Az elválasztás elméleti alapjai • Az elválasztás során, a kromatogram kialakulása közben végbemenő folyamatok matematikai leirása bonyolult, ezért azokat teljességgel nem tárgyaljuk. • Cél: * megismerni az elválasztás során azokat a főként fizikai folyamatokat, amelyek befolyásolják az elválaszthatóságot * az aktuális paraméterek ismeretében hogyan lehet az elválasztást szabályozni, optimalizálni
• a mintakomponensek az elválasztás során a heterogén összetételű álló- és mozgófázis között eltérő fizikai és kémiai tulajdonságaik következtében kölönbözőképpen oszlanak meg
• a kialakult rendszerre a minta és a fázisok dinamikus kölcsönhatása jellemző: MINTA
ÁLLÓFÁZIS
MOZGÓFÁZIS
•
a komponensek az állófázishoz való kötődésüknek megfelelően mozognak a mozgófázisban, melyet meghatároz: – az álló- és mozgófázis összetétele, – a hőmérséklet, – a nyomás
•
visszatartáskor a minta szétterül, létrehozza a zóna- vagy sávszélesedést, melynek oka elsősorban diffúzió, másrészt anyagátadási gátlás
Örvénydiffúzió Oka: – a mozgófázis eltérő áramlási útja – a széles csatornákban gyorsabban, a szűk, keskeny csatornákban lassabban halad az eluens – a molekulák belekerülve ezekbe az áramlási csatornákba, hosszabbrövidebb szakaszt foglalnak el, ezáltal megnövelve a felviteli keskeny sávot
Anyagátadási gátlás a mozgó fázisban Oka: – a mobilfázis az állófázis egyenetlen részei mentén eltérő áramlási sebességgel halad – a szemcsék közelében az áramlási sebesség kicsi, vagy nulla, míg a csatorna közepén nagy
Anyagátadási gátlás a mozgó fázis álló részében Oka: – a szemcsék pórusaiban lévő mozgófázis nem mozog, hanem áll – a meghatározandó molekulák diffúzió révén ki-be mozognak ezekben a pórusokban – a sávszélesedés attól függ, hogy mennyi időt töltöttek a pórusokban
Anyagátadási gátlás az állófázisban Oka: – a komponensek bediffundálva az állófázisba valamilyen mechanizmus révén be is hatolnak abba és ott megkötődnek – ha a molekula mélyre hatol, akkor sokáig tartózkodik az állófázisban, ezzel megnövelve a sávszélesedést
A kromatogram keletkezése
A kromatogram jellemzői • 1.) a komponens retenciós ideje (tR): – a minta beadagolásától a csúcsmaximum megjelenéséig eltelt idő
* értéke az adott rendszerre mindíg állandó * felhasználható az ismeretlen komponens azonosítására
• 2.) a vissza nem tartott komponens retenciós ideje (t0)
A mintamennyiség hatása a retencióra • kis mintamennyiségek estében a retenciós idő nem változik(a ) • egy bizonyos kritikus értéknél a tR csökkenése figyelhető meg (b) • a mintaméret további növekedésével a retenciós idő tovább csökken és gyorsan romlik az elválasztóképesség, a szelektivitás is (c), (d).
• 3.) visszatartási tényező (retenciós faktor; kromatográfiás megoszlási hányados; k) megadja, hogy egy vizsgált k= komponens az elválasztás t0 során mennyi időt tartózkodott az állófázison, viszonyítva a mozgófázisban töltött időhöz
tR - t0
• k értéke gyakorlatilag 1-10 közé kell essen • biológiai minták esetében k értéke 2-5 között már megfelelő elválasztást jelent
• k értékét térfogategységekben is megadhatjuk: VR - V0 (nettó retenciós térfogat) k= V0 (hottérfogat) • következmény: – a.) ha változtatjuk a hordozón az állófázis relatív mennyiségét, akkor megváltozik minden komponens k értéke is – b.) változtatva a mobilfázis összetételét ugyancsak változnak a k értékek
• A kapacitási tényező és a mintatérfogat összefüggése azt mutatja, hogy olyan mintaméret tartományon belül kell dolgozni, ahol a k értéke állandó • ez a kritikus érték a rendszer lineáris kapacitása, melyet túllépve a retenciós adat azonosításra nem használható
• 4.) Szelektivitási tényező () : a két visszatartási tényező hányadosaként adható meg k2 = k1 • változtatása alapvetően két úton lehetséges: – az állófázis megváltoztatásával (ún. állófázis hatás) – a mozgófázis változtatásával (ún. mozgófázis hatás)
• a kettő egymással szorosan összefügg: – pl., ha megváltozik a mozgófázis összetétele, akkor változik az adszorpciós réteg összetétele, de egyúttal változik az anyagok megoszlása és így a szelektivitás is
A kromatográfiás csúcs • az összetevők anyageloszlását mutatja • nem írhatók le Gauss görbével, torzultak, nem szimmetrikusak • a csúcsok alakját befolyásolja: – – – –
túlterhelés, nyomás, hőmérséklet nem megfelelően megválasztott álló- és mozgófázis
Sávelhúzódás
• a.) kémiai : - a minta és az álló-/mozgófázis nem összeillő • •
-a leszálló ág nehezen vagy egyáltalán nem tér vissza az alapvonalra - teendő: új fázisrendszert kell választani!
