi polipropilen, plastik yang disintesis dari petrokimia (Purwadi R, 2006). Ketidakjenuhan dalam rantai PHA meningkatkan keelastisitasannya, dan gugus fungsi yang berbeda mengubah sifat fisika dan kimianya. PHA dengan gugus rantai pendek lebih keras, kristalinitasnya lebih tinggi, namun PHA dengan gugus rantai yang panjang lebih bersifat elastomer. PHB jauh lebih tinggi kristalinitasnya, kaku dan rapuh. Sumber karbon dan strain bakteri yang digunakan dalam proses fermentasi mempengaruhi sifat dan kemungkinannya dalam menghasilkan polimer yang kaku, rapuh atau elastis. Sebagai tambahan 15


untuk memperjelas gugus samping, monomer PHA dengan percabangan, kejenuhan, ketidakjenuhan dan gugus samping aromatis juga ditemukan. Dan juga gugus fungsi dalam rantai samping seperti halogen, karboksil, hidroksil, epoksi,

fenoksi,

sianofenoksi,

nitroin

fenoksi,

tiofenoksi,

metilester

merupakan gugus yang sering digunakan dalam modifikasinya. Panjang rantai, kejenuhan, dan gugus fungsi dari rantai samping juga mempengaruhi sifat titik leleh, transisi kaca dan kristalinitas (Yilgor P dkk, 2007). Karakteristik yang dimiliki oleh PHB hampir sama dengan karakteristik polipropilen, sehingga PHB berpotensi menggantikan plastik sintetik misalnya Polipropilena (PP). Dimana PP diperoleh dengan bahan baku minyak bumi. Adapun perbandingan karakteristik tersebut dijabarkan dalam tabel dibawah ini: Tabel 2.2 Perbandingan sifat - sifat fisika dan kimia PHB dan PP Karakteristik Polihidroksibutirat Polipropilena 0 Titik Leleh ( C) 175-182 171-186 Suhu Glass-transition (0C) 4 -10 5 6 Berat Molekul 5 x 10 -1 x 10 2 x 105 Distribusi berat molekul 2.2 - 3 5 - 12 3 Densitas (g/cm ) 1.25 0.92 Crystallinity (%) 65-80 65-70 Modulus Young (GPa) 3.5 - 4 1.7 Tensile Strength (MPa) 40 38 Extension to Break (%) 6-8 400 Solvent Reistance Poor Good Ultraviolet Resistnace Good Poor Oxygen Permeabelity 45 1700 Biodegradability Excellent Poor Sumber: Biotechnology Bioprocess Engineering (Choi, 1997)

16


2.3 Proteobakteri Bakteri, dari kata Latin bacterium (jamak, bacteria), adalah kelompok terbanyak dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus/inti sel, sitoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Struktur sel mereka dijelaskan lebih lanjut dalam artikel mengenai prokariot, karena bakteri merupakan prokariot, untuk membedakan mereka dengan organisme yang memiliki sel lebih kompleks, disebut eukariot. Proteobakteri adalah salah satu dari filum bakteri yang didasarkan pada interpretasi rRNA. Proteobakteri memiliki empat sub kelompok yaitu alfa, beta, gamma

seperti pada lampiran A. Bakteri dalam filum ini dapat

menghasilkan PHA. Bakteri yang menghasilkan PHA membutuhkan subtratsubtrat tertentu seperti glukosa, maltosa, gliserol dan lainnya seperti pada lampiran B.

2.4 Filogenetik Filogenetik adalah studi yang membahas tentang hubungan kekerabatan antar berbagai macam organisme melalui analisis molekuler dan morfologi. Karakter

morfologi

telah

lama

digunakan

dalam

banyak

penelitian

filogenetik.Dengan pesatnya perkembangan teknik-teknik di dalam biologi molekuler, seperti PCR dan pengurutan DNA, penggunaan urutan DNA dalam

17


penelitian filogenetik telah meningkat pesat dan telah dilakukan pada semua tingkatan taksonomi, misalnya famili, marga, dan spesies. Filogenetik molekuler mengkombinasikan teknik biologi molekuler dengan statistik untuk merekonstruksi hubungan

filogenetik. Pemikiran dasar

penggunaan sekuens DNA dalam studi filogenetik adalah bahwa terjadi perubahan basa nukleotida menurut waktu, sehingga akan dapat diperkirakan kecepatan evolusi yang terjadi dan akan dapat direkonstruksi hubungan evolusi antara satu kelompok organisme dengan yang lainnya. Sekuens DNA telah menarik perhatian para praktisi taksonomi dunia untuk dijadikan

karakter

dalam

penelitian

filogenetik

karena

beberapa

fakta.Pertama, sekuens DNA menawarkan data yang akurat melalui pengujian homologi yang lebih baik terhadap karakter-karakter yang ada.Kedua, sekuens DNA menyediakan banyak karakter karena perbedaan laju perubahan basabasa nukleotida di dalam lokus yang berbeda adalah besar. Dan ketiga, urutan DNA telah terbukti menghasilkan sebuah hubungan kekerabatan yang lebih alami (natural) (Nei,1996).

2.5 Analisis Filogenetik Analisis filogenetik merupakan proses bertahap untuk mengolah data urutan DNA atau protein sehingga diperoleh suatu hasil yang menggambarkan estimasi mengenai hubungan evolusi suatu kelompok organisme. Ada sejumlah asumsi yang harus diperhatikan sebelum menggunakan data urutan DNA atau protein ke analisis, diantaranya yaitu (1) sekuens berasal dari sumber yang 18


spesifik, apakah dari inti, kloroplas atau mitokondria; (2) sekuens bersifat homolog (diturunkan dari satu nenek moyang); (3) sekuens memiliki sejarah evolusi yang sama (misalnya bukan dari campuran DNA inti dan mitokondria); dan (4) setiap sekuens berkembang secara bebas. Paling sedikit, ada tiga tahap

penting dalam

analisis

filogenetik,

yaitu

sequence

alignment,

rekonstruksi pohon filogenetika, dan evaluasi pohon filogenetika dengan uji statistik (Cavalli-Sforza,1997).

