Antigén-ellenanyag kapcsolódás kimutatásán alapuló analitikai módszerek Áramlási citofluorimetria (FACS) Konfokális lézerpásztázó mikroszkópia (CLSM)
2016.03.22. Sándor Noémi
[email protected]
Ismétlés
Mivel jelöljük az ellenanyagot
Példa
Mit detektálunk
Milyen módszerben használjuk
Enzim
HRPO, AP
Enzimreakciót (szubsztrát elhasítva világít/színt vált)
ELISA, Western blot, immunhisztokémia
Fluoreszcens festék
FITC, PE, Alexa fetsékek, stb....
Fluoreszcenciát (fényt)
FACS, fluoreszcens mikroszkópia
Fémkolloid
arany, vas
A fém tulajdonságait
MACS, elektronmikroszkóp
Radioaktív izotóp
pl. 125I
Radioaktiv sugárzást
RIA
Fluoreszcencia • Egy gerjesztett molekula elektronátmeneteit (relaxáció) kísérő foton kibocsátás (emittáció) • Egy foton elnyelése, az ABSZORBCIÓ (1) váltja ki (=lézerrel megvilágítjuk) • Egy gerjesztett elektronállapot (S1’) jön létre, mely először az alacsonyabb S1 vibrációs szintre relxál (2), majd • Fluoreszcencia kibocsátás (=ezt detektáljuk) vagy egyéb relaxációs folyamatok (3) során visszatér az alapállapotba: a kibocsátott fluoreszcencia mindig hosszabb hullámhoszú, mint az elnyelt hullámhossz
Ha a jelölt ellenanyag felismerte az antigént → tudott kötődni → „van mit gerjeszteni” a mintában → van detektálható fluoreszcencia
Fluorofórok • •
•
A flurofórok olyan molekulák, melyek képesek az elnyelt fényt jó hatásfokkal fluoreszcencia formájában kibocsátani (gerjeszthető elektronok) Természetes fluorofórok: Trp, Tyr, koenzimek, szteroidok, DNS/RNS (autofluoreszcencia) Gyakori szintetikus és szemi szintetikus fluorofórok: Fluoreszcein, Rhodamin, Etídium bromid, Propídium jodid, fikobiliproteinek (RPE, APC) Fluoreszcensen jelölt ellenanyagok
Pl. anti-CD4-FITC
Fluoreszcens próbák
phalloidin-FITC (F-aktin próba)
Fluorofórok Fluorofórok lényeges paraméterei • Gerjesztési (elnyelési, excitációs) spektrum • Emissziós (kibocsátási) spektrum
A spektrum megmutatja mely hullámhosszon optimális az adott fluorofór gerjesztése, és mely hullámhosszon célszerű detektálni
Miért jó fluoreszcens technikákat használni?
pmol/l érzékenységű → a radioaktív jelölés lenne hasonlóan érzékeny, de az veszélyes térbeli és időbeli feloldást is lehetővé tesz (határ: 1-100 ns, ami a fluoreszcencia életideje) Felhasználási területek: spekrofluorimetria, excitációs és emissziós spektrumok mérése multiparaméteres fluoreszcens mikroplate reader, high troughput áramlási citofluorimetria (FACS) fluoreszcens mikroszkópia
Áramlási citofluorimetria (FACS) Előnyök • • •
Sejtenkénti multiparaméteres analízis (1 sejtről 2-6 paraméter meghatározása egyszerre) Nagy sebesség (akár 10.000 sejt/perc) Sejtszortírozás lehetősége (tetszőleges tulajdonság alapján)
Felhasználások • Klinikumban: sejtpopulációk arányának, sejttípusok abszolút számának meghatározása, aktivációs állapot meghatározása, citokinek mérése • Kutatásban: gyakorlatilag „bármire”: populációk mennyisége/minősége, sejtosztódás, sejtaktiváció, sejthalál, ionok, citokinek meghatározása
Áramlási citofluorimetria (FACS) Fluorescence Activated Cell Sorting
Alapelvek • Sejtszuszpenzió áramoltatása zárt keringési rendszerben • Hidrodinamikai fókuszálás kis keresztmetszetű kapilláris fejbe • Egyszerre 1 sejt megvilágítása lézerrel • Sejtről érkező fluoreszcencia és fényszórás detektálása • Adatok digitális feldolgozása és tárolása (1 minta=1 file a minta összes sejtjének összes paraméterét tartalmazza, fcs formátum)
Optikai szűrők és dikroikus tükrök
Áramlási citofluorimetria Hidrodinamikai fókuszálás
A minta laminárisan áramlik
(köpenyfolyadék) http://www.labome.com/method/FlowCytometry-A-Survey-and-the-Basics.html
Áramlási citofluorimetria