• b.)oldószer okozta sávelhúzódás – a minta oldására használt oldószer nem azonos az eluenssel – nagyobb mennyiségű anyag után kis csúcsot akarunk detektálni – megoldás: kisebb mennyiségű minta injektálása
• c.) Poisson-féle sávelhúzódás • gyenge minőségű állófázis esetében alakul ki • igyekezzünk azokat mellőzni
• d.) exponenciális vagy normális sávelhúzódás – minden kromatográfiás rendszerben megtalálható, bár esetenként alig észlelhető – jól tervezett rendszerekben hatása elhanyagolható – a HPLC-ben kisebb a sávok elhúzódása, mint a GC-ben
• 5. Csúcsfelbontás vagy relatív elválasztás (RS) : • a két szomszédos sáv középpontja és az átlagos sávszélességük hányadosaként adható meg (t2 - t1) RS=2 (W1+W2) W-a sávok csúcsszélessége • nagyobb RS értékek jobb, a kisebbek gyengébb elválasztást eredményeznek
Az RS értékét meghatározza: a.) a visszatartási tényező (k) b.) az elméleti tányérszám (N), mely a komponens retenciós ideje és a sávszélessége ismeretében számítható tR
2
N=16 WR • az N a kromatográfiás rendszer hatásosságát fejezi ki • értéke egy kromatogram különböző sávjaira közelítőleg azonos
• A két sáv közül ha az egyik lényegesen kisebb a másiknál, az átfedés nagyobb mértékűvé válik:
• N arányos az elválasztó rendszer hosszával (növekedésével nő) L (az elválasztó rendszer hossza)
N= H (HEPT= height equivalent to theoretical;az egységnyi hosszban lévő hatásosság mértéke) •a
felbontás a következőképpen adható meg: Rs = 1/4 N * (-1)/ *k/(k+1) 1
2
3
• az első tag az elválasztásra jellemző kinetikai hatásokat (zónaszélesedés), •a második az elválasztást megszabó termodinamikai hatásokat, •a harmadik tag a komponensek visszatartását adja meg
• Az elválasztás alapegyenlete: • Rs = 1/4 N * (-1)/ *k/(k+1) N - elméleti tányérszám
-szelektivitási tényezö k - visszatartási tényezö /kapacitásarány/
• az alapegyenletben szereplő tényezők definíciója és a javasolt értékek: N= 16(tR /Wb ) =k2/k1 k=(tR-t0)/ t0 ahol: tR=retenciós idő ahol: k2k1 ahol: t0 az inert Wb=az alapvonalon anyag retenciós mért csúcsszélesség ideje N>1000 >1,05 1 k >10 ha =1 nincs elválás
biológiai minta esetén 2 k >5
Összefoglaló • A kromatográfiás elválasztás célja: hasonló fizikai-kémiai szerkezetű vegyületek elkülönítése, azonosítása és mennyiségi meghatározása • A kromatografálhatóság kritériuma: az anyagok átalakulás nélkül oldatba vihetők legyenek • Az elválasztás alapja: két hasonló fizikai-kémiai tulajdonsággal rendelkező komponens megoszlása az álló- és egy állandó mozgásban lévő mozgófázis között • Eluciós módszer: a minta bevitele impulzusszerűen (dugószerűen) történik, a mozgó fázis folyamatosan áramlik az állófázis felett és szorpciója kisebb, mint a legkevésbé szorbeálódó mintakomponensé