2.6 Analisis DNA Beberapa

teknik

analisis

DNA

seperti

RAPD

(Random

Amplified

Polymorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), dan DGGE (Denaturing Gradient Gel Elecrophoresis) membutuhkan amplifikasi daerah genom tertentu dari suatu organisme. Amplifikasi ini membutuhkan primer spesifik (sekuen oligonukelotida khusus) untuk daerah tersebut. Primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah konservatif dalam genom tersebut. Makin panjang primer, makin harus spesifik daerah yang diamplifikasi. Jika suatu kelompok organisme memang berkerabat dekat, maka primer dapat digunakan untuk mengamplifikasi daerah tertentu yang sama dalam genom kelompok tersebut. Beberapa faktor seperti konsentrasi DNA contoh, ukuran panjang primer, komposisi basa primer, konsentrasi ion Mg, dan suhu hibridisasi primer harus dikontrol dengan hati-hati agar dapat diperoleh pita-pita DNA yang utuh dan baik. Keberhasilan teknik ini lebih didasarkan kepada kesesuaian primer dan efisiensi dan optimasi proses PCR. Primer yang tidak spesifik dapat 19


menyebabkan teramplifikasinya daerah lain dalam genom yang tidak dijadikan sasaran atau sebaliknya tidak ada daerah genom yang teramplifikasi. Optimasi PCR juga diperlukan untuk menghasilkan karakter yang diinginkan. Optimasi ini menyangkut suhu denaturasi dan annealing DNA dalam mesin PCR. Suhu denaturasi yang rendah dapat menyebabkan belum terbukanya DNA utas ganda sehingga tidak dimungkinkan terjadinya polimerisasi DNA baru. Proses penempelan primer pada utas DNA yang sudah terbuka memerlukan suhu optimum, sebab suhu yang terlalu tinggi dapat menyebabkan amplifikasi tidak terjadi atau sebaliknya suhu yang terlalu rendah menyebabkan primer menempel pada sisi lain genom yang bukan sisi homolognya; akibatnya dapat teramplifikasi banyak daerah tidak spesifik dalam genom tersebut. Suhu penempelan (annealing) ini ditentukan berdasarkan primer yang digunakan yang dipengaruhi oleh panjang dan komposisi primer. Suhu penemelan ini sebaiknya sekitar 5°C di bawah suhu leleh. Secara umum suhu leleh (Tm) dihitung dengan rumus Tm = 4(G+C) + 2(A+T)°C (Rybicky, 1996). Berikut ini disajikan contoh hasil amplifikasi gen 16S-rRNA pada gel elektroforesis dari bakteri dengan primer domain Bacteria 63f (5'-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC) dan 1387r (5'-GGG CGG WGT GTA CAA GGC) (Marchesi et al., 1998).

20


Gambar 2.5 Hasil elektroforesis gel mini hasil amplifikasi gen 16S rRNA.

2.6.1 Teknik PCR-RAPD

PCR-RAPD merupakan salah satu teknik molekuler berupa penggunaan penanda tertentu untuk mempelajari keanekaragaman genetika. Dasar analisis RAPD adalah menggunakan mesin PCR yang mampu mengamplifikasi sekuen DNA secara in vitro. Teknik ini melibatkan penempelan primer tertentu yang dirancang sesuai dengan kebutuhan. Tiap primer boleh jadi berbeda untuk menelaah keanekaragaman genetik kelompok yang berbeda. Penggunaan teknik RAPD memang memungkinkan untuk mendeteksi polimorfisme fragmen DNA yang diseleksi dengan menggunakan satu primer arbitrasi, terutama karena amplifikasi DNA secara in vitro dapat dilakukan dengan baik dan cepat dengan adanya PCR (Suryanto,2001). Penggunaan penanda RAPD relatif sederhana dan mudah dalam hal preparasi. Teknik RAPD memberikan hasil yang lebih cepat dibandingkan dengan teknik molekuler lainnya. Teknik ini juga mampu menghasilkan jumlah 21


karakter yang relatif tidak terbatas, sehingga sangat membantu untuk keperluan analisis keanekaragaman organisme yang tidak diketahui latar belakang genomnya. Pada tanaman tahunan RAPD dapat digunakan untuk meningkatkan efisiensi seleksi awal. Teknik RAPD sering digunakan untuk membedakan organisme tingkat tinggi (eucaryote). Namun demikian beberapa peneliti menggunakan teknik ini untuk membedakan organisme tingkat rendah (procaryote) atau melihat perbedaan organisme tingkat rendah melalui piranti organel sel seperti mitokondria (Suryanto,2001).

2.6.2 Teknik PCR-RFLP Teknik ini mirip dengan RAPD pada prinsip penggunaan primer. Untuk melihat polimorfisme dalam genom organisme digunakan juga suatu enzim pemotong tertentu (restriction enzymes). Karena sifatnya yang spesifik, maka enzim ini akan memotong situs tertentu yang dikenali oleh enzim ini. Situs enzim pemotong dari genom suatu kelompok organisme yang kemudian berubah karena mutasi atau berpindah karena genetic rearrangement dapat menyebabkan situs tersebut tidak lagi dikenali oleh enzim, atau enzim restriksi akan memotong daerah lain yang berbeda. Proses ini menyebabkan terbentuknya fragmen-fragmen DNA yang berbeda ukurannya dari satu organisme ke organisme lainnya. Polimorfisme ini selanjutnya digunakan untuk membuat

pohon

filogeni

atau

dendogram

kekerabatan

kelompok

(Suryanto,2001).

22


Teknik RFLP sering digunakan untuk mengetahui perbedaan jenis bakteri misalnya berdasarkan gen ribosomal DNA (contoh 16S-rRNA). Oleh karenanya teknik ini seringkali pula disebut ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis). Penggunaan teknik PCR-RFLP telah pula mampu secara mengesankan mengungkap keanekaragaman genetik mikroba yang tidak dapat dikulturkan di laboratorium. Dengan menggunakan teknik isolasi DNA dari lingkungan yang kemudian dilanjutkan dengan amplifikasi dengan menggunakan primer spesifik untuk 16S-rRNA telah dapat diungkap adanya jenis-jenis mikroba baru. Dengan menggunakan primer tertentu, teknik ini juga dapat digunakan untuk gen-gen lain yang ada dalam contoh lingkungan.

2.6.3 Teknik PCR- Analisis Sekuen Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme. Teknik ini berkembang setelah orang menciptakan mesin

DNA sequencer. Pada

prinsipnya polimorfisme dilihat dari urutan atau sekuen DNA dari fragmen tertentu dari suatu genom organisme. Untuk melihat keanekaragaman jenis dapat dilakukan melalui analisis sekuen gen 16S-rRNA bagi organisme prokaryota atau 18S-rRNA bagi organisme eukaryota. Perbandingan sekuen rRNA merupakan alat yang baik untuk mendeduksi hubungan filogeni dan evolusi

di

antara

organisme

bacteria,

archaebacteria,

dan

eukaryot

(Suryanto,2001).

23


2.6.4 Teknik PCR-DGGE Teknik analisis ini sebenarnya mirip dengan RAPD ataupun RFLP, hanya saja primer yang digunakan misalnya primer GC clamp. Elektroforesis yang dilakukan menggunakan gel poliakrilamida dengan gradien urea yang ditambah dengan formamida. Pemisahan dilakukan tanpa enzim restriksi dan sekuen bukan berdasarkan berat molekul. Teknik ini menggunakan dasar perbedaan stabilitas produk PCR. Dengan demikian sangat tergantung dari jumlah ikatan hidrogen yang ada dalam DNA tersebut (Suryanto,2001).