Alapelvek • Sejtszuszpenzió áramoltatása zárt keringési rendszerben • Hidrodinamikai fókuszálás kis keresztmetszetű kapilláris fejbe • Egyszerre 1 sejt megvilágítása lézerrel • Sejtről érkező fluoreszcencia és fényszórás detektálása • Adatok digitális feldolgozása és tárolása (1 minta=1 file a minta összes sejtjének összes paraméterét tartalmazza, fcs formátum)
Optikai szűrők és dikroikus tükrök
Áramlási citofluorimetria Mit detektálunk? Fényszórás a megvilágító lézer fénye beleütközik a detektálandó részecskébe (sejt, gyöngy, stb), ez nem fluoreszcencia!!! Két típusa: előre szóródó (FSC=forward scatter) → partikulum mérete oldalra szóródó (SSC=side scatter) → partikulum granuláltsága Ezek mellett fluoreszcens jelek
http://www.labome.com/method/FlowCytometry-A-Survey-and-the-Basics.html
Áramlási citofluorimetria Fluoreszcens jelölés típusok 1. Fluoreszcens próbák 2. Jelölés specifikus ellenanyaggal direkt fluo jelölt ellenanyag jelöletlen elsődleges + fluo jelölt másodlagos (=indirekt) biotinnal jelölt elsődleges + fluo avidin
av B
Eredmények feldolgozása Általában 10.000 sejtet analizálunk minimum → statisztikailag értelmezhető, a populációt reprezentáló eredmény
HISZTOGRAM
DOT-PLOT 2 paraméter eloszlásának vizsgálata paraméter #2 értéke
partikulumok (sejtek) száma
1 paraméter eloszlásának vizsgálata
paraméter értéke
1 pont=1 sejt
paraméter #1 értéke
A paraméter lehet fényszórás vagy fluoreszcens jel
Eredmények feldolgozása
partikulumok (sejtek) száma
A hisztogram eredményeinek értékelése, számszerűsítése
paraméter értéke
Paraméter intenzitásának középértéke (általában fluo)
Eredmények feldolgozása A hisztogram eredményeinek értékelése, számszerűsítése
Nem mindig homogén a populáció az adott paraméterre M2
CD4+
M1
CD4Markerekkel kijelölhetjük a populációkat, ezekre utána ugyanolyan statisztika kérhető, mint a homogén (egy csúcsú) hisztogramra, pl. fluoreszcencia intenzitás középértéke
Pl. CD4 sejtek arányának meghatározása T-sejt szuszpenzióban, jelölés: antiCD4-FITC
Eredmények feldolgozása A hisztogram eredményeinek értékelése, számszerűsítése Több minta (=file) egyidejű vizsgálata = hisztogram overlay
• Pl. adott marker eloszlása negatív kontrol (=nem stimulált) és pozitív kontrol (=stimulált) minta sejtjein • Erre is kérhető statisztika, markerezhető (természetesen mintánként külön adja meg az eredményeket)
Eredmények feldolgozása A dot-plot eredményeinek értékelése, számszerűsítése Hány sejt van itt?
Kapuzás (gate)
Konkrét százalékot, darabszámot határozhatok meg, illetve további kiértékeléseket kérhetek erre a populációra
Kvadráns analízis
Eredmények feldolgozása A dot-plot eredményeinek értékelése, számszerűsítése
sejtszám
Kapuzás felhasználása példa: Emberi monocitákon milyen mértékben fejeződik ki a CD4 a T-sejtekhez képest? ? Ha nincs kapuzás
?
Emberi fehérvérsejtek
sejtszám
CD4 jelölés
Ha van kapuzás = minden, nem a kapuba eső sejtet figyelmen kívül hagy az adott elemzés szempontjából CD4 jelölés
Eredmények feldolgozása – 2 paraméteres dot plot
Eredmények feldolgozása
Kvadráns-analízis Eredmények feldolgozása – 2 paraméteres dot plot, példa
(pl. T sejt populációk a timuszban)
FL-2 : anti-CD8
érett, CD8+ citotoxikus T-limfocita (5-7%)
TÍMUSZ
éretlen, CD4- és CD8- T-sejt (3-5 %)
éretlen, CD4+ és CD8+ T-limfocita (~ 80 %)
érett, CD4+ helper T-limfocita (~ 10 %) FL-1 : anti-CD4 (10-20.000 sejt)
Sejtpopulációk lépben. Eredményekafeldolgozása – 2 paraméteres dot Kvadráns analízis limfocita markerekkel
TÍMUSZ Nincs kettősen pozitiv sejt !
FL-2 : sIgM spec. antitest
B limfociták
nem limfoid sejtek
plot, példa
T limfociták
FL-1: anti-CD3
Sejtpopulációk lépben. Eredményekafeldolgozása – 2 paraméteres dot Kvadráns analízis limfocita markerekkel
LÉP Nincs kettősen pozitiv sejt !