Gambar 2.6 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). 2.6.5 Teknik MFLP Pada prinsipnya semua teknik pemisahan DNA, misalnya pada RFLP dan RAPD, menggunakan suatu teknik elektroforesis medan listrik tetap dan satu arah (konfigurasi horizontal) dengan media agarose atau akrilamid. Gel agarose memiliki kapasitas pemisahan yang lebih rendah dibandingkan dengan gel akrilamid, tetapi memilik spektrum pemisahan yang lebih besar. Teknik elektroforesis gel agarose konvensional ini biasanya digunakan untuk memisahkan fragmen DNA dengan ukuran relatif kecil dengan ukuran sekitar 24


200 bp sampai kira-kira 50 kb. Fragmen dengan ukuran di atas 50 kb tidak lagi dapat dipisahkan dengan baik dengan menggunakan teknik ini. Fragmenfragmen ini akan bergerak dalam kecepatan yang sama dalam gel agarosa. Batas kemampuan linier tersebut melampaui ukuran pori-pori gel. Agar dapat terpisah fragmen harus bergerak dari ujung ke ujung (end-on). Masalah ini akhirnya dapat diatasi oleh Schwartz dan Cantor (1984) yang memperkenalkan teknik pulsed field gel electrophoresis (PFGE). Dengan teknik ini molekul DNA secara periodik merubah arah migrasi selama elektroforesis. Beberapa teknik PFGE telah diperkenalkan, yaitu field inversion gel electrophoresis (FIGE), contour clamped homogenous electric field (CHEF), dan programmable, autonomously controlled electrode gel electrophoresis (PAGE). Berbeda dengan teknik elektroforesis lainnya, yang sering mengisolasi DNA dalam cairan, teknik PFGE ini membutuhkan DNA yang kurang lebih utuh. Isolasi DNA dalam cairan seringkali menyebabkan DNA terpotong-potong dengan ukuran rata-rata kurang dari 1000 kb. Untuk keperluan PFGE genom suatu organisme biasanya diisolasi utuh dengan cara memerangkap sel dalam agarose. Pemecahan dan pemurnian DNA selanjutnya dilakukan secara in situ. Teknik identifikasi dengan PFGE atau MFLP ini sangat diskriminatif dalam membedakan strain suatu kelompok bakteri dengan strain bakteri lainnya. Oleh karenanya teknik ini sering digunakan untuk melihat perbedaan strainstrain bakteri spesies yang sama.

25


Gambar 2.7 Profil MFLP genom total bakteri fotosintetik anoksigenik DS-1, DS4, dan Cas-13 yang dipotong dengan Asel. M = genom total Rhodobacter sphaeroiides 2.4.1. 2.7 Setrifugasi Pada suatu larutan, partikel-partikel yang berat jenis lebih besar dari berat jenis sekelilingnya akan mengendap (sedimentasi). Apabila berat jenis lebih kecil maka partikel tersebut akan mengapung, makin besar perbedaan berat jenis makin cepat partikel itu bermigrasi. Apabila tidak ada perbedaan berat jenis, maka partikel melayang.Agar perbedaan kecil berat jenis dapat digunakan

untuk

pemisahan

partikel-partikel

yang

berbeda

dalam

larutan.Gaya tarik bumi dapat digantikan oleh tenaga sentrifugal yang jauh lebih dengan bantuan sentrifugasi. Percepatan yang tercapai melalui sentrifugasi dinyatakan sebagai kelipatan percepatan gaya tarik bumi (9.8 ms-1). Dengan bantuan sentrifugasi dapat dicapai nilai percepatan hingga lebih kurang 10.000 g. dengan alat sentrifugasi dingin dapat dicapai percepatan hingga 50.000 g dan ultra sentrifugasi yang bekerja dalam keadaan dingin dan vakum dapat mencapai percepatan hingga 500.000 g.

26


Untuk pemisahan makromolekul antara satu dengan yang lain yang memiliki perbedaan ukuran atau berat jenis yang tidak berarti, digunakan pemisahan gradien berat jenis. Di dalam alat sentrifugasi, bahan uji yang akan dipisahkan (misal protein atau sel) ditambahkan di atas larutan sentrifugasi. Selama sentrifugasi partikel-partikel bermigrasi menembus larutan.Kecepatan migrasi sangat ditentukan terutama dari berat molekulnya. Sentrifugasi di akhiri sebelum partikel-partikel mencapai dasar tabung sentrifugasi dengan cara melubangi bagian bawah tabung sentrifugasi dan membiarkan larutan menetes keluar lubang. Selama sentrifugasi, larutan dalam tabung distabilkan oleh gradien berat jenis.Gradien berat jenis adalah suatu larutan karbohidrat atau gel silika koloid yang konsentrasinya dari permukaan larutan hingga dasar tabung meningkat.Gradien berat jenis mencegah aliran konveksi yang mengganggu pemisahan partikel (Koolman, 2000).

27


BAB III METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan 3.1.1 Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan dari gelas seperangkat alat fed-batch dan kultur flask, GC dan inkubator.

3.1.2 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah media untuk : Natrium

fosfat

heptahidrat

(Na2HPO4·7H2O),

Kalium

dihidrogen

fosfat

(KH2PO4), Magnesium sulfat heptahidrat (MgSO4·7H2O), besi amonium sitrat, Kalsium klorida dihidrat (CaCl2·2H2O), Asam borat (H3BO3), Kobal (II) klorida heksahidrat (CoCl2·6H2O), Seng (II) sulfat heptahidrat (ZnSO4·7H2O), Mangan (II) klorida tetrahidrat (MnCl2·4H2O), NaMoO4·2H2O 30 mg L-1, Nikel (II) klorida heksahidrat (NiCl2·6H2O), Tembaga (II) sulfat (CuSO4·5H2O), aquades, asetat, propionat dan butirat.

3.2 Prosedur 3.2.1 Pembuatan Medium Medium kultur dibuat menggunakan ekstrak ragi 5 g L-1, pepton 10 g L-1, NaCl 5 g L-1. PH pada medium kultur dinetralkan dengan NaOH 3 M dan HCl 3 M dan disterilkan sebelum digunakan pada penelitian. Kultur murni yang

28


dihasilkan diisolasi pada agar dengan media yang sama yang mengandung Nile Blue (50 μm L-1 Sigma) (Spiekermann et al, 1999). Medium yang digunakan untuk fermentasi terdiri dari sumber karbon, sumber nitrogen dan larutan mineral logam. Komposisi dari larutan mineral yaitu : Na2HPO4.7H2O 8,9 g L-1, KH2PO4 1.5 g L-1, MgSO4.7H2O L-1 0.2 g, besi amonium sitrat 60 mg L-1, CaCl2.2H2O 10 mg L-1, dan 10 mL L-1 trace element. trace element dibuat dari: H3BO3 0,3 g L-1, CoCl2.6H2O 0,2 g L-1, ZnSO4.7H2O 0,1 g L-1, MnCl2.4H2O 30 mg L-1, NaMoO4.2H2O 30 mg L-1, NiCl2.6H2O 20 mg L-1, CuSO4.5H2O 10 mg L-1.

3.2.2 Isolasi dan Identifikasi Kultur murni yang sudah diisolasi pada agar diuji menggunakan fluoresens untuk memeriksa kandungan penyimpanan lemak termasuk PHA. Identifikasi urutan parsial 16S rDNA dari bakteri diproses di Shanghai Sangon Biological Engineering Technology and Service Co. Hasil pengurutan dibandingkan dengan

database

National

Center

for

Biotechnology

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Mikroskop elektron transmisi digunakan untuk memeriksa morfologi. Pada proses ini, pelet sel yang disentrifugal mengandung glutaraldehide 4 % dan osmium tetroksida 1 %. Bagian ultra tipis pada sampel yang menempel di resin epoxy disusun dengan ultramicrotome, dikotori dengan uranil asetat dan timah sitrat, dan diperiksa di bawah mikroskop transmisi elektron (TEM) JEM1200EXII (JEOL, Tokyo, Jepang).

29


3.2.3 Kultur Flask Pada kultur ini dilakukan percobaan rasio C/N, asam butirat digunakan sebagai satu-satunya sumber karbon. Rasio C/N yang diteliti adalah 35, 40 dan 45. Percobaan sumber karbon dilakukan untuk membandingkan penggunaan asam butirat, asetat dan propionat sebagai sumber karbon untuk produksi PHA. Amonia sulfat digunakan sebagai sumber nitrogen dalam semua percobaan. Pada masing-masing percobaan, kultur biakan yang tumbuh diinokulasikan dalam medium bibit. Bibit murni kemudian ditumbuhkan dalam labu 250 mL berisi 60 mL medium yang telah dibuat, masing-masing diputar dan digoyang pada 180 rpm selama 24 jam. Suhu dijaga pada suhu 30 °C. Sel dipanen setelah disentrifugasi pada 8000g selama 2 menit dan dicuci dengan larutan NaCl 0,9 %, kemudian diinokulasikan pada medium fermentasi dengan 5 % (v/v) inokulum dan difermentasi selama 72 jam (untuk percobaan rasio C/N) dan 48 jam (untuk percobaan sumber karbon).

3.2.4 Kultur Fed-batch Bibit kultur ini dipersiapkan dalam labu 250 mL pada suhu 30 °C selama 24 jam. Sel-sel yang sudah dicuci kemudian ditransfer ke dalam medium yang berisi nitrogen yang dibatasi, dengan kandungan 17,01 g L -1 natrium butirat sebagai sumber karbon dan 1 g L-1 amonia sulfat sebagai sumber nitrogen, masing-masing dengan volume inokulasi 0,5 % (v/v). Rasio C/N adalah 35 dan suhu dalam proses kultur dikontrol pada suhu 30 °C. Sampel diambil secara berkala pada interval 10-12 jam untuk analisis.

30


3.2.5 Analisis Pertumbuhan mikroba dipantau dengan mengukur kepadatan sel dari biakan pada 600 nm setelah pengenceran dengan aquades. Konsentrasi amonium sulfat diukur dengan menggunakan dengan metode Kemper (Kemper, 1974). Berat sel kering diukur setelah pengeringan vakum pada 50 °C selama 24 jam. Jumlah PHA diukur dengan menggunakan kromatografi gas (GC) dengan proses: 2 mL kloroform dan 2 mL larutan metanol ditambahkan ke dalam inkubator pada 105 ° C. Pemecahan larutan metanol dibuat dari 3 % (v/v) asam sulfat pekat dan 1 g asam benzoat L-1. Campuran kemudian dikocok berkala

selama

inkubasi.

Setelah

pendinginan

sampai

suhu

kamar,

ditambahkan aquades 1 mL, dan campuran dikocok selama 20-30 detik. Lapisan yang bawah diambil dan disuntikkan langsung kedalam GC (GC6890 N/FID, Agilent, AmerikaSerikat) dengan kolom HP-5 (panjang 30 m, diameter 320 μm, ketebalan film 0,25 μm) untuk menentukan komposisi PHA. VFAs juga diukur dengan menggunakan GC.

31


BAB IV PEMBAHASAN

4.1 Identifikasi dan Isolasi Strain Empat puluh dua koloni berbeda yang dipilih dari piring agar yang mengandung Nile Blue, lalu diberi nama sebagai ST1-ST11 (dimana ST berarti dari tanah), WD1-WD10 (dimana WD berarti dari pengolahan limbah kedelai), WZ1-WZ17 (dimana WZ berarti dari pengolahan limbah pabrik bir) dan WS1WS4 (dimana WS berarti dari pengolahan air limbah perkotaan). Dari empat puluh dua koloni yang dipilih diambil enam koloni secara acak untuk studi fermentasi lebih lanjut setelah dilakukan analisis GC. Sel dari enam koloni yang telah dipilih ditumbuhkan dalam medium fermentasi dan dipanen setelah pembiakan selama 48 jam.Kemudian hasil fermentasi tersebut dianalisis menggunakan GC.Kandungan PHA dan DCWs dari 6 strain ditunjukkan pada Tabel 4.1.

Tabel 4.1 Kandungan PHA dan berat sel kering dari 6 strain Strain bakteri WD-1 WD-3 ST-4 ST-8 WS-10 WS-11 Kandungan PHA: PHA/BSK

Berat sel kering (gL-1) 2,5 ± 0,17 6,25 ± 0,21 3,57± 0,13 1,8± 0,18 1,67± 0,16 2,87±0,12

Kandungan PHA (%) 18 ± 1 21 ± 1 11 ± 1 11± 1 6± 1 9±1

Tabel 4.1 menunjukkan bahwa bakteri strain WD-3 tumbuh dengan baik dan, dari 6 strain yang diuji, akumulasi PHA paling besar (hingga 21 % dari 32


DCW) pada eksperimen.Oleh karena itu, bakteri strain WD-3 digunakan dalam eksperimen lebih lanjut. Urutan rDNA 16S parsial (sekitar 1500 bp) dari bakteri strain WD-3 itu dibandingkan dengan yang tersedia di database online.Ditemukan bahwa WD-3 memiliki kemiripan dengan γ-proteo-bacterium spp. (98 % identik dengan urutan 16S rDNA) sehingga bakteri strain WD-3 diidentifikasi sebagai γ-proteobacterium spp. Filogenik didasarkan pada urutan parsial 16S rDNA dan γproteo-bacterium spp. ditunjukkan pada Gambar 4.1 urutan nukleotida 16S rDNA dari bakteri strain WD-3 yang ditentukan dalam penelitian ini telah disimpan di GenBank database dengan nomor akses FJ440556.

Gambar 4.1 Filogenetik strain WD-3

4.2 Karakteristik Mikrobiologi PHA terdeteksi sebagai inklusi diskrit yang biasanya berdiameter 0,2-0,5 μm dalam sitoplasma sel dan kemungkinan dapat digambarkan cukup jelas dengan mikroskop karena memiliki indeks bias yang tinggi (Kourmentza et al, 2009). Dalam studi ini, sel-sel yang ditumbuhkan dalam medium fermentasi dengan asam butirat sebagai sumber karbon dan dipanen setelah pembiakan 33


48 jam. Ketika bagian dari bakteri strain WD-3 diamati oleh mikroskop transmisi elektron, butiran abu-abu dari akumulasi polimer PHA diamati, ditunjukkan pada Gambar 4.2.