FL-2 : anti-CD8
érett, CD8+ citotoxikus T-limfocita (10-15%)
B limfociták nem limfoid sejtek
plot, példa
érett, CD4+ helper T-limfocita (~ 25-30 %) FL-1 : anti-CD4
Eredmények feldolgozása Fluoreszcencia időbeli követése
paraméter
Gyors (percek alatt lejátszódó) biokémiai folyamatok követése
idő
Pl. intracelluláris Ca+ koncentráció követése Ca+ próbával, ami ha Ca-ot köt, intenzívebben emittál adott hullámhosszon
Áramlási citofluorimetria felhasználási területei • • • • •
Sejtfelszíni receptorok jelölése (pl. 18. dia, CD4 expresszió monocitákon) sejtpopulációk elkülönítése (pl. lép CD4+ és CD8+ T-sejt összetételének meghatározása) sejtizolálás hatékonyságának ellenőrzése sejtszortírozás áramlási citometriával Monociták (CD14+) tisztítása vérből aktivációs markerek detektálása
M1
Igen/nem válasz Saha, CMGH, 2016
Tisztítás előtt sok CD14(=nem monocita) sejt
Expresszió fokozódás
https://www.denovosoftware.com/site/histograms.shtml
Tisztítás során eltűnnek a CD14- sejtek (=tisztítás sikeres, a sejtszuszpenzió már csak monocitákból áll)
Speciális, szortírozásra képes áramlási citofluoriméter képes szétválogatni az általam kijelölt sejtpopulációt, pl. az M1 markerrel azonosított CD14+ sejteket.
Áramlási citofluorimetria felhasználási területei • Intracelluláris molekulák jelölése - intracelluláris receptorok jelölése (pl. TLR9) - jelátviteli molekulák foszforilációs állapotának meghatározása (foszforilált formára specifikus fluoreszcensen jelölt ellenanyagokkal) - citokin termelő sejtpopuláció azonosítása - DNS jelölés (sejtosztódási fázisok (G1, S, stb) és sejthalál meghatározása) A sejtfelszín jelölése is lehetséges ezzel párhuzamosan!
Ha adott citokint termelő sejtpopulációt szeretnénk azonosítani, akkor mivel ezek szekretált proteinek, gátolnunk kell a sejtkeből való kijutásukat (más esetben ez a lépés nem szükséges)
http://www.bdbiosciences.com/sg/research/ics/techniques/
Áramlási citofluorimetria felhasználási területei
citokin termelő sejtpopuláció azonosítása
http://www.novusbio.com/IFN-gamma-Antibody-4SB3_NBP142935.html
Áramlási citofluorimetria felhasználási területei Halott sejtek jelölése: propídium jodiddal (PI, DNS interkaláló festék) • Citotoxicitás vizsgálata (pl. gyógyszerek) • Halott sejtek kizárása a mérésből
PI
www.biolegend.com
Áramlási citofluorimetria felhasználási területei • Ionok szintjének detektálása Pl. Ca++ koncentráció változása sejtaktivációkor Fluo4AM festékkel (ez nem ellenanyag jelölés, hanem fluoreszcens próba)
Atkinson, 2010, Blood
A festék fluoreszcenciájának intenzitása a Ca++ koncentráció növekedésével A párhuzamosan nő. Ezt tudjuk időben követni. Atkinson, 2010, Blood
Áramlási citofluorimetria felhasználási területei • Sejtosztódás detektálása az újonnan szintetizált DNS fluoreszcens jeölésével (BrDU) fluoreszcensen jelölt sejtek osztódáskor bekövetkező fluoreszcencia csökkenés követésével (CFSE)
BrDU az újonnan szintetizálódó DNS-be épül jelölése fluoreszcens anti-BrDU-val
Luzyanina, 2007, TBMM
Fluoreszcens mikroszkópia • • • • •
Szelektíven csak a számunkra érdekes molekulákat látjuk Térbeli és időbeli meghatározás a minta előkészítése gyakorlatilag azonos a FACS-al és IHC-val lokalizáció meghatározására elsősorban a sejtekről érkező fluoreszcens jelet detektáljuk
Fényforrás: lámpa/lézer
• A sejteknek nem kell szuszpenzióban lenni • Lassabb (adott idő alatt kevesebb sejtről nyerünk adatot) • Információ a vizsgált molekula lokalizációjáról
FACS
Fluoreszcens mikroszkópia-konfokális mikroszkópia Fluoreszcens (konfokális) mikroszkópia CLSM: confolal laser scanning microscope
A nem a fókuszsíkból származó fluoreszcencia kizáródik
(Ez a pinhole a gerjesztő fény fókuszálására van)
Konfokális mikroszkópia mikroszkópia előnye A konfokális előnye
Konfokális mikroszkópia Többféle fluoreszcensen jelölt molekula egyidejű térbeli vizsgálata (kolokalizáció)
Konfokális mikroszkópia
Transzkripciós faktorok magi traszlokációja
Konfokális mikroszkópia Fagocitózis detektálása
Konfokális mikroszkópia Intracelluláris Ca++ jelölése (ezt sima fluoreszcenssel is lehet)
Atkinson, 2010, Blood