Gambar 4.2

Mikroskop electron dari bagian WD-3 strain (a) perbesaran

125000x dan (b) perbesaran 50000x

4.3 Pengaruh rasio C/N pada produksi PHA Komposisi PHA dalam bakteri dianalisis setelah pembiakan 72 jam.Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 4.2.

Tabel 4.2 Kandungan PHA dan pertumbuhan sel WD-3 pada subtrat dengan rasio C/N berbeda Rasio C/N (mol mol-1) 35 40 45

Natrium butirat (g L-1) 17,01 17,84 18,74

Amonia sulfat (g L-1) 1 1 1

Berat sel kering (g L-1) 6,68 ± 0,18 4,00 ± 0,17 9,00 ± 0,19

Kandungan PHA (%) 22 ± 1 14 ± 1 17 ± 1

Pada tabel, hasil difokuskan pada dua konsentrasi, yaitu dari DCW dan PHA.akumulasi PHA maksimum, yaitu sebesar 22 % dari berat sel kering, diperoleh pada rasio C/N 35. Namun, pada rasio C/N 45 berat sel kering yang diperoleh mencapai 9 g L-1.Fenomena ini tidak konsisten dengan studi sebelumnya yang menunjukkan bahwa tinggi rasio C/N dapat meningkatkan 34


akumulasi PHA (Sharma dan Mallick, 2005). Ketika rasio C/N meningkat ke 45, sel dapat tumbuh dengan baik, namun dianggap bahwa mikroorganisme mungkin perlu lebih banyak waktu untuk menghasilkan PHA. Oleh karena itu dimungkinkan bahwa jika proses pembiakan itu semakin lama, komposisi PHA dapat

ditingkatkan.

Berdasarkan

hal

ini,

percobaan

diulang

dengan

menggunakan periode pembiakan 150 jam. Bakteri strain WD-3 menghasilkan akumulasi PHA 41 % dari DCW di bawah rasio C/N 45.

4.4 Pengaruh sumber karbon pada produksi PHA Karena identifikasi komponen lain selain 3HB di PHA lebih dari dua dekade lalu, diketahui bahwa enzim bertanggung jawab untuk sintesis PHA dalam bakteri menunjukkan substrat yang spesifik dan karenanya berbagai macam monomer dapat dipolimerisasi (Steinbuèchel et al, 1992.). Salah satu faktor yang menentukan sifat dari unsur PHA dihasilkan oleh bakteri adalah sumber karbon (Sudesh et al, 2000).Berdasarkan kinetika akumulasi PHA, bakteri dapat dibagi dalam dua kelompok.Kelompok pertama, dibentuk oleh bakteri yang memerlukan beberapa pembatasan nutrisi seperti Ralstonia eutropha dan Pseudomonas oleovorans. Bakteri dari kelompok kedua tidak tergantung pada pembatasan nutrisi karena mereka menimbun PHA selama pertumbuhan sel seperti Latus Alcaligenes, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas putida, 47T2 Pseudomonas aeruginosa dan r-Escherichia coli (Fernandez et al, 2005).

35


Tabel 4.3 Efek sumber karbon pada akumulasi PHA dari bakteri WD-3 setelah inkubasi 48 jam Sumber karbon (g L-1) Asetat Propionat Butirat

Berat sel kering (g L-1) 12,2 ± 0,79 8,76 ± 0,21 9,66 ± 0,12

PHB:PHV 53 : 47 35 : 65 77 : 23

Kandungan PHA (%) 25 ± 1 21 ± 1 34 ± 1

Dalam studi ini, PHB dan PHV adalah konstituen yang paling umum dalam produk PHA, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4.3. Hasil penelitian menunjukkan bahwa biosintesis bakteri strain WD-3 milik bakteri kelompok pertama yang dijelaskan di atas. Namun, ada beberapa perbedaan antara biosintesis WD-3 dan Ralstonia eutropha. Akiyama et al. (1992) melaporkan bahwa Ralstonia eutropha mampu menghasilkan homopolimer PHB dari karbon bernomer genap dari n-alkanoat, daripada menggunakan karbon bernomer ganjil dari n-alkanoat (Seperti asam propionat atau asam valerik) sebagai sumber karbon yang dihasilkan dalam akumulasi kopolimer 3HV. Tabel 4.3 menunjukkan perbedaan dengan Ralstonia eutropha, bakteri strain WD-3 dapat mensintesis kopolimer PHA dari 3HB dan 3HV baik dari substrat C-genap atau substrat C-ganjil. Hal ini berarti bahwa bakteri strain WD-3 dapat menimbun PHA yang mengandung monomer 3HB dan 3HV setiap satu sumber karbon. Ketika propionat bekerja sebagai sumber karbon tunggal, komposisi monomer 3HB:3HV dari polimer menjadi 35:65 Namun, ketika asetat dan butirat digunakan sebagai sumber karbon, komposisi monomer 3HB: 3HV dari polimer masing-masing adalah 53:47 dan 77:23.

36


4.5 Kultur Fed-batch Hubungan antara pertumbuhan sel, produksi PHA dan pengurangan substrat dipelajari melalui biakan fed-batch. Pada percobaan ini digunakan asam butirat sebagai sumber karbon.Gambar. 3 menunjukkan profil pH, DCW, amonia dan VFA dalam media dan produksi PHA selama proses fermentasi Fedbatch dari bakteri strain WD-3.

Gambar 4.3 Akumulasi PHA dalam percobaan fermentasi Fed-Batch bakteri strain WD-3 dengan referensi PH,VFA,ammonia sulfat, dan pertumbuhan sel.

Diamati pada gambar bahwa produksi PHA, DCW dan pH meningkat dengan waktu selama proses fermentasi, sedangkan konsentrasi VFA dan amonia sulfat menurun, terutama pada saat fase pertumbuhan sel. Selama fermentasi tersebut, DCW meningkat secara signifikan dari 0,1 sampai 6,45 g L -1 antara 6 dan 100 jam, dan setelah 100 jam, sel tumbuh melambat. Berbeda dengan pertumbuhan sel, kandungan PHA diamati meningkat secara perlahan pada 90 jam pertama pada proses fermentasi, kemudian meningkat signifikan dari 19 % menjadi 45 % setelah 100 jam. Hasil menunjukkan bahwa akumulasi PHA terjadi terutama pada fase pertumbuhan stasioner daripada selama fase 37


pertumbuhan logaritmik dari sel. Penemuan ini sesuai dengan hasil yang dilaporkan oleh Campbell et al. (1982) dan Stal (1992), yang mengamati bahwa akumulasi maksimum PHB terjadi selama tahap stasioner pada bakteri Spirulina platensis dan Oscillatoria limosa. Alasan yang paling mungkin untuk penemuan ini adalah bahwa selama fermentasi, pertumbuhan dan reproduksi bakteri mikroba terbatas ketika konsentrasi sumber karbon dan sumber nitrogen mengalami penurunan sedangkan rasio C/N masih relatif tinggi pada periode akhir fermentasi.Bakteri memproduksi dan menyimpan PHA ketika mereka kekurangan nutrisi lengkap yang dibutuhkan untuk pembelahan sel tetapi memiliki persediaan karbon yang banyak. PH pada sistem yang tidak dikontrol, meningkat dari 7,0 ke 8,6 selama proses fermentasi. Akumulasi maksimum dari PHA diukur pada akhir fermentasi ketika pH meningkat menjadi sekitar 8,5. Akumulasi kandungan PHA maksimum oleh bakteri strain WD-3 dalam penelitian ini adalah 45 % dari berat sel kering, setara dengan hasil 0,45 g g

-1

sel kering. Proporsi PHV menempati sepertiga dari produk akhir PHA. Observasi ini memberikan spektrum polimer yang luas dengan variasi sifat fisik, karena kopolimer PHA terdiri dari terutama 3HB dengan fraksi monomer rantai yang panjang, seperti 3HV, dimana lebih kuat dan fleksibel. Beberapa plastik tersebut biasanya memiliki aplikasi yang lebih luas.

38


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan

Kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini adalah sebuah bakteri, yang diisolasi dari pabrik pengolahan limbah dari fasilitas pengolahan kedelai di Harbin diidentifikasi sebagai γ-proteobacterium spp., yaitu bakteri strain WD3. Bakteri ini mampu menghasilkan PHA menggunakan sedikit molekul asam organik sebagai sumber karbon, termasuk butirat, asetat dan propionat.rasio C/N menimbulkan hasil yang beragam pada proses fermentasi. Ketika natrium butirat digunakan sebagai sumber karbon, akumulasi PHA terbaik 22 % dari DCW didapat apabila rasio C/N 35 setelah pembiakan 72 jam, namun produksi PHA lebih tinggi sebesar 41 % dari DCW dibawah rasio C/N 45 dicapai setelah pembiakan 150 jam. Penggunaan sumber karbon yang berbeda menghasilkan kombinasi monomer dalam PHA yang berbeda. Ketika propionat diambil sebagai sumber karbon tunggal, komposisi monomer 3HB: 3HV dari polimer sebesar 35:65, bagaimanapun, ketika asetat dan butirat digunakan sebagai sumber karbon, komposisi monomer 3HB: 3HV dari polimer masing-masing sebesar 53:47 dan 77:23, bakteri strain WD-3 dapat menimbun PHA yang mengandung monomer 3HB dan 3HV jika terdapat satu sumber karbon tunggal. Hasil dari percobaan kultur yang Fed-batch menunjukkan bahwa akumulasi PHA maksimum terjadi pada fase stasioner pertumbuhan sel.

39


akumulasi PHA maksimum oleh bakteri strain WD-3 dalam penelitian ini adalah 45 % dari DCW, setara dengan hasil 0,45 g g-1 sel kering. Percobaan ini menunjukkan bahwa residu yang dihasilkan dari hidrolisis asam dari limbah organik atau limbah lumpur, seperti molekul kecil asam organik, dapat digunakan untuk biosintesis PHA oleh bakteri turunan γproteobacterium WD-3. Proses ini memiliki potensi untuk mengurangi biaya produksi PHA sementara juga menawarkan keuntungan bagi lingkungan melalui penggunaan kembali limbah dari proses pengolahan air limbah.

5.2 Saran Saran-saran untuk penelitian ini adalah perlu dilakukan penelitian sintesis PHA dari bakteri-bakteri lain. Penelitian selanjutnya dapat mengembangkan metode alternatif untuk menggantikan metode sintesis awal.

40


DAFTAR PUSTAKA

Adam, S. dan Clark, D., 2009. Landfill Biodegradation An in-depth Look at Biodegradation in Landfill Environments. Bio-tec Environmental, Albuquerque & ENSO Bottles, LLC, Phoenix. p. 9-11. Ahmann, D & Dorgan J. R., 2009. Bioengineering for Pollution Prevention through Development of Biobased Energy and Materials State of the Science Report, EPA/600/R07/028. p.76-78. Akiyama, M., Taima, Y., Doi, Y., 1992. “Production of poly(3hydroxyalkanoates) by a bacterium of the genus Alcali genes utilizing long-chain fatty acids”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, 698–701. Awaliyyah, R. F., 2008. Modifikasi Polistiren Melalui Kopolimerisasi dengan Poli (ε-kaprolakton) serta Karakterisasinya. S1-Final Project ITB. Bandung. Brown, Terence A.,2002,”Genomes”, Bios Scientific Publishers,UK. Campbell, J., Stevens, J.S.E., Balkwill, D.L., 1982. Accumulation of poly-b- hydroxybutyrate in Spirulina platensis, J. Bacteriol. 149, 361–363. Cavalli-Sforza LL, Balfourier. 1997. Phylogenetic analysis: models and estimation procedures, Am J Human Genet 19:122-257 Chien, C.C., Chen, C.C., Choi, M.H., Kung, S.S., Wei, Y.H., 2007. Production of poly- hydroxybutyrate(PHB) by Vibrio spp. isolated from marine environment, J. Biotechnol. 34, 259–263. Choi, J., Lee, S.Y., 1999. Factors affecting the economics of polyhydroxyalkanoate production by bacterial fermentation, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 13–21. Choi, J., Lee, S.Y., 2000. Economic considerations in the production of poly(3- hydroxybutyrateco-3-hydroxyvalerate) by bacterial fermentation, Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 646–649. Coats, E. R., Loge, F.J., Wolcott, M. P., Englund, K., Mcdonald, A.G., 2007. Synthesis ofPolyhydroxyalkanoates in Municipal Waste Water Treatment. Water Environment Research; Nov; 79, 12; Proquest Agriculture Journals. 41


Daniel, M., Choi, J.H., Kim, J.H., Lebeault, J.M., 1992. Effect of nutrient deficiency on accumulation and relative molecular weight of poly-hydroxybutyric acid by methylotrophic bacterium Pseudomonas 135, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, 702–706. Fernández, D., Rodríguez, E., Bassas, M., Viñas, M., Solanas, A.M., Llorens, J.,Marqués, A.M., Manresa, A., 2005. Agro-industrial oily wastes as substrate for PHA production by the new strain Pesudomonas aeruginosa NCIB 40045: effect of culture conditions”, Biochem. Eng. J. 26, 159–167. Fuller, R.C., O’Donnell, J.P., Saulnier, J., Redlinger, T.E., Foster, I., Lenz, R.W., 1992. The supramolecular architecture of the polyhydroxyalkanoate inclusions in Pseudomonas oleovorans, FEMS Microbiol. Rev. 103, 279–288. Jung, Y.M., Park, J.S., Lee, Y.H., 2002. Metabolic engineering of Alcaligenes eutrophus through the transformation of cloned phbCAB genes for the investigation of the regulatory mechanism of polyhydroxyalkanoate biosynthesis, Enzyme Microbiol. Technol. 26, 201–208. Kadouri, D., Jurkevitch, E., Okon, Y., Sowinski, S. C., 2005. Ecological and Agricultural Significance of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. Critical Reviews in Microbiology, 31:55-67. Copyright@Taylor&Prancis. Kemper, A.J., 1974. Determination of sub-micro quantities of ammonium and nitrate in soils with phenol, sodium nitropusside and hypochlorite, Geoderma 12, 201– 206. Khopkar,S.M, (1990). Dasar-dasar Kimia Analitik”, Universitas Indonesia Press, Jakarta. Kim, J.S., Lee, B.H., Kim, B.S., 2005. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by Ralstonia eutropha, Biochem. Eng. J. 23, 169–174. Kimura, H., Yoshida, Y., Doi, Y., 1992. Production of poly (3-hydroxybutyrateco-4-hydroxybutyrate) by Pseudomonas acidovorans, Biotechnol. Lett. 14, 445–450. Koolma, J. dan Rohm, K., (2000). Atlas Berwarna dan Teks Biokimia, Terjemahan Septelia, Penerbit Hipokrates, Jakarta. Kourmentza, C., Ntaikou, I., Kornaros, M., Lyberatos, G., 2009.

42


Production of PHAsfrom mixed and pure cultures of Pseudomonas sp. using short-chain fatty acids as carbon source under nitrogen limitation, Desalination 248, 723–732. Luengo, J.M., García, B., Sandoval, A., Naharro, G., Olivera, E.R., 2003. Bioplastics from microorganisms, Curr. Opin. Microbiol. 6, 251–260. Marchesi, J.R., T. Sato, A.J. Weightman, T.A. Martin, J.C. Fry, S.J. Hiom & W.G. Wade. 1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Appl. Environm. Microbiol. 64: 795-799. Nath, A., Dixit, M., Bandiya, A., Chavda, S., Desai, A.J., 2008. Enhanced PHB production and scale up studies using cheese whey in fed batch culture of Methylobacterium sp. ZP24, Bioresour. Technol. 99, 5749–5755. Nei M. 1996. Phylogenetic analysis in molecular genetic, Ann Rev Genet 30:371-403 Ojumu, T. V. I., Yu, J. and Solomon, B. O., 2004. Production of Polyhydroxyalkanoates, a Bacterial Biodegradable Polymer. African Journal of Biotechnology Vol. 3 (1), pp. 18-24. Page, W.J., 1992. Production of poly-hydroxybutyrate by Azotobacfer vinelandii UWD in media containing sugars and complex nitrogen sources, Appl. Microbiol.Biotechnol. 103, 149–157. Ping, K. C., 2006. Polyhydroxybutyrates (PHB) Production from Grey Water Using AerobicIntermittent Feeding. A report submitted in partial fulfillment of the requirements for the award of the degree of Bachelor of Engineering (Civil- Environmental). Faculty of Civil Engineering Universiti Teknologi Malaysia. Pozo, C., Martinez-Toledo, M.V., 2002. Effects of culture conditions on the production of polyhydroxyalkanoates by Azotobacter chroococcum H23 in media containing a high concentration of alpechin (wastewater from olive oil mills) as primary carbon source, J. Biotechnol. 97, 125–131. Pranamuda, Hardaning. 2009. Pengembangan Bahan Plastik Biodegradabel Berbahan Baku Pati Tropis. Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi Jakarta. Weblog Biology Resources on Shantybio.

43


Purwadi, R., 2006. Manuscript Fermentation Production of Poly(3hydroxyalkanoats). School of Engineering – Hogskolan i Boras Allegatan 1– 501 90 Boras, Sweden. Rahayu, D., 2007. Produksi Polihidroksialkanoat dari Limbah Industri Tapioka dengan Sequencing Batch Reactor. Karya Ilmiah Penelitian yang Tidak Dipublikasikan. Universitas Padjajaran Fakultas Farmasi. Jatinangor. Reddy, C.S.K., Ghai, R., Rashmi, Kalia, V.C., 2003. Polyhydroxyalkanoates: an overview, Bioresour. Technol. 87, 137–146. Reis, M.A.M., Serafim, L.S., Lemos, P.C., Ramos, A.M., Aguiar, F.R., Van Loosdrecht, M.C.M., 2003. Production of polyhydroxyalkanoates by mixed microbial cultures, Bioprocess Biosyst. Eng. 25, 377–385. Rhu, D.H., Lee, W.H., Kim, J.Y., Choi, E., 2003. Polyhydroxyalkanoate (PHA) production from waste, Water Sci. Technol. 48, 221–228. Rybicky, E.P. 1996. PCR primer design and reaction optimisation. In Molecular Biology Techniques Manual. Ed. V.E. Coyne, M.D. James, S.J. Reid & E.P. Rybicki. Dept.of Microbiology. Univ. Cape Town. Ruan, W., Chen, J., Lun, S., 2003. Production of biodegradable polymer by A. eutrophus using volatile fatty acids from acidified wastewater, Process Biochem. 39, 295–299. Salehizadeh, H., Van Loosdrecht, M.C.M., 2004. Production of polyhydroxy-alkanoates by mixed culture: recent trends and biotechnological importance, Biotechnol. Adv. 22, 261–279. Sharma, L., Mallick, N., 2005. Accumulation of poly-b-hydroxybutyrate in Nostoc muscorum: regulation by pH, light–dark cycles, N and P status and carbon sources, Bioresour. Technol. 96, 1304–1310. Slater, S., Houmiel, K. L., Tran, M., Mitsky T. A., Taylor N. B., Padgette, S. R., Gruys, K. J., 1998. Multiple b-Ketothiolases Mediate Poly(b-Hydroxyalkanoate) Copolymer Synthesis in Ralstonia eutropha. Journal of Bacteriology, p. 1979–1987. Spiekermann, P., Rehm, B.H., Kalscheuer, R., Baumeister, D., Steinbuchel, A., 1999. A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds, Arch. Microbiol. 171, 73–80. 44


Stal, L.J., 1992. Poly(hydroxyalkanoate) in cyanobacteria: an overview, FEMS Microbiol. Rev. 103, 169–180. Steinbuèchel, A., Hustede, E., Liebergesell, M., Pieper, U., Timm, A., Valentin, H.,1992. Molecular basis for biosynthesis and accumulation of polyhydroxyalkanoic acids in bacteria, FEMS Microbiol. Rev. 10, 217–230.Suchada, C., Songsri, K., 2006. Suryanto, D. 2001. Selection and characterization of bacterial isolates for monocyclic aromatic degradation. Disertasi. IPB Bogor. Chanprateep, S., Kulpreecha, S., 2006, Production and characterization of biodegradable terpolymerpoly(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-4hydroxybutyrate) by Alcaligenes sp. A-04, J. Biosci. Bioeng. 101, 51–56. Sudesh, K., Abe, H., Doi, Y., 2000. Synthesis, structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters, Prog. Polym. Sci. 25, 1503–1555. Tobella, L.M., Bunster, M., Pooley, A., Becerra, J., Godoy, F., Martínez, M., 2005. Biosynthesis of poly-beta-hydroxyalkanoates by Sphingopyxis chilensis S37 and Wautersia sp. PZK cultured in cellulose pulp mill effluents containing 2,4,6- trichlorophenol, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 32, 397– 401. Yan, S., Subramanian, B., Tyagi, R. D., Surampalli,, R. Y., 2009. Polymer Production by Bacterial Strain Isolated from Activated Sludge Treating Municipal Water. Institue National de la Recherche Scientifique, Centre Eau, Terre & Environment, Universite du Quebec, Canada and US Environment Protection Agency, USA. Yilgor, P., Yucel, D., Kenar, H., Hasirci, V., 2007. Polyhydroxyalkanoates: a Versatile Class of Biopolymers and Their Biomedical Potensial. Brazzilian Network on Green Chemistry Awareness, Responsibility and Action. Yu, J., Song, X., Gong, L., Li, P., 2008. High poly(-hydroxybutyrate) production by Pseudomonas fluorescens A2a5 from inexpensive substrates, Enzyme Microbiol.Technol. 42, 167– 172. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21128/ diakses 1 maret 2011 45


LAMPIRAN

A. Produksi PHA oleh mikroorganisme sesuai kondisi tumbuhnya. Polyhydroxyalkanoate (PHA)

Substrate

Homopolymers Gram-Positive Gram-Negative Glucose

Azotobacter Bacillus Streptococcus Comamonas Streptomyces Escherichia a

GramPositive Bacillus

Copolymers Gram-Negative Pseudomonas Ralstonia

Pseudomonas Ralstonia Vibrio Comamonas Ralstonia Bacillus Comamonas Microlun atus Alcaligenes Bacillus Rhizobium

Fructose

Bacillus

Sucrose

Bacillus Streptococcus Comamonas Vibrio

Lactose

Lactobacillus

Comamonas

Lactococcus

Hydrogenophaga

Sphingomonas

Streptococcus Methylobacterium Paracoccus Pseudomonas Fatty acids Bacillus

Sinorhizobium Brachymonas Comamonas Pseudomonas Spirulina Vibrio

Maltose

Comamonas

Methanol

Protomonas Pseudomonas

Starch

Azotobacter Haloferax

Glycerol

Escherichia

a Bacillus Aeromonas Microlun Comamonas atus Escherichia a Pseudomonas

a

Methylobacterium Ralstonia Vibrio 46


Xylose

Burkholderia

Agricultura Bacillus

Methylobacterium Alcaligenes

l Waste

Staphylococcus Azotobacter Burkholderia a

Escherichia Haloferax

Bacillus

Haloferax Klebsiella Pseudomonas Rhizobium Sphingomonas

a

Klebsiella Ralstonia a

Dairy

Escherichia

Products

Hydrogenophaga

Pseudomonas Ralstonia

Methylobacterium Pseudomonas Sinorhizobium Ralstonia

Oily Waste

Comamonas Pseudomonas

Industrial Actinobacillus Azotobacter Waste

Bacillus

Burkholderia

Rhodococcus

Pseudomonas

47

Ralstonia a Azotobacter


B. Anggota Kelas Proteobakteri

Subclass

"Alpha"

“Alpha”

"Beta"

Taxon* Rhodobacter Rhodomicrobium Rhodopseudomonas Rhodopila Rhodospirillum Acetobacter Acidiphilium Agrobacterium Ancalomicrobium Aquaspirillum Azospirillum Beijerinckia Blastobacter Bradyrhizobium Caulobacter Erythrobacter Filomicrobium Gemmobacter Gluconobacter Hyphomicrobium Hyphomonas Methylobacterium Mycoplana Nitrobacter Paracoccus Pedomicrobium Phyllobacterium Phenylobacterium Prosthecomicrobium Rhizobium Rochalimaea Stella Xanthobacter Zymomonas Rhodocyclus Achromobacter Alcaligenaceae Alcaligenes Bordetella Aquaspirillum Chromobacterium

16S rRNA sequences 25 25 25 25 25

References 16S rRNA-23S rRNA hybridization 9

5S rRNA sequences

9 9 9

13 13

25 NP( 25 25 NP 17 8

9 9 9 9 9 NP

25 17a 17 9 17a

17a 17a

NP 9 25 25 17a

17a 13 9

25 NP 25 25 17a NP

NP 9

25 25 25 25 48

13 11 4 15 15 5


Comamonas Derxia Janthinobacterium Kingella Leptothrix Methylomonas clara Methanolomonas Methanomonas Neisseria Nitrosococcus Nitrosolobus Nitrosospira Nitrosovibrio Oligella Pseudomonas acidovorans complex Pseudomonas solanacearum complex Simonsiella Sphaerotilus Spirillum “Beta” Taylorella Thiobacillusd Vitreoscilla Xylophilus Chromatia ceae "Gamma" Amoeboba cter

25 NP 25

6 5 5 16 19 28 28 28

25 25 25 25 25

16

15 25

5

25

5

13

NP 25 25 15 25 25

19 19 24

25 7

Chromatium Lamprocystis Thiocapsa Thiocystis Thiodictyon Thiospirillum Ectothiorhodospiraceae Ectothiorhodospira Acinetobacter Aeromonadaceae Aeromonas Alteromonas Alysiella Azomonas Azotobacter Beggiatoa Branhamella Deleya Enterobacteriaceae

25 25 25 25 25 25 25 25 25 27 27 NP

13

16 3 3

3 13

5 5 25 NP 27 49

19 16 5 3


Budvicia (1) BuUiauxeilaf Cedecea1' Citrobacter1' Edwardsiellae Enterobacter Erwiniae Escherichia Hafniae Klebsiellae Kluyverae Leclercia (21) Leminorellae Moellerellae Morganellae Obesumbacteriunf Proteus Providencia" Rahnellae Salmonella'' Serratia Shigella" Tatumellae Yersinia Yokenella ( = Koserella) (12) Xenorhabdus Frateuria Halomonas Legionella Leucothrix Lysobacter Marinomonas Moraxella Oceanospirillum Pasteurellaceae Pasteurella Plesiomonas Pseudomonas fluorescens complex Psychrobacter (10) Ruminobacter Serpens

27 27

3

27

27

3

27

3

6a 5 27 27 27 27 5 16 25 3 25 25

5

18, 25 25

Thiomicrospira Thiothrix Vibrionaceae

19

3 50

3 3 13

19 3


"Delt a"

Enhydrobacter (20) Listonella Vibrio Photobacterium Shewanella Xanthomonas Xylella Bdellovibrio

27 27 25 23

3

3 3 3 3

5

25

Desulfobacter Desulfobulbus Desulfococcus Desulfonema Desulfovibrio Desulfuromonas Myxococcaceae Chondromyces Cystobacter Myxococcus Nannocystis Sorangium Stigmatella Pelobacter

25 25 25 25 25 25 25 NP 25 25 25 25 25 NP

51


BIOSINTESIS POLIHIDROKSIALKANOAT OLEH BAKTERI GAMMA PROTEOBACTERIUM WD-3 DARI ASAM LEMAK VOLATIL

Recommend Documents